Изучение расположения транспортной и матричной РНК на рибосоме тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

#

.. московским государственный университет

су т. М.В. Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи УДК 576.85.48

Розен Кирилл Викторович

ИЗУЧЕНИЕ РАСПОЛОЖЕНИЯ ТРАНСПОРТНОЙ И МАТРИЧНОЙ РНК НА 'РИБОСОМЕ

02.00.Ю - Оиоорганическая химия, химия пр;фояшх и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКБа - 1993 г.

Работа выполнена на кафедре хишш природных соединений Химического факультета МГУ им.И.В. Ломоносова и на кафедре биохимии н молекулярной биологии Университета штата Массачусетс, США.

Научные руководители - доктор химических наук,

профессор, Чл.-корр. РАН А.А.Богданов

- профессор Р.А.Зиымерманн

Официальные ошоненты - доктор биологических наук,

профессор О.О.Фаворова

- кандидат химических наук, М.Ф.Турчинский

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН

им.В.А.Энгельгардта •

Защита состоится *\У "/^¿Х* 1993 г. в. ÎS . часов на заседании специализированного, совета Д osa.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им.М.В. Ломоносова по адресу: иэвээ, Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория soi.

С .диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "ÇocS/bCtU^Jt^993 г.'

Ученый секретарь • ' " , специализированного совета _ '

кандидат химических наук / .s/s-^---*-^-__? И.Г.Смирнова

Общая характеристика работа.

Актуальность проблемы.Трансляция - синтез бежа на рибосомах -представляет собой один из наиболее фундаментальных процессов, протекающих в живой клетке. Детальное понимание его механизмов является одной из основных задач современной молекулярной биологии. Важнейшими участникам трансляции являются рибосомы, тРНК и МРНК. Изучение механизма биосинтеза бежа на молекулярном уровне невозможно без подробных .знаний о пространственной структуре комплексов, содержащих рибосому и указанные.макромолекулы. К настоящему времени третичная структура тРНК расшифрована с высоким разрешением. Предложен ряд в целсм согласующихся между собой моделей пространственной организации рибосомы. Кроме того установлено, что взаимодействующий с рибосомой район мРНК не содержит двуспиральных участков. Эти данные создали пр~¡щосылки, необходимые для детального изучения тРНК- и мРНК-рибосомных взаимодействий.

Цель работа. Детальное изучение расположения тРНК в пептидйльном - и мРНК в мРКК-связывающем участках рибосомы методом фотоаффинной модификации.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе получен ряд сшивок между тРНК, мРНЙ й- рибосомными белками в пептидильном и мРНК-связыващем участках рибосомы. В отличие от многих сходных работ, сшивки получали с помощью коротких сшивающих реагентов ( расстояние между- сшиваемыми атомами не превышало з-4 А ) в условиях, исключающих инактивацию рибосом, функциональная специфичность сшивок была строго доказана.

В результате, были идентифицированы рибосомные белки, непосредственно' сближенные с центральной частью ъ-образной молекулы . тРНК в Р-участке. Полученные данные позволили выбрать одну из нескольких существующих на настоящий момент моделей пространственного расположения тРНК в указанном участке рибосомы как наиболее адекватную.

Поскольку расстояния между любой парой нуклеотидов тРНК известны из данных ректгеноструктурного анализа, указанные результаты позволили оценить расстояния между рядом рябосомных компонентов. Таким образом, полученные в. настоящей работе данные могут служить источником уточнения уже имеющихся модзлей структуры рибосомы.

В сходных работах по мРНК-рибосомным сшивкам в качество модельных матриц, как правило, использовались синтетические олиго- и Полинуклеотида с "неприродными" последовательностями. В тех же случаях, когда использовались аналоги природных мРНК, функциональная специфичность полученных сшивок не была строго доказана. В настоящей работе были идентифицированы белки, сближенные с аналогом природной мРНК в истинном мРНК-связывавдём участке рибосомы. Кроме того использование в данном исследовании 5-азидоу^идина в качестве сшивавдего реагента позволило получить новую, по сравнении с првдшествувдими результатами нашей и других лабораторий, информацию о белковом окружении мРНК на рибосоме.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международном конгрессе по биотехнологии, Гавана ( Куба ), 1989; Международном симпозиуме "Регуляция трансляции", Рига, 1989; симпозиуме ембо/ревз/шв "Механизм и контроль трансляции", Ноордвикераут (Нидерланды ), 1990; IV Всесоюзной школе-семинаре "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии", Рига, 1990; симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии, Кистоун ( США ), 1991; XIV Мевдународном симпозиуме по тРНК, Познань ( Польша ), 1991; Международной конференции "Трансляционный аппарат", Берлин ( ФРГ ). 1992.

Структура и об'ем работы. Диссертационная работа изложена на /4^траницах машинописного . текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы ( посвящен современным представлениям о генетике, биосинтезе, структуре рибосомных белков, и их функционированию в процессе трансляции ), результата, обсуждение результатов, материалы и методы, вывода. Материал иллюстрирован ^¿рисунками. Библиографический указатель включает /^цитированных работ.

