Пространственная структура и динамика белка L7 из рибосомы Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

h у ' У' * 7 P

ju t- wS ......

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи УДК 577.963.3 577.322.52

БОЧАРОВ Эдуард Валерьевич

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И ДИНАМИКА БЕЛКА L7 ИЗ РИБОСОМЫ Escherichia coli

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н. A.C. Арсеньев

Москва 1998

Работа выполнена в группе ядерного магнитного резонанса Института биоорганической химии М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН на установке "Комплекс ЯМР-спектроскопии" (№96-03-08)

Автор выражает признательность научному руководителю Александру Сергеевичу Арсеньеву, сотрудникам группы ЯМР В.А. Жаравину, А.Г. Соболю, Л.И. Васильевой, Р.Г. Ефремову, А.П. Голованову, П.Е. Волынскому, А. О. Терехову, а также всему коллективу группы за внимание, поддержку и ценные советы, которые помогли ему в работе над диссертацией.

Автор особенно благодарен Анатолию Тимофеевичу Гудкову за тесное сотрудничество в работе и Валерию Николаевичу Бушуеву за ценные обсуждения результатов работы.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. 5

ГЛАВА I. РИБОСОМА И ЕЕ КОМПОНЕНТЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). 10

Современные представления о структуре и функции рибосомы и ее

компонентов. Ю

Физико-химические методы исследования строения макромолекул. 10

Морфология рибосомы 12

Рибосомная РНК. 16

Рибосомные факторы. 18

Структура рибосомных белков. 21

Синтез белка на прокариотической рибосоме. 28

Рибосомный белок L7/L12. 34

Заключение. 43

ГЛАВА II. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ДИМЕРА БЕЛКА L7 ИЗ

РИБОСОМЫ ESCHERICHIA COLI В РАСТВОРЕ. 44

Экспериментальные данные для определения пространственной

структуры димера рибосомного белка L7. 44

Отнесение сигналов в ЯМР спектрах белка L7. 46

Отнесение сигналов спиновых систем протонов. 46

Последовательное отнесение сигналов спиновых систем протонов. 50

Конфигурация Х-Pro пептидных связей. 52

Основные элементы вторичной структуры димера L7 и их упаковка в

пространстве. 53

Химический обмен амидных протонов димера L7 с растворителем. 60

N- и С-концевые фрагменты (Ser1-Ala37 и Ala47-Lys120) белка L7. 64

Фрагмент 1-37 рибосомного белка L7. 64

Фрагмент 47-120 рибосомного белка L7. 64

Расчет пространственной структуры димера L7. 67

Экспериментальные ограничения на межпротонные расстояния

и двугранные углы. 67

Продолжение отнесения кросс-пиков ЯЭО в спектрах NOESY. 72

Пространственные структуры N- и С-концевых доменов димера L7. 75 Внутри- и межмолекулярные гидрофобные и гидрофильные взаимодействия,

стабилизирующие пространственную структуру димера L7. 85

Заключение. 95

ГЛАВА III. ПЕНТАМЕРНЫЙ КОМПЛЕКС (L7)4L10. 97

Гомо- и гетероядерные спектры пентамерного комплекса (L7)4L10. 97

Пространственная организация пентамерного комплекса (L7)4L10. 102

Заключение. 108

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 109

Основные экспериментальные проблемы при исследовании рибосомных белков

методом ЯМР. (Обоснование выбора экспериментальных методик.) 109

Получение и очистка белков. 116

Получение спектров ЯМР. 118

Методика отнесения химических сдвигов сигналов в спектре ЯМР. 122 Расчет пространственной структуры методом молекулярной динамики в

пространстве торсионных углов. 123

Минимизация конформационной энергии. 125

Анализ гидрофобных и гидрофильных взаимодействий по методу МГП. 126 Теоретическое предсказание пространственной структуры рибосомного

белка L10 из Escherichia coli. 127

ВЫВОДЫ. 130

ПРИЛОЖЕНИЕ. 132

Таблицы. 132

Список сокращений. 142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 143

Введение.

