Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Рубцова, Мария Петровна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2004
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи
Рубцова Мария Петровна
Свойства 5 -нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека
НЭР70
02.00.10 - биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2004
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.
Научный руководитель: д.х.н., гл.н.сотр. Шатский Иван Николаевич
Официальные оппоненты: д.х.н., проф. Карпова Галина Георгиевна
к.б.н., ст.н.сотр. Скулачев Максим Владимирович
Ведущая организация: Институт биоорганической химии
им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится 24 февраля 2004 г. в 1 500 на заседании Диссертационного
совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан 22 января 2004 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
2004-4 20054
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Современная модель инициации трансляции эукариотических мРНК предполагает, что 40S рибосомная субчастица совместно с факторами инициации связывает 5'-конец мРНК. Это связывание происходит за счет специфического взаимодействия фактора инициации elF4E с кеп-структурой (7-метилгуанозин, соединенный с 5'-концевым нуклеозидом 5'-5'-трифосфатной связью) мРНК. Затем 40S рибосомная субчастица "сканирует" мРНК до первого, находящегося в благоприятном нуклеотидном контексте, AUG-кодона. Расплетание вторичной структуры 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК при этом производят факторы инициации elF4A, elF4B и elF4G. После нахождения нужного инициаторного кодона к малой рибосомной субчастице присоединяется 60S субчастица, и образовавшийся 80S комплекс начинает синтез белка.
Описанная модель предъявляет определенные требования к структуре мРНК. Подавляющее большинство эукариотических мРНК кепированы, моноцистронны и содержат относительно короткие (50-100 нуклеотидов) и слабо структурированные 5'-НТО. Инициация трансляции таких мРНК происходит обычно на ближайшем к 5'-концу инициаторном AUG-кодоне. Такой механизм инициации называется кеп-зависимым. Оказалось, что к ряду мРНК этот механизм инициации трансляции неприменим в силу иного строения их 5'-НТО. Для таких мРНК была предложена модель внутренней (кеп-независимой) инициации трансляции. В соответствии с этой моделью 40S рибосомная субчастица связывается непосредственно с внутренним участком 5'-НТО мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы, или IRES (internal ribosome entry 8йе)-элементом. Впервые подобный механизм инициации трансляции был предложен для мРНК пикорнавирусов, 5'-НТО которых не кепированы, весьма протяженны, сильно структурированы и содержат до 11 AUG-триплетов, предшествующих истинному инициаторному кодону.
Впоследствии IRES-элементы обнаружили и в мРНК вирусов других групп. Синтез белка на вирусных мРНК обеспечивается трансляционным аппаратом инфицированной клетки млекопитающих, при этом используются канонические факторы инициации. Это послужило основанием для предположения, что некоторые клеточные мРНК также способны к внутренней инициации. Список мРНК млекопитающих, содержащих IRES-элементы, постоянно увеличивается и в настоящее время включает мРНК 50-60 белков, важных для роста, дифференцировки и функционирования клетки. Тем не менее, молекулярные механизмы внутренней инициации трансляции на IRES-элементах клеточных мРНК до сих пор не известны. Поиск новых IRES-элементов, а также изучение их строения и функционирования необходимы для выяснения механизмов внутренней инициации трансляции в целом.
Цель работы
Синтез белков теплового шока в клетках млекопитающих активируется при кратковременном повышении температуры до 42°С. При этом происходит снижение общего уровня белкового синтеза за счет инактивации кеп-связывающего фактора инициации трансляции elF4E. В этих условиях эффективность синтеза белков теплового шока не только не снижается, а наоборот, возрастает и остается повышенной в течение некоторого времени после возврата к нормальной температуре. Цель настоящей работы — изучение механизма инициации трансляции мРНК одного из белков теплового шока, HSP70, а также определение участков 5'-НТО мРНК НЭР70, важных для взаимодействия с трансляционным аппаратом клетки.
Научная новизна и практическая ценность
В настоящей работе впервые показано, что мРНК НЭР70 содержит IRES-элемент, активность которого в 4-5 раз выше активности IRES-элемента риновируса и сравнима. с активностью- IRES-элементов пикорнавирусов. Определены границы участка внутреннего связывания рибосомы и важные для инициации трансляции районы в .самом IRES-элементе. Полученные результаты имеют важное значение для
понимания молекулярных механизмов инициации трансляции мРНК млекопитающих. Накопление данных об IRES-элементах мРНК млекопитающих позволит понять механистические аспекты регуляции инициации белкового синтеза в клетках эукариот.
Публикации и апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в отечественных и международных журналах. Результаты работы докладывались на международных конференциях 'The Dynamics of Ribosome Structure and Function" (Queenstown, New Zealand. 27th January - 1st February, 2002), "8th Annual Meeting of the RNA Society" (Vienna, Austria. July 1 - July 6, 2003), III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, июнь-июль 2002), 'The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology" (Moscow, June 21 -26, 2001).
Структура и объем работы
Диссертация изложена на ^¡йграницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Содержит рисунков. Список литературы включает источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Свойства 5-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека
HSP70
Исследование способности мРНК HSP70 к внутренней инициации трансляции
При повышении температуры в клетках млекопитающих, происходит фосфорилирование кеп-связывающего фактора инициации трансляции elF4E. Фосфорилирование затрагивает аминокислотные остатки находящиеся в районе взаимодействия этого фактора с фактором elF4G, который служит своеобразным
мостиком между 4Е и группой факторов, связывающих мРНК. Кроме того происходит активация белков, связывающих и инактивирующих фактор инициации elF4E (4E-BP). Оба эти события приводят к подавлению белкового синтеза в клетке. В то же время существует немногочисленный класс белков, эффективность синтеза которых при и после теплового шока не только не падает, а резко возрастает. Эти белки, названные белками теплового шока (HSP), являются типичными шаперонами - они возвращают белкам, изменившим свою конформацию под действием тепловой денатурации, активную форму, а также способствуют ускоренной деградации дефектных белков.
Очевидно, что инициация синтеза белков теплового шока (и, в частности, HSP70) в гораздо меньшей степени зависит от кепа, чем инициация трансляции других клеточных матриц. Этот вывод подтверждается тем фактом, что мРНК белков теплового шока активно транслируются в системах с искусственно пониженным содержанием инициаторного фактора elF4E. Еще одним доводом в пользу наличия IRES-элемента в мРНК HSP70 является способность к внутренней инициации мРНК белка BiP - близкого гомолога HSP70, сходного с ним как по строению, так и по функции. Этот белок также относится к шаперонам, и его синтез активируется в условиях стресса.
Для исследования способности какой-либо нуклеотидной последовательности к внутренней посадке 40S рибосомной субчастицы применяют метод бицистронных конструкций (Pelletier J. et.al.1988, Jang S.K.et.al.1988). Схема этого метода приведена на рис. 1. В бицистронной конструкции две нуклеотидные последовательности, кодирующие разные репортерные белки, разделены нетранслируемым спейсером. В соответствии со сканирующей моделью инициации белкового синтеза у эукариот трансляция второго цистрона может осуществляться только по механизму реинициации ("проскок" рибосомы, присоединившей факторы инициации, с первого цистрона), т.е. такая трансляция должна быть крайне неэффективной (рис. 1 А). В том случае, когда между двумя цистронами находится нуклеотидная последовательность, содержащая участок внутреннего связывания рибосомы, эффективность трансляции второго цистрона резко усиливается (рис. 1 Б) и становится совершенно независимой
от трансляции первого цистрона (рис. 1 В). Этот подход широко использовали при доказательстве наличия IRES-элементов в РНК пикорнавирусов. При трансфекции в клетки млекопитающих или при трансляции in vitro контрольных плазмид (рис. 1А), трансляция второго - цистрона крайне неэффективна.- Однако, когда между двумя цистронами находилась 5'-НТО пикорнавирусной РНК (рис. 1Б), экспрессия второго цистрона становилась высокоэффективной. При появлении в последней конструкции перед первым цистроном стабильной шпилечной структуры, трудно поддающейся сканированию, трансляция первого цистрона практически полностью прекращалась, в то время как экспрессия второго цистрона оставалась на прежнем уровне (рис. 1 В).
— репортерный ген
А 5
J
1 ~~L_
-У
о
'— —. репортерный ген I ^¡^ рвпортсрныи^внаг^-
В 5- ' 3"
Рис. I. Схематическое изображение метода бицистронных конструкций. А - первый и второй цистроны разделены нетранслируемым спейсером, не способным к внутренней инициации, Б -в межцистронной области находится ГОЕ5-элемент, В - бицистронная конструкция содержит ШЕв-элемент между репортерными генами и шпилечную структуру перед первым из них. Стрелками показано направление движения 40$ рибосомных субчастиц по мРНК. Толщина стрелок отражает эффективность трансляции.
Для доказательства наличия в мРНК HSP70 участка внутреннего связывания рибосомы мы использовали бицистронную конструкцию на основе плазмиды рвЬЗЯ, содержащую гены люциферазы RenШa reinformis и люциферазы светлячка (Photinus pyralis), разделенные межцистронным спейсером (рис. 2). В межцистронную область
поместили фрагмент ДНК, соответствующий 5'-НТО мРНК НБР70. Контрольные конструкции содержали в межцистронной области полилинкер вектора (вектор), а также ИЗЕв-элемент РНК - вируса энцефаломиокардита, не содержащий - участок связывания фактора инициации е!Р4в (ЕМОЫ/мут). Такой мутантный ИЗЕв-элемент неспособен к внутренней инициации трансляции. Эти конструкции использовали в качестве контроля фоновой трансляции второго цистрона. Положительным контролем служила конструкция/ содержащая ИЗЕв-элемент. РНК риновируса человека (ИЯУ). Плазмиды трансфицировали кальций-фосфатным методом в клетки двух различных линий: 293Т - клетки эмбриональной почки человека, трансформированные аденовирусом, и ТЕ 671 - клетки саркомы поперечно-полосатых мышц. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и лизировали, после чего измеряли активность люцифераз.
£N40
ЗУ40 Гки люциферазы Геилюциферюы иотл
промотор ЯепШагеМогт свешни- лп^гш.^«»-. эвинсер.