Содержание работы.

1.Идентификация рибосомных белков, сближенных с тРНК в Р -участке рибосомы.

1.1 Синтез фэтоактивного производного тРНК.

Для введения фотометки в тРНК мы использовали подход,, основан-

иый на статистическом, включении 4-тиоуридана ( s4u ) - фэточувсг -вительного аналога уридина - в транскркпг тРШ в ходе Т7 РНК-полимеразной реакции. В качестве модельной тРНК для сшивки с компонентами Р -участка рибосомы мы использовали Т7 транскрипт TPHK"et-2 из б.coli. Поскольку последовательность TPffií"et начинается с остатка цитидина, ген такой тРНК, находящийся под контролем Т7 промотора, должен транскрибироваться с низким выходом. По этой причине в настоящей работе была использована плазмида, кодирующая предшественник TPHK"et. Указанный предаственнпк содержал около 100 дополнительных 5' -концевых нуклеотидов, причем последовательность, примыкающая к Т7 промотору, эффективно узнавалась Т7 РНК -полимеразой. Расщепление такой плазмида эндонуклеазой рестрикции BstNi позволило получить матрицу для синтеза полноразмерной тРНК,. оканчивающейся последовательностью ССА. Для того, чтобы удалить сайт рестрикции Bstm из участка гена тРНК, соответствующего дигидроуридиловой петле, остаток g, кодирующий С в положении 17 тРНК, был заменен на А, так что полученный транскрип? содержал остаток ц в данном положении ( Рис.1 ).

Для статистического включения s4u в Т7 транскрипт тРНК"е^ наряду с s4utp в Т7 РНК -полкмеразную реакцию добавляли итр. Зрелую тРНК получали, из пре-тРНК, обрабатывая s4u- содержащий транскрипт РНКазой Р из в.subtili is. Процессияг пре- тРНК протекал количественно. Транскрипт предварительно метили либо "внутренней" меткой -а-[32р ] NTP - в ходе транскрипции либо - по 5' -концу после получения зрелой тРНК.

Для того, чтобы контролировать связывание ТРНК с Р -участком рибосомы, транскрипт аминоацшшровали [Зн ] метионином с помощью экстракта sioo из е.сои. Максимальный уровень амяноацилирования составлял около 1000 пмоль/А2'60. Тот факт, что выход аминоацилиро-вания не достигал 100%, можно об'яснить либо отсутствием в тРНК модифицированных оснований, либо ошибками в синтезе 3'-конца молекулы Т7 РНК -полимеразой. Для того, чтобы стабилизировать амино-ацильную связь и иметь возможность- для эффективного контроля за связыванием тРНК с Р -участком рибосом, остаток, метионина HetTPHK^et N ацетилировали.

-а

А С с А

1 с а g с с g 70 с с g с

g с 60

g с j^a

g u. с g g с с а

с а 10 с а

17 ¿j. с g a g g_u_c g g с

17.1 i C50 JU^

g g cjj.c jj.

g а с n a

U 20

_и А А

с G

G С

30 G с 40

G С

С А

А

С л

tief

Рис л Вторичная структура Т7 трацскрипта тРНК£ -2 из е.coli. Остатки уридина подчеркнуты.

1.2 Получение комплекса TPHK*70s рибосома*мРНК.

Тройной комплекс тРНК * 70s рибосомы * мРНК получали, смешная тРНК с рибосомами е.coli ( tight couples ) в соотношении 1:4 при избытке poiy ( a,g,а ), которую использовали в качестве мРНК. 7080% прцентов тРНК связывалозь с рибосомами в присутствии - и 3040% - в отсутствии матрицы. Около 90% процентов связанной аминоацил -тРНК реагировало с пуромицином.что говорило о количественном связывании указанной тРНК с Р-учасгком рибосом и, следовательно, о высокой функциональной активности изучаемого нами транскрипта.

1.3 Сшивка тРНК с рибосомой.

TPHK"et сшивали с рибосомами УФ -светом с длиной.волны > 300

гш. Облучение нз влияло на способность аминоацил -тРНК реапфовать с пуромицином. Для того, чтобы выяснить,действительно ли наблюдаемые наш сшивки происходили в Р -участке рибосомы, ми следили за распределением [Зн ] метионина между рибосомными субчастицами с помощью ультрацентрифугировашя в градиенте концентрации сахарозы после УФ -облучения и добавления пурсшщина (Рис.2 ). Как видно из рисунка* сравнительно небольшая ( около 4% ) фракция тРНК, кова-лентно связанная с каждой из субчастиц, была способна количественно реагировать с пуромкцином в составе 70S рибосомы. Тагам образом, как сшитая с рибосомами амшгоацкл -тРНК, так и рибосомннй Р-участок сохраняли функциональную активность даже после аффинной модификации'.

Наприеле ¡ше седиментации -

Рис.2 Разделение 7os рибосом на . субчастицы при помощи ультрацентрифугирования в ю% - зо% сахарозном градиенте после УФ - ОбЛуЧвНИЯ КОМПЛеКСа [3Н ]TPHK"et* 70S рибОСОМЫ * poly ( A,G,и ): а - перед добавлением пуромицина, б'- после добавления пуромицина.

