Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

£

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СЕРГИЕВ Петр Владимирович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РИБОСОМНЫХ РНК

02 00 10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссергации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2008 г

003163880

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им М.В Ломоносова

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор, чл-корр РАНЦетлинВИ

доктор химических наук, профессор Лаврик О И

доктор биологических наук, профессор Гарбер М Б

Ведущая организация Институт Молекулярной Биологии

Защита состоится 26 февраля 200В г в 16 часов на заседании совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан 21 января 2008 г

им В А ЭнгельгардтаРАН

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Рибосома это молекулярное устройство, осуществляющее синтез белков из аминокислот, приносимых транспортной РНК (тРНК), согласно инструкциям, закодированным в последовательности нуклеотидов матричной РНК (мРНК) Рибосома состоит из большой (50S) и малой (30S) субчастиц и имеет три участка связывания тРНК -А, Р и Е В ходе своей работы она взаимодействует с несколькими десятками различных лигандов и координирует работу своих функциональных центров, разнесенных в пространстве Основную структурную и функциональную роль в рибосоме выполняет рибосомная РНК (рРНК) Основу 30S субчастицы составляет 16S рРНК, основу 50S субчастицы - 23S и 5S рРНК Малая субчастица образует декодирующий центр, в котором происходит проверка соответствия (комплементарное™) кодона мРНК и антикодона аминоацил-тРНК (аа-тРНК) Связывание аа-тРНК осуществляется при помощи комплекса фактора элонгации Tu и GTP (aa-TPHK*EF-Tu*GTP) После гидролиза GTP, который происходит в случае соответствия кодона мРНК и антикодона тРНК, аа-тРНК перемещается в А участок При этом 3'-конец аа-тРНК, несущей аминокислоту проникает в пептидилтрансферазный центр (peptidyltransferase center, РТС) большой субчастицы рибосомы В этом каталитическом центре происходит перенос синтезируемого рибосомой пептида с 3'-конца тРНК, связанной с Р участком рибосомы, на аминокислоту, связанную с тРНК, находящейся в А участке После переноса пептида возникает необходимость переместить молекулы тРНК из А и Р участков в Р и Е участки, чтобы освободить А участок для связывания следующей аа-тРНК Вместе с тем, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида, чтобы можно было считать следующий кодон Согласно гипотезе, сформулированной Спириным и Бретшером, а затем подтвержденной Моазедом и Ноллером, перемещение тРНК (транслокация) происходит сначала на большой субчастице, а затем на малой Транслокация катализируется фактором элонгации G (EF-G) в комплексе с GTP, который в ходе транслокации гидролизуется

В начале 21 века изучение рибосомы вышло на качественно новый уровень С помощью рентгеноструктурного анализа были определены с высоким разрешением структуры рибосомных субчастиц, а затем и всей рибосомы Появилась возможность формулировать вопросы и предположения о назначении тех или иных "деталей" рибосомы и подвергать их экспериментальной поверке Методы изучения структуры рибосомы -рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия помогли выявить несколько изменений структуры рибосомы в ходе биосинтеза белка Однако, функциональная роль этих изменений не может быть установлена исключительно с помощью определения строения рибосом Направленное изменение тех или иных элементов пространственной структуры с помощью мутаций и анализ мутантных рибосом позволяет понять роль этих элементов в процессе трансляции В настоящее время изучение взаимосвязи структуры и функции рибосомы - это чрезвычайно динамично развивающаяся область биоорганической химии и молекулярной биологии Более того, без понимания механизмов работы таких молекулярных устройств, как рибосома, невозможно представить себе дальнейший прогресс в создании искусственных молекулярных машин нанометровых размеров

Цель работы Понять роль ряда элементов рибосомной РНК в функционировании

рибосомы

Задачи

1 Найти неизвестные ранее гены ферментов, проводящих модификацию рРНК, и определить роль модификаций рРНК в клетке

2 Определить функциональную роль элементов 16S рРНК, участвующих в формировании структуры декодирующего центра

3 Установить функциональную роль формы желоба 50S субчастицы, по которому аа-тРНК поступает в А участок

4 Выяснить функциональную роль Е и Р/Е участков связывания тРНК в рибосоме

5 Установить, какие элементы 23 S рРНК обеспечивают аллостерическую связь Р/Е участка и участка связывания факторов элонгации Определить, как происходит выбор между связыванием EF-G и EF-Tu при их конкуренции за общий участок связывания о рибосомой

Научная новизна и практическая значимость Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе В ходе выполнения работы впервые определены гены рРНК метилтрансфераз, модифицирующих основания G966 16S рРНК, А1618, G1835 и G2445 23 S рРНК Е coli Показано, что субстратом для метилтрансферазы YhhF, метилирующей NH2 группу нуклеотида G966 16S рРНК, служит 30S субчастица На основе пространственных структур 30S субчастицы и бежа YhhF построена модель их комплекса Предположено, что метилтрансфераза связывается с малой субчастицей в том месте, где в ходе функционального цикла рибосомы расположена антикодоновая петля тРНК, находящейся в Р участке Субстратом метилтрансфераз YgjO и YcbY, модифицирующих нуклеотиды Gl 835 и G2445 23S рРНК, служит, как было показано, депротеинизированная рРНК Метилированные нуклеотиды m2GI835 и m2G2445 23S рРНК расположены в области контакта субчастиц и в пептидилтрансферазном центре Метиатрансфераза YbiN проводит монометилирование нуклеотида А1618 23S рРНК Субстратом для нее служит промежуточный комплекс сборки 50S субчастицы, сходный с рибонуклеопротеидом, образующимся при частичной депротеинизации 50S субчастицы Хотя отсутствие любой из обнаруженных в работе метилтрансфераз приводит к замедлению роста клеток, оно не нарушает работу рибосомы т vivo

В работе разработана методология изучения функции рибосомной РНК с помощью мутагенеза Впервые в мире разработан метод выделения рибосом, несущих аптамер в рРНК, с помощью аффинной хроматографии В результате стало возможным выделять и изучать рибосомы, несущие летальные мутации Собраны в одну систему методы изучения структуры рРНК и способы определения эффективности отдельных стадий трансляции Впервые получены мутации нуклеотидов 16S рРНК, участвующих в третичных взаимодействиях спирали 34 16S рРНК Обнаружено, что мутации влияют на точность трансляции и предложено объяснение этого эффекта Впервые доказано экспериментально, что нуклеотидные остатки U2492, С2556 и С2573 23S рРНК, образующие сужение на пути перемещения аа-тРНК в А участок не важны для скорости этого перемещения

Детально изучен механизм аллостерической связи между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации Впервые показано, что не отсутствие пептидной группы на тРНК, находящейся в Р участке, а способность этой тРНК перемещаться в Р/Е участок способствует связыванию EF-G и многократному не сопряженному с транслокацией гидролизу GTP С помощью мутаций проверена возможность передачи аллостерического сигнала через спирали 38, 39, 89, 91, 95 (SRI.) и 42 23S рРНК Показано, что спираль 38 и петли спиралей 89 и 91 не участвуки в передаче сигнала Мутации в спирали 39 способствовали стабилизации такой конформации 23 S рРНК в составе рибосомы, при которой защищены от химической модификации нуклеотиды 23 S рРНК, взаимодействующие с тРНК, связанной с Р участком С помощью мутации в спирали 95 23S рРНК (SRL) было обнаружено, что гидролиз GTP не требует прочного взаимодействия EF-G с SRL В тоже время, это взаимодействие необходимо для транслокации Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гидролиз GTP элонгационным фактором G предшествует транслокации Движение спиралей 43-44 23 S рРНК (GAC), наблюдаемое при связывании с рибосомой факторов элонгации, было вызвано нами искусственно, вне зависимости от присутствия лигандов рибосомы, с помощью мутации в спирали 42 23S рРНК Впервые показано, что движение GAC в сторону SRL не мешает связыванию аа-

tPHK*EF-Tu*GTP с рибосомой и декодированию, но препятствует связыванию EF-G*GTP и транслокации С помощью химической модификации выявлена сеть третичных взаимодействий, связывающая пептидилтрансферазный центр с центром связывания факторов элонгации Предложена модель селективного связывания факторов элонгации с рибосомой в зависимости от того, какое положение занимает в ней GAC

Результаты работы опубликованы в виде 10 статей в отечественных и 23 статей в зарубежных научных журналах, а также глав в 3 книгах и 2 методических разработках

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как метод детекции протонированных оснований в рРНК и метод аффинной хроматографии рибосом могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии как в нашей стране, так и за рубежом Разработанная нами система выделения рибосом с помощью аффинной хроматографии уже была успешно использована в Университете Брауна, США Результаты, полученные в ходе выполнения работы, отвечают на многие вопросы о механизме функционирования сложных молекулярных машин и имеют фундаментальную научную ценность Кроме того, выявленные в работе участки рРНК, необходимые для функционирования рибосомы, могут быть использованы как мишени для разработки новых видов антибиотиков Работа была поддержана грантами РФФИ, HHMI, Fogarty, CRDF

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции

-The Ribosome Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark

- RNA2001,6th Annual meeting of the RNA society, May 29 -June 3,2001, Banff, Canada -Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, The Ribosome, May 31- June 5, 2001, Cold Spring Harbor, USA

- The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июнь, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия

-International conference m honour of Alexander Spmn, Protein synthesis, 27 августа - 1 сентября, 2001, Пущино, Россия

-The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 — February 1, 2002, Queenstown, New Zealand

- ENA2003, 8th Annual meetmg of the RNA society, July 1-6,2003, Vienna, Austria

- RNA2006, 11th Annual meetmg of the RNA society, June 20-25,2006, Seattle, USA

- The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA - Protem Interactions", 19-24 августа, 2006, Московская обл, Россия

-Ribosomes Form and Function, June 3-8,2007, North Falmouth, USA

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 287 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы Материал иллюстрирован 85 рисунками и 10 таблицами Библиографический указатель включает 405 цитированных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее время определена структура комплексов рибосомы, находящейся на различных этапах ее функционального цикла, однако функциональная роль конформационных изменений рРНК в этих комплексах не очевидна Целью работы было изучение функциональной роли потенциально важных элементов рРНК и их наблюдаемых или предполагаемых конформационных изменений в ходе работы рибосомы Стратегия, выбранная нами для изучения рибосомы это сочетание направленного мутагенеза компонентов рибосомы и анализа функциональных последствий внесенных мутаций

Поиск генов рРНК-метилтрансфераз, ответственных за метилирование нуклеотидов G966 16S рРНК, А1618, G1835 и G2445 23S рРНК

Рибосомные РНК Е coli содержат 36 модифицированных нуклеотидов Модификацию этих остатков проводят 32 фермента, из которых 10 до сих пор неизвестны Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы крайне неравномерно Большинство из них находятся в функциональных центрах рибосомы -декодирующем, пептидилтрансферазном и в местах контакта субчастиц Отдельная группа модифицированных оснований сближена с туннелем, проходящим через большую субчастицу Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы еще более неравномерно относительно участков связывания лигандов Большинство модифицированных нуклеотидов сближены с тРНК, находящимися в А и Р участках Особенно богато минорными остатками окружение Р участка Понять функциональную роль модификаций рРНК можно, только получив клетки и рибосомы, в которых та или иная модификация не происходит Для этого необходимо определить гены, ответственные за модификацию нуклеотидов и инактивировать их

В нуклеотидной последовательности генома Е coli нами был произведен поиск открытых рамок считывания, кодирующих белки, гомологичные известным РНК метилтрансферазам Штаммы, в которых соответствующие участки ДНК были заменены на ген устойчивости к канамицину, были любезно предоставлены нам проф X Мори (Япония) Из штаммов, в которых предполагаемые рРНК-метилтрансферазы были инактивированы, была выделена суммарная клеточная РНК, большинство из которой составляла рРНК Для того, чтобы понять, привела ли инактивация генов к отсутствию той или иной модификации, мы использовали метод обратной транскрипции

Нуклеотид m2G966 16S рРНК напрямую взаимодействует с нуклеотидом 34 антикодоновой петли тРНК (Рис 1а) Метилтрансфераза, проводящая модификацию этого нуклеотида была неизвестна Обратная транскрипция рРНК, выделенной из клеток дикого типа, останавливалась за один нуклеотид до ro2G966 (Рис 16, дорожка 1) Остановка обратной транскрипции не происходила, если использовалась рРНК, выделенная из клеток, в геноме которых ген yhhF был заменен на ген устойчивости к канамицину (Рис 16, дорожка 2) При инактивации генов других рРНК метилтрансферси (Рис 16, дорожки 3, 4) остановка обратной транскрипции за один нуклеотид до G966 по-прежнему наблюдалась Необходимо было доказать, что именно инактивация гена yhhF, а не изменение его окружения в геноме, послужила причиной отсутствия модификации Мы трансформировали штамм, в котором ген yhhF на хромосоме был заменен на ген устойчивости к канамицину, плазмидой, в которой был закодирован ген yhhF Экспрессия гена yhhF , содержавшегося на плазмиде, компенсировала отсутствие гена yhhF в геноме (Рис 16, дорожка 5) Для того, чтобы показать, что белок YhhF без каких-либо дополнительных белков способен модифицировать G966, мы провели метилирование in vitro Для этого нами были выделены 30S рибосомные субчастицы и 16S рРНК из штамма, в котором ген yhhF был инактивирован Также, с помощью металлохелатной хроматографии

на №-МТА агарозе был выделен рекомбинантный белок УЪЬР, содержащий гексагистидиновый "довесок". Рекомбинаптный УЬИР метилировал 0966 в составе 308 субчастиц (Рис. 16, дорожка 6), но не был способен метилировать 16Б рРНК (Рис. 16, дорожка 8). Модификации не наблюдалось в отсутствии З-аденозил-Ь-метионина (ЗАМ) (Рис. 16, дорожки 7, 9), что позволяет отбросить маловероятную возможность того, что уйЫ7 кодирует не метилтрансферазу, а специфическую рибонуклеазу.

UGC 1 23456789

Щ - ';>; "я " -¿4- 1- ' : -с;'

т ш

Рисунок I. Метилирование нуклеотида G966 16S рРНК и влияние этого

метилирования на

жизнеспособность Е. coli. А. Расположение m'G966 в пространственной структуре малой субчастицы. Темно-серым выделены тРНК, мРНК и нуклеотиды tn2G966 (на него указывает стрелка),

ш5С967 рРНК.

m Gl207 16S

3 4 5

ЦИКЛ РОСТА

и

Б. Модификация нуклеотида 0966 16Б рРНК с помощью обратной

транскрипции. А, С, О, и -дорожки определения

нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 163 рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором укИР

инактивирован; (3) штамма, котором даО

инактивирован; (4) штамма, в котором усЬУ инактивирован; (5) штамма, в котором yhhF кодируется только плазмидой; (6) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF и SAM in vitro.', (7) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF in vitro; (8) обработанной белком YhhF и SAM in vitro; (9) обработанной YhhF in vitro; Нуклеотиды 16S pPFIK подписаны слева. Использовали олйгодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без yhhF, клетками дикого типа. По оси ординат - доля клеток без yhhF. По оси абсцисс - количество циклов разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток.

jji^lЙЙ^ Рисунок 2. Пространственная '"^ЙчР структура YhhF (А) и модель I I , структуры комплекса YhhF с малой

субчасгицей рибосомы (Б).

¿МАЙ*9 Для оценки влияния модификации G966 на ■ /•'.' конкурентоспособность клеток, /nSgPgr мы оценили эффективность вьп-еснения мутантного штамма из культуры клеток при совместной культивации с клетками дикого типа. Использовались различные среды и температуры культивации. Оказалось, что образование m2G966 даст клеткам небольшое преимущество при росте на богатой среде (Рис. 1в). Поскольку фенотип клеток, лишенных

метилирования G966 был практически неотличим от дикого типа, мы сделали вывод о том, что маловероятна важная роль метильной группы, присоединенной к G966, в базовых стадиях трансляции. Возможно, метилирование G966 важно для регуляции работы рибосомы в каких-либо специфических, например, стрессовых условиях. В нашей совместной работе с лабораторией проф. А. Йохимяка из Центра Структурной Геномики, США, была определена структура белка YhhF (Рис. 2а). Этот небольшой однодоменный белок имел пространственную укладку Россмана, сходную со структурами многих других метилтрансфераз. Интересно было сопоставить структуру этого фермента со структурой его субстрата, 30S субчастицы (Рис. 26). Нуклеотидный остаток m2G966 расположен в углублении, образующем часть Р участка. В комплексе рибосомы с тРНК, m2G966 контактирует с наиболее далеко выступающим нуклеотидом антикодоновой петли тРНК и расположен практически в самом "глубоком" месте "щели", в которой происходит связывание мРНК и антикодонов тРНК. Удивительно, как метилтрансфераза может контактировать со столь малодоступным нуклеотидным остатком. Возможно, именно этим обстоятельством объясняются малые размеры YhhF. Белок не содержит характерных для других ДНК и РНК метилтрансфераз дополнительных узнающих доменов. Напротив, сама форма YhhF способствует его связыванию с Р участком рибосомы, как это было показано при помощи созданной нами компьютерной модели (Рис. 26). В отличие от большинства ферментов, в которых субстрат связывается во "впадине" активного центра белка, здесь фермент связывается в "активном центре" субстрата.

д, Б. UACG123456 Рисунок 3. Метилирование

UACG123456 нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК

и влияние этого метилирования на

•...... - liüUfcllfiM.1»- -<m2G2445 жизнеспособность Е. coli. А.

Модификация Gl 835 23S рРНК. А, С, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 23 S рРНК; (1) штамма, в котором ygjO инактивирован; (2) дикого типа; (3) 50S субчастиц обработанных YgjO и SAM in vitro; (4) обработанная YgjO и SAM in vitro; (5) также, как (1); (6) штамма, в котором ygjO кодируется плазмидой; Полоса, соответствующая m2G1835, отмечена стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 18741893 23S рРНК. Б. Модификация G2445 23 S рРНК. Обозначения дорожек, как для панели А, только для выделения рРНК использовали штамм, в геноме которого был инактивирован ген усЬУ. Этот же ген, закодированный на плазмиде использовали в опытах но комплементации. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2480-2496 23S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без yg/O клетками дикого типа. Показана доля клеток без ygjO. По оси абсцисс - количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Г. Тоже, что и на панели В, только использовали штамм SviycbY.

4 5 6

цикл роста

4 5 6

цикл роста

С помощью обратной транскрипции рРНК, выделенной из штаммов, в которых были инактивированы гены предполагаемых метилтрансфераз, были установлены гены, ответственные за модификацию нуклеотидов С1835 и С2445 23Я рРНК. Ими оказались у&О (Рис. За, дорожки 1 и 2) и усЬУ (Рис. 36, дорожки 1 и 2), соответственно. Экспрессия генов метилтрансфераз, закодированных на плазмиде (Рис. За,б, дорожки 6), компенсировала отсутствие функциональных генов в геноме. В отличие от метилтрансферазы УМР, субстратом которой служила 308 субчастица, метилтрансферазы УдО и УсЬУ использовали депротеинизированную 23Б рРНК в качестве субстрата (Рис. За,б, дорожки 4). Отсутствие генов удО и усЬУ в геноме замедляло рост клеток и приводило к преимущественному размножению клеток дикого типа при совместном культивировании (Рис. Зв,г). Особенно выраженным преимуществом обладали клетки дикого типа при выращивании на минимальной среде.

