Сходные черты в механизмах инициации трансляции у прокариот и эукариот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА.

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

АНДРЕЕВ Дмитрий Евгеньевич

Сходные черты в механизмах инициации трансляции у прокариот и эукариот

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук

Иван Николаевич Шатский

Официальные оппоненты: кандидат химических наук доктор биологических наук, профессор

Лариса Витальевна Мочалова Юрий Леонидович Дорохов

Ведущая организация:

Новосибирский институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится " 27 " июня 2006 г. в 16— на заседании Диссертационного совета Д.501.001.41 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан " 27 " мая 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

/

И.Г. Смирнова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. До недавнего времени считалось, что механизмы инициации трансляции у прокариот и эукариот кардинально различны. Стандартные прокариотические мРНК полицистронны, перед каждым инициаторным триплетом располагается последовательность, комплементарная участку в 16S рРНК (последовательность Шайна-Дальгарно) и участок связывания рибосомного белка S1. Эукариотическая рибосома не имеет анти-ШД участка в составе 18S рРНК и не имеет функционального аналога S1, вот почему она не способна инициировать белковый синтез на прокариотической мРНК.

В отличие от бактериальных мРНК, стандартные эукариотические мРНК моноцистронны, на 5' конце находится "кеп", который привлекает факторы инициации и малую рибосомную субъединицу на 5' конец мРНК, затем следует предшествующая инициаторному кодону 5' НТО, которая сканируется рибосомой при содействии сканирующих инициаторных факторов. Другой уникальной особенностью эукариотических мРНК является поли-А последовательность на 3' конце мРНК. Прокариоты, естественно, не имеют кеп-связывающего инициаторного фактора, также для них не обнаружены факторы, необходимые для сканирования, и поэтому они не способны транслировать подавляющее большинство эукариотических мРНК. Таким образом, посадка рибосомы на 5'конец (которая определяется кепом) и сканирование в поисках инициаторного триплета являются отличительными чертами эукариотической трансляции, а посадка на внутренний участок мРНК непосредственно в окрестности инициаторного триплета — отличительной чертой прокариотической трансляции.

В последнее десятилетие, однако, появились данные, которые похоже начали "перекидывать мостик" между механизмами инициации трансляции у эукариот и прокариот. Обнаружено, что эукариотические факторы инициации elF1, elF1A и elF5B являются структурными и функциональными аналогами бактериальных IF3, IF1 и IF2. Кроме того, оказалось, что для некоторых эукариотических мРНК, прежде всего вирусного происхождения, несомненно возможен механизм связывания рибосомы на их специфических внутренних участках. Такие участки получили название IRES-элементы (от англ. Internal Rlbosome Entry Site). Однако следует подчеркнуть, что если в случае прокариотических мРНК внутренняя посадка рибосомы требует только белка S1 и/или наличия в них последовательности Шайна-Дальгарно, а также участия в процессе инициации только трех факторов инициации (IF1, IF2 и IF3), то IRES-элементы это протяженные участки с развитой вторичной структурой. Классические

IRES-элементы РНК пикорнавирусов содержат высокоспецифические сайты связывания для инициирующих факторов, чего нет в бактериальных мРНК. Для инициации трансляции на таких элементах РНК пикорнавирусов требуются почти все эукариотические факторы инициации трансляции (за исключением кеп-связывающегс фактора elF4E) и ряд вспомогательных мРНК-связывающих белков. Гораздо большее сходство с бактериальной системой: обнаруживают IRES-элемент из РНК вируса гепатита С, который для образования 40S инициирующего комплекса (48S комплекс) обходится всего двумя факторами инициации, elF2 и elF3, и таким образом не требует ни кепа, ни процесса сканирования цепи мРНК при выборе инициирующего кодона. До недавнего времени IRES-элемент РНК ВГС, не считая совсем экзотического случая IRES-элемента РНК вируса паралича сверчка, где не нужны никакие факторы инициации трансляции и даже инициаторная Мет-тРНК, был по существу единственным примером, показывающим сходство в механизмах связывания мРНК у про- и эукариот.

В данной работе обсуждаются новые примеры, которые показывают очевидное сходство во взаимодействии ■ мРНК с рибосомами бактерий и эукариот (млекопитающих).