Одной из наиболее фундаментальных и важных проблем молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белков. Синтез белка играет главную роль в таких процессах, как рост и дифференцировка клеток, поддержание их структуры и функций. Основная задача при биосинтезе белка состоит в обеспечении строго определенной последовательности аминокислотных остатков, уникальной для каждого нового белка. Именно уникальная аминокислотная последовательность определяет особое положение белков среди многих других биополимеров. Эта задача чрезвычайно сложна.

В настоящее время различают два типа биосинтеза полипептидов. Первый - наиболее важный и совершенный - адапторный синтез, при котором порядок присоединения аминокислот к строящемуся полипептиду определяется порядком чередования кодонов в мРНК и в структурных цистронах хромосомы. Второй - безадапторный синтез, при котором порядок чередования аминокислот обусловлен специфичностью энзимов каждой последующей реакции присоединения аминокислоты. Он менее распространен, допускает некоторые вариации в последовательности аминокислот, т.е. менее надежен, чем адапторный синтез, и используется при образовании лишь небольших по размеру пептидов (пептидных антибиотиков, некоторых гормонов и т.п.), которые содержат необычные аминокислоты (Б-изомеры, например). В последнем типе синтеза геном клетки определяет последовательность аминокислот весьма опосредованно - только через структуру энзимов. Естественно, такой путь немыслим при синтезе больших

спираль ДНК

стадия 2: трансляция

транспортная РНК

аминокислоты □

□ □

анхккодон

Рисунок 1. Схема последовательных этапов в биосинтезе белка.

полипептидов, так как количество специфических сочетаний включающейся аминокислоты со строящимся пептидом, которое требует все новых и новых разновидностей энзимов, становится чрезвычайно большим. Таким образом, безадапторный синтез не используется как основной путь синтеза белка. Поэтому именно адапторный синтез обычно называют биосинтезом белка.

Процесс перевода (трансляции) генетической информации с языка

нуклеотиднои последовательности синтезируемого полипептида является едва

ли не самым сложным из всех известных биосинтетических процессов (рис. 1). Во время биосинтеза белка в клетке принимают участие большое количество различных макромолекул и низкомолекулярных соединений, которые детерминированы друг относительно друга в пространстве и во времени. Центральной и наиболее сложной в структурном отношении частью этой системы является рибосома. Необходимым условием для понимания принципов организации и функционирования рибосомы является установление ее пространственной структуры и динамики на атомном уровне. Одним из возможных подходов выяснения структурной организации рибосомы, как самособирающейся частицы, является детальное изучение структуры входящих в ее состав РНК и белков, а также их комплексов в изолированном состоянии.

В отличие от дифракционных методов, для которых большинство рибосомных белков недоступны для изучения из-за трудностей получения упорядоченных кристаллов, ЯМР-спектроскопия позволяет исследовать конформацию и динамику белковых молекул в условиях близких к физиологическим. При этом необычайно высокая чувствительность параметров ЯМР (в частности, времен релаксации) к молекулярным движениям позволяет изучать самые разнообразные внутри- и межмолекулярные динамические процессы: конформационные перестройки, подвижность отдельных групп и больших фрагментов, самосборку, денатурацию, связывание лигандов и др. Основные сложности метода ЯМР связаны с тем, что ширина сигналов в спектре ЯМР пропорциональна размерам исследуемой системы. В результате для больших ассоциатов

макромолекул, например таких как рибосома, спектр ЯМР настолько уширен, что из него невозможно получить информацию о пространственной структуре. Одним из способов решения проблемы является изучение отдельных частей макрокомплексов и подбор условий, который сохраняет функционально значимую структуру молекул или отдельных их фрагментов и позволяет получить спектр ЯМР высокого разрешения. Современная спектроскопия ЯМР в растворе является эффективным методом установления пространственной структуры белков с молекулярной массой до 30-40 кДа. Зачастую это единственный метод, дающий детальную информацию о структуре и динамике белков и пептидов, конформация которых зависит от среды солюбилизации и взаимодействия с другими макромолекулами.

