Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РАССОХИН ТИМОФЕЙ ИГОРЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОДИНАМИКИ БИНАРНЫХ КОМПЛЕКСОВ РНК И РИБОСОМНОГО БЕЛКА %7 ЭУБАКТЕРИЙ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ

шлллдитй! »мм уэ ллцл|;аи[1А \/иаилй лтвпаим I ац|Г1п по тЛупвппС у имм! 1п

кандидата химических наук

Москва 2003 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители

доктор химических наук, профессор Алексей Михайлович Копылов кандидат химических наук, старший научный сотрудник Вера Алексеевна Спиридонова

Официальные оппоненты

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Владимир Иванович Польшаков кандидат химических наук, старший научный сотрудник Михаил Флорианович Турчинский

Ведущая организация

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится в 15 часов 23 декабря 2003 г. на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 ноября 2003 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат химических наук

обгЦая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Достигнутые в последнее время успехи в расшифровке структуры бактериальных рибосом, их субчастиц и функциональных комплексов с мРНК и тРНК методом рентгеноструктурного анализа (РСА) позволили перейти к детальному изучению механизмов функционирования этого сложнейшего РНП-комплекса, как на стадии сборки рибосом, так и в процессе трансляции. Обладая знаниями о тонкой структуре сложного супрамолекулярного комплекса и его компонентов, можно на новом уровне изучать его сборку, а также регуляцию этого процесса.

Сборка рибосомы - очень затратный для клетки процесс, как с точки зрения энергии, так и материалов". Биогенез бактериальных рибосом связан с синтезом и поэтапным взаимодействием рибосомных белков (р-белков) с рРНК. Его регуляция происходит на уровне координации синтеза р-белков и рРНК с помощью альтернативных высоко специфичных взаимодействий р-белков либо с рРНК, либо с собственной мРНК. Детальное изучение термодинамических факторов, направляющих этот процесс, в настоящий момент явно недооценивается, однако является существенным для понимания этого важного для клетки механизма. Феномен регуляции основан на способности р-белков, выполняющих регуляторную функцию, узнавать как рРНК, так и мРНК.

Настоящая работа посвящена изучению термодинамического аспекта РНК-белковых взаимодействий для одного из таких белков - р-белка S7 прокариот, связывающегося с 16S рРНК и инициирующего сборку основного З'-концевого домена и, следовательно, всей малой субчастицы бактериальной рибосомы.

Ген белка S7 входит в состав стрептомицинового (sti) оперона. str оперон Е. coli состоит из 4 генов: rpsL (р-белок S12), rpsG (р-белок S7, EcoS7), fus (фактор элонгации трансляции EF-G) и tufA (фактор элонгации трансляции EF-Tu). Контроль уровня экспрессии этих генов осуществляется на уровне трансляции. Выполняя регуляторную функцию, белок EcoS7 связывается с межцистронным участком S12-S7 и ингибирует трансляцию str мРНК. Как по первичной, так и по предполагаемой вторичной структуре участки 16S рРНК и str мРНК, связывающиеся с EcoS7, отличаются. Именно способность белка EcoS7 образовывать высоко аффинные и специфичные комплексы с различными по структуре РНК делает возможным регуляцию биосинтеза белков str оперона. Решение этой задачи необходимо искать в-изучвмии-нв-только структурных,

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* но и термодинамических характеристик комплексов f-----

белка$7БЛИ0ТЕКА

С Петербург . j j 09 Wtff «кт^//- >

Кроме того, установлена связь между функцией генов str оперона и возникновением у бактерий устойчивости к антибиотикам: мутации в гене rpsL вызывают устойчивость к стрептомицину, в гене tufA - к антибиотику кирромицину, а сам белок S7 принимает участие в связывании тетрациклина с бактериальной рибосомой. Так как стрептомицин и тетрациклин широко используются в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности, то исследование механизмов регуляции экспрессии этих генов является очень важной задачей и в прикладном аспекте. Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению структурно-термодинамического аспекта РНК-белковых взаимодействий р-белка S7 эубактерий. В ходе выполнения данной работы были поставлены и выполнены следующие задачи:

1. Клонирование и получение супер-продуцента Е. coli для белка EcoS7. Разработка метода выделения белка с высокой РНК-связывающей активностью.

2. Исследование термодинамических характеристик гомологичных бинарных комплексов EcoS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК, а также их гетерологичных аналогов для белка S7 из Т. thermophilus (TthS7).

3. Делеционный анализ межцистронного фрагмента EcoStr мРНК - поиск минимального фрагмента РНК, необходимого для связывания с EcoS7. Сравнение полученных комплексов для EcoS7 и TthS7.

4. Исследование структурных аспектов узнавания белками EcoS7 и TthS7 межцистронного фрагмента EcoStr мРНК методами комбинаторной химии РНК (SELEX).

5. Изучение структуры и температурных конформационных превращений белка S7 in vitro и in silico.

Научная новизна и практическая значимость. Разработана эффективная методика выделения белка из суперпродуцента Е. coli обладающего высокой РНК-связывающей активностью EcoS7. Определены термодинамические параметры взаимодействия белков EcoS7 и TthS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК. Делеционным анализом определен минимальный фрагмент EcoStr мРНК, способный взаимодействовать с белком EcoS7. Проведена корреляция с гетероличной системой для белка TthS7. Структура предполагаемого участка узнавания EcoStr мРНК исследована с помощью метода комбинаторной химии РНК (SELEX). На основе фрагмента EcoStr мРНК впервые получены аптамеры к белку TthS7, обладающие высокой аффинностью и специфичностью. Методами дифференциальной

сканирующей калориметрии и компьютерной молекулярной динамики исследованы белки EcoS7 и TthS7. Определены термодинамические характеристики обоих белков. Получены данные, подтверждающие предложенную ранее модель пространственной структуры белка EcoS7. Полученные данные позволяют сформулировать гипотезу о возможном механизме регуляции экспрессии str оперона других бактерий, в том числе важных с медицинской точки зрения.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международных конференциях: «Динамика рибосомной структуры и функции», Квинстаун, Новая Зеландия (2002); XVI Международный симпозиум по биоэлекгрохимии и биоэнергетике, Братислава, Словакия (2001); Международная конференция в честь А. Спирина «Биосинтез белка», Пущино, Россия (2001); «Современные направления в химии нуклеиновых кислот», Москва, Россия (2000); 5 Международная конференция "Биогенез рибосом и функция ядрышка", Гранлибакен, США (2000); а также на отечественных конференциях: III съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, Россия (2002), Первая российская электронная конференция по биоинформатике «RECOB-2000», Москва, Россия (2000).

Структура в объем диссертационной работы. Диссертационная работа

изложена на_страницах машинописного текста и содержит следующие разделы:

введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы

и список цитируемой литературы. Материал "иллюстрирован_рисунками и_

таблицами. Библиографический указатель включает в себя_цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Клонирование и выделение р-белка EcoS7 из Е. coli.

При конструировании супер-продуцентов белка S7 требуется учитывать трудности клонирования и экспрессии регуляторных белков, которые могут быть очень токсичными для клетки. Сравнение первичных структур белков S7 из различных клеток выявило гетерогенность N-концевых аминокислотных последовательностей, поэтому для экспрессии была выбрана конструкция с шестью остатками His на N-конце белка. Супер-продуцент Е. coli для EcoS7 получали на основе системы вектор-хозяин Штудира. Различные природные штаммы Е. coli содержат два варианта EcoS7 -короткий и длинный, которые отличаются дополнительной последовательностью из 24 аминокислот на С-конце. Длинный вариант гена белка, содержащего оба природных терминирующих триплета, был клонирован в вектор рЕТ28Ь+, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка с 6His на N-конце, которые отделены от аутентичной последовательности EcoS7 субстратным участком для тромбина.

Лизис клеток проводили в растворе 8 M гидрохлорида гуанидина, что обеспечивало полное растворение телец включения. Для аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе белок сорбировали на колонке, затем промывали раствором 20 мМ имидазола. После элюции градиентом концентрации имидазола (50-500 мМ) белок переводили диализом в раствор 6 M мочевины в буфере Rec-4 (20 мМ Трис-НС1 (рН=7,6), 4 мМ MgCI2l 400 мМ NHXI, 0,5 мМ ß-меркаптоэтанол). Ренатурацию белка проводили по методике Ниерхауса с помощью 3-5 диализов по 1 часу против буфера Rec-4. Выход белка составлял порядка 30-40 мг на 1 литр культуры.

Эффективная ренатурация - ключевая стадия, от которой зависит функциональная активность любого белка. Использованная методика обеспечивает эффективную ренатурацию белка EcoS7, что подтверждается более высокой РНК-связывающей активностью, чем описана в литературе.

2. Изучение активности белка EcoS7 при взаимодействии с фрагментом Ecol6S рРНК.

Основной «мишенью» для белка S7 в бактериальной клетке является 16S рРНК (Рис. 1).