Г ..... 1-|АИ6" ' БЪр]--{АШ1 : Ч- - ^ОрН^'ЛГ^}—" ■ - I
—' "" 5^-кетранслируемая обла^ " ' ~ а(аасддс1адсс1даддаддс{дс(дсдасад1ссас1ассШсдадад1дас{сссдНд(сссааддсйсссададсд аассЛд1дсддс1дсаддсассддссд(сдадИссддсд1ссддааддассдадс1сНс1сдсдда1ссад{дйссдШс садсссссааГОсададссдадссдасадададсадддаассддсАТОд
Рис. 2. Схематическое изображение бицистронной конструкции рСЬЗЯ, используемой в работе, и нуклеотидная последовательность 5'-нетранслируемой области мРНК Н$Р70 человека.
Активность люциферазы светлячка (второй цистрон) нормировали к активности люциферазы ИепШв reniformis (первый цистрон), что позволило сравнивать эффективность внутренней инициации независимо от эффективности трансфекции клеток. Степень трансфекции проверяли, измеряя активность р-галактозидазы, синтез
которой обеспечивался плазмидой (pCMVPgal), котрансфицированной с изучаемыми конструкциями. Эффективность внутренней инициации трансляции в случае 5'-НТО мРНК HSP70 оказалась в 4-5 раз выше, чем в случае IRES-элемента РНК риновируса независимо от типа клеток, и в 60-100 раз выше фоновой трансляции второго цистрона (рис. 3). Помимо присутствия IRES-элемента в межцистронной области существуют и другие возможные причины трансляции второго цистрона. Эффективный синтез люциферазы светлячка может происходить в случае реинициации трансляции на инициаторном кодоне второго цистрона, наличия криптического промотора в 5'-НТО, альтернативного сплайсинга или деградации мРНК. Для того чтобы исключить эти возможности, мы создали следующие конструкции: конструкцию, содержащую стабильную шпилечную структуру перед первым цистроном (hsp70h) (см. рис. 1) и конструкцию, не содержащую промотора, необходимого для транскрипции бицистронной мРНК в клетке (dSV40promoter). Эти конструкции трансфицировали в клетки 293Т и измеряли в них активности люцифераз.
Активность второго цистрона осталась прежней, а активность первого уменьшилась в 2,5 раза в случае введения шпилечной структуры перед первым геном (рис. 4). Таким образом, синтез люциферазы светлячка не обусловлен реинициацией трансляции.
В клетках, трансфицированных конструкцией, не содержащей промотор, активность обеих люцифераз отсутствовала (рис. 4). Это свидетельствует о том, что экспрессия второго цистрона обусловлена присутствием в межцистронной области IRES-элемента, а не связана с функционированием криптического промотора, приводящего к образованию моноцистронной мРНК, кодирующей Flue.
293Т
1| м
E a1
la
M
t §
11 6 -
109
L
26
J 1 3
EMCV вектор HRV hsp70
мут
ТЕ 671
<§■ ! «
EMCV вектор HRV. hsp70 мут
Рис. 3. Сравнение эффективности экспрессии второго цистрона в составе конструкций с разной структурой межцистронной области: НМСУмут содержит lRES-элемент РНК вируса энцефаломиокардита (принята за единицу), в состав которого не входит участок связывания e!F4G, вектор ~ полилинкер, HRV - IRES-элемент РНК риновируса, hsp70 ~ 5'-НТО мРНК HSP70. Приведено среднее значение эффективности трансляции, измеренной в трех независимых экспериментах.
Flue Rluc
а
ф ■&
s
г S с л ь и о
X
о
S
£ <
140 -120 , 100 100 —J-80 60 40 20 0
100 _1_
/ f ✓
J
100
43
/ / ф
Рис. 4. Экспрессия первого и второго цистронов в присутствии шпилечной структуры (конструкция Ь$р70Ь) и в отсутствие промотора (конструкция <15У40ргото1ег). Активность люцифераз в конструкции рСИЗЮ^рТО принята за 100%. Приведено среднее значение эффективности трансляции, измеренной в трех независимых экспериментах.
Третьей возможной причиной эффективной экспрессии второго цистрона может быть деградация в клетках бицистронной мРНК или альтернативный сплайсинг, в результате которого образуется одноцистронная матрица. Данное предположение проверяли с использованием метода защиты от рибонуклеаз (рис. 5). Синтезировали радиоактивно меченный зонд, комплементарный участку, содержащему концевую область первого цистрона (288 нуклеотидов), межцистронную область (216 нуклеотдов) и начало второго цистрона (122 нуклеотида). На концах зонда располагались дополнительные нуклеотидные последовательности, не комплементарные анализируемой РНК. Общая длина зонда составляла 728 нуклеотидов.
roG—
Радиоахтивно меченный [ ^PJUTP эонд(728п1;)
1 2 3 4 5 6
849 579
219
if
.РГ-Э^. "/fr
Рис. б. Проверка целостности бицистронной мРНК методом защиты от РНКазы. А — схематическое изображение бицистронной мРНК и меченого РНК-зонда. Б - радиоавтограмма полиакриламидного геля после разделения продуктов гидролиза РНКазами РНК-РНК-дуплексов. Дорожка М соответствует маркерам молекулярных масс; 1 -радиоактивный РНК-зонд; 2 - зонд, гибридизованный с РНК из клеток, трансфицированных pGL3Rhsp70, и обработанный РНКазой ONE; 3 - зонд, гибридизованный с РНК из нетрансфициро ванных клеток и обработанный рибонуклеазой (контроль); 4 - зонд, гибридизованный с тРНК из печени теленка (контроль); 5 - РНК-зонд, гидролизованный РНКазой ONE (контроль).
Из результатов опыта, приведенных на рис. 6, следует, что бицистронная мРНК в клетках сохраняет свою целостность. Суммарную РНК, выделенную из клеток, гибридизовали с полученным зондом и обрабатывали РНКазой, гидролизующей одноцепочечную РНК, после чего полученный дуплекс денатурировали и проводили электрофорез в лолиакриламидном геле (ПААГ)- На радиоавтографе зонд образует. зоны, соответствующие фрагментам,. защищенным мРНК от деградации рибонуклеазами. Если бицистронная мРНК в клетках не расщепляется, то на радиоавтографе будет одна зона (рис. 5, дорожка 1), равная по длине области комплементарности мРНК и зонда (в нашем случае 626 нуклеотидов), если же мРНК деградировала, то в соответствующей дорожке должны появляться фрагмент(ы) меньшей длины (рис. 5, дорожка 2).
Таким образом, эффективный синтез белка со второго цистрона обусловлен не реинициацией трансляции, не образованием моноцистронной РНК и не наличием критического промотора или альтернативного сплайсинга мРНК. Единственная возможность - способность 5'-НТО мРНК HSP70 к внутренней инициации трансляции. Из приведенных данных можно заключить, что мРНК HSP70 содержит ИЗЕв-элемент, активность которого сопоставима с активностью ИЗЕв-элементов пикорнавирусов.
Определение границ !РЕБ-злемента мРНК НЭР70
Для того чтобы локализовать ИЗЕв-элемент внутри 5'-НТО мРНК HSP70, мы создали набор бицистронных конструкций, содержащих в межцистронном участке фрагменты 5-НТО, укороченные с 5'-конца или содержащие внутренние делеции. На. рис. 7 схематически показаны положения и размеры делеций участков 5'-НТО мРНК HSP70. Все эти конструкции трансфицировали в клетки линии 293Т и измеряли активность люцифераз в лизатах этих клеток.
ВатН\ ВаП 216
вхлхтяггга 151 216
Я ;'ус4>сг» ¿1
151 216'
Ьзр70сЛ-9б Ь5р70с11-151
Рис. 7. Схематическое изображение 5'-НТО мРНК Н5Р70 и делеций в ней, используемых для определения границ 1КИ8-элсмента. Участки делеций выделены темным.
Результаты анализа представлены на рис. 8. Как видно из рисунка, ни одна из полученных конструкций не обеспечивала эффективную внутреннюю инициацию трансляции. Независимо от того, в какой части 5-НТО находилась делеция, эффективность трансляции второго цистрона резко падала. Минимальное 7-8-кратное падение уровня экспрессии второго цистрона наблюдается в случае удаления 50 51-концевых нуклеотидов (вариант Изр70С1-50). Все другие варианты делеций подавляют эффективность трансляции второго цистрона в еще большей степени. Показано, что вся 5'-НТО мРНК НЭР70 необходима и для эффективной трансляции моноцистронных конструкций (Умпив е! а1. 2001). Удаление разных участков (СМ23, С1-53, С54-213, (Л24-213, С184-213) 5ЧНТО мРНК НЭР70 приводило к полной инактивации трансляции этой матрицы в разных типах клеток, а при тепловом шоке наиболее эффективная трансляция наблюдалась в случае всей 5'-НТО. В этой работе проводили опыты по определению способности к внутренней иницации мРНК НЭР70, и, как следует из наших данных, пришли к ошибочному выводу, что ИЗЕв-элемент в ней отсутствует. Тем не менее, примечательно, что для эффективной трансляции
мРНК НЭР70 в составе как моноцистронной, так и бицистронной конструкций необходимы одни и те же участки.
Удаление больших участков 5-НТО мРНК без знания ее вторичной структуры может приводить к образованию совершенно новых 5"-НТО, не имеющих ничего общего с исходной природной структурой. Делеции небольших участков (20 нуклеотидов) также могут сказываться на структуре РНК, но, скорее всего, этот вклад будет меньшим, чем в первом случае. С целью более подробного анализа структуры ИЗЕв-элемента мРНК НЭР70 и характеристики функциональных центров в пределах участка внутреннего связывания рибосомы был получен набор бицистронных конструкций с делециями 20-30 нуклеотидов, перекрывающими практически всю 5'-НТО мРНК НЭР70. Схема таких делеционных вариантов приведена на рис. 9.
И$р70 Ьзр70с)1-23 И5р70ЬЗЗ-50 11Бр70с149-б8 Ьзр70<172-95
Зое1
ВатН1
Ва/1
1 216
1 23 216
'•.■■Кк гг С^^Ю-ЛГ
1 33 50 216
'. шмя.я.а _ г ^-г— - .
1 49 68 216
1 72 95 216
Изр70с196-117 «этюл^жаасодза:?:!