Работа была выполнена в группе ЯМР Института биоорганической химии М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и является составной частью проводимых в институте исследований структуры и функции биологических молекул.

Целью данной работы являлось определение пространственной структуры, изучение динамики и установление структурно-функциональной связи для белка L7 из рибосомы Escherichia coli методом ЯМР в водном растворе.

Диссертация состоит из введения, трех глав, экспериментальной части и выводов. В первой главе, являющейся обзором литературы, рассмотрены работы, посвященные структуре и функции рибосомы и ее компонентов. Во второй главе диссертации изложено отнесение химических сдвигов сигналов ЯМР в гетероядерных спектрах димера белка L7, а также его N- и С-

концевых фрагментов, и приведены результаты расчета пространственной структуры димера L7. Третья глава диссертации посвящена изучению пентамерного комплекса, состоящего из 4-х молекул белка L7 и рибосомного белка L10. В этой главе приведены результаты предсказания пространственной структуры белка L10 и обсуждена связь динамики белка L7 с его функцией в рибосоме. В экспериментальной части приведены сведения об используемых в диссертационной работе оборудовании и веществах, описаны методики приготовления препаратов, получения и обработки гетероядерных спектров ЯМР, а также реконструкции пространственного строения белков по данным спектроскопии ЯМР. В конце диссертации приведены список литературы, табличные данные и сокращения.

Глава I. Рибосома и ее компоненты (Обзор литературы).

Современные представления о структуре и функции рибосомы и ее компонентов.

Физико-химические методы исследования строения макромолекул.

Существуют различные физические методы исследования пространственной структуры макромолекулярных комплексов. Дифракционные методы (рентгеноструктурный анализ (РСА), электронная микроскопия (ЭМ), электронная криомикроскопия (ЭКМ), рассеяние нейтронов (РН)) на сегодняшний день являются самыми точными и мощными методами установления пространственной организации макромолекул. Для получения детальной информации о структуре отдельной молекулы или молекулярного комплекса методом РСА необходимо приготовление правильных трехмерных кристаллов. Однако трудности, возникающие при кристаллизации макромолекул, существенно возрастают при переходе к рибосомным компонентам и, по-видимому, обусловлены их большими размерами, сложностью формы, а также часто нестабильностью их нативной структуры в изолированном состоянии. В отличие от дифракционных методов, исследования спектроскопическими методами, такими как оптическая спектроскопия (круговой дихроизм (КД), инфракрасная спектроскопия (ИК) и другие) и радиоспектроскопия (электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР)), можно проводить как в природном окружении, так и в растворах, что позволяет изучать структуру

некристаллизующихся макромолекул, а также следить за их динамикой и конформационными перестройками. Методы оптической спектроскопии дают интегральные характеристики конформационного состояния молекулы или отдельных репортерных связей (групп). Получение детальной информации о структуре рибосомных компонентов радиоспектроскопическими методами нередко сопряжено со значительными трудностями, связанными с их высокой амфифильностью, тенденцией к агрегации, конформационным обменом и, как следствие, уширением сигналов в спектрах. Однако использование различных препаратов (мутантные аналоги, изотопное мечение, фрагменты молекулы, макромолекулярные комплексы) позволяет применять радиоспектроскопические методы в исследовании их структуры.

При допущение, что структура изолированных рибосомных компонентов аналогична их структуре in situ, можно разместить, например, высокоразрешенные структуры отдельных рибосомных белков или их комплексов в низкоразрешенных структурах субъединиц рибосомы, полученных дифракционными методами. При этом необходимо знать расположение и ориентацию белковых молекул в рибосоме. Информацию о расположении можно получить из экспериментов по нейтронному рассеянию, дающих карту расстояний между центрами тяжести молекул, а также из иммунных ЭМ исследований, из которых определяются относительные локализации поверхностей различных белков и рРНК фрагментов. Данные же об ориентации получают из кристаллографических исследования белок-белковых или РНК-белковых комплексов или из детального анализа белок-белковых, РНК-белковых или РНК-РНК кросс-сшивок.