1.4 Анализ тРНК -рибосомных сшивок.

Распределзние [32р ) - радиоактивности между рибосомными субчастицами, как и следовало ожидать, ничем не отличалось от таково-

го для [Зн ]-радиоактивности. В тог? елучаа, когда тРЩ-рибасоащый комплекс не облучали УФ-светом, равно как и в отсутствии в Т7 транскрипте остатков s4u, 132р)-метка практически не включалась в рибосомные субчастицы. С другой стороны, количество 132р 1-метки, включившееся в каадую из .субчастиц, практически не зависело от присутствия в изучаемой системе МРНК и от того, была ли тРНК ами-ноацилирована перед облучением комплекса. Согласно проведенным нэки расчетам, около л % тРНК, связавшейся с рибосомами в присутствии мРНК, сшивалось с каждой из субчастиц.

Рис.з Разделение кова-ленгных РНК-белковых и РНК-РНКовых комплексов в полиакриламидном геле, содержащем ДСН и моче -вину: sos - материал из пика сахарозного градиента, соответствующего большой субчастице рибосомы, sos + к - материал из пика сахарозного градиента, соответствующе -го большой субчастице рибосомы, после обработки про'теиназой к, зоб -материал из пика сахарозного градиента, соответствующего малой субчастице рибОСОМЫ,30S + к - материал из пика сахарозного градиента, соответствующего малой субчастице рибосомы, после обработки протеина-зой к.

Материал из пиков сахарозного градиента, соответствующий каждой из субчастиц, анализировали с помощью гель -электрофореза в присутствии ДСН и мочевины ( Рис.з ). Подобная электрофоретическая

Het ТРШ, » L1

Hat ТРИХ, • 127

4

О ь

£9t

тИИ. « S19

»

система позволяет разделять индивидуальные ковзлентные РНК-белковые и РНК-РНКовые комплексы. Как видно из Рис.з, в результате сшивки с рибосомой образовались два ковалентных комплекса мевду тРНК и компонентами малой субчастицы рибосомы, причем только один из них был чувствителен к обработке протеиназой к.

В случае sos субчастицы были обнаружены три комплекса, два из которых были чувствительны к протеиназному гидролизу. На основании этих данных мы предположил!, что изучаемая наш тРНК сшивалась с одним 3os и двумя sos белками. Комплесы, нечувствительные к протеиназной обработке,повидимому, возникали в результате сшивок между Т7 транскриптом и 16S и 23S рРНК,соответственно. Поскольку каждый комплекс содержал полгоразмерную тРНК, мы смогли оценить выход сшивок в каждом из описанных случаев. Так, с 3os белком сшивалось 45% , а с igs рРНК - 55% тРНК, ковалентно связашюй с малой субчастицей ,с sos белками - и% и 42%, ас 23S рРНК - 37% тРНК, ковалентно связанной с большой субчастицей.

Как и следовало ожидать, степень комплексообразования в кандом случае слабо зависела от присутствия в изучаемой системе мРНК. В отсутств1ш матрицы выход снизался приблизительно в два раза, что хорошо корреллировало с измеренными нами уровнями связывания тРНК с рибосомами в присутствии и в отсутствии ро i у ( л, g, и ) (см. вше). Степень образования каждого комплекса не зависела и от того, была ли тРНК аминоацилирована перед сшиванием. Поскольку нами било показано, что аминоацил -тРЯК сшивалась с рибосомами исключительно в Р -участке, мы пришли к выводу о том, что популяция деацилированной тРНК, содержавшаяся в использованном нами препарате, сшивалась с тем же участком рибосом. Из вышесказанного следует, что наблюдаемые нами сшивки были строго функционально специфичны.

i.5 Анализ сшивок мевду тРНК и малой субчастицей рибосомы.

Анализ материала из пика сахарозного градиента, соответствующего 3os субчастице, после исчерпывающего гидролиза РНКазой Тх( в этом случае использовался .гранскрипт, меченый "внутренней" меткой ) с помощью электрофореза по Лзммли показал, что тРНК сшивалась с одним белком 30S субчастицы (Рис.4 ). Для идентификации этого белка продукты РНКазного гидролиза материала

из пика малой субчастицы анализировали, используя ВЭЖХ. Как видно из Рис.5, [32р ] -радиоактивность мигрировала в градиенте концентрации ацетонитрила как белок 519. Повторный анализ в условиях более эффективного разделения белков,: мигрирующих в ацетонитрильном градиенте поблизости от 319, дал идентичные результаты. Таким образом, нами был сделан вывод о том, что Т7 транскрипт тРНК^ексшивался с белком Б19.

