Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

61

'сковски^ орденов Ленина, Октябрьской революции и Трудового красного знамени Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СИЗОВА Дарья Викторовна

Структурно-функциональный анализ участков внутреннего

связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и МРНК белка

теплового шока ШР70

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н. Шатский И.Н.

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений..................................... 6

ВВЕДЕНИЕ........................................... 8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Участки внутреннего связывания рибосомы вирусных и клеточных РНК

1.1 Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот........................................... 12

1.2 Внутренняя инициация трансляции................... 16

1.3 Метод поиска IRES-элементов внутри 5'-НТР мРНК..... 17

1.4 Вирусные IRES-элементы............................ 19

1.4.1 IRES-элементы РНК пикорнавирусов........... 19

1.4.1.1 Структура IRES-элементов у различных пикорнавирусных РНК................... 20

1.4.1.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК пикорнавирусов.......... 24

1.4.2 IRES-элементы РНК вируса гепатита С и пестивирусов................................... 30

1.4.2.1 Структура IRES-элементов РНК вируса гепатита С и пестивирусов................. 31

1.4.2.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК вируса гепатита С и пестивирусов............................ 33

1.4.3 IRES-элементы некоторых других вирусных РНК. 34

1.4.3.1 IRES-элемент РНК F-MLV............ 35

1.4.3.2 IRES-элемент РНК Mo-MuLV......... 37

1.4.3.3 IRES-элемент РНК HaMSV............ 38

1.4.3.4 IRES-элемент РНКЗ IBV.............. 38

1.4.3.5 IRES-элемент РНК crTMV..........................39

1.5 Клеточные IRES-элементы......................................................4q

1.5.1 IRES-элемент мРНК BIP..............................................41

1.5.2 IRES-элемент мРНК FGF-2........................................43

1.5.3 RES-элемент мРНК протоонкогена с-тус................44

1.5.4 IRES-элемент мРНК PDGF/c-sw................................46

1.5.5 IRES-элемент мРНК IGFII..........................................47

1.5.6 IRES-элемент мРНК VEGF........................................48

1.5.7 IRES-элементы мРНК TFID и НАР4 дрожжей________49

1.5.8 IRES-элемент мРНК морфогенетического фактора Antennapedia у дрозофилы................................................50

1.5.9 IRES-элемент мРНК eIF-4G........................................51

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70

2.1 Структурно-функциональный анализ IRES-элемента

HCV............................................... 53

2.1.1 Локализация участка связывания eIF-З на IRES-элементе HCV.................................. 55

2.1.2 Исследование влияния структурных составляющих IRES-элемента HCV на связывание с eIF-3.......................................... 57

2.1.3 Изучение возможности одновременного связывания eIF-З и 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементом HCV............................ 62

2.2 Структурно-функциональный анализ IRES-элемента белка теплового шока HSP70.......................... ^3

2.2.1 Исследование способности мРНК HSP 70 к внутренней инициации трансляции................ 65

2.2.2 Изучение влияния мутантного eIF-4A (R362Q) на функционирование IRES-элемента HSP 70.......... 69

2.2.3 Сравнение эффективности функционирования IRES-элементов HSP70 и BIP...................... 71

2.2.4 Определение границ IRES-элемента HSP 70...... 72

2.2.5 Исследование 5'-НТР и фрагмента кодирующей последовательности мРНК Р-глобина методом бицистронных конструкций...................... 72

2.2.6 Структурный анализ IRES-элемента HSP 70...... 75

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Реактивы и материалы............................... 81

3.2 Плазмидные конструкции, использованные в работе для исследования IRES-элемента HCV...................... 82

3.3 Плазмидные конструкции, использованные в работе для исследования IRES-элемента HSP 70.................... 82

3.4 Получение РНК-транскриптов........................ 86

3.5 Выделение 40S рибосомных субчастиц.................. 87

3.6 Выделение эукариотического фактора инициации трансляции eIF3...................................... gg

3.7 Анализ рибонуклеопротеидных комплексов............. 90

3.7.1 Образование рибонуклеопротеидных комплексов. . ^

3.7.2 Мечение 5'-концов олигонуклеотидов............ ^

3.7.3 Анализ рибонуклеопротедных комплексов методом "toe-printing"............................ 91

3.7.4 Обработка рибонуклеопротеидных комплексов РНКазами...................................... 92

3.7.5 Анализ фрагментов РНК, полученных после обработки рибонуклеопротеидных комплексов РНКазами...................................... 92

3.8 Химическое и ферментативное зондирование вторичной структуры РНК............................................................................93