Морфология рибосомы

Рибосомы найдены во всех известных живых существах, кроме истинных вирусов и некоторых других особенно просто устроенных клеточных паразитов, которые в своем развитии используют рибосомы клетки-хозяина. Рибосомы из самых разнообразных источников очень сходны по форме и архитектуре [1]. Наиболее изучены два основных типа рибосом, первый - из бактерий, синезеленых водорослей, а также из хлоропластов эукариотов с общим весом рибосомной частицы около 2,5 • 106 дальтон - 70S, второй - из других компонентов клеток эукариотов с большим весом около 4 • 106 - 80S. Под электронным микроскопом рибосомы выглядят как компактные округлые частицы с линейными размерами около 25 нм у прокариотов и несколько больше, до 30 нм, в случае эукариотов. По химическому составу рибосомы - чистые рибонуклеопротеиды, т.е. состоят только из РНК и белка. Соотношение масс РНК:белок в 70S рибосомах около 2:1 , а в 80S - 1:1. Прокариотическая 70S рибосома диссоциирует на большую 50S и малую 30S субчастицы, эукариотическая 80S рибосома - на 60S и 40S субчастицы. Рибосомы про- и эукариотов различаются и по ряду других особенностей состава, структуры и действия, однако эти различия непринципиальны. РНК в рибосомах присутствует главным образом в виде ее Mg2+ и Са2+ соли, а также связана с небольшим количеством полиаминов и диаминов (спермин, спермидин, путресцин). Важной особенностью строения обеих субчастиц рибосом является их очень высокая компактность. В отличие от обычных компонентов клеток количество связанной воды в рибосомах относительно невелико и составляет около 50% и менее. Общая

характеристика формы и размеры рибосом получены давно. Однако до сих пор эти данные, фигурирующие в различных обзорах, могут отличаться в зависимости от метода и условий измерения. Особое значение имеют колебания влажности рибосом, возможные различия в плотности ассоциации частиц, а также отклонения от осевой симметрии субчастиц в разных препаратах.

Функциональную архитектуру рибосомы можно понять, если проследить за ее эволюционным развитием. Большая субъединица рибосомы собирает полипептид, в то время как малая субъединица служит для сканирования мРНК (матричная РНК) поэтому их эволюция должна отличаться. Эволюция большой субъединицы рибосомы видимо началась с молекул тРНК (транспортная РНК), которые прикреплялись друг к другу, чтобы катализировать рост неупорядоченного пептида [2]. В дальнейшем молекулы тРНК стали использовать для синтеза матрицу в виде мРНК, при этом увеличилось время взаимодействия между молекулами тРНК, и появилась возможность синтезировать пептид с заданными свойствами. Затем для создания оптимального пространственного окружения вокруг синтезирующего центра и для защиты растущего полипептида на эволюционной сцене появилась рРНК (рибосомная РНК) большой субчастицы, которая постепенно обрастала белками, увеличивающими скорость и точность полипептидного синтеза. В тоже время для сканирования рамки считывания мРНК в помощь к рРНК большой субчастице появилась рРНК малой субчастицы. Многие из рибосомных белков малой субъединицы были найдены в других клеточных системах, связанных с молекулами

нуклеиновых кислот: репликации, транскрипции, сплайсинге РНК, SOS репарации, а также в качестве эндонуклеаз [3].

На протяжении многих лет пространственную структуру рибосом изучают дифракционными методами, и только в последние годы наметился существенный прогресс в этой области, что связано в первую очередь с развитием компьютерной техники и новых приемов математической обработки данных. Вместе с тем остаются проблемы и трудности присущие определенному методу и ограничивающие его использование. В частности, асимметричная структура рибосомы и её субъединиц сильно усложняет кристаллографические исследования. Наибольшую проблему при исследованиях на выращенных кристаллах рибосом представляет определение начальных фазовых углов, для этого было предложено множество подходов, некоторые из них в будущем могут достигнуть прос