Определение структуры, динамики и белок-белковых взаимодействий С-домена белка фактора терминации трансляции человека eRF1 методом ЯМР спектроскопии в растворе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Манцызов Алексей Борисович

Определение структуры, динамики и белок-белковых взаимодействий С-домена белка фактора терминации трансляции человека еИИ методом ЯМР спектроскопии в растворе

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2010

1 5

МР29М

004600773

Работа выполнена в Учебно-научном межфакультетском и междисциплинарном центре магнитной томографии и спектроскопии Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук

Польшаков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Устынюк Юрий Александрович

кандидат химических наук Бони Ирина Венедиктовна

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук

Институт органической химии имени Н.Д.Зелинского

Защита состоится 20 апреля 2010 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при химическом факультете МГУ по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ. Автореферат разослан ^ марта 2010 года

Учёный секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И. Г.

Актуальность проблемы

Биосинтез белка на рибосоме по матрице РНК (трансляция) является одним из важнейших биохимических процессов в клетке. Механизм трансляции находится в фокусе интенсивных исследований в течение последних пятидесяти лет. Актуальность таких исследований подтверждает, в частности, факт присуждения Нобелевской премии по химии 2009 года трем исследователям за их вклад в изучение структуры и функции рибосомы. Тем не менее, до настоящего времени установлены далеко не все детали механизма процесса трансляции. Наибольшее количество нерешенных вопросов связано с процессом трансляции в эукариотах. В частности, не определены многие ключевые аспекты механизма остановки биосинтеза белка (терминации трансляции) при достижении стоп-кодона мРНК. Известно, что ключевую роль в механизме терминации трансляции в клетках эукариот играют белки eRFl и eRF3, называемые факторами терминации трансляции (eukaryotic Release Factor) первого и второго класса соответственно. Белок eRFl проявляет структурно-функциональную мимикрию молекулы тРНК, и обеспечивает узнавание стоп-кодона, а также последующее освобождение синтезированного белка из терминационного рибонуклеопротеинового комплекса. Фактор терминации трансляции второго класса eRF3 является рибосомо- и eRFl-зависимой ГТФазой. Этот белок кодируется жизненно важным геном и необходим для стимулирования активности eRFl и повышения эффективности процесса терминации. Трехмерная структура eRFl человека была ранее определена в кристалле. Было, в частности, установлено, что белок состоит из трех доменов, соединенных гибкими линкерами. При этом каждый из доменов ответственен за определенную функцию. Так, N-терминальный домен играет ключевую роль в узнавании стоп-кодона, обеспечивая строго специфическое взаимодействие eRFl с каждым их трех возможных триплетов UAA, UAG и UGA. Средний (М) домен участвует в гидролизе связи между полипептидной цепью синтезированного белка и тРНК в пептидилтрансферазном центре 60S субъединицы рибосомы. Все функции С-терминального домена до конца не установлены, но было показано, что этот домен участвует во взаимодействии с eRF3. Это позволяет предположить для него регуляторную роль в процессе терминации трансляции. Фрагмент eRFl, состоящий только из М и С-доменов способен связываться с рибосомой эукариот и индуцировать ГТФазную активность eRF3. В то же время, фрагмент, состоящий лишь из N и М доменов, сохраняет функциональную активность полноразмерного eRFl in vitro.

Структура, динамика и функции С-домена eRFl изучены значительно меньше чем N и М доменов белка. Так, в рентгеновских структурах полноразмерного eRFl, как в свободной форме, так и в комплексе с eRF3, С-домен имеет обширные неразрешенные фрагменты. Очевидно, что установление структуры и исследование динамических свойств С-домена eRFl необходимо для понимания его роли в механизме терминации трансляции и определения молекулярных аспектов регуляции этого процесса.

Цель работы

Целью данной работы является изучение структуры в растворе, динамики и функций С-домена фактора терминации трансляции eRFl человека. Для достижения указанных целей в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Определение структуры высокого разрешения С-домена белка eRFl в растворе методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР);

2) Экспериментальное определение динамических свойств белковой цепи С-домена eRFl с помощью спектроскопии ЯМР;

3) Исследование молекулярной динамики и междоменных взаимодействий в eRFl методом молекулярного моделирования in silico, с использованием полученных экспериментальных данных по структуре и динамике белка.

Научная новизна

В работе впервые получены данные о структуре высокого разрешения С-домена фактора терминации трансляции eRFl человека в растворе. Впервые получены структурные данные для фрагмента 329-372 белка, не определенного ранее в кристалле. Установлено, что фрагмент 329-372 структурирован и формирует отдельный минидомен, существующий в виде двух конформеров с равной населенностью, медленно (в шкале времени от секунд до минут) переходящих друг в друга. Для каждого из конформеров определена структура высокого разрешения в растворе. Элементом новизны является сам факт определения структуры двух конформеров белка. Установлено также, что С-терминальный фрагмент 414-437, не разрешенный, как и фрагмент 329-372, в кристаллической структуре eRFl, неструктурирован в растворе. Полученные семейства структур ЯМР для каждого из конформеров депонированы в банк данных белковых структур PDB (коды 2KTU и 2KTV).

Впервые методом ЯМР изучена динамика основной белковой цепи С-домена eRFl человека. Установлено, что амплитуда молекулярных движений структурированной части домена сравнительно невелика.

Исследована стабильность конформеров С-домена eRFl при различной температуре, рН и ионной силе раствора. Показано, что при рН раствора ниже рКа протонирования имидазольного фрагмента гистидина белок неустойчив. После рефолдинга белка из раствора с пониженным рН остается только один конформер.

Рассчитаны длинные (до 200 не) траектории молекулярной динамики С-домена eRFl и исследованы факторы стабилизации мини-домена. Изучено влияние состояния протонирования имидазольного кольца гистидина на устойчивость конформаций белка. Рассчитаны траектории молекулярной динамики полноразмерного eRFl с использованием полученных структур ЯМР фрагментов С-домена, не определенных в кристаллической структуре полноразмерного eRFl. Исследовано междоменное взаимодействие eRFl и

влияние на него конформационного состояния мини-домена и состояния протонирования имидазольных фрагментов остатков гистидина.

На основании полученных результатов установлены основные факторы стабилизации конформаций мини-домена и сделаны предположения о функциональной роли С-домена в процессе терминации трансляции.

Практическая значимость работы

Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о структуре eRFl человека и представляют новую информацию об организации фрагментов белка, структура которых была неизвестна ранее. Установление структуры мини-домена 329-372 позволило исследовать детали молекулярного механизма междоменных взаимодействий в факторе терминации трансляции eRFl человека методами молекулярной динамики и сделать рациональный выбор мутаций аминокислотных остатков в области мини-домена для исследования их влияния на уровень терминационной активности фактора. Результаты работы позволили расширить понимание молекулярных основ регуляции процесса терминации трансляции и выдвинуть новые экспериментально обоснованные предположения о функции С-домена eRFl человека в этом процессе.

Апробация работы

Основные положения данной работы и ее результаты были представлены на семи международных конференциях и научных школах:

1. International Youth Scientific School "Actual problems of magnetic resonance and its application", 23-28 September, 2007, Kazan, Russia.

2. XV International Scientific Conference of Undergraduate, Postgraduate Students and Young Scientists "Lomonosov", 8-11 April, 2008, Moscow, Russia.

3. EUROMAR 2008, 6-11 July, St. Petersburg, Russia.

4. International Conference "Advances in NMR of protein and nucleic acid molecular recognition", 16-18 October, 2008, Murnau, Germany.

5. Joint NMR-life and Extended-NMR Meeting "New approaches to biomolecular structure determination", 27-29, October, 2008, Berlin, Germany.

6. XVI International Scientific Conference of Undergraduate, Postgraduate Students and Young Scientists "Lomonosov", 13-18 April, 2009, Moscow, Russia.

7. EMBO World Practical Course, "Structure and dynamics of biomolecules by NMR spectroscopy", 21-30, September, 2009, Rosario, Argentina.

Публикации

По материалам диссертационного исследования на момент подготовки автореферата опубликованы 1 статья в реферируемом журнале, 1 статья в сборнике трудов научной конференции и 5 тезисов докладов. 1 статья принята к печати в журнале FEBS Journal.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (177 наименований). Диссертация содержит 37 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная часть диссертации содержит подробное описание методик, использованных в работе, и условий проведения экспериментов.

Для экспрессии белка использовали плазмиду конструкции рЕТ23Ь(+) (Novagen), содержащую ген белка C-eRFl (аминокислотные остатки 276-437) с фрагментом, кодирующим аффинный таг из 6 гистидинов на С-конце. Экспрессию проводили в минимальной среде М9 под контролем промотера РНК полимеразы фага Т7. Выделение белка из супернатанта, содержащего растворимую часть клеточного лизата, осуществляли на Ni-NTA агарозной смоле, полученный белок далее очищали с помощью анионообменной хроматографии низкого давления на HiTrap SP колонках (GE Healthcare). Для получения образца, меченного изотопами 13С и/или 1SN, использовали [13C6]-D-nn0K03y и/или 15NH4C1 (Cambridge Isotope Laboratories Inc.) в качестве единственных источников углерода и/или азота при экспрессии белка в минимальной среде М9. Концентрация белка в конечных образцах для измерения спектров ЯМР составляла -1 мМ. Для поддержания постоянной величины рН 7.0 использовали 20 мМ фосфатный буфер. Для повышения стабильности образца ионную силу буферного раствора повышали, добавляя NaCl до концентрации 50 мМ. Для предотвращения окисления двух свободных остатков цистеина (в положениях 302 и 335), добавляли [i-меркаптоэтанол. Азид натрия в концентрации 0.01% использовали для подавления бактериального заражения образцов. Приготовленные образцы подвергали лиофилизации и хранили при -20°С. Перед проведением ЯМР экспериментов образец растворяли в 95% Н20 / 5% D20 или в 99.95% D20.

Спектры ЯМР измеряли на приборах Varian INOVA 600 и 800 MHz и Bruker AVANCE 600 и 700 MHz. Все спектрометры были оборудованы датчиками с возможностью одновременного возбуждения резонанса ядер 'Н, |3С и lsN, детектирования сигналов ядер 'Н и создания градиента магнитного поля по оси Z. Спектрометры 700 и 800 MHz были оснащены высокочувствительными криодатчиками. Для накопления одного 3D спектра требовалось в среднем от 24 до 72 часов. Проведено измерение серии 3D экспериментов ЯМР для отнесения сигналов атомов основной и боковых цепей белка (HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNHAHB, HBHA(CO)NH и HNHA при 298K и НССН-TOCSY при 313К). Для определения межатомных расстояний были измерены спектры ['H,15N]-N0ESY-HSQC (в 95% Н20) и ['H,13C]-NOESY-HSQC (в D20).

Измерены константы остаточного диполь-дипольного взаимодействия (КДДВ) белка в различных разбавленных анизотропных средах.

Лиофилизированный образец белка, меченного изотопом 15N, растворяли в 5% водных растворах смесей 1,2-дигексаноил-от-глицеро-З-фосфохолина с 1,2-димиристоил-5/г-глицеро-З-фосфохолином (соотношение DMPC/DHPC = 3 - 3.5) или в 5% водных растворах смесей алкил-полиэтиленгликоля Ci2E5 с п-гексанолом. Для изменения ориентирующих свойств жидкокристаллической среды бицеллы DMPC/DHPC модифицировали, добавляя к раствору отрицательно заряженный додецилсульфат натрия (SDS). Для измерения остаточных КДДВ накапливали спектры IPAP-['H,15NJ HSQC (In-Phase - Anti-Phase) полученных образцов в слабо ориентирующих средах, как в изотропных, так и в анизотропных условиях. Фазовый переход осуществляли путем изменения температуры среды и контролировали его по величине квадрупольного расщепления ядер дейтерия. Значения остаточных КДДВ измеряли по разнице величин расщепления сигналов в изотропных и анизотропных условиях.

Расчет структуры проводили в программе CNS в картезианских координатах. Для поиска семейства структур, наилучшим образом удовлетворяющих экспериментально полученным пространственным ограничениям (см. ниже), применялся метод моделированного отжига, а также алгоритм Пауэла для завершающей минимизации энергии структуры. В расчете использовались три типа ограничений: (1) Расстояния между протонами, определенные из интенсивностей кросс-пиков в трехмерных спектрах NOESY-HSQC; (2) Диэдральные углы (р и у, полученные из анализа величин химических сдвигов атомов С, Сое, На, HN и N белка CeRF 1 с помощью программы TALOS; и (3) Остаточные КДДВ между атомами HN и N основной белковой цепи, несущие информацию об ориентации амидных фрагментов. В результате проведенных расчетов получены семейства из 24 структур для каждого из конформеров С-домена eRFl. Структуры депонированы в банк данных PDB.

Для исследования динамики атомов основной белковой цепи измеряли скорости продольной Ri и поперечной R2 релаксации, а также величины гетероядерных эффектов Оверхаузера ISN{'H}. Анализ полученных данных выполняли с использованием безмодельного подхода Липари и Сзабо в программе Tensor-2.

Стабильность конформеров белка изучали при различных значениях рН (в диапазоне от 3.5 до 8.0), температуры (от 278 до 313К) и ионной силы раствора (концентрация NaC! 50 и ЮОтМ). Относительную населенность конформационных состояний определяли путем сравнения интенсивностей сигналов двух конформеров в 2D спектрах ['H,15N] HSQC.

Репрезентативные структуры рассчитанных семейств ЯМР С-домена eRFl определяли по критерию максимального приближения к средним координатам атомов по семействам. Выбранные структуры далее использовали для расчета длинных (от 100 до 200 не) траекторий молекулярной динамики (МД) в водном окружении в программном пакете Gromacs 4. Для обоих конформеров белка были рассчитаны траектории МД как при незаряженных остатках гистидина, так и с полностью протонированными имидазольными фрагментами всех гистидинов.

Поскольку в диапазоне рН от 4.7 до 7.0 гистидин является единственной аминокислотой, которая может менять состояние протонирования боковой группы (рКа 6.0), расчет динамики для двух различных состояний имидазольного кольца моделировал поведение белка в слабо кислой и нейтральной средах.

Исходные структуры для расчета траекторий МД полноразмерного eRFl были подготовлены путем достройки кристаллической структуры полноразмерного eRFl недостающими фрагментами мини-домена 329-372 и С-терминального фрагмента 414-437 взятых из репрезентативных структур ЯМР. Далее были рассчитаны 4 траектории по 60 не для открытого и закрытого конформеров, как для протонированного, так и для нейтрального состояний имидазольных фрагментов остатков гистидина.

Все расчеты проводились при температуре 300К. Перед началом расчета все структуры были минимизированы по алгоритму скорейшего спуска и далее уравновешены в растворителе (воде) с помощью метода динамики с ограниченными позициями (position restrained dynamics).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Отнесение сигналов в спектрах ЯМР

Отнесение сигналов атомов С-домена eRFl человека проводили по классическому методу, основанному на использовании гетероядерных 3D экспериментов ЯМР с переносом намагниченности посредством непрямого спин-спинового взаимодействия. Для отнесения сигналов атомов основной цепи использовали 3D спектры HNCA, HN(CO)CA и HNCO, для отнесения сигналов боковых цепей - спектры HCCH-TOCSY, HNCACB и CBCA(CO)NH.

Получены значения химических сдвигов 99% атомов 'Н, 13С и 15N основной белковой цепи. Не удалось сделать отнесение лишь сигналов 'Н и l5N амидных фрагментов остатков Asp277, Asn325 и Glu397, что связано с существенным перекрыванием сигналов на частотах резонанса этих ядер. Для атомов боковых цепей получено отнесение более 78% сигналов !Н, 13С и ISN.

Обнаружено удвоение сигналов для остатков находящихся во фрагменте 329-372 (а именно 333-344, 351 и 357-370, рис. 1). Этот факт является прямым доказательством присутствия двух конформаций белка в области мини-домена 329-372, который не был ранее разрешен в кристаллической структуре eRFl. Время конформационого перехода между двумя состояниями белка оказывается медленнее секунд или минут. Вместе с тем, следует отметить, что разделить два конформера методом гель-фильтрации не удается. Это может быть обусловлено либо тем, что скорость конформационного перехода лежит в минутной шкале времени, либо (что более вероятно) тем, что физические свойства двух конформеров слишком близки для их разделения этим методом.

Для большинства остатков мини-домена 329-372 разница химических сдвигов между удваивающимися сигналами достаточно велика (Рис. 2), что позволило получить отнесение сигналов для каждого конформера в отдельности.

Рисунок 1. Фрагмент спектра ['Н, Ы]- Рисунок 2. Величины разницы х.с.

Н8С>С. Обозначены удваивающиеся между конформерами для сигналов

сигналы. Сигналы второго конформера НЫ (А), На (В) и 15И (С) основной

отмечены символом*. белковой цепи.

Структура С-домена фактора терминации трансляции еЯР¡человека

Статистическая характеристика семейств структур ЯМР, включая величины средних квадратичных отклонений (СКО) координат атомов, представлена в таблице 1.

С-терминальный фрагмент 414-437

Рисунок 3. Репрезентативные структуры семейств открытого (А) и закрытого (Б) конформеров.

С-терминальный фрагмент 414-437

Детальный анализ >ЮЕ8У спектров позволил идентифицировать ряд ограничений на межатомные расстояния, различающиеся для двух конформеров белка. Кроме того, было установлено, что в 5% растворе фосфолипидных бицелл БМРС/ОНРС присутствует только один из конформеров (далее «открытый», Рис. ЗА), тогда как в разбавленной анизотропной среде, приготовленной на основе смеси СпЕз/п-гексанол, обнаружен только второй конформер (далее «закрытый», Рис. ЗБ). Это обстоятельство позволило получить величины остаточных КДДВ индивидуально для каждого конформера С-е11Р1 и на основании полученных данных определить их структуры.

Таблица 1. Статистические характеристики полученных семейств структур ЯМР С домена е1Ш человека.

Ограничения, использованные в расчетах

Открытый Закрытый Открытый Закрытый

Всего ЯЭО 1857 1852 КДДВ 'Ом, 90 69

Дальние (|Ч|>4) 497 490

Средние (1<|Н|<4) 332 332 Диэдральные углы 216 214

На соседние остатки (1НМ) 516 516 РЫ (ф) 108 107

Внутри одного остатка 512 514 РэЕ (V) 108 107

Нарушения ограничений (для ансамблей из 24 структур)

Отсутствуют нарушения ограничений на расстояния и диэдральные углы более чем на 0.2 А и 5й соответственно.

Среднее СКО по ансамблю Открытый Закрытый

Для экспериментальных ограничений

Расстояния (А) 0.017±0.001 0.019±0.004

Диэдральные углы (") 0.42±0.06 0.4±0.1

Для ковалентной геометрии

Связи (А) 0.0022±0.0001 0.0025±0.0005

Углы (") 0.43±0.01 0.49±0.09

% остатков в наиболее благоприятной области карты Рамачандрака 91.1% 85.5%

% остатков в запрещенной области карты Рамачандрана 0 0

Суперпозиция структур семейства на репрезентативную структуру

СКО по атомам С, Са, О и N остатков основной цепи 277328 и 373-413 (А) 0.42 0.42

Изображение репрезентативных структур двух рассчитанных семейств приведено на рисунке 3. В структурах обоих конформеров можно выделить три основных фрагмента: (1) структурное ядро белка (остатки 277-328 и 373-413) (2)

мини-домен 329-373; и (3) неструктурированный С-терминальный фрагмент 414 -437.