____г

I

■ к. ■'

«ига» ^

} ]

Б2«ех5» . 1

БЗ^^г |

Б4 «чу ****** ■

51 «.-¿а» ' 85 «аггя»

Б13И. чгз?^'

ею,17,19,го,21,

815,16 ^^

Рис. 4 Анализ белков малой субчастицы рибосома, ковалентно связанных с тРНк"еЬ, с помощью гель -электрофореза по Лэмадш:

1 - окрашенные белки-мар -керы малой субчастицы,

2 - материал из пика, соответствующего зоб субчастице, после исчерпывающего гидролиза РНКазой Т1 ( авторадиограмма ).

к о о

\ ф

о

0.37-1 0.35 0.33 Н 0.31

1> 0.29 Н 0.270.25

г 400

-300

-200

100

гз

(2, О

И

Й

Е}

сз р».

0Е+0

21 41 61 81 101 121 141 161

Время'олюции ( мин.)

Рис.5 Анализ белков малой пубчастицы рибосомы, ковалентно связанных с тРНК"еЬ, с помощью ВЭЖХ-. верхний профиль -немеченые белки-маркеры, нижний профиль -материал из пика сахарозного градиента, соответствующего• зоб субчастице, после исчерпывающего гидролиза РНКазой т1.

Для того, чтобы идентифицировать нуклеотидный остаток молекулы тРНК, ковалентно связанный с указанным белком, мы использовали следующий подход. 5' -меченную тРНК, ковалентно связанную с 319, ( комплекс выделяли, как показано на Рис.з ), статистически расщепляли щелочью с последующей фенольной экстракцией олиго - и полинуклеотидов, сшитых с белком. Материал, оставшийся в водной

фазе, анализировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле ( Рис.б ). „

од:

.н §

•Лг

Рис.6 Идентификация нук-леотидаого остат-

фенольной экстракции

ЕЗз -»зо СЭ» «О •

егаСО еэ с» «О

' ОЭ®3 « С«3>СЭ О сэ <» «а

вне сЭ

сэвэ Ого

в» О «гэ в» «э

( авторадаограмма

ка тРНК

■Met

ков'а-

лентно связанного с белком Б19: X,

тРНК^е1- продук-

тРНК^3*-

ты частичного щелочного гидролиза тРНК"е,: после фе-нольной экстракции, ь-Т7

продукты частичного щелочного гидролиза Т7 транскрипта тРНК^еС после фенолыюй экстракции, ь-Т7 тРНК"61* 319-'цродукты частичного щелочного гидролиза ковалект-ного комплекса между Т7 тран-скриптом тРНК"еЬ и белком 819 после шлиакриламидного геля ).

Как видно из рисунка, зоны "леддера", получившегося в результате расщепления РНК. исчезали после положения, соответствующего остатку А4 6. Это означало, что белок был ковалентно- связан с нуклеотидом и47.

i.6 Анализ сшивок между тРНК и большой субчастицей рибосомы. Анализ материала из sos пика сахарозного градиента при помощи

злекторофореза по Лзммли показал, белками большой субчастицы ( Рис.7 ).

1 2

UÍ

что тРНК скидала сь с двумя

Рис.7 Анализ белков большой субчаспщы рибосомы, ковзлентно связашшх с rPHK"et, с помощью гель -электрофореза по Лзммли:

1 - окрашенные белки-мар--керы большой субчастицы,

2 - материал из гшка, соответствующего sos суб-частаце, посла исчерпывающего гидролиза РНКазой ti ( овторадиограмма ).

15,б , ИЗ L15.16

L10 ^»яя!^, ipt 19,11.17.22 — £ '"% Ы9.24 ~ГГГГ,"> ^j* 1.18,23,27*^®»®» ' ■

1/7/12,25,28 ,*íss3ss» . •

133,34 129,30 '

I

Tj-гидролизат фракций, соответствующих пику sos субчастюда,. анализировали мзтодсм ВЭЖГ (Рис.в). Один' из модифицированных белков мигрировал в ацетсиитрильном градиенте как li/ls, тогда как другой - как L2 7.

Для окончательной идентификации ковалентные. комплесы мевду sos ■белками и тРНК, выделенные кзк показано на Рис.з, анализировали с помощью антител против белков большой субчастицы (Рис.э). Комплекс, обладавший меньшей подвижностью в геле ( Рис.з ), давал по ложительную реакцию с анти -ы, тогда как болое легкий комплекс -

о ч

0.36

0.34

0.32-

0.3

0.28-

0.26-

0.24-

L2T

I

Шш

V/ÍS -300

MÍUUxJu

1-200

l .

100

21 41 61 81 101 121 141

Время ЭЛЮЦ1Ш ( мин.)

161

в а о

л н а о И

н

й со

о

га Л

Pi м п

0Е+0

Рис.8 Анализ белков большой субчастица рибосомы, ковалентно связанных с тРНК"еЬ, с помощью ВЭЖХ-. верхний профиль - немеченые белка-маркеры sos субчастицы, нижний профиль - материал из пика сахарозного градиента, соответствуюцего sos субчастице, после исчерпывающего гидролиза РНКазой ti.

с анти -Ь27. Таким образом, исходя из совокупности полученных результатов, мы пришли к выводу о том, что тРНК сшивалась.' с белками ы и Ь27 большой суочастицы рибосомы.