А.

ACGU 1 2 34 5 6 78 91011

Б.

-*т"А1618

vs **

1 AybiN

. л. 3 АОСМО» " wt

да

Рисунок 4. Метилирование иуклеотида А1618 23 S рРНК. А. Модификация иуклеотида А1618 23S рРНК. А, С, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 23 S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором ybiN инактивирован; (3) штамма, в котором ybiN кодируется на плазмиде; (4) обработанной YbiN и SAM in vitro; (5) обработанной YbiN in vitro; (6) из частиц, депротеинизированных LiCi и обработанных YbiN и SAM in vitro. (7) из частиц, депротеинизированных LiCl, и обработанных YbiN in vitro. (8) из частиц, депротеинизированных NH4Cl/EtOH, и обработанных YbiN и SAM in vitro. (9) из частиц, депротеинизированных NH^Cl/EiOH и обработанных YbiN in vitro. (10) из 50S субчастиц, обработанных YbiN и SAM in vitro. (11) из 50S субчастиц, обработанных YbiN in vitro. Нуклеотид m6A1618, отмечен стрелкой справа. Использоиали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1760-1780 23S рРНК. Б. Проверка наличия модификации иуклеотида А1618 23 S рРНК с помощью MALDI-MS продуктов гидролиза фрагмента 23S рРНК с 1590 по 1620 нуклеотид РНКазой Т1. Нуклеотид Al 618 входит в состав олигонуклеотида 1614ACACAGI6IV Спектры соответствуют: (AybiN) штамм без ybiN', (WT) дикий тип; (AybiN pYbiN) штамм, в котором ybiN закодирован только на плазмиде; Г. Скорость вытеснения клеток без ybiN клетками дикого типа. Показана пропорция клеток без ybiN. По оси абсцисс отложено количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Условия культивирования (среда и температура), соответствующие представленным кривым, приведены справа.

Метилтрансфераза, осуществляющая модификацию иуклеотида т6А1618 23 S рРНК, была выявлена с помощью обратной транскрипции (Рис. 4а) и масс-спектрометрии MALDI (Рис.

ЦИКЛ РОСТА

46). Эта метилтрансфераяа была закодирована в гене ybiN Е. coli. Примечательно, что эта метилтрансфераза использовала в качестве субстрата не депротеинизироаанную рРНК (Рис. 4а, дорожка 4) и не 50S субчастнцу (Рис. 4а, дорожка 10), а исключительно частично депротеинизированную 3.5М LiCl частицу (Рис. 4а, дорожка 6), сходную с рибонуклеопротеидными комплексами, служащими промежуточным звеном при сборке большой субчастицы. Особенностью YbiN было образование ковалентного соединения с рРНК в случае, когда субстрат подвергался обработке избытком фермента in vivo (Рис. 4а, дорожка 3) или in vitro (Рис. 4а, дорожка 6). Наличие ковалентного соединения было показано с помощью со-выделения YbiN с 23S рРНК в денатурирующих условиях. А

Рисунок 5. Расположение т"Л1618 в пространственной структуре большой субчастицы. Показан "срез" структуры большой субчастицы, как если бы на нее смотрели от пептидилтрансферазного центра через туннель и удалили ее верхнюю, ближайшую к наблюдателю часть. Участки связывания белков L7 и белок L9 обозначены. Темными лентами показаны белки L22 и L34 (подписаны). Нуклеотид ш6А 1618 показан темно-серым.

Отсутствие гена ybiN в геноме Е. coli приводит к потере конкурентоспособности по отношению к клеткам дикого типа при совместном культивировании (Рис. 4в), особенно при росте на богатой среде. Расположение нуклеотида тбА1618 в непосредственной близости от туннеля 50S субчастицы (Рис. 5) позволяет предположить, что метильная группа, переносимая YbiN, может быть необходимой для взаимодействия с туннелем регуляторных пептидов. Тем не менее, среди четырех изученных в работе рРНК метилтрапсфераз, мы пе выявили ви одной, функционирование которой было бы необходимо для трансляции. Идентификация генов рРНК мегилтрансфераз служит непременным первым шагом на пути установления функции модифицированных оснований в рРНК. Скорее всего, эта функция связана с процессами регуляции трансляции или адаптации к стрессовым условиям.

Изучение функции элементов рРНК с помощью мутагенеза

Изменение элементов рРНК, не связанное с нарушением метилирования, возможно с помощью направленного мутагенеза. Для того, чтобы изучить, как та или иная мутация нарушает работу рибосомы, необходимо иметь возможность выделять мутантные рибосомы в чистом виде. Получение мутантных рибосом в чистом виде возможно с помощью штаммов, лишенных рДНК оперонов в геноме, однако, таким образом можно изучать только рибосомы, сохраняющие функциональную активность.

Создание метода выделения рибосом, несущих летальные мутации

Изучение рибосом, несущих летальные мутации, таким способом невозможно. Мы создали метод выделения таких рибосом с помощью аффинной хроматографии. Основой метода служит введение в рРНК участка, с высокой аффинностью взаимодействующего со смолой-носителем. Подобный метод уже повсеместно используется для выделения белков, но только начинал применяться для выделения нескольких небольших РНК. О применении аффинной хроматографии для очистки объектов масштаба рибосомы от практически

идентичных рибонуклеопротеидов, отличающихся лишь коротким фрагментом РНК, не сообщалось.

Мы выбрали спирали 9, 25, 45, 63 и 98 23S рРНК для вставки аптамеров, поскольку в различных организмах длины этих спиралей варьируются. В качестве аффинной вставки использовали участок связывания белка оболочки фага MS2, стрептомицин-связывающий аптамер и стрептавидин-связывающий аптамер. Для выделения рибосом с помощью участка связывания белка оболочки фага MS2 нам был нужен гибрид белка оболочки фага MS2 с доменом, который мог бы прочно связываться с каким-либо аффинным сорбентом. Была создана плазмида, кодирующая гибрид двух мономерных молекул белка оболочки и двух Z доменов белка A Staphylococcus aureus (Рис. 6а). Z домены белка А были нужны для связывания этого гибридного бежа с IgG сефарозой. Участки связывания с РНК и с IgG сефарозой были разделены аминокислотной последовательностью, содержащей участок узнавания протеиназой TEV. К сожалению, одновременного связывания гибридного белка и с рибосомой и с IgG сефарозой не наблюдалось. Возможно, это объясняется слишком коротким участком аминокислотной последовательности, соединяющим две части белка, РНК-связывающую и IgG-связывающую.

сефароэа

Рисунок 6. Схема аффинного связывания 50S субчастиц, содержащих различные аффинные довески, с соответствующим сорбентом. А. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания белка оболочки фага MS2, с рекомбинантным белком и IgG сефарозой. Б. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептомицина со стрептомицин-сефарозой. В.

Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептавидина со стрептавидин -сефарозой.

Аптамер, связывающий

стрептомицин, был присоединен к уже сделанной вставке в спираль 98 23S рРНК (Рис. 66). Рибосомы, содержащие аптамер, связывали стрептомицин той областью 23S рРНК, которая содержала вставку. Об этом свидетельствовала защита нуклеотидов, входящих в состав аптамера, от химической модификации при связывании стрептомицина Тем не менее, специфичного взаимодействия рибосом, несущих стрептомицин-связывающий аптамер со стрептомицином, иммобилизованном на агарозе, не удалось. Аминогруппы иммобилизованного стрептомицина превращали агарозу в анионообменную смолу, прочно и неспецифично взаимодействующую с рибосомами как содержащими аптамер, так и с рибосомами дикого типа.

Использование аптамера, взаимодействующею со стрептавидином (Рис. 6в), привело к желаемому результату. Для внедрения аптамера были выбраны спирали 9, 25 и 45 23S рРНК. Известно было, что вставки участка узнавания белка оболочки MS2 в эти спирали не сказывается на функциональной активности рибосом. Чтобы избежать проблем с отталкиванием такого крупного лиганда, кате рибосома, от стрептавидин-сефарозы, была

вставки находились петли этих спиралей. Плазмиды рЬК119211, несущие вставки аптамеров в спирали 9, 25 и 45 могли служить единственным источником рРНК в клетках. Опыты показали, что чистые рибосомы дикого типа не связываются со стрептавидин-сефарозой. Рибосомы, несущие стрептавидин-связывающий аптамер, присоединенный к спиралям 25 и 45, связывались с аффинным сорбентом и элюировались биотином. Связывание с сорбентом рибосом, имеющих вставку аптамера в спираль 25, было на 30% лучше, чем связывание рибосом, содержащих вставку в спирали 45. Рибосомы, в которых стрептавидин-связывающая последовательность была введена в спираль 25 23 Э рРНК, были использованы для дальнейших опытов по аффинной очистке рибосом, содержащих летальные мутации 238 рРНК.

Изучение значимости для трансляции третичных взаимодействий спирали 34 168 рРНК

Спираль 34 это один из основных структурных элементов декодирующего центра рибосомы. Еще до определения структуры ЗОЭ субчастицы с помощью РСА функциональная важность спирали 34 в декодировании и терминации трансляции была выявлена с помощью мутагенеза. Опыты по фотоаффинному сшиванию, проведенные в нашей лаборатории, показали, что спираль 34 находится в контакте с частью мРНК, расположенной от б до 9 нуклеотидов к З'-концу от кодона в Р участке. Взаимодействие спирали 34 с ЕР-Э, было выявлено в ходе экспериментов по химической модификации,

Рисунок 7. Анализ влияния мутаций в спирали 34 на структуру и функционирование рибосомы. А. Влияние мутаций на ассоциацию рибосомных субчастиц.

Представлена пропорция 308/708. - дикий тип, мутантные субчастицы подписаны. Черные столбцы соответствуют [М§; 7 мМ, серые -14 мМ, белые - 21 мМ. Б. Влияние мутаций на частоту ошибок декодирования (черные столбцы) и сдвига рамки считывания -1 (белые столбцы) и +1 (серые столбцы). Высота столбцов соответствует частоте ошибок трансляции по сравнению с диким типом. В. Влияние мутаций на частоту ошибочного прочтения

терминационных кодонов, как смысловых. Черные столбцы соответствуют ошибочному прочтению кодона ивА, серые - иАА, белые - иАС. Г. Анализ изменения структуры 168 рРНК, вызванного мугациями в спирали 34. А, С, О, и дорожки определения нуклеотидной последовательности. \¥1 -168 рРНК дикого типа. БМЯ - обработка диметилсульфатом. Мутации подписаны. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 168 рРНК.

Спираль 34 связана со спиралью 31 168 рРНК помощью третичного взаимодействия нуклеотидов 11961 - А974 - А1201. Положение спирали 34 в пространстве, по-видимому, определяется структурой узла спиралей 34/35/38 168 рРНК. По предсказанию Гутелла, основанном на сравнительном анализе последовательностей, нуклеотид С1109 находящийся в месте соединения спиралей 34/35/38 16Э рРНК образует третичный контакт

проведенных в лаборатории Винтермайера-Родниной.

5г

100 ; 80

3 60

1

40

20

а.

I ,.. к 1|а.1п, 1, ...

с парой оснований 0933-0 384 16Э рРНК. Это взаимодействие также может фиксировать положение узла спиралей. Мы сделали мутации Ш61А, А120Ш, и двойную компенсаторную мутацию Ш61А/А120Ш чтобы определить, какую роль играет взаимодействие этих нуклеотидов в цикле трансляции. Мутация С1Ю90 должна была предотвратить взаимодействие нуклеотида в этом положении с парой оснований 0933-С1384, если это взаимодействие действительно реализуется когда-либо в ходе трансляции. Замеыы АИ9Ш, А1191С должны были ослаблять, а мутация А119Ю разрушать структуру узла соединения спиралей 34/35/38.

Разрушение контакта 11961 - А974 - А1201 как с помощью замены 11961 А, так и с помощью мутации А120Ш приводило к нарушению ассоциации субчастиц рибосомы (Рис. 7а). Восстановление взаимодействия с помощью двойной мутации и961А/А120Ш возобновляло способность субчастиц к ассоциации. Скорее всего, разрушение контакта 11961 - А974 - А1201 влияло на положение "головы" субчастицы относительно ее "тела" и эффективность образования межсубчастичных мостиков В1 группы. Мутация 11961А приводила к большей точности декодирования (Рис. 76) и меньшей эффективности терминации (Рис.. 7в). Уровень точности декодирования восстанавливался при компенсаторной мутации 11961 А/А 120 Ш (Рис. 76), а эффективность терминации нет (Рис. 7в). Скорее всего, это объясняется восстановлением при компенсаторной мутации лишь взаимодействия между нуклеотидами 961 и 1201, но не их взаимодействия с нуклеотидом 974. Об этом свидетельствует химическая модификация А974 диметилсулъфатом (ОМБ) во всех трех мутантах (Рис. 7г). Измерение константы скорости транслокации, как однократной (перемещение тРНК), так и многократной (весь цикл работы ЕР-в) показало, что взаимодействие нуклеотидов 11961 - А974 - А1201 для траислокации несущественно.

Мугация A1191G может приводить к движению головы от большой субчастицы.

Мы объясняем эффект разрушения триады оснований U961 - А974 - А1201 на трансляцию механически. Из-за оппозиции двух аденозинов (961 и 1201) на 1-3А увеличивается расстояние между спиралью 34 и верхней частью головы 30S субчастицы (Рис. 8а). В свободных 30S субчастицах это приводит к сдвигу белка S13, вместе со всей верхней частью головы, и препятствует взаимодействию S13 с ASF и L5 большой субчастицы, т.е. образованию мостиков группы В1. В рибосомах, стабилизированных тРНК, связанной с Р участком, образование мостиков происходит, но спираль 34 вынуждена "опуститься" на 1-3 А "глубже" в декодирующий центр (Рис. 8а). Это приводит к более "тесному" окружению антикодона тРНК в А участке, меньшему сродству тРНК к А участку и большей точности декодирования. То же изменение структуры декодирующего центра препятствует проникновению в декодирующий центр доменов II/IV факторов терминации. Фенотип мутаций A119IC и A1191U отличался от фенотипа мутации A1191G. Мутации А1191С и А1191U повышали частоту +1 сдвига рамки считывания и препятствовали терминации, в то

Предполагаемое влияние мутаций на конформацию головы малой субчастицы. Нуклеотиды, которые были мутированы, подписаны. А. Мутация и961А может сдвигать спираль 34 16в рРНК (темно-серая) вниз. Б Мутации А1191С и А119 Ш могут приводить к движению головы к большой субчастице.

Рисунок

8.

время как A1191G - повышала частоту -1 сдвига рамки и не препятствовала терминации (Рис 76) Пиримидиновые основания, меньшее объемные, чем аденин, могли вызывать компактизацию узла соединения спиралей 34/35/38 Гуанин, напротив, "раздвигал" укладку этого узла В результате могло меняться положение всей спирали 34 В случае компактизации узла соединения спиралей 34/35/38, спираль 34 сдвигалась по направлению к большой субчастице, а в случае увеличения размеров этого узла, от большой субчастицы Вероятность -1 и +1 сдвига рамки считывания увеличивалась из-за того, что спираль 34 определяет 3'-границу А участка При перемещении в сторону большой субчастицы, эта спираль будет стремиться сдвинуть антикодон тРНК на один нукпеотид в сторону 5*-конца мРНК При возможности образования кодон-антикодоновых взаимодействий в -1 рамке считывания это приведет к сдвигу рамки Отклонение спирали 34 от большой субчастицы будет позволять антикодону тРНК, если это позволяет нуклеотидная последовательность мРНК, образовать кодон-антикодоновый дуплекс в +1 рамке Таким образом, положение спирали 34, фиксированное с помощью ее третичных взаимодействий, определяет размер декодирующего центра и, таким способом, минимизирует вероятность ошибок декодирования и сдвига рамки считывания

Определение функциональной роли "желоба", по которому аа-тРНК попадает в А участок

На поверхности 50S субчастицы, между пептидилтрансферазным центром и участком связывания трансляционных факторов GTPa3 проходит желоб, образованный спиралями SRL, 91, 90 и 89 23S рРНК "сверху" и L14 и спиралью 92 23S рРНК "снизу" По этому "желобу" движется аминоацилированный конец аа-тРНК, когда она перемещается от EF-Tu*GDP к РТС Перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок было подвергнуто компьютерному моделированию Санбонматсу и коллегами Согласно компьютерной модели, аминоацилированный конец тРНК движется неравномерно Временная остановка перемещения аа-тРНК происходит перед сужением, образованном нуклеотидными остатками U2492, С2556 и С2573 спиралей 89, 91 и 90 23S рРНК, соответственно (Рис 9а,б) На основе компьютерной модели возникла гипотеза, что задержка перемещения аа-тРНК в А участок, вызванная этими "воротами", необходима для повышения точности трансляции, поскольку при замедлении перехода аа-тРНК из А/Т в А/А участок аа-тРНК, несоответствующая кодону мРНК, будет иметь дополнительное время для ухода из рибосомы

Мы сконструировали плазмиды, в которых в ген 23 S рРНК были внесены замены С2573 на A, G и U, а также проведена делеция этого нуклеотида и соседнего нуклеотида А2572 Предположительно, замена цитидина на более объемные пуриновые основания должна ' сужать" коридор, через который проходит аа-тРНК Мутации нуклеотида U2492 и его окружения планировались так, чтобы изменить вторичную структуру спирали 89, которой принадлежит этот остаток Для этой спирали можно предложить два варианта вторичной структуры (Рис 9в) Тот вариант, который был определен методом РСА (Рис 9в, слева), содержит три неспасенных основания Альтернативный, гипотетический вариант (Рис 9в, справа) содержит лишь одно неспаренное основание Мы внесли в спираль 89 23S рРНК ряд мутаций, UUU2491-3UC A2459G, U2491C, U2491C/A2459G, G2458C, U2491C/G2458C, каждая из которых влияла на предполагаемый переход между двумя альтернативными структурами

Среди введенных в 23 S рРНК мутаций летальными оказались делеции нуклеотидов С2573 и А2572, а также замена UUU последовательности 2491-2493 на UC Остальные мутации в разной степени замедляли рост клеток, но не были летальными, даже если все рибосомы в клетке содержали мутацию Измерение скоростей роста клеток позволило заключить, что мутации, дестабилизирующие "альтернативную" вторичную структуру не влияют на процесс трансляции Напротив, мутации, дестабилизирующие вторичную структуру,

наблюдаемую при помощи РСА, приводили к замедлению роста клеток. Мутация ЦиШ491-ЗиС, полностью исключающая образование вторичной структуры, наблюдаемой при помощи РСА, была детальна. На основании этих наблюдений можно сделать вывод о том, что "альтернативная" вторичная структура не реализуется в ходе трансляции.