16S рРНК

/ \

?S12

str мРНК

S7__EF-G

í^uti F^ftlO

EF-TuA (t)

rpsL ipsG

fusA

Рис. 1. 168 рРНК и а<г мРНК - «мишени» белка Э7 в бактериальной клетке. Участки связывания белка 57 в 163 рРНК выделены белыми прямоугольниками. В мРНК Есо37 связывается с межциетронным участком 812-37.

Связывание с участком основного З'-концевого домена 16S рРНК происходит на начальном этапе сборки малой субчасгицы рибосомы. Таким образом, наиболее корректно охарактеризовать функциональную активность EcoS7 можно по взаимодействию с этим фрагментом (фрагмент Eco16S рРНК: нуклеотиды 926986/1219-1393 16S рРНК).

Для этого была разработана методика комплексообразования для белка EcoS7. Подобраны концентрации ионов магния и одновалентных катионов, которые обеспечивали высокую степень комплексообразования. [32Р]-меченую РНК денатурировали в буфере для связывания (20 мМ Трис-HCI (рН=7,6), 15 мМ MgCI2, 200 мМ NH4CI, 4 мМ р-меркаптозтанол) 2 мин. при 95 °С, резко охлаждали во льду и инкубировали 30 мин. при 37 °С. Белок в буфере для связывания инкубировали 30 мин. при 37 °С. Растворы РНК и белка смешивали и инкубировали 30 мин. при той же температуре.

Постоянное количество РНК титровали возрастающим количеством белка. Степень комплексообразования определяли по количеству радиоактивного комплекса, сорбированного на нитроцеллюлозных мембранах. По результатам строили изотерму связывания (Рис. 2). Кажущиеся константы диссоциации (кКд) комплекса рассчитывали в координатах Скэтчарда.

Как белок EcoS7, так и фрагмент Eco16S рРНК, представляют собой конформационно лабильные макромолекулы. Это выражается в том, что не все молекулы белка могут образовывать комплекс с РНК, и наоборот. Во втором случае это видно из того, что максимальное количество комплекса на плато изотермы

связывания никогда не достигает 100%: его реальное значение и есть доля активной РНК. Для фрагмента Есо16Э рРНК в комплексообразовании участвует от 40% до 60% молекул (Рис. 2).

Рис. 2. Изотермы связывания различных препаратов белка ЕсоЭ7 с фрагментом Есо16Э рРНК. Исходная концентрация Есо168 рРНК-20 нМ,

кК^ * 14,7_ ,. .. кК^ = 25,7 ± 4.4 нМ кКдя 21,4 ± 4,7 нМ «К =10,4 ±2,2 нМ

|EcoS7], НМ

кКд является наиболее удобной количественной характеристикой РНК-белкового комплекса и позволяет сравнивать стабильность данного комплекса с другими. Для полученных нами различных препаратов белка EcoS7 значения кКд находились в диапазоне от 10,4 до 25,7 нМ.

В литературе для белка EcoS7 описаны комплексы с Eco16S рРНК, имеющие кКд порядка 150 нМ. Этот факт позволяет утверджать, что разработанная методика выделения обеспечивает самую высокую на сегодняшний день активность белка EcoS7.

При обратном титровании постоянного количества белка возрастающим количеством РНК максимальное количество комплекса отражает долю активных молекул EcoS7, которая составила порядка 60 % (Рис. ЗА).

? »

I М 100 «0 144 1W 1» [EralKpPHKlnU

[Eco166pPHKL tM

Рве. 3. Изотермы связывания белка Есов7 с фрагментом Есо16в рРНК: А) титрование постоянного количества белка ([Есов71 = 40 нМ) возрастающим количеством РНК; Б) конкурентное связывание: 20 нМ [32Р]-Есо163 рРНК и 40 нМ ЕсоЭ7 титруются немеченой Есо16в рРНК.

Другим методом определения кКд, а также доли активных молекул РНК и белка, является конкурентное связывание (Рис ЗБ). Суть метода заключается в титровании постоянного количества белка и [32Р]-меченой РНК возрастающим количеством «холодной», немеченой, РНК. При этом происходит разбавление детектируемого по метке комплекса. Преобразование Скэтчарда позволяет определить долю активного белка.

Поскольку значения кКд выражаются через концентрацию белка, а доля активного белка в различных препаратах отличается (Рис. 2), то более корректными являются приведенные значения кКд.

Оценка термодинамических параметров комплексообразования EcoS7 с Ecol6S рРНК.

Наиболее полное термодинамическое описание любой супрамолекулярной, в том числе РНК-белковой, системы состоит в определении свободной энергии Гиббса, энтальпии и энтропии. Именно эти параметры позволяют сравнивать ее свойства с другими системами. При работе в регламентированных условиях для таких сложных молекул как РНК и белок можно использовать т.н. эффективные величины этих параметров.

Изменение эффективной стандартной энергии Гиббса РНК-белкового комплекса определяют по кажущимся константам ассоциации (кКд) комплекса в неком температурном интервале и строят зависимость натурального логарифма кКд от обратной температуры. Из интерполяции можно получить значение кКд при 25°С и рассчитать дб°'298. В использованном интервале температур (22 - 42 °С) экспериментальные данные хорошо аппроксимировались линейной функцией, что позволило рассчитать:

кКА' гее = (83,5 ± 25,3) х 106- М"\ = -45,2 кДж/моль , ДН°'2вз = -53,6 кДж/моль,

AS0 =-6,9 э.е.

3. Изучение взаимодействия белка TthS7 с фрагментом Ecol6S рРНК.

Близким структурным гомологом белка EcoS7 является белок S7 из Т. thermophilus (TthS7). На сегодняшний день из данных РСА известна пространственная структура малой субчастицы термофильных рибосом (Tth30S), однако основная масса биохимических данных была получена для рибосом Е. coli. Исследование

гетерологичной системы - белок TthS7 и РНК из Е. coli, делает возможным корреляцию структурных и биохимических данных. Таким образом, белок TthS7 можно рассматривать как «природный» мутант белка EcoS7. При гомологии первичной структуры белков 50%, по результатам компьютерного анализа структуры Tth30S степень идентичности зоны РНК-белковых контактов для белков S7 достигает 83%.

Белок TthS7 выделяли по методике, разработанной для EcoS7. Для комплексов белка TthS7 были подобраны концентрации ионов магния и одновалентных катионов. Связывание с Eco16S рРНК проводили в буферном растворе: 20 мМ Трис-HCI (рН=7,6), 7 мМ MgCI2l 350 мМ NH-tCI, 4 мМ ß-меркаптоэтанол. РНК денатурировали 2 мин. При 95°С и охлаждали во льду. Белок TthS7 инкубировали 10 мин. при 65°С и тоже охлаждали во льду. Затем белок и РНК раздельно инкубировали 30 мин. при 42°С, смешивали и инкубировали еще 30 мин. при 42°С. На Рис. 4А представлена изотерма связывания белка TthS7 с фрагментом Eco16S рРНК. кКд комплекса составила 18,2 ±2,3 нМ.

rmsri нм

10 20 30 40 и ео 70 [EC016S рРНК] нМ

Рис. 4. Изотермы связывания белка Т№57 с фрагментом Есо168 рРНК: А) титрование постоянного количества РНК ([РНК] = 20 нМ) возрастающим количеством белка; Б) конкурентное связывание: 20 нМ [32Р]-Есо163 рРНК и 40 нМ Т№57 титруются немеченой Есо16Б рРНК.

Рассчитанная по данным конкурентного анализа доля активного белка составила 36%. Несмотря на использование дестабилизирующих условий, в сравнении с ЕсоБ7, -меньшая концентрация ионов магния и повышенная ионная сила раствора - доля связанной РНК и кКд комплекса сопоставимы с гомологичной системой. По-видимому, это связано с более стабильной структурой Т№87.

Таким образом, белок TthS7 обладает высоким сродством к 16S рРНК Е. coli, что позволяет проводить сравненительное изучение этих двух комплексов.

4. Делеционный анализ sir мРНК Е. coli.

Второй «функциональной мишенью» для белка S7 в бактериальной клетке является sfrMPHK (Рис. 1). Связываясь с собственной мРНК, белок S7 ингибирует свою трансляцию и трансляцию других белков оперона по механизму сопряженной трансляции. М. Номура с сотр. показал, что EcoS7 взаимодействует со str мРНК в районе межцистронного участка между цистронами белков S12 и S7. По данным химической модификации str мРНК, полученными как М. Номурой с сотр., так и А. Копыловым с сотр., район узнавания EcoS7 str мРНК располагается в верхней части шпильки (Рис. 5А).

Исходя из этих данных, можно поставить задачу минимизации участка мРНК для связывания EcoS7 методом делеционного анализа. С помощью ПЦР с соответствующими праймерами и последующей транскрипции получен набор фрагментов str мРНК с координатами: мРНК143: -100 +42 (+1 соответствует А инициаторного кодона AUG цистрона EcoS7); мРНКЮЗ: -100 +2 (непосредственно сам межцистронный участок); МРНК85: -91 -7; мРНК74: -86 -13; мРНКбЗ: -82 -20 (Рис 5Б).