.Попытка идентифицировать нуклеогиды тРНК, ковалентно связанные. с указанными белками, при помощи описанного вше подхода не дала столь ясных результатов, как это было в случае сшивки и47-819. Зоны соответствующих "леддеров" не исчезали полностью - интенсивность их лишь ослабевала в несколько раз после положения, соответствующего приблизительно 17-му нуклеотиду тРНК. Для того, чтобы выяснить, действительно ли указанные белки сшивались с данным районом Т7 транскрипта, мы использовали другой подход, который заключался в защите модифицированного участка тРНК от гидролиза РНКазой Т1 комплементарными олигодезоксинуклеотидами. В тех случаях, когда для защиты "свободной" 5'-меченой тРНК использовались

олигонуклеотиды комплементарные первым 12-гк или 19 -ти основаниям TPHKjQt, оСразовывались, Соответственно, 12 -ти или 20 -тичленные

600

Е

о

л ь о о

га Р,

0, СМ п

400

200

600

400

200

Белки 50S субчастицы Еис.9 Иммунологическая идентификация белков большой субчастицы, ковалентно' связанных с TPffií"et: слева - анализ ковалентного тРНК-белкового комплекса с меньшей подвижностью в полиакриламидном геле { см. Рис.з ), справа - анализ ковалентного тРНК-белкового комплекса с большей подвижностью в полиакриламидном геле ( см. Рис.з )

фрагменты ( Рисло ). В тех же случаях,когда с тРНК были сшиты короткие пептида, получившиеся в результате обработки комплексов тРНК 'ы и тРНК -Ь27 протеиназой К, защита 12 -тичленным олиго-нуклеотидом приводила к образованию фрагментов тРНК той же элетро-форетической подвижности, что и в описанных выше контрольных эк-

спериментах ; в случае защиты 19 -тичленным олигонуклеотидом получались фрагменты, мигрирующие в геле 'медленнее, чем соответству-иций 20 -тичленный фрагмент тРНК в контрольной пробе. Очевидно, что замедление подвижности защищенных участков' тРНК СыЛо вызвано наличием ковалентно связанных пептидов. Это означает, что белки ы и L27 сшивались с участком тРНК, расположенным между положениями 12 и 18 . Указанный район использованного нами транскрипта TPffit"et содержит только два остатка уридина - в положениях 17 и 17.1. Таким образом, один из этих нуклоотидов ( либо оба ) был ковалентно связан с белками ы и Ь27.

Тот факт, что в случае сшивки тРНК -ы мы наблюдали количественное образование комплекса мевду 20 -тичленным фрагментом тРНК и продуктами протеолиза бежа, означает, что ы сшивался исключи-, телью с указанной областью тРНК. Что касается сшивки тРНК -L27, то при ее анализе наряду с 20 -тичленным фрагментом тРНК, сшиты}.! с пептидными фрагментами белка, образовывался также и свободный 20-тичленный фрагмент. Источником такого фрагмента могла служить как свободная тРНК, возникшая в результате диссоциации РНК -белкового комплекса, так и тРНК, сшитая с L27, вне указанного участка.

Остатки тРНК, сшивавшиеся в наших опытах с белками sis, li и L27 расположены в угловой части третичной структура ь-образной молекулы тРНК ( Рис.и ). .

Если модель третичной структуры тРНК ориентировать тагам образом, чтобы плоскость, проходящая через антикодон, угол ж 3'-конец молекулы, была перпендикулярна плоскости рисунка, то положение 47 окажется, расположенным слева, тогда как положение 17- справа от этой плоскости. Таким образом, согласно нашим результатам, "левая" часть молекулы тРНК, находящейся в Р -участке 70s рибосом, должна примыкать к малой субчастице, тогда как "правая " - к большой субчастице.

Каждый из белков, сшивающихся, по нашим данным, с угловой частью молекулы тРНК, был ранее локализован на рибосоме. Так, белок si9 картирован с помощью ЮМ, нейтронного рассеяния и данных по белок-белковым сшивкам в верхней части головы малой субча'йтнцы, причем, по крайней мере, некоторые его участки расположены на поверхности межсубчастичвого контакта.

ь

о

<В!>

м $

еяЖЗ

Рис.10 Идентификация нук-леотидных остатков тРНк"вк, ковалентно ■ связанных с белками ы и ьп с помощью электрофореза' в полиакрил-амидном геле ( авторадиограмма )

1 - Т7

2

обработанный РНКазой т1 в присутствии олигодезокси-нуклеотида, комплементарного положениям 1- 18, з -