1 96 117
216
Ьзр70<Ш8-140 г-гаж-т. 1
Ьзр70<Л52176
1
118 140 216
г. . а.-. -.Ч-.ч ■ ; <. Я. "»'' "Т
152 176 216
Изр70с1177-206
1
177 206
Рис. 9. Схематическое изображение 5'-НТО мРНК Н5Р70 и делеций в ней, используемых для выявления функционально важных участков тЕЭ-элемента. Участки делеций выделены
Результаты определения люциферазной активности после трансфекции представлены на рис. 10. Из рис. 10 видно, что для проявления максимальной активности участка внутреннего связывания рибосом и эффективной экспрессии второго цистрона необходима полная 5'-НТО мРНК НБР70. Делеции даже небольших участков 5'-НТО негативно влияют на внутреннюю инициацию. Степень подавления трансляции второго цистрона варьирует довольно сильно в зависимости от положения делеции. Так, почти все 5'-концевые делеции, за исключением С133-50, оказывали незначительное влияние на синтез белка, а З'-концевые, наоборот, сильно подавляли трансляцию, вплоть до ее практически полной инактивации в случае делеции С151-176. Исходя из суммы полученных данных, можно предположить, что для эффективной работы участка внутреннего связывания рибосом мРНК НБР70
необходима полная или почти полная 5"-НТО с неравномерным распределением по ее длине функционально важных участков.
В работе (Yuen et. al., 2000) был изучен механизм инициации трансляции на мРНК HSP70 и трехчастного лидера аденовируса. Авторы пришли к выводу, что мРНК HSP70 не способна к внутренней инициации трансляции, а инициация на ней происходит по механизму шунтирования, и наиболее важную роль играют участки 96102 и 194-205 нуклеотидов. По мнению авторов, эти участки могут быть вовлечены в комплементарные взаимодействия с 18S рибосомной. РНК. По нашим данным делеции d96-117 и d177-206, которые захватывают эти участки, также сильно снижают эффективность трансляции и являются важными элементами участка внутреннего связывания рибосом, наряду со многими другими районами 5ЧНТО мРНК HSP70.
Обсуждая, однако, результаты широко используемого делеционного анализа, необходимо учитывать возможное влияние делеций на вторичную структуру мРНК. Негативные последствия делеции могут быть обусловлены не отсутствием какого-то
важного района, отвечающего за взаимодействие мРНК с трансляционным аппаратом, в частности с 40S рибосомной субчастицей, а нарушением вторичной структуры, необходимой для формирования IRES-элемента.
Суммируя полученные данные, можно высказать предположение о структурных особенностях IRES-элемента мРНК HSP70 и предложить возможную модель взаимодействия этой мРНК с аппаратом трансляции, альтернативную шунтирующей модели (Yuen et. al. 2000). Классические вирусные IRES-элементы имеют жесткую вторичную структуру и содержат отдельные и - сильно структурированные домены. В состав этих доменов входят высокослецифичные участки связывания канонических факторов инициации трансляции, мРНК-связывающих белков или 40S рибосомной субчастицы. Хорошо изучен пример трехмерного узнавания фактором elF4A участка, окружающего инициаторный AUG-кодон IRES-элемента EMCV. В случае этого IRES'a факторы инициации elF4F, elF4B, elF3 имеют строго фиксированные специфические места связывания и не могут присоединиться к мРНК в каких-либо других участках. IRES-элемент EMCV, по-видимому, имеет специфическую трехмерную конфигурацию, которая позволяет найти инициаторный триплет только в случае открытого "стартового окна". Именно поэтому удаление небольших участков, а иногда и точечные мутации в разных частях IRES-элементов пикорнавирусов полностью инактивируют их трансляцию. Как видно из наших данных, IRES-элемент мРНК HSP70 не относится к числу таких строго детерминированных структур. В этом случае только делеция участка 151-176 приводит- к почти полной инактивации трансляции,- а небольшие делеции других участков оказывают не столь значительный эффект. Можно предположить, что структура IRES-элемента мРНК HSP70 является не такой жесткой, как в случае вирусных IRES-элементов, а довольно лабильной и содержит избыточное количество мест связывания компонентов инициации трансляции. Тем не менее, мы выдвигаем гипотезу, что 5-НТО мРНК HSP70 способна к трехмерному (а не линейному, как в сканирующей модели Козак) узнаванию инициаторного кодона. Это предположение иллюстрирует модель, представленная на рис. 11. Согласно этой
модели трансляционный аппарат связывает 5'-НТО мРНК НБР70 одновременно в ее 5'- и З'-концевых участках, являющихся важными элементами структуры. Основным принципиальным моментом этого взаимодействия является трехмерная конфигурация 5'-НТО, благодаря которой происходит сближение инициаторного кодона и компонентов трансляции. Это предположение подтверждается эффектами, наблюдаемыми при удалении больших участков 5'-НТО. Их удаление может нарушать не только участки связывания аппарата-трансляции, но и влиять на пространственную конфигурацию ИЗЕв-элемента.
Следует специально подчеркнуть, что кеп-эависимый механизм инициации трансляции не исключает возможность трехмерного узнавания района инициации для мРНК, содержащей ИЗЕв-элемент. В этом случае, вероятно, взаимодействие с кепом необходимо для первоначального привлечения мРНК на рибосому, за. которым следует узнавание пространственной структуры И^ЕБ-элемента и локализация инициаторного Д1Ю-кодона.
Предлагаемая нами модель отличается от механизма шунтирования (см. выше). Согласно механизму шунтирования. первичное взаимодействие мРНК с аппаратом - инициации трансляции происходит посредством связывания кепа фактором е!Р4Е, после чего необходимо сканирование 5'-концевой части 5-НТО мРНК и последующее "перепрыгивание" в направлении инициаторного кодона. В случае ИЗЕв-элемента мРНК НБР70 наличие кепа необязательно, а сканирование последовательности, обогащенной остатками в и С на 62%, должно быть сильно затруднено. Предлагаемая модель позволяет также объединить кеп-зависимый и независимый механизмы инициации трансляции. В условиях, благоприятных для кеп-зависимой инициации трансляции, связывание мРНК с 40в- рибосомной субчастицей происходит за счет первичного взаимодействия е!Р4Е с кеп-структурой, в результате чего может увеличиваться скорость образования инициаторного комплекса. В условиях инактивации е!Р4Е возможно прямое взаимодействие с е!Р4в или какими-то другими компонентами, имеющими повышенное сродство к внутренним участкам 5-НТО этой матрицы.
Выводы
1. При помощи метода бицистронных конструкций впервые показано, что 5'-нетранслируемая область мРНК ИвР70 способна обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции, то есть содержит ИЗЕв-элемент.
2. Определены границы ИЗЕв-элемента мРНК ИвР70. Показано, что для максимальной эффективности внутренней инициации трансляции необходима полная 5'-нетранслируемая область мРНК.
3. Проведен делеционный анализ ИЗЕв-элемента ИвР70. Показано, что 5'-концевые делеции в меньшей степени подавляют инициацию трансляции, чем З'-концевые.
4. На основе полученных данных предложена трехмерная модель узнавания инициаторного кодона при инициации трансляции на 5'-НТО мРНК ИвР70.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Rubtsova M.P., Sizova D.V., Dmitriev S.E., Ivanov D.S., Prassolov V.S., Shatsky I.N. (2003) Distinctive properties of the 5'-untranslated region of human hsp70 mRNA. J. Biol. Chem., V. 278, N. 25. P. 22350-22536.
2. Dmitriev S.E., Pisarev A.V., Rubtsova M.P., Dunaevsky Y.E., Shatsky I.N. (2003) Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett., V. 533, N. 1-3, P. 99-104.
3. Дмитриев С.Е., Теренин И.М., Рубцова М.П., Шатский И.Н. (2003) Незначительные вариации вторичной структуры 5'-нетранслируемой мРНК В-глобина изменяют требования к концентрации фактора инициации elF2. Молекулярная биология, Т. 37, N
3. С. 494-504.
4. Rubtsova M.P., Sizova D.V., Ivanov D.S., Prassolov V.S., Merrick W.. Shatsky I.N. Identification and location of the internal ribosome entry site in the 5' noncoding region of the HSP70 mRNA. The Dynamics of Ribosome Structure and Function. Queenstown, New Zealand. 27th January - 1st February, 2002. Abstracts, p. 175.
5. Rubtsova M.P.. Ivanov D.S., Prassolov V.S., Shatsky I.N. Distinctive properties of the 51-untranslated region of human hsp70 mRNA. RNA 2003. 8th Annual Meeting of the RNA Society. Vienna, Austria. July 1 - July 6, 2003. Program & Abstracts, p. 406.
ООП МГУ. Заказ 8. Тираж 100
РНБ Русский фонд
2004-4 20054
Список сокращений ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Участки внутреннего связывания рибосомы клеточных мРНК
1.1. Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот
1.2. Внутренняя инициация трансляции
1.3. Инициация трансляции по механизму шунтирования
1.4. Метод поиска IRES-элементов
1.5. Участки внутреннего связывания клеточных мРНК
1.5.1. IRES-элемент мРНК BIP/GRP
1.5.2. IRES-элементы мРНК морфогенетических факторов Ultrabithorax и Antennapedia
1.5.3. IRES-элемент мРНК протоонкогена с-туе
1.5.4. IRES-элемент мРНК N-myc 25 pi 1.5.5. IRES-элемент мРНК AML1/RUNX
1.5.6. IRES-элемент мРНК NRF
1.5.7. IRES-элемент мРНК Smad
1.5.8. IRES-элемент мРНК аутоантигена La
1.5.9. IRES-элемент мРНК XIAP
1.5.10. IRES-элемент мРНК BAG
1.5.11. IRES-элемент мРНК Apaf-1 32 * 1.5.12. IRES-элемент мРНК FGF
1.5.13. IRES-элемент мРНК PDGF2/c-Sis
1.5.14. IRES-элемент мРНК VEGF
1.5.15. IRES-элемент мРНК PITSLRE
1.5.16. IRES-элемент мРНК р
1.5.17. IRES-элемент мРНК протеинкиназы С5 (РКС) 40 0 1.5.18. IRES-элемент мРНК рецептора IGF-I
1.5.19. IRES-элемент мРНК cat
1.5.20. IRES-элемент мРНК орнитиндекарбоксилазы
1.5.21. IRES-элементы других мРНК клеточных белков 45 IRES-элемент мРНК FMR1 45 IRES-элемент мРНК NDST 46 IRES-элемент мРНК Myt
IRES-элемент мРНК c-jun
IRES-элемент мРНК Mnt
IRES-элемент мРНК Nkx6.