ГЧоптидил-

трансферэзньй

центр

Спираль 89

ее MA004>CCCA*Q*0U( I I • I • I II I I I • ►•!!<? соо о^иаясяосласи*

Оы

f-w» U2492

Б.

ЩЩФш

Структура, наблкдзэмзя при помощи РСА

ОСФ A UA ССОС ССААОА О

'.1-1 - I I И I I ...»t CCfi и GUGOCQOCAOCUA

6CV A U А С С

C2556

Спираль 91

'лисси ссоссисА] , и оао ессоооди

Альтернативная структура

GGCV aAUACCOCCCAACABU MI» Мм1П11»««П ССОО UUGUaQOQeCAGCUfc

ССС»аАиАСС6СС0ААОАвии

| I С* I* I II I и ..«I I С COOOOUCUeeCQSCACCUA А

3 С г / ..

SOf А 0АСС9СССААвА0и

I I • I ♦ 11 IIII I I coa и виовс A UC\

8И0

U2491C/A24590

U249ÍC/G2458C

Сш

A <MOi

вас» QC,UACC6CCCAA6AOuy CCGOyllCCüeSCOOCAflCUAyA

с гьк

Рнсуиок 9. "Ворота", через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок. А. Расположение "ворог" (показаны темно-серым) в структуре 50S субчастицы. Б. Нуклеотиды U2492, С2556 и С2573 во фрагменте вторичной структуры 23 S рРНК. В. Варианты вторичной структуры спирали 89 23S рРНК. Слева - вариант вторичной структуры,

определенный с помощью РСА. Слева предсказанный на основе ковариационного анализа. Г. Предполагаемое влияние мутаций в спирали 89 на ее вторичную структуру. Нуклеотиды,

измененные с помощью мутагенеза, выделены цветом. Светло-серым показан тот вариант структуры, который,

предположительно, дестабилизируется мутацией; черным — вариант структуры, который стабилизируется.

В чем причина вызываемой UUU2491-3UC? эффективности £Met-TPHKfMa с РЬе-тРНКРКе с

легальности, мугацией Проверка связывания Р участком и А участком

показала, что мутация ииС2491-ЗиС приводит к снижению степени связывания тРНК на 20% с Р-участком и на 50% с А участком. Эффективность переноса пептида, катализируемого мутантньгми рибосомами, была проверена с помощью гидролиза пептидил-тРНК, выделенной из комплекса с рибосомами, содержащими мутацию ииС2491-ЗиС и разделения продуктов гидролиза с помощью ВЭЖХ. Оказалось (Рис. 10а), что эта мутация полностью ингибирует пептидилтрансферазную реакцию. Полученный результат уникален, поскольку ни одна из изученных до сих пор мутаций не приводила к полному ингибированию переноса пептида на аминоацил-тРНК. В литературе описаны лишь мутации, предотвращающие перенос пептида на пуромицин. Поддержание вторичной структуры спирали 89 23Й рРНК оказалась важным для пептидилтрансферазной реакции.

Можно было предположить, что мутации нуклеотидов С2572 и А2573 будут влиять на размер "ворот", через которые проходит аа-тРНК. В сотрудничестве с лабораторией Винтермайера-Родниной мы измерили константы скорости перемещения аа-тРПК в А участок рибосом, содержащих мутации А2572ТГ, С2573А, Д2573 и Д2572. Мы ожидали, что

в соответствии с моделью Санбонматсу, мутация С2573А будет уменьшать, а Д2573 увеличивать скорость перемещения аа-тРНК в А участок. Для измерения констант скоростей перемещения аа-тРНК в А участок использовали взаимодействие комплекса рибосом, содержащего МеИгРИК^01 в Р участке с комплексом

Скорость перемещения аа-тРНК в А участок оценивали по образованию дипептида, поскольку скорость пептидилтрансферазной реакции на 2 порядка превышает скорость перемещения аа-тРНК. Кинетические кривые, описывающие процесс перемещения РЬе-тРНК в А участок рибосом и соответствующие константы скорости представлены на рисунке 106. Оказалось, что константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом изменяются несущественно в результате мутаций А2572Ц С2573А, Д2573 и Д2572 в 23Э рРНК. Это значит, что гипотеза Санбонматсу о важности размера "ворот", образованных иуклеотидами С2573,112492 и С2556, как фактора, определяющего скорость перемещения аа-тРНК не подтверждается.

х

40% 20% 0%

Wf иии/ис

время, с

Рисунок 10. Влияние мутаций в элементах вторичной структуры, образующих "ворота", через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок, на функционирование рибосомы. А. Влияние мугации ииС2491-311С в спирали 89 23Б рРНК на пептидилтрансферазную реакцию. Доля тРНК, вступившей в реакцию транспептидации. Черные столбики - Мй-тРИК""', серые столбики - РЬе-тРНК1''15. В. Зависимость доли РЬе-тРНКр1,е переместившейся в А участок рибосомы от времени. Нумерация кривых соответствует рибосомам дикого типа (1) и рибосомам, несущим мутации А2572и (2), С2573А (3), Д2573 (4) и Д2572 (5).

А. «юо%

V £ 80%

SL

■s ш

Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации С23940, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками

После переноса пептида с псптидил-тРНК, связанной с Р участком, на аминоацильный остаток тРНК, находящийся в А участке, комплекс рибосомы с мРНК и двумя тРНК должен претерпеть самую значительную конформационную перестройку в функциональном цикле рибосомы, траислокацию, катализируемую EF-G*GTP. Первой стадией транслокации, не требующей гидролиза GTP, служит переход тРНК в гибридные участки. Пептидил-тРНК переходит из А/А участка в А/Р участок, а деацшщрованная тРНК из Р/Р в Р/Е участок. Присутствие деацилированной тРНК, связанной с Р участком способствует связыванию EF-G и увеличивает скорость цикла его работы, измеренную по скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP. Оставалось неясным, что же служит сигналом для стимуляции связывания EF-G - отсутствие пептида, присоединенного к ССА концу тРНК, находящейся в Р участке или возможность перехода тРНК в гибридный Р/Е участок? Кроме функциональной роли гибридного Р/Е участка оставалась неясной и роль самого Е участка. Согласно представлениям группы Витермайера-Родниной, роль Е участка сводится

к понижению энергетического барьера транслокации. Согласно аллостерической модели рибосомы, предложенной Ниерхаусом, роль Е участка состоит также в поддержании рамки считывания и снижении числа ошибок декодирования. Кроме того, считается, что

связывание тРНК с Е участком прочное и разрушается только при взаимодействии с А участком следующей аа-тРНК в комплексе с ЕР-Ти*СТР.

В. № С2394С

1

WT

2 3

ш

4 12 3 4

A.WT - polyu tRNA ♦ WT +p«lyU SNA 1WT J WNA Д3'-A

1+16

+19

+22 +24

Рисунок 12. Взаимодействие нуклеотидов A76 тРНК и С2394 23S рРНК и его влияние на связывание тРНК с рибосомой. А. Пространственное окружение нуклеотида А76 тРНК. Б. Зависимость степени связывания тРНКИю с рибосомами от соотношения тРНК/рибосома. Обозначение кривых указано справа. WT соответствует рибосомам дикого типа, G соответствует рибосомам, несущим мутацию C2394G. Присутствие или отсутствие полиуридиловой кислоты обозначено. тРНК, лишенные З'-концевого остатка адениловой кислоты обозначены, как tRNA ДЗ'-А. В. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла. Дорожки соответствуют: (1) рибосома, мРНК, кодирующая MFK пептид, fMet-TPHK,Mct. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-TPHKp"c*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-tPHK'^EF-Ti^GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 от инициаторного кодона. Рибосомы дикого типа - WT, несущие мутацию — C2394G.

АО -peiyUUiMA

»0 tpelyUtRNA ■О +p«1yU№NA43'-A

Реакциоппая способность нуклеотида С2394 по отношению к ОМБ снижается при связывании тРНК с Е участком. С другой стороны, модификация этого нуклеотида ЭМв приводит к ингнбирования связывания тРНК с Е участком. Недавно взаимодействие нуклеотида С2394 с З'-концевым аденозином тРНК было прямо показано с помощью РСА (Рис. 12а). Известно, этот остаток адснозина необходим для связывания тРНК с Е участком. Плазмида, несущая мутацию С23940 в гене 23Э рРНК могла служить единственным источником рРНК в клетках. Время удвоения числа клеток получившегося штамма при росте на богатой среде при 37°С было 103+2 минуты. Штамм, трансформированный плазмидой, не несущей мутации С2394в, имел время удвоения 85±2 минуты. Мы решили проверить, действительно ли замена С2394й нарушает связывание тРНК с Е участком рибосомы? Мы определили число молекул деацилированной тРНК способное связаться с мутангными рибосомами (Рис. 126). Связывание транспортной РНК как с рибосомами дикого типа, так и с мутантными рибосомами в отсутствии мРНК ограничивается Р

участком В присутствии полиуридиловой кислоты (polyU) в качестве мРНК две молекулы тРНКр1ю, лишенной З'-концевого аденозина, связьшалась с рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию C2394G Значит, связывание тРНК с А и Р участками мутантных рибосом проходило нормально Полноразмерная деацилированная тРНКр|,е в присутствии polyU связывалась с А, Р и Е участками рибосом дикого типа Мутантные рибосомы могли связать только две молекулы тРНК, что свидетельствовало о нарушении связывания с Е участком

Для прямого связывания тРНК с Е участком мы использовали комплекс рибосом с мРНК, кодирующей дипептид fMet-Phe (MF) Связывание АсРЬс-тРПКР11С с Р участком рибосомы, запрограммированной MF-мРНК (Табл 1), приводило к тому, что AUG кодон, кодирующий метионин, оказывался в Е участке Прямое связывание TPHKfMet могло проходить только с Е участком Деацилированная тРНК хорошо связывалась с Е участком рибосом дикого типа Е участок мутантных рибосом связывал в 4 раза меньше деацилированной тРНК (Табл 1)

Таблица 1 Связывание деацилированной тРНК,мм с Е участком рибосом, запрограммированных мРНК, кодирующей МР пептид_

Степень связывания тРНК (на рибосому) Порядок Рибосомы, несущие

добавления Рибосомы дикого типа мутацию С23М6

тРНК ДсРИе^А^ 1РМАГМЙ АсРЬе-(ЯМАте 1!ЧМА,МЙ

(Р-участок) (Е-участок) (Р-участок) (Е-участок) О 77 ± 0 04 0 95 ± 0 06

0 76 ± 0 03 0 44 ± 0 05 091 ±0 06 011 ±003

Чтобы проверить, насколько прочно тРНК связывается с Е участком мутантных рибосом после транслокации мы провели пошаговую трансляцию модельной мРНК, кодирующей пептид Ше^РИе-Ьуз (МРК) Эффективность прохождения отдельных шагов трансляции мы оценивали с помощью тоупринтинга (Рис 12в) Количество деацилированной 5'-[32Р]-тРЫК(Ме', находящейся в комплексе с рибосомами, измеряли с помощью связывания рибосом с нитроцеллюлозными фильтрами Связывание деацилированной тРНК/"1"1 с Р участком (Рис 12в, дорожки 1, Табл 2) и АсР11е-тРНКРЬе с А участком (Рис 12в, дорожки 2) проходило одинаково эффективно для рибосом дикого типа и мутантных рибосом Транслокация (Рис 12в, дорожки 3) не приводила к уходу деацилированной тРНК из комплекса с рибосомами дикого типа, которая оставалась связанной с Е участком Транслокация деацилированной тРНК в Е участок мутантных рибосом приводила к диссоциации комплекса тРНК и рибосомы (Табл 2) Только связывание Ьуз-тРНК^ЕР-Ти*ОТР с А участком рибосом дикого типа (Рис 12в, дорожки 4) приводило к диссоциации комплекса деацилированной тРНК с Е участком рибосомы (Табл 2) Таким образом, мутантные рибосомы не были способны удерживать деацилированную тРНК в Е участке

Таблица 2 Количество деацилированной тРШ0Мм, связанной с рибосомой, на различных стадиях трансляции мРНК, кодирующей МРК пептид_

Степень связывания тРНК/""* (на рибосому)

Рибосомы, несущие мутацию С2394С

Стадия трансляции /л vitro

Рибосомы дикого типа

Связывание tRNAf с Р-участком Связывание AcPhe-tRNAphe с А-участком Транслокация, катализируемая EF-G*GTP Связывание Lys-tRNALys*EF-Tu*GTP с А-участком

0 82 а: 0 01 0 76 ± 0 03 0 70 ±010

0 45 ± 0 05

083±0 10 0 69 ± 0 05 0 45 ± 0 08

0 40 ± 0 04

Связывание AcPhe-tRNAplre с A-участком О 76 ± О 03 0 69 ± 0 05 Транспокация, катализируемая EF-G*GTP 0 70 ± 0 10 0 45 ± 0 08 Связывание Lys-tRNALys*EF-Tu*GTP с А- 0 45 ±0 05 0 40 ±0 04 _участком

Используя метод тоупринтинга для того, чтобы оценить эффективность отдельных шагов трансляции мы обратили внимание на то, что транслокация AcPhe-Lys-TPHKLys из А в Р участок мутангных рибосом происходит менее эффективно, чем транслокация AcPhe-Lys-TPHKLys из А в Р участок рибосом дикого типа (Рис 12в, дорожки 4) Среди продуктов транслокации мутантных рибосом виден комплекс, сигнал тоупринтинга которого свидетельствует о произошедшем сдвиге рамки считывания (+22 нуклеотид от AUG кодона) Очевидно, что неспособность тРНК связываться с Б участком приводит к понижению эффективности транслокации и повышению вероятности сдвига рамки считывания

Таблица 3 Частота ошибок трансляции в клетках дикого типа и клетках, несущих мутацию С2394в в 235 рРНК_

Плазмида, кодирующая ген-репортер Тип ошибки трансляции, компенсирующей мутацию в гене lacZ Клетки дикого типа Клетки, несущие мутацию C2394G

pSG 853 Прочтение UAA, как 2 2 ± 0 6 7 3 ± 0 6

смыслового

pSG 12-6 Прочтение UAG, как 7 ± 04 12 ± 0 5

смыслового

pSG % Прочтение UGA, как 43 ±2 64 ± 3

смыслового

pSG Iac7 Сдвиг рамки считывания +1 41 ±2 74 ±4

pSG 12DP Сдвиг рамки считывания -1 44 ±2 84 ± 5

fCSH 103 Встраивание глютаминовой 06±0 1 06±01

кислоты вместо глютамина

pSG25 Эффективность трансляции 4280 ±70 5990 ±80

без ошибок

Приведены значения активности Р-гапакгозидазы в единицах Миллера Чем выше _активность, тем выше частота ошибок трансляции_

Наблюдается ли повышенная частота сдвига рамки считывания в клетках, экспрессирующих ггпВ оперон, несущий мутацию С2394С Для оценки частоты сдвига рамки считывания в клетках мы воспользовались набором плазмид, каждая из которых несла ген 1ас2 с мутацией Получение ферментативно активной р-галактозидазы могло произойти только если при трансляции происходила ошибка, компенсирующая мутацию в мРНК Как показали результаты опыта (Табл 3), мутация С2394й приводила к умеренному, примерно в 2 раза, повышению частоты как +1, так и -1 сдвига рамки считывания и не приводила к изменению частоты ошибок декодирования За счет чего рибосомы, несущие мутацию С2394й, оказались менее эффективны в реакции транслокации тРНК и мРНК, чем рибосомы дикого типа? Мы сравнили эффективность взаимодействия ЕР-й с рибосомами, имеющими мутацию С2394й, и рибосомами дикого типа Связывание ЕР-в с рибосомами и их функциональными комплексами детектировали по защитам нуклеотидов А1067 (Рис 13а) и А2661 23в рРНК от модификации БМЭ Эффективность связывания ЕР-в с рибосомой падает в результате мутации С2394в Влияние мутации С2394в иа связывание ЕРЦЗ можно объяснить только аллостерическим эффектом, поскольку расстояние между нуклеотидом 2394 23в рРНК и участком связывания ЕБ-О равно примерно 100А

А.

WT C2394G

AC G UK5 4 3 2 1 К 54321

m

•»«•«A1067

* «j w лг

"•««Ив!*»»

Б.

Рисунок 13. Оценка влияния мутации С2394в 238 рРЖ на связывание и функционирование ЕР-в. А. Влияние мутации С2394в 23 в рРНК на взаимодействие ЕИ-О с ОАС. А, С, в, и дорожки определения нуклеотидной

последовательности. К немодифицированная 23Б рРНК. \\ПГ - дикий тип, С2394 - рибосомы, несущие мутацию. Цифрами обозначены модифицированные ОМЭ комплексы рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК, Ме1-тРНКгМс|, РЬе-1КМА№,!*ЕР-Ти*ОТР, ЕР-С*ОМРР1\(Р; (3) с мРНК, Мй-ЙШАгма, Р11е-1ШМАр1,8*ЕР-Ти*СТР, ЕР-С*ОТР и фусидовой кислотой; (4) с ЕР-С*ОМРР№; (5) с ЕР-0*вТР и фусидовой кислотой. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой справа. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 238 рРНК. Б.

О 10 20 30 40 50 60 г

время, мин Зависимость степени не

сопряженного с транслокацией гидролиза вТР ЕР-в от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (серые круги), рибосомами, несущими мутацию С2394С (серые треугольники), комплексами рибосом дикого типа с ро1у11 и тРНКн,е (черные круги) и комплексами рибосом, несущими мутацию С2394С, с ро1у11 и тРНКр1,е (черные треугольники).