Цели исследования.

1. Показать, что ранее исследованный в нашей лаборатории универсальный IRES-элемент RhPV способен направлять внутреннюю инициацию не только в бесклеточной системе, но и in vivo.

2. Проверить предположение, что эукариотическая 80S рибосома способна, подобно прокариотической 70S, связываться с безлидерной мРНК при отсутствии факторов инициации. В случае если предположение подтвердится:

3. Доказать функциональность полученного инициаторного комплекса

4. Сравнить два возможных для безлидерных мРНК пути инициации трансляции: путь через образование 48S прединициаторного комплекса (который реализуется для подавляющего большинства мРНК), и путь через прямое образование 80S комплекса без участия факторов инициации

5. Изучить трансляционные свойства безлидерных мРНК в бесклеточной системе.

6. Определить структурные особенности безлидерных мРНК, которые необходимы для образования инициаторного комплекса с 80S рибосомой.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Автор диссертации и его коллеги исходили из предположения, что постоянное сравнение не только структур рибосом или отдельных факторов трансляции, но и самих механизмов трансляции у бактерий и эукариот может быть весьма полезным для более глубокого понимания этого фундаментального процесса. Подробный анализ этих механизмов позволяет более четко выявить, что же в них является сходным, а что кардинально различным и тем самым сфокусировать внимание исследователей на еще совсем не исследованных проблемах.

Нами было показано, что внутренняя инициация трансляции для IRES-элемента РНК вируса черемуховой тли (RhPV) возможна не только в бесклеточных системах, но и in vivo - следовательно, все данные, полученные ранее in vitro методом реконструкции инициаторных комплексов из очищенных компонентов (совместно с И.М. Терениным) отражают "упрощенный" способ инициации трансляции, который напоминает инициацию трансляции у прокариот.

Основное Внимание в диссертационной работе было уделено изучению механизмов инициации трансляции безлидерных мРНК. Ранее в нашей лаборатории Балакиным и др, было показано, что безлидерная С1 мРНК фага А способна связываться с недиссоциированной прокариотической 70S рибосомой и инициаторной тРНК в отсутствие факторов инициации трансляции. В ходе данной работы было показано, что модельная безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой и инициировать белковый синтез в отсутствие факторов инициации трансляции. Установлено, что связывание безлидерной мРНК с 80S рибосомой обуславливается расположением инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечной конформацией мРНК непосредственно за инициаторным триплетом.

Чтобы приблизиться к пониманию механизма инициации трансляции безлидерных мРНК, который может реализовываться in vivo в условиях конкуренции с обычными мРНК и в присутствии полного набора факторов инициации, нами был проанализирован возможный "стандартный" механизм инициации через образование 48S предынициаторного комплекса. Методом реконструкции 48S комплексов из очищенных компонентов было показано, что фактор инициации elF1 оказывает дестабилизирующее влияние на 48S комплекс, собранный на безлидерной мРНК, что делает инициацию трансляции для безлидерной мРНК через связывание с 80S рибосомой предпочтительной.

Исследованные нами трансляционные свойства безлидерной мРНК в бесклеточной системе (ЛРК) представили весомые аргументы в пользу того, что в системе, в которой

присутстзуют все компоненты трансляционного аппарата, для безлидерной мРНК реализуется (хотя бы частично) фактор - независимый механизм инициации через связывание с 80S рибосомой.

Таким образом, в данной работе был предложен новый механизм инициации трансляции у эукариот и показана практически полная аналогия в связывании безлидерной мРНК с 70S и 80S рибосомами.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ 29 марта 2006 г. Материалы работы докладывались на международной конференции ЕМВО Conference on "Protein Synthesis and Translational Control", Германия, 2005.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы, список литературы. Материал иллюстрирован 13 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 243 цитированных работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Несмотря на то, что IRES-элемент RhPV способен направлять внутреннюю инициацию в бесклеточных системах, оставалось непонятным, способен ли он функционировать в клетках млекопитающих in vivo. Изучению этого факта посвящена начальная часть данной работы.