IRES-элемент мРНК HIF-la
IRES-элемент мРНК DAP5/NAТ1/Р
IRES-элемент мРНК Сх
IRES-элемент мРНК Сх
IRES-элемент мРНК рецептора эстрогена а
IRES-элемент мРНК Kvl.
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP
2.1. Особенности инициации трансляции в условиях теплового шока
2.2. Исследование способности мРНК HSP70 к внутренней инициации трансляции
2.3. Определение границ IRES-элемента мРНК HSP
2.4. Делеционный анализ IRES-элемента мРНК HSP
2.5. Трехмерная модель узнавания инициаторного кодона при инициации трансляции на 5 '-НТО мРНК HSP
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Плазмидные конструкции, использованные для исследования способности 5'-НТО мРНК HSP70 к внутренней инициации
3.3. Плазмидные конструкции, использованные для исследования границ IRES-элемента мРНК HSP
3.4. Плазмидные конструкции, использованные для делеционного анализа IRES-элемента мРНК HSP
3.5. Клонирование
3.5.1. Рестрикция и выделение фрагмента ДНК в легкоплавкой агарозе
3.5.2. Лигирование
3.5.3. Полимеразная цепная реакция
3.6. Трансфекция клеток и измерение в них активности люцифераз и Р-галактозидазы
3.7. Определение целостности РНК методом защиты от рибонуклеаз 82 ВЫВОДЫ 85 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ мРНК матричная РНК
Met-tRNAj инициаторная тРНК рРНК рибосомная РНК
5'-НТО 5'-нетранслируемая область
IRES-элемент участок внутреннего связывания рибосомы elF эукариотический фактор инициации трансляции
HSP 70 белок теплового шока
АТР аденозин-5'-трифосфат
GTP гуанозин-5'-трифосфат
UTP уридин-5'-трифосфат
GDP гуанозин-5'-дифосфат
NTP рибонуклеозид-5'-трифосфат
ПААГ полиакриламидный гель
EDTA этилендиаминтетраацетат
HPRI ингибитор РНКаз из плаценты человека
BiP/GRP78 белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулинов/регулируемый глюкозой белок
NRF репрессор фактора NF-kB
XIAP Х-сцепленный ингибитор апоптоза
BAG-1 белок, ассоциированный с антиапоптотическим геном Вс
Apaf-1 фактор 1, активирующий апоптотические протеазы
FGF2 фактор роста фибробластов
PDGF2/c-Sis фактор роста тромбоцитов
VEGF фактор роста сосудистого эндотелия
IGF-I инсулиноподобный фактор роста I cat-1 переносчик катионных аминокислот
NDST гепарансульфат-А^-ацетилглюкозамин-//-деацетилазаЛУ-сульфотрансфераза
HIF-la индуцируемый гипоксией фактор la
DAP5/NAT1/P97 белок, ассоциированный с гибелью клеток
Сх коннексин
Модель инициации белкового синтеза в клетках эукариот, предложенная М. Козак [1], предполагает, что первоначально 40S рибосомная субчастица при участии факторов инициации узнает кеп-структуру на 5'-конце мРНК (кеп-структура представляет собой 7-метилгуанозин, соединенный с 5'-концевым нуклеозидом 5'-5' трифосфатной связью) и связывается с 5'-концевой областью мРНК (рис. 1). Затем 40S субчастица начинает скользить вдоль мРНК (при содействии инициаторных факторов, расплетающих вторичную структуру 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК), "сканируя" ее в поисках AUG-кодона, находящегося в благоприятном для инициации трансляции нуклеотидном контексте. После этого к 48S комплексу присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80S инициаторный комплекс начинает синтез белка. Данная модель механизма инициации трансляции называется кеп-зависимой или сканирующей.
Следует отметить, что даже если мРНК не содержит кеп-структуры (например, когда она получена с помощью стандартной Т7-транскрипции), ее трансляция в лизате ретикулоцитов кролика идет достаточно активно, уступая лишь в 2-3 раза эффективности трансляции природной кепированной матрицы. В этом случае 40S рибосомная субчастица также "садится" на 5'-конец моноцистронной молекулы эукариотической мРНК, поэтому данный механизм правильнее называть 5'-конец-зависимым. Согласно этой модели посадка 40S рибосомной субчастицы внутри цепи мРНК принципиально невозможна.
Описанная модель предъявляет определенные требования к строению мРНК. Так, подавляющее большинство эукариотических мРНК кепированы, моноцистронны, содержат относительно короткую (50-100 нуклеотидов) и слабо структурированную 5'-НТО. Инициация трансляции таких мРНК происходит, как правило, на ближайшем к 5'-концу AUG-кодоне. m Gpppи О
-УА
403 m Gppp m 7Gppp 7 у2
Рис. 1. Схематическое изображение сканирующей модели инициации трансляции эукариотических мРНК.
Впоследствии оказалось, что к ряду мРНК подобный механизм инициации синтеза белка неприменим в силу иного строения их 5'-НТО. Для таких мРНК была предложена модель внутренней (5'-конец-независимой) инициации трансляции. В соответствии с этой моделью 40S рибосомная субчастица связывается с внутренним участком 5'-НТО мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы или IRES-элементом (/nternal /fibosome Entry Site), который может отстоять от 5'-конца мРНК более чем на 100 нуклеотидных остатков. Впервые такой механизм инициации трансляции был предложен для мРНК пикорнавирусов [2,3,4], 5'-НТО которых не кепированы, весьма протяженны, сильно структурированы и содержат до 11 AUG-триплетов, предшествующих истинному инициаторному AUG-кодону.
Впоследствии IRES-элементы обнаружили и в мРНК вирусов других групп. В настоящий момент известно три типа IRES-элементов: тип I (полиовирус) — AUG-кодон отделен спейсером 50-100 нуклеотидов, тип II (EMCV) -- AUG-кодон входит в IRES, тип III (гепатит А) ~ не активен в составе бицистронной конструкции [5].
Белковый синтез на вирусных мРНК обеспечивается трансляционным аппаратом инфицированной клетки млекопитающих, при этом используются канонические факторы инициации. Это послужило основанием для предположения, что некоторые клеточные мРНК также способны к внутренней инициации. Список мРНК млекопитающих, содержащих IRES-элементы, постоянно растет и в настоящее время включает 50-60 мРНК, важных для роста, дифференцировки и функционирования клетки [6]. Тем не менее, молекулярные механизмы внутренней инициации трансляции клеточных IRES-элементов до сих пор неизвестны. Нахождение новых IRES-элементов, а также изучение их строения и функционирования позволит пролить свет на механизм внутренней инициации трансляции.
Для своей работы мы выбрали достаточно простую модель 5'НТО мРНК белка теплового шока человека HSP70. На основании тщательного анализа литературных данных мы пришли к выводу, что 5'НТО мРНК HSP70 должна обладать способностью к внутренней инициации трансляции не только при тепловом шоке, но и в условиях возврата к нормальной температуре. Действительно в условиях теплового шока подавляется активность кеп-связывающего инициаторного фактора eIF4E, что приводит к снижению эффективности кеп-зависимой инициации трансляции.
Очевидно, что инициация синтеза белков теплового шока (и, в частности, HSP70) в гораздо меньшей степени зависит от кепа, чем инициация трансляции других клеточных матриц. Этот вывод подтверждается тем фактом, что мРНК HSP активно транслируются в системах с искусственно пониженным содержанием инициаторного фактора eIF4E. Еще одним доводом в пользу наличия IRES-элемента в мРНК HSP70 является способность к внутренней инициации мРНК белка BiP -- близкого гомолога HSP70, сходного с ним как по строению, так и по функции. Этот белок также относится к шаперонам, и его синтез активируется в условиях стресса. Данная работа посвящена проверке этой гипотезы.
выводы
1. При помощи метода бицистронных конструкций впервые показано, что 5'-нетранслируемая область мРНК HSP70 способна обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции, то есть содержит IRES-элемент.
2. Определены границы IRES-элемента мРНК HSP70. Показано, что для максимальной эффективности внутренней инициации трансляции необходима полная 5'-нетранслируемая область мРНК.
3. Проведен делеционный анализ IRES-элемента HSP70. Показано, что 5'-концевые делеции в меньшей степени подавляют инициацию трансляции, чем 3'-концевые.
4. На основе полученных данных предложена трехмерная модель узнавания инициаторного кодона при инициации трансляции на 5'-НТО мРНК HSP70.
1. Kozak М. 1978. How do eukaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell. V.15, p.l 109-1123.
2. Pelletier J., Sonenberg N. 1988. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. V.334, p.320-325.
3. Jang S.K., Davies M.V., Kaufman R.J., Wimmer E. 1989. Initiation of protein synthesis by internal entry of ribosomes into the 5'nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA in vivo. J. Virol. V.63, p.1651-1660.
4. Sachs A.B., Sarnow P., Hentze M.W. 1997. Starting at the beginning, middle and the end: translation initiation in eukaryotes. Cell. V.89, p.831-838.
5. Bonnal S., Boutonnet C., Prado-Lourenco L., Vagner S. 2003. IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database. Nucleic Acids Res. V.31, p.427-428.
6. Voorma H.O., Thomas A. A.M., Van Heughten H.A.A. 1994. Initiation of protein synthesis in eukaryotes. Mol. Biol. Reports. V.19, p. 13 9-145.
7. Dever Т.Е. 2002. Gene-specific regulation by general translation factors. Cell. V.108, p.545-556.
8. Ehrenfeld E. 1996. Initiation of translation by picornavirus RNAs. In Translational Control (ed. Hershey JWB, Mathews MB, Sonenberg N), p.549-573. Cold Spring Harbor Laboratory . Press.
9. Jackson R. 2000. A comparative view of initiation site selection mechanisms. In Translational Control of Gene Expression (ed. Sonenberg N Hershey JWB Mathews MB) p. 127-183. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
10. Macejak D.G., SarnowP. 1991. Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature. V.353, p.90-94.
11. Yang Q., Sarnow P. 1997. Location of the internal ribosome entry site in the 5' non-coding region of the immunoglobulin heavy-chain binding protein (BiP) mRNA: evidence for specific RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. V.25, p.2800-2807.