Чтобы оценить влияние мутации C2394G 23 S рРНК на суммарную скорость цикла работы EF-G, мы измерили скорость не сопряженному с транслокацией гидролиза GTP. В этом модельном опыте рибосомы или их комплекс с мРНК и деацилированной тРНК смешиваются с EF-G и с избытком GTP. Скорость обмена GDP на GTP для EF-G велика по сравнению со скоростью цепочки превращений, происходящих с EF-G при связывании с рибосомой. Поэтому, скорость гидролиза GTP в выбранной экспериментальной системе отражает только суммарную скорость связывания рибосомы с EF-G, гидролиза GTP, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP*Pi, выхода фосфат-иона, конформационных превращений комплекса рибосомы с BF-G*GDP и диссоциации этого комплекса. Таким методом не удается определить ту стадию функционального цикла EF-G, на которую влияет мутация C2394G 23S рРНК, но удается оценить влияние мутации на общую эффективность взаимодействия рибосомы с EF-G. Когда в Р участке рибосом находится деацилированная тРНК, суммарная скорость функционального цикла EF-G значительно возрастает. В претранслокационном комплексе, который служит естественным субстратом EF-G, в Р участке как раз находится деацилированная тРНК, в то время, как А участок занят пептидил-тРНК. Как это ни удивительно, для функционирования EF-G оказывается важным, что деацилированная тРНК занимает Р участок, даже если А участок свободен. Подобный вывод подтверждается также тем, что EF-G может катализировать транслокацию, только когда в Р участке находится полноразмерная тРНК. При этом достаточно, что в А участке находится только антикодоновая петля тРНК. В соответствии с данными литературы, мы обнаружили, что деацилированная тРНК, связанная с Р участком рибосом дикого типа, оказывает стимулирующее влияние на

скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза OTP EF-G (Рис. 136). Рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, слабо стимулировали не сопряженную с транслокацией ОТРазную активность EF-G вне зависимости от того, была тРНК связана с Р участком или нет (Рис. 13в). Таким образом, нарушение связывания тРНК с Е участком нарушает взаимодействие EF-G с модельным комплексом, имитирующим претранслокационное состояние рибосомы.

Как мутация, ингибирующая связывание тРНК с Е участком, может препятствовать формированию комплекса рибосомы с деацилированной тРНК в Р участке, узнаваемому EF-G? Известно, что если с Р участком рибосомы связана деацилированная тРНК, ее акцепторный конец может перемещаться в Е участок большой субчастицы. Такая тРНК оказывается связанной с гибридным Р/Е участком. Для того, чтобы определить, с каким участком мутантных рибосом связана деацилированная тРНК, мы использовали метод химической модификации. В первую очередь подтверждено, что рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК не могут связывать тРНК в Е участок. На радиоавтографах, интенсивность полос, соответствующих модификации нуклеотидов G2U2 и G2116 кетоксалем, практически не изменялась при связывании тРНК с Е участком мутантных рибосом (Рис. 14а, дорожки 1 и 4). Для рибосом дикого типа защита нуклеотидов G2112 и G2116 от модификации кетоксалем наблюдалась уже при связывании деацилированной тРНК с Р участком (Рис. 14а, дорожка 2). Взаимодействие тРНК с Е участком 50S субчастицы дикого типа сохранялось и при связывании двух тРНК (деацилированной тРНКгМй в Р участок и AcPhe-тРНК ' в А участок) (Рис. 14а, дорожка 3) и при последующей транслокации (Рис. 14а, дорожка 4). Защита нуклеотида U2585 23S рРНК дикого типа от модификации СМСТ возникала при связывании с рибосомой двух тРНК (деацилированной TPHKfMcl в Р участок и AcPhe-TPHKPhe в А участок) (Рис. 146, дорожка 3). После транслокации, когда в Р участке рибосом оказывалась не деацилированная, a AcPhe-тРНКр|ге пониженный уровень модификации U2585 сохранялся (Рис. 146, дорожка 4). Наши опыты свидетельствовали о связывании деацилированной тРНК в гибридный Р/Е участок как в комплексе рибосом дикого типа с одной тРНК, так и в претранслокационном комплексе рибосом дикого типа. Напротив, рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, связывали деацилированную тРНК в "классический" Р/Р участок. Защита нуклеотидных остатков G2112 и G2116 от модификации кетоксалем, характеризующая взаимодействие с Е участком при связывании деацилированной тРНК, не наблюдалась (Рис. 14а, дорожка 2). Нуклеотид U2585 23S рРНК мутантных рибосом оказывался защищенным от модификации 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом (СМСТ) при связывании деацилированной тРНК (Рис. 146, дорожка 2), что свидетельствовало о взаимодействии ССА конца тРНК с Р участком 50S субчастицы.

Рисунок 14. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание тРНК с Е (А) и Р (Б) участками. А, С, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. К ^модифицированная 23S рРНК. WT - 23S рРНК дикого типа, С2394 - 23S рРНК, несущая мутацию. Цифры соответствуют комплексам рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК и TPHKfMct; (3) с мРНК, TPHKfM" и AcPhe-tRNArhc; (4) с мРНК, тРШ<гМо', AcPhe-tRNA"* и EF-G*GTP. Нуклеотиды G2112, G2116 и U2585 отмечены стрелками. Использовали модификацию кетоксалем (А) и СМСТ (Б) и олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2281-2301 23S рРНК (А) и 2649-2667 23S рРНК (Б).

■.vi:.,.- . •■■■-;."'■■'■ » ...

A. WT C2394G

ACGUKK12 34 12 34

G2116 с

Б- WT C2394G

ACGUKK12 3412 34

-<U2585 Р

Связывание деацилированной тРНК происходит с Р участком рибосом, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК, а не с Р/Е участком, как это наблюдается для рибосом дикого типа. Нарушение связывания тРНК с гибридным участком, вызванное мутацией, коррелирует с отсутствием стимуляции не сопряженной с транслокацией ОТРазной активности EF-G связыванием деацилированной тРНК. Теперь мы можем утверждать, что не само отсутствие пептидной группы, а именно способность деацилированной тРНК перемещаться в гибридный Р/Е участок важно для функциональной активности EF-G в комплексе с рибосомами.

Гибридный Р/Е участок находится на расстоянии около 100Á от места связывания EF-G (Рис. 15). Как информация о переходе тРНК в Р/Е участок может влиять на EF-G? Между Р/Е участком и EF-G расположен пептидилтрансферазный центр, D петля 5S рРНК, спирали 80, 39, 42, 89, 91 23S рРНК и сам участок связывания EF-G, состоящий из GAC и SRL. Аллостерическая связь между Р/Е участком и EF-G должна осуществляться с помощью изменения конформации одного или нескольких из этих элементов структуры 50S субчастицы. Внося мутации в эти элементы, мы искали путь передачи аллостерического сигнала исходя их нескольких соображений.

Рисунок 15. Возможные участники конформационных перегруппировок, аллостерически связывающих Р/Е участок и участок связывания факторов элонгации. Разными оттенками показаны и обозначены стрелками элементы 50S субчастицы, расположенные между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Расстояние от Е участка на большой субчастице до участка связывания факторов элонгации показано стрелкой.

Во-первых, структура 50S субчастицы, определенная с помощью РСА, выглядит монолитной (за исключением L1 пальца и GAC) и не позволяет точно идентифицировать подвижные элементы. Мы предполагаем существование нескольких конформаций элементов 50S субчастицы между Р/Е участком и участком связывания EF-G. Вносимые в 23 S рРНК мутации могут влиять на конформационное равновесие и делать более стабильной ту конформацию, которая реализуется в процессе передачи аллостерического сигнала при функционировании EF-G, транслокации. В пользу такой интерпретации говорит сходный характер изменений структуры 23 S рРНК, вызываемых мутациями в различных, удаленных друг от друга участках рРНК.

Во-вторых, мы ожидаем, что внося мутации в 23 S рРНК на пути передачи аллостерического сигнала, мы нарушим эту передачу. Это значит, что EF-G перестанет различать, находится ли тРНК в Р/Е участке или нет. Теоретически, возможно создание мутаций 23 S рРНК, вследствие которых EF-G будет либо все время взаимодействовать с рибосомой так, как если бы она содержала тРНК в Р/Е участке, либо наоборот, даже если тРНК и находится в Р/Е участке, EF-G слабо взаимодействует с таким комплексом, как будто тРНК в Р/Е участке нет. Дальнейшие разделы работы посвящены изучению с помощью мутагенеза функциональной роли элементов 23 S рРНК между РТС и участком связывания EF-G.

будто тРНК в Р/Е участке нет. Дальнейшие разделы работы посвящены изучению с помощью мутагенеза функциональной роли элементов 238 рРНК между РТС и участком связывания ЕР-й.

Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В 1а: укорочение ASF

Спираль 38 23S рРНК (Рис. 16а) образует длинный выступ большой субчаегицы, так называемый "палец А участка" (ASF). Этот выступ достигает "головы" малой субчастицы и образует контакт с С-концевым доменом белка S13. При связывании EF-G*GDPNP, согласно литературным данным, субчастицы рибосомы поворачиваются друг относительно друга и ASF, вместо белка S13, начинает взаимодействовать с белком S19. Заманчиво было предположить, что разрыв В 1а мостика будет способствовать спонтанной и ускорять EF-G зависимую транслокацию.

Для изучения функциональной роли мостика В1а мы провели делецию нуклеотидов 872905 23S рРНК, составляющих оконечность ASF, взаимодействующую с 30S субчастицей. Мутация не была летальной. Клетки, все рибосомы которых были лишены В 1а мостика, росли со скоростью одно удвоение в 116±8 мин, в то время как клетки того же штамма, не содержащие мутации, удваивались каждые 87±8 мин. Измерение точности трансляции с помощью тестовых плазмид, кодирующих ген lacZ с мутациями, показало, что разрушение мостика В1а практически не влияет ни на прочтение стоп-кодонов как смысловых, ни не сдвиг рамки считывания, ни на ошибки декодирования.

А. „ji¿> Б. Рисунок 16.

а,- - . Деления "пальца А

участка" (ASF) и ее влияние на

функционирование рибосом А.

Фрагмент вторичной структуры 23 S рРНК. В черный прямоугольник обведены нукпеотиды 872-905, удаленные с

помощью мутагенеза Б.

Расположение мостиков В1а (образованный ASF), Bib и Ble в пространственной структуре большой субчастицы рибосом. В

Пошаговая трансляция in vitro.

Дорожки соответствуют функциональным комплексам рибосомы: (1) с мРНК и fMet-TPHK['MM Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-rPHKpt*,EF-Tu*GTP+EF-Ts Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-tPHKLv"*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию от А в инициаторном AUG кодоне Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона WT - дикий тип, Д872-905-мутантные рибосомы. Г. Зависимость от концентрации EF-G скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP, стимулированного

wr

12 3 4

Д872-905 1 2 3

S

V

О

5 300"

О 250

a." h- 200 о

^ tSQ

♦16 c: CL.100

♦ 19

*22 J3 50

tef-g j, (im

Поскольку мы разрушили межсубчастичный мостик, сначала логично было проверить, влияет ли такая мутация на ассоциацию субчастиц? Оказалось, что рибосомные 50S субчастицы с делецией части спирали 38 требуют более высоких концентраций ионов магния, чтобы ассоциировать с малыми субчастицами. При концентрации Mg2+ 5мМ 70% 50S субчастиц дикого типа и 95% мутантных субчастиц не образовывали 70S рибосом. При концентрации Mg2+ 14мМ 85% 50S субчастиц дикого типа, но лишь 50% мутантных субчастиц находились в составе 70S рибосом. Даже при концентрации Mg2+ 21мМ, когда 90% субчастиц дикого типа ассоциировали с 30S субчастицами, лишь 60% субчастиц с укороченной спиралью 38 23S рРНК ассоциировали с малыми субчастицами. Таким образом, мы показали, что разрушение В1а мостика нарушает ассоциацию субчастиц. Известно, что структура В1а мостика меняется при взаимодействии с EF-G. Скажется ли разрушение этого мостика на эффективность работы EF-G? С помощью тоупринтинга мы проверили, влияет ли укорочение спирали 38 23S рРНК на эффективность отдельных стадий цикла элонгации (Рис. 16в). Оказалось, что связывание fMet-TPHKfMct с Р участком рибосом (Рис. 16в дорожки 1), Phe-TPHKPhe*EF-T u*GTP с А участком рибосом (Рис. 16с дорожки 2) и транслокация, катализируемая EF-G*GTP (Рис. 1 бв дорожки 3,4) происходили с одинаковой эффективностью в случае рибосом дикого типа и рибосом с делецией нуклсотидов 872-905 23S рРНК. Можно сделать вывод о том, что все стадии элонгационного цикла рибосомы с нарушенным В1а мостиком выполняют с той же

Рисунок 17. Влияние делеции ASF на структуру 23S и 5S рРНК. А, С, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - дикий тип, А - рибосомы, несущие делецию ASF Модификация проводилась DMS, котоксалем (Ket) и СМСТ. Un - без модификации. Нуклеотиды, меняющие реакционную способность, показаны стрелками. Использовали

олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А), 2281-2301 (Б), 2591-2611 (В), 2886-2903 (Г) 23S рРНК и 102-120 (Д) 5S рРНК.

Для того, чтобы определить влияние делеции нуклеотидов спирали 38 23 S рРНК на скорость функционирования EF-G, мы измерили скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP элонгационньгм фактором G, стимулированным рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами (Рис. 16г), а также комплексами рибосом с polyU и деацилированной тРНКИ1С. За исключением несколько меньшей скорости гидролиза GTP, стимулированной комплексом мутантных рибосом с polyU и деацилированной TPHK|;hc, по сравнению с тем же комплексом рибосом дикого типа, никаких существенных отличий найдено не было. Этот результат свидетельствует против того, что В1а мостик и его изменения в ходе транслокации существенны для работы EF-G.

Для нас было интересным оценить, как отсутствие мостика В 1а сказывается на структуре рибосомы. Мы повели химическую модификацию рибосом, у которых спираль 38 содержала делецию нуклеотидов 872-905 DMS, кетоксалем и СМСТ (Рис. 17). Спираль 38 взаимодействует с Е петлей 5S рРНК и спиралью 81 23S рРНК. Спираль 81, в свою очередь, связана со спиралью 80, т.н. Р петлей 23S рРНК. Между спиралями 80 и D-петлей 5S рРНК

эффективностью, что и рибосомы дикого типа.

Un Ket

UGCA д wt

Б.

DMS Ket СМСТ Un UGCA Awt A wt A wt A wt

<G9Se

..... ■ .

«s

SÉ

"<tU2249 "«G2250

-<G225S

DMS Ket Un

UGCA Awj t A wt A wt

4G2529

<g2751

<U8S

расположена спираль 39 23S рРНК Весь этот узел третичной структуры 23S рРНК оказался измененным под влиянием делении конца спирали 38 23S рРНК Нуклеотиды U2249, G2250 и G2255 Р петли (спирали 80), U89 D петли 5S рРНК и G956 спирали 39 23S рРНК стали более реакционноспособными по отношению к химическим реагентам (Рис 17 аДд) Некоторые из этих нуклеотидных остатков вовлечены в третичные взаимодействия сами, некоторые соседствуют с нуклеотидами, вовлеченными в третичные взаимодействия с нуклеотидами спиралей 42 и 89 Две последние спирали расположены между РТС и центром связывания трансляционных факторов йТРаз, состоящим из GAC и SRL (Рис 15) Очевидно, что эти спирали несколько изменили свое положение в пространстве как единое целое Этим можно объяснить влияние делеции нуклеотидов 872-905 на реакционную способность нуклеотидов G2529 и G2751, участвующих в третичных взаимодействиях со спиралями 89 и 42, соответственно

Изучение роли взаимодействия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в

формировании структуры РТС и участка предполагаемой передачи аллостерического

сигнала

Петля спирали 39 расположена между Р петлей 23S рРНК, взаимодействующей с ССА концом тРНК, находящейся в Р участке, и D петлей 5S рРНК (Рис 15) Спираль 39 расположена таким образом, что может участвовать в передаче аллостерического сигнала от Р/Е участка к месту взаимодействия с EF-G Делеция части ASF привела к усилению степени модификации нуклеотида G956 петли спирали 39 кетоксалем (Рис 17в) Спираль 39 привлекла наше внимание еще до определения пространственной структуры 50S субчастицы рибосомы В нашей лаборатории, с помощью фотоаффинного сшивания, было обнаружено, что D петля 5S рРНК соединяет спирали 39, 42 и 89 23S рРНК Эти спирали сближены с GAC и РТС во вторичной структуре 23 S рРНК Именно тогда, еще до определения структуры большой субчастицы рибосомы с атомарным разрешением, в нашей лаборатории была сформулирована гипотеза о передаче аллостерического сигнала между РТС и участком связывания EF-G

Замены нуклеотида А960 на G, С и U оказались не летальными Рибосомы, несущие эти мутации могли поддерживать жизнь клеток, в которых не было рибосом дикого типа Замены A960G и A960U практически не меняли времени удвоения клеток, составляющему 119±1 минута для клеток дикого типа, 107+8 минут для клеток, несущих мутацию A960G в 23S рРНК и 125±3 минуты для мутанта A960U Замена нуклеотида А960 на цитидии (А960С) замедляла рост клеток (время удвоения 175±4 минуты)

Мы использовали химическую модификацию рибосом DMS, кетоксалем и СМСТ для определения нуклеотидных остатков 23 S и 5S рРНК, изменяющих свою конформацию в результате мутаций нуклеотида А960 Как и ожидалось, мутации изменяли структуру петли спирали 39 и D петли 5S рРНК (Рис 18 а,б) Степень изменения реакционной способности коррелировала со степенью влияния мутаций на скорость роста клеток Наибольшее отличие от дикого типа имели рибосомы, несущие мутацию А960С Кроме нуклеотидов, непосредственно взаимодействующих со спиралью 39, мы обнаружили еще несколько нуклеотидов 23 S рРНК, которые меняли свою реакционную способность по отношению к DMS, кетоксалю или СМСТ при мутациях А960 (Рис 18 в-ж) Эти нуклеотиды были расположены вблизи, либо входили в состав РТС Наиболее удивительным было то, что нуклеотиды G2251, G2252, U2506, U2585, защищаемые от химической модификации при связывании тРНК с Р участком рибосом, также оказывались защищены в рибосомах, несущих мутации А960 (Рис 18 г,е,ж) Особенно сильным было изменение реакционной способности нуклеотидов РТС при замене А960С Нарушение структуры спирали 39 23 S рРНК приводит к конформационному изменению ПТЦ, делающему недоступными для химической модификации нуклеотиды, взаимодействующие с тРНК в Р участке

рРНК приводит к конформационному изменению ПТЦ, делающему недоступными для химической модификации нуклеотиды, взаимодействующие с тРНК в Р участке.

( i

д. Un DMS Kethoxal СМСТ

n960

Рисунок 18. Влияние мутаций нуклеотида А960 на структуру 23S. А, С, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Нуклеотид 960 23S рРНК обозначен над дорожками. RNA - депротеинизированная рРНК дикого типа. Обработка проводилась DMS, кетоксалем (Kethoxal) и СМСТ. Un -без обработки. Нуклеотиды,

изменяющие реакционную способность, показаны

стрелками. Использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г), 2281-2301 (Д) 2730-2749 (Ж) 23S рРНК.

Рисунок 19. Расположение нуклеотидов, степень модификации которых уменьшалась (синие) или увеличивалась (красные) при мутациях нуклеотида А960 238 рРНК. Зеленым показана спираль 89 23Э рРНК.