Изотермы связывания для комплексов EcoS7 с фрагментами EcoStr мРНК получали в тех же условиях, что и с Eco16S рРНК (Рис. 6). Делеция 19 нуклеотидов фрагмента мРНКЮЗ (мРНК85) не приводит к изменению степени связывания и кКд. Однако мРНК74 и мРНКбЗ уже не способны связываться с EcoS7, хотя эти фрагменты содержат предполагаемый район узнавания для белка. По-видимому, в формировании участка связывания EcoS7 участвуют нуклеотиды из делетированной нижней части шпильки. Предложенная нами модель вторичной структуры межцистронного фрагмента была призвана объяснить этот феномен (Рис. 5А справа).-Возможность существования интегральной вторичной структуры с коаксильным стэкингом между двутяжевыми участками III и V предполагает взаимное влияние участков II и V.

Исходя из предложенной модели вторичной структуры, было решено проверить, является ли нижняя часть шпильки только стабилизирующим фактором для ее верхней половины. Если бы это было так, то при искусственной стабилизации структуры в основании укороченного фрагмента мРНКбЗ путем введения дополнительных трех пар G-C (шпилька AG, Рис. 5Б) белок должен был бы связываться. Для дополнительной стабилизации неканоническая пара А-80 - G-22 была заменена на пару A-U (шпилька AU). Однако эти РНК по-прежнему не были способны связывать белок EcoS7.

МРНК143

цЧЛАА.

01

>

0 Си,' ОС

"/ч

СА'

и А и А » О 5 с-в с о * и-А с-а„

. ЗлАА ¡и

мРНКЮЗ

-40

гр«0

МРНК85

мРНК74

с о

и А

с с

А V

и. ли

ДА А С и А и

,.ииив ли

А СдА Св

се", 6 Си д' ос"

А и

■»а -о и А в-А я А и А и и А\-и АА1" О С С в

с-в

*>и А

с

и

ие си и" б е.,

и. Ж «,*•[« и и А.В

■-и*

и

нРНКбЗ

шпилька Ав (А1))

-ее

сУиАЧ

и А

и А

и А

<3 С

с и

А ААЛСиСв

А и и и йАОА А V

Г!»»

О и

\ ди

Л, л"*

О А О С С*0 С-О «и А С-в..

ил

и А и-А О С с и

А* АААС иСО и Л иииОАОА

А И

Св., Св'с. О Си ДА е с

? 'V

и А и "А

а с с-в с-о

■ми-А

с-_а

СА*

О А и А

с°1|

А АААС и С в А иииОАОА

ее

•Л* У л Ц* А®0

и А и А У А

а с

АААС и С в иии вАОАи

I

в С -во А и А Од-»

и А и А и А

в С с и

А АААСиеО. А иииОАОА

ли С

С в . о-сиА* о с «А и _

§

Рис. б. Модели предполагаемой вторичной структуры межцистронного фрагмента Есо81г мРНК. А) Слева: модель, предложенная М. Номурой и сотр., двутяжевые участки пронумерованы римскими цифрами, предполагаемый район связывания белка Есо57 выделен серым цветом, регуляторные элементы обведены рамкой (последовательность Шайна-Дальгарно, стоп-кодон цистрона Э12 и старт-кодон цистрона 37); справа: модель вторичной структуры, предложенная А. Копыловым и сотр. Б) Делеционные фрагменты Есов^ мРНК Наклонными жирными буквами в структуре шпилки АО (А1)) выделены нукпеотиды с -53 по -49, рандомизированные для ЭЕЬЕХ.

Очевидно, что нижняя часть межцистронной шпильки (участок II) служит не просто для стабилизации структуры участков III, IV, V. Отсюда следует интересное предположение о возможном механизме регуляции сопряженной трансляции оперона: связывание белка в верхней части межцистронной шпильки изменяет ее конформацию и, тем самым, модулирует структуру нижней части, где расположены регуляторные элементы (последовательность Шайна-Дальгарно, старт-кодон цистрона S7). В результате дальнейшая трансляция str мРНК оказывается невозможной.

5. Взаимодействие делеционных фрагментов Есо81г мРНК с белком ТЧЬ87.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что фрагменты ЕсоЗК мРНК143 и 103 образуют специфические комплексы с белком Шв7. Мы повторили эти эксперименты с различными препаратами белка "№87, а также проверили связывание белка с другими делеционными фрагментами ЕсоЭ^ мРНК (Рис. 6).

Рис. 6. Изотермы связывания белка Есо87 с фрагментами Есовй ' , мРНКдля [Еа^г мРНК] = 20 нМ.

200 300 400 [ECOS7], нМ

а 05

S

8 оз |

а о: 01

У

•1'

I'

■ мРНК 143 кКд = 55 ±10 нМ # мРНК 103 кК» = 67 ± 12 нМ д мРНК 85 кКд = 71 ± 12 нМ

Рис. 7. Изотермы связывания белка TthS7 с фрагментами EcoStr мРНКдля (EcoStr мРНК] = 20 нМ.

мРНК 143 кКд = 114 ±27 нМ мРНК 103 кКд =И32 ± 26 нМ МРНК85 кКд = 222 ± 26 нМ

[Т№87], нМ

Результаты эксперимента для гетерологичного взаимодействия оказались аналогичны поведению гомологичных комплексов (Рис. 7). Белок Т№)87 был способен

связывать фрагменты мРНК143, мРНКЮЗ и мРНК85. И, также как и белок EcoS7, TthS7 не взаимодействовал с фрагментами МРНК74, мРНКбЗ, шпильками AG и AU. Можно предположить, что, благодаря высокой степени гомологии пространственных структур и сходному поведению в комплексообразовании с фрагментами мРНК Е. coli, белки S7 из разных бактерий могут однотипно взаимодействовать с РНК, а их РНК-связывающие центры консервативны. В отличие от гомологичной системы при уменьшении фрагмента мРНК с 103 до 85 н о. наблюдалось уменьшение кКд почти в два раза. Можно предположить, что белок TthS7, в отличие от EcoS7, обладающий более стабильной структурой, способен эффективно связываться с делеционными фрагментами мРНК.

Сравнение свойств комплексов EcoS7 с Ecol6S рРНК и с EcoStr мРНК

Механизм аутогенной регуляции трансляции предполагает взаимодействие р-белка с двумя различными РНК - рибосомной и матричной. Существуют несколько механизмов дискриминации РНК. Первый путь - аффинность белка к рРНК выше, чем к мРНК, и, т.о., только при недостатке рРНК, белок связывается с мРНК, блокируя собственный синтез. Второй способ основан на том, что при наличии обеих РНК белок связывается преимущественно с рРНК за счет высокой кооперативности сборки целой субчастицы. В данном случае не требуется существенных различий в кКд комплексов с различными РНК. Полученные нами результаты говорят в пользу второго механизма. кКд комплексов белка EcoS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК имеют близкие значения: 14 ± 3 и 50 ± 7 нМ, соответственно.

6. Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку EcoS7.

Для более детального изучения структуры участка узнавания белка S7 можно использовать несколько подходов. Направленный мутагенез участка связывания -пример рационального подхода к решению проблемы. Принципиально иные возможности открывает метод так называемого иррационального дизайна, основанный на методологии комбинаторной химии РНК. Он позволяет ответить на вопрос -возможно ли на базе элементов природной структуры создание какого-либо варианта минимальной структуры РНК, узнаваемой белком S7.

Для поиска подобных структур был использован метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Суть метода - отбор из комбинаторной

библиотеки только тех молекул РНК, которые специфически и с высокой аффинностью связываются с белком. Такие РНК называют аптамерами

Во фрагментах РНК «шпилька АО» и «шпилька А1Ь были рандомизированы 5 нуклеотидов двутяжевого участка II: -53 по -49 (Рис. 5Б), которые по некоторым данным непосредственно не участвуют во взаимодействии с белком. Рандомизация означает, что в указанных позициях участка РНК может находиться любой из четырех возможных нуклеотидов. Таким образом, исходная библиотека содержала 45 = 1024 варианта молекул РНК.

Эксперимент по селекции аптамерных РНК к белку ЕсоБ7 был проведен в условиях, подобранных ранее для комплексообразования. Уровень связывания белка с исходной библиотекой РНК не превышал 5-10%, что соответствует уровню неспецифического связывания. Было проведено 10 циклов селекции с постепенным повышением так называемой строгости отбора: от цикла к циклу увеличивалось соотношение белок:РНК от 1:2 на первом цикле до 1:100 на десятом После десятого цикла оценивали уровень связывания с белком, однако увеличения аффинности обогащенной фракции РНК не произошло. Известно, что при высоких соотношениях белок:РНК возможны потери целевых вариантов молекул РНК в силу их низкой представленности в библиотеке.