Структура основного ядра белка идентична в обоих конформерах. Она образована четырьмя [3-тяжами pi, |32, рб и Р7 (остатки 301-303, 320-323, 389-392 и 409-412 соответственно) формирующими единую Р-структуру белка, окруженную четырьмя а-спиралями al, a2, a4 и a5 (остатки 278-294, 305-313, 374-381 и 397-405 соответственно).

Структура мини-домена 329-372, координаты атомов которого отсутствуют в известных кристаллических структурах eRFl человека (коды PDB 1DT9 и 3E1Y), сформирована тремя антипараллельными р-тяжами ¡33, р4 и Р5 (остатки 329-335, 339-344 и 367-372 соответственно) и искаженной a-спиралью аЗ (остатки 348-356). Установлено, что элементы вторичной структуры мини-домена 329-372 для обоих конформеров практически идентичны. Наиболее существенными структурными различиями между конформерами являются положение искаженной a-спирали по отношению к Р-структуре и сопутствующий сдвиг петли 357-366 (Рис. 4). Положение боковой группы остатка His 356 также существенно отличается: в одном из конформеров (называемом «закрытым») имидазольный фрагмент пространственно сближен с отрицательно заряженными боковыми группами Glu 365 и Glu 367 (рис. 4Б), тогда как в другом конформере (называемом «открытым») боковая группа His356 расположена вблизи Asp353 и ароматических колец Туг 331 и Phe 357 (рис. 4А).

Рисунок 4. Структура мини-домена 329-372 в открытом (А) и закрытом (Б) конформерах. Указаны ограничения на расстояния, соответствующие пикам с существенно отличающейся интенсивностью для открытого и закрытого конформеров.

Фрагменты

5.

['H,15N]-NOESY

Рисунок

спектров НБОС открытого (левый) и закрытого (правый)

конформеров, в которых наблюдаются различия в интенсивностях сигналов.

Различные ориентации петли 357-366 по отношению к искаженной а-спирали соответствуют различным конформациям основной цепи Phe 357 (величины диэдральных углов составляют -60° ±3° (ф) и -38° ± 4° {у/) в открытом конформере и +57° ± 3° (ф) и +6° ± 4° ((//) - в закрытом), что полностью согласуется с наблюдаемыми различиями в интенсивностях ЯЭО HN357- HN358 в спектрах NOESY. Перестройка конформации основной цепи приводит к изменению расстояний между атомами остатков верхнего витка искаженной а-спирали, что также соответствует изменению ЯЭО в спектрах (Рис. 5). Наиболее существенно меняется расстояние между атомами HN338 - На353: кросс пик наблюдается только для открытого конформера, в то время как ЯЭО HN358 - На356 наблюдается в обоих случаях.

Структура петли 358-363 идентична в обоих конформерах, что подтверждается большим количеством интенсивных ЯЭО, соответствующих контактам между удаленными по цепи аминокислотными остатками. Конформация петли стабилизируется водородной связью между кислородом карбонильной группы Asp 359 и протонами HN Thr 362 и Gly 363, а также гидрофобным взаимодействием метальных групп остатков Thr 358 и Thr 362 и

Наблюдаемые температурные эффекты

Повышение температуры от 298 до 313К ведет к существенному снижению интенсивности кросс пиков ЯЭО от HN Gly 337, а также ЯЭО между атомами HN Thr358 На His356 и HN Thr338 - HN Glu339 в открытом конформере. При этом интенсивности аналогичных сигналов в закрытом конформере остаются неизменными. Такой эффект для сигналов Gly337 можно объяснить увеличением скорости обмена Рисунок 6. Структура петли 358-363. амидного протона с водой. Этот вывод Пунктиром обозначены водородные подтверждается наблюдением

связи, важные для стабилизации интенсивного обменного сигнала структуры петли. между резонансом HN Gly 337 и воды.

Уменьшение интенсивности кросс-пиков между соседними остатками для Thr338 и Thr358 обусловлено динамическими процессами. Указанные данные свидетельствуют о том, что при повышенной температуре петля 336-338, а также фрагмент 356-358 в открытом конформере оказываются более подвижными, чем в закрытом.

Для остатков His334, Leu368, 11е369 и Glu370 наблюдается существенное сужение линий и повышение интенсивностей сигналов HN кросс пиков при

СН2 протонов остатка Asp 359 (Рис. 6).

Gly363

увеличении температуры от 298 до 313К. Данный эффект объясняется ростом скорости конформационного обмена с повышением температуры, т.к. для этих остатков не обнаружено кросс пиков НТ^-растворитель. Н1з334 находится на центральном тяже р-листовой пластины мини-домена и пространственно сближен с остатками Ьеи368, 11е369 и С1и370, что объясняет одинаковый характер конформационных перестроек, происходящих в остатках, находящихся далеко друг от друга в аминокислотной последовательности белка.

Исследование стабильности конформеров

В спектрах ['Н/^-НБС^С наблюдалась незначительная разница в интенсивностях пиков различных конформеров в зависимости от образца, что является свидетельством приблизительно одинаковой населенности обоих состояний. Было проведено исследование стабильности конформеров в зависимости от температуры, ионной силы и рН раствора.

Обнаружено, что в диапазоне температур от 278 до 313К, а также при увеличении концентрации ЫаС1 в растворе от 50 до ЮОмМ оба конформера остаются стабильными, и сдвиг равновесия в сторону какой-либо одной формы не наблюдается. При изменении рН раствора в диапазоне от 6.0 до 8.0 также не наблюдается изменений населенности конформеров, однако, при понижении рН ниже 6.0 происходит медленная агрегация, которая существенно ускоряется при рН ниже 5.4. Процесс преципитации обратим, однако после рефолдинга белка из кислого раствора (рН 3.5) в смеси наблюдается только закрытый конформер. Важно отметить, что рН 6.0 соответствует рКа протонирования боковой группы имимдазольного кольца остатков гистидина. В аминокислотной последовательности С-еИЛ, используемой при экспресси белка, присутствует три остатка гистидина - 335, 356 и 366 в области мини-домена (если не считать аффинный таг из 6-ти гистидинов на С конце). Можно предположить, что состояние протонирования боковой группы остатка гистидина оказывает влияние как на баланс населенности конформеров белка, так и на их стабильность.

Также обнаружено, что относительная населенность конформационных состояний высоко чувствительна к природе ориентирующий среды, используемой для измерения КДДВ: в среде С|2Е5/п-гексанол устойчив лишь закрытый конформер, тогда как в БМРС/ОНРС присутствует 90% открытого конформера.

Динамические свойства белковой цепи С-домена еЯР1

Экспериментально определены релаксационные параметры ядер 15Ы (/?/, скорость продольной релаксации; скорость поперечной релаксации и величины гетероядерных ЯЭО 15Ы{'Н}). Рассчитаны параметры тензора вращательной диффузии. Экспериментальным данным наилучшим образом удовлетворяет модель полностью асимметричного тензора. Использование безмодельного подхода Липари-Сзабо позволило определить характер движений и параметры порядка для 15Ы атомов основной цепи белка, которые отражают амплитуду движения атомов 15Ы в пико-наносекундной шкале времени. Полученные величины параметров порядка приведены на рисунке 7.

Анализ данных показал, что наиболее подвижным фрагментом С-еКР1, помимо неструктурированного С-терминального фрагмента, является петля 357366. Важно отметить, что существенных отличий между конформерами в величинах Н2 и 15Ы{!Н} ЯЭО, измеренных при 298К, не наблюдается. Это означает примерно равную подвижность атомов основной цепи в двух состояниях при температуре измерений. Для атомов в области 357-359 наблюдается значительный вклад компоненты химического обмена в процесс релаксации (рис. 7Д). Это наблюдение согласуется со структурными данными, в соответствии с которыми основные конформационные изменения претерпевает именно этот фрагмент белковой цепи мини-домена.

280 300 320 340 360 330 400 420 440 Номер остатка

Рисунок 7. Результаты релаксационных экспериментов (А-В) и рассчитанные из этих данных параметры порядка (Г) и вклады конформационного обмена в скорость поперечной релаксации Ясх (Д) для С-домена eR.Fl человека. 14

Расчет молекулярной динамики С-домена eRFl

В связи с наблюдаемыми эффектами влияния рН среды на стабильность конформеров, представлялось необходимым провести расчет длинных (до 200 не) траекторий молекулярной динамики С-домена eRFl для каждого из конформеров белка и изучить влияние состояние протонирования боковых групп остатков гистидина на структуру и стабильность конформеров.

Все четыре рассчитанные траектории МД были стабильны в течение всего времени, что определялось по отсутствию значимых колебаний энергии, температуры, объема и плотности системы белка и растворителя.

При незаряженных имидазольных фрагментах остатков гистидина (рН 7.0) перехода между двумя конформационными состояниями белка не наблюдалось. Однако, в моделях с положительно заряженными боковыми группами гистидина открытый конформер переходил в закрытый в течение первых двух наносекунд. Конформационный переход определялся по изменению положения боковой группы остатка His356, которое однозначно характеризует каждый из конформеров. Вслед за изменением положения имидазольного кольца происходило постепенное изменение положения искаженной a-спирали. Вместе с тем, закрытый конформер с положительно заряженными боковыми группами гистидинов оставался стабильным до конца траектории МД (т.е. до 200 не).

Этот результат согласуется с экспериментальными данными, согласно которым после рефолдинга из кислой среды остается только закрытый конформер.

Конформация основного структурного ядра белка (остатки 277-328 и 373413) не претерпевала существенных изменений для обоих конформеров при каждом из двух значений рН среды. Об этом свидетельствуют низкие значения СКО при суперпозиции по всем тяжелым атомам основной цепи белка структур, соответствующих различным участкам траектории МД.

Конформация мини-домена 329-372 более лабильна. Его р-структура остается практически неизменной во всех траекториях, однако a-спираль, петля 357-366 и петля 336-338 проявляют значительную подвижность. При этом следует отметить тот факт, что в отсутствии протонирования остатков гистидина, петля 336-338 оказывается более подвижной в открытом конформере. Это наблюдение находится в полном соответствии с экспериментальными данными. Действительно, ЯЭО между HN338 и HN339, а также все сигналы от HN337 становятся менее интенсивными в открытом конформере при повышении температуры. Это указывает на меньшую стабильность этого структурного элемента в открытом конформере. Искаженная a-спираль также оказывается более подвижна в открытом конформере. В то же время подвижность петли 357366 оказывается несколько выше в закрытом конформере.

Протонирование остатков гистидина приводит к образованию более жесткой структуры мини-домена 329 - 372, что выражается в снижении СКО координат атомов белковой цепи. Важно отметить то, что во всех четырех

рассчитанных траекториях фрагмент, содержащий остаток His356, показывает сравнительно низкие значения СКО, что подтверждает предположение о важной структурирующей роли этого аминокислотного остатка.

С-терминальный неструктурированный фрагмент белка претерпевает высокоамплитудные движения, однако на некоторых участках траектории МД этот фрагмент располагался вдоль структурного ядра белка и удерживался там за счет зарядовых взаимодействий. Это взаимодействие приводило к некоторому искажению структуры белкового ядра, причем искажение оказывалось более заметным в моделях с протежированными остатками гистидина.

Анализ динамики С-домена eRFl методом разложения молекулярных движений на главные компоненты (Principal component analysis) показал, что все движения в белке можно условно разделить на два класса: 1) взаимное колебание основного структурного ядра белка и мини-домена 329-372 друг относительно друга как жестких фрагментов; и 2) колебания отдельных фрагментов молекулы.

Расчет молекулярной динамики полноразмерного eRFl

Все четыре траектории МД были стабильны на всем протяжении расчета. Как и при расчете траекторий МД изолированного С-домена, оба конформера были устойчивы в случае незаряженных остатков гистидина. При появлении положительного заряда на остатках гистидина только закрытый конформер оказался стабилен. Во всех случаях, когда наблюдалось взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRFl, интерфейс такого взаимодействия формировался главным образом аминокислотными остатками а-спирали 348-356, в то время как (3-ядро (остатки 329-335, 339-344, 367-372) находились на удалении от N-домена eRFl.

А Б В

закрытой конформацией мини-домена 329-372, (Б) Стартовая модель eRFl с открытой конформацией мини-домена 329-372, (В) Закрытый конформер с протежированными остатками гистидина в конце траектории МД (60 не).

Непротонированные остатки гистидина

Структуры eRFl как открытого, так и закрытого конформеров в отсутствии заряда на имидазольных фрагментах остатков гистидина не претерпевают существенных информационных перестроек. Однако в этом случае взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRFl наблюдается только для закрытого конформера. Это обусловлено различиями в ориентации искаженной альфа-спарали 348-356 в двух конформерах (рис. 8, А и Б). В закрытом конформере остатки Q350, Е351 и D353 этого фрагмента оказываются пространственно сближены с заряженными остатками R81, К106, К108 и К109 N домена eRFl, что приводит к электростатическому взаимодействию между ними. Важно отметить, что в ЯМР спектрах наблюдалось удвоение сигналов остатка Е351.

Из анализа траектории молекулярной динамики видно, что взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRFl в закрытом непротонированном конформере ведет к отдалению, но не сближению, фрагментов NIKS-GGQ за счет сближения N и С доменов белка.

Положительно заряженные остатки гистидина

При введении положительного заряда на все имидазольные фрагменты остатков гистидина открытый конформер переходит в закрытый во время молекулярной динамики. Структура закрытого конформера при этом претерпевает существенные конформационные изменения, которые ведут к сближению фрагмента NIKS в N-домене с трипептидом GGQ в М-домене (Рис. 8В). Так, расстояние между атомами Са остатков 11е62 и Gin 185 изменяется от 97.47 Â в начале расчета до 62.44 Â в конце траектории МД. Мини-домен 329-372 играет существенную роль в этом процессе. Этот вывод следует из следующих результатов:

1. Конформационная перестройка молекулы eRFl, приводящая к сближению фрагментов NIKS и GGQ, наблюдается только в случае протонированных (т.е. положительно заряженных) остатков гистидина.

2. Конформационная перестройка наблюдается только для закрытого конформера мини-домена 329-372. На траектории МД, где в качестве стартовой структуры была использована протонированная форма открытого конформера (переходящего в ходе молекулярной динамики в закрытый конформер) изменения взаимной ориентации N и M доменов eRFl не наблюдалось. Это обусловлено тем, что за время перехода мини-домена 329-372 из открытой формы в закрытую, он успевает удалиться от N-домена.

3. Взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRFl наблюдалось только на первых 30 не траектории, после чего начиналась медленная конформационная перестройка всей молекулы eRFl, приводящая к сближению фрагментов NIKS и GGQ.

Таким образом, взаимодействие доменов eR.Fl, является важным регулирующим элементом для конформационной перестройки белка. Следует также отметить, что интерфейс взаимодействия мини-домена 329-372 с И-доменом eR.Fl различается для протонированной и непротонированной формы белка (табл. 2).

Таблица 2. Остатки, формирующие интерфейс взаимодействия мини-домена 329-372 с И-доменом еЯР1.

Закрытый/непротонированный конформер Закрытый/протонированный конформер

Ы-домен Мини-домен 329-372 >1-домен Мини-домен 329-372

ап80, А^81, ЬувЮб, Ьуз108, Ьуэ 109, Абп1 11 С1п350, »11351, АБр353, (1^354) БегёЗ, вЫ03, «и 104, (ЬуэЮб) ЬуБ352,1^354, 8ег355, №356, 8ег371

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сравнение структуры С-домена еЯР1 в растворе и в кристалле

На данный момент в банке данных РБВ имеется две структуры С-домена еЯР1 человека - свободный белок (ШТ9), и в комплекс с еЯРЗ (ЗЕ1У). Обе структуры получены методом рентгеновской кристаллографии. В этих моделях хорошо разрешено центральное ядро С-домена (а.о. 277-328 и 373-413). Структуры двух конформеров С домена еЯР1 в растворе, полученные методом ЯМР, хорошо согласуются в области центрального ядра белка с обеими рентгеновскими структурами (СКО при суперпозировании по атомам С, Са и N фрагментов 277-328 и 373-413 репрезентативной структуры каждого конформера на рентгеновскую структуру ШТ9 составляет 1.58 ± 0.06 А). Вместе с тем, следует отметить, что в структурах еЯР1 в кристалле координаты атомов мини-домена 329-372 не определены. Таким образом, полученные в данной работе модели С-домена еИЛ человека впервые содержат информацию об этом фрагменте белка. Кроме того, впервые удалось установить и сам факт существования двух конформационных состояний еЯР1 в растворе.

Стабилизация конформеров С-домена еКР1

Населенность двух конформационных состояний С-домена еИЛ в растворе приблизительно равна, что следует из анализа интенсивностей сигналов ЯМР каждого из конформеров. Следовательно, энергии образования конформеров также приблизительно равны. Вместе с тем, энергетический барьер перехода между двумя конформерами велик, что следует из того факта, что времена жизни двух конформеров оказываются дольше секунд или даже минут. Точно оценить энергетические параметры не представляется возможным, поскольку при нагревании белка до температуры 313К не наблюдается коалесценции сигналов ЯМР или даже заметного их уширения.

Можно было предположить, что существование двух конформеров белка обусловлено процессами цис-транс изомеризации остатков пролина, как это достаточно часто встречается. Действительно, мини-домен eRFl содержит два остатка пролина в положениях 348 и 372. Однако удвоения сигналов ЯМР не наблюдается ни для указанных остатков пролина ни для соседних с ними аминокислотных остатков.

Другим фактором, способствующим стабилизации двух конформационных состояний белка, может являться взаимодействие боковых групп полярных аминокислотных остатков, которыми насыщен мини-домен 329-372. Из полученных экспериментальных данных следует, что для стабилизации закрытого конформера особенно важную роль играет взаимодействие имидазольного фрагмента остатка His356 с карбоксильными группами Glu365 и Glu367. В структуре открытого конформера боковая группа His356 сближена с карбоксильной группой Asp353 и ароматическими фрагментами остатков ТугЗЗ 1 и Phe357. Таким образом, конформация открытой формы может быть стабилизирована как за счет я-стэккинг взаимодействия ТугЗЗ 1-His356-Phe357, так и за счет полярного взаимодействия с карбоксильной группой остатка Asp353 (Рис. 4). В связи с высокой подвижностью мини-домена 329-372 определить положения боковых групп аминокислотных остатков с высокой точностью не представлялось возможным. Вместе с тем, последующий расчет траекторий МД позволил проверить все выдвинутые на основании данных спектроскопии ЯМР предположения in silico.

Так, было установлено, что на всей траектории расчета МД прямые полярные взаимодействия боковых групп аминокислотных остатков мини-домена или взаимодействия через молекулу растворителя играют ключевую роль в определении взаимной ориентации элементов вторичной структуры. Эти взаимодействия оказались важны и для стабилизации структуры петли 357-366 и а-спирали 348-356.