транскрипт тРНК"вЬ, Т7 транскрипт тРНК"6*,

Т7

тРНК

МеЪ

о

транскрипт обработанный РНКазой Т1 в присутствии олигодезокси-нуклеотида, комплементарного положениям 1- 12, 4 -ковалентный комплекс Т7 тРНк"е<:* ы, обработанный протеиназой к, 5 -ковалентный комплекс Т7 тРНК"®** ы, обработаыый протеиназой к, и РНКазой Т1 в присутствии олигодезокси-нуклеотида, комплементарного положениям 1-га, б - ковалентный комплекс Т7 тРНК"е1:* ы, обработанный протеиназой к, и РНКазой' Т1 в присутствии олигодезоксинуклеотида, комплементарного положениям 1-12, 7- ковалентный комплекс Т7 тРНК"е<:* ьп, обработанный. протеиназой к, 8 - ковалентный комплекс Т7 тРНк"оЪ* Ь27, обработанный протеиназой к и РНКазой Т1 в присутствии олигодезоксинуклеотида, комплементарного положениям 1-18, 9 - ковалентный

«■О

с! еэ о о

комплекс Т7 тРНК' твии о;

1-12, т1 -продукты статистического расщепления Т7 тРНК^ т1, ь - продукты статистического щелочного гидролиза Т7 тРНК*

с* Ь27, обработанный протеиназой к и РНКазой т1 в присутствии олигодезоклиуклеотида, комплементарного положениям

РНКазой

Согласно результатам Юй и данным по белок- белковым сшивкам, белок ы расположен в области sos субчастицы, получившей название ха -стержня, тогда еж башк L27 - между ы-стержнем и центральаым Протуберанцем, на швецхшмяя большой субчастицы, обращенной к aos рибосоме.

Из сказанного ададувэг, что цуклеотид в положении 47 TPHK"et, по всей вероятноста, щшшкзет к верхней части головы малой ¡субчастицы. Поскольку 17-е основание, находящееся, согласно модели

о

третичной структуры тРЕ2. жа расстоянии около IOA от 47 -го, сшивалось в-наших опытах с бетами большой субчастицы, становится ясным, что пологэниз 4? дают) быть сближенным с участком s19, находящимся на пове|ишста шетубчасгичного контакта.

Поскольку полоякшв 17 айК^^сближено с белками ы и L27, это основание, повидтацу, растшшено в районе sos субчастицы, находящимся мевду ы -стершем и центральным протуберанцем.

Представленные вше результаты в сочетании .с данными, полученными друга® авторами, согласно которым антикодон тРНК сближен с нуклеотидда ci4oo íes рРНК, расположенным у основания платформы малой суОчасзицн, а З'-конец - с белками L27, ьг и ыб, расположенными между центральным протуберанцем и телом большой субчастицы, позволили изы выбрать одну из нескольких существующих на настоящий момент моделей пространственного расположения тРНК в указанном участке работает как наиболее адекватную ( Рис.12 ).

Расстояния мевду изрой лшйшс нуклеотидов TPHK"et известны из данных рентгено структурного анализа . Полученные нами, а также другими авторами результата »тут служить независимым- источником оценки расстояний мздщг рзщш рибосомных компонентов. Так,' белки ы и L2 7, по всей вероязшета, непосредственно примыкают друг ок другу. Эти белки не дагуз бга удалены от si9 более, чем на ю а, а от нуклеотида cuco íes рЕЕК, сшивавшегося с антикодоном тРНК в Р -участке, - более, тем вз 50 а. Расстояние между si9 и ciído, в свою очередь, должно составлять около 40 а.

LI_127

С

17 .. ТЗ -%

17.1 g

1С G С С G G G

G U

A 10 G С G A G

A C С A A С

G 70 С . С С С

С С С С С

£0 U А

А А

G С U С

G А U 20

G U С G G С50

r A^S19 A AG G С

С 40 С A

A

U

О U

'ис.11 Остатки тРНК

Met

ковалентно связанные с белками Li,

an и si9 - вторичная и третичная структуры тРНК.

с

Рис.12 Модель пространственного расположения тРНК в Р-участю рибосомы - на малой и большой субчастицах ( на рисунке приведет ИЭМ модели рибосомных субчастиц ).

2. Идентификация рибосомных белков, сближенных с°мРНК-связывавдим участком рибосомы. В качестве модельной матрицы для сшивок с рибосомой мы выбрал]

Т7 транскрипт, кодирукщий N -концевой участок белка его фага л ( гагзг ). Эта мРНК имела длину 36 нуклеотидов и содержала протяженную ( э нуклеотидов ) последовательность Шайн -Дальгарно, находившуюся' на расстоянии трех нуклеотидов от .рнициа торного кодона мю ( Бис. 13 ).

-10 +1 +10 +20 ** * * * ** -

ОСССААССАССиисиАиССААСААСССДиААССииС

Рис.13 Первичная структура мРНК гаг31. Последовательность Шайн-Дальгарно и инициаторный кодон подчеркнуты. Остатки уридина обозначены *. Цифрами обозначены номера нуклеотидов мРНК, если принять'остаток а в инициаторном кодоне за +1.

Подобный выбор был основан на следующих соображениях.. Во -первых, такая мРНК имела природную последовательность, а значит,' должна была связываться с истинным мРНК -узнающим участком рибосомы. Во -вторых, данная матрица способна эффективно связываться с рибосомами в присутствии инициаторной тРНК. Различные инициаторше комплексы мевду сго-мРНК и рибосомой были подробно охарактеризованы в нашей лаборатории при помощи нескольких методов. Более того, сотрудниками нашей лаборатории уже получен ряд сшивок мевду з4и -замещенными производными данной мРНК и рибосомой.