Повторно эксперимент по селекции был проведен при других соотношениях белок : РНК. В третьем эксперименте был изменен состав буферного раствора (7 мМ МдС12, 350 мМ МН4С1). Во всех трех случаях отобрать молекулы РНК, связывающиеся с белком ЕсоЭ7, не удалось.

Отрицательные результаты селекции можно объяснить высокой специфичностью взаимодействия белка ЕсоБ7 со своим участком связывания на мРНК. Способной к связыванию является лишь природная структура ЕсоЭК мРНК, а удаление нижней части межцистронной шпильки и стабилизация структуры верхней части шпильки делает невозможным «восстановление» способности взаимодействовать с белком ни при каких изменениях структуры, возможных для использованной библиотеки РНК.

7. Селекция аптамерных РНК на основе фрагмента Есов1;г мРНК к белку тЭ7.

способный связываться с фрагментами ЕсоЭ^ мРНК, поэтому было решено провести эксперимент по отбору аптамерных РНК к белку Тй1Б7 из библиотеки на основе шпильки Ав. Условия комплексообразования соответствовали подобранным ранее для белка Т№Б7. Как и в случае белка ЕсоБ7 было проведено 10 циклов селекции с постепенным повышением строгости отбора К десятому циклу кКд комплекса обогащенной фракции РНК с белком Тй187 составила 70 нМ (Рис. 8).

Обогащенная библиотека 10 цикла была клонирована в плазмидный вектор р1)С19. Индивидуальные клоны были секвенированы. 70% клонов имели одинаковую последовательность нуклеотидов (Рис. 9А).

Были изучены РНК-связывающие свойства индивидуальных аптамеров: т.н. основной аптамер, имеющий первичную структуру, представленную в наибольшем числе клонов, связывался с белком ТСЬ87 с кКд = 50 + 6 нМ. Однако в большинстве полученных вариантов последовательностей нуклеотидов, кроме рандомизированного участка, подверглись изменениям и другие участки молекулы РНК: произошла вставка двух I) после 11-22 и делеция 11-41. Чтобы проверить, являются ли мутации в константных частях следствием контаминации системы или случайным сбоем, который при амплификации на стадии полимеразных реакций закрепился и оказался выгодным для связывания с белком, вытеснив другие варианты, был проведен еще один эксперимент по отбору аптамерных РНК к белку ПЬ87 в более строгих условиях. Причем, параллельно проводили две селекции - для обеих библиотек «шпилька А11» и

Белок "П1187 можно рассматривать как «природный мутант» белка Есо87,

08

Рис. 8. Изотермы связывания белка Т1Ь87 с фрагментами ЕсовК мРНК: ▲ фракция «шпилька АС» (эксперимент 1) после 10 циклов селекции; • фракция «шпилька Аи» (эксперимент 2) после 4 циклов селекции; ■ фракция «шпилька АО» (эксперимент 2) после 4 циклов селекции; ▼ исходная библиотека «шпилька АС»; исходная библиотека «шпилька А11».

О 100 200 300 400 600 600 700 [№57] нМ

А

2 1 0ВСТДА8аСИААС5етТТМС1ТТТАДАТ6ТСввГТ1ЙААС-СвТАеАвТТТТв(5ЛСААТССГ6ЛССС 68

4 1 ОС01АА&ОССЛАЛСКТТТААСТ*Г1'ГАДАТСТССОТТТАААС-С6ТА5АСТТТТОСАСЛАТССТСАССС 68

5 1 беСТААа^ССАААССТТТГААСТТТГАААТСТСОаТТТЛААС-ССТАОЛЗТТТТССАСААТССТСАССС 68

6 1 6ОТААв(ГССАААССТТТТМСИТГАААТСТСав»Т»ААЛС-С<ЗТАаАеТТТТВ(ИСДАТССТ(аССС 68

7 1 (^ТААе1КСАААСеТТТТААСТТТГАМТеТСввТТ*АДАС-С6ТА(а13ТТТТВе4СЯАТССТеАССС 68 10 1 5<ОТААВетСАААСдаТТААСТТтаАМ1СТСввТЯЯААС-СетаМеИТТ(^СЙАТССТ1аССС 68

13 1 бдаТААЕ6ССАААССТТТТААСИТГА»АТЗТСав1Т1АААС-С9ТАаАЕТТТТа;АСААТССТеАССС 68

14 1 6беТАА8вССАААСеТТТТААС1ТТГАААТеТСввТТТАААС-ССТАвАе1ТТТВ6АСААТССТ13АССС 68

15 1 веСТАА<^САЫСетТ1ТААС1тАААТвТС<М»«АААС-СВТА6АвТТТТеСАСААТССТаАССС 68

16 1 6ССТААСКСАААСвТТТТААСГТОАААТ<ЗТСвОГТ1АААС-СвТАвАЕТТТТВЕАСААТССТеАССС 68 19 1 бевТААбеССАААССТСТТААСТТТГАААТаТСввТТТАААС-ССТАеАеТТТТевАСААТССТОАССС 68

21 1 в6ОТАА6<К:САААССТТТТААСТТТГА»АТСТС001ЙАААС-СеТАвАвТТ1ТвеАСААТССТ6АССС 68

22 1 ОбОТААОаССАААСеТТТТААСИтаАААТВГСввСТТАААС-сетАбАбТТТТБСАСААТССТбАССС 68

■ШШ Ав 1 ООвТААЛЗССАЛЛСОТТТТАЛСТ—ТАААТ<ЗТСАААСТАААСТССТАОАОТТТТООАСААТСС?аАССС 67

18 1 СееТААбвССАААСеТТТТААСМТТАААтетаВТЯАААС-ССТАеАОТТТТеОССААТССТеАССС 68

■Вт Лв 1 ОЯЯМи!ОССЛААСОПТТЛАСТ~^ЛЛАТОТСЛЛАС¥АЛЯСТСОТЛвЛОТТТТООЯСААТССТОАССС 67

24 1 <3<ЯЗТАА8еССАААСеГТТТААСТ-АААТСТС1в1ТвАААТТСеТАвАеТТ1ТегАСААТССТеАССС 67

швп АО 1 ССС7ААООССАААСОТТТТААСТТА)икТвТСАААСТАААСТСОТАОА4?ТТТТ<><2АСАА?ССТаАССС 67

17 1 вветААвЮССАААСеТТТТААСТТТТАААТСТаавИТАААС-СеТАОАСТТТГаСАСААТССТ<ЗАССС 69 ШШЛЬШ АО 1 «*ИА»ОаСС-Х11»СеГГГП1»СТТ—ХХ1ТОТСА1Ц^ЫЛСТСаТ1ЛХаТТТТЭа^САЛТ<ХТОЛССС 67

12 1 ОВСТАА5<К;САААСЕТТ1ТААСТТАТАТСТа1«»СТАААСТСеТАеА8Т1ТТООАСААТССТ<;АССС 67

вшш жа 1 еоетмаааэииитетггадсттштогаилм^^ 67

3 1 |ЗОСТААайСССАААСвТТТТААСТТАААтетСП1в1Т&АТСТС61А5АетТТТОВАСААТССТеАССС 68 шяспыса ла 1 ОООТАЗиЗОСС-АААССТТТТААСТТАААТСТСАААСТАААСГСОТАОАОГТТТОСАСААГССТйАССС 67