12. Le S.Y., Maizel J.V. Jr. 1997. A common RNA structural motif involved in the internal initiation of translation of cellular mRNAs. Nucleic Acids Res. V.25, p.362-369.
13. Johannes G., Sarnow P. 1998. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. V.4, p. 15001513.
14. Kim Y.K., Hahm В., Jang S.K. 2000. Polypyrimidine tract-binding protein inhibits translation of bip mRNA. J. Mol. Biol. V.304, p.l 19-133.
15. Kim Y.K., Back S.H., Rho J., Lee S.H., Jang S.K. 2001. La autoantigen enhances translation of BiP mRNA. Nucleic Acids Res. V.29, p.5009-5016.
16. Kim Y.K., Jang S.K. 2002. Continuous heat shock enhances translational initiation directed by internal ribosomal entry site. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.297, p.224-231.
17. Oh S.K., Scott M.P., Sarnow P. 1992. Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5'-noncoding sequences that confer translational initiation by internal ribosome binding. Genes Dev. V.6, p. 1643-1653.
18. Ye X., Fong P., Iizuka N., Choate D., Cavener D.R. 1997. Ultrabithorax and Antennapedia 5' untranslated regions promote developmentally regulated internal translation initiation. Mol. Cell. Biol. V.17, p.1714-1721.
19. Evan G.I., Littlewood T.D. 1993. The role of с-myc in cell growth. Curr. Opin. Genet. Dev. V.3, p.44-49.
20. Blackwood E.M., Luscher В., Eisenman R.N. 1992. Мус and Max associate in vivo. Genes Dev. V.6, p.71-80.
21. Marcu K.B., Bossone S.A., Patel A.J. 1992. myc function and regulation. Annu. Rev. Biochem. V.61, p.809-860.
22. Bentley D.L., Groudine M. 1986. Novel promoter upstream of the human c-myc gene and regulation of c-myc expression in B-cell lymphomas. Mol. Cell. Biol. V.6, p.3481-3489.
23. Hann S.R., King M.W., Bentley D.L., Anderson C.W., Eisenman R.N. 1988. A non-AUG translational initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitt's lymphomas. Cell. V.52, p. 185-195.
24. Taylor M.V., Gusse M., Evan G.I., Dathan N., Mechali M. 1986. Xenopus myc proto-oncogene during development: expression as a stable maternal mRNA uncoupled from cell division. EMBOJ. V.5, p.3563-3570.
25. Gazin C., Dupont de Dinechin S., Hampe A., Masson J.M., Martin P., Stehelin D., Galibert F. 1984. Nucleotide sequence of the human c-myc locus: provocative open reading frame within the first exon. EMBOJ. V.3, p.383-387.
26. Gazin C., Rigolet M., Briand J.P., van Regenmortel M.H.V., Galibert F. 1986. Immunochemical detection of proteins related to the human c-myc exon 1. EMBOJ. V.5, p.2241-2250.
27. Paulin F.E., Chappell S.A., Willis A.E. 1998. A single nucleotide change in the c-myc internal ribosome entry segment leads to enhanced binding of a group of protein factors. Nucleic Acids Res. V.26, p.3097-3103.
28. Nanbru C., Lafon I., Audigier S., Gensac M.C., Vagner S., Huez G., Prats A.C. 1997. Alternative translation of the proto-oncogene c-myc by an internal ribosome entry site. J. Biol. Chem. V.272, N.51, p.2061-2066.
29. Hann S.R., Thompson C.B. Eisenman R.N. 1985. c-myc oncogene protein synthesis is independent of the cell cycle in human and avian cells. Nature. V.314, p.366-369.
30. Stoneley M., Paulin F.E., Le Quesne J.P., Chappell S.A., Willis A.E. 1998. C-Myc 5' untranslated region contains an internal ribosome entry segment. Oncogene. V.16, p.423-428.
31. Carter P.S., Jarquin-Pardo M., De Benedetti A. 1999. Differential expression of Мус 1 and Myc2 isoforms in cells transformed by eIF4E: evidence for internal ribosome repositioning in the human c-myc 5TJTR. Oncogene. V.18, p.4326-4335.
32. Henis-Korenblit S., Shani G., Sines Т., Marash L., Shohat G., Kimchi A. 2002. The caspase-cleaved DAP5 protein supports internal ribosome entry site-mediated translation of death proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. V.99, p.5400-5405.
33. Stoneley M., Chappell S.A., Jopling C.L., Dickens M., MacFarlane M., Willis A.E. 2000. c-Myc protein synthesis is initiated from the internal ribosome entry segment during apoptosis. Mol. Cell. Biol. V.20,p.l 162-1169.
34. Le Quesne J.P., Stoneley M., Fraser G.A., Willis A.E. 2001. Derivation of a structural model for the c-myc IRES. J. Mol. Biol. V.310, p.l 11-126.
35. Kim J.H., Paek K.Y., Choi K., Kim T.D., Hahm В., Kim K.T., Jang S.K. 2003. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein С modulates translation of c-myc mRNA in a cell cycle phase-dependent manner. Mol. Cell. Biol. V.23, p.708-720.
36. Subkhankulova Т., Mitchell S.A., Willis A.E. 2001. Internal ribosome entry segment-mediated initiation of c-Myc protein synthesis following genotoxic stress. Biochem J. V.359, p.183-192.
37. Stanton B.R., Perkins A.S., Tessarollo L., Sassoon D.A., Parada L.F. 1992. Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop. Genes Dev. V.6, p.2235-2247.
38. Jopling C.L., Willis A.E. 2001. N-myc translation is initiated via an internal ribosome entry segment that displays enhanced activity in neuronal cells. Oncogene. V.20, p.2664-2670.
39. Kagoshima H., Shigesada K., Satake M., Ito Y., Miyoshi H., Ohki M., Pepling M., Gergen P. 1993. The runt domain identifies a new family of heteromeric DNA-binding transcriptional regulatory proteins. Trends Genet. V.9, p.338-341.
40. Ghozi M.C., Bernstein Y., Negreanu V., Levanon D., Groner Y. 1996. Expression of the human acute myeloid leukemia gene AML1 is regulated by two promoter regions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.93, p. 1935-1940.
41. Nourbakhsh M., Hauser H. 1997. The transcriptional silencer protein NRF: a repressor of NF-kappaB enhancers. Immunobiology. V.198. p.65-72.
42. Oumard A., Hennecke M., Hauser H., Nourbakhsh M. 2000. Translation of NRF mRNA is mediated by highly efficient internal ribosome entry. Mol. Cell. Biol. V.20, p.2755-2759.
43. Wang S.I., Mukhtar H. 2002. A high-efficiency translational control element with potential for cancer gene therapy. Int. J. Oncol. V.20, p. 1269-1274.
44. Shiroki K., Ohsawa C., Sugi N., Wakiyama M., Miura K., Watanabe M., Suzuki Y., Sugano S. 2002. Internal ribosome entry site-mediated translation of Smad5 in vivo: requirement for a nuclear event. Nucleic Acids Res. V.30, p.2851-2861.
45. Alspaugh M.A., Tan E.M. 1975. Antibodies to cellular antigens in Sjogren's syndrome. J. Clin. Invest. V.55, p. 1067-1073.
46. Mattioli M., Reichlin M. 1974. Heterogeneity of RNA protein antigens reactive with sera of patients with systemic lupus erythematosus. Description of a cytoplasmic nonribosomal antigen. Arthritis Rheum. V.17, p.421-429.
47. Tan E.M. 1989. Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. V.44, p.93-151.
48. Van Horn D.J., Yoo C.J., Xue D., Shi H., Wolin S.L. 1997. The La protein in Schizosaccharomyces pombe: a conserved yet dispensable phosphoprotein that functions in tRNA maturation. RNA. V.3, p.1434-1443.
49. Yoo C.J., Wolin S.L. 1994. La proteins from Drosophila melanogaster and Saccharomyces cerevisiae: a yeast homolog of the La autoantigen is dispensable for growth. Mol. Cell. Biol. V.14, p.5412-5424.
50. Rinke J., Steitz J.A. 1982. Precursor molecules of both human 5S ribosomal RNA and transfer RNAs are bound by a cellular protein reactive with anti-La lupus antibodies. Cell. V.29, p.149-159.
51. Rinke J., Steitz J.A. 1985. Association of the lupus antigen La with a subset of U6 snRNA molecules. Nucleic Acids Res. V.13, p.2617-2629.
52. Chambers J.C., Kurilla M.G., Keene J.D. 1983. Association between the 7 S RNA and the lupus La protein varies among cell types. J. Biol. Chem. V.258, p.l 1438-11441.
53. Meerovitch K., Svitkin Y.V., Lee H.S., Lejbkowicz F., Kenan D.J., Chan E.K., Agol V.I., Keene J.D., Sonenberg N. 1993. La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J. Virol. V.67, p.3798-3807.
54. Carter M.S., Sarnow P. 2000. Distinct mRNAs that encode La autoantigen are differentially expressed and contain internal ribosome entry sites. J. Biol. Chem. V.275, p.28301-28307.
55. Han J., Sabbatini P., Perez D., Rao L., Modha D., White E. 1996. The El В 19K protein blocks apoptosis by interacting with and inhibiting the p53-inducible and death-promoting Bax protein. Genes Dev. V.10, p.461-477.
56. Deveraux Q.L., Reed J.C. 1999. IAP family proteins-suppressors-of apoptosis. Genes Dev. V.13, p.239-252.
57. LaCasse E.C., Baird S., Korneluk R.G., MacKenzie A.E. 1998. The inhibitors of apoptosis (IAPs) and their emerging role in cancer. Oncogene. V.17, p.3247-3259.
58. Liston P., Young S.S., Mackenzie A.E., Korneluk R.G. 1997. Life and death decisions: the role of the IAPs in modulating programmed cell death. Apoptosis. V.2, p.423-441.
59. Holcik M., Lefebvre C., Yeh C., Chow Т., Korneluk R.G. 1999. A new internal-ribosome-entry-site motif potentiates XIAP-mediated cytoprotection. Nat. Cell. Biol. V.l, p. 190-192.