Можно было предположить, что подобное гаУааШ!изменение структуры, также делает эти

взаимодействия с тРНК. В таком случае мы можем иметь дело со стабилизацией ó-'* ' конформации 50S субчастицы, при которой

нарушено взаимодействие тРНК с Р

iJ конформация может реализовыватъся в ходе

-W транслокации, при перемещении тРНК в

участки А/А + Р/Е. Пространственное расположение нуклеотидов, которые меняют конформацию в результате мутации А960С представлено на рисунке 19. Эти нуклеотиды образуют третичные взаимодействия между спиралями 39. 89. 91, 92 23S рРНК и D петлей 5S рРНК. Изучение рибосом, несущих мутации нуклеотида А960, подтвердило, что 50S субчастица имеет участки конформационной подвижности между РТС и местом

а2518

Un Kethoxal СМСТ

Un Kethoxal д. ----------

между двумя ее функциональными центрами, необходим для передачи аллостерического сигнала

Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23 S рРНК в функционировании

факторов трансляции - GTPa3

Петли спиралей 89 и 91 23 S рРНК находятся между GAC и SRL, двумя участками связывания факторов трансляции, имеющих БТРазную активность (Рис 15) Хотя реакционная способность нуклеотидов спиралей 89 и 91 по отношению к химическим модифицирующим реагентам не меняется при связывании EF-G с рибосомой, IF2 защищает нуклеотиды А2476 и А2478 спирали 89 23S рРНК от модификации DMS Участок 23S рРНК, изменяющий свою реакционную способность по отношению к DMS при связывании фактора, участвует в третичных взаимодействиях со спиралью 91 23S рРНК Эти две спирали связывает неканоническая, так называемая обращенная Уотсон-Криковская пара С2475 - G2529 Для изучения функциональной важности этих взаимодействий в 23 S рРНК были введены мутации C2475G, двойная мутация C2475G/G2529C и делеция пары А2471 -U2479 Мутация C2475G, не разрушала взаимодействие спирали 89 с петлей спирали 91 Псевдокомпенсаторная мутация C2475G/G2529C наоборот, приводила к разобщению спиралей 89 и 91 Делеция A2471/U2479 приводила к тому, что петля спирали 89 смещалась от участка взаимодействия с трансляционными факторами ОТРазами к РТС Взаимодействие со спиралью 91 также нарушалось Все мутации оказались не летальными, и соответствующие мутантные рибосомы могли осуществлять трансляцию в клетках, в которых отсутствовали рибосомы дикого типа Скорость роста клеток штамма, в котором все рибосомы имели мутацию C2475G (время удвоения 87+8 мин) не отличалась от скорости роста штамма, в котором функционировали только рибосомы дикого типа (время удвоения 85±8 мин) Мутация C2475G/G2529C приводила к увеличению времени удвоения клеток до 134+10 мин Укорочение спирали 89 (AA2471/U2479) приводило к самому сильному замедлению роста (время удвоения 220+16 мин)

Для оценки роли взаимодействия петель спиралей 89 и 91 в поддержании точности трансляции мы использовали систему плазмид, в которых был закодирован ген lacZ Мутации, внесенные в этот ген, могли быть компенсированы ошибками при трансляции считанной с него мРНК Оказалось, что взаимодействие петель спиралей 89 и 91 не важно для поддержания точности декодирования

Эффективность отдельных стадий трансляции, осуществляемой мутантными рибосомами, мы оценивали с помощью метода тоупринтов Для этих опытов использовали мРНК, кодирующую пептид MFK Связывание fMet-TPHKfMet с Р участком, связывание Phe-тРНКр|ге* EF-Tu* GTP с А участком и транслокация проходили одинаково эффективно с рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами Кроме того, все типы мутантных рибосом были способны стимулировать не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP элонгационным фактором G в той же степени, что и рибосомы дикого типа Получив подобные результаты, мы пришли к заключению, что взаимодействие спиралей 89 и 91 не важно для функционирования ни EF-Tu, ни EF-G и вообще для элонгации трансляции

Согласно литературным данным, петля спирали 89 взаимодействует с инициаторным фактором 2 Этот фактор, как EF-Tu и EF-G, связывает GTP, однако, катализирует другой процесс - отбор fMet-TPHKfMtt и ассоциацию субчастиц при инициации Связывание IF2*GDPNP с рибосомами мы детектировали, наблюдая за защитой оснований 23 S рРНК от химической модификации (Рис 20а) Поскольку было известно, что IF2 Е сок связывается с рибосомой слабо и не способен защищать нуклеотиды 23 S рРНК от химической модификации, мы использовали IF2 Т thermophilic Как было известно, взаимодействие IF2 с рибосомой приводит к уменьшению реакционной способности нуклеотида А2665 и повышению реакционной способности нуклеотида А2660 23S рРНК по отношению к DMS

Все мутантные рибосомы были способны связывать 1Р2*ООР1МР, однако степень связывания отличалась у рибосом, несущих мутации. Оценка степени связывания 1Р2*ОБР]МР проводилась с помощью сравнения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к Мы использовали такой своеобразный "внутренний контроль", чтобы небольшие отличия в интенсивности дорожек радиоавтографа соответствующего полиакриламидного геля, в котором разделяли продукты обратной транскрипции, минимально влияли на результаты нашей оценки. Мутация ДА2471/Ш479 не влияла на связывание с рибосомой 1Р2*ООРЫР (Рис. 20а). Одиночная замена С2475С немного (примерно на 20%) ухудшала взаимодействие №2 с рибосомой (Рис. 20а). Двойная мутация С2475СЛл2529С приводила к снижению эффективности изменения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 23Б рРНК на 60% (Рис. 20а). Ни одна из изученных мутаций не приводила к полному ингибированию связывания №2 с рибосомой, что вполне согласуется с тем, что мутации не были летальными.

А.

Б.

v»! д 89

--¿¡а М а-1

ип смз Б Рисунок 20. Влияние

мдЦаЦм а $ 89 мутаций в участке

контакта спиралей 89 и 91 238 рРНК на инициацию трансляции. А. Оценка

взаимодействия №2 с ЭИ-и влияние на нее мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 238 рРНК. А, С, в и и -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Для модификации использовали ОМ8. ип-23 Б рРНК без модификации. ХУТ-дикий тип, 89 -мутация С2475С, > 89/91 - мутации С2475СЛ32529С, А -делеция А2471/Ш479.

Дорожки, находящиеся справа в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют рибосомам без лигандов; Дорожки, находящиеся слева в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют комплексам рибосом и П\2*ОБРНР. Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 238 рРНК. Б. Зависимость от концентрации рибосом скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза СТР инициаторным фактором 2, стимулированного рибосомами дикого типа (квадраты), рибосомами, несущими мутацию С2475в (ромбы), рибосомами, несущими мутацию С2475СЛ32529С (треугольники) и рибосомами, несущими делецшо пары нуклеотидов А2471/Ц2479 (круги). В. Оценка с помощью тоупринтинга влияния 1Р2 на образование инициаторного комплекса. Дорожки соответствуют: (К) мРНК; (-) комплексам рибосомы, мРНК, Ше1-тРНК"м, 1Р1 и 1РЗ; (+) комплексам рибосомы, мРИК, Ме^тРНК"", ПН, 1¥2 и 1РЗ. Полоса, соответствующая инициаторному комплексу, отмечена цифрой +16. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. Подписи дорожек -как на панели (А).

Опыты по изучению связывания 1Р2 с рибосомой были дополнены измерением ОТРазной активности №2, индуцируемой рибосомами (Рис. 206). Рибосомы, несущие укороченную спираль 89 (ДА2471/Ш479) хуже, чем рибосомы дикого типа, способствовали гидролизу ОТР инициаторным фактором 2. Рибосомы, несущие мутации С2475Э и С24750/С2529С,

[705], рМ

были более эффективны в стимуляции йТРазной активности №2. Кажущееся противоречие между результатами измерения связывания с рибосомами и ОТРазной активности №2 можно объяснить. Сходный феномен наблюдался в лаборатории Далберга при изучении связывания и не сопряженной с транслокацией йТРазной активности ЕР-О. Объяснение подобных результатов состоит в том, что фактор трансляции может связаться с рибосомой, гидролизовать вТР, и покинуть рибосому, не выполнив свою функцию - то или иное изменение конформации функционального комплекса рибосомы. Прочное связывание, необходимое для выполнения функции, препятствует "холостому" гидролизу вТР.

А.

%Ж .

СД32475 Е

т(

в!С2529 >

А2534 ►

в2751

ивСА

Рисунок 21. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23в рРНК на структуру 238. А, С, О, и - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили БМ8, кетоксалем (КеО и СМСТ. Ш - без модификации. Подписи дорожек, как для рис. 20. Нуклеотиды, степень модификации которых

зависела от мутаций, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г) и 2281-2301 (Д) 238 рРНК.

Как же мутации в спиралях 89 и 91 влияют на выполнение фактором №2 своей функции - сборке комплекса рибосом с мРНК, содержащего ШеИгРНК™" в Р участке? Для ответа на этот вопрос мы использовали метод тоупринтов. Для определения влияния ЕР2 на сборку инициаторньгх комплексов сравнивали интенсивности сигналов тоупринтинга, соответствующих инициаторным комплексам, собранным в присутствии всех трех инициаторных факторов и в присутствии только Ш1 и №3 (Рис. 20в). Все мутантные рибосомы были способны образовывать инициаторный комплекс, и для всех мутаптных рибосом присутствие №2 способствовало сборке этого комплекса. Количественные оценки показали, что для мутации ДА2471/112479 235 рРНК, активность Ш2 в сборке инициаторного комплекса снижена на 30%. Мутации С24750 и С24750/Ч32529С 238 рРНК снижали эффективность работы Ш2 вдвое. Эти результаты хорошо согласуются с интерпретацией результатов оценки связывания 1Р2 с рибосомой и измерения ОТРазной активности №2, стимулируемой рибосомами. Мутации С24750 и С2475СЛ32529С 238 рРНК приводят к тому, что возрастает вероятность диссоциации комплекса №2*ОВР с рибосомой без образования инциаторного комплекса. Такое "холостое" связывание приводит к перерасходу ОТР и снижению эффективности инициации трансляции. Слишком прочное связывание Ш2, характерное для рибосом, несущих делецию пары оснований в спирали 89, также замедляет инициацию, препятствуя уходу Ш2.

В:-'

А2225 *

1ЮСА

A. L1 ПАЛЕЦ Б.

Рисунок 22. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК во вторичной (А) и пространственной (Б) структуре 50S субчастицы. Черные линии соединяют те нуклеотиды, которые участвуют в третичных взаимодействиях. Красными треугольниками (А) и черными сферами (Б) отмечены нуклеотиды, реакционная способность которых повышается при мутациях в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. Черные прямоугольники - места мутаций.

Петли спиралей 89 и 91 находятся на предполагаемом пути передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка большой субчастицы к EF-G (Рис. 15). Хотя мутации, нарушающие взаимодействие этих петель, не сказываются на функционировании EF-G, нам показалось интересным выяснить, какие изменения они вызывают в конформации 23S рРНК? Возможно, не прервав цепь передачи аллостерического сигнала полностью, мутации могли сместить равновесие конформеров 23S рРНК. Обнаружение нуклеотидов 23S рРНК, которые изменили свою реакционную способность в результате мутаций в спиралях 89 и 91, позволило бы выявить подвижные элементы 23S рРНК, расположенные между РТС и участком, взаимодействующим с факторами элонгации.

Химическая модификация рибосом, несущих мутации C2475G, C2475G/G2529C и ДА2471/Ш479 23S рРНК, проводилась с помощью DMS, кетоксаля и СМСТ. Степень модификации тех или иных оснований 23S рРНК определялась с помощью обратной транскрипции. Были обнаружены несколько нуклеотидных остатков 23 S рРНК, реакционная способность которых по отношению к используемым реагентам менялась в результате мутаций (Рис.21). Степень изменения конформации рРНК, вызванная мутациями, коррелировала с замедлением скорости роста клеток. Замена C2475G 23S рРНК практически не вызывала изменений реакционной способности нуклеотидов 23S рРНК (Рис. 21). Двойная мутация C2475G/G2529C привела к изменению реакционной способности нуклеотидов G2472, G2475(Mecro мутации), А2476, U2477, С2529(место мутации), А2534 23S рРНК в спиралях 89 и 91 (Рис. 21 а,б). Очевидно, что двойная мутация привела к нарушению взаимодействия между спиралями 89 и 91. Кроме нуклеотидов, сближенных с местом мутации, изменили конформацию несколько нуклеотидов 23S рРНК, расположенных на расстоянии. Так, стали более доступны для реакции с кетоксапем нуклеотиды G956 (Рис. 21в) и G2751 (Рис. 21г), принадлежащие петлям спиралей 39 и 97 23 S рРНК. Обе эти петли участвуют в третичных взаимодействиях с удаленными во вторичной структуре 23S рРНК участками (Рис. 22 а).

Возможно, что эти третичные взаимодействия могут нарушаться в ходе передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G Нуклеотид G956 расположен в непосредственной близости от РТС (Рис 22 а,б), а нуклеотид G2751 образует третичный контакт со спиралью 42 23 S рРНК (Рис 22 а,б), соединяющей GAC с оставшейся частью 23S рРНК Деления нуклеотидов A2471/U2479 23S рРНК приводит к изменению реакционной способности тех же нуклеотидов 23S рРНК, что и мутация C2475G/G2529C, но дополнительно изменяет конформацию еще нескольких нуклеотидов (Рис 21) В спирали 89 оказываются реакционноспособными по отношению к кетоксалю нуклеотиды G2470 и G2481 (Рис 21а) Это наблюдение свидетельствует о разрушении части вторичной структуры спирали 89 Неожиданным было обнаружить, что мутация AA2471/U2479 23S рРНК приводит к усилению модификации нуклеотида А2225 23S рРНК DMS (Рис 21 д) Нуклеотид А2225 расположен в основании L1 пальца большой субчастицы, с противоположной стороны от GAC и спиралей 89 и 91 Хотя петлю спирали 89 и нуклеотид А2225 разделяет значительное расстояние (Рис 22 б), они связаны двумя длинными спиралями 89 и 75, симметрично расположенными относительно РТС (Рис 22 а,б) Можно предположить, что участок связывания факторов элонгации и L1 палец аллостерически связаны спиралями 89 и 75 К этому выводу можно также прийти, в результате анализа структуры комплекса рибосомы с EF-G*GDPNP, определенной методом криоЭМ Два самых подвижных элемента большой субчастицы, GAC и L1 палец, подвержены в этом комплексе скоординированному перемещению в сторону центрального протуберанца большой субчастицы

Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23 S рРНК в связывании EF-G и транслокации

Элонгационный фактор G взаимодействует с двумя элементами 23 S рРНК - SRL и GAC Сарцин-рициновая петля абсолютно необходима для взаимодействия рибосомы с элонгационными факторами Апуринизация А2660 рицином и разрезание связи между нуклеотидами G2661 и А2662 сарцином приводит к инактивации рибосом Нуклеотидный остаток G2655 защищается от модификации кетоксалем при связывании с рибосомой факторов элонгации Мутации этого нуклеотида G2655C и G2655U были описаны как летальные Применение криоЭМ позволило определить, что SRL взаимодействует с участком связывания GTP элонгационными факторами Можно было предположить, что это взаимодействие необходимо для гидролиза GTP

Мы провели замены нуклеотида G2655 23S рРНК на А, С и U Мутация G2655U, в отличие от ранее опубликованных данных, оказалась не летальной, замена G2655A не влияла на функционирование рибосом Однако, мутация G2655C была летальной, и мы использовали рибосомы, несущие эту мутацию в дальнейших опытах

Мы оценивали связывание EF-G с рибосомами по степени модификации нуклеотидов А1067 (Рис 23а) и А2660 DMS (Рис 236) Основание А1067 принадлежит GAC, а А2660 -SRL Оценивая степень модификации этих нуклеотидов, можно было получить ответ на вопрпос, взаимодействует ли EF-G с GAC и взаимодействует ли он с SRL Оказалось, что связывание EF-G с GAC не было подвержено влиянию мутации G2655C (Рис 23а) В то же время, заимодействие EF-G с SRL в результате этой мутации было значительно ослаблено (Рис 236)

Было известно, что SRL взаимодействует именно с той частью EF-G, которая связана с GTP Влияет ли мутация G2655C 23 S рРНК на стимуляцию ОТРазной активности EF-G рибосомами' Мы использовали не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, для оценки способности EF-G взаимодействовать с рибосомами и осуществлять гидролиз гуанозин - 5'- трифосфата (Рис 23в) Оказалось, что рибосомы, несущие мутацию G2655C 23S рРНК, стимулируют не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, осуществляемый

ЕБ-О, в той же степени, что и рибосомы дикого типа (Рис. 23в). Может быть, эта мутация вообще не влияет на функционирование ЕР-в?

Ш С2655С

т Э2655С

„„ cif.iluLcHja.ii. АвэЧ'шшэ'Ушш

Цяй»

Что ^

т^Мпим

-4?А1067

Рисунок 23. Оценка влияния мутации 02655С 23Я рРНК на связывание и функционирование ЕР-О. А. Оценка взаимодействия ЕР<5 с вАС и влияние на нее мутации 02655С 238 рРНК. А, в -дорожки определения нуклеотидиой последовательности. Модификацию проводили БМБ, иптоё немодифицированная 238 рРНК WT -дикий тип, 02655С - рибосомы, несущие мутацию. Дорожки: (-ЕР-в) рибосомы без лигандов; (ЕР-в) комплекс рибосом и ЕР-С*ОТР; (ЕР-О+Риз) комплекс рибосом, ЕР-С*вТР и фусидовой кислоты. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23в рРНК. Б. Оценка взаимодействия ЕР'-й с БИТ и влияние на нее мутации в2655С 23Б рРНК. Обозначения соответствуют таковым для панели А. Нуклеотиды А2660 и 0/С2655 отмечены стрелкой. Использовали олигонуклеотид,

комплементарный нуклеотидам 27302749 23в рРНК. В. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза вТР [Т-О от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими мутацию 02655С (черные

треугольники), рибосомами дикого типа в присутствии фусидовой кислоты (серые квадраты) и рибосомами, несущими мутацию 02655С в присутствии фусидовой кислоты (серые треугольники). Г. Изучение 2 1 ' влияния мутации С2655С 23в рРНК на

эффективность транслокации. Белые столбцы соответствуют функциональным комплексам рибосом дикого типа, черные - комплексам рибосом, несущих мутацию в2655С 23Э рРНК. (1) рибосомы, ро!уи и АсРЬе-тРНКй"; (2) комплекс (1)+ АсР11е-тРНКр|,е; (3) комплекс (2) + ЕР-0*СТР.