Б

12Ав 1 В<етААОКСАААССТТТТААСМТГАААТвТСвв1Т1АААС-Се1А5АСТ1ТТ66АСААТССТвАССС 68

11Ав 1 еаЗТААвСССАААС5ТТИААСТТТГАААТОТСвСТТТАААС-С6ТАеА5ТТ1ТООАСААТССТеАССС 68

2Аб 1 6вСТАА(^САААС6ТТТТААСТТТ1АААТЕТС<»ГТ*АААС-СвТА5А5ТТТТбеАСААТССТаАССС 68

8АЙ 1 ВОСТМв13ССАААС1ОТТТААСТТТ1АААТСТСввЯТАААС-СОТАЕАОтаТТС6АСААТССТеАССС 68

9АБ 1 Б<^ААгССС»ААСгТТПААСтТАААТгТСавТТТАААС-СвТАвАбтТСгАСААТССТ£АССС 68

5А6 1 ОССТААЕОСаЛАСОТТТТААСТТОАААТетСТаТИАААС-ССТАеАвТТТТесАСААТССТОАССС 68

■шяьи ла 1 во<пшихххэд1сгапттклст--гАмт<ггсшстлА1иж»тА1^^ 67

7Ав 1 ееСТААееССАААСеТТТТААСТТАААТеТСАААСТАААСТСеТАВАвТТТТевАСААТССТвАССС 67

■пхяыса Ав 1 ОООТААООССАААСОТТТТААСТТАААТОТСАААСТАААСТССТАОАОТТТТООАСААТССТОАССС 67

13А6 1 вееТААОбССАААСОТТТТААСТТАААТвТаЗввТТАААСТССТАбАбТТТТВеАСААТССТвАССС «7

шшп М 1 ОООТААСОССАААСОТТТТААСТТАААТОТС^ААСГАААСТСаТАйАСТТТТООАСААТССТОАССС 67

8А0 1 0еСТАА6СССАААСВТТТТААСТТТГАААТетСв01ТТАААС-С0ТА13АеТТТТ66АСААТССТТАССС 68

9А0 1 0|ЗСТААСОССАААССТТТТ»АСТТТГАААТОТС1И»ТТДААС-СЕТА5А6ТТТТеОАСААТССТТАССС 68

4А0 1 ееСТАА<5ВССАААС<ЛГГТААСТтаДААТСТС1»ИТТАААС-Са1АеА5ТТТТввАСААТССТТАССС 68

ЗАО 1 вСОТААССССАААССТт'ААСТТТГАААТОТСООТТТАААС-СОТАСАСТТТТССАСААТССТТАССС 68

13АС 1 6®ЭТАА60;САААССТТТТААС331ТАААТСТСв(И1ТАААС-СеТАвАВТТТТ6вАСААТССТТАССС 68

ПШ1 «I 1 СССТААООССАААСОТТТТААСТ—ТАААЮТСАААСТАААСТСОТАвАОТТТТбОАСААТССТТЖССС 67

12АС 1 в1^ААебСа^ССТТТТААСТТтаАААТв1С0вв1ТТААС-СВТАЕАвТТТТееАСААТССТ1АССС 68

6А0 1 ВССТАА1^САААС6ТТТТААСТтАААТСТСвввТ1ТААС-СВТА0АС1ТТТв0АСААГССТТАССС 68

•шш Ю 1 GGCfПUШí*XAAJW^GTTTTAACT--TAAA7CTCAAACтаAACTCGTAйAGTTTTG^ЗACAATCXT!ГJLCCC 67

2А0 1 бевТААеСССАААСОтТААСтаИАААТбТСваТТТАААСССССТАбАСТМТббАСААТССТТАССС 70

ШШИЬК* ли 1 аОСТААООССААЛСОТТТТААСТ—ТАААТСГСАААСТАЛЛСТС-СТАСаЮГГГГОйЬСААТССГГАССС 67

Рис. 9. Выравнивание первичных структур индивидуальных аптамеров к белку Т№в7. А) аптамеры из библиотеки «шпилька Ав» (эксперимент 1) Б) аптамеры из библиотек «шпилька Аб» и «шпилька Ав» (эксперимент 2). Жирным текстом выделен рандомизированный участок, подчеркнуты нукпеотедные вставки в полученных аптамерах.

«шпилька Аб». В результате на 4 цикле селекции было достигнуто обогащение библиотеки, аналогичное предыдущему опыту селекции. кКд полученных обогащенных фракций РНК составили 150 и 120 нМ для «шпильки А11» и «шпильки Ав», соответственно (Рис. 8). После клонирования и секвенирования индивидуальных аптамеров оказалось, что как вставка, так и делеция в константных частях, все равно присутствуют в подавляющем большинстве аптамеров (Рис. 9Б). И что характерно, получены такие же варианты первичных структур аптамеров, что и в первом эксперименте.

Это позволяет сделать вывод, что произошедшие изменения в константной части аптамеров необходимы для формирования таких структур РНК, которые способны наилучшим образом связываться с белком Э7. То есть случайные ошибки, возникающие при полимеразных реакциях, закрепляются в процессе селекции. Наличие природных первичных структур среди отобранных молекул свидетельствует о том, что исходная библиотека ошибок не содержала (последовательность 13АС на Рис. 9Б).

Индивидуальные аптамеры были охарактеризованы по связыванию с белком ТШ57 (Рис. 10). Для основного аптамера были построены модели вторичной структуры по алгоритму Зукера (Рис. 11).

I«

/

с""»

(4

бСОвААбО ССАА*

СССАии<\? ЧРПцаА* АаС АI

ГТ1Л57]. ИМ

Рис. 10. Изотермы связывания основного аптамера из библиотеки «шпилька Аб» (■) и «шпилька Аи» (•)

м С<3и А

бвбвААСО ССААА иииА СССАииС

"О

боиии, АйАи АААШибЗ-

ио асс 1-*

Рис. 11. Модель вторичной структуры основного аптамера - победителя селекции, к белку Т№57. Рамкой выделены рандомизированные нуклеотиды. Жирными буквами выделена вставка, стрелкой показана делеция I), возникшие в результате селекции.

8. Изучение структуры и температурных конформационных превращений белка S7 методами дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и компьютерной молекулярной динамики (МД).

Полученные результаты по взаимодействию с различными РНК двух белков EcoS7 и TthS7 показали как высокую степень родства между ними, так и принципиальные различия. Для разрешения возникших вопросов мы обратились к физическому методу исследования термодинамических свойств белков. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) - один из немногих прямых методов изучения белков, дающий возможность определить реальные термодинамические и структурные характеристики. Наличие максимума функции теплоемкости на термограмме означает кооперативное плавление структуры белковой глобулы - переход из нативного состояния в денатурированное. Изучение термодинамики конформационной подвижности обоих белков позволяет понять, с чем связаны сходство и различия в поведении белков.

Для эксперимента использовались препараты белков EcoS7 и TthS7 с известной РНК-связывающей активностью. Калориметрические эксперименты проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра SCAL-1 (НПО «Биоприбор») с объемом ячеек 0,472 мл при скорости нагрева 1,0 °С/мин. Полученные термограммы представлены на Рис. 12.

Белок EcoS7 не имеет четко выраженного температурного интервала перехода из нативного в денатурированное состояние. Такой тип структуры называют «расплавленной глобулой». Это означает, что белок EcoS7 при повышении температуры постепенно «набухает» - молекулы воды проникают внутрь структуры белка. Напротив, белок TthS7 имеет два максимума на термограмме - при температурах 70 и 98 °С, что говорит о наличии двух конформационных переходов в структуре белка. Следует отметить, что температура первого перехода совпадает с областью физиологических температур клеток организма Т. thermophilus. Изменения калориметрической энтальпии переходов составляет &Н-\= 26,1 кДж/моль для первого перехода, ДН2= 97,7 кДж/моль - для второго.

Следовательно, EcoS7 имеет конформацию, отличную от термофильного белка TthS7. Однако можно предположить, что в различных условиях в клетках £ coli и Т. thermophilus р-белки находятся в однотипном состоянии, причем функционально активная конформация образуется в процессе формирования рибосом.

А

Б

Моделировать движение структурных элементов белка на атомном уровне можно /л в///со, с помощью компьютерного метода симуляции молекулярной динамики (МД). Пространственная структура белка Т№87 была экстрагирована из структуры "ПИЗОв субчастицы, а для модели пространственной структуры белка ЕсоБ7 в нашей лаборатории ранее была построена модель с помощью сервиса 8\л158Мо(1е1 (5Уиз5тос1е1-ехразу сЮ. Для получения траекторий молекулярной динамики обоих белков в растворе использовали программный пакет Сготасэ (уууууу oromacs.org). Для сравнения с данными, полученными методом ДСК было проведено виртуальное «плавление» обоих белков (Рис. 13). Были подобраны условия и длина траекторий, описывающие движения белков с максимальным приближением к макроскопической системе, изучаемой калориметрическими методами. Повышенная РНК-связывающая способность Т№87 по сравнению с ЕсоЭ7 обеспечивается его более стабильной структурой.

Сравнение результатов плавления белков EcoS7 и TthS7 in vitro и in sthco (Рис. 12, 13) позволяет сделать три важных вывода. Во-первых, разработанный метод МД позволяет адекватно описывать экспериментальные результаты ДСК. Во-вторых, получены данные в пользу построенной компьютерной модели пространственной структуры EcoS7. И, наконец, в-третьих, стабильность белка TthS7 обеспечена качественно иной природой его структуры, что позволяет предположить, что именно этот фактор обеспечивает более эффективную РНК-связывающую активность белка.

ВЫВОДЫ

1) Получен супер-продуцент £ со//'для рибосомного белка EcoS7, обеспечивающий выход 30-40 мг белка на литр культуры. Разработана эффективная методика выделения препарата, содержащего до 60 % активного белка и обладающего самой высокой РНК-связывающей активностью.

2) Гомологичные комплексы EcoS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК имеют кКД 14 ± 3 и 50 ± 7 нМ, соответственно. Их гетерологичные аналоги с белком TthS7 имеют кКд 18 ± 9 и 114 ± 11 нМ, соответственно, что говорит о консервативности РНК-связывающего центра белков.

3) Делеционный анализ межцистронного фрагмента EcoStr мРНК показал, что для взаимодействия как с белком EcoS7, так и с TthS7, необходим фрагмент РНК около 85 нуклеотидов длиной, заключенный между терминирующим кодоном цистрона S12 и инициирующим кодоном цистрона S7.

4) На основе библиотеки с рандомизацией 5 нуклеотидов межцистронного фрагмента EcoStr мРНК получены аптамеры к белку TthS7. кКД комплекса белка с аптамером составляет 56 ± 6 нМ.