Основная часть данной работы была посвящена изучению механизма инициации трансляции безлидерных мРНК у эукариот. В качестве модельной мРНК нами была выбрана мРНК С1 фага Л. Предпосылкой для такого выбора явился тот факт, что эта мРНК не имеет каких-либо прокариотических или эукариотических черт, а также то, что механизм инициации трансляции для этой мРНК в прокариотах детально изучен.

Нашей исходной гипотезой, вытекающей из параллели с прокариотическим способом инициации, было то, что безлидерная мРНК С1 способна связываться с эукариотической 80S рибосомой в отсутствие факторов инициации трансляции.

IRES-элемент вируса RhPV способен направлять внутреннюю инициацию /л vivo л

В нашей лаборатории, в совместной работе с И.М. Терениным были исследованы свойства IRES-элемента вируса черемуховой тли RhPV, расположенного в 5-НТО геномной вирусной РНК. IRES-элемент RhPV обладает удивительной особенностью - ■ направлять внутреннюю инициацию трансляции в различных биологических системах. Его универсальность объясняется тем, что этот IRES-элемент не имеет специфической структуры и специфических участков связывания компонентов трансляционного аппарата. Фактически он представлен протяженной неструктурированной U-богатой последовательностью. Это и объясняет, почему IRES-элемент RhPV способен связывать факторы инициации и 40S субчастицу рибосомы любого происхождения. Как было показано в опытах in vitro, посадка 40S субчастицы на инициирующий кодон этой мРНК возможна (хотя и с меньшей эффективностью) в отсутствие факторов 4-ой группы и гидролиза АТР, что совершенно нехарактерно для эукариот и, наоборот, демонстрирует сходство с прокариотическим механизмом инициации трансляции [Terenin et al, 2005]. Эта работа была продолжена в данной диссертационной работе, в которой были исследованы трансляционные свойства IRES-элемента RhPV как в бесклеточной системе, так и in vivo.

Подавляющее большинство работ по изучению трансляции in vitro делается в коммерчески доступной трансляционной бесклеточной системе - лизатате ретикулоцитов кролика, ЛРК. Однако для того, чтобы избежать неправильных интерпретаций результатов экспериментов в этой системе, необходимо учитывать ее недостатки.

При изучении трансляционных свойств другой мРНК, мРНК реторотранспозона человека LINE-1 в системе ЛРК нами было обнаружено, что инициация трансляции для такой мРНК происходит не только на аутентичном инициаторном кодоне, но и на других участках этой мРНК, приводя к образованию аберрантных продуктов трансляции. Известно, что ЛРК по сравнению с цитоплазмой содержит мало мРНК-связывающих белков. Присутствующие в ЛРК факторы инициации трансляции способны, неспецифично связываясь с мРНК, вызывать образование инициаторных комплексов на таких инициаторных триплетах, которые не могут быть достигнуты рибосомой ни при кеп - зависимой, ни при IRES-зависимой инициации трансляции in vivo. При добавлении в ЛРК экстракта клеток HeLa наблюдалось исчезновение аберрантных продуктов трансляции для мРНК LINE-1, что, по всей видимости, связано с увеличением количества мРНК-связывающих белков, которые, связываясь с мРНК,

не позволяют факторам инициации неспецифически связываться на внутренних участках этой мРНК. Таким образом, добавление экстракта клеток HeLa в ЛРК делает систему более адекватной для изучения мРНК с длинными 5'НТО.

Этот подход был применен нами и для изучения трансляционных свойств мРНК RhPV. Добавление экстракта клеток HeLa в ЛРК не подавляло трансляцию мРНК, содержащей этот IRES-элемент.

Однако для более строгого доказательства функционирования этого IRES-элемента в клетках млекопитающих нами был применен подход РНК-трансфекции. Поскольку вирус RhPV относится к РНК-вирусам, чей жизненный цикл проходит целиком в цитоплазме клеток хозяина, метод РНК-трансфекции является наиболее адекватным. Действительно, при трансфекции клеток HeLa бицистронной мРНК, у которой межцистронная область представляла собой 5'НТО вируса RhPV, наблюдалась трансляция второго цистрона. Так, нормированное к трансляции первого цистрона (Renilla люцифераза) значение активности второго цистрона (Firefly люцифераза), в случае, когда межцистронная область представляла собой IRES-элемент RhPV, возрастало в 9,6 раза по сравнению с конструкцией, в которой межцистронной областью являлась последовательность вектора. Необходимо отметить, что активность этого IRES-элемента в клеточной линии 293 невелика, однако не стоит забывать, что такая вирусная последовательность изначально должна функционировать в клетках насекомых, и именно там следует ожидать проявления наибольшей активности данного IRES-элемента.