Поскольку, согласно многочисленным литературным данным, мРНК -связывающий участок расположен на малой субчастице рибосомы, мы изучали мРНК -рибосомные сшивки в составе тройного инициаторного комплекса тг31 * зоб субчастица* тРНК"еЬ.

2.1 Синтез фотоактивгого производного мРНК.

Для введения фотометки в мРНК мы использовали подход, основанный на статистическом включении 5-азидоуридина ( 5ы3и ) -£оточувствительного аналога уридина - в транскрипт мРНК в ходе Т7 РНК-полимеразной реакции.По всей вероятности, это соединение вшивается с бежами и нуклеиновыми кислотами по механизму иному, гем з4и, таким образом, используя данный реагент, мы расчитывали юлучить дополнительную информацию о белковом окружении мРНК на

рибосоме. Для того, чтобы добиться статистического включения sn3u В транскрипт. mz31, используемый для сшивок с рибосомой, в транскрипционную систему наряду с sn3utp добавляли utp. поскол^' для идентификации модифицированных рибосомных белков требовалась высокомеченая мРНК, в РНК -полимеразную реакцию помимо немеченых нуклеозндтрифосфатов добавляли, о-[32р jütp.

2.2 Получение комплекса mPHK*30S рибосома *TPHK"et и сшивка мРНК с рибосомой.

Т? транскрипт мРНК, приготовленный, как описано выше, смешивали с 30s рибосомами е.coli и тРНК^е(: в соотношении 1:4:40. Образовавшийся таким образом комплекс очищали от несвязавшейся мРНК при помощи гель -фильтрации.

2.3 Анализ сшивок между мРНК и рибосомой.

Комплекс mPHK*30S рибосома *TPHK"et облучали УФ ■ -светом с длинной волны > 280 нм и обрабатывали смесью РНКаз. Белки, сшитые с матрицей, идентифицировали с помощью одномерного и двумерного гель -электрофореза. Как и следовало ожидать, уровень включения радиоактивности в рибосомные 'белки сильно зависел от присутствия в матрице остатков sn3u. Степень фоновой модификации белков' в отсутсвие сшивающего агента была приблизительно на порядок величины ниже, . чем' при использовании мРНК, содержавшей 5-азидоуридин.

Анализ модифицированных белков с помощью двумерного электрофореза в ПААГ пока§ал, что матрица сшивалась с белками s7, s5, s4 и s3 ( Рис.14 ). следует помнить, что короткие олигонуклеотиды, ковалентно связанные с белками ( как это было в нашем случае ), згмедляюг элекрофоретичоскую подвижность последних, что, в принципе, может привести к ошибкам при идентификации. Тем не менее, в использованной нами системе разделения S7, ss, зз и 54 хорошо отделялись от прочих белков. Кроме того перечисленные белки имеют относительно высокие молекулярные массы, и замедление их подвижности в геле по сравнению с подвижностью соответствущих маркеров было весьма незначительным. Таким, образом, в данном случае выбранный нами метод аналйза можно рассматривать как адекватный. •

* бз е. в4

$

Э5 *

Рис. 14 Идентификация белков зоб субчасгида рибосомы, ковалентно связанных с тг31 мРНК в комплексе тг31*30Бсубчастица* тРНК"8^, с помощью двумерного гель - электрофореза :а - окрашенные белки-маркеры зоэ субчастицы, б - белки, сшитые с мРНК ( авторадиограмма ). • .

В том случае, когда для идентификации сшивок использовалось лишь второе направление данной двумерной системы, мы наблюдали также модификацию белка Б1

В том случае, когда мРНК связывали с рибосомами в отсутствии •тРНК"8*, матрица сшивалась с белками Б7 и Б15/1б/17, то есть наблюдаемая нами модификация белков Б5, Б4 и бз была строго тРНК -зависимой . Указанный набор сшивок был получен исключительно в тех случаях, когда мы использовали препараты активных рибосом. Таким образом, перечисленные белки сближены, по всей, вероятности, с истинным мРНК -связывающим участком рибосомы.

Использование метода гель -фильтрации позволило нам выделить лишь стабильные мРНК -рибосомные комплексы С как в присутствии, так и в отсутствии тРНК ), поэтому наблюдаемые нами сшивки с

- В2 * БЗ

* V

• 513Л4

эю * ^

* 817/15 Э19/20/21 »6 ад

белками Э7 и 515/16/17, скорее всего, отражают расположение мРНК в специфическом бинарном, комплексе МРНК -рибосома. Поскольку в присутствии тРНК исчезала лишь сшивка с 315/16/17, представляемся вполне вероятным, что белок Б7 сближен с мРНК как в бинарном, так и в тройном комплексе.

Белки 37, 35, э4 и бз сшивались с различными мРНК в работах других авторов. Несмотря на то, что последние не свободны от перечисленных выше методических недостатков, результаты этих исследований хорошо согласуются с нашими данными и, видимо,, также отражают истинное расположение мРНК на рибосоме.