5) Методом ДСК показано, что структура и температурные превращения белка EcoS7 близки к модели «расплавленная глобула». Белок TthS7 имеет два структурных перехода при температурах 70 °С и 98 °С. Разработана методика и проведено моделирование процесса термической денатурации белков in silico методом молекулярной динамики.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Spiridonova VA, Rassokhin Tl, Golovin AV, Petrova EV, Rohzdestvensky TS, Pakhomova JYu, Kopylov AM (2002) A comparative thermodynamic study for both natural and artificial RNA/DNA-protein binary complexes. Bioelectrochemistry, 55, p. 95-97.

2. Рассохин ТИ, Головин AB, Петрова ЕВ, Спиридонова ВА, Каргинова OA, Рождественский ТС, Брозиус Ю, Копылов AM (2001) Изучение связывания белка S7 с фрагментом 926-986/1219-1393 16S рРНК - ключевого этапа сборки малой субчастицы прокариотических рибосом. Молекулярная биология, 35, с. 617-627.

3. Рохедественский ТС, Рассохин ТИ, Анохина ММ, Головин АВ, Спиридонова ВА, Копылов AM (1999) Делеционный анализ регуляторного участка межцистронной области S7-S12 s/гмРНКЕ. со//на связывание рибосомного белка S7. Вестник Московского Университета, серия Химия, с. 390-395.

4. Rassokhin Tl, Golovin AV, Rozhdestvensky TS, Bessonov SI, Petrova EV, Spiridonova VA, Brosius J, Kopylov AM (2002) A sfructure-thermodynamic study of prokaryotic ribosomal small subunit biogenesis. Abstract of the International Conference "The Dynamics of Ribosome Structure and Function", Queenstown, New Zealand, p. 163.

5. Бессонов СИ, Рассохин ТИ, Петрова ЕВ, Рождественский ТС, Спиридонова ВА, Брозиус Ю, Копылов AM (2002) Структурно-термодинамическое изучение регуляции биогенеза малой субчастицы рибосом Е. coli. Тезисы III съезда Российского биохимического общества, С.-Петербург, Россия, с. 4.

6. Spiridonova VA, Rassokhin Tl, Golovin AV, Petrova EV, Rozhdestvensky TS, Kopylov AM (2001) Nucleic Acids as a Novel Molecular Recognition Elements. Abstracts of the International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Bratislava, Slovakia, p. 142.

7. Rassokhin Tl, Golovin AV, Rozdestvensky TS, Bessonov SI, Petrova EV, Spiridonova VA, Brosius J, Kopylov AM (2001) A structure-thermodynamic study of prokaryotic ribosomal small subunit biogenesis Abstract of the International Conference in Honor of Alexander Spirin, Puschino, Russia, p. 19.

8. Rozhdestvensky TS, Golovin AV, Rassokhin Tl, Petrova EV, Anokhina MM, Spiridonova VA, Kopylov AM (2000) Protein S7 interactions with sfrmRNA and 16S rRNA. Abstract of the International Conference "Ribosome Biogenesis and Nucleolar Function", Granlibakken, USA, p. 111.

9. Golovin AV, Rassokhin Tl, Petrova EV, Anokhina MM, Spiridonova VA, Kopylov AM (2000) A study of the thermophilic ribosomal protein S7 binding to the truncated S12-S7 intercistronic region provides more insight for a mechanism of regulation of str operon of E. coli. Poster of the 1st Russian Electronic Conference on Bioinformatics (RECOB-2000), F03.

10. Golovin AV, Rozhdestvensky TS, Rassokhin Tl, Petrova EV, Anokhina MM, Spiridonova VA, Kopylov AM (2000) Thermodynamic of ribosomal protein S7 interactions with sfrmRNA and 16S rRNA Abstract of the International Conference "Trends in Nucleic Acid Chemistry", Moscow, Russia, p. 65.

J

5-М

#20405

Подписано в печать 19 11.03 Заказ № 129 Тираж 110 экз.

ООО "Фирм* Печатный двор" тел.: 202- 31-45

1. СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Структура рибосомного белка S4.

3.2.1. Взаимодействие рибосомного белка S4 с 16S рРНК.

3.2.2. Термодинамика связывания рибосомного белка S4 с 16S рРНК.

3.2.3. Термодинамика бинарных комплексов BstS4-Bst16S рРНК.

3.2.4. Изучение участка взаимодействия белка EcoS4 с Eco16S рРНК с помощью селекции.

3.3.1. Регуляция трансляции оперонов рибосомных белков.

3.3.2. Регуляция трансляции а-оперона белком S4.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1.1. Клонирование и выделение рибосомного белка EcoS7 из Е. coli.

4.2.1. Определение активности белка EcoS7 при взаимодействии с фрагментом Eco16S рРНК.

4.2.2. Оценка термодинамических параметров комплексообразования EcoS7 с Eco16S рРНК.

4.2.3. Изучение взаимодействия белка TthS7 с фрагментом Eco16S рРНК.

4.3.1. Делеционный анализ межцистронного фрагмента S12-S7 sfr мРНК Е. coli.

4.3.2. Изучение взаимодействия белка TthS7 с делеционными фрагментами EcoStr мРНК.

4.3.3. Сравнение свойств комплексов EcoS7 с Eco16S рРНК и с EcoStr мРНК.

4.4.1. Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку EcoS7.

4.4.2. Селекция РНК-аптамеров на основе фрагмента EcoStr мРНК к белку TthS7.

4.5. Изучение структуры и температурных конформационных превращений белков EcoS7 и TthS7 методами дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и компьютерной молекулярной динамики (МД).

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5.1. Использованные штаммы микроорганизмов и реактивы.

5.2. Использованные методы.

6. ВЫВОДЫ.

Исс/едование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка 87эубактерий 2. ВВЕДЕНИЕ Достигнутые в последнее v время успехи в расшифровке структуры бактериальных рибосом, их субчастиц и функциональных комплексов с мРНК и тРНК методом рентгеноструктурного анализа (РСА) позволили перейти к детальному изучению механизмов функционирования этого сложнейшего РНПкомплекса, как на стадии сборки рибосом, так и в процессе трансляции. Обладая знаниями о тонкой структуре такого сложного супрамолекулярного комплекса и его компонентов, можно на новом уровне изучать его сборку, а также регуляцию этого процесса. Биогенез бактериальных рибосом связан с синтезом и поэтапным взаимодействием рибосомных белков с рРНК. Его регуляция происходит на уровне координации синтеза рибосомных белков и рРНК с помощью альтернативных высоко специфичных взаимодействий рибосомных белков либо с рРНК, либо с собственной мРНК. Детальное изучение термодинамических факторов, направляющих этот процесс, в настоящий момент явно недооценивается, однако является существенным для понимания такого важного для клетки механизма. Феномен регуляции основан на способности рибосомных белков, выполняющих регуляторную функцию, узнавать как рРНК, так и мРНК. Настоящая работа посвящена изучению термодинамического аспекта РНК-белковых взаимодействий для одного из таких белков рибосомного белка S7 прокариот, связывающегося с 16S рРНК и инициирующего сборку основного З-концевого домена и, следовательно, всей малой субчастицы бактериальной рибосомы. Ген белка S7 входит в состав стрептомицинового (sti) оперона. str оперон Е. со//состоит из 4 генов: rpsL (рибосомный белок S12), rpsG (рибосомный белок Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий S7, EcoS7), fus (фактор элонгации трансляции EF-G) и tufA (фактор элонгации трансляции EF-Tu). Контроль уровня экспрессии этих генов осуществляется на уровне трансляции. Выполняя регуляторную функцию, белок EcoS7 связывается Ц1 с межцистронным участком S12-S7 и ингибирует трансляцию str мРНК. Как по первичной, так и по предполагаемой вторичной структуре участки 16S рРНК и str j j |jl мРНК, связывающиеся с EcoS7, отличаются. Именно способность белка EcoS7 образовывать высоко аффинные и специфичные комплексы с различными по структуре РНК делает возможным регуляцию биосинтеза белков str оперона. Решение этой задачи необходимо искать в изучении не только структурных, но и термодинамических характеристик комплексов белка S7. Кроме того, установлена связь между функцией генов str оперона и возникновением у бактерий устойчивости к антибиотикам: мутации в гене rpsL вызывают устойчивость к антибиотику стрептомицину, в гене tufA к кирромицину, а сам белок S7 принимает участие в связывании тетрациклина с бактериальной рибосомой. Так медицине, как стрептомицин и и тетрацикпин широко то используются в ветеринарии пищевой промышленности, исследование механизмов регуляции экспрессии этих генов является очень важной задачей и в 1 прикладном аспекте.

6. ВЫВОДЫ

1) Получен супер-продуцент Е. coli для рибосомного белка EcoS7, обеспечивающий выход 30-40 мг белка на литр культуры. Разработана эффективная методика выделения препарата, содержащего до 60 % активного белка и обладающего самой высокой РНК-связывающей активностью.