Таким образом, универсальный IRES-элемент RhPV способен функционировать и in vivo в клетках млекопитающих. Данный факт делает правомерным наш вывод о том, что такая мРНК демонстрирует необычный "упрощенный" и универсальный способ инициации трансляции, похожий на инициацию трансляции у прокариот.

Механизм инициации трансляции для безлидерных мРНК, не имеющей ни прокариотических, ни эукариотических черт, по предположению автора и его коллег должен был оказаться еще более схожим с механизмом инициации трансляции у прокариот. Его изучению посвящена основная часть работы.

Безлидерная С1 мРНК способна связываться с недиссоциированной 80S рибосомой и инициаторной Мет-тРНКиМ9Т в отсутствие факторов инициации трансляции

Комплекс 80S рибосомы и С1 мРНК собирался в присутствии прокариотической Мет-тРНКиМет, которая полностью способна заменять эукариотическую Мет-тРНК„Мет

(по литературным данным; кроме того, дальнейшие наши эксперименты по реконструкции стадии элонгации полностью подтверждают этот факт).

Образование инициаторного комплекса анализировалось двумя независимыми методами - методом тоу-принта, основанным на ингибировании обратной транскрипции, и методом центрифугирования в сахарозном градиенте.

Метод тоу-принта основан на том, что обратная транскриптаза, удлиняющая [32Р]-меченный праймер, отожженный примерно в 60 нт от интересующей области мРНК, способна останавливаться, если с мРНК стабильно связан какой-либо лиганд. О такой остановке свидетельствует укороченный фрагмент кДНК, который можно наблюдать на авторадиограмме. В случае рибосомы остановка обратной транскрипции (сигнал тоу-принта) наблюдается в 16-18 нт от триплета, находящегося в Р-сайте рибосомы, и в большинстве случаев только тогда, когда в Р-сайте уже установлено кодон-антикодоновое взаимодействие. Таким образом, главными достоинствами метода являются не только регистрация мРНК-рибосомных комплексов, но также и определение положения рибосомы на мРНК. Как можно видеть из рис.1, 80S рибосома образует стабильный комплекс с мРНК и Мет-тРНК„Мет (дорожка 4). Для 40S субъединицы не наблюдается образование тройного комплекса (дорожка 2), что говорит о факте стабилизации комплекса с 80S рибосомой, по-видимому, за счет взаимодействия Мет-тРНК„Мвт с 60S рибосомной субъединицей в составе 80S инициаторного комплекса.

gaugagcacaaaaaagaaaccauuaacacaagagcagcuu... 1 2 3 4 5 6

Рис. 1. Образование тройного комплекса 80S с С1 мРНК и Мет-тРНК„Мет.

А - метод центрифугирования в градиенте сахарозы. Направление седиментации обозначено стрелкой. Профиль пиков строился из значений радиоактивности, измерянных в каждой фракции градиента.

Б - метод тоу-принта. Положение полос сигнала тоу-принта и полноразмерной (ПР) кДНК обозначено стрелкой.

Замена 5' концевого инициаторного триплета AUG на GUG или на UAA (контроль) приводит к исчезновению тройного комплекса (дорожки 5 и 6). Поскольку в системе отсутствуют факторы инициации, которые способствуют разрушению "неправильных" инициаторных комплексов, то неспособность мРНК с GUG и UAA триплетом участвовать в образовании инициаторного комплекса с 80S рибосомой объясняется только менее стабильным кодон-антикодоновым взаимодействием мРНК с Мет-тРНК„Мет.