Фиксация имидазольного фрагмента His356 играет ключевую роль в определении ориентации а-спирали 348-356 относительно р-листовой пластины мини-домена. В структуре закрытого конформера имидазольное кольцо этого остатка участвует во взаимодействии с полярными группами а.о. 357-366 (как основной белковой цепи, так и боковых заместителей). Наиболее значимым оказывается взаимодействие имидазольного фрагмента His356 с карбоксильными группами Glu 365 и Glu 367 (Табл. 3, Рис. 9, А). При протонировании остатка His356 это взаимодействие усиливается, что приводит к сближению верхнего витка искаженной а-спирали 354-356 с р-листом 367-372 и формированию водородной связи C0355—HN368. Важным фактором структурной стабилизации оказывается и я-стэккинг взаимодействие ароматических систем остатков ТугЗЗ 1 и Phe357, которое, однако, ослабляется при введении положительного заряда на имидазольные группы остатков гистидина.

Открытый конформер устойчив только при отсутствии протонирования остатков гистидина. В этом случае имидазольный фрагмент His356 ориентирован

между ароматическими системами ТугЗЗ 1 и РЬе357 и располагается в гидрофобном кармане внутри структуры мини-домена (Табл. 3, Рис. 9, Б). Таким образом, положение Шз356 в открытом конформере стабилизируется в значительной степени за счет стэкинг взаимодействия ароматических систем. При введении положительного заряда, протежированному имидазольному кольцу Н1б356 гидрофобное окружение кармана становится менее выгодно, что приводит к конформационной перестройке белка в закрытую форму, в которой боковая группа №$356 позиционируется в окружение полярных остатков и при этом может быть эффективно гидратирована.

Агрегация белка при понижении рН ниже рКа имидазольного фрагмента остатков гистидина может быть обусловлена присутствием последовательности из шести гистидинов на С конце белка. Это предположение согласуется с результатами расчетов траектории МД: введение положительного заряда на остатки гистидинов в модельной структуре, содержащей только один гистидин на С конце, приводит к искажению конформации основного структурного ядра белка в результате взаимодействия С терминального гистидина с отрицательно заряженными аминокислотными остатками центральной части С домена eR.Fl человека.

Рисунок 9. Стабилизация положения имидазольного кольца гистидина 356 в закрытом (А) и открытом (Б) конформерах по данным расчета молекулярной динамики. Линиями показаны наблюдаемые взаимодействия.

А

Минидомен

Б

Минидомен

Таблица 3. Средние по траектории молекулярной динамики расстояния (А) между некоторыми группами боковых цепей остатков мини-домена 329-372

Закр./ Закр./ Откр./ Откр./

нейтр. прот. нейтр. прот.

His356 - Glu365 5.4 5.1 15.7 9.6

His356 - Glu367 7.0 8.8 13.8 10.8

Phe357 - Tyr331 5.0 9.4 7.9 5.0

Phe357 - His356 9.8 10.5 5.1 9.0

His356 - ТугЗЗ 1 12.8 14.5 6.0 13.3

" Для расчета расстояний использованы центры ароматических систем остатков His, Phe и Туг и центр карбоксильной группы остатков Glu.

Исследование диналшки атомов основной цепи

С-домен фактора терминации трансляции eRFl человека имеет достаточно сложную картину молекулярных движений. Анализ параметров релаксации ядер i5N показывает, что основное структурное ядро белка оказывается относительно жестким в растворе в широком интервале характеристических времен движений (от пикосекунд до секунд). Эти данные находятся в согласии с результатами рентгеновской кристаллографии для динамики белка в кристалле, а также подтверждаются расчетами молекулярной динамики. Мини-домен 329-372 eRFl более подвижен. Этот фрагмент существует в растворе в двух конформационных состояниях, причем переход между ними происходит в шкале времени от секунд и медленнее. Однако, амплитуды быстрых движений атомов основной белковой цепи мини-домена (в шкале времени от пс до не) сравнительно невелики, о чем свидетельствуют большие величины параметра порядка S", близкие по своим величинам к аналогичным значениям структурного ядра С домена eRFl.

Наиболее подвижными участками мини-домена 329-372 оказываются петли 333-339 и 357-366. Подробный анализ релаксационных данных для фрагмента 335-339 оказался невозможным из-за перекрывания сигналов в спектрах корреляции ядер 1SN и 'Н, однако аналогичные параметры для фрагмента 357-366 удалось измерить и проанализировать. Как видно из рисунка 7, петля 357-366 оказывается наиболее подвижным участком С-домена eRFl, если не считать С-терминальный неструктурированный «хвост» белка. Для этой петли характерны и более медленные движения, соответствующие конформационным перестройкам, протекающим в миллисекундной шкале. Об этом свидетельствуют величины Rcx, соответствующие вкладам химического обмена в скорость поперечной (спин-спиновой) релаксации ядер ISN аминокислотных остатков 357-359 (рис. 7Д).

Других значимых конформационных переходов, протекающих в милисекундной шкале времени, как и движений основной цепи белка со временами корреляции порядка 1 наносекунды, обнаружено не было. Не удалось

также обнаружить и существенных различий в относительной подвижности двух конформеров С-домена eRFl. Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами расчета молекулярной динамики.

Предполагаемая функциональная роль мини-домена 329-372 eRFl

Существует несколько белков, способных связываться с eRFl. Недавно было показано, что один из таких белков, фосфатаза РР2А, взаимодействует с областью 338 - 381 eRFl, которая почти точно соответствует минидомену. РР2А не влияет на эффективность процесса терминации трансляции, но играет важную роль в близко связанном процессе - NMD (nonsense-mediated decay), т.е. разрушении мРНК, в которой стоп-кодон в результате ошибки транскрипции находится в середине кодирующей последовательности. Многие детали того, каким образом eRFl участвует этом процессе, еще предстоит установить.

Основным партнером eRFl в процессе терминации трансляции является фактор терминации второго класса eRF3. Однако было показано, что интерфейс взаимодействия eRFl с eRF3, включает в себя кластер гидрофобных остатков Phe291, IIe294, Туг301, РЬеЗОЗ и Phe406, расположенных в удалении от мини-домена 329-372. Вместе с тем, полученные структурные данные указывают на вероятную близость мини-домена к N-домену eRFl, ответственному за узнавание стоп-кодонов. Проведенные расчеты молекулярной динамики полноразмерного белка eRFl показали, что мини-домен 329-372 действительно способен взаимодействовать с N доменом eRFl. Полученные результаты позволили предложить места точечных замен аминокислотных остатков мини-домена для определения их роли в процессе терминации трансляции. Исследование, проведенное в лаборатории структурно-функциональной геномики ИМБ РАН (зав. лаб. Л.Ю. Фролова) показало, что замены аминокислотных остатков, находящихся на верхушке мини-домена 329-372 на аланин, влияют на специфичность узнавания стоп-кодонов. Было установлено, в частности, что мутации Y331A, Н356А, F357A, D359A, G363A и Е365А приводили к увеличению терминационной эффективности eRFl при узнавании стоп кодона UAG, не влияя заметным образом на обработку стоп-сигналов UAA и UGA. При этом было показано, что такое изменение специфичности узнавания стоп кодонов обусловлено прямым взаимодействием мини-домена с N доменом и не связано с регуляторным действием eRF3.

Взаимодействие мини-домена 329-372 с N доменом eRFl может также оказывать влияние на подвижность трех доменов eRFl друг относительно друга и вызывать конформационные перестройки внутри молекулы белка. Как было показано выше, регуляторами таких конформационных перестроек могут быть состояние протонирования остатков гистидина и конформация мини-домена 329372. Расстояние между фрагментом NIKS в N домене (вероятным центром узнавания стоп кодона) и трипептидом GGQ в М домене (ответственном за гидролиз связи пептидил-тРНК) в кристаллической структуре eRFl по меньшей мере на 20А превышает расстояние между антикодоном и аминоацильной группой в тРНК. Многие исследователи предполагают, что для успешного

функционирования еЯР1 должна менять свою конформацию при образовании терминационного комплекса. Описанные выше расчеты МД позволили наблюдать именно такое изменение конформации белка, стимулированное состоянием протонирования остатков гистидтина и конформацией мини-домена 329-372. Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о роли мини-домена, как конформационного переключателя, способного влиять как на специфичность узнавания стоп-кодонов, так и на эффективность образования терминационного комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Проведено отнесение 99% сигналов ЯМР ядер 'Н, 13С и 15Ы основной белковой цепи и более 78% сигналов 'Н, 13С и 15Н боковых цепей аминокислотных остатков С-домена фактора терминации трансляции еЯР1 человека. Результаты отнесения депонированы в международный банк данных ВюК^ЯевВапк (код 15366).

2. Установлено, что С-домен eR.Fl человека существует в растворе в виде двух конформеров с приблизительно равной населенностью. Изучено влияние температуры, рН и ионной силы раствора на стабильность конформеров. Установлено, что при понижении рН ниже величины рКа имидазольных фрагментов гистидина, происходит денатурация белка. Рефолдинг белка из кислой среды приводит к образованию лишь одного конформера.

3. Определены структуры ЯМР высокого разрешения в растворе двух конформеров С-домена eRFl человека. Координаты атомов депонированы в банк белковых структур (коды 2КТ1Л и 2КТУ). Получены структуры обоих конформеров мини-домена 329-372, отсутствовавшего в опубликованных ранее рентгеновских структурах еРР1 человека. Установлена роль остатка Н1б356 в структурной стабилизации конформеров.

4. Методом ЯМР исследованы динамические свойства основной белковой цепи С-домена еРР1 человека. Установлено, что мини-домен 329-372 претерпевает медленные (в шкале времени от мс до минут) конформационные перегруппировки. В то же время, амплитуда движений белковой цепи мини-домена в шкале времени от пс до не сравнительно невелика, и лишь немного превышает подвижность атомов основного структурного ядра белка (а.о. 277328 и 373-413).

5. Для определения факторов стабилизации двух конформационных состояний мини-домена 329-372 и роли протонирования остатков гистидина в структурных перестройках белка, проведен расчет длинных (до 200 не) траекторий молекулярной динамики С-домена eRFl и полноразмерного белка. Установлено, что конформационное состояние мини-домена и состояние протонирования остатков гистидина стимулируют изменение взаимной ориентации доменов eRFl.

6. Полученные результаты позволили спланировать проведение функциональных исследований роли мини-домена 329-372 eRFl в механизме терминации трансляции. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что мини-домен играет роль конформационного переключателя, способного влиять как на специфичность узнавания стоп-кодонов, так и на эффективность образования терминационного комплекса.

Материалы работы изложены в следующих публикациях

1. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev, V.I.Polshakov, 2007, NMR assignments of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRFl, Biomol. NMR Assign., 1 (2), p. 183-185.

2. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev, V.I.Polshakov, NMR assignments of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRFl. Materials of the International Youth Scientific School "Actual problems of magnetic resonance and its application", 23-28 September, 2007, p. 137-139, Kazan, Russia.

3. А.Б.Манцызов, Е.В.Иванова, Б.Бирдсалл, Л.Л.Кисселев, В.И.Польшаков, ЯМР отнесения и исследование структуры С-терминального домена фактора терминации трансляции человека eRFl. Сборник тезисов XV конференции конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", 8-11 Апреля, 2008, с. 281, Москва, Россия.

4. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev and V.I.Polshakov, NMR assignments and structure investigation of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF-1. The proceedings of international conference EUROMAR, 6-11 July, 2008, p. 118, St. Petersburg, Russia.

5. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev and V.I.Polshakov, Structure determination of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF-1 by NMR spectroscopy. The proceedings of international conference of the International Conference "Advances in NMR of protein and nucleic acid molecular recognition", 16-18 October, 2008, p. 16, Murnau, Germany.

6. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev and V.I.Polshakov, Structure determination of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF-1 by NMR spectroscopy. The proceedings of international conference of the Joint NMR-Life and Extended-NMR Meeting "New approaches to biomolecular structure determination ", 27-29, October, 2008, p. 9, Berlin, Germany.

7. А.Б.Манцызов, Е.В.Иванова, Б.Бирдсалл, Л.Ю.Фролова, В.И.Польшаков. ЯМР структура С-домена белка фактора терминации трансляции человека eRF-1 в растворе. Сборник тезисов XVI конференции конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", 13-18 апреля, 2009, с. 21, Москва, Россия.

Заказ № 57-а/03/10 Подписано в печать 15.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

§1.1 Механизм терминации трансляции эукариот.

§ 1.2 Структура и функции еКР1.

Ы-домен.

М-домен.

С-домен.

§ 1.3 Структура и функции еКРЗ.

§ 1.4 Ключевые отличия механизма терминации трансляции в прокариотах и эукариотах

§ 1.5 Механизмы контроля ошибок трансляции и гомологи эукариотических факторов терминации трансляции.

Механизм ИМИ.

Механизм N00.

Механизм ЫБИ.

Гомология белков Иот34, НяЫр и 8к17р с факторами терминации транслтщи еЯЛ и еЯГЗ.

§ 1.6 Методы спектроскопии ЯМР для определения структуры биологических макромолекул в растворе.

Возможности и ограничения метода.

Определение структуры белка методом ЯМР.

Теоретические основы метода ЯМР.

Использование КДЦВ для определения структур биомолекул.

§ 1.7 Метод молекулярной динамики для исследования биомолекулярных систем.

Расчет молекулярной динамики с экспериментальными ограничениями.

ГЛАВА И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

§ 2.1 Материалы.

§ 2.2 Методы исследования.

Получение образцов.

Спектроскопия ЯМР.

ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ.

§ 3.1 Отнесение сигналов в спектрах ЯМР.

§ 3.2 Структура С-домена еИЛ.

§ 3.3 Температурный эффект.

§ 3.4 Исследование стабильности конформеров.

§ 3.5 Исследование динамики атомов основной белковой цепи С-домена

§ 3.6 Расчет динамики движения С-домена белка еШП.

Конформация основного ядра.

Конформация мини-домена 329-372.

Подвижность мини-домена при различных состояниях.

Динамика С-терминального фрагмента.

Стабилизация конформациймини-домена 329

§ 3.7 Расчет динамики движения полноразмерного белка еЫБ1.

Непротонированные боковые группы остатков гистидина.

Положительно заряженные боковые группы остатков гистидина.

Сравнение траекторий МДразличных конформеров еЯЕ1.

ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

§ 4.1 Сравнение ЯМР структуры С-домена с кристаллической.

§ 4.2 Стабилизация конформации мини-домена.

§ 4.3 Динамика атомов основной цепи С-домена еШП.

§ 4.4 Сравнение результатов расчета молекулярной динамики с результатами экспериментов ЯМР.

§ 4.5 Гомологи мини-домена ERF1 и консервативность аминокислотной последовательности.

§ 4.6 Рациональный выбор мутаций остатков мини-домена для изучения функциональной активности.

§ 4.7 Предполагаемая функциональная роль мини-домена 329-372 в процессе терминации трансляции.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Биосинтез белка на рибосоме по ¿матрице РНК (трансляция) является одним из важнейших биохимических процессов в клетке. Механизм трансляции находится в фокусе интенсивных исследований в течение последних пятидесяти лет. Актуальность таких исследований подтверждает, в частности, факт присуждения Нобелевской премии по химии 2009 года трем исследователям за их вклад в изучение структуры и функции рибосомы. Тем не менее, до настоящего времени установлены далеко не все детали механизма процесса трансляции. Наибольшее количество нерешенных вопросов связано с процессом трансляции в эукариотах. В частности, не определены многие ключевые аспекты механизма остановки биосинтеза белка (терминации трансляции) при достижении стоп-кодона мРНК. Известно, что ключевую роль в механизме терминации трансляции в клетках эукариот играют белки eRFl и eRF3, называемые факторами терминации трансляции (eukaryotic Release Factor) первого и второго класса соответственно. Белок eRFl проявляет структурно-функциональную мимикрию молекулы тРНК, и обеспечивает узнавание стоп-кодона, а также последующее освобождение синтезированного белка из терминационного рибонуклеопротеинового комплекса. Фактор терминации трансляции второго класса eRF3 является рибосомо- и eRFl-зависимой ГТФазой. Этот белок кодируется жизненно важным геном и необходим для стимулирования активности eRFl и повышения эффективности процесса терминации. Трехмерная структура eRFl человека была ранее определена в кристалле. Было, в частности, установлено, что белок состоит из трех доменов, соединенных гибкими линкерами. При этом каждый из доменов ответственен за определенную функцию. Так, N-терминальный домен играет ключевую роль в узнавании стоп-кодона, обеспечивая строго специфическое взаимодействие eRFl с каждым их трех возможных триплетов UAA, UAG и UGA. Средний (М) домен участвует в гидролизе связи между полипептидной цепью синтезированного белка и тРНК в пептидилтрансферазном центре 60S субъединицы рибосомы. Все функции С-терминального домена до конца не установлены, но было показано, что этот домен участвует во взаимодействии с eRF3. Это позволяет предположить для него регуляторную роль в процессе терминации трансляции. Фрагмент eRFl, состоящий только из М и С-доменов способен связываться с рибосомой эукариот и индуцировать ГТФазную активность eRF3. В то же время, фрагмент, состоящий лишь из N и М доменов, сохраняет функциональную активность полноразмерного eRFl in vitro.

Структура, динамика и функции С-домена eRFl изучены значительно меньше чем N и М доменов белка. Так, в рентгеновских структурах полноразмерного eRFl, как в свободной форме, так и в комплексе с eRF3, С-домен имеет обширные неразрешенные фрагменты. Очевидно, что установление структуры и исследование динамических свойств С-домена eRFl необходимо для понимания его роли в механизме терминации трансляции и определения молекулярных аспектов регуляции этого процесса.

Глава I. Обзор литературы § 1.1 Механизм терминации трансляции эукариот

Процесс терминации трансляции запускается в ответ на появление в А-сайте рибосомы термииационного кодона. Вновь синтезированный белок в этот момент находится в Р-сайте рибосомы, связанный сложноэфирной связью с 3' ССА концом молекулы тРНК. Результатом остановки биосинтеза белка является освобождение продукта трансляции из термииационного комплекса и рециклизация субъединиц рибосомы для нового раунда трансляции.

Ключевыми белками, участвующими в этом процессе в клетках эукариотических организмов, являются белки eRFl и eRF3, которые относятся к факторам терминации трансляции I и II класса соответственно. Фактор I класса eRFl непосредственно связывается с А-сайтом рибосомы и отвечает за распознавание стоп-кодона и последующий гидролиз сложноэфирной связи белок-тРНК в пептидилтрансфсразном центре большой субъединицы рибосомы. Эукариотические факторы терминации трансляции 1 класса являются омнипотентным и способны узнавать любой из трех стоп-кодонов AUG, UGA или UAA. Белок eRF3 содержит ГТФазный домен и необходим для регуляции процесса терминации трансляции.

Освобождение еЯРз-ГТФ (?) е р А Шаг 1 ЕРА Шаг 2 еРА Шаг 3 ЕРА Шаг4 ЕРА

Связывание eRFl, Транслокация/ Гидролиз ГТФ Освобождение белка eRF3 и ГТФ структурные перегруппировки

Рисунок 1. Схема процесса терминации трансляции в клетках эукариотических организмов (1). Комментарии в тексте.