2) Гомологичные комплексы EcoS7 с фрагментами Eco16S рРНК и EcoStr мРНК имеют кКд 14 ± 3 и 50 ± 7 нМ, соответственно. Их гетерологичные аналоги с белком TthS7 имеют кКд 18 ± 9 и 114 ± 11 нМ, соответственно, что говорит о консервативности РНК-связывающего центра белков.

3) Делеционный анализ межцистронного фрагмента EcoStr мРНК показал, что для взаимодействия как с белком EcoS7, так и с TthS7, необходим фрагмент РНК около 85 нуклеотидов длиной, заключенный между терминирующим кодоном цистрона S12 и инициирующим кодоном цистрона S7.

4) На основе библиотеки с рандомизацией 5 нуклеотидов межцистронного фрагмента EcoStr мРНК получены аптамеры к белку TthS7. кКд комплекса белка с аптамером составляет 56 ± 6 нМ.

5) Методом ДСК показано, что структура и температурные превращения белка EcoS7 близки к модели «расплавленная глобула». Белок TthS7 имеет два структурных перехода при температурах 70 °С и 98 °С. Разработана методика и проведено моделирование процесса термической денатурации белков in silico методом молекулярной динамики.

1. Stern, S., Wilson, R.C. and Noller, H.F. (1986) Localization of the binding site for protein S4 on 16 S ribosomal RNA by chemical and enzymatic probing and primer extension. J Mol Biol 192,101-10.

2. Zengel, J.M. and Lindahl, L. (1994) Diverse mechanisms for regulating ribosomal protein synthesis in Escherichia coli. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 47, 331-70.

3. Mattheakis, L.C. and Nomura, M. (1988) Feedback regulation of the spc operon in Escherichia coli: translational coupling and mRNA processing. J Bacteriol 170, 4484-92.

4. Nomura, M., Yates, J.L., Dean, D. and Post, L.E. (1980) Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli: structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein MRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 7084-8.

5. Saito, K., Mattheakis, L.C. and Nomura, M. (1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation. J Mol Biol 235, 111-24.

6. Mougel, M., Ehresmann, B. and Ehresmann, C. (1986) Binding of Escherichia coli ribosomal protein S8 to 16S rRNA: kinetic and thermodynamic characterization. Biochemistry 25, 2756-65.

7. Wower, I., Kowaleski, М.Р., Sears, L.E. and Zimmermann, R.A. (1992) Mutagenesis of ribosomal protein S8 from Escherichia coli: defects in regulation of the spcoperon. J Bacteriol 174,1213-21.

8. Nevskaya, N. et al. (1998) Crystal structure of ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus reveals a high degree of structural conservation of a specific RNA binding site. J Mol Biol 279, 233-44.

9. Kalurachchi, K. and Nikonowicz, E.P. (1998) NMR structure determination of the binding site for ribosomal protein S8 from Escherichia coli 16 S rRNA. J Mol Biol 280, 639-54.

10. Moine, H., Cachia, C., Westhof, E., Ehresmann, B. and Ehresmann, C. (1997) The RNA binding site of S8 ribosomal protein of Escherichia coli: Selex and hydroxyl radical probing studies. RNA 3, 255-68.

11. Benard, L., Mathy, N., Grunberg-Manago, M., Ehresmann, В., Ehresmann,

12. C. and Portier, C. (1998) Identification in a pseudoknot of a U.G motif essential for the regulation of the expression of ribosomal protein S15. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 2564-7.

13. Serganov, A., Polonskaia, A., Ehresmann, В., Ehresmann, C. and Patel,

14. D.J. (2003) Ribosomal protein S15 represses its own translation via adaptation of an rRNA-like fold within its mRNA. EMBO J 22, 1898-908.

15. Markus, M.A., Gerstner, R.B., Draper, D.E. and Torchia, D.A. (1998) The solution structure of ribosomal protein S4 delta41 reveals two subdomainsand a positively charged surface that may interact with RNA. EMBO J 17, 4559-71.

16. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T. and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407, 327-39.

17. Sayers, E.W., Gerstner, R.B., Draper, D.E. and Torchia, D.A. (2000) Structural preordering in the N-terminal region of ribosomal protein S4 revealed by heteronuclear NMR spectroscopy. Biochemistry 39,1360213.

18. Burley, S.K. and Petsko, G.A. (1985) Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization. Science 229, 23-8.

19. Marqusee, S. and Baldwin, R.L. (1987) Helix stabilization by Glu-.Lys+ salt bridges in short peptides of de novo design. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 8898-902.

20. Ramakrishnan, V. and White, S.W. (1998) Ribosomal protein structures: insights into the architecture, machinery and evolution of the ribosome. Trends Biochem Sci 23, 208-12.

21. Kodandapani, R., Pio, F., Ni, C.Z., Piccialli, G„ Klemsz, M., McKercher, S., Maki, R.A. and Ely, K.R. (1996) A new pattern for helix-turn-helix recognition revealed by the PU.1 ETS-domain-DNA complex. Nature 380, 456-60.

22. Aravind, L. and Koonin, E.V. (1999) Novel predicted RNA-binding domains associated with the translation machinery. J Mol Evol 48, 291-302.

23. Sivaraman, J., Sauve, V., Larocque, R., Stura, E.A., Schrag, J.D., Cygler, M. and Matte, A. (2002) Structure of the 16S rRNA pseudouridine synthase RsuA bound to uracil and UMP. Nat Struct Biol 9, 353-8.

24. Squires, C.L., Greenblatt, J., Li, J. and Condon, C. (1993) Ribosomal RNA antitermination in vitro: requirement for Nus factors and one or more unidentified cellular components. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 970-4.

25. Nomura, M. (1973) Assembly of bacterial ribosomes. Science 179, 86473.

26. Held, W.A. and Nomura, M. (1973) Rate determining step in the reconstitution of Escherichia coli 30S ribosomal subunits. Biochemistry 12, 3273-81.

27. Zimmermann, R.A., Muto, A., Fellner, P., Ehresmann, C. and Branlant, C. (1972) Location of ribosomal protein binding sites on 16S ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 69, 1282-6.

28. Draper, D.E. (1995) Proteln-RNA recognition. Annu Rev Biochem 64, 593620.

29. Mougel, M., Allmang, C., Eyermann, F., Cachia, C., Ehresmann, B. and Ehresmann, C. (1993) Minimal 16S rRNA binding site and role of conserved nucleotides in Escherichia coli ribosomal protein S8 recognition. Eur J Biochem 215, 787-92.

30. Ehresmann, C., Stiegler, P., Carbon, P., Ungewickell, E. and Garrett, R.A. (1980) The topography of the 5' end of 16-S RNA in the presence and absence of ribosomal proteins S4 and S20. Eur J Biochem 103, 439-46.

31. Mackie, G.A. and Zimmermann, R.A. (1978) RNA-protein interactions in the ribosome. IV. Structure and properties of binding sites for proteins S4, S16/S17 and S20 in the 16S RNA. J Mol Biol 121, 17-39.

32. Zimmermann, R.A. (1980) in: Ribosomes: Structure, Function and Genetics, pp. 135-169 (al., G.C.e., Ed.) University Park Press, Baltimore.

33. Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий39! Powers, Т. and Noller, H.F. (1995) Hydroxy I radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. RNA 1,194-209.

34. Mackie, G.A. and Zimmermann, R.A. (1975) Characterization of fragments of 16 S ribonucleic acid protected against pancreatic ribonuclease digestion by ribosomal protein S4. J Biol Chem 250, 4100-12.

35. Ungewickell, E., Garrett, R., Ehresmann, C., Stiegler, P. and Fellner, P. (1975) An investigation of the 16-S RNA binding sites of ribosomal proteins S4, S8, S15, and S20 FROM Escherichia coli. Eur J Biochem 51, 165-80.

36. Schluenzen, F. et al. (2000) Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution. Cell 102, 615-23.

37. Vartikar, J.V. and Draper, D.E. (1989) S4-16 S ribosomal RNA complex. Binding constant measurements and specific recognition of a 460-nucleotide region. J Mol Biol 209, 221-34.

38. Sapag, A., Vartikar, J.V. and Draper, D.E. (1990) Dissection of the 16S rRNA binding site for ribosomal protein S4. Biochim Biophys Acta 1050, 34-7.

39. Deckman, I.C., Draper, D.E. and Thomas, M.S. (1987) S4-alpha mRNA translation repression complex. I. Thermodynamics of formation. J Mol Biol 196,313-22.

40. Schulte, C., Morrison, C.A. and Garrett, R.A. (1974) Protein-ribonucleic acid interactions in Escherichia coli ribosomes. Solution studies on S4-16S ribonucleic acid and L24-23S ribonucleic acid binding. Biochemistry 13,1032-7.

41. Schulte, С. and Garrett, R.A. (1972) Optimal conditions for the interaction of ribosomal protein S8 and 16S RNA and studies on the reaction mechanism. Mol Gen Genet 119, 345-55.