ВРЕМЯ, МИН

3"

.2 ^ >> —

X ш 2

<§5 ест с

Для оценки эффективности транслокации, катализируемой ЕР-в, мы использовали иуромициновую реакцию (Рис. 23г). Способность мутантных рибосом к транслокации была значительно, примерно в 3 раза, снижена. В этом опыте мы не измеряли скорость транслокации, а лишь выход этой реакции за 10 минут. Такой низкий уровень транс локации в течении длительного для элонгационного цикла рибосомы времени свидетельствовал о том, что в клетке рибосомы, несущие мутацию 02655С должны быть практически неактивны в трансляции, что и объясняет летальность мутации. За те же 10 минут мутантные рибосомы стимулировали количественный гидролиз 100-кратного избытка вТР,

осуществляемого EF-G Значит, рибосомы, имеющие мутацию G2655C 23S рРНК, связывают EF-G*GTP и стимулируют гидролиз трифосфата, после чего комплекс рибосомы с EF-G*GDP диссоциирует без прохождения конформационных изменений, необходимых для транслокации

Сходное явление было описано в литературе для EF-G, в котором домены I и V были сшиты дисульфидной связью Такой, "конформационно-ограниченный" EF-G взаимодействовал с GAC 50S субчастицы дикого типа и не взаимодействовал с SRL Отсутствие взаимодействия с SRL не препятствовало гидролитической активности EF-G, но деладо транслокацию невозможной Мы наблюдали практически такой же эффект, нарушая взаимодействие EF-G с SRL с помощь мутации G2655C Основываясь на результатах этих опытов, можно предложить, в какой последовательности происходят конформационные превращения комплекса EF-G с рибосомой Взаимодействие EF-G с GAC (или GAC-связывающими белками L11 и L7/L12) первично Для него не требуется "разгибания" субдоменов 1-П1 и IV-V Взаимодействие EF-G с GAC приводит к гидролизу GTP Затем, для катализа транслокации, необходимо изменить взаиморасположение субдоменов FF-G Это изменение конформации EF-G требует стабилизации, достигаемой дополнительно возникающим взаимодействием EF-G с SRL GAC и SRL оказываются не просто двумя частями участка связывания EF-G, но и элементами, активно участвующими в изменении конформации EF-G, и в транслокации

Изучение движения GAC как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G Роль GAC в связывании EF-G и EF-Tu

Факторы элонгации EF-G и EF-Tu взаимодействуют с двумя участками 50S субчастицы - GAC и SRL По данным криоэлектронной микроскопии, в комплексе рибосомы с EF-G*GDPNP GAC сдвинут в сторону центрального протуберанца Затем, после гидролиза GTP, рибосома принимает ту конформацию, которую она имела до связывания EF-G В структуре комплекса рибосомы с aa-TPHK*EF-Tu*GDPNP, GAC немного смещается в сторону спирали 89 23S рРНК, принимая "полузакрытую" конформацию, которая затем, после гидролиза GTP, превращается в "закрытую" Изменение положения GAC можно наблюдать также, сравнивая пространственные структуры 50S субчастиц Н mansmortui и D radiodurans Очевидно, что GAC это подвижная структура и ее положение относительно других компонентов 50S субчасшцы зависит от функционального состояния рибосомы Почему GAC может перемещаться относительно других элементов большой субчастицы9 Дело в том, что GAC представляет собой разветвленную шпильку, соединенную с оставшейся частью 23 S рРНК одной спиралью 42 Эта спираль взаимодействует со спиралью 89 в своем начале и имеет изгиб, образованный т н К-поворотом Мы решили проверить, насколько важен поворот спирали 42 23S рРНК, ведущий к "закрытой" конформации GAC для связывания и функционирования факторов трансляции Было интересно также выяснить, сопровождается ли переход в эту конформацию другими изменениями структуры 50S субчастицы Для того, чтобы зафиксировать GAC в "закрытой" конформации вне зависимости от функционального состояния рибосомы, мы ввели в спираль 42 вставку C-G пары после пары оснований C1030-G1124 23S рРНК (Рис 24а) Вставка пары оснований в спираль РНК приводи! к удлинению спирали на 3-3 5Á и повороту нукяеотидов спирали, следующих за вставкой на 30-36° В случае спирали 42, имеющей изогнутую Г-образную форму, вставка пары оснований будет приводить к смещению GAC в стороны спирали 89 и образованию "закрытой" конформации (Рис 24в) Перемещение GAC в сторону спирали 89 23S рРНК и образование контакта с этой спиралью должно было сопровождаться изменением реакционной способности нуклеотидов спирали 89 и, возможно, тех элементов структуры 50S субчастицы, которые образовывали третичные взаимодействия с этой спиралью Для проверки этого

предположения мы провели химическую модификацию мутантных рибосом DMS, кетоксалем и СМСТ. Степень модификации нуклеотидов 23 S рРНК определяли с помощью обратной транскрипции (Рис. 25). Множество нуклеотидов 23 S рРНК в результате мугации InsC1030/G1124 изменяли свою реакционную способность по отношению к модифицирующим реагентам (Рис. 25). Эти нуклеотиды была рассеяны во вторичной структуре 23S рРНК (Рис. 24а), но оказались сгруппированы в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис. 246,в). Большинство оснований, степень модификации которых химическими реагентами зависела от присутствия мутации InsC1030/Gl 124, сгруппированы вокруг спирали 89 23 S рРНК. Одни нуклеотиды этой группы напрямую участвуют в образовании третичных взаимодействий с этой спиралью, другие участвуют в третичных взаимодействиях со спиралями 23S рРНК, в свою очередь, находящихся в контакте со спиралью 89 23S рРНК (Рис. 246,в). Область изменения конформации рРНК, вызванная переходом GAC в "закрытое" состояние находится между РТС и участком взаимодействия с факторами элонгации (Рис. 246,в). Интересно, что изменение положения GAC вызвало, в свою очередь, изменение конформации SRI, (Рис. 24, 25).

GZZ8S gz2t!

Helix 89

Helix 91

Helix 39

Helix 98

GAC

Рисунок 24. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная

способность которых

зависит от перемещений GAC. А. Фрагмент

вторичной структуры 23 S рРНК. Стрелками показаны нуклеотиды 23 S рРНК, реакционная способность которых изменяется при вставке в спираль 42 23 S рРНК. Нуклеотид G2655 становится менее

доступным для

модификации кетоксалем. Все остальные нуклеотиды, отмеченные стрелками увеличивают свою

реакционную. Прямоугольник- вставка пары нуклеотидов. Б.

Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная

способность которых зависит от перемещений GAC 23S рРНК в пространственной структуре 50S (показаны черным). В. Элементы вторичной структуры 23 S рРНК, которые меняют конформацию при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Элементы вторичной структуры 23S рРНК подписаны. Стрелкой показано направление движения GAC.

А.

р- dms Ket Unm

ACGU I Wt I wt I wt

,K.I Unm ACGU I wt I wt

Ii966 A960

Б.

ACL.

B.

, , DMS Ket Unm ACGU I wtl wt Iwt

gG1026 ЦА102В

4G1128 -4G1131

д- dms ket unm

ACGU iwt iwt iwt

a- •"

E.

Л1 MAS Ket CMC Unm ACGU iwt iwt iwt iwt

i.

; ^G2250

Рисунок 25. Влияние вставки пары нуклеотидов в спираль 42 238 рРНК на структуру 23 в. А, С, в, II -дорожки определения

нуклеотидной последовательности. -дикий тип; I - вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23 Б рРНК. Модификацию проводили ЭМв,

кетоксалем (КеИюха1) и СМСТ. Шш - без модификации. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутации, показаны

стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотиды, ЛА235Б комплементарные

Зй2860 нуклеотидам 1104-1120 (А,

Б), 1190-1210 (В), 2081-2100 (Г), 2281-2301 (Д), 2591-2611 (Е, Ж), 2730-2749 (3, И), 2886-2903 (К, Л) 238 рРНК.

-<G2S29

р ■ DMS Ket Unm

ACGU Iwt Iwt Iwt

k.

|t| A2764

^G2661

И

ШЩ

-4G2454

-<G2472 ^U2477 -<C2483

iG2666 A2657

. „_, . DMS Ket Unm

ACGU iwt iwt iwt

.DMS Ket Unm ACGU iwt iwt iwt

+ + + + WT

+ + + + Ins

+ + + + + + + + + мРНК

+ + + + + + + + тРНК

+ + + + + + AePhe-TPHK

+ + + + G'GTP

+ + Tu*GTP*Lvs-tPHK

Шт^ т ^ да» ш s.-! <+16 -<+17 <+19 <+20 <+22

Рисунок 26. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла с помощью пошаговой трансляции in vitro. Компоненты, участвующие в образовании функционального комплекса подписаны сверху от авторадиограммы. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Цифры соответствуют расстоянию (в нуклеотидах) места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный

нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона.

Несколько цуклеотидпых остатков, чья реакционная способность по отношению к химическим реагентам изменилась в результате мутации 1п8С1030/01124 были расположены на значительном удалении от места мутации, ОАС и спирали 89 23Я рРНК (Рис. 246,в). Эта группа нуклеотидов либо входила в состав петли спирали 96, либо участвовала в третичных взаимодействиях со спиралью 96 (Рис. 24, 25). Как могла измениться конформация этих нуклеотидов 23 Б рРНК? Мы обратили внимание на то, что спирали 96 и 97 образуют монолитный спиральный элемент, скрепленный коаксиальным стекинг-взаимодействием (Рис. 24в). Верхняя часть этого спирального элемента находится под "сгибом" спирали 42, образованном К-поворотом. Со стороны спирали 97, во взаимодействии со спиралью 42 участвует пуклеотид й2751. Его реакционная способность по отношению к кетоксалю меняется у нескольких типов мутантных рибосом. Видимо, при образовании "закрытой" конформации ОАС спираль 42 "давит" на спиральный элемент, образованный спиралями 97 и 96 23 в рРНК. При этом разрываются контакты петли спирали 96 с ее окружением. Спирали 97 и 96 служат своеобразным "ограничителем" и "амортизатором" движения йАС. Заметим, что ЭИЕ (спираль 95) присоединена к этому

спиральному элементу Таким образом, конформация SRL оказывается зависимой от положения GAC, что мы можем наблюдать при помощи химической модификации (Рис 24,

Рисунок 27 Оценка влияния вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на связывание и функционирование EF-Tu А Зависимость от времени степени гидролиза GTP фактором элонгации Tu Черные значки соответствуют комплексам рибосом дикого типа, а серые - комплексам рибосом, со вставкой в спирали 42 23S рРНК Использовали комплексы Phe-TPHKme*EF-Tu*GTP (круги), соответствующие, и Lys-TPHKLys*EF-Tu*GTP (квадраты), не соответствующие кодону мРНК в А участке Б Оценка взаимодействия EF-Tu с SRL и влияние на нее вставки в спираль 42 23S рРНК А, С, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности Модификацию проводили DMS, К - без модификации Компоненты, функциональных комплексов, подписаны сверху от авторадиограммы WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелками Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК

Влияет ли перемещение GAC к спирали 89 23S рРНК на активность факторов элонгации и передачу аллостерического сигнала от Р/Е участка к GAC и SRL? Мы использовали метод тоупринтинга для того, чтобы найти ту стадию цикла элонгации, на которую оказывает влияние летальная мутация InsC1030/G1124 23S рРНК (Рис 26) В опыте, результаты которого показаны на рисунке 26, мы связывали тРНК,Мс1 с Р участком рибосомы, затем связывали AcPhe-TPHKphe с А участком Добавление EF-G*GTP вызвало транслокацию в случае рибосом дикого типа Эффективность транслокации была снижена для мутантных рибосом (Рис 26) Последующее добавление Lys-TPHKL>3*EF-Tu*GTP приводило к образованию AcPheLys-TPHKLys в А участке рибосом дикого типа и ее транслокации Рибосомы, содержащие вставку пары оснований в спирали 42 23S рРНК оставались в претранслокационном состоянии (Рис 26) Для рибосом, несущих мутацию, после 10 минут инкубации, вообще не видно продукта, содержащего в Р участке AcPheLys-TPHKLys Из результатов приведенных опытов мы сделали вывод, что образование "закрытой" конформации GAC препятствует транслокации Поскольку при проведении реакции m vitro, связывание аа-тРНК с А участком рибосомы возможно и без посредства EF-Tu, необходимо было удостовериться, что EF-Tu может способствовать связыванию аа-тРНК с А участком мутантных рибосом Мы образовали комплекс рибосомы с мРНК, кодирующей пептид MFK и fMet-TPHKfMa, так же, как мы делали это в опытах, описанных в предыдущем разделе В декодирующем центре малой субчастицы оказывался кодон UUC, кодирующий фенилаланин Далее, мы проводили связывание Phe-TPHKphe*EF-Tu*GTP или Lys-TPHKLys*EF-Tu*GTP с А участком и измеряли уровень гидролиза GTP (Рис 27а) Как рибосомы дикого типа, так и рибосомы, несущие мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК. способствовали кодон-зависимому гидролизу GTP элонгационным фактором Tu Для того, чтобы оценить, не изменилось ли сродство EF-Tu к рибосоме в результате мутации InsC1030/G1124 23S рРНК, мы использовали метод защиты нуклеотидов 23 S рРНК от химической модификации

А

a. so

& 85

и so

2 75

о 70

0 5 10 15 ВРЕМЯ 20 25 30 МИН

+ + ЦП-

+ + Ins

+ + + + мРНК. fMet-тРНК

+ + EF-Tu*GMPPNP "Phe-TPHK

А С G U Фг>

в№> **** •<А2660

ДО W** ЧА2665

*** ш •

-<А1067

[EF-G], цМ

функциональных комплексов, подписаны сверху. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23 S рРНК. Нуклеотид А2660 отмечен стрелкой.

Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23 S рРНК. Б. Оценка взаимодействия EF- О с GAC и влияние на нее вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Нуклеотид А1067 отмечена стрелкой.

Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23 S рРНК. В. Зависимость от концентрации EF-G скорости не

сопряженного с транслокацией гидролиза вТР, стимулированного рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими вставку пары нуклеотидов в спираль 42 23Э рРНК (серые квадраты), комплексами рибосом дикого типа с ро1у11 и тРНКр|18 (черные круги) и комплексами рибосом, несущими вставку пары нуклеотидов в спираль 42 238 рРНК, с ро1у11 и тРНК1'1" (серые круги).

J/VT ins

мРНК.тРНК .мРНК, Met-тРНК EF-G'GMPPNP EF-G'GTPTus

Рисунок 28. Оценка влияния вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23в рРНК на связывание и функционирование ЕР-й. А. Оценка взаимодействия ЕР-в с А, С, в, и - дорожки определения нукпеотидной последовательности. Модификацию проводили ОМ8, К - без модификации. Компоненты

Связывание комплекса РЬе-тРНКр|гс*ЕР-Ти*ООРНР с рибосомами, содержащими мРНК, кодирующую пептид МБК, и снижало реакционную способность

нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к ОМЭ (Рис. 276). При этом не было обнаружено никакого различия между рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию 1пэС 1030/01124 238 рРНК, в степени связывания РЬе-тРНКи,е*ЕР-Ти'|'ОВРМР. Мы пришли к выводу о том, что образование "закрытого" состояния вАС никак не влияет на функционирование ЕР-Ти.

Поскольку применение тоупринтинга показало, что мутация 1п5С1030Л31124 233 рРНК нарушает процесс транслокации, мы изучили взаимодействие ЕР-й с мутантными

помощью защиты нуклеотидов 23S рРНК от химической модификации при образовании комплекса рибосомы с EF-G (Рис. 28а,б). Реакционная способность нуклеотидов А2660 (Рис. 28а) и А1067 (Рис. 286) при взаимодействии рибосомы с EF-G снижается. Оказалось, что смещение GAC к спирали 89 сильно ингибирует связывание EF-G с рибосомой. Мы также изучили влияние мутации InsC1030/Gl 124 23S рРЖ на эффективность передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G. Для этого измеряли то, как связывание деацилированной тРНК с Р/Е участком рибосомы стимулирует не сопряженную с транслокацией ОТРазную активность EF-G (Рис. 28в). Оказалось, что вставка пары оснований в спираль 42 23S рРНК полностью подавляет передачу аллостерического сигнала. Даже когда деацилированная тРНК связана с Р/Е участком рибосомы, несущей мутацию, EF-G этого "не видит".

Рисунок 29 Модель

селективного связывания

факторов элонгации в зависимости от конформации GAC рибосомы. А. Фрагменты структуры 23 S рРНК Н. marismortui (GAC показан оранжевым) и D. radiodurans (GAC показан желтым). Зеленый кружок обозначает

приблизительное место контакта нуклеотид-связывающего кармана факторов элонгации с рРНК. Красный кружок показывает приблизительное место взаимодействия тройного комплекса EF-Tu с GAC, синий -место взаимодействия EF-G с GAC. Б. Структура тройного комплекса aa-rPHK*EF-Tu*GTP. Зеленым показан GTP, красным -спираль D G-домена EF-Tu, взаимодействующая с белком L7/L12, прикрепленным к месту соединения спирали 42 и GAC. В. Структура комплекса EF-G*GDP. Зеленым показан GDP, синим -спираль A G'-домена EF-G, взаимодействующая с белком L7/LI2, прикрепленным к месту соединения спирали 42 и GAC. Г. Модель взаимодействия факторов элонгации с рибосомой. Крупная полусфера - большая, маленькая - малая субчастицы. "Рука" обозначает GAC и присоединенные к нему белки L11 и L7/L12. Закрытая и открытая конформации GAC показаны в виде "длинной" и "короткой" "руки" А, Р и Е -тРНК, связанные с соответствующими участками. EF-Tu и EF-G подписаны. Обозначены претранслокационное (PRE) и посттранслокационное (POST) состояния рибосомы.

Мы показали, что если GAC находится в "закрытом" состоянии, это не препятствует связыванию и функционированию EF-Tu, но препятствует связыванию и функционированию EF-G. На основании этого результата мы сделали вывод, что положение GAC определяет, какой из факторов элонгации может связаться с рибосомой. "Закрытое" состояние GAC способствует связыванию тройного комплекса aa-TPHK*EF-Tu*GTP, а "открытое" - связыванию EF-G*GTP.