Реконструкция терминации трансляции in vitro позволила детально изучить механизм протекания процесса (I). На первом этапе остановки биосинтеза белка происходит узнавание стоп-кодона белком cRPl и связывание eRFl, eRF3 и ГТФ с претерминационным рибонуклеопротеиновым комплексом (Рис. 1, шаг I). Осуществляется ли это связывание кооперативно или нет неизвестно, однако, было показано, что в растворе возможно формирование тройных и четверных комплексов eRFl*eRF3*rTO и eRFl*eRF3*rTO*Mg2+ (2). Взаимодействие белковых факторов и ГТФ с терминационным комплексом вызывает конформационную перестройку всего комплекса. Это ведет к частичной или полной транслокации кодона и антикодоновой петли тРНК в Е-сайт рибосомы (Рис. 1, шаг 2). Акцепторная петля тРНК вместе со связанным вновь синтезированным белком сохраняет свое положение в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Стоп-кодон попадает в Р-сайт. На данном этапе петля GGQ белка eRFl, играющая ключевую роль в катализе гидролиза сложноэфирной связи вновь синтезированный белок - тРНК, оказывается не оптимально расположена в пептидилтрансферазном центре. Для правильного позиционирования трипептида GGQ необходима дополнительная конформационная перестройка, которая происходит после гидролиза ГТФ в ГТФазном домене eRF3 (Рис. 1, шаг 3). Гидролиз ГТФ может вызывать как освобождение еКРЗТДФ из терминационного комплекса, так и изменение во взаимодействии eRFl - eRF3. Далее осуществляется гидролиз сложноэфирной связи и освобождение вновь синтезированного белка (Рис. 1, шаг 4). Заключительной стадией терминации трансляции является разборка комплекса и рециклизация субъединиц рибосомы. По последним данным важную роль в этом процессе играют белки факторы инициации трансляции eIF3, elFl, elFIA и eIF3j (3).

§ 1.2 Структура и функции eRF1

Первая структура с атомным разрешением полноразмерного белка eRFl человека (437 аминокислотных остатков) была получена методом рентгенеструктурного анализа (РСА) Н. Song и коллегами в 2000 году (4). Это достижение внесло существенный вклад в понимание механизма терминации трансляции.

Белок состоит из трех доменов, сочлененных гибкими линкерами, и проявляет структурно-функциональную мимикрию молекулы тРНК (Рис. 2А, Г). Выделяют N-терминальный, средний (М) и С-терминальный домены. Каждый из них несет строго определенные функции (4-6). А Б

N домен

NIKS

С домен

Область минидоменэ 329-372

Основное ядро С домена

276-328, 373-414 В

PVT

Антикодоновая петля

ССА 3'

Рисунок 2. А. Структура человека (4), Б. Структура гомолога eR.Fl, белка

Оош34 ЪассНаготусеь сегеу1$'юе (7), В. Структура прокариотического фактора терминации трансляции ШЛ из кристаллической структуры терминационного комплекса ТИеппиз гкегторкНих (8), Г. Структура молекулы тРНК БассИаготусез сегеушае (9).

N домен

С домен

М домен

N-домен

N-терминальный домен (1-141 остатки, нумерация по eRFl человека) может быть поставлен в соответствие с антикодоновой петлей тРНК (10, 11). Было показано (12-14), что консервативные последовательности NIKS (остатки 61-64) и YxCxxxF (остатки 125-131) этого домена являются критичными для узнавания стоп кодона и обеспечивают строго специфическое взаимодействие с каждым из трех возможных терминационных триплетов UAA, UAG и UGA.

Вместе с тем, механизм узнавания стоп-кодона до конца не изучен. Предполагается, что рибосома служит платформой для сборки комплекса мРНК-pPHK-eRFl и определяет геометрию расположения функциональных элементов молекул в области сайта связывания стоп-кодона (15). Непосредственно взаимодействовать с основаниями стоп-кодона могут как нуклеотиды рибосомальной РНК (16), так и аминокислотные остатки N-домена (14). Первое предположение подтверждается следующими экспериментальными данными: 1) нуклеотиды рРНК находятся в тесном контакте с основаниями тРНК (8, 17-19), 2) мутации в рРНК существенно влияют па терминацию трансляции и увеличивают процент сквозного прочитывания стоп-кодонов (20), 3) авторами (21) было показано, что в большой субъединице рибосомы прокариот имеются 2 петли в области сайта связывания стоп кодона, аналогичные по структуре антикодоновой петле тРНК, однако несущие последовательности, комплементраные стоп-кодонам.

Возможность непосредственного контакта остатков N-домена и мРНК обосновывается наблюдением специфических химических сшивок и результатами мутагенеза. Обнаружение химических сшивок между остатком лизина 63 и 4-тиоуридином, находящемся в первом положении терминационного триплета, позволило предположить, что инвариантные остатки IK консервативного фрагмента NIKS необходимы для опознавания первого уридина в стоп-кодоне (13). Также было показано (12, 22, 23), что введение мутаций во фрагменты NIKS и YxCxxxF фактора терминации трансляции человека существенно влияют на специфичность узнавания стоп-кодонов. Результаты работ (22, 23) свидетельствуют о том, что основную роль в узнавании адепозина во втором положении стоп-кодона играют остатки С127 и F131 фрагмента YxCxxxF, тогда как Y125 необходим для успешного узнавания нуклеозида в третьем положении.

М-домен

Средний (М) домен (142-275 а.о.) несет инвариантную последовательность GGQ (183-185 а.о.), необходимую для гидролиза связи между синтезированным белком и тРНК. Функционально он сопоставляется акцепторной петле тРНК (24, 25).

Важно отметить, что расстояние между фрагментами NIKS и GGQ в РСА структуре полноразмерпого белка eRFl превышает расстояние между соответствующими функциональными элементами тРНК более чем на 20 Ä. Данный факт позволяет предположить, что в процессе образования терминациопного комплекса молекула eRFl претерпевает конформационную перестройку, которая ведет к уменьшению расстояния между NIKS и GGQ (4, 26).

Гидролиз связи между вновь синтезированным белком и ССА 3' концом молекулы транспортной РНК происходит в пептидилтрансферазном центре (ПТЦ) рибосомы. ПТЦ располагается в большой субъединице между А и Р сайтами и является самым консервативным участком рибосомы. ПТЦ формируется исключительно нуклеозидами молекулы рРНК и не включает аминокислотные остатки рибосомальных белков (27).

На текущий момент предполагается, что гидролиз связи пептидил-тРНК осуществляется путем нуклеофильной атаки карбоксильного углерода сложноэфирной связи кислородом молекулы воды (Рис. 3) (4, 27, 28). Образуется тетр аэ д р ич с с к и й интермедиат. Далее происходит перенос протона на 2'(3')-гидроксил 3' концевого аденозина пептидил-тРНК и разрыв сложноэфирной связи. Для эффективного протекания реакции необходима правильная координация молекулы воды относительно объекта нуклеофильной атаки. Подобная каталитическая активность может проявляться как нуклеозидами рРНК, так и аминокислотными остатками М-домена eRFl, расположенными в ПТЦ. Известно, что самопроизвольный гидролиз сложноэфирной связи в ПТЦ протекает в отсутствии факторов терминации трансляции, однако его скорость очень невелика и составляет 1 реакцию на 14 часов для прокариотического терминационного комплекса (29). Многочисленные исследования функций субъединиц рибосомы показали (30-33), что поддержание корректной структуры ПТЦ необходимо для эффективного гидролиза связи пептидил-тРНК. Из этих данных следует предположение, что нуклеозиды ПТЦ рибосомы не осуществляют кислотно-основной катализ реакции и служит каркасом для координации ССА 3' фрагмента тРНК, GGQ петли eRFl й молекулы воды. С

С С

С он А

ОН он полипептид полипептид полипептид

Рисунок 3. Схема гидролиза сложноэфирной связи в пептидилтрансферазном центре большой субъединицы рибосомы (27).

Петля вСС) М-домена еМЧ располагается непосредственно в ПТЦ (8, 14). Было показано, что мутации любого из двух остатков глицина трипептида приводят к подавлению гидролиза сложноэфирной связи, по не влияют па способность сИЛ связываться с претерминационным комплексом (25, 29, 34, 35). Предполагается, что данные остатки глицина играют структурирующую роль и опосредуют правильное расположение петли в ПТЦ. Функция глутамина до конца не ясна. Предположение о том что именно этот остаток координирует молекулу воды (4) плохо согласуется с экспериментальными данными, согласно которым мутации (^1850 и (^18511 (нумерация по еЯН человека) приводит к снижению активности еЯР 1 т VI(го лишь на 50% (34). Однако, любые мутации остатков этого фрагмента как в эукариотах так и в прокариотах оказывались летальными (4, 36).

Интересно отмстить, что факторы терминации трансляции первого класса Е. соП (37) и йсегвушае (38) подвергаются пострансляционному процессингу и оказываются метилированы по N8 положению глутамина петли ССС). В клетках дрожжей метилирование осуществляется в цитоплазме. Метилтрансфераза, представлена в виде гетеродимера двух белков: каталитической субъедииицы YDR140w и цинк связывающего белка YDR046w (39). Процесс протекает только в присутствии eRF3 и является существенным для поддержания терминационной активности фактора. Метилирован ли человеческий eRFl неизвестно. Этот вопрос будет дополнительно прокомментирован в обсуждении результатов данной работы.

С-домен

Структура и функции С-теминального домена eRFl (276-437 остатки) наименее изучены. C-eRFl можно разделить на три структурных субдомена: основное ядро 276328, 373-413, мини-домен 329-372 и С-терминальный неструктурированный фрагмент 414-437. На данный момент существуют 2 экспериментальные структуры С-домена: одна в составе свободного полноразмерного белка eRFl (код в банке данных PDB 1DT9), другая - в составе eRFl в комплексе с eRF3 (3E1Y). Обе модели получены методом РСА и в обеих для С-домсна определены только координаты атомов основного ядра. Существование мини-домена 329-372 было показано в данной работе.

C-eRFl играет регуляторную роль в процессе терминации трансляции. Он необходим для успешного связывания С-домена eRF3 (40, 41) и совместно с М-доменом стимулирует ГТФазпую активность eRF3 (1, 42, 43). Методом изотермической калориметрии было обнаружено (44), что индивидуальный М-домсн также способен связываться с eRF3, однако константа ассоциации этого взаимодействия приблизительно в 2 раза ниже, чем для С-домена. N-домен с eRF3 не взаимодействует. Удаление С-домена увеличивает, но не уменьшает эффективность терминации трансляции in vitro (5). Этот факт говорит о сложном механизме регуляции активности, который может выходить за рамки взаимодействия с eRF3.

Исследование связывания eRFl и eRF3 с помощью методов делеционного и двухгибридного анализа показало (40), что остатки 281-305 и 411-415 основного ядра C-eRFl необходимы для обеспечения высокой афинности взаимодействия. В то же время, в недавно полученной кристаллической структуре комплекса eRFl и С-домена eRF3 (45) интерфейс межбелкового взаимодействия формируется другими остатками, которые располагаются в области а-спиралей 276—296 и 396-406 основного ядра СeRFl. Наблюдаемое расхождение экспериментальных данных объясняется тем фактом, что остатки 300-303 и 411-415 образую тяжи центральной (3-листовой платины и необходимы для стабилизации структуры основного ядра С-домена. Дестабилизация структуры, вызванная делецией остатков 281-305 и 411-415, приводит к потере способности C-eRFl связывать eRF3. Это предположение подтверждается исследованием мутанта С-домена eRFl дрожжей (46), согласно которому мутация Y410S приводит к искажению структуры С-домена.

Остатки С-терминального фрагмента 416-437 не оказывают существенного влияния на взаимодействие eRFl и eRF3 человека, однако в почкующихся и делящихся дрожжах последние 22 остатка с С-конца необходимы для высоко афинного связывания с eRF3 (47,48).

Функциональная роль мини-домена 329-372 не определена. Фрагмент не участвует в связывании eRF3, однако располагается вблизи N-терминального домена eRFl. Данные моделирования молекулярной динамики свободного eRFl показали, что остатки мини-домсиа могут взаимодействовать с остатками N-домена (49). Эти данные согласуются с результатами моделирования структуры эукариотического треминационного комплекса (50), в соответствии с которыми мини-домен взаимодействует с N-доменом, находясь в А-сайте рибосомы. Необходимо отметить, что исходной структурой для моделирования в обоих случаях являлась РСА структура eRFl 1DT9. Координаты подавляющего большинства атомов мини-домена в этой структуре не определены. Авторы расчетов достраивали не достающие фрагменты белка неструктурированными элементами аминокислотных последовательностей. Таким образом, к полученным результатам в отношении миии-домена необходимо относиться критически.

Ранее было обнаружено (51, 52), что каталитическая субъединица белковой фосфатазы РР2А выделяется из клеток скелетных мышц кролика совместно с белком eRFl. Методом двухгибридного анализа было показано, что остатки 338-381 C-eRFl, в точности соответствующие области мини-домена, необходимы для успешного связывания РР2Ас. Функциональная роль этого взаимодействия не ясна. Несмотря на наличие сайтов фосфорилирования, уровень фосфатов в eRFl in vitro достаточно низок. Фосфорилирован ли белок in vivo неизвестно. Связывание PP2Ac-eRFl не влияет на терминацию трансляции, однако это взаимодействие может быть важным для другого процесса, который тесно связан с терминацией трансляции, и осуществляет деградацию мРНК, содержащую неверные, позиционно ранние стоп-кодоны (Nonsense Mediated Decay - NMD). Более подробно процесс NMD обсуждается ниже.

Важно отметить, что, несмотря на консервативность остатков основного ядра С-домена, фрагменты мини-домена, и особенно С-терминальиого «хвоста», проявляют высокую изменчивость первичной структуры (53). У некоторых представителей архей, факторы терминации трансляции aRFl которых гомологичны эукариотическим белкам eRFl, вставка на месте мини-домена вообще отсутствует.

Из выше сказанного видно, что функциональная роль C-eRFl не ограничивается связыванием eRF3 и, возможно, выходит за рамки процесса терминации трансляции.

§1.3 Структура и функции eRF3

Рисунок 4. Структура фактора терминации трансляции II класса eRF3 S.pombe (54).

N те после

ГТ< д

С домен

Пост-G домен

Эукариотический фактор терминации трансляции 2 класса eRF3 кодируется жизненно важным геном (55). Несмотря на высокую гомологию первичных структур eRFl и aRFl аналога eRF3 в архебактериях не найдено. У млекопитающих обнаружено 2 формы белка, различающиеся длинной последовательности аминокислот на N-конце (56, 57). В экспериментах ш vivo (57) было показано, что уменьшение уровня eRF3a приводит к повышению количества сквозных прочитываний стоп-кодона. Для формы eRF3b подобного эффекта не наблюдается. Из этих данных следует, что eRF3a с укороченным N-концом играет ключевую роль в процессе терминации трансляции в исследованной клеточной линии, однако это не исключает возможности, что длинная форма несет главенствующую функцию в других типах клеток. На настоящий момент смысл присутствия двух форм белка остается не до конца ясен.

Структурно cRF3 состоит из N-терминального неструктурированного фрагмента, ГТФазного, пост-ГТФазного и С-терминального доменов (Рис. 4) (26, 54). Белок проявляет высокую структурную гомологию с факторами элонгации EF-TU и eEFla (53, 54).

N-терминальный «хвост» неконсервативен. Длина может меняться от полного отсутствия (Giardia lambliá) до 321 а.о. (Leishmania major) (53, 58). В некоторых видах водорослей N-концевой фрагмент содержит повторы из а.о. Q, G, N и Y и в ряде случаев обладает прионогенными свойствами. N-домен не участвует в терминации трансляции, однако необходим для связывания РАВР (poly A binding protein - поли А связывающий белок) на 3' конце мРНК (59) (60). Это взаимодействие приводит к формированию РНК-белкового комплекса (A)*PABP*eIF4F*cap, который позволяет получить циркуляризованную мРНК и опосредует рециклизацию субъединиц рибосомы для нового этапа трансляции (61). Также было показано, что eRF3 участвует в инициации процесса деаденилирования и деградации мРНК после терминации трансляции, причем удаление N-терминального фрагмента ведет к существенному снижению скорости деаденилирования (62).

ГТФазный домен eRF3 является структурным гомологом ГТФазных доменов таких белков как EF-TU, eEFla и Ras и относится к семейству G-белков. Пост-ГТФазный и С-терминальный домены обладают характерной ß-барельной укладкой третичной структуры (54). С-терминальный домен является основным участком связывания eRFl и несет высоко консервативную последовательность 641GRFTLRD647 (нумерация по белку S.pombé), необходимую для успешного взаимодействия C-eRFl и C-eRF3 (54, 63, 64). ГТФазный и ß-барельные домены играют важную функцию в процессе контроля ошибок трансляции мРНК, являясь основным участком связывания Upf белков NMD комплекса (60, 65). eRF3 выполняет ряд других функций и может участвовать в контроле организации цитоскелета (66) и регуляции апоптоза, взаимодействуя с белками -ингибиторами каспаз (67).

§ 1.4 Ключевые отличия механизма терминации трансляции в прокариотах и эукариотах

Выравнивание аминокислотных последовательностей факторов терминации трансляции I класса различных организмов показало, что эти белки являются универсальными в рамках надцарства эукариот (eRF1) и прокариотического царства архей (aRF1), однако факторы терминации трансляции прочих прокариот не проявляют гомологии первичной структуры с эукариотическими eRF1 (53).

В отличие от эукариотических организмов и архей, бактерии имеют два фактора терминации трансляции (RF1 и RF2) с перекрывающейся кодонной специфичностью: оба белка способны узнавать стоп-кодон UAA. Кроме того, RF1 узнает кодон UAG, а RF2 — UGA (68). Белки не проявляют значимой гомологии аминокислотных последовательностей с эукариотическим eRF1, что свидетельствует о различных и, вероятно, независимых путях эволюции эукариотических и прокариотических факторов терминации трансляции (5, 53). Единственный фрагмент, инвариантный в факторах первого класса всех живых организмов, это трипептид GGQ, играющий ключевую роль в гидролизе связи белок-тРНК (25). В то же время, RF1 и RF2 обладают между собой высокой гомологией как первичной так и третичной структур. Аналогично эукариотическим белкам, RF1 и RF2 проявляют структурную и функциональную мимикрию молекулы тРНК, однако структурной гомологии с eRF1 не наблюдается (8). Стоп кодон распознается в декодирующем центре RF, содержащем последовательность PA(V)T/SPF (69). В бактериях данные фрагменты известны как пептидный антикодон и непосредственно участвуют в декодировании нуклеотидов мРНК (69). В отличие от eRF1, свободные RF1 и RF2 в кристалле находятся в закрытой конформации и расстояние между функциональными фрагментами GGQ и PA(V)T/SPF составляет 25Â (70). Однако, в кристаллической структуре претерминационного комплекса RF1 и RF2 присутствуют в открытой конформации, напоминающей по геометрии молекулу тРНК: расстояние между функциональными трипептидами соответствует расстоянию между стоп-кодон опознающей петлей и ССА концом тРНК и составляет 75 Â (8). Интересно отметить, что исследование методом малоуглового рассеяния (Small-angle X-ray scattering -S AXS) показало, что в растворе свободный RF1 Е. Coli также находится в открытой конформации (71).