3.9 Трансляция РНК-транскриптов in vitro..................................93

ВЫВОДЫ........................................................................................95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................97

мРНК

тРНК

Met-tRNAi

рРНК

кДНК

5'-НТР

IRES-элемент elF

HCV HSP 70 BIP

RRL

ATP

GTP

UTP

СТР

GDP

NTP

dNTP

ПААГ

ЭДТА

IPTG

DMS

CMCT

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

матричная РНК

транспортная РНК

инициаторная тРНК

рибосомная РНК

ДНК, синтезированная

in vitro путем обратной транскрипции

5'-нетранслируемый район мРНК

участок внутреннего связывания рибосомы

эукариотический фактор инициации

трансляции

вирус гепатита С

белок теплового шока 70

белок, связывающий тяжелую цепь

иммуноглобулина

лизат ретикулоцитов кролика

аденозин-5'-трифосфат

гуанозин-5'-трифосфат

уридин-5'-трифосфат

цитидин-5'-трифосфат

гуанозин-5'-дифосфат

рибонуклеозид -5'-трифосфат(ы)

дезоксирибонуклеозид -5'-трифосфат(ы)

полиакриламидный гель

этилендиаминтетраацетат

изопропилтио-(3-Б-галактопиранозид

диметилсульфат

1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-/>-толуолсульфонат

SDS додецилсульфат натрия

PMSF фенилметилсульфонилфторид

ВВЕДЕНИЕ

Модель инициации синтеза белка у эукариот, предложенная М.Козак [1], предполагает, что первоначально 40S рибосомная субчастица при участии факторов инициации узнает кэп-структуру на 5'-конце мРНК (кэп-структура представляет собой 7-метилгуанозин, соединенный с 5'-концевым нуклеозидом 5'-5' трифосфатной связью) и связывается с мРНК на самом 5'-конце молекулы (см. рис.1). Далее 40S субчастица начинает скользить вдоль мРНК (при содействии инициаторных факторов, расплетающих вторичную структуру 5'-нетранслируемой области мРНК), "сканируя" ее в поисках AUG кодона, находящегося в благоприятном для инициации нуклеотидном контексте. После этого к ней присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80S инициаторный комплекс начинает синтез белка. Данная модель механизма инициации трансляции называется кэп-зависимой или сканирующей.

Следует отметить, что даже если мРНК не содержит кэп-структуры (например, когда она получена в Т7-транскрипционной системе), ее трансляция идет весьма активно, уступая лишь в 2-3 раза эффективности трансляции природной кэпированной матрицы. В этом случае, по не вполне пока понятным причинам, посадка 40S рибосомной субчастицы происходит также на самом 5'-конце моноцистронной молекулы эукариотической мРНК, поэтому данный механизм инициации трансляции правильнее называть 5'-конец-зависимым. Согласно такой модели посадка 40S рибосомной субчастицы внутрь цепи мРНК принципиально невозможна.

Вышеописанная модель предъявляет определенные требования к строению мРНК. Так, подавляющее большинство эукариотических мРНК кэпированы, моноцистронны, содержат относительно короткий и слабо структурированный 5'-

нетранслируемый район (5'-НТР). Инициация трансляции таких мРНК происходит, как правило, на ближайшем к 5'-концу А1Ю-кодоне.

40Э

Рис. 1 Схематическое изображение сканирующей модели инициации трансляции эукариотических мРНК. Малая и большая рибосомные субчастицы обозначены соответственно 40Б и 608.

Впоследствии оказалось, что для ряда мРНК такой механизм инициации синтеза белка не применим в силу иного строения их 5'-НТР. Для таких мРНК была предложена модель внутренней (5'-конец-независимой) инициации трансляции. В соответствии с этой моделью 408 рибосомная субчастица связывается непосредственно с внутренним участком 5'-НТР мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы или ШЕ8-элементом (от

английского Internal Ribosome Entry Site), который может отстоять от 5'-конца молекулы мРНК на расстояние более 100 нуклеотидных остатков. Впервые такой механизм инициации трансляции был предложен для мРНК пикорнавирусов [2,3], 5'-НТР которых не кэпированы, весьма протяженны, сильноструктурированы и содержат до 11 AUG триплетов, предшествующих истинному инициаторному AUG ко дону.