Как перемещение GAC (Рис 29а) может регулировать выбор EF-Tu или EF-C Эти белки имеют весьма сходное строение Сходство структур aa-TPHK*EF-Tu*GTP (Рис 296) и EF-G*GDP (Рис 29в) легло в основу гипотезы молекулярной мимикрии Структура G-доменов обоих факторов очень похожа Участок связывания GTP/GDP имеет консервативную структуру и взаимодействует, согласно результатам, полученным с помощью криоЭМ, с SRL В отличие от GAC, SRL не меняет своего положения в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис 29а) В строении комплексов аа-тРНК*ЕР-Ти*ОТР (Рис 296) и EF-G*GDP (Рис 29в) можно увидеть важные различия Так, EF-G содержит дополнительный минидомен - G' Именно с G'-доменом перед гидролизом GTP взаимодействует С-домен L7/L12 и N-домен L11, образуя "арку", существование которой было показано с помощью криоЭМ Белки L7/L12 связаны со спиралью 42 посредством белка L10, а белок L11 напрямую связан с GAC Переход GAC в "закрытое" состояние может быть необходим для изменения положения С-домена L7/L12 и N-домена L11 У бежа EF-Tu нет G'-домена и взаимодействие с С-доменом L7/L12 осуществляется спиралью D G-домена EF-Tu Спираль A G'- домена EF-G расположена практически параллельно спирали D EF-Tu при выравнивании структур факторов элонгации в пространстве (Рис 296,г) Модель селекции факторов элонгации при прохождении рибосомой по циклу элонгации представлена на рисунке 29г Согласно модели, движение GAC изменяет взаиморасположение двух участков связывания факторов элонгации - GAC и SRL (Рис 29а) Большее расстояние между GAC и SRL необходимо для связывания и функциональной активности EF-G Этот фактор взаимодействует с белками, ассоциированными с GAC, А спиралью G'-домена при "закрытой" конформации GAC и, после перемещения GAC в "открытую" конформацию может взаимодействовать с SRL участком связывания нуклеотида (Рис 29) Такой переход невозможен для рибосом, несущих мутацию InsC1030/Gl 124 23S рРНК Напротив, EF-Tu связывается при "открытой" конформации GAC, с помощью D спирали G-домена Для дальнейших шагов в функционировании EF-Tu необходим переход GAC в "закрытую" конформацию При этом SRL вступает в контакт с участком связывания нуклеотида EF-Tu По-видимому, комплекс aa-TPHK*EF-Tu*GTP может связываться напрямую с рибосомами, у которых GAC находится в "закрытой" конформации из-за мутации InsC1030/G1124 23S рРНК При таком взаимодействии и GAC и SRL образуют контакты с аа-тРНК* EF-Tu* GTP одновременно

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе удалось разработать комплекс методов, позволяющий определять функциональную роль элементов рРНК в трансляции Сейчас, после определения пространственной структуры рибосомы, появилась возможность рационально планировать направленный мутагенез рРНК Если раньше мутагенезу подвергали нуклеотиды, взаимодействие которых с лигандами рибосомы было показано с помощью пришивок и химической модификации, то сейчас стало возможным направленно изменять третичные контакты, поддерживающие архитектуру функциональных центров и осуществляющие их взаимодействие

Разработан метод выделения рибосом, несущих летальные мутации Дополняя использование штаммов, в которых рРНК кодируется только на плазмиде, этот метод позволяет выделять рибосомы, несущие любые мутации Метод тоупринтинга позволяет выявить стадию трансляции, на которую влияет мутация При этом, взаимодействие факторов элонгации с рибосомой может быть изучено с помощью тестирования ОТРазной активности и с помощью химической модификации комплекса фактора и рибосомы Тот же метод химической модификации позволяет оценить изменения структуры рРНК, вызванные мутацией

Нам удалось доказать, а в ряде случаев опровергнуть, гипотезы о функциональной роли элементов рРНК Мы получили ответы на вопросы о поддержании структуры декодирующего центра, о роли желоба, по которому аа-тРНК поступает в А участок, о роли Е и Р/Е участков связывания тРНК и о передаче аллостерического сигнала к участку связывания факторов элонгации Собранный нами набор методов может быть использован и в будущем, для изучения тех молекулярных механизмов работы рибосомы, которые еще не были изучены

ВЫВОДЫ

1 Гены yhhF, ybiN, ygjO и ycbY кодируют ферменты, метилирующие нуклеотиды G966 16S рРНК, А1618, G1835 и G2445 23S рРНК Escherichia coli Субстратом для YhhF служит 30S субчастица, для YbiN - рибонуклеопротеид, промежуточный в процессе сборки 50S субчастиц, и депротеинизированная 23S рРНК для YgjO и YcbY Делеции генов yhhF, ybiN, ygjO и .усб У приводят к замедлению роста клеток, но не легальны

2 Третичные взаимодействия нуклеотидов А1201 и Al 191 спирали 34 16S рРНК, способствуют ассоциации субчастиц и обеспечения точности трансляции

3 Сужение, образованное нуклеотидами U2492, С2556 и С2573 23S рРНК на пути перемещения аминоацил-тРНК в А участок не влияет на скорость этого перемещения

4 Перемещение деацилированной тРНК из Р в Р/Е участок способствует взаимодействию EF-G*GTP с рибосомой, повышает эффективность и точность транслокации

5 Межсубчастичный мостик В1а не важен для транслокации, но способствует формированию структуры 50S субчастицы

6 Мутации нукпеотида А960 23 S рРНК стабилизируют конформацию рибосомы, в которой нуклеотиды, образующие Р участок 50S субчастицы защищены от действия модифицирующих реагентов

7 Взаимодействие петель спиралей 89 и 91 23S рРНК не важно для элонгации трансляции, но способствует функционированию фактора инициации 2

8 Прочное взаимодействие EF-G с SRL не важно для ОТРазной активности EF-G, но необходимо для транслокации

9 Вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК, предположительно сближающая GAC и SRL, нарушает аллостерическое взаимодействие между Р/Е участком связывания тРНК и участком связывания факторов элонгации, благоприятно для связывания и функциональной активности EF-Tu и ингибирует связывание и функциональную активность EF-G

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах

1 Bogdanov А, Dontsova О , Rinke-Appel J, Dokudovskaya S , Lavrik I, Alekseeva К, Spanchenko О , Sergiev P , Baranov P , Shirokova E , Nierhaus К, and Bnmacombe R Thio-substituted derivatives of RNA application m protem biosynthesis studies //Nucí Acids Symp Sei - 1994-v 31 -p 273-274

2 Sergiev P V , Lavrik IN , Wlasoff V A, Dokudovskaya S S , Dontsova О А, Bogdanov А А and Bnmacombe R The path of mRNA through the bacterial nbosome A site-directed cross-lmking study using new photoreactive derivatives of guanosme and uridine //RNA - 1997-v 3 -p 464-475

3 Sergiev P V , Dokudovskaya S S , Topin A, Petrov A, Shpanchenko О V , Dontsova О A , Bnmacombe R and Bogdanov A A The environment of 5S rRNA m the Eschenchia coli nbosome a cross-linking study // Nucl Acids Symp Ser - 1997-v 36 -p 181-183

4 Baranov P V , Sergiev P V , Dontsova О A, Bogdanov A A and Bnmacombe R The Database ofRibosomal Cross links (DRC) //Nucl Acids Res - 1998-v 26 -p 187-189

5 Sergiev P, Dokudovskaya S , Romanova E , Topm A, Bogdanov A , Bnmacombe R and

Dontsova О The environment of 5S rRNA in the ribosome cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA //Nucl Acids Res - 1998-v 26 -p 2519-2525

6 Сергиев П В , Лаврик И Н, Докудовская С С, Донцова О А и Богданов А А Структура декодирующего центра рибосомы //Биохимия- 1998- т 63- выл 8 - с 1129-1143

7 Леонов А А, Сергиев П В , Донцова О А и Богданов А А Направленное введение фотоаффинных реагентов во внутренние участки РНК // Молекулярная биология - 1999 -тЗЗ-с 1063-1073

8 Bogdanov А А, Sergiev Р V, Lavrik IN, Spanchenko О V, Leonov А А, and Dontsova О А Modern Site-Directed Cross-Linking Approaches Implications for Ribosome Structure and Functions //In The Ribosome, Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions/ Eds Garrett R A, Douthwaite S R, Liljas A, Matheson A T , Moore P В , and Noller H F - 2000 -ASM Press Washington D С - pp 245-255

9 Sergiev P V, Bogdanov A A, Dahlberg A E , Dontsova О Mutations at position A960 of E coll 23 S nbosomal RNA influence the structure of 5 S nbosomal RNA and the peptidyltransferase region of 23S nbosomal RNA // T Mol Biol - 2000-v 299 -p 379-389

10 Matadeen R, Sergiev P, Leonov A, Pape T, van der Sluis E, Mueller F, Osswald M, von Knoblauch K, Bnmacombe R, Bogdanov A, van Heel M, Dontsova О Direct Localization by Cryo-electron Microscopy of Secondary Structural Elements in Escherichia coll 23 S rRNA which Differ from the Corresponding Regions in Haloarcula marismortui // J Mol Biol - 2001 -v 307 -p 1341-1349

11 Сергиев П В , Донцова О А , Богданов А А Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами Судный день // Молекулярная биология - 2001 -т 35 - с 559-583

12 Kubarenko А V , Sergiev Р V , Bogdanov А А, Bnmacombe R and Dontsova О А А protonated base ран participating m rRNA tertiary structural interactions // Nucleic Acids Res -2001-v 29 -p 5067-5070

13 Smith M W , Meskauskas A, Wang P , Sergiev P , and Dinman J D Saturation mutagenesis of 5S rRNA in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol -2001-v 21 -p 8264-8275

14 Avdeeva О N, Myasmkov A G, Sergiev P V, Bogdanov A A, Bnmacombe R and Dontsova О A The construction of the "minimal" SRP interacting with the translating ribosome but not with specific membrane receptor m E colt //FEBSLett -2002-v 514 -p 70-73

15 Rmke-Appel J, Osswald M, von Knoblauch К, Mueller F , Bnmacombe R, Sergiev P , Avdeeva О , Bogdanov A, and Dontsova О Crosslmkmg of 4 5S RNA to the Escherichia coh ribosome m the presence or absence of the protein Ffh //RNA-2002-v 8 -p 612-625

16 Sergiev P , Leonov A, Dokudovskaya S , Shpancheriko О, Dontsova О , Bogdanov A, Rmke-Appel J , Mueller F , Osswald M , von Knoblauch К , and Bnmacombe R Correlating the X-ray structures for halo- and thermophylic nbosomal subumts with biochemical data for the Escherichia coh nbosome // Cold Spnng Harbor Symposia on Quantitative Biology, v LXVI - The Ribosome, CSH Laboratory Press - 2001 - p 87-100

17 Leonov A A, Sergiev P V , Bogdanov A A, Bnmacombe R, Dontsova О A Affinity punfication of libosomes with a lethal G2655C mutation m 23 S rRNA that affects the translocation // J Biol Chem - 2003 - v 278 - p 25664-25670

18 Кубаренко А В , Лаврик И H, Сергиев П В , Хойпль М, Роднина М, Винтермаер В , Богданов А А , Донцова О А Метод фотоаффинного химического сшивания как способ выявления контактов фактора элонгации G с малой субчастицей рибосомы // Доклады Академии Наук - 2003 - т 393 - вып 1 - с 124-127

19 Лаврик И Н, Сергиев П В , Богданов А А, Zunmermann R А, и Донцова О А Рибосома Escherichia coh как модель для апробации новых фотоаффинных аналогов тРНК, содержащих остатки 6-тиогуанозина // Молекулярная биология- 2004-т 38 -вып 5 -с 937-944

20 Кубаренко А В , Сергиев П В , Роднина М В ОТРазы аппарата трансляции // Молекулярная биология - 2005 - т 39 - вып 5 -с 746-751

21 Kiparisov S, Petrov A, Meskauskas A, Sergiev Р V, Dontsova О А , Dinman J D Structural and functional analysis of 5S rRNA m Saccharomyces cerevisiae // Mol Genet Genomics - 2005 -v 274 - pp 235-247

22 Sergiev P V , Lesnyak D V, Burakovsky D E, Kiparisov S V , Leonov A A, Bogdanov A A, Bnmacombe R, Dontsova О A Alteration m location of a conserved GTPase-associated center of the nbosome induced by mutagenesis influences the structure of peptidyltransferase center and activity of elongation factor G //J Biol Chem -2005-v 280 -pp 31882-31889

23 Sergiev P V , Kiparisov S V , Burakovsky D E , Lesnyak D V , Leonov A A, Bogdanov A A, Dontsova О A The conserved A-site finger of the 23 S rRNA just one of the mtersubumt bridges or a part of the allostenc communication pathway'' // J Mol Biol - 2005 - v 353 - pp 116-123

24 Sergiev P V , Bogdanov A A , Dontsova О A How can elongation factors EF-G and EF-Tu discriminate the functional state of the nbosome using the same binding site? // FEBS Lett - 2005 - v 579 - pp 5439-5442

25 Sergiev P V , Lesnyak D V , Kiparisov S V , Burakovsky D E, Leonov A A, Bogdanov A A, Bnmacombe R, Dontsova О A

Function of the nbosomal E-site a mutagenesis study // Nucleic Acids Res - 2005 - v 33 -pp 6048-6056

26 Kovalskaya О N, Sergiev P V , Bogdanov A A , Dontsova OA// Does a deficiency of the signal recognition particle (SRP)-pathway affect the biosynthesis of its components m Saccharomyces cerevisiae and Eschenchia coli9 Biochemistry (Mosc) - 2006 - v 71 - pp 723-729

27 Кипарисов С В , Сергиев П В , Богданов А А, Донцова OA// Конформационные изменения рибосомы в процессе элогнационного цикла Молекулярная биология - 2006 -г40-вып 4 -с 1-14

28 Kubarenko А, Sergiev Р, Wmtermeyer W, Dontsova О , Rodnina М V // Involvement of helix 34 of 16S rRNA m decoding and translocation on the nbosome J Biol Chem -2006-v 281 - pp 35235-35244

29 Lesnyak D V, Sergiev P V , Bogdanov A A, Dontsova OA// Identification of Escherichia coli m(2)G methyltransferases I The ycbY gene encodes a methyltransferase specific for G2445 of the 23 S rRNA J Mol Biol -2006-v 364-pp 20-25

30 Sergiev P V , Lesnyak D V , Bogdanov A A , Dontsova OA// Identification of Escherichia coli m(2)G methyltransferases II The ygjO gene encodes a methyltransferase specific for G183 5 of the 23 S rRNA J Mol Biol -2006-v 364-pp 26-31

31 Sergiev P V, Bogdanov A A, Dontsova OA// Ribosomal RNA guanme-(N2)-methyltransferases and their targets Nucleic Acids Res -2007-v 35-pp 2295-2301

32 Lesnyak D V , Osipiuk J, Skarma T, Sergiev P V , Bogdanov A A , Edwards A , Savchenko A , Joachimiak A, Dontsova OA// Methyltransferase that modifies guanine 966 of the 16 S rRNA functional identification and tertiary structure J Biol Chem - 2007 - v 282 - pp 58805887

33 Ковальская, О H , Сергиев, П В , Богданов, А А , Донцова, OA// Структурно-функциональная анатомия сигнал-узнающей частицы от бактерий до млекопитающих Успехи Биол Химии -2007-т 47-с 129-188

34 Бураковский Д Е , Смирнова А С , Лесняк Д В , Кипарисов С В , Леонов А А, Сергиев П В , Богданов А А, Донцова OA// Взаимодействие спиралей 89 и 91 23S рибосомной РИК Escherichia coli способствует функционированию IF2, но не важно для работы факторов элонгации - 2007 - Молекулярная биология - т 41-вып 6-с 1031-1041

35 Sergiev, Р V, Serebryakova, М V , Bogdanov, А А, Dontsova, OA// The ybiN gene of E coli encodes ademne-N6 methyltransferase specific for modification of A1618 of 23S ribosomal RNA, a methylated residue located close to the nbosomal exit tunnel J Mol Biol, принято к печати

Избранные тезисы конференций

36 A A Bogdanov, PV Sergiev, A A Leonov, R Bnmacombe, A Dahlberg, and OA Dontsova Interaction between functional centers of the nbosome LXVI Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology The Ribosome Cold Spnng Harbor, 2001 Abstracts of papers presented p 11

37 PV Sergiev, R Matadeen, A A Leonov, T Pape, E van der Sluis, F Mueller, M Osswald, К von Knoblauch, R Bnmacombe, A Bogdanov, M van Heel, О Donstova Cryo-electron microscopy localization of artificially extended helical elements of the 23 S rRNA RNA2001 6th Annual Meeting of the RNA Society 2001 Abstract book p 482

38 P V Sergiev, ON Avdeeva, A A Bogdanov, R Bnmacombe Study of the interaction of Escherichia coli signal recognition particle with the ribosome Meeting of International Research Scholars Vancouver Canada 2001 Program and Abstract p 37

39 OA Dontsova, P V Sergiev, О N Avdeeva, О V Shpanchenko, M I Zvereva, P V Ivanov, NI Topilina, G Aglyamova, A A Bogdanov, M Kalkum, Y Teraoka, К H Nierhaus and R Bnmacombe Interaction of RNP with the E coll nbosome International conference in honour of Alexander Spinn Protein synthesis Pushchmo Russia 2001 Abstract book p 12

40 P Sergiev, R Matadeen, A Leonov, T Pape, E van der Sluis, F Mueller, M Osswald, К von Knoblauch, R Bnmacombe, A Bogdanov, M van Heel, О Donstova Localization of helical elements of Ecoli 23 S rRNA that differ from the H marismortui 23 S rRNA International conference m honour of Alexander Spinn Protem synthesis Pushchino Russia 2001 Abstract book p 85

41 О A Dontsova, PV Sergiev, A A Leonov, R Bnmacombe, A Dahlberg, A A Bogdanov Interaction between functional centers of the nbosome The Dynamics of Ribosome Structure and Function Queenstown, New Zealand 27lh January-lsl February 2002 Abstracts Programme p43

42 P V Sergiev, О N Avdeeva, R Bnmacombe, A A Bogdanov, О A Dontsova Interaction of SRP with the Ecoli nbosome Interaction between functional centers of the nbosome The Dynamics of Ribosome Structure and Function Queenstown, New Zealand 27th January-lsl February 2002 Abstracts Programme p45

43 P V Sergiev, A A Leonov, A A Bogdanov, R Bnmacombe, О A Dontsova Isolation of nbosomes with a lethal G2655C mutation m 23S rRNA that affects the translocation 8th Annual Meeting of the RNA Society "RNA 2003" July 1-July 6, 2003 Vienna, Austria p 707

44 P Sergiev, D Lesnyak, D Burakovsky, S Kipansov, A Leonov, A Bogdanov, and О Dontsova Communication Between the Ribosomal P- and E-sites and Elongation Factor Binding Sites - Eleventh Annual Meeting of the RNA Society "RNA 2006", Seattle, Washington, June 2025,2006, p 274

45 P V Sergiev, D V Lesnyak, D E Burakovsky, S V Kipansov, A A Leonov, A A Bogdanov, and О A Dontsova Communication between the functional centers of the ribosome - The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA - Protem Interactions", Buran Conference Center, Moscow, August 19-24,2006, p 23

46 P Seigiev, D Lesnyak, D Burakovbky, A Smirnova, A Bogdanov, О Dontsova Conformation signals that determine the activity of translational factors site-directed mutagenesis and biochemical studies "Ribosome form & function", North Falmouth, USA, 3-8 June, 2007, Abstract book, p 22

47 P Sergiev, D Lesnyak, A Bogdanov, О Dontsova Eschenchia coli m2G methyltransferases Identification of the new enzymes and mystery of their functional role "Ribosome form & function", North Falmouth, USA, 3-8 June, 2007, Abstract book, p 171

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stpnnt ru e-mail zakaz@stprmt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 14 01 2008 г

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Основные морфологические элементы рибосомы.