Изучаемая нами мРНК содержала две сильно удаленные друг от друга группы остатков уридина - в 3' -концевой области и в районе инициаторного кодона. Полученные ранее нами, а также другими авторами данные позволяют высказать предположение о тем, какиь образом сшивки с указанными белками распределялись между этимг группами. Поскольку в одной из работ, проделанных в наше! лаборатории, белок Э7 сшивался с областью мРНК, расположенно! между инициаторным кодовом, .находящимся в Р-участке рибосомы, I последовательностью Шайн-Дальгарно, мы предположили, что в наше« случае Б7 ковалентно связывался с одним из остатков уридина ] положениях (-4 - +2) сго-мРНК. В опытах, поставленных рядо! авторов, белки бз, б4 и б5 сшивались с з'-концевыми участкам! различных модельных матриц, поэтому в представленных выш< экспериментах указанные белки, по всей видимости, ковалента связывались с одним из остатков +1.4, +19, +20 изучаемой нами ыРНК

Вывода.

1. Методом фотоаффинной модификации показано, что в Р -участк рибосомы основание в положении 47 тРНК"е*из е.сои находится непосредственной близости от белка Б19.

2. Белки ы и Ь27 сближены с положением 17 тРНК" е,:в Р -участк рибосомы.

3. В составе тройного. комплекса мРНК * рибосома * тРНК"0* мРН находится в контакте с белками 81, б7, 85, бз и б4. в

4. Положение МРНК на рибосоме зависит от присутствия тРНК -бинарном комплексе мРНК * рибосома матрица сближена с Сежами Б7

815/16/17.

Сшсок работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Kopylov А.Н., Dontsova O.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., Skripkin E.A., Skrjabin G.A., Balakin A.G., Evstafieva A.G., Shatsky I.N., Bogdanov A.A. Efficiency of translational initiation of procariotic mRNA, // 3rd Cuban -and International Seminar on Interferon, 2nd Cuban and International Seminar on Biotechnology, 1st iberoamerican Concjres? oji Biotechnology. -1989. - Habana, Cuba. - p.7-10. • . ,. ,

I , . .

2. Skripkin E.A\ , Dontsova O.A., Hosen K.V., Bogdanova S.L., Kopylov A.M., Bogdanov A.A. Upon location of mRNA initiation signals on procariotic ribosome3.//EMB0/FEBS/IUB Advanced course "Mechanism and control of translation".-1990.- the Netherlands.-p.62

3. Донцова O.A., Розен K.B., Скрипкин E. А., Копылов A.M. Модификация рибосом е.coli фотоаффшшми производными мРНК// Iv Всесоюзная школа-сешшар молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии". - 1ээо.- Рига.-Тезисы.-С.29.

4. /Донцова O.A., Богданова С.Л.,Розен К.В., Скрябин Г.А., Скрипкин Б.А., Копылов A.M., Богданов A.A. ФотоафЕинная модификация малой субчастицы рибосом е. coli диазиришшми ПРОИЗВОДНЫМ^ МРНК.//Д0КЛ. АН .СССР, - 1990.- Т.313, N3. -С.730-733.

5. Rosen K.V., Dontsova O.A., Bogdanova S.L., Skripkin E.A., Kopylov A.M., Bogdanov A.A. Ribosomal proteins path of mRNA in the 30S ribosomal initiation complex of E.coli.// Keystone symposium on molecular and cellular biology.-1991.-USA.- j.Cell.Bloch.-v.223, p.181.

6. Zimmermann R.A., Sylvers L.A., Rosen K.V., Hixon S.S., Wintermeyer W. and Wower J. Azidonucleotides as photoprobes of tHe topography of tRNA binding sites on the Escherichia coli ribosome.// Abstracts of the lectures and posters presented at XlV International tRNA Workshop. - 1991. - Rydzyna-Poznan-Poland. -p.69.

7.Dontsova O.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., Skripkin E.A.,Kopylov

A.M., Bogdanov A.A. Identification of the Escherichia coli 30S ribosoraal subunit proteins neighbouring mRNA during initiation of translation.//Biochimie. - 1992.- v.74. - p.363-371.

8. Wower J.,Sylvers L.A., Rosen K., Scheffer p.,Wintermeyer W.,Hixon S.S., and Zimmermann R.A. A model of tRNA binding sites on the E.coli ribosorae.// International Conference on The Translational Apparatus.- 1992.-Berlin.- Program -p.7.2.

9. Rosen K.V., Kower J. and Zimmermann R.A. Mapping the central fold of tRNA"et in the P site of the Escherichia coli ribosome.// International Conference on The Translational Apparatus.- 1992.-Berlin.— Abstract book.-p.207.

10. Wower J., Sylvers L.A., Rosen K., Hixon S.S., and Zimmernann R.A. A model of tRNA binding sites on the E.coli ribosome.//In: The Translational Apparatus, Nierhaus K.,ed.-Plenum press.-1993.-in press.