Тройной комплекс 808*С1мРНК*Мет-тРНК„Мвт является функциональным инициаторным комплексом

Для того, чтобы в дальнейшем говорить о механизме инициации трансляции безлидерных мРНК через прямое связывание мРНК с 80S субъединицей, необходимо было показать, что комплекс, который мы получили in vitro в системе очищенных компонентов, является функциональным инициаторным комплексом, а не каким-либо артефактом. Единственным способом проверить это являлась реконструкция стадии, элонгации в системе из очищенных компонентов, так как очевидно, что только

"настоящий" инициаторный комплекс способен участвовать в синтезе полипептида.

Рис.2 Реконструкция стадии элонгации

в системе из очищенных компонентов

В правой части геля показаны продукты реакции секвенирования плазмиды рС1(стоп), выполненные с того же праймера. Положения полноразмерой кДНК (ПР кДНК), инициаторного триплета, стоп кодона, б триплета и сигналов тоу-принта обозначены стрелками. Положения сигналов тоу-принта показаны звездочками над нуклеотидами последовательности С1(стоп) мРПК.

даидадсасаааааадаааиааииаасасаададсадсии... Для реконструкции стадии элонгации 1 ' 5 4 * 6 7 нами были выделены суммарные

человеческие аа-тРНК синтетазы, с помощью которых была проаминоацилиррвана суммарная тРНК, кроме того, был очищен фактор элонгации еЕРШ (еЕР1А в

80S + + + + +

0ЕГ1Н + + +

eEF2 + + +

GTP + + + +

GMPPNP t

^mmmmmmi:

- ' _ , AM

тсу-принт к _ _ г: h

AUG 1 С — - „ щ

ЙГЧ =

1 2 3 4.5

комплексе со своим мультисубъединичным обменным фактором). Фактор элонгации eEF2 был любезно предоставлен Л.П. Овчинниковым. Нами была использована стратегия, при которой мы сначала собирали тройной инициаторный 80S комплекс, а затем добавляли в систему факторы элонгации, суммарную тРНК и GTP. Чтобы наблюдать стадию элонгации методом тоу-принта, седьмой триплет С1 мРНК был заменен на стоп-кодон (получена мРНК С1(стоп)). Седьмой триплет был выбран для того, чтобы исключить влияние изменяемой последовательности на образование инициаторного комплекса. Поскольку в системе отсутствуют факторы терминации, элонгирующая рибосома должна инвариантно останавливаться на мРНК со стоп-кодоном в A-сайте и предыдущим, 6 триплетом, в Р-сайте рибосомы. В этом случае мы должны были наблюдать возникновение сигнала тоу-принта на расстоянии +16-+18 нт от 6 триплета мРНК С1 (стоп).

Действительно, добавление обоих факторов элонгации, суммарной аа-тРНК и GTP к инициаторному комплексу, собранному на С1(стоп) мРНК, приводило к появлению нового сигнала тоу-принта в предсказанной позиции (дорожка 4). При отсутствии какого либо из элонгационных факторов возникновение нового сигнала тоу-принта не наблюдалось (дорожка 2 и 3). Более того, при замене GTP на его негидролизуемый аналог GMPPNP также не наблюдалось возникновение сигнала тоу-принта (дорожка 5). GTP не нужен для образования тройного комплекса 803*С1-мРНК*Мет-тРНК„Мвт, но необходим для элонгации.

Представленные результаты все вместе подтверждают предположение о том, что комплекс, который образуется на безлидерных мРНК через прямое связывание с Мет-тРНК„Мет и 80S рибосомой, является функциональным.

Образование 48S инициаторного комплекса на С1 мРНК

Поскольку в реальных условиях в клетке присутствуют все факторы инициации трансляции, мы решили определить эффективность образования 48S инициаторного комплекса на безлидерной мРНК, поскольку было необходимо оценить возможность реализации стандартного пути инициации трансляции. Все факторы инициации, которые необходимы для трансляции обычных клеточных кеп-зависимых мРНК, имеются у нас в виде индивидуальных компонентов.