Впоследствии внутренняя инициация трансляции была показана для мРНК вирусов ряда других групп, а также для нескольких клеточных мРНК. Недавно было обнаружено, что мРНК вируса гепатита С (Human Hepatitis С Virus, HCV) также использует механизм внутренней инициации трансляции [4]. IRES-элемент HCV, так же как и IRES-элементы пикорнавирусов, не содержит кэп-структуры и сильноструктурирован [5,6], но, в отличии от пикорнавирусных, он включает еще около 30 нуклеотидов кодирующей последовательности вирусного полипротеина [7], а также имеет функционально важный структурный элемент - псевдоузел [8]. Для инициации трансляции мРНК HCV не требуется участия большинства канонических эукариотических инициаторных факторов, однако присутствие инициаторного фактора 3 (eukariotic initiation factor 3, eIF-3) является обязательным [9]. eIF-3, самый большой из известных факторов инициации (содержит по крайней мере 8 различных субъединиц), способен связываться с рибосомной 40S субчастицей и предотвращать ее ассоциацию с 60S субчастицей [10]. В нашей лаборатории было показано, что eIF-3 образует комплекс с IRES-элементом HCV. Структурный анализ этого комплекса, предпринятый в настоящей работе, способен пролить свет на специфичность такого взаимодействия и его функциональную роль в ходе инициации синтеза вирусного полипротеина. HCV вызывает необычный вид гепатита (не А и не В), приводящий к тяжелым

ю

поражениям печени и, в ряде случаев, к злокачественным новообразованиям [11]. Поиск путей борьбы с этой опасной и быстро распространяющейся инфекцией занимает ученых во всем мире, поэтому любая новая информация о механизме инициации белкового синтеза у вируса гепатита С является чрезвычайно полезной.

В настоящий момент известно лишь небольшое число клеточных мРНК, использующих внутреннюю инициацию белкового синтеза, поэтому особенно интересно было найти и исследовать новый клеточный ЖЕБ-элемент. В литературе имелись данные, указывающие на то, что кандидатом на подобную роль может быть 5'-НТР мРНК белка теплового шока ШР70 [12,13]. Нахождение и структурное исследование новых клеточных 1ЫЕ8-элементов необходимо для дальнейшего изучения процесса внутренней инициации трансляции. Сравнение структурно-функциональных особенностей вирусных (в данной работе у РНК вируса гепатита С) и клеточного (в данной работе у мРНК белка теплового шока ШР70) участков внутреннего связывания рибосомы способно значительно расширить знания в области механизмов инициации синтеза белка у эукариот.

и

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Участки внутреннего связывания рибосомы вирусных и клеточных

РНК

1.1 Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот.

Трансляция мРНК, т.е. перевод информации, которую несет в себе мРНК, в белковую форму, является одним из основных этапов экспрессии генов. Белковый синтез не только производит новые необходимые клетке белки, но и заменяет те, что успели подвергнуться деградации. Для того, чтобы мРНК могла транслироваться, на ней должен собраться инициаторный комплекс. Помимо мРНК и рибосомных субчастиц, процесс сборки такого комплекса требует, как правило, участия большого количества факторов инициации (eukaryotic initiation factors, elFs), инициаторной аминоацилированной транспортной РНК (Met-tRNAj), молекул GTP и АТР [14]. Общая схема инициации трансляции эукариотических мРНК приведена на рис.2 [10].

Первым этапом процесса инициации белкового синтеза является диссоциация 80S рибосом на 40S и 60S субчастицы (рис.2, этап а)). В физиологических условиях (концентрация Mg2+ приблизительно 1-2 тМ) динамическое равновесие сдвинуто в сторону недиссоциированных 80S рибосом, поэтому на этом этапе необходимо участие факторов инициации, способных сдвинуть равновесие в сторону продуктов диссоциации. Данную функцию выполняют три белковых фактора, способные связываться с рибосомными субчастицами. Эукариотический инициаторный фактор 3 (eIF-3), наибольший из elFs, содержащий у млекопитающих по меньшей мере восемь различных субъединиц, связывается с 40S субчастицей с образованием природной 43Sn

рибосомной субчастицы [11]. Данное взаимодействие, по-видимому, стабилизируется при содействии eIF-lA. Еще один инициаторный фактор, eIF-б, способен связываться с 60S субчастицей, также способствуя накоплению необходимых для инициации трансляции свободных 40S субчастиц.

Перед тем, как связаться с 40S субчастицей, Met-tRNA; образует тройной комплекс с eIF-2 и GTP. GDP ингибирует образование тройного комплекса, поскольку бинарный комплекс eIF-2*GDP не может связывать Met-tRNAj. Однако, eIF-2,

выполнив раунд инициации, высвобождается именно в виде бинарного комплекса с GDP. Для того, чтобы eIF-2 смог участвовать в следующем раунде инициации, необходимо заменить GDP на GTP. Эту задачу выполняет инициаторный фактор eIF-2B, который связывается с eIF-2*GDP и катализирует реакцию обмена гуанинового нуклеотида. Тройной комплекс связывается с 40S субчастицей, несущей eIF-З и eIF-lA, с образованием 43S прединициаторного комплекса (рис.2, этап б)). Инициаторный фактор eIF-1 стабилизирует образование данного комплекса.