60. Holcik M., Korneluk R.G. 2000. Functional characterization of the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) internal ribosome entry site element: role of La autoantigen in XIAP translation. Mol. Cell. Biol. V.20, p.4648-4657.
61. Holcik M., Gordon B.W., Korneluk R.G. 2003. The internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic protein XIAP is modulated by the heterogeneous nuclear ribonucleoproteins CI and C2. Mol. Cell. Biol. V.23, p.280-288.
62. Chau B.N., Cheng E.H.-Y., Kerr D.A., Hardwick J.M. 2000. Aven, a novel inhibitor of caspase activation, binds Bcl-xL and Apaf-1. Mol. Cell. V.6, p.31—40.
63. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. 1999. An APAF-1.cytochrome с multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J. Biol. Chem. V.274, p. 11549-11556.
64. Coldwell M.J., Mitchell S.A., Stoneley M., MacFarlane M., Willis A.E. 2000. Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry. Oncogene. V.l9, p.899-905.
65. Mitchell S.A., Spriggs K.A., Coldwell M.J., Jackson R.J., Willis A.E. 2003. The Apaf-1 internal ribosome entry segment attains the correct structural conformation for function via interactions with PTB and unr. Mol. Cell. V.l 1, p.757-771.
66. Packham G., Brimmell M., Cleveland J.L. 1997. Mammalian cells express two differently localized Bag-1 isoforms generated by alternative translation initiation. BiochemJ. V.328, p.807-813.
67. Takayama S., Sato Т., Krajewski S., Kochel K., Irie S., Millan J.A., Reed J.C. 1995. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. V.80, p.279-284.
68. Wang H.G., Takayama S., Rapp U.R., Reed J.C. 1996. Bcl-2 interacting protein, BAG-1, binds to and activates the kinase Raf-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.93, p.7063-7068.
69. Nollen E.A., Brunsting J.F., Song J., Kampinga H.H., Morimoto R.I. 2000. Bagl functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. V.20, p.1083-1088.
70. Coldwell M.J., deSchoolmeester M.L., Fraser G.A., Pickering B.M., Packham G., Willis A.E. 2001. The p36 isoform of BAG-1 is translated by internal ribosome entry following heat shock. Oncogene. V.20, p.4095-4100.
71. Pickering B.M., Mitchell S.A., Evans J.R., Willis A.E. 2003. Polypyrimidine tract binding protein and poly r(C) binding protein 1 interact with the BAG-1 IRES and stimulate its activity in vitro and in vivo. Nucleic Acids Res. V.31, p.639-646.
72. Vagner S., Gensac M.C., Maret A., Bayard F., Amalric F., Prats H., Prats A.C. 1995. Alternative translation of human fibroblast growth factor 2 mRNA occurs by internal entry of ribosomes. Mol. Cell. Biol. V. 15, p.35-44.
73. Florkiewicz R.Z., Sommer A. 1989. Human basic fibroblast growth factor gene encodes four polypeptides: three initiate translation from non-AUG codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.86, p.3978-3981.
74. Bugler В., Amalric F., Prats H. 1991. Alternative initiation of translation determines cytoplasmic or nuclear localization of basic fibroblast growth factor. Mol. Cell. Biol. V.l 1, p.573-577.
75. Renko M., Quarto N., Morimoto Т., Rifkin D.B. 1990. Nuclear and cytoplasmic localization of different basic fibroblast growth factor species. J. Cell. Physiol. V.l 44, p. 108-114.
76. Creancier L., Morello D., Mercier P., Prats A.C. 2000. Fibroblast growth factor 2 internal ribosome entry site (IRES) activity ex vivo and in transgenic mice reveals a stringent tissue-specific regulation. J. Cell. Biol. V.l50, p.275-281.
77. Bernstein J., Sella 0., Le S.Y., Elroy-Stein O. 1997. PDGF2/c-sis mRNA leader contains a differentiation-linked internal ribosomal entry site (D-IRES). J. Biol. Chem. V.272, p.9356-9362.
78. Sella O., Gerlitz G., Le S.Y., Elroy-Stein O. 1999. Differentiation-induced internal translation of c-sis mRNA: analysis of the cis elements and their differentiation-linked binding to the hnRNP С protein. Mol. Cell. Biol. V.19, p.5429-5440.
79. Stein I., Itin A., Einat P., Skaliter R., Grossman Z., Keshet E. 1998. Translation of vascular endothelial growth factor mRNA by internal ribosome entry: implications for translation under hypoxia. Mol. Cell. Biol V.18, p.3112-3119.
80. Miller D.L., Dibbens J.A., Damert A., Risau W., Vadas M.A., Goodall G.J. 1998. The vascular endothelial growth factor mRNA contains an internal ribosome entry site. FEBS Lett. V.434, p.417-420.
81. Huez I., Creancier L., Audigier S., Gensac M.C., Prats A.C., Prats H. 1998. Two independent internal ribosome entry sites are involved in translation initiation of vascular endothelial growth factor mRNA. Mol. Cell. Biol. V.18, p.6178-6190.
82. Gururajan R., Lahti J.M., Grenet J., Easton J., Gruber I., Ambros P.F., Kidd V.J. 1998. Duplication of a genomic region containing the CdcLI-2 and MMP21-22 genes on human chromosome lp36.3 and their linkage to D1Z2. Genome Res. V.8, p.929-939.
83. Bunnell В.A., Heath L.S., Adams D.E., Lahti J.M., Kidd V.J. 1990. Increased expression of a 58-kDa protein kinase leads to changes in the CHO cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.87, p.7467-7471.
84. Lahti J.M., Xiang J., Heath L.S., Campana D., Kidd V.J. 1995. PITSLRE protein kinase activity is associated with apoptosis. Mol. Cell. Biol. V.15, p.1-11.
85. Meyerson M., Enders G.H., Wu C.L., Su L.K., Gorka C., Nelson C., Harlow E., Tsai L.H. 1992. A family of human cdc2-related kinases. EMBO J. V.l 1, p.2909-2917.
86. Cornelis S., Bruynooghe Y., Denecker G., Van Huffel S., Tinton S., Beyaert R. 2000. Identification and characterization of a novel cell cycle-regulated internal ribosome entry site. Mol. Cell. V.5, p.597-605.
87. Clurman B.E., Porter P. 1998. New insights into the tumor suppression function of P27(kipl). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.95, p.15158-15160.
88. Dahia P.L., Aguiar R.C., Honegger J., Fahlbush R., Jordan S., Lowe D.G., Lu X., Clayton R.N., Besser G.M., Grossman A.B. 1998. Mutation and expression analysis of the p27/kipl gene in corticotrophin-secreting tumours. Oncogene. V.l6, p.69-76.
89. Ferrando A.A., Balbin M., Pendas A. M., Vizoso F., Velasco G., Lopez-Otin C. 1996. Mutational analysis of the human cyclin-dependent kinase inhibitor p27kipl in primary breast carcinomas. Hum. Genet. V.97, p.91-94.
90. Lloyd R.V., Erickson L.A., Jin L., Kulig E., Qian X., Cheville J.C., Scheithauer B.W. 1999. p27kipl: a multifunctional cyclin-dependent kinase inhibitor with prognostic significance in human cancers. Am. J. Pathol. V.l54, p.313-323.
91. Ponce-CastanedaM.V., LeeM.H., LatresE., Polyak K., Lacombe L., Montgomery K., Mathew S., Krauter K., Sheinfeld J., Massague J. 1995. p27Kipl: chromosomal mapping to 12pl2-12pl3.1 and absence of mutations in human tumors. Cancer Res. V.55, p.1211-1214.
92. Miskimins W.K., Wang G., Hawkinson M., Miskimins R. 2001. Control of cyclin-dependent kinase inhibitor p27 expression by cap-independent translation. Mol. Cell. Biol. V.21, p.4960-4967.
93. Kullmann M., Gopfert U., Siewe В., Hengst L. 2002. ELAV/Hu proteins inhibit p27 translation via an IRES element in the p27 5'UTR. Genes Dev. V.16, p.3087-3099.
94. Nishizuka Y. 1992. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science. V.258, p.607-614.
95. Dekker L.V., Parker P. J. 1994. Protein kinase С—a question of specificity. Trends Biochem. Sci. V. 19, p.73-77.
96. Mellor H., Parker P. J. 1998. The extended protein kinase С superfamily. Biochem. J. V.332, p.281-292.
97. Cacace A.M., Guadagno S.N., Krauss R.S., Fabbro D., Weinstein I.B. 1993. The epsilon isoform of protein kinase С is an oncogene when overexpressed in rat fibroblasts. Oncogene. V.8, p.2095-2104.
98. Perletti G.P., Folini M., Lin H.C., Mischak H., Piccinini F., Tashjian A.H.J. 1996. Overexpression of protein kinase Ce is oncogenic in rat colonic epithelial cells. Oncogene. V.12, p.847-854.
99. Morrish B.C., Rumsby M.G. 2002. The 5' untranslated region of protein kinase Cdelta directs translation by an internal ribosome entry segment that is most active in densely growing cells and during apoptosis. Mol Cell Biol. V.22, p.6089-6099.
100. Werner H, Adamo M, Roberts CT Jr, LeRoith D. 1994. Molecular and cellular aspects of insulin-like growth factor action. Vitam Horm. V.48, p. 1-58.
101. Jones J.I., Clemmons D.R. 1995. Insulin-like growth factor (IGF)-binding proteins inhibit the smooth muscle cell migration responses to IGF-I and IGF-II. Endocrinology. V.l36. p.4168-4173.
102. Werner H., Stannard В., Bach M.A., LeRoith D., Roberts C.T. 1990. Cloning and characterization of the proximal promoter region of the rat insulin-like growth factor I (IGF-I) receptor gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.l69, p. 1021-1027.
103. Giraud S., Greco A., Brink M., Diaz J.J., Delafontaine P. 2001. Translation initiation of the insulin-like growth factor I receptor mRNA is mediated by an internal ribosome entry site. J. Biol. Chem. V.276, p.5668-5675.
104. Hyatt S.L., Aulak K.S., Malandro M., Kilberg M.S., Hatzoglou M. 1997. Adaptive regulation of the cationic amino acid transporter-1 (Cat-1) in Fao cells. J. Biol Chem. V.272, p.19951-19957.