RF3 является прокариотическим фактором терминации трансляции И класса. RF3 содержит ГТФазный домен и оказывается гомологичен eRF3 : процент гомологии между RF3 E.Coli и eRF3 S.Pombe составляет 17.1% (54). В отличие от эукариот, ген белка RF3 не является жизненно важным (29). Тогда как eRF3 необходим для быстрого гидролиза связи пептидил-тРНК, RF3 увеличивает скорость освобождения RF1 или RF2 (1). После освобождения белка терминационный комплекс служит в качестве фактора обмена гуаниновых нуклеозидов и вызывает обмен ГДФ на ГТФ в составе RF3 (19). Это в свою очередь приводит к повышению афинности RF3 к рибосоме и способствует освобождению RF1 и RF2 (72). Далее следует RF3-опосредованный гидролиз ГТФ и диссоциация RF3. Белковый фактор RRF способствует рециклизации субъединиц рибосомы (17). В отсутствии RF3 скорость освобождения RF1 или RF2 снижается приблизительно в 5 раз, вероятно с этим фактом связано отсутствие летальности у RF3 делеционных мутантов (19, 29).

§ 1.5 Механизмы контроля ошибок трансляции и гомологи эукариотических факторов терминации трансляции

Механизмы контроля ошибок трансляции тесно связаны с процессом терминации трансляции и в зависимости от причины возникновения ошибки могут задействовать как непосредственно факторы терминации трансляции, так и гомологичные им белки. На текущий момент известны три механизма контроля ошибок процесса трансляции эукариот.

Механизм NM D

Уже упоминавшийся выше, механизм NMD отвечает за распознавание ошибочных стоп кодонов, образовавшихся в результате мутаций ранее нормального расположения стоп-кодона. Факторы терминации трансляции eRF1 и eRF3 формируют основу для сборки NMD белкового комплекса, который инициирует деградацию аберрантной мРНК (73, 74). Предполагается, что данный механизм защиты от синтеза укороченных белков функционирует только в эукариогических организмах, т.к. в архебактериях не обнаружено гомологов eRF3.

Распознавание мутаптпого стоп-кодона в клетках млекопитающих происходит с помощью специфического белкового комплекса EJC (Exon Junction Complex), находящегося на местах сшивок экзонов мРНК. EJC необходимы для посттранскрипционной регуляции мРНК. Тогда как природные стоп-кодоньт находятся в последнем экзоне мРНК, преждевременные кодоны обычно располагаются за 50-55 нуклеозидов выше последней сшивки экзопов. В случае отсутствия преждевременных стоп-кодопов EJC удаляются после первого раунда трансляции. Если мутаптиьте стоп-кодоны имеются, то EJC служит маркером для сборки NMD комплекса на терминационном рибонуклеопротеиновом комплексе, находящимся на мутантном стоп кодоне выше EJC (75, 76). Вероятно, развитию NMD способствует также отсутствие контакта eRF3 с PA BP, которое происходит если терминационный комплекс находится близко к полиадениновому кэпу (75, 77).

Ключевую роль в NMD играют белки Upf 1 р и Smg1, образующие комплекс с eRF1 и eRF3 на начальных этапах NMD (65, 73, 78, 79), а также Upf2p и Upf3p, связывающиеся с EJC (80). Upf 1 р является РНК хеликазой, активность которой регулируется фосфорилированием. Для фосфорилирования Upf 1 р необходимы белки Upf2p и Upf3p, процесс катализируется киназой Smg1 (77, 81, 82). Дефосфорилирование Upf 1 р осуществляется фосфатазой РР2А, данное взаимодействие опосредуется белками NMD комплекса Smg5, Smg6 и Smg7 (83). Как упоминалось ваше, каталитическая субъединица РР2Ас обладает способностью связывается с мини-доменом 329-372 eRF1. Upf 1 р взаимодействует с eRF1 в неопределенном сайте. Два других белка NMD комплекса, Upf2p и Upf3p, конкурируют с С-доменом eRF1 за связывание С-домена eRF3 в процессе развития NMD (65).

Определение терм инационного кобона как предварительного

Фосфорипирова ние ирп

AUG

Дефосфорипирование Upfi к

Деградация mRNA

Стабильная структура на мРНК

AUG I

РяЬ1

AÁAAA.

Остановка трансляции Pabi

AUG

О—Г

AUG

РвЫ

-АЛАЛА.

У V Эндонуилеаэное

X расщеп пенив мРНК

3'-*- 5'деградация 5'-»- 3' деградация

AUG

SWT: Xmi

Эиосома В

AUG

Рибосома остановилась на 3' конце мРНК

Декапирование

Ski7 : Связывание экзосомы

Ski7 :

5'— 3' деградация з'— 5' деградация

Ь—i

Аиа В

5W7 :

Эсхкома

Рисунок 5. Схемы механизмов контроля ошибок трансляции. A. NMD, Б. NGD, В. NSD (79, 84).

Механизм NMD представлен на рис. 5А. На первой стадии белки Upf 1 р и Smg1 связываются с eRF1 и eRF3 термипационного комплекса, находящегося tía предварительном кодоне (79). Далее Upf 1р взаимодействует с Upf2p и Upf3p, которые

Узнавание термин а ииомного кодона связаны с находящимся ниже по последовательности мРНК EJC комплексом (77). Это взаимодействие ведет к фосфорилированию Upflp киназой Smgl. Фосфорилированный Upflp узнается белками Smg5-7, которые предположительно являются посредниками между белками NMD комплекса и клеточным механизмом деградации мРНК. Связывание белками Smg5-7 фосфатазы РР2А ведет к дефосфорилированию Upflp и его рециклизации. В организмах млекопитающих деградация аберрантной мРНК начинается с декепирования/деаденилирования, последующая деградация обеспечивается белками экзонуклеазами Xrnl, Rati и экзосомой. Взаимодействие рибосомы и экзосомы опосредуется белком Ski7p (84).

Интересно отметить, что белки Smg5, Smg6 и Smg7 являются гомологами субъединицы Estlp теломеразы дрожжей S.cerevisiae (85, 86).

Механизм NGD

Второй механизм контроля ошибок мРНК, No-Go Decay (NGD), активируется в случае если рибонулеопротеиновый комплекс не может преодолеть прочную шпильку на матричной РНК в процессе элонгации (Рис. 5Б). Два белка играют ключевую роль в этом механизме: Dom34 (который иногда также называют Pelota) и Hsbl (87, 88). Предполагается, что Dom34 непосредственно взаимодействует с A-сайтом рибосомы, аналогично eRFl. Белки Dom34 и Hsbl проявляют структурную и функциональную гомологию с факторами терминации трансляции eRFl и eRF3 соответственно (53). Аналогично eRF3, в архебактериях не обнаружено аналога Iisblp (53).

В отличие от остальных обсуждаемых здесь механизмов контроля ошибок терминации трансляции, в NGD происходит разрезание мРНК в области остановки трансляционно активной рибосомы (89). Образовавшийся 3' продукт далее разрушается с помощью Xrnl, тогда как деградация 5' продукта осуществляется экзосомой. Как и в случае NMD, взаимодействие с экзосомой происходит с привлечением Ski7p (89).

Механизм NSD

Третий путь, отвечающий за контроль терминации трансляции (Рис. 5В), активируется если на матричной РНК отсутствует стоп-кодон (Non-Stop Decay - NSD) (90). Механизм NSD полностью отличается от NMD и NGD и задействует белок Ski7p на первом этапе развития. С-терминальная часть белка Ski7p, содержащая домен, гомологичный ГТФазному домену eRF3, связывается со свободным А-сайтом 80S рибосомы, которая находится на самом 3' конце мРНК (90). N-терминальный домен Ski7p необходим для взаимодействия с экзосомой, которая опосредует деградацию аберрантной мРНК (91).

На текущий момент этот путь контроля качества мРНК обнаружен только в клетках человека и дрожжей Saccharomycetes (84). Существует предположение, что в прочих эукариотах функции Ski7p может выполнять белок Hsblp (87).

Гомология белков Dom34, Hsblp и Ski7p с факторами терминации трансляции eRFl и eRF3

Гомология белков Dom34 и eRFl

Согласно текущей классификации Pfam, Dom34 относится к семейству eRPl-аналогичных белков (92). Он состоит из трех четко разделенных доменов: N-терминального, среднего (М) и C-терминального (Рис. 2Б). Значительное структурное сходство наблюдается между М и С доменами eRFl и соответствующими доменами Dom34. Однако, М-домен Dom34 не имеет аналога петли GGQ, что позволяет предположить, что гидролиза пептидил - тРНК связи в процессе NGD не происходит. Аналогично функции C-eRFl связывать eRF3, C-терминальный домен Dom34 участвует в связывании Hsblp. N-терминальный домен обладает характерной Sm-укладкой третичной структуры, которая часто встречается в функциональных фрагментах белков, необходимых для опознавания шпилек на мРНК, а также привлечения аппарата деградации мРНК. Предполагается, что N-домен может обладать эндонуклеазной активностью и необходим для разрезания мРНК. В то же время N-Dom34 не гомологичен ни одной из известных эндонуклеаз. N-домен не проявляет гомологии с Ы-доменом eR.Fl, что говорит об отсутствии кодон-распознагощего аппарата у Оогп34 и, как следствие, отсутствии кодонной специфичности процесса N00 (7, 93, 94).

ОопиЗ 4 - 3-с» г *

А-дозвур!1

К-1асЫа

С-д1аЬгаЪа

0-Ъапа«пи

С~а1Ыс«па

3-рояЬ»

Л-пост/едАсиа

В-1аигиа

М-«иаси1иа

Х-ггор1са11а

Л-доззури.

С-д1«Ьга(а

С-«1Ь1с«лз

5-розаЬ*

К-погл^кии

Й-Шипи И-яивси1иа Х-С юр1Са! 1 •

Н-9вр1«ПЗ

Н-ЖЛрХФПЖ

Е)«1|]4-5-С9Г#

К- 1асс 13

С-д1аЬса1а

О-Ьапзопи

С-в1&1сап«

3-ропЬе

Й-поп/*д1сиа

В-Саигиа

Н-тиэси1из

0-гаа1аподазг*1; Н-мр1ело

А-доэауо11

К-исги

С-?1аЬгаг.а

О-Ьапаел1 а С- а1ЬIсапа 5-рояЪ«

-г*иги» Н-ви9Си1иЭ Х-ггор1с«11а

И-аар1«пэ

Н-злр1тпя Ж х

Р1с К

Р1 с

01. £

1ТЕ^гс»* фок

Г.Ь V - г - Ю- !■ . кь - в

Е1, ко. и 1с |>::>р.

К1с вИлл .(.-'„'гВ; £ .

1> х> о ге и Ъ о £

В | ги . ^ : :

Рисунок 6. Выравнивание аминокислотных последовательностей с учетом структуры для белков С-доменов Оот34 и еКР1. Элементы вторичной структуры показаны над последовательностями Оот34 и под последовательностями еИТ 1. Строго консервативные остатки отмечены белыми буквами на черном фоне. Частично консервативные остатки отмечены рамкой. (53)

ПК

3 10

ПВО зк дал. эзо щлд

О V N V ОГЛЕ 01АУ О г Г Е

01ЛТ .ЪУАТ 1>УАТ . РУАТ БУРТ . 0У51 1.|РУ»Т

ПТтб што шзо

L1.IT 8

ГМ1ТС

1МУ5С1 ьчео

1.1130

11»В 1.1,110

I.1. УТР

II,150

Гомология С доменов eR.Fl и Оот34

Выравнивание аминокислотных последовательностей С-доменов еШ<Т и Оош34 приведено на рисунке 6. В соответствии с гомологией первичных структур наблюдается сходство вторичной и третичной структур для фрагмента основного ядра белков (277-328, 373-413 остатки еИЛ) (7, 53, 93). Гомологичные фрагменты последовательностей высоко консервативны. Особенно это касается последовательностей С-еКЛ 281-305 и 41101Ы1У415 (соответственно 278-302 и

370 3 74

С1ЬКУ в белка дрожжей Басскаготусез сегеугягае Бот34) (93). Как было сказано выше, эти аминокислотные остатки играют структурирующую роль в человеческом С-еМ7! и поэтому важны для связывания еКРЗ.

Белок Оош34 не содержит аналога мини-домена 329-372 человеческого С-еКР1 (53). Это согласуется с данными о том, что мини-домен не играет роли в связывании еКРЗ, т.к. предполагается что взаимодействие НэЫр и Оот34 происходит аналогично. Необходимо отметить, что отсутствие мини-домена у Оот34 может быть также связано и с отсутствием кодонной специфичности связывания мРНК в N00. Как было упомянуто выше, мини-домен теоретически может взаимодействовать с N-eR.Fl из чего можно предположить, что это взаимодействие способно влиять на узнавание остатками ^домена стоп-кодона.

Для С-терминального неструктурированного фрагмента Бот34 характерна высокая вариабельность аминокислотной последовательности (53).

Гомология белков Н$Ыр, 8М7р и еЛГЗ

НэЫр совместно с е1^3, 81а7р и еЕР1а являются белками семейства ЕР1 (53). Аналогично cRFЗ, НэЫр и 8к17р состоят из ^терминального, ГТФазного, пост-ГТФазного и С терминальный доменов (53, 54, 58, 95). ^терминальный домен не проявляет высокой гомологии первичной последовательности и существенно варьируется по длине. ГТФазный, пост-ГТФазный и С-терминальный домены НбЫ, напротив, высоко консервативны, что характерно для большинства членов семейства ЕР1 (53, 95). Особенно высокий уровень гомологии наблюдается для ГТФазного домена (96). Консервативность С-домена ниже. С-домсн НэЫр отвечает за связывание

С-домена Оот34. Аналогично еИР1 и еРРЗ, Оот34р и НэЫр способны образовывать тройные комплексы Эот34р* НэЫ р* 6ТР в растворе (93).

Белок Бку7р может быть представлен как измененный вариант НэЫр. Он показывает меньшую степень консервативности и содержит вставки в первичной структуре негомологичные еИРЗ. Особенно низкой оказывается гомология пост-ГТФазного и С-терминального фрагментов.

§ 1.6 Методы спектроскопии ЯМР для определения структуры биологических макромолекул в растворе

Возможности и ограничения метода

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в растворе является одним из наиболее мощных инструментов определения трехмерной структуры биомолекул. Ограничения и возможности ЯМР интересно рассмотреть в сравнении с методом рентгеноструктурного анализа, другим широко распространенным методом, позволяющим определить структуру атомного разрешения белка.

К преимуществам ЯМР можно отнести следующие возможности:

• Структура белка определяется непосредственно в растворе.

Понимание организации третичной структуры в нативных условиях является важным условием для интерпретации функциональной роли биомолекулы. Многочисленные исследования (97, 98) показали, что укладка третичной структуры отдельных доменов белковой глобулы в кристалле и в растворе меняется незначительно. Обычно отличия состоят в небольших отклонениях относительной ориентации элементов вторичной структуры (99). В то же время, взаимное расположение доменов может меняться существенно (100). Активно развивающиеся в настоящее время ЯМР методики исследования структуры белков, основанные на измерении констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия (КДДВ), позволяют определять относительную ориентацию жестких структурированных элементов белка в растворе при наличии его трехмерной модели, не прибегая к повторному полному определению структуры белка (101, 102).

Некоторые белки содержат фрагменты, координаты атомов которых не могут быть определены методом РСА. Этими элементами могут являться как неструктурированные участки белковой цепи, так и подвижные фрагменты, обладающие структурой, которая дестабилизируется в процессе кристаллизации. В последнем случае ЯМР позволяет получить исчерпывающую структурную информацию. Эта информация может быть крайне важна, т.к. подвижные фрагменты белковой цепи часто задействованы в формировании активных центров ферментов (24). Хорошим примером белка с частично не определенной методом РСА структурой является исследованный в данной работе С-домен еКР1. В структуре еКР1, полученной методом рентгеновской кристаллографии, отсутствуют координаты атомов мини-домена 329-372 и С-терминального фрагмента 414-437 (4).

К преимуществу ЯМР можно отнести и сам факт отсутствия необходимости проводить кристаллизацию, т.к. не все белки способны кристаллизоваться.

• Метод ЯМР позволяет исследовать динамику белка в широком диапазоне характеристичных времен молекулярных движений.

Молекулярные движения

У Колебания боковых цепей, диффузия Ферментативный катализ

Колебания валентных углов и связей, конформационная подвижность (колебания торсионных углов)

Крупномасштабные конформационные переходы, движение доменов фемто пико нано ми про милли секунды

Релаксация

Параметры ЯМР

Уширение линий в спектрах, дисперсия Т1г1ю

Константы диполь-дипольного взаимодействия

Обменная спектроскопия

Рисунок 7. Изучение динамики движения белковой цепи с помощью спектроскопии ЯМР.

Эксперименты по измерению скоростей продольной и поперечной релаксаций в сочетании с измерением гетероядреных ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО) для ядер 15К амидных фрагментов основной цепи дают информацию о молекулярных движениях в пико- наносекундной шкале времени (103-105). Измерение величин остаточных КДДВ в различных слабо ориентированных средах позволяет исследовать динамику колебаний как отдельных связей, так и целых доменов друг относительно друга в субмилисекундном временном интервале (100, 106, 107). Скорости обмена подвижных протонов на дейтерий (108) и изменение изотропного химического сдвига в процессе конформационного обмена (109) предоставляют информацию о более медленных движениях.

• Метод является крайне чувствительным к слабым взаимодействиям.

ЯМР позволяет определять интерфейс белок-лигантдного взаимодействия при Кд порядка 10"3 М (110). Это свойство активно используется в методиках ЯМР-скрининга для поиска и оптимизации новых лекарственных соединений (111).

Наряду с весомыми преимуществами, ЯМР обладает и рядом недостатков:

• Ограничение на молекулярную массу исследуемой биомолекулы.

С увеличением молекулярной массы возрастает скорость релаксационных процессов, что вызывает уширение пиков вплоть до полного их исчезновения. Одновременно растет и число наблюдаемых сигналов в спектрах ЯМР. Это приводит к интенсивному перекрыванию пиков, снижает возможность адекватного анализа спектра и повышает вероятность ошибочной интерпретации спектральных данных. Аналогично, эффект перекрывания пиков наблюдается, если в молекуле белка присутствуют неструктурированные фрагменты: сигналы атомов таких участков аминокислотной цепи попадают приблизительно в одну и ту же область спектра, содержащую, в то же время, сигналы атомов структурированных элементов белка. Наиболее критичным оказывается перекрывание сигналов в спектрах NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), по интенсивности которых определяются межатомные расстояния.

• Длительность процедуры определения структуры

Методология обработки и интерпретации спектральных данных слабо автоматизирована, что делает процесс определения структуры относительно больших (более 100 а.о.) белков достаточно трудоемким. В то время как получение структуры РСА в среднем занимает около месяца с момента подготовки образца, для определения структуры ЯМР высокого качества нужно не менее года.

• Высокая стоимость изтопно меченных образцов.

В настоящее время методология ЯМР активно развивается. Разрабатываются новые подходы для улучшения качества спектров и извлекаемой из них информации. Метод TROSY (Transverse Relaxation Optimized SpectroscopY) (112) позволяет существенно уменьшить ширину пиков. Введение многомерной (3D и более) спектроскопии на образцах, меченных изотопами 13С и 15N, значительно снижает процент перекрывания сигналов (113). Аналогичной цели служат методики частичного или полного дейтерирования образцов и избирательное введение изотопно меченных аминокислот. С применением данных подходов удается получить отнесение химических сдвигов ЯМР для белков с молекулярной массой до 100 кДа. Из анализа спектров ЯМР была получена интересная информация об организации мультисубъединичного комплекса шаперона 900 кДа (114). Тем не менее, оптимальными объектами для исследования методом ЯМР остаются сравнительно небольшие белки молекулярной массой до 30 кДа.