Следующие этапы инициации белкового синтеза - связывание прединициаторного 43 S комплекса с мРНК и узнавание инициаторного кодона, т.е. образование 48S инициаторного комплекса - являются наиболее интригующими и вызывающими наибольшее число споров. Основным механизмом, по которому происходит формирование 48S комплекса у большинства эукариотических мРНК, признан сканирующий механизм, суть которого изложена во введении к настоящей работе. Остановимся подробнее на роли в данном процессе инициаторных факторов. Узнавание кэп-структуры на 5'-конце мРНК происходит за счет фактора eIF-4E. Этот инициаторный фактор совместно с eIF-4A и eIF-4G образует кэп-связывающий белковый комплекс, названный

а)

ЫРЗ

(5) + («Г) т^ О^'

ь

е|р6

е!Р2 +

йТР +

МеМ!Ш

в1Р2'СТР'МвИЯМА| Мв_МНМА|

т7с-дио-(Д)л

[ 4В, 4Р,

ТО '

АТР

АОР

высвобождение факторов, еИ^-ОБР

■ йОР

•СТР

Рис.2 Схематическое изображение инициации трансляции в клетках эукариот [10]. Цифры, заключенные в ромбики, соответствуют индивидуальным факторам инициации согласно принятой на сегодняшний день номенклатуре, 3° - тройной комплекс (еШ2 • вТР• МеМШЧ А;). Малая и большая рибосомные субчастицы обозначены соответственно 408 и 608.

eIF-4F. Сродство eIF-4F к кэпированной мРНК приблизительно в 15 раз больше, чем у eIF-4E, что говорит о весьма вероятном дополнительном связывании с мРНК других субъединиц, составляющих eIF-4F [15]. Связанный eIF-4F совместно с eIF-4B обладает АТР-зависимой хеликазной активностью, позволяющей им расплетать вторичную структуру мРНК. Затем 43 S прединициаторный комплекс связывается с мРНК посредством взаимодействия eIF-4G с eIF-З (последний, как указано выше, связан с 40S субчастицей в составе 43S комплекса) (рис.2, стадия в)) [10].

Связывание 40S рибосомной субчастицы на 5'-конце мРНК не доставляет Met-tRNAj к инициаторному кодону, поскольку последний, как правило, отстоит от кэп-структуры на 50-100 нуклеотидных остатков. Узнавание AUG-кодона происходит в результате "сканирования" последовательности мРНК 43S прединициаторным комплексом. В этом процессе также, по-видимому, принимает участие eIF-4F благодаря своей способности расплетать вторичную структуру мРНК (рис.2, стадия г)). Описанная модель предполагает, что первый от 5'-конца молекулы мРНК AUG-триплет и будет инициаторным кодоном, что действительно справедливо для большинства эукариотических РНК-матриц. Непосредственное узнавание AUG-кодона, по-видимому, происходит при спаривании оснований AUG и антикодона Met-tRNAi. Однако это не единственная составляющая механизма узнавания инициаторного кодона, поскольку не все AUG-триплеты узнаются с одинаковой эффективностью. Было показано, что существует конценсусная стартовая последовательность, содержащая важные элементы в позициях -3 и +4 (если А из AUG считать позицией +1): CCC(A/G)CCAUGG. Весьма вероятно, что в узнавании инициаторного кодона задействована 40S рибосомная субчастица (точнее, ее рРНК), а также eIF-2 [14]. Недавно было

показано [16], что в этом процессе важную роль играют eIF-1 и elF-1А.

После того, как на стартовом AUG-кодоне оказывается собран 48S инициаторный комплекс, молекула GTP, связанная с eIF-2, подвергается гидролизу. Это событие происходит благодаря действию eIF-5. В результате все elFs высвобождаются с поверхности 40S рибосомной субчастицы, а затем происходит связывание последней с 60S субчастицей с образованием 80S инициаторного комплекса (рис.2, стадия д)). Сформированный 80S инициаторный комплекс вступает в фазу элонгации.

1.2 Внутренняя инициация трансляции.

Как упоминалось выше, помимо общепринятой сканирующей модели инициации трансляции, существует еще од