105. Fernandez J., Yaman I., Mishra R., Merrick W.C., Snider M.D., Lamers W.H., Hatzoglou M. 2001. Internal ribosome entry site-mediated translation of a mammalian mRNA is regulated by amino acid availability. J. Biol. Chem. V.276, p. 12285-12291.
106. Fredlund J.O., Johansson M.C., Dahlberg E., Oredsson S.M. 1995. Ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase expression during the cell cycle of Chinese hamster ovary cells. Exp. Cell Res. V.2I6, p.86-92.
107. Norbury C., Nurse P. 1992. Animal cell cycles and their control. Annu. Rev. Biochem. V.61, p.441-470.
108. Fan H., Penman S. 1970. Regulation of protein synthesis in mammalian cells. J. Mol. Biol. V.50, p.655-670.
109. Tarnowka M.A., Baglioni C. 1979. Regulation of protein sythesis in mitotic HeLa cells. J. Cell. Physiol. V.99, p.359-368.
110. Bonneau A.M., Sonenberg N. 1987. Involvement of the 24-kDa cap-binding protein in regulation of protein synthesis in mitosis. J. Biol Chem. V.262, p.l 1134-11139.
111. Shantz L.M., Pegg A.E. 1999. Translational regulation of ornithine decarboxylase and other enzymes of the polyamine pathway. Int. J. Biochem. Cell. Biol. V.31, p. 107-122.
112. Wen L., Huang J.K., Blackshear P.J. 1989. Rat ornithine decarboxylase gene. Nucleotide sequence, potential regulatory ele- ments, and comparison to the mouse gene. J. Biol. Chem. V.264, p.9016-9021.
113. Pyronnet S., Pradayrol L., SonenbergN. 2000. A cell cycle-dependent internal ribosome entry site. Mol. Cell. V.5, p.607-616.
114. Hagerman R.J. 1999. Neurodevelopmental Disorders: Diagnosis and Treatment, p. 61-132, Oxford University Press, New York.
115. Oberle I., Rousseau F., Heitz D., Kretz C., Devys D., Hanauer A., Boue J., Bertheas M.F., Mandel J.L. 1991. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. V.252, p. 1097-1102.
116. Pieretti M., Zhang F.P., Fu Y.H., Warren S.T., Oostra B.A., Caskey C.T., Nelson D.L. 1991. Absence of expression of the FMR-1 gene in fragile X syndrome. Cell. V.66, p.817-822.
117. Sutcliffe J.S., Nelson D.L., Zhang F., Pieretti M., Caskey C.T., Saxe D., Warren S.T. 1992. DNA methylation represses FMR-1 transcription in fragile X syndrome. Hum. Mol. Genet. V.l, p.397-400.
118. Devys D., Lutz Y., Rouyer N., Bellocq J.P., Mandel J.L. 1993. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat. Genet. V.4, p.335-340.
119. Tassone F., Hagerman R.J., Loesch D.Z., Lachiewicz A., Taylor A.K., Hagerman P.J. 2000. Fragile X males with unmethylated, full mutation trinucleotide repeat expansions have elevated levels of FMR1 messenger RNA. Am. J. Med. Genet. V.94, p.232-236.
120. Tassone F., Hagerman R.J., Taylor A.K., Gane L.W., Godfrey Т.Е., Hagerman P.J. 2000. Elevated levels of FMR1 mRNA in carrier males: a new mechanism of involvement in the fragile-X syndrome. Am. J. Hum. Genet. V.66, p.6-15.
121. Tassone F., Hagerman R.J., Chamberlain W.D., Hagerman P J. 2000. Transcription of the FMR1 gene in individuals with fragile X syndrome. Am. J. Med. Genet. V.97, p. 195-203.
122. Tassone F., Hagerman R.J., Taylor A.K., Hagerman P.J. 2001. A majority of fragile X males with methylated, full mutation alleles have significant levels of FMR1 messenger RNA. J. Med. Genet. V.38, p.453-456.
123. Chiang P.W., Carpenter L.E., Hagerman P.J. 2001. The 5'-untranslated region of the FMR1 message facilitates translation by internal ribosome entry. J. Biol. Chem. V.276, p.37916-37921.
124. Hashimoto Y., Orellana A., Gil G., Hirschberg C.B, 1992. Molecular cloning and expression of rat liver N-heparan sulfate sulfotransferase. J. Biol. Chem. V.267, p.l 5744-15750.
125. Orellana A., Hirschberg C.B., Wei Z., Swiedler S.J., Ishihara M. 1994. Molecular cloning and expression of a glycosaminoglycan N-acetylglucosaminyl N-deacetylase/N-sulfotransferase from a heparin-producing cell line. J. Biol. Chem. V.269, p.2270-2276.
126. Eriksson I., Sandback D., Ek В., Lindahl U., Kjellen L. 1994. cDNA cloning and sequencing of mouse mastocytoma glucosaminyl N-deacetylase/N-sulfotransferase, an enzyme involved in the biosynthesis of heparin. J. Biol Chem. V.269, p. 10438-10443.
127. Aikawa J., Esko J.D. 1999. Molecular cloning and expression of a third member of the heparan sulfate/heparin GIcNAc N-deacetylase/ N-sulfotransferase family. J. Biol Chem. V.274, p.2690-2695.
128. Aikawa J., Grobe K., Tsujimoto M., Esko J.D. 2001. Multiple isozymes of heparan sulfate/heparin GlcNAc N-deacetylase/GlcN N-sulfotransferase. Structure and activity of the fourth member, NDST4. J. Biol. Chem. V.276, p.5876-5882.
129. Fan G., Xiao L., Cheng L., Wang X., Sun В., Hu G. 2000. Targeted disruption of NDST-1 gene leads to pulmonary hypoplasia and neonatal respiratory distress in mice. FEBS Lett. V.467, p.7-11.
130. Forsberg E., Pejler G., Ringvall M., Lunderius C., Tomasini-Johansson В., Kusche-Gullberg M., Eriksson I., Ledin J., Hellman L., Kjellen L. 1999. Abnormal mast cells in mice deficient in a heparin-synthesizing enzyme. Nature. V.400, p.773-776.
131. Humphries D.E., Wong G.W., Friend D.S., Gurish M.F., Qiu W.T., Huang C.F., Sharpe A.H., Stevens R.L. 1999. Heparin is essential for the storage of specific granule proteases in mast cells. Nature. V.400, p.769-772.
132. Grobe K., Esko J.D. 2002. Regulated translation of heparan sulfate N-acetylglucosamine N-deacetylase/n-sulfotransferase isozymes by structured 5'-untranslated regions and internal ribosome entry sites. J. Biol. Chem. V.277, p.30699-30706.
133. Angel P., Allegretto E.A., Okino S.T., Hattori K., Boyle W.J., Hunter Т., Karin M. 1988. Oncogene jun encodes a sequence-specific trans-activator similar to AP-1, Nature. V.332, p.166-171.
134. Bohmann D., Bos T.J., Admon A., Nishimura Т., Vogt P.K., Tjian R. 1987. Human proto-oncogene c-jun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1. Science. V.238, p.1386-1392.
135. Vogt P.K., Bos T.J. 1990. C-jun: oncogene and transcription factor. Adv. Cancer Res. V.55, p.1-35.
136. Sehgal A., Briggs J., Rinehart-Kim J., Basso J., Bos T.J. 2000. The chicken c-Jun 51 untranslated region directs translation by internal initiation. Oncogene. V.19, p.2836-2845.
137. Schreiber-Agus N., DePinho R.A. 1998. Repression by the Mad(MxiI)-Sin3 complex. Bioessays. V.20, p.808-818.
138. Stoneley M., Spencer J.P., Wright S.C. 2001. An internal ribosome entry segment in the 5' untranslated region of the mnt gene. Oncogene. V.20, p.893-897.
139. Oster A., Jensen J., Serup P., Galante P., Madsen O.D., Larsson L.I. 1998. Rat endocrine pancreatic development in relation to two homeobox gene products (Pdx-1 and Nkx 6.1). J. Histochem. Cytochem. V.46, p.707-715.
140. Ahlgren U., Jonsson J., Jonsson L., Simu K., Edlund H. 1998. Beta-cell-specific inactivation of the mouse Ipfl/Pdxl gene results in loss of the beta-cell phenotype and maturity onset diabetes Genes Dev. V.12, p. 1763-1768.
141. Watada H., Mirmira R.G., Leung J., German M.S. 2000. Transcriptional and translational regulation of beta-cell differentiation factor Nkx6.1. J. Biol. Chem. V.275, p.34224-34230.
142. Amellem O., Pettersen E.O. 1991. Cell inactivation and cell cycle inhibition as induced by extreme hypoxia: the possible role of cell cycle arrest as a protection against hypoxia-induced lethal damage. Cell Prolif. V.24, p.127-141.
143. Schmaltz С., Hardenbergh P.H., Wells A., Fisher D.E. 1998. Regulation of proliferation-survival decisions during tumor cell hypoxia. Mol. Cell Biol. V.l8, p.2845-2854.
144. Kraggerud S.M., Sandvik J. A., Pettersen E.O. 1995. Regulation of protein synthesis in human cells exposed to extreme hypoxia. Anticancer Res. V.l5, p.683-686.
145. Tinton S.A., Buc-Calderon P.M. 1999. Hypoxia increases the association of 4E-binding protein 1 with the initiation factor 4E in isolated rat hepatocytes. FEBS Lett. V.446, p.55-59.
146. Shweiki D., Itin A., Soffer D., Keshet E. 1992. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. V.359, p.843-845.
147. Ladoux A., Frelin C. 1993. Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor mRNA expression in the heart. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.l95, p. 1005-1010.
148. Lang K.J., Kappel A., Goodall G.J. 2002. Hypoxia-inducible factor-lalpha mRNA contains an internal ribosome entry site that allows efficient translation during normoxia and hypoxia. Mol. Biol. Cell. V.13,p.l792-1801.
149. Yamanaka S., Poksay K.S., Arnold K.S., Innerarity T.L. 1997. A novel translational repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the transgene expression of the apoB mRNA-editing enzyme. Genes Dev. V.l 1, p.321-333.