Таблица 1. Затраты на получение одного образца меченого белка и требуемые эксперименты ЯМР в зависимости от размера исследуемого объекта.

ММ белка Изотопное мечение Цена за 1л среды М9 для экспрессии белков Эксперименты

5-15 кДа не требуется или 15N -30$ id, 2d гомоядерные, 2d гетероядерные

10-25 кДа 15n, 13с ~ 750$ 2d, 3d гетероядерные, измерение КДДВ

20-50 кДа и более 15n,13c или 15n,13c,2h ~1500$ 2d, 3d, 4d гетероядерные, trosy, измерение КДДВ, использование криодатчиков

Определение структуры белка методом ЯМР

Процедура определения структуры белка методом ЯМР заключается в поиске конформации молекулы, которая наилучшим образом удовлетворяет набору экспериментально установленных пространственных ограничений. Пространственные ограничения определяются из характеристик сигналов в спектрах ЯМР. Обычно такими характеристиками являются интенсивности пиков, расстояния между максимумами мультиплетов, измеренные в герцах, и величины химических сдвигов.

Рисунок 8. Схема определения структуры белка методом спектроскопии ЯМР.

Теоретические основы метода ЯМР

В спектрах ЯМР белков наблюдают сигналы ядер со спииом 1А. К таковым относятся изотопы ■н, 'Ч 13с, а также 19Р и 31Р. Воздействие постоянного магнитного поля напряженностью Ва на ядро, имеющее ненулевой спин, приводит к Зеемановскому расщеплению энергетических уровней (рис. 9). Проекция момента количества движения на ось г лабораторной системы координат, совпадающую с направлением вектора В0, определяется выражением:

1г=Ьт, (I) где ш - магнитное квантовое число, а Ь - постоянная Планка (1.055*10"34 Дж*С). Для ядер со спином Уг ш принимает значения -Уг и +У2. Магнитный момент ядра связан с величиной момента импульса через гиромагнитное отношение у

Р=у1 (2) у является индивидуальной характеристикой ядер каждого изотопа. В присутствии внешнего магнитного поля В0 энергия ядра определятся соотношением:

Е=-/лВ0. (3)

Для данного энергетического уровня имеем:

Е=-туЬВ0. (4)

Откуда величина кванта энергии, необходимая для перехода между уровнями ш и ш+1 составляет

АЕ—ур1В0 (5)

Используя закон Планка, получаем = у В о- (6) где <х> соответствует резонансной частоте данного ядра и измеряется а радианах.

Рисунок 9. Зеемановское расщепление энергетических уровней ядра со спином Уг в постоянном магнитном поле напряженностью Ва. Величина ЛЕ линейно зависит от напряженности постоянного магнитного поля В0.

Подставляя в выражение (5) численные значения гиромагнитного отношения для ядер 'Н у = 2.67* 10~8 1/(Тс) и значение В0—14.09 Т, соответствующее частоте

1 26 резонанса ядер Н 600МГц, получаем ДЕ=6.3*10~ Дэю. Эта величина мала в сравнении со средней энергией тепловых колебаний при комнатной температуре Е29зк 21 кТ=4.04*10' Дж. Таким образом, разница заселенностей двух энергетических уровней, рассчитываемая в соответствии с распределением Больцмана, оказывается невелика при температуре измерения. Это объясняет относительно низкую чувствительность метода и, как следствие, высокие требования к концентрации белка в образце (около 1 тМ для успешного накопления многомерных ЯМР спектров).

Химический сдвиг

При помещении исследуемых молекул в магнитное поле, возникает диамагнитный момент, обусловленный орбитальным движением электронов. Это движение электронов образует эффективные токи, которые создают вторичное магнитное поле, пропорциональное, в соответствии с законом Лоренца, полю В0 и противоположно направленное. Таким образом, локальное поле в том месте, где находится исследуемое ядро, равно:

ВЭфф=В0(1-ст), (7) где о — константа экранирования. Химический сдвиг характеризует отклонение частоты резонанса данного сорта ядер относительно стандарта и определяется выражением: о где со0 — несущая частота, со и coref частоты резонанса данного ядра и стандарта соответственно. Величина химического сдвига крайне чувствительна к химическому окружению атома. Это позволяет определять вторичную структуру белка путем сравнения экспериментально измеренных величин химических сдвигов с аналогичными величииами, известными для белков с определенной трехмерной структурой (115). Аналогичный принцип лежит в основе определения величин диэдральных углов \|/ифпо значениям химических сдвигов ядер 15N, 1HN, 13Са, 13С и 'На атомов основной цепи белка в программе TALOS (116, 117). Химические сдвиги

32 могут быть также рассчитаны, если известна трехмерная структура белка. Сравнение экспериментальных и расчетных данных используется для проверки корректности определения структуры.

Перенос намагниченности и получение экспериментальных ограничений

Воздействие на образец, находящийся в постоянном магнитном поле, серией электромагнитных импульсов определенной формы и длительности позволяет контролировать перенос намагниченности по спиновой системе ядер и моделировать интенсивности пиков в спектре. Поведение не взаимодействующих друг с другом ядерных спинов в постоянном магнитном поле под действием электромагнитных импульсов описывается полуклассическими уравнениями Блоха, хорошо известными из физики. Для описания более сложных систем необходимо использовать аппарат квантовой механики.

Усредненное по ансамблю состояние системы спинов характеризуется оператором плотности а (см. уравнение 9). Эволюция оператора плотности во времени описывается уравнением Лиувилля фон Наймаиа, решение которого при условии независимости гамильтониана от времени определяется выражением: о(1) =ехр (- о(0) ехр (Ш(), (9) где Н - гамильтониан, - мнимая единица. Таким образом, зная значения гамильтонианов, действующих в процессе эволюции намагниченности при воздействии радиочастотных импульсов и в процессе задержек между ними, можно точно предсказать весь путь переноса намагниченности в ходе импульсной последовательности.

Передача намагниченности может осуществляться по двум механизмам: через систему ковалентных связей (непрямое спин-спиновое взаимодействие с участием электронов) или непосредственно через пространство благодаря взаимодействию сближенных магнитных диполей ядер (прямое диполь-дипольное взаимодействие). Эксперименты, в которых используется спин-спиновый механизм передачи намагниченности, применяются для получения значений химических сдвигов атомов белка и определения величин констант спин-спинового взаимодействия. К таким экспериментам относятся HNCA, HNCO, HN(CO)CA, HCCH-TOCSY, HNHA и др. Гимальтониан спин-спинового взаимодействия двух спинов / и S при условии слабого связывания (27vJls«\corcos\) определяется выражением:

Иj = 2nI.SJls, (10) где Jjs — константа спин-спинового взаимодействия, /, и Sz — операторы момента импульса, соответствующие z компонентам намагниченности / и S спинов соответственно.

Из величин констант спин-спинового взаимодействия через 3 связи 3J могут быть рассчитаны величины диэдральных углов. Константа 3J связана с величиной диэдрального угла эмпирическим уравнением Каргшуса:

3J(9) = A cos2 в + В cos в + С, (11) где А, В и С - константы, в - диэдальный угол. Экспериментально 3J могут быть измерены по величине расщепления кросс-пиков в 2D спектрах COSY (Correlated Spectroscopy) (118) или из анализа интенсивностей сигналов HN, На и Hß в 3D спектрах HNHA (119) или HNHB (120).

Диполь-дипольный механизм передачи намагниченности используется в экспериментах NOESY. Интенсивность кросс пиков определяется величиной неравновесных ядерных эффектов Оверхаузера. ЯЭО заключается в изменении интенсивности сигнала данного ядра молекулы при изменении населенности энергетических состояний другого ядра, сближенного в пространстве, за счет переноса намагниченности по диполь-дипольному механизму. Величина ЯЭО между ядрами / и S определяется скоростью кросс релаксации а^ОЕ и зависит от расстояния между ядрами: г где тс - время корреляции вращательной диффузии молекулы, а/— сложная функция движения. Как видно из уравнения (12), интенсивность ЯЭО быстро спадает с увеличением расстояния. Сигналы ЯЭО удается наблюдать между ядрами, располагающимися ближе, чем 5-6 Ä. Как правило, информация о межатомных расстояниях, полученная из анализа интенсивности ЯЭО, составляет основной массив экспериментальных ограничений, используемых для определения структуры.

В твердых телах диполь-дипольное взаимодействие является одной из главных причин усложнения спектров, т.к. приводит к расщеплению всех сигналов, аналогично спин-спиновому взаимодействию. Гамильтониан взаимодействия двух слабо связанных (27rDjS«\coj-cos\) диполей I и S определяется соотношением:

Н*п = < ¿cos2 0-~)>=2тг< I7SzDis >, (13) отг rs, 2 2 где |i0 — магнитная восприимчивость, — расстояние между взаимодействующими ядрами, 0 - угол между вектором rSi и вектором напряженности магнитного поля В0, Dsj - константа диполь-дипольного взаимодействия, < > означает усреднение по всем ориентациям.

Сравнивая (10) и (13) легко видеть, что гамильтониан диполь-дипольного взаимодействия аналогичен таковому для спин-спинового взаимодействия. Полный гамильтониан системы из двух спинов, между которыми наблюдается спин-спиновое и диполь-дипольпое взаимодействия имеет вид:

H=Hext+H,+Hdip, (14) где Hext - гамильтониан взаимодействия с внешним магнитным полем. Таким образом, в случае если имеет место ориентирование молекулы относительно внешнего магнитного поля, наблюдаемая константа спин-спинового взаимодействия будет определяться как Jjs+Djs.

Из (13) следует, что величина КДДВ зависит от ориентации вектора между взаимодействующими ядрами относительно внешнего магнитного поля. В изотропной жидкой среде ориентация всех связей усредняется за счет быстрой вращательной диффузии молекулы, поэтому дополнительного расщепления сигналов не наблюдается. Введение слабого ориентирующего воздействия на образец позволяет наблюдать константы остаточного диполь-дипольного взаимодействия для близко расположенных атомов без существенного усложнения спектра (121). Информация об относительной ориентации отдельных связей представляет еще один важный тип ограничений для определения структуры белка методом ЯМР (122), кроме того величины КДДВ несут информацию о динамике белковой цепи, т.к. зависят от усреднения положения связи в пространстве (106, 107, 123). Как правило, КДДВ белков измеряют для ковалентно связанных пар атомов 'Н-1^ и 13С-'Н.

Использование КДДВ для определения структур биомолекул

Для использования КДДВ в расчетах структуры необходимо перейти к системе координат, жестко связанной с молекулой белка. Это позволяет разделить движение белковой глобулы как целого и внутримолекулярные движения. Если белок жесткий (т.е. величины параметра порядка Э2 превышают 0.8 (124)), внутримолекулярными движениями можно пренебречь.

А) и в системе координат, в которой матрица Саупа (см. ниже) является диагональной (В) (125).

При переходе к новой системе координат имеем: cosé? = ^cosc^ cosflk, (15) к где ах, ау, az углы между вектором связи и соответствующими осями координат, (Зх, (Зу, Pz - углы между вектором магнитной индукции и соответствующими осями. Тогда в соответствии с (13), КДДВ будет определяться выражением:

Dis = -—Щ1- cosa, eos*, , (16) rSl i.J={x,y,z) где S¡j= 5/2 <cosfij со s fi ¡>- 1/2 <5,y , S¡j — дельта Кронекера. Матрица, составленная из элементов S¡j , носит название матрицы Саупа (далее S). Она является симметричной и имеет размер 3x3. Кроме того, в матрице Саупа сумма диагональных элементов равна нулю. Таким образом, матрица состоит из 5-ти независимых элементов. Это означает, что для определения всех элементов матрицы необходимо измерить как минимум 5 независимых КДДВ.

Матрица Саупа является симметричной и вещественной, следовательно возможно найти такую систему координат, в которой Б будет диагональной и выражение (16) примет вид: = -ЪИ^Щ^^А^ соэ2 £ + А соэ2 £ + А= соб2 £г) , (17)

8л г,,

- углы между вектором связи и осями новой системы координат. Такая система координат называется ориентирующей, а матрица А - тензором ориентации или тензором порядка. Величины диагональных элементов матрицы А пропорциональны вероятности расположения /-й оси параллельно вектору напряженности магнитного поля и определяются так, что |Ан|>|Ауу|>|Ахх|. След тензора А равен нулю.

ЪиЛуеГ

Определим аксиальную компоненту Эа -— ' А„ и ромбичность К=(АХХ

32л- гДу

Ауу)/А22. Переходя в сферическую систему координат получаем: д. =£>я((Зсоз2^-1) + 3/2Лсо82^зт^). (18)

Множество решений для данного значения определяется конусом величин в и (р. Более того, из (18) видно, что обратный конус также является множеством решений. Неоднозначность ориентации вектора данной связи может быть разрешена с помощью уже имеющихся структурных данных либо путем измерения дополнительного набора КДДВ в ориентирующей среде, которой соответствует другой тензор порядка (Рис. 11).

Для использования КДДВ в расчетах структуры необходимо определить параметры тензора порядка. Существуют различные способы решения этой задачи. А В ъ г л У

Рисунок 11. Множества ориентацнй вектора связи, определенные из 5 независимых наборов КДЦВ. А. Точка пересечения множеств решений однозначно определяет ориентацию связи. Внутренние движения отсутствуют. Б. Единственного пересечения множеств решений может не существовать, если присутствуют внутримолекулярные движения (125).

Если точная структура белка неизвестна, параметры тензора могут быть определены по распределению величин КДЦВ (124). В таком случае величина определяется как КДЦВ, имеющая максимальное абсолютное значение, а величина Оуу - как КДЦВ, определяющая второй максимум по абсолютному значению и имеющая противоположный знак относительно Тогда: если А-В располагается вдоль : в=0°г 0,г=20а; если А-В располагается вдоль Ауу : в=90°, (р=90° , Оу>,=-Оа(1 +3/2к); если А-В располагается вдоль А^ : в=90°, <р=0°, Охх=-Оа(1-3/2Я).

Полученная таким образом грубая оценка параметров тензора порядка может быть использована на первых итерациях расчета структуры. Ключевым моментом для успешного использования данного подхода является необходимость получить набор КДЦВ, представляющий широкий интервал углов в и <р, что выполняется не для всех биомолекул. Когда структура известна, параметры тензора могут быть определены методом разложения по сингулярным числам матрицы (126).

А Б

О (Иг)

Рисунок 12. А. Гистограмма распределения величин нормализованных КДДВ 'Оцн» 'Ослнл^ '^сы и 'Осса белка КНЗ домена рибонуклеоттротеина (127). Б. Схематическое изображение распределения ориентации межъядерного вектора от величин КДДВ. Черный/темно-серый -отрицательные, Серый и светло-серый - положительные, Белый - небольшие и нулевые значения. Оси совпадают с осями тензора порядка. Знаки КДДВ выбраны в соответствии с распределением А. (Взято из материалов лекции М. Блэкледжа.)

Как видно из выше сказанного, необходимо соблюдать аккуратность при использовании КДЦВ в расчетах структуры. Обычно данный тип ограничений подключают как дополнительный к межатомным расстояниям и диэдральным углам. В то же время, в ряде пионерских работ структура белка была определена исключительно с помощью КДДВ (128). Использование данных по ориентации связей позволяет существенно улучшить характеристики карты Рамачандрана и уменьшить СКО в ансамбле структур белка (129).

Анизотропные среды для измерения КДДВ

Впервые КДДВ биомолекулы в растворе были измерены на образце меченного цианометмиоглобина (МЬСЫ), в котором наблюдалось спонтанное ориентирования молекул в постоянном магнитном поле из-за большой анизотропии парамагнитной восприимчивости МЬСК (121). Ориентация молекул оказывалась невелика и величины 'Н-15Ы КДДВ не превышали нескольких герц. Еще более низкие

Таблица 2. Некоторые ориентирующие среды и их свойства.

Тип среды Состав* Заряд Т°С Особенности

Бицеллы (сложные БМРС/ОНРС (130) Нейтральный 30-45 Склонны к гидролизу эфиры) БМРС/ОНРС/СТАВ (131) Положительный 30-45 Склонны к гидролизу

ОМРС/ОНРС/БОБ (131) Отрицательный 30-45 Склонны к гидролизу

ОМРСЯШРС/СНАРЗО(125) Нейтральный 7-50

Бицеллы (эфиры) ОКЮРСЯЛОНРС (132) Нейтральный 30-45 рП 1-12

ВЮОРС/СНАРБО (133) Нейтральный 10-60 рН 1-6.5

Суспензия частиц Бактериофаг РП (134) Отрицательный 14-45 рН > 5, агрегация при вирусов высоких значениях ионной силы, белок можно восстановить.

Пурпурные Фрагменты липидных Отрицательный 0-70 Белок можно восстановить. мембраны мембран с Активно взаимодействует с бактериородопсином (125) белками.

Ламеллярные СпЕт/п-гексанол (135) Нейтральный 0-40 Низкая афинность к белкам, жидкокристалличе СпЕт/п-гексанол/СТАВ (135) Положительный 0-40 нечувствительна к рН, ские фазы дороговизна. се1у1РгВг/п-гексанолЛМаВг Положительный 15-60

136) Положительный 0-70 се1у1РгС1/п-гексанол/КаС1

125)

Парамагншное Хелатирование белком иона Уширение линий вблизи ориентирование лантанида (137, 138). иона лантанида.

Растянуты е/сжатые Полиакриламидный гель Нейтральный 5-45 Простота восстановления гели (139) образца, высокая совместимость с биомолекулами, уширение линии из-за негомогенности среды. БИРС - 1,2-дигексаноил-.ул-глисеро-3-фосфохолин, БМРС - 1,2-димиристоил-л'я-глицеро-З-фосфохолин, СНАРБО - 3-(хлорамидопропил)диметиламмонио-2-гидроксил-1-пропансульфонат, се1у1РгВг - цетилпиридиний бромид, БЮБРС — 1,2-ди-0-додецил-зп-глицеро-3-фосфохолин, БЮНРС - 1,2-ди-0-гексил-зп-глицеро-3-фосфохолин, СпЕт — алкнл-полиэтилепгликоль, СТАВ — цетилтриметиламмоний бромид, БОБ — додецилсульфат натрия. значения КДДВ были получены для диамагнитной молекулы убиквитина - при аналогичной напряженности поля 600 МГц максимальная величина 'Н-1^ КДДВ составляла 0.2 Гц. Для увеличения упорядоченности было предложено хелатировать парамагнитный ион в структуру молекулы белка с помощью группы, пришитой в качестве тага с N или С конца (138). Этот метод не нашел широкого применения. Более простым решением оказалось использовать сильно разбавленные растворы жидких кристаллов (131). Впервые для этих целей были использованы фосфолипидные бицеллы. Впоследствии было разработано множество ориентирующих сред для биомолекул, обладающих различными морфологическими и электростатическими свойствами. Характеристика наиболее популярных из них представлена в таблице 2.