42. Baker, A.M. and Draper, D.E. (1995) Messenger RNA recognition by fragments of ribosomal protein S4. J Biol Chem 270, 22939-45.

43. Dragon, F. and Brakier-Gingras, L. (1993) Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S7 with 16S rRNA. Nucleic Acids Res 21, 1199-203.

44. Dragon, F., Payant, C. and Brakier-Gingras, L. (1994) Mutational and structural analysis of the RNA binding site for Escherichia coli ribosomal protein S7. J Mol Biol 244, 74-85.

45. Nomura, M., Traub, P. and Bechmann, H. (1968) Hybrid 30S ribosomal particles reconstituted from components of different bacterial origins. Nature 219, 793-9.

46. Held, W.A., Gette, W.R. and Nomura, M. (1974) Role of 16S ribosomal ribonucleic acid and the 30S ribosomal protein S12 in the initiation of natural messenger ribonucleic acid translation. Biochemistry 13,2115-22.

47. Gerstner, R.B., Pak, Y. and Draper, D.E. (2001) Recognition of 16S rRNA by ribosomal protein S4 from Bacillus stearothermophilus. Biochemistry 40, 7165-73.

48. Gutell, R.R. (1994) Collection of small subunit (16S- and 16S-like) ribosomal RNA structures: 1994. Nucleic Acids Res 22, 3502-7.

49. Schwarzbauer, J. and Craven, G.R. (1981) Apparent association constants for E. coli ribosomal proteins S4, S7, S8, S15, S17 and S20 binding to 16S RNA. Nucleic Acids Res 9, 2223-37.

50. Pan, J. and Woodson, S.A. (1998) Folding intermediates of a self-splicing RNA: mispairing of the catalytic core. J Mol Biol 280, 597-609.

51. Leung, D., Chen, E, Goeddel, DV (1989) Technique, 11-15.

52. Woese, C.R., Gutell, R., Gupta, R. and Noller, H.F. (1983) Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids. Microbiol Rev 47, 621-69.

53. Heus, H.A. and Pardi, A. (1991) Structural features that give rise to the unusual stability of RNA hairpins containing GNRA loops. Science 253, 191-4.

54. Woese, C.R., Winker, S. and Gutell, R.R. (1990) Architecture of ribosomal RNA: constraints on the sequence of "tetra-loops". Proc Natl Acad Sci U S A 87, 8467-71.

55. Woese, C.R. and Gutell, R.R. (1989) Evidence for several higher order structural elements in ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 311922.

56. Heilek, G.M., Marusak, R., Meares, C.F. and Noller, H.F. (1995) Directed hydroxyl radical probing of 16S rRNA using Fe(ll) tethered to ribosomal protein S4. Proc Natl Acad Sci U S A 92,1113-6.

57. Lu, M. and Draper, D.E. (1995) On the role of rRNA tertiary structure in recognition of ribosomal protein L11 and thiostrepton. Nucleic Acids Res 23, 3426-33.

58. Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий65l Sapag, A. and Draper, D.E. (1997) In vitro evolution used to define aprotein recognition site within a large RNA domain. Bioorg Med Chem 5, 1097-105.

59. Stemmer, W.P. (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370, 389-91.

60. Fallon, A.M., Jinks, C.S., Strycharz, G.D. and Nomura, M. (1979) Regulation of ribosomal protein synthesis in Escherichia coli by selective mRNA inactivation. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 3411-5.

61. Lindahl, L. and Zengel, J.M. (1979) Operon-specific regulation of ribosomal protein synthesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 6542-6.

62. Fiil, N.P., Friesen, J.D., Downing, W.L. and Dennis, P.P. (1980) Post-transcriptional regulatory mutants in a ribosomal protein-RNA polymerase operon of E. coli. Cell 19, 837-44.

63. Nomura, M. (1999) Regulation of ribosome biosynthesis in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae: diversity and common principles. J Bacteriol 181, 6857-64.

64. Yates, J.L., Arfsten, A.E. and Nomura, M. (1980) In vitro expression of Escherichia coli ribosomal protein genes: autogenous inhibition of translation. Proc Natl Acad Sci U S A 77,1837-41.

65. Yates, J.L. and Nomura, M. (1980) E. coli ribosomal protein L4 is a feedback regulatory protein. Cell 21, 517-22.

66. Dean, D. and Nomura, M. (1980) Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 3590-4.

67. Thomas, M.S., Bedwell, D.M. and Nomura, M. (1987) Regulation of alpha operon gene expression in Escherichia coli. A novel form of translational coupling. J Mol Biol 196, 333-45.

68. Jinks-Robertson, S. and Nomura, M. (1982) Ribosomal protein S4 acts in trans as a translational repressor to regulate expression of the alpha operon in Escherichia coli. J Bacteriol 151, 193-202.

69. Deckman, I.C. and Draper, D.E. (1987) S4-alpha mRNA translation regulation complex. II. Secondary structures of the RNA regulatory site in the presence and absence of S4. J Mol Biol 196, 323-32.

70. Draper, D.E. (1987) in: Translational Regulation of Gene Expression, pp. 1-26 (Man, J., Ed.) Plenum Press, New York.

71. Spedding, G., Gluick, T.C. and Draper, D.E. (1993) Ribosome initiation complex formation with the pseudoknotted alpha operon messenger RNA. J Mol Biol 229, 609-22.

72. Spedding, G. and Draper, D.E. (1993) Allosteric mechanism for translational repression in the Escherichia coli alpha operon. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4399-403.

73. Tang, C.K. and Draper, D.E. (1990) Evidence for allosteric coupling between the ribosome and repressor binding sites of a translationally regulated mRNA. Biochemistry 29, 4434-9.

74. Schlax, P.J., Xavier, K.A., Gluick, T.C. and Draper, D.E. (2001) Translational repression of the Escherichia coli alpha operon mRNA: importance of an mRNA conformational switch and a teRNAry entrapment complex. J Biol Chem 276, 38494-501.

75. Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка 57 эубактерий

76. Robert, F. and Brakier-Gingras, L. (2001) Ribosomal protein S7from

77. Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA. Nucleic Acids Res 29, 677-82.

78. Варфоломеев С.Д., Гуревич Г.К. (1999) ФАИР-ПРЕСС, М.

79. Spierer, P., Bogdanov, A.A. and Zimmermann, R.A. (1978) Parameters for the interaction of ribosomal proteins L5, L18, and L25 with 5S RNA from Escherichia coli. Biochemistry 17, 5394-8.

80. Saito, K. and Nomura, M. (1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7. J Mol Biol 235,125-39.

81. Tuerk, C. and Gold, L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249, 505-10.

82. Исследование термодинамики бинарных комплексов РНК и рибосомного белка S7 эубактерий

83. Ж Финкельштейн А.В., Птицын П.О. (2002) Книжный дом "Университет", Москва.

84. Hansson, Т., Oostenbrink, С., and van Gunsteren, W. (2002) Molecular dynamics simulations. Curr Opin Struct Biol 12,190-196.

85. Van der Spoel, D., A. R. Van Buuren, E. Apol, P. J. Meulenhoff, D. P. Tieleman, A. L. Т. M. Sijbers, B. Hess, K. A. Feenstra, E. Lindahl, R. Van Drunen, and H. J. C. Berendsen (2001) University of Groningen, Groningen.

86. Peitsch, M.C. (1996) ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling. Biochem Soc Trans 24, 274-9.

87. Pichert, G.a.R.A.S. (2000) Organizing cancer genetics programs: the Swiss model. J Clin Oncol 18, 65-9.

88. Schappach, A.a.H.D.H. (2001) Molecular modelling of 17 alpha-hydroxylase-17,20-lyase. Pharmazie 56, 435-42.

89. Lindahl, E., B. Hess, and D. van der Spoel (2001) GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. JouRNAI of Molecular Modeling 7, 306-317.

90. Freire, E., Haynie, D.T. and Xie, D. (1993) Molecular basis of cooperativity in protein folding. IV. CORE: a general cooperative folding model. Proteins 17,111-23.

91. Freire, E. (1993) Structural thermodynamics: prediction of protein stability and protein binding affinities. Arch Biochem Biophys 303,181-4.

92. Xie, D., Bhakuni, V. and Freire, E. (1993) Are the molten globule and the unfolded states of apo-alpha-lactalbumin enthalpically equivalent? J Mol Biol 232, 5-8.

93. Gomez, J., Hilser, V.J., Xie, D. and Freire, E. (1995) The heat capacity of proteins. Proteins 22, 404-12.

94. Маниатис, Т., Фрич, Э., and Сэмбрук, Д. (1984) (Мир, Ed.) А. А. Баев, Москва.

95. Handbook, Q. (1995) QIAGEN.

96. Spiridonova, V.A., Golovin, A.V., Drygin, D. and Kopylov, A.M. (1998) An extremely high conservation of RNA-protein S7 interactions during prokaryotic ribosomal biogenesis. Biochem Mol Biol Int44, 1141-6.