150. Henis-Korenblit S., StrumpfN.L., Goldstaub D., Kimchi A. 2000. A novel form of DAP5 protein accumulates in apoptotic cells as a result of caspase cleavage and internal ribosome entry site-mediated translation. Mol. Cell. Biol. V.20, p.496-506.
151. Henis-Korenblit S., Shani G., Sines Т., Marash L., Shohat G., Kimchi A. 2002. The caspase-cleaved DAP5 protein supports internal ribosome entry site-mediated translation of death proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.99, p.5400-5405.
152. Kanter H.L., Saffitz J.E., Beyer E.C. 1992. Cardiac myocytes express multiple gap junction proteins. Circ Res. V.70, p.438-44.
153. Schiavi A., Hudder A., Werner R. 1999. Connexin43 mRNA contains a functional internal ribosome entry site. FEBS Lett. V.464, p. 118-22.
154. Neuhaus I.M., Dahl G., Werner R. 1995. Use of alternate promoters for tissue-specific expression of the gene coding for connexin32. Gene. V.158, p.257-262.
155. Bergoffen J., Scherer S.S., Wang S., Scott M.O., Bone L.J., Paul D.L., Chen K., Lensch M.W., Chance P.F., Fischbeck K.H. 1993. Connexin mutations in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Science. V.262, p.2039-2042.
156. Hudder A., Werner R. 2000. Analysis of a Charcot-Marie-Tooth disease mutation reveals an essential internal ribosome entry site element in the connexin-32 gene. J. Biol. Chem. V.275, p.34586-34591.
157. Faye J-C., Fargin A., Bayard F. 1986. Dissimilarities between the uterine estrogen receptor in cytosol of castrated and estradiol-treated rats. Endocrinology. V.l 18, p.2276-2283.
158. Faye J-C., Toulas C., Bayard F. 1989. Differential estrogenic responsiveness of MCF-7 cells. Relationship to the presence of two different estrogen receptors. J. Recept Res. V.9, p.203-219.
159. Barraille P., Chinestra P., Bayard F., Faye J.C. 1999. Alternative initiation of translation accounts for a 67/45 kDa dimorphism of the human estrogen receptor ERalpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.257, p.84-88.
160. Lesage F., Attali В., Lazdunski M., Barhanin J. 1992. Developmental expression of voltage-sensitive K+ channels in mouse skeletal muscle and C2C12 cells. FEBSLett. V.310, p. 162-166.
161. Wymore R.S., Negulescu D., Kinoshita K., Kalman K., Aiyar J., Gutman G.A., Chandy K.G. 1996. Characterization of the transcription unit of mouse Kvl.4, a voltage-gated potassium channel gene. J. Biol. Chem. V.271, p. 15629-15634.
162. Stuhmer W., Ruppersberg J.P., Schroter K.H., Sakman В., Stocker M., Giese K.P., Perschke A., Baumann A., Pongs O. 1989. Molecular basis of functional diversity of voltage-gated potassium channels in mammalian brain. EMBOJ. V.8, p.3235-3244.
163. Negulescu D„ Leong L.E., Chandy K.G., Semler B.L., Gutman G.A. 1998. Translation initiation of a cardiac voltage-gated potassium channel by internal ribosome entry. J. Biol. Chem. V.273, p.20109-20113.
164. Lindquist S. 1981. Regulation^protein synthesis during heat shock. Nature. V.293, p.311-314.
165. Kruger C., Benecke B.-J. 1981. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. V.23, p.595-603.
166. Panniers R., Henshaw E.C. 1984. Mechanism of inhibition of polypeptide chain initiation in heat-shocked Ehrlich ascites tumour cells. Eur.J.Biochem. V.140, p.209-214.
167. Duncan R.F. 1996. Translational control during heat shock. In Translational Control (ed. Hershey J.W.B., Sonenberg N., Mathews M.B.) p. 271-294. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
168. Morimoto R.I. 1998. Regulation of the heat shock transcriptional response: Cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Genes Dev. V.12, p.3788-3796.
169. Duncan R., Hershey J.W.B. 1984. Heat shock-induced translational alterations in HeLa cells. Initiation factor modifications and the inhibition of translation. J. Biol. Chem. V.259, p.l 1882-11889.
170. Duncan R., Hershey J.W.B. 1989. Protein synthesis and protein phosphorylation during heat stress, recovery, and adaptation. J. Cell Biol. V.109, p. 1467-1481.
171. Scorsone K.A., Panniers R., Rowlands A.G., Henshaw E.C. 1987. Phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 during physiological stresses which affect protein synthesis. J. Biol. Chem. V.262, p. 14538-14543.
172. Rowlands A.G., Montine K.S., Henshaw E.C., Panniers R. 1988. Physiological stresses inhibit guanine-nucleotide-exchange factor in Ehrlich cells. Eur. J. Biochem. V. 175, p.93-99.
173. Scheper G.C., Mulder J., Kleijn M., Voorma H.O., Thomas A.A., van Wijk R. 1997. Inactivation of eIF2B and phosphorylation of PHAS-I in heat-shocked rat hepatoma cells. J. Biol. Chem. V.272, p.26850-26856.
174. Panniers R., Stewart E.B., Merrick W.C., Henshaw E.C. 1985. Mechanism of inhibition of polypeptide chain initiation in heat shocked Ehrlich cells involves reduction of eukaryotic initiation factor 4F activity. J. Biol. Chem. V.260, p.9648-9653.
175. Zapata J.M., Maroto F.G., Sierra J.M. 1991. Inactivation of mRNA cap-binding protein complex in Drosophila melanogaster embryos under heat shock. J. Biol. Chem. V.266, p. 1600716014.
176. Marcotrigiano J., Gingras, A.C., Sonenberg, N., Burley S.K. 1997. Cocrystal structure of the messenger RNA 5' cap-binding protein (eIF4E) bound to 7-methyl-GDP. Cell. V.89, p.951-961.
177. Duncan R., Milburn S.C., Hershey J.W.B. 1987. Regulated phosphorylation and low abundance of Hela cell initiation factor eIF-4F suggest a role in translational control. J. Biol. Chem. V.262, p.380-388.
178. Lamphear В .J., Panniers R. 1990. Cap binding protein complex that restores protein synthesis in heat shocked Ehrlich cell lysates contains highly phosphorylated eIF-4E. J. Biol. Chem. V.265, p.5333-5336.
179. Lamphear B.J., Panniers R. 1991. Heat shock impairs the interaction of cap binding protein complex with 5' mRNA cap. J. Biol Chem. V.266, p.2789-2794.
180. Joshi-Barve S., DeBenedetti A., Rhoads R.E. 1992. Preferential translation of heat shock mRNAs in Hela cells deficient in protein synthesis initiation factors eIF-4E and elF-gamma. J. Biol Chem. V.267, p.21038-21043.
181. Yueh A., Schneider R.J. 1996. Selective translation by ribosome jumping in adenovirus infected and heat shocked cells. Genes Dev. V.10, p. 1557-1567.
182. Lin T.-A., Kong X., Haystead T.A.J., Pause A., Belsham G., Sonenberg N., Lawrence J.C. 1994. PHAS-1 as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. V.266, p.653-656.
183. Lin T.A., Kong X., Saltiel A.R., Blackshear P.J., and Lawrence J.C. 1995. Control of PHAS-I by insulin in 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. V.270, p. 18531-18538.
184. Haghighat A., Mader S., Pause A., Sonenberg N. 1995. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: Competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBOJ. V.14, p.5701-5709.
185. Mader S., Lee II., Pause A., Sonenberg N. 1995. The translation initiation factor eIF-4E binds to a common motif shared by the translation factor eIF-4 gamma and the translational repressors 4E-binding proteins. Mol. Cell. Biol. V.l5, p.4990-4997.
186. Poulin F., Gingras A.C., Olsen H., Chevalier S., and Sonenberg N. 1998.4E-BP3, a new member of the eukaryotic initiation factor 4E-binding protein family. J. Biol. Chem. V.273, p. 14002-14007.
187. Feigenblum D., Schneider R.J. 1996. Cap-binding protein (eukaryotic initiation factor 4E) and 4E-inactivating protein BP-1 independently regulate cap-dependent translation. Mol. Cell. Biol. V.l6, p.5450-5457.
188. Vries R.G., Flynn A., Patel J.C., Wang X., Denton R.M., Proud C.G. 1997. Heat shock increases the association of binding protein-1 with initiation factor 4E. J. Biol. Chem. V.272, p.32779-32784.
189. Cuesta R., Laroia G., Schneider R.J. 2000. Chaperone Hsp27 inhibits translation during heat shock by binding eIF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes. Genes Dev. V.14, p. 1460-1470.
190. Yueh A., Schneider R.J. 2000. Translation by ribosome shunting on adenovirus and Hsp70 mRNAs facilitated by complementarity to 18S rRNA. Genes Dev. V.l4, p.414-421.
191. Vivinus S, Baulande S, van Zanten M, Campbell F, Topley P, Ellis JH, Dessen P, Coste H. 2001. An element within the 5' untranslated region of human Hsp70 mRNA which acts as a general enhancer of mRNA translation. Eur. J. Biochem. V.268, p. 1908-1917.
192. Poogin M.M., Hohn Т., Fiitterer J. 1998. Forced evolution reveals the importance of short open reading frame A and secondary structure in the cauliflower mosaic virus 35S RNA leader. J. Virol. V.72,p.4157-4169.
193. Hemmings-Mieszczak M., Hohn T. 1999. A stable hairpin preceded by a short ORF promotes non-linear ribosome migration on a synthetic mRNA leader. RNA. V.5, p.l 149-1157.
194. Ryabova L.A., Hohn T. 2000. Ribosome shunting in the cauliflower mosaic virus 35S RNA leader is a special case of reinitiation of translation functioning in plant and animal systems. Genes Dev. V.l4, p.817-829.
195. La Torre P., Kolakofsky D., Curran J. 1998. Sendai virus Y proteins are initiated by a ribosomal shunt. Mol. Cell. Biol. V.l8, p.5021-5031.
196. Pestova T.V., Hellen C.U.T., Shatsky I.N. 1996. Canonical eukaryotic initiation factors determine translation by internal ribosome entry. Mol. Cell. Biol. V.l6, p.6859-6869.