Наилучшую совместимость с биомолекулами проявляют изотропные среды на основе смеси СпЕт/п-гексанол или полиакриламидного геля, упорядоченного за счет механической деформации. С использования этих сред рекомендуется начинать проведение экспериментов в случае если необходимо измерить 1 или 2 набора КДДВ. Для измерения большого количества независимых наборов КДДВ необходимо использовать среды с различными морфологическими и электростатическими свойствами. Характеристики среды могут быть изменены с помощью ряда подходов. Для модификации заряда поверхности частиц добавляют небольшие количества заряженных молекул. Чаще всего используют СТАВ и ЗББ. Сила взаимодействия биомолекул со средой регулируется с помощью изменения ионной силы и концентрации среды или модифицирующего агента.

§ 1.7 Метод молекулярной динамики для исследования биомолекулярных систем

Метод молекулярной динамики (МД) широко применяется для моделирования поведения биомолекулярных систем. Расчет длинных траекторий молекулярного движения (до 1 мкс) позволяет теоретически предсказать детали конформационных перестроек белков, что может внести существенный вклад в понимание их функций. При проведении таких расчетов стремятся максимально точно моделировать условия реального окружения белка в растворе. В связи с этим расчет динамики белка проводят в водном окружении, что существенно увеличивает количество атомов в системе и, как следствие, накладывает серьезные требования к вычислительной мощности используемой компьютерной техники.

Поведение молекулы белка на траектории МД описывается уравнениями классической Ньютоновской механики:

19) где Ы— количество частиц. Сила Р, действующая на данный атом, определяется:

Р^-^—^гасЦШ). (20)

Потенциальная энергия молекулы и вводится как сумма потенциальных энергий отдельных взаимодействий. Вид функции потенциальной энергии и набор всех параметров, используемых для расчета потенциалов, определяется т.н. силовым полем. К параметрам силового поля относятся величины силовых констант деформации связей, а также параметры ковалентной геометрии и невалентных взаимодействий. В классическом виде функция потенциальной энергии определяется выражением:

Щх) = иь+ ил и, + иа> + ии + ие1 + иИЬ, (21) где энергии соответствуют £4 - химическим связям; иу - валентным углам; Ц, -торсионным углам; 11ы - плоским группам; 1]и - ван-дер-ваальсовым контактам; ие1 -кулоновским взаимодействиям; и^ - водородным связям. Вид отдельных потенциалов может меняться в зависимости от используемого силового поля.

В стартовой точке траектории всем атомам молекулы, находящимся под действием силового поля, сообщаются начальные скорости движения. Для определения параметров системы в следующий момент времени проводят интегрирование уравнений движения. Скорость движения атомов характеризует температуру системы, которая может контролироваться с помощью т.н. термостата. Мгновенная температура рассчитывается как средняя кинетическая энергия, приходящаяся на одну степень свободы:

T(t) = ^—Ym¡Vf, (22)

3 Nkb T

Одним из ключевых условий получения реалистичных результатов расчета является корректная параметризация параметров силового поля. На данный момент разработано множество различных силовых полей для расчета динамики белков. Среди наиболее часто используемых, можно упомянуть GROMOS (140), AMBER (141), CHARMM (142) и OPLS-AA (143). Наиболее существенное отличие между ними заключается в стратегии параметризации невалентных взаимодействий (кулоновские и Ван дер Ваальсовы взаимодействия). Для полей GROMOS и OPLS-AA величины парциальных зарядов и параметры потенциала Леннарда-Джонса были определены эмпирически на основании соответствия данных моделирования экспериментальным данным, таким как плотность раствора, энтальпия сольватации, удельная теплота испарения и др. (144). Другая стратегия, использованная для параметризации AMBER и CHARMM, заключалась в эмпирическом подборе параметров, которые позволят получить сходимость результатов с квантово механическими расчетами. В зависимости от данной конкретной стратегии, использованной для параметризации, силовое поле оптимизируется для моделирования определенных молекулярных систем (144). Например, для одной из модификаций поля GROMOS (140) использовалась параметризация относительно энергий сольватации модельных соединений не только в воде, но и в циклогексане. Целью данного подхода являлась оптимизация моделирования поведения остатков аминокислот, находящихся на поверхности белка и в гидрофобном окружении внутри глобулы. Сравнение результатов расчетов МД, выполненных в полях GROMOS, AMBER, CHARMM и OPLS-AA при одинаковых условиях, показал, что, несмотря на различие в параметризации, траектории МД сходятся с точностью до погрешности метода (144, 145).

Важно отметить, что во всех упомянутых силовых полях парциальные заряды жестко связаны с атомами молекулы белка (т.е. поле неполяризуемо). Этот факт вносит ошибку при моделировании невалентных взаимодействий, что делает бессмысленным проведение расчетов траекторий молекулярной динамики длиннее микросекунды. Поляризуемые поля активно разрабатываются, однако на данный момент они пока не получили широкого распространения. При моделировании незаряженных систем, таких как углеводороды, в неполярных растворителях, специализированные силовые поля позволяют получить хорошее соответствие расчета МД эксперименту (146).

Расчет молекулярной динамики с экспериментальными ограничениями

При использовании МД для расчета структуры по экспериментальным ограничениям во главу угла ставится задача поиска модели, наилучшим образом удовлетворяющей данным эксперимента. Для этой цели в функцию потенциальной энергии вводится дополнительный потенциал, величина которого зависит от степени нарушения набора экспериментальных ограничений. Поиск минимума энергии осуществляется по т.н. алгоритму моделированного отжига (simulated annealing) (147). МД рассчитывается в вакууме в отсутствии потенциала электростатических взаимодействий, т.к. искажение структуры, вызванное ошибочными ограничениями, может привести к сближению одноименно заряженных атомов и последующему взрыву системы в процессе расчета. Потенциал Леннарда-Джонса заменяется упрощенным потенциалом вида ^k (max(o,(j/?min)2 -R2))2 , где к - силовая

ВдВпары константа, s - взвешивающий фактор, Rmin - расстояние на котором потенциал Ван дер Ваальса имеет минимум, R — расстояние между взаимодействующими атомами (148). Длительность траектории обычно составляет десятки пикосекунд.

Для упрощения конформационного пространства, в котором осуществляется поиск наилучшей структуры, от декартовых координат можно перейти к пространству торсионных углов (т.н. внутренние координаты). В такой системе координат структура молекулы белка описывается с помощью набора торсионных углов, при этом параметры ковалентной геометрии (длины связей, валентные углы и т.п.) считаются неизменяемыми (148). Еще большее упрощение расчета достигается за счет использования подхода «жестких фрагментов» (rigid body). Суть метода заключается в том, что МД рассчитывается при фиксированных (жестких) структурах заданных участков молекулы (148). Этот подход может быть эффективно использован при поиске взаимной ориентации доменов белка с использованием ограничений КДДВ (149).

На данный момент наиболее популярными программами для расчета структур биомолекул по ограничениям ЯМР являются CNS (150), С Y ANA (151) и Xplor-NIH (149). CYANA позволяет проводить расчет только во внутренних координатах. Xplor-NIH снабжен интерфейсом на языке Python, что позволяет гибко модифицировать протокол расчета. Версия CNS для программы автоматического отнесения ARIA (152) предполагает возможность подключения полноценных потенциалов невалентных взаимодействий и осуществления расчета короткой траектории МД в тонком слое растворителя (153, 154) после завершения процедуры моделированного отжига. Последние версии Xplor-NIH также содержат модули для моделирования коротких траекторий МД в растворителе.

выводы

1. Проведено отнесение 99% сигналов ЯМР ядер «Н, 13С и N основной белковой цепи и более 78% сигналов !Н, 13С и боковых цепей аминокислотных остатков С-домена фактора терминации трансляции еМЧ человека. Результаты отнесения депонированы в международный банк данных Вю1у^К.езВапк (код 15366).

2. Установлено, что С-домен еШЛ человека существует в растворе в виде двух конформеров с приблизительно равной населенностью. Изучено влияние температуры, рН и ионной силы раствора на стабильность конформеров. Установлено, что при понижении рН ниже величины рКа имидазольных фрагментов гистидина, происходит денатурация белка. Рефолдинг белка из кислой среды приводит к образованию лишь одного конформера.

3. Определены структуры ЯМР высокого разрешения в растворе двух конформеров С-домена еКБ1 человека. Координаты атомов депонированы в банк белковых структур (коды 2КТи и 2КТУ). Получены структуры обоих конформеров мини-домена 329-372, отсутствовавшего в опубликованных ранее рентгеновских структурах еШ7! человека. Установлена роль остатка №8356 в структурной стабилизации конформеров.

4. Методом ЯМР исследованы динамические свойства основной белковой цепи С-домена еКР1 человека. Установлено, что мини-домен 329-372 претерпевает медленные (в шкале времени от мс до минут) конформационные перегруппировки. В то же время, амплитуда движений белковой цепи мини-домена в шкале времени от пс до не сравнительно невелика, и лишь немного превышает подвижность атомов основного структурного ядра белка (а.о. 277328 и 373-413).

5. Для определения факторов стабилизации двух конформационных состояний мини-домена 329-372 и роли протонирования остатков гистидина в структурных перестройках белка, проведен расчет длинных (до 200 не) траекторий молекулярной динамики С-домена еЯЕ1 и полноразмерного белка. Установлено, что конформационное состояние мини-домена и состояние протонирования остатков гистидина стимулируют изменение взаимной ориентации доменов eR.Fl.

6. Полученные результаты позволили спланировать проведение функциональных исследований роли мини-домена 329-372 eR.Fl в механизме терминации трансляции. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что мини-домен играет роль конформационного переключателя, способного влиять как на специфичность узнавания стоп-кодонов, так и на эффективность образования терминационного комплекса.

Благодарности

Я благодарен научному руководителю д.х.н. В.И.Полынакову за предоставленную тему и внимание к проекту на всем протяжении работы, Dr Berry Birdsall за помощь в записи спектров ЯМР, акдемику РАН [Л.Л.Киселеву], по чьей инициативе было начато исследование eRFl с помощью спектроскопии ЯМР, а также д.б.н., проф. Л.Ю.Фроловой, к.б.н. Е.З.Алкалаевой и к.б.н. Е.В.Ивановой за предоставленные образцы и плодотворное сотрудничество.

Выражаю глубокую признательность проф. д.ф.-м.н. Ю.А. Пирогову за поддержку и содействие в организационных вопросах.

Отдельное спасибо к.ф.-м.н. В.А.Рознятовскому, к.х.н. Ю.Г.Калягину и О.Савельеву за ценные советы, касающиеся работы на ЯМР спектрометре.

Я горячо благодарен моим родителям за поддержку, понимание и создание условий для выполнения данной работы.

1. Alkalaeva, Е. Z., А. V. Pisarev, L. Y. Frolova, L. L. Kisselev, and T. V. Pestova. 2006. 1. vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3. Cell 125:1125.

2. Pisarev, A. V., C. U. Hellen, and T. V. Pestova. 2007. Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes. Cell 131:286.

3. Song, H., P. Mugnier, A. K. Das, H. M. Webb, D. R. Evans, M. F. Tuite, B. A. Hcmmings, and D. Barford. 2000. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl—mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Cell 100:311.

4. Frolova, L. Y., T. I. Merkulova, and L. L. Kisselev. 2000. Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA 6:381.

5. Kononenko, A. V., V. A. Mitkcvich, V. I. Dubovaya, P. M. Kolosov, A. A. Makarov, and L. L. Kisselev. 2008. Role of the individual domains of translation termination factor eRFl in GTP binding to eRF3. Proteins 70:388.

6. Graille, M., M. Chaillct, and H. van Tilbeurgh. 2008. Structure of yeast Dom34: a protein related to translation termination factor Erfl and involved in No-Go decay. J Biol Chem 283:7145.

7. Petry, S., D. E. Brodersen, F. V. t. Murphy, С. M. Dunham, M. Selmer, M. J. Tarry, A. C. Kelley, and V. Ramakrishnan. 2005. Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123:1255.

8. Basavappa, R., and P. B. Sigler. 1991. The 3 A crystal structure of yeast initiator tRNA: functional implications in initiator/elongator discrimination. EMBO J 10:3105.

9. Inagaki, Y., C. Blouin, W. F. Doolittle, and A. J. Roger. 2002. Convergence and constraint in eukaryotic release factor 1 (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucl. Acids Res. 30:532.

10. Frolova, L., A. Seit-Nebi, and L. Kisselev. 2002. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA 8:129.

11. Chavatte, L., A. Seit-Nebi, V. Dubovaya, and A. Favre. 2002. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. EMBO J 21:5302.

12. Kisselev, L., M. Ehrenberg, and L. Frolova. 2003. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J 22:175.

13. Petry, S., A. Weixlbaumer, and V. Ramakrishnan. 2008. The termination of translation. Curr Opin Struct Biol 18:70.

14. Arkov, A. L., and E. J. Murgola. 1999. Ribosomal RNAs in translation termination: facts and hypotheses. Biochemistry (Mosc) 64:1354.

15. Weixlbaumer, A., S. Petry, C. M. Dunham, M. Selmer, A. C. Kelley, and V. Ramakrishnan. 2007. Crystal structure of the ribosome recycling factor bound to the ribosome. Nat Struct Mol Biol 14:733.

16. Chavatte, L., L. Frolova, L. Kisselev, and A. Favre. 2001. The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaiyotic ribosomes. Eur J Biochem 268:2896.

17. Yusupova, G. Z., M. M. Yusupov, J. H. Cate, and H. F. Noller. 2001. The path of messenger RNA through the ribosome. Cell 106:233.

18. Green, R., and H. F. Noller. 1997. Ribosomes and translation. Annu Rev Biochem 66:679.

19. Ivanov, V., A. Beniaminov, A. Mikheyev, and E. Minyat. 2001. A mechanism for stop codon recognition by the ribosome: a bioinformatic approach. Rna 7:1683.

20. Kolosov, P., L. Frolova, A. Seit-Nebi, V. Dubovaya, A. Kononenko, N. Oparina, J. Justesen, A. Efimov, and L. Kisselev. 2005. Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. Nucl. Acids Res. 33:6418.

21. Seit-Nebi, A., L. Frolova, and L. Kisselev. 2002. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBO Rep 3:881.

22. Ivanova, E. V., P. M. Kolosov, B. Birdsall, L. L. Kisselev, and V. I. Polshakov. 2006. NMR assignments of the middle domain of human polypeptide release factor eRFl. J Biomol NMR 36 Suppl 1:8.

23. Kisselev, L. L., and R. H. Buckingham. 2000. Translational termination comes of age. Trends Biochem Sci 25:561.

24. Polacek, N., and A. S. Mankin. 2005. The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit Rev Biochem Mol Biol 40:285.

25. Tate, W. P., and C. M. Brown. 1992. Translational termination: "stop" for protein synthesis or "pause" for regulation of gene expression. Biochemistry 31:2443.

26. Zavialov, A. V., L. Mora, R. H. Buckingham, and M. Ehrenberg. 2002. Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol Cell 10:789.

27. Amort, M., B. Wotzel, K. Bakowska-Zywicka, M. D. Erlacher, R. Micura, and N. Polacek. 2007. An intact ribose moiety at A2602 of 23S rRNA is key to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis during translation termination. Nucleic Acids Res 35:5130.

28. Bieling, P., M. Beringer, S. Adio, and M. V. Rodnina. 2006. Peptide bond formation does not involve acid-base catalysis by ribosomal residues. Nat Struct Mol Biol 13:423.

29. Yusupov, M. M., G. Z. Yusupova, A. Baucom, K. Lieberman, T. N. Earnest, J. H. Cate, and H. F. Noller. 2001. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292:883.

30. Seit-Nebi, A., L. Frolova, J. Justesen, and L. Kisselev. 2001. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucl. Acids Res. 29:3982.

31. Mora, L., A. Zavialov, M. Ehrenberg, and R. H. Buckingham. 2003. Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RF1 and RF2 from Escherichia coli. Mol Microbiol 50:1467.

32. Mora, L., V. Heurgue-Hamard, S. Champ, M. Ehrenberg, L. L. Kisselev, and R. H. Buckingham. 2003. The essential role of the invariant GGQ motif in the function and stability in vivo of bacterial release factors RF1 and RF2. Mol Microbiol 47:267.

33. Dincbas-Renqvist, V., A. Engstrom, L. Mora, V. Heurgue-Hamard, R. Buckingham, and M. Ehrenberg. 2000. A post-translational modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J 19:6900.

34. Heurgue-Hamard, V., M. Graille, N. Scrima, N. Ulryck, S. Champ, H. van Tilbeurgh, and R. H. Buckingham. 2006. The zinc finger protein Ynr046w is plurifimctional and a component of the eRFl methyltransferase in yeast. J Biol Chem 281:36140.

35. Merkulova, T. I., L. Y. Frolova, M. Lazar, J. Camonis, and L. L. Kisselev. 1999. C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett 443:41.

36. Ebihara, K., and Y. Nakamura. 1999. C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids. RNA 5:739.

37. Salas-Marco, J., and D. M. Bedwell. 2004. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination. Mol Cell Biol 24:7769.

38. Cheng, Z., K. Saito, A. V. Pisarev, M. Wada, V. P. Pisareva, T. V. Pestova, M. Gajda, A. Round, C. Kong, M. Lim, Y. Nakamura, D. I. Svergun, K. Ito, and H. Song. 2009. Structural insights into eRF3 and stop codon recognition by eRFl. Genes Dev 23:1106.

39. Akhmaloka, P. E. Susilowati, Subandi, and F. Madayanti. 2008. Mutation at tyrosine in AMLRY (GILRY like) motif of yeast eRFl on nonsense codons suppression and binding affinity to eRF3. IntJBiol Sci 4:87.

40. Eurwilaichitr, L„ F. M. Graves, I. Stansfield, and M. F. Tuite. 1999. The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol 32:485.

41. Ito, K., K. Ebihara, and Y. Nakamura. 1998. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. RNA 4:958.

42. Ma, B., and R. Nussinov. 2004. Release factors eRFl and RF2: a universal mechanism controls the large conformational changes. J Biol Chem 279:53875.

43. Vorob'ev lu, N., and L. L. Kiselev. 2008. Molecular modeling of positioning of human release factor eRFl relative to mRNA stop-codon explains a proximity of the eRFl C-domain to stop-codon in ribosomal complex. Mol Biol (Mosk) 42:341.

44. Andjelkovic, N., S. Zolnierowicz, C. Van Hoof, J. Goris, and B. A. Hemmings. 1996. The catalytic subunit of protein phosphatase 2A associates with the translation termination factor eRF 1. EMBO J15:7156.

45. Lechward, K., S. Zolnierowicz, and B. A. Hemmings. 1999. Eukaryotic translation termination factor 1 associates with protein phosphatase 2A and targets it to ribosomes. Biochemisity (Mosc) 64:1373.

46. Atkinson, G. C., S. L. Baldauf, and V. Hauryliuk. 2008. Evolution of nonstop, no-go and nonsense-mediated mRNA decay and their termination factor-derived components. BMC Evol Biol 8:290.

47. Kong, C., K. Ito, M. A. Walsh, M. Wada, Y. Liu, S. Kumar, D. Barford, Y. Nakamura, and H. Song. 2004. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Mol Cell 14:233.