Для инициации трансляции обычных кеп-зависимых мРНК необходимы следующие факторы инициации: elF1 (участвует в выборе инициаторного триплета, необходим для сканирования мРНК, разрушает нестабильные инициаторные комплексы), elF1A (стимулирует посадку инициаторной Мет-тРНК„Мат в Р-сайт рибосомы, необходим для

сканирования), elF2 (фактор инициации, связывающий инициаторную тРНК и направляющий ее в Р-сайт рибосомы), elF3 (фактор-'платформа", необходимый для взаимодействия компонентов инициации трансляции между собой), elF4F (мультисубъединичный комплекс, который необходим для связывания с 5' концом мРНК и для сканирования предынициаторным комплексом 5' нетранслируемой области мРНК в поиске инициаторного триплета: в процессе сканирования расплетаются вторичные структуры, мешающие движению рибосомы). Главная субъединица elF4F - elF4G, субъединица elF4E отвечает за связывание с кепом, а хеликаза elF4A отвечает за расплетание вторичных структур. Вспомогательный фактор elF4B увеличивает процессивность elF4A и абсолютно необходим для образования инициаторных комплексов на мРНК, содержащих в своих 5' нетранслируемых областях стабильные вторичные структуры.

Если полный набор канонических факторов инициации требуется для инициации трансляции на стандартных кеп-зависимых клеточных мРНК, то для некоторых мРНК показаны пониженные требования к некоторым факторам, например мРНК RhPV, мРНК вируса гепатита С, некоторые мРНК с нестркутурированными 5'НТО. Все эти случаи (единственное исключение - IRES элемент CrPV, расположенный в межгеномной области мРНК) имеют общую черту: всегда необходимы факторы инициации elF2 и elF3. ;

Как можно видеть из рис.3, 48S комплекс на безлидерной мРНК собирается в присутствии факторов инициации elF2 и elF3, однако выход комплекса весьма

незначителен (дорожки 5 и , 6). Как и ожидалось, добавление к этим факторам инициации фактора elF1A значительно стимулирует выход 48S инициаторного комплекса (дорожка 4).

+ 80S, тРНКи

+ + * * + 40S, тРНКи

+ + e(F1

+ + + + elF1A

+ + + + + + elF2

+ + + + + e!F3

+ + e(F4A,e]F4F

.ПРкДНК

|ТОу-ПриНТ

123456789_

|1q0|230|108[ 85 i 15 112 i 5 i 83 i о i •ыпи.т-плшвт. %

Рис. 3 Образование 483 инициаторного комплекса на С1 мРНК. .

Полноразмерная кД1Ж и сигналы тоу-принта обозначены спарва от геля. Выход инициаторного комплекса, рассчитанный как отношение сигнала тоу-принта к общей интенсивности сигнала в дорожке, указан внизу геля. За 100% принят выход' 48Э комплекса в присутствии полного набора факторов инициации.

При использовании этих 3 факторов инициации трансляции 48S инициаторный комплекс собирается примерно так же эффективно, как и 80S комплекс, получаемый при прямом связывании безлидерной мРНК 80S рибосомы (сравнить дорожку 4 и 8).

Неожиданным фактом оказалась значительная стимуляция образования 48S инициаторного комплекса факторами 4-ой группы (сравнить дорожку 2 и 4). Полученный результат не согласуется с общепринятыми функциями фактора инициации elF4F. В мРНК С1 отсутствует 5' НТО, которую необходимо расплетать для успешного сканирования. Можно было бы предположить, что этот фактор инициации расплетает область после инициаторного триплета для успешной посадки рибосомы, однако известно, что область непосредственно после инициаторного кодона имеет одноцепочечную конформацию, и ее так же не нужно расплетать. Из дополнительного эксперимента (см. диссертацию) видно, что для такой стимуляции необходим гидролиз АТР и хеликазная реакция. Хотя изучение этого крайне интересного факта требует проведения дополнительной работы, мы предполагаем, что фактор e(F4F АТР-зависимо стимулирует укладку мРНК, расположенной после инициаторного триплета, в мРНК-связывающий канал рибосомы.

Важный результат был получен при добавлении в систему фактора инициации elF1. Прежде необходимо упомянуть о литературных данных по функции этого фактора инициации. При добавлении всех факторов инициации, кроме elFI, к искусственной мРНК, содержащей 2 инициаторных AUG триплета (один на самом 5' конце мРНК, после него, через 19 CAA повторов - второй инициаторный триплет) наблюдалось образование инициаторных комплексов на 2 инициаторных триплетах. При добавлении недостающего фактора инициации elF1 наблюдалось полное исчезновение инициаторного комплекса на 5'-проксимальном AUG триплете.