2.2. Инициация трансляции.

2.3. Связывание аа-тРНК с А участком.

2.4. Пептидилтрансферазная реакция.

I ' г

2.5. Транслокация.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Мутагенез рРНК и способы выделения рибосом, содержащих мутации.,

3.1.1. Используемые плазмиды.

3.1.2. Используемые штаммы.

3.1.3. Выделение рибосом, несущих летальные мутации.

3.2. Определение генов, кодирующих рРНК метилтрансферазы и получение рибосом, не содержащих метилированных оснований.

3.3. Методы изучения фенотипа мутаций и отсутствия модификаций рРНК.

3.3.1. Измерение характеристик роста клеток.

3.3.2. Измерение точности трансляции in vivo.

3.3.3. Химическая модификация.

3.3.4. Выделение компонентов для тестов in vitro.

3.3.5. Toy-принт.

3.3.6. Изучение связывания тРНК с рибосомой.

3.3.7. Измерение активности белковых факторов трансляции.

3.4. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G966 16S рРНК.

3.5. Мутации нуклеотидов спиралей 31,34,35 и 38 16S рРНК.'.

3.6. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G1835 23S рРНК.

3.7. Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF.

3.8. Мутации нуклеотидов, образующих "ворота", через которые проходит перемещение аа-тРНК в А участок.

3.9 Разработка метода прямого определения протонированных оснований в рРНК.

ЗЛО. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G2445 23S рРНК.

3.11. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей А1618 23S рРНК.

3.12. Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации C2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками.

3.13. Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации.

3.14. Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPa3.

3.15. Изучение роли взаимодействия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры РТС и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала.

3.16. Изучение движения GAC, как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Ти.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Реактивы и биопрепараты.

4.2. Буферы и растворы.

4.3. Штаммы и плазмиды.

4.4 Манипуляции с ДНК: клонирование, мутагенез.

4.4.1 Выделение плазмидной ДНК.

4.4.2. Определение концентрации ДНК в растворе.

4.4.3 ПЦР.

4.4.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозпом геле.

4.4.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

4.4.6. Приготовление векторов и вставок.

4.4.7. Лигирование.

4.4.8. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

4.4.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

4.4.10. Мутагенез М13 по методу Кункеля.

4.4.11. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagenc).

4.4.12. Создание плазмид для экспрессии генов 16S и 23S рРНК с мутациями.

4.4.13. Создание плазмиды, кодирующей модельную мРНК.

4.4.14. Создание плазмиды pYbinPPAA.

4.5. Манипуляции с клетками.

4.5.1. Создание штаммов для экспрессии генов рРНК с мутациями.238 4.5.2 Измерение времени удвоения клеток.

4.5.3. Измерение скорости вытеснения клеток мутантных штаммов клетками дикого типа при совместном культивировании.

4.5.4. Измерение точности трансляции in vivo.

4.5.5. Создание штаммов для экспрессии генов рекомбинантных белков.

4.6 Выделение рибосом, рибосомных субчастиц, рРНК и частично депротеинизированных частиц.

4.6.1. Выделение рибосом из штамма AVS69009.

4.6.2. Выделение рибосом с помощью аффинной хроматографии.

4.6.3. Выделение больших количеств рибосом.

4.6.4. Выделение рРНК.

4.6.5. Выделение суммарной клеточной РНК.

4.6.6. Выделение частиц, частично депротеинизированных LiCl.

4.6.7. Выделение частиц, частично депротеинизированных NH4Cl/EtOH.

4.7. Выделение рекомбинантных белков.

4.7.1. Выделение рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на N1NTA агарозе.

4.7.2. Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ.

4.8 Выделение других компонентов для реакций in vitro.

4.8.1. Получение S100 экстракта без тРНК.

4.8.2. Получение аминоацил-тРНК.

4.8.2.1. Получение [3H]£Met-TPHKfMet Е. coli.

4.8.2.2. Получение [14С]РЬе-тРНКРНе Е. coli.

4.8.2.3. Получение Lys-TPHKLys Е. coli.

4.8.2.4. Получение радиоактивно меченной тРНКРЬе Е. coli.

4.8.2.5. Получение радиоактивно меченной TPHKfMet Е. coli.

4.8.3. Получение мРНК, кодирующей MFK пептид.

4.8.4. Электрофорез РНК в денатурирующем ПААГ.

4.9. Манипуляции с рРНК в составе рибосом и в депротеинизированном виде.

4.9.1. Ферментативное метилирование рибосом, рРНК и частично депротеинизированных частиц.

4.9.2. Обработка рибосом и рРНК борогидридом натрия для модификации протонированных оснований.

4.9.3. Обработка рибосом и рРНК модифицирующими реагентами.

4.9.3.1. Модификация диметилсульфатом.

4.9.3.2. Модификация кетоксалем.

4.9.3.3. Модификация карбодиимидом.

4.9.4. Вырезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Н.

4.9.5. Разрезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Т1.

4.9.6. Анализ олигонуклеотидных фрагментов рРНК с помощью масс-спектрометрии.

4.9.7. Анализ модификации рРНК с помощью обратной .транскрипции.

4.9.8. Анализ с помощью обратной транскрипции соотношения рРНК дикого типа и рРНК, несущей мутации в образце.

4.10 Функциональные тесты рибосом.

4.10.1. Оценка способности рибосомных субчастиц к ассоциации.

4.10.2. Оценка эффективности poIyU-зависимого синтеза polyPhe и частоты ошибочного встраивания Leu.

4.10.3. Тестирование при помощи тоу-припта способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro.

4.10.4. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации G.

4.10.5. Стимуляция СТРазной активности фактора инициации 2.

4.10.6. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации Ти.

4.10.7. Анализ функциональных комплексов рибосомы с помощью химической модификации (футпринтинг).

4.10.8. Определение степени связывания тРНК с рибосомами с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры.

4.10.9. Измерение степени и скорости образования дипептида.

4.10.10. Пуромициновая реакция.

5. ВЫВОДЫ.

Жизнь основана на взаимодействии и взаимопревращении биомолекул и собранных из них надмолекулярных устройств. Биомолекулы физически и химически ничем не отличаются от всех остальных органических и неорганических соединений и совершенно также подчиняются классическим законам химии [1]. Однако биомолекулы обладают несвойственной другим молекулам особенностью, которая делает их столь интересными в глазах исследователей. Эта особенность, присущая также устройствам, созданным человеком, - функциональность. Биологические молекулы обладают функцией, или многими функциями, и эта функциональность заложена в биомолекулах изначально, т.е. они возникли (были отобраны в ходе эволюции) для выполнения той или иной цели. Мы не можем ответить на вопрос: "зачем в природе водород?", но можем ответить на вопрос: "зачем в природе рибосома?". С тем, чтобы по возможности, не слишком углубляться в вопросы философии, мы не будем стремиться пройти по цепочке последовательных вопросов "зачем синтезировать белки?", "зачем нужен метаболизм?", "зачем нужна жизнь?", оставив это занятие Фоме Аквинскому [2]. В данной работе нас больше будет интересовать, насколько можно приписать функциональность более мелким компонентам, частям биомолекул. В этом ключе уместно будет сравнить биомолекулы с устройствами, созданными человеком. Несмотря на то, что принципы работы молекулярных устройств живой природы и, скажем, автомобиля, совершенно различны, нас будут интересовать "детали" молекулярного устройства, функцию которых мы будем стараться понять, как, например, мы можем понять функцию руля или фар у автомобиля.

Данная работа посвящена изучению рибосомы. Рибосома - это крупное надмолекулярное устройство, функция которого заключается в синтезе белков [3], согласно информации, закодированной в матричной РНК (мРНК) [4]. При этом синтез белка осуществляется из аминокислотных остатков, присоединенных к индивидуальным транспортным РНК (тРНК). Каждая тРНК отвечает за перенос одной единственной аминокислоты и может существовать в трех видах: деацилированном (без аминокислоты), аминоацилированном (с аминокислотой, присоединенной к ее 3'-концу) и пептидильном (с присоединенным к 3'-концу пептидом). Собственно, синтез белка, т.е. полимеризация аминокислот, состоит из повторяющихся реакций присоединения растущего пептида к аминокислоте. При этом до начала реакции и пептид, и аминокислота присоединены к разным молекулам тРНК.

Изучение рибосомы ведется уже несколько десятилетий, за которые был накоплен колоссальный массив данных о структуре рибосомы и протекании всех этапов ее функционального цикла. В наше время основной интерес представляет взаимосвязь структуры и функции отдельных элементов рибосомы. Эта взаимосвязь изучается с помощью двух дополняющих друг друга подходов. Во-первых, это изучение параметров протекания тех или иных стадий цикла работы рибосомы и выявление сопутствующих им структурных изменений тех или иных компонентов рибосомы и ее лигандов. Во-вторых, это намеренное изменение каких-либо элементов рибосомы или ее лигандов и выявление тех стадий функционального цикла, которые были нарушены в результате такого воздействия. Естественно, что оба эти подхода применяются совместно и необходимо дополняют друг друга. Воспользовавшись аналогией, можно представить себе, что для изучения функционирования автомобиля можно подвергать его различным тестам, как на станции технического осмотра, а можно ломать последовательно те или иные детали автомобиля и смотреть с помощью тестов, какие функции окажутся нарушенный. В случае рибосомы, "ломать" что-либо можно несколькими основными способами. Во-первых, использовать аналоги субстратов, неспособные участвовать в тех или иных химических реакциях. Например, вместо GTP использовать его негидролизуемый аналог -GDPNP. Во-вторых, использовать природные ингибиторы работы рибосомы -антибиотики. Эти, как правило, небольшие молекулы связываются с достаточно небольшим участком рибосомы или ее лигандов и могут влиять на множество стадий работы рибосомы. И, в-третьих, можно вводить мутации в компоненты рибосомы и изучать функциональные последствия таких структурных изменений.

Особое внимание мы уделим движущимся "деталям" рибосомы. Говоря о движении компонентов и лигандов рибосомы, необходимо оговориться, что рибосома, как и всякое другое молекулярное образование, подчиняется статистическим законам физической химии и не может быть полным аналогом какой-либо механической машины, созданной человеком [5, 6]. Функционирование рибосомы построено на принципах работы всех ферментов и движения компонентов и лигандов рибосомы должны относиться к следующим нескольким типам. Во-первых, взаимодействие рибосомы и ее лиганда может быть построено на принципе "жесткого соответствия" [7], когда и рибосома и ее лиганд при взаимодействии друг с другом не изменяют своей пространственной структуры. Тогда только сам факт связывания лиганда будет иметь функциональное значение. Во-вторых, связывание лиганда может осуществляться по принципу "индуцированного соответствия" [8]. При этом конформационное изменение рибосомы при связывании с лигандом будет происходить из-за того, что тот или иной компонент рибосомы или лиганд обладает достаточной подвижностью, и одна из его конформаций стерически благоприятна для связывания. В этом случае мы будем наблюдать, что при связывании с лигандом рибосома меняет конформацию, но никакой функциональной ролью это изменение конформации не обладает — важно лишь связывание лиганда. В-третьих, изменение конформации рибосомы или ее лиганда при связывании может иметь функциональное значение. При этом мы можем говорить об "аллостерическом эффекте" [9], когда взаимодействие рибосомы с лигандом может влиять на конформацию других лигандов или компонентов рибосомы, не находящихся в прямом контакте с участниками взаимодействия. Иными словами, функциональные центры рибосомы получают возможность "передавать сигналы" друг другу. Разумеется, такая передача сигналов возможна только с помощью индуцированного изменения структуры элементов рибосомы/лигандов, находящихся между сообщающимися центрами. И, в-четвертых, изменение пространственного расположения молекулярных структур рибосомы или ее лигандов может быть обусловлено их подвижностью и не иметь никакого функционального значения.

В обзоре литературы будут последовательно рассмотрены инициация синтеза белка, связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с А участком рибосомы, пептидилтрансферазная реакция и транслокация. Будут сформулированы основные вопросы, относящиеся к механизму протекания отдельных стадий, и дан обзор тех ответов, которые уже были найдены.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Гены yhhF, ybiN, ygjO и ycbY кодируют ферменты, метилирующие нуклеотиды G966 16S рРНК, А1618, G1835 и G2445 23S рРНК Escherichia coli. Субстратом для YhhF служит 30S субчастица, для YbiN - рибонуклеопротеид, промежуточный в процессе сборки 50S субчастиц, и депротеинизированная 23S рРНК для YgjO и YcbY. Делеции генов yhhF, ybiN, ygjO и ycbY приводят к замедлению роста клеток, но не летальны.

2. Третичные взаимодействия нуклеотидов А1201 и А1191 спирали 34 16S рРНК, способствуют ассоциации субчастиц и обеспечения точности трансляции.

3. Сужение, образованное нуклеотидами U2492, С2556 и С2573 23S рРНК на пути перемещения аминоацил-тРНК в А участок, не влияет на скорость этого перемещения.

4. Перемещение деацилированной тРНК из Р в Р/Е участок способствует взаимодействию EF-G*GTP с рибосомой, повышает эффективность и точность транслокации.

5. Межсубчастичный мостик В 1а не важен для транслокации, но способствует формированию структуры 50S субчастицы.

6. Мутации нуклеотида А960 23S рРНК стабилизируют конформацию рибосомы, в которой нуклеотиды, образующие Р участок 50S субчастицы, защищены от действия модифицирующих реагентов.

7. Взаимодействие петель спиралей 89 и 91 23 S рРНК не важно для элонгации трансляции, но способствует функционированию фактора инициации 2.

8. Прочное взаимодействие EF-G с SRL не важно для ОТРазной активности EF-G, но необходимо для транслокации.

9. Вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23 S рРНК, предположительно сближающая GAC и SRL, нарушает аллостерическое взаимодействие между Р/Е участком связывания тРНК и участком связывания факторов элонгации, благоприятно для связывания и функциональной активности EF-Tu и ингибирует связывание и функциональную активность EF-G.

1. Wohler, F., (1828) Uber kunstliche Bildung des Harn-stoffes. Annalen der Physik und Chemie, 88.

2. Aquinas, Т., (1265-1274) Summa theologiae.

3. Littlefield, J.W., E.B. Keller, J. Gross and P.C. Zamecnik, (1955) Studies on cytoplasmic ribonucleoprotein particles from the liver of the rat J Biol Chem, 217(1): p. 111-23.

4. Gros, F., H. Hiatt, W. Gilbert, C.G. Kurland, R.W. Risebrough and J.D. Watson, (1961) Unstable ribonucleic acid revealed by pulse labelling of Escherichia coli. Nature, 190: p. 581-5.

5. Spirin, A.S., (2002) Ribosome as a molecular machine. FEBSLett, 514(1): p. 2-10.

6. Spirin, A.S., (2004) The ribosome as an RNA-based molecular machine. RNA Biol, 1(1): p. 3-9.

7. Fischer, E., (1894) Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. Chem.Ber., 27: p. 2985-2993.

8. Koshland, D.E., (1958) Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 44(2): p. 98-104.

9. Monod, J., J.P. Changeux and F. Jacob, (1963) Allosteric proteins and cellular control systems. JMolBiol, 6: p. 306-29.

10. Lubin, M., (1968) Observations on the shape of the 50S ribosomal subunit Proc Natl Acad Sci USA, 61(4): p. 1454-61.

11. Lake, J. A., (1976) Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes. JMol Biol, 105(1): p. 1319.

12. Vasiliev, V.D., (1974) Morphology of the ribosomal 30S subparticle according to electron microscopic data Acta Biol Med Ger, 33(5-6): p. 779-93.

13. Spirin, A.S., (1964) Macromolecular Structure and Ribonucleic Acids. New York: Reinhold.

14. Vasiliev, V.D., O.M. Selivanova and V.E. Koteliansky, (1978) Specific selfpacking of the ribosomal 16 S RNA FEBS Lett, 95(2): p. 273-6.

15. Wimberly, B.T., D.E. Brodersen, W.M. Clemons, Jr., R.J. Morgan-Warren, A.P. Carter, C. Vonrhein, T. Hartsch and V. Ramakrishnan, (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit Nature, 407(6802): p. 327-39.

16. Cate, J.H., M.M. Yusupov, G.Z. Yusupova, T.N. Earnest and H.F. Noller, (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science, 285(5436): p. 2095104.

17. Ban, N., P. Nissen, J. Hansen, P.B. Moore and T.A. Steitz, (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution Science, 289(5481): p. 90520.

18. Klein, D.J., P.B. Moore and T.A. Steitz, (2004) The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit JMol Biol, 340(1): p. 141-77.

19. Vasiliev, V.D. and O.M. Zalite, (1980) Specific compact selfpacking of the ribosomal 23 S RNA FEBS Lett, 121(1): p. 101-4.22,23,24.25,2627,28,29,30,31,32,3334,35,3637,38,39,4041,

20. Bernabeu, С. and J. A. Lake, (1982) Nascent polypeptide chains emerge from the exit domain of the large ribosomal subunit: immune mapping of the nascent chain Proc Natl AcadSci USA, 79(10): p. 3111-5.

21. Choi, K.M. and R. Brimacombe, (1998) The path of the growing peptide chain through the 23S rRNA in the 50S ribosomal subunit; a comparative cross-linking study with three different peptide families. Nucleic Acids Res, 26(4): p. 887-95.

22. Doty, P., H. Boedtker, J.R. Fresco, R. Haselkorn and M. Litt, (1959) Secondary Structurein Ribonucleic Acids. Proc Natl AcadSci USA, 45(4): p. 482-99.

23. Shatsky, I.N., A.V. Bakin, A.A. Bogdanov and V.D. Vasiliev, (1991) How does themRNA pass through the ribosome? Biochimie, 73(7-8): p. 937-45.

24. Balakin, A.G., E.A. Skripkin, I.N. Shatsky and A.A. Bogdanov, (1992) Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage lambda repressor. Nucleic Acids Res, 20(3): p. 563-71.

25. Boni, I.V., D.M. Isaeva, M.L. Musychenko andN.V. Tzareva, (1991) Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SL Nucleic Acids Res, 19(1): p. 155-62.

26. Юсупова, Г., Дженнер, Л., и М. Юсупов (2007) Перемещение матричной РНК на рибосоме. Молекулярная биология, 41(2): с. 274-83.

27. Huttenhofer, A. and H.F. Noller, (1994) Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. Embo J, 13(16): p. 3892-901.

28. O'Donnell, S.M. and G.R. Janssen, (2001) The initiation codon affects ribosome binding and translational efficiency in Escherichia coli of cl mRNA with or without the 5' untranslated leader. JBacteriol, 183(4): p. 1277-83.

29. Crick, F.H., (1966) Codon—anticodon pairing: the wobble hypothesis. JMol Biol, 19(2): p. 548-55.

30. Dallas, A. and H.F. Noller, (2001) Interaction of translation initiation factor 3 with the 30S ribosomal subunit Mol Cell, 8(4): p. 855-64.