48. Stansfield, I., and M. F. Tuite. 1994. Polypeptide chain termination in Saccharomyces cerevisiae. Carr Genet 25:385.

49. Chauvin, C., S. Salhi, C. Le Goff, W. Viranaicken, D. Diop, and O. Jean-Jean. 2005. Involvement of human release factors eRF3a and eRF3b in translation termination and regulation of the termination complex formation. Mol Cell Biol 25:5801.

50. Kodama, H., K. Ito, and Y. Nakamura. 2007. The role of N-terminal domain of translational release factor eRF3 for the control of functionality and stability in S. cerevisiae. Genes Cells 12:639.

51. Inge-Vechtomov, S., G. Zhouravleva, and M. Philippe. 2003. Eukaryotic release factors (eRFs) history. Biol Cell 95:195.

52. Uchida, N., S. Hoshino, H. Imataka, N. Sonenberg, and T. Katada. 2002. A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-depcndent translation. J Biol Chem 277:50286.

53. Hosoda, N., T. Kobayashi, N. Uchida, Y. Funakoshi, Y. Kikuchi, S. Hoshino, and T. Katada. 2003. Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation. J Biol Chem 278:38287.

54. Kobayashi, T., Y. Funakoshi, S. Hoshino, and T. Katada. 2004. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay. J Biol Chem 279:45693.

55. Wang, W., K. Czaplinski, Y. Rao, and S. W. Peltz. 2001. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts. EMBOJ 20:880.

56. Valouev, I. A., V. V. Kushnirov, and M. D. Ter-Avanesyan. 2002. Yeast polypeptide chain release factors eRF 1 and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Cell Motil Cytoskeleton 52:161.

57. Salvesen, G. S., and C. S. Duckett. 2002. IAP proteins: blocking the road to death's door. Nat Rev Mol Cell Biol 3:401.

58. Scolnick, E., R. Tompkins, T. Caskey, and M. Nirenberg. 1968. Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc Natl Acad Sci USA 61:768.

59. Ito, K., M. Uno, and Y. Nakamura. 2000. A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403:680.

60. Vestergaard, B., L. B. Van, G. R. Andersen, J. Nyborg, R. H. Buckingham, and M. Kjeldgaard. 2001. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol Cell 8:1375.

61. Freistroffer, D. V., M. Y. Pavlov, J. MacDougall, R. H. Buckingham, and M. Ehrenberg. 1997. Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J 16:4126.

62. Frischmeyer, P. A., and H. C. Dietz. 1999. Nonsense-mediated mRNA decay in health and disease. Hum Mol Genet 8:1893.

63. Shyu, A. B., M. F. Wilkinson, and A. van Hoof. 2008. Messenger RNA regulation: to translate or to degrade. EMBO J27:471.

64. Ivanov, P. V., N. H. Gehring, J. B. ICunz, M. W. Hentze, and A. E. Kulozik. 2008. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. EMBO J27:736.

65. Weng, Y., K. Czaplinski, and S. W. Peltz. 1996. Identification and characterization of mutations in the UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex but not mRNA turnover. Mol Cell Biol 16:5491.

66. Denning, G., L. Jamieson, L. E. Maquat, E. A. Thompson, and A. P. Fields. 2001. Cloning of a novel phosphatidylinositol kinase-related kinase: characterization of the human SMG-1 RNA surveillance protein. J Biol Chem 276:22709.

67. Chiu, S. Y., G. Serin, O. Ohara, and L. E. Maquat. 2003. Characterization of human Smg5/7a: a protein with similarities to Caenorhabditis elegans SMG5 and SMG7 that functions in the dephosphorylation of Upfl. Rna 9:77.

68. Isken, O., and L. E. Maquat. 2007. Quality control of eukaryotic mRNA: safeguarding cells from abnormal mRNA function. Genes Dev 21:1833.

69. Snow, B. E., N. Erdmann, J. Cruickshank, H. Goldman, R. M. Gill, M. O. Robinson, and L. Harrington. 2003. Functional conservation of the telomerase protein Estlp in humans. Curr Biol 13:698.

70. Carr-Schmid, A., C. Pfund, E. A. Craig, and T. G. Kinzy. 2002. Novel G-protein complex whose requirement is linked to the translational status of the cell. Mol Cell Biol 22:2564.

71. Doma, M. K., and R. Parker. 2006. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation elongation. Nature 440:561.

72. Finn, R. D., J. Mistry, B. Schuster-Bockler, S. Griffiths-Jones, V. Hollich, T. Lassmann, S. Moxon, M. Marshall, A. Khanna, R. Durbin, S. R. Eddy, E. L. Sonnhammer, and A. Bateman. 2006. Pfam: clans, web tools and services. Nucleic Acids Res 34:D247.

73. Passos, D. O., M. K. Doma, C. J. Shoemaker, D. Muhlrad, R. Green, J. Weissman, J. Hollien, and R. Parker. 2009. Analysis of Dom34 and its function in no-go decay. Mol Biol Cell 20:3025.

74. Inagaki, Y., C. Blouin, E. Susko, and A. J. Roger. 2003. Assessing functional divergence in EF-lalpha and its paralogs in eukaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res 31:4227.

75. Leipe, D. D., Y. I. Wolf, E. V. Koonin, and L. Aravind. 2002. Classification and evolution of P-loop GTPases and related ATPases. J Mol Biol 317:41.

76. Ivanova, E. V., P. M. Kolosov, B. Birdsall, G. Kelly, A. Pastore, L. L. Kisselev, and V. I. Polshakov. 2007. Eukaryotic class 1 translation termination factor eRFl—the

77. NMR structure and dynamics of the middle domain involved in triggering ribosome-dependent peptidyl-tRNA hydrolysis. FEBS J274:4223.

78. Chou, J. J., S. Li, C. B. Klee, and A. Bax. 2001. Solution structure of Ca(2+)-calmodulin reveals flexible hand-like properties of its domains. Nat Struct Biol 8:990.

79. Fischer, M. W., J. A. Losonczi, J. L. Weaver, and J. H. Prestegard. 1999. Domain orientation and dynamics in multidomain proteins from residual dipolar couplings. Biochemistry 38:9013.

80. Goto, N. It., N. R. Skrynnikov, F. W. Dahlquist, and L. E. Kay. 2001. What is the average conformation of bacteriophage T4 lysozyme in solution? A domain orientation study using dipolar couplings measured by solution NMR. J Mol Biol 308:745.

81. Dosset, P., J. C. Hus, D. Marion, and M. Blackledge. 2001. A novel interactive tool for rigid-body modeling of multi-domain macromolecules using residual dipolar couplings. JBiomol NMR 20:223.

82. Barbato, G., M. Ikura, L. E. Kay, R. W. Pastor, and A. Bax. 1992. Backbone dynamics of calmodulin studied by ,5N relaxation using inverse detected two-dimensional NMR spectroscopy: the central helix is flexible. Biochemistry 31:5269.

83. Kordel, J., N. J. Skelton, M. Akke, A. G. Palmer, 3rd, and W. J. Chazin. 1992. Backbone dynamics of calcium-loaded calbindin D9k studied by two-dimensional proton-detected 15N NMR spectroscopy. Biochemistry 31:4856.

84. Palmer, A. G., 3rd. 1997. Probing molecular motion by NMR. Curr Opin Struct Biol 7:732.

85. Meiler, J., J. J. Prompers, W. Peti, C. Griesinger, and R. Bruschweiler. 2001. Modelfree approach to the dynamic interpretation of residual dipolar couplings in globular proteins. J Am Chem Soc 123:6098.

86. Fares, C., N. A. Lakomek, K. F. Walter, B. T. Frank, J. Meiler, S. Becker, and C. Griesinger. 2009. Accessing ns-micros side chain dynamics in ubiquitin with methyl RDCs. J BiomolNMR 45:23.

87. Hilser, V. J., and E. Freire. 1996. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J Mol Biol 262:756.

88. Polshakov, V. I., B. Birdsall, and J. Feeney. 1999. Characterization of rates of ring-flipping in trimethoprim in its ternary complexes with Lactobacillus casei dihydrofolate reductase and coenzyme analogues. Biochemistry 38:15962.

89. Pellecchia, M., D. S. Sem, and K. Wuthrich. 2002. NMR in drug discovery. Nat Rev Drug Discov 1:211.

90. Oschkinat, H., C. Griesinger, P. J. Kraulis, O. W. Sorensen, R. R. Ernst, A. M. Gronenborn, and G. M. Clore. 1988. Three-dimensional NMR spectroscopy of a protein in solution. Nature 332:374.

91. Fiaux, J., E. B. Bertelsen, A. L. Horwich, and K. Wuthrich. 2002. NMR analysis of a 900K GroEL GroES complex. Nature 418:207.

92. Wishart, D. S., B. D. Sykes, and F. M. Richards. 1992. The chemical shift index: a fast and simple method for the assignment of protein secondary structure through NMR spectroscopy. Biochemistry 31:1647.

93. Shen, Y., F. Delaglio, G. Cornilescu, and A. Bax. 2009. TALOS+: a hybrid method for predicting protein backbone torsion angles from NMR chemical shifts. JBiomol NMR 44:213.

94. Cornilescu, G., F. Delaglio, and A. Bax. 1999. Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR 13:289.

95. Delaglio, F., Z. Wu, and A. Bax. 2001. Measurement of homonuclear proton couplings from regular 2D COSY spectra. J Magn Res on 149:276.

96. Vuister, G. W., and A. Bax. 1993. Measurement of three-bond nitrogen-carbon J couplings in proteins uniformly enriched in 15N and 13C. J Am Chem Soc 115:5334.

97. Polshakov, V. I., T. A. Frenkiel, B. Birdsall, A. Soteriou, and J. Feeney. 1995. Determination of stereospecific assignments, torsion-angle constraints, and rotamer populations in proteins using the program AngleSearch. J Magn Reson B 108:31.

98. Tolman, J. R., J. M. Flanagan, M. A. Kennedy, and J. H. Prestegard. 1995. Nuclear magnetic dipole interactions in field-oriented proteins: information for structure determination in solution. Proc Natl Acad Sci USA 92:9279.

99. Tjandra, N., and A. Bax. 1997. Direct measurement of distances and angles in biomolecules by NMR in a dilute liquid crystalline medium. Science 278:1111.

100. Tolman, J. R., H. M. Al-Hashimi, L. E. Kay, and J. H. Prestegard. 2001. Structural and dynamic analysis of residual dipolar coupling data for proteins. J Am Chem Soc 123:1416.

101. Clore, G. M., A. M. Gronenborn, and A. Bax. 1998. A robust method for determining the magnitude of the fully asymmetric alignment tensor of oriented macromolecules in the absence of structural information. J Magn Reson 133:216.

102. Tolman, J. R., and K. Ruan. 2006. NMR residual dipolar couplings as probes of biomolecular dynamics. Chem Rev 106:1720.

103. Losonczi, J. A., M. Andrec, M. W. Fischer, and J. H. Prestegard. 1999. Order matrix analysis of residual dipolar couplings using singular value decomposition. J Magn Reson 138:334.

104. Lipsitz, R. S., and N. Tjandra. 2004. Residual dipolar couplings in NMR structure analysis. Annu Rev Biophys Biomol Struct 33:387.

105. Andrec, M., P. Du, and R. M. Levy. 2001. Protein backbone structure determination using only residual dipolar couplings from one ordering medium. J Biomol NMR 21:335.

106. Tjandra, N„ J. G. Omichinski, A. M. Gronenborn, G. M. Clore, and A. Bax. 1997. Use of dipolar ^-^N and 'H-13C couplings in the structure determination of magnetically oriented macromolecules in solution. Nat Struct Biol 4:732.

107. Ottiger, M., and A. Bax. 1998. Characterization of magnetically oriented phospholipid micelles for measurement of dipolar couplings in macromolecules. J Biomol NMR 12:361.

108. Losonczi, J. A., and J. H. Prestegard. 1998. Improved dilute bicelle solutions for high-resolution NMR of biological macromolecules. J Biomol NMR 12:447.

109. Ottiger, M., and A. Bax. 1999. Bicelle-based liquid crystals for NMR-measurcment of dipolar couplings at acidic and basic pH values. J Biomol NMR 13:187.

110. Cavagnero, S., H. J. Dyson, and P. E. Wright. 1999. Improved low pH bicelle system for orienting macromolecules over a wide temperature range. J Biomol NMR 13:387.

111. Hansen, M. R., L. Mueller, and A. Pardi. 1998. Tunable alignment of macromolecules by filamentous phage yields dipolar coupling interactions. Nat Struct Biol 5:1065.

112. Barrientos, L. G., C. Dolan, and A. M. Gronenborn. 2000. Characterization of surfactant liquid crystal phases suitable for molecular alignment and measurement of dipolar couplings. J Biomol NMR 16:329.

113. Bertini, I., I. C. Felli, and C. Luchinat. 2000. Lanthanide induced residual dipolar couplings for the conformational investigation of peripheral 15NH2 moieties. J Biomol NMR 18:347.

114. Ma, C., and S. J. Opella. 2000. Lanthanide ions bind specifically to an added "EF-hand" and orient a membrane protein in micelles for solution NMR spectroscopy. J Magn Resort 146:381.

115. Oostenbrink, C., A. Villa, A. E. Mark, and W. F. van Gunsteren. 2004. A biomolecular force field based on the free enthalpy of hydration and solvation: the GROMOS force-field parameter sets 53A5 and 53A6. J Comput Chem 25:1656.

116. Hornak, V., R. Abel, A. Okur, B. Strockbine, A. Roitberg, and C. Simmerling. 2006. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins 65:712.

117. Guvench, O., E. R. Hatcher, R. M. Venable, R. W. Pastor, and A. D. Mackerell. 2009. CHARMM Additive All-Atom Force Field for Glycosidic Linkages between Hexopyranoses. J Chem Theory Comput 5:2353.

118. Kahn, K., and T. C. Braice. 2000. Alpha-ketoamides and alpha-ketocarbonyls: conformational analysis and development of all-atom OPLS force field. Bioorg Med Chem 8:1881.

119. Guvench, O., and A. D. MacKerell, Jr. 2008. Comparison of protein force fields for molecular dynamics simulations. Methods Mol Biol 443:63.

120. Price, D. J., and C. L. Brooks, 3rd. 2002. Modern protein force fields behave comparably in molecular dynamics simulations. J Comput Chem 23:1045.

121. Ponder, J. W., and D. A. Case. 2003. Force fields for protein simulations. Adv Protein Chem 66:27.

122. Guntert, P. 1998. Structure calculation of biological macromolecules fromNMR data. Q Rev Biophys 31:145.

123. Schwieters, C. D., J. J. Kuszewski, N. Tjandra, and G. M. Clore. 2003. The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package. J Magn Reson 160:65.

124. Guntert, P. 2004. Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol Biol 278:353.

125. Rieping, W., M. Habeck, B. Bardiaux, A. Bernard, T. E. Malliavin, and M. Nilges. 2007. ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation. Bioinformatics 23:381.

126. Linge, J. P., M. A. Williams, C. A. Spronk, A. M. Bonvin, and M. Nilges. 2003. Refinement of protein structures in explicit solvent. Proteins 50:496.

127. Linge, J. P., and M. Nilges. 1999. Influence of non-bonded parameters on the quality of NMR structures: a new force field for NMR structure calculation. J Biomol NMR 13:51.

128. Bodenhausen, G., and D. Ruben. 1980. Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chem Phys Lett. 69:185.

129. Ottiger, M., F. Delaglio, and A. Bax. 1998. Measurement of J and dipolar couplings from simplified two-dimensional NMR spectra. J Magn Reson 131:373.

130. Ikura, M., L. E. Kay, and A. Bax. 1991. Improved three-dimensional 'H-13«:-1!! correlation spectroscopy of a 13C-labeled protein using constant-time evolution. J BiomolNMR 1:299.

131. Vuister, G. W., and A. Bax. 1993. Quantitative J Correlation a New Approach For Measuring Homonuclear 3-Bond J(H(N)H(Alpha) Coupling-Constants in N-15-Enriched Proteins. J Am Chem Soc 115:7772.

132. Piotto, M., V. Saudek, and V. Sklenar. 1992. Gradient-tailored excitation for singlequantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. J ВiomoINMR 2:661.

133. Clore, G. M., A. Bax, P. C. Driscoll, P. T. Wingfield, and A. M. Gronenborn. 1990.1 13

134. Assignment of the side-chain H and С resonances of interleukin-1 beta using double- and triple-resonance heteronuclear three-dimensional NMR spectroscopy. Biochemistry 29:8172.

135. Kay, L. E., D. A. Torchia, and A. Bax. 1989. Backbone dynamics of proteins as studied by 15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease. Biochemistry 28:8972.

136. Delaglio, F., S. Grzesiek, G. W. Vuister, G. Zhu, J. Pfeifer, and A. Bax. 1995. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J BiomolNMR 6:277.

137. Zimmerman, D. E., C. A. Kulikowski, Y. Huang, W. Feng, M. Tashiro, S. Shimotakahara, C. Chien, R. Powers, and G. T. Montelione. 1997. Automated analysis of protein NMR assignments using methods from artificial intelligence. J. Mol. Biol. 269:592.

138. Sattler, M., J. Schleucher, and C. Griesinger. 1999. Heteronuclear multidimentional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 34:93.

139. Nabuurs, S. B., C. A. Spronk, G. W. Vuister, and G. Vriend. 2006. Traditional biomolecular structure determination by NMR spectroscopy allows for major errors. PLoS Comput Biol 2:e9.

140. Laskowski, R. A., J. A. Rullmannn, M. W. MacArthur, R. Kaptein, and J. M. Thornton. 1996. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J Biomol NMR 8:477.

141. Kuszewski, J., A. M. Gronenborn, and G. M. Clore. 1997. Improvements and extensions in the conformational database potential for the refinement of NMR and X-ray structures of proteins and nucleic acids. J Magn Reson 125:171.

142. Dosset, P., J. C. Hus, M. Blackledge, and D. Marion. 2000. Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data. J Biomol NMR 16:23.

143. Lipari, G., and A. Szabo. 1982. Model-Free Approach To The Interpretation Of Nuclear Magnetic-Resonance Relaxation In Macromolecules.2. Analysis Of Experimental Results. J. Am. Chem. Soc. 104:4559.

144. Van Der Spoel, D., E. Lindahl, B. Hess, G. Groenhof, A. E. Mark, and H. J. Berendsen. 2005. GROMACS: fast, flexible, and free. J Comput Chem 26:1701.

145. Oostenbrink, C., T. A. Soares, N. F. van der Vegt, and W. F. van Gunsteren. 2005. Validation of the 53A6 GROMOS force field. Eur Biophys J 34:273.

146. Hess, B., and N. F. van der Vegt. 2006. Hydration thermodynamic properties of amino acid analogues: a systematic comparison of biomolecular force fields and water models. JPhys Chem B 110:17616.

147. Kutzner, C., A. van Buuren, E. Apol, P. Meulenhoff, P. Tieleman, A. Sijbers, A. Feenstra, R. Drunen, and H. J. Berendsen. 2006. GROMACS 4: user manualJ26.

148. Chen, X., and Y. Deng. 2007. Long-time molecular dynamics simulations of botulinum biotoxin type-A at different pH values and temperatures. J Mol Model 13:559.