В нашем случае добавление к факторам инициации elF1A, elF2 и elF3 недостающего eiF1 никак не сказывалось на выходе инициаторного комплекса (дорожка 3). Однако если в системе присутствовал еще и elF4F, то наблюдалось резкое падение выхода инициаторного комплекса (дорожка 1). Различия с результатами лаборатории Т.В. Пестовой (а именно тот факт, что в нашей системе при добавлении elF1 не наблюдалось полное исчезновение инициаторного комплекса) мы объясняем тем, что наша мРНК имеет всего один инициаторный код он, в то время как для мРНК с двумя инициаторными триплетами существуют альтернативы -присутствие второго инициаторного кодона смещает равновесие в сторону полного исчезновения комплекса на 5' проксимальном инициаторном триплете и накопления инициаторного комплекса на втором инициаторном триплете.

Тот факт, что для дестабилизирующего влияния elF1 на сборку комплекса на 5' проксимальном инициаторном триплете безлидерной мРНК С1 необходим фактор инициации elF4F, оказался новым результатом. Мы считаем, что в случае, когда в системе присутствует и фактор инициации elF4F, и фактор инициации elF1, прединициаторный комплекс, связавшись с 5' концом С1 мРНК, начинает сканировать кодирующую часть этой мРНК до того, как произошло кодон-антикодоновое узнавание, и, не найдя подходящего инициаторного триплета, диссоциирует. elF1 увеличивает процессивность такого сканирования за счет разрушения нестабильных комплексов в процессе продвижения прединициаторного комплекса по мРНК, и за счет этого и оказывает дестабилизирующее влияние на образование инициаторного комплекса на самом 5' конце мРНК. В отсутствии факторов инициации 4 группы сканирование тоже возможно, но с меньшей эффективностью. В этом случае более быстрой стадией по сравнению с "переходом к сканированию" оказывается установление кодон-антикодонового взаимодействия на 5' проксимальном AUG кодоне.

В случае полного набора факторов инициации трансляции (за исключением elF4B -мы не использовали его, поскольку в нашем случае речь точно не идет о каких либо стабильных вторичных структурах в мРНК) выход иницаторного 48S примерно равен выходу 80S комплекса, полученного при прямом взаимодействии 80S рибосомы с С1 мРНК и Мет-тРНК„М9Т. Однако очевидно, что в реальной системе, в которой большое количество клеточных мРНК конкурируют между собой за факторы инициации трансляции, безлидерная мРНК, возможно, будет неконкурентноспособной в стандартном пути инициации трансляции, протекающем через образование 48S инициаторного комплекса. В этом случае единственной альтернативой для такой мРНК будет использование "бесфакторного" механизма инициации трансляции через прямое связывание с 80S рибосомой.

Необычные трансляционные свойства безлидерной мРНК С11ас2.

Хотя нами было показано, что для безлидерной мРНК могут реализовываться два способа инициации трансляции, один - через образование 48S инициаторного комплекса, другой - через прямое связывание с 80S рибосомой, было неясно, какой же путь окажется предпочтительным в реальной системе, в которой присутствуют все компоненты трансляции, например, в бесклеточной трансляционной системе. лизата ретикулоцитов кролика (J1PK).

мРНК CllacZ устроена следующим образом: после инициаторного триплета, который находится на самом 5' конце этой мРНК (не считая G для проведения Т7-

транскрипции), расположены 13 триплетов мРНК С1 фага Л, после которой следует кодирующая часть Э-галактозидазы. В результате трансляции такой мРНК получается полипептид размером примерно 60 кДа. Для того, чтобы оценить трансляционные свойства этой мРНК, был необходим адекватный контроль, В качестве контроля нами были получены две мРНК, которые представляли собой ту же самую С11ас7 мРНК, но с добавленными 5' нетранслируемыми областями. В первом случав была добавлена полностью неструктурированная 5' НТО, представляющая собой 19 повторов САА триплетов - мРНК САА-С11асг. Во втором случае была добавлена 5'НТО стандартной кеп-зависимой мРНК р-актина. Необходимо отметить, что у всех трех мРНК последовательности после инициаторного триплета были одинаковыми, что исключает влияние открытой рамки считывания на эффективность трансляции этих мРНК.

Увеличение уровня трансляции безлидерной мРНК С1 lacZ при повышении ее концентрации в бесклеточной трансляционной системе

Известно, что для стандартных мРНК зависимость их уровня трансляции выглядит от концентрации выглядит следующим образом: вначале при увеличении концентрации наблюдается рост уровня трансляции до некоторого максимума, а затем при дальнейшем увеличении концентрации мРНК наблюдается ингибирование трансляции. Было показано (в том числе и в нашей лаборатории), что такое ингибирование прежде всего связано с тем, что некоторые факторы инициации трансляции являются РНК-связывающими, Такие РНК-связывающие белки помимо своих высокоспецифичных сайтов связывания с рибосомой и другими инициаторными факторами способны за счет своих РНК-связывающих свойств неспецифично связываться с мРНК, и таким образом, покидать пул активных факторов инициации. При большой концентрации мРНК в системе такие факторы инициации начинают активно вытитровываться, остальные компоненты инициации оказываются не способны поддерживать высокий уровень трансляции, и наблюдается ее ингибирование.

д концентрация мРНК

сарЬАс1-С1/ас2

Рис 4. Зависимость уровня трансляции от концентрации мРНК Б 30 60 90 120 в бесклеточной трансляционной

системе

Л - зависимость для сар-р-актип-жЪмРНК

Б - зависимость для С11ас7. мРНК

С11асг

30 60 90 120 С11ас2 мРНК

Такая зависимость уровня трансляции от концентрации мРНК наблюдается для кепированной мРНК ß-aKTHH-CllacZ (рис. 4А)

Однако для безлидерной мРНК CllacZ наблюдается другая зависимость: при увеличении ее концентрации в бесклеточной системе уровень трансляции также возрастает (рис. 4Б). Необходимо отметить, что при наибольшей концентрации безлидерной мРНК, когда уровень ее трансляции по прежднему продолжает расти, все кеп-зависимые мРНК, для которых в нашей лаборатории изучалась такая зависимость, были уже практически полностью заингибированы. В свете сказанного выше можно предположить, что трансляция безлидерной мРНК мало зависит от эффективной концентрации РНК-связывающих факторов инициации.

Трансляция безлидерной мРНК CllacZ не зависит от кепа

Все клеточные мРНК котранскрипционно кепируются. Хотя некепированные мРНК также способны транслироваться . (механизм неясен, так как и в этом случае наблюдается зависимость от 5' конца мРНК), эффективность трансляции таких мРНК несравненно ниже, чем у кепированных мРНК.

Для мРНК, содержащих в своих 5'НТО IRES-элементы, уровень трансляции никак не зависит от присутствия или отсутствия кепа на 5' конце. Независимость какой либо мРНК от присутствия кепа является очень сильным аргументом в пользу того, что трансляция открытой рамки считывания такой мРНК направляется IRES-элементом.

Ken на 5' конце мРНК, как уже упоминалось выше, необходим для привлечения через фактор elF4F предынициаторного комплекса для последующего сканирования в поисках инициаторного триплета.

CllacZ саа-CllacZ bAct-C1iacZ кеп - + - + - +

Рис 5. Зависимость трансляции безлидерной мРНК CllacZ и ее производных с 5' НТО от присутствия кепа на 5' конце.

Для производных мРНК CILacZ, как с полностью неструктурированным лидером САА19, так и с лидером мРНК ß-актина, наблюдалась значительная стимуляция трансляция в случае, если эти мРНК были кепированы. Однако для безлидерной мРНК наблюдалось полное отсутствие эффекта кепирования на уровень трансляции. Отсутствие этого эффекта можно объяснить только тем, что для данной мРНК не

выполняется стандартный сценарий, при котором одной из важнейших стадий является связывание е1Р4Р с 5' концом мРНК посредством взаимодействия его субъединицы е1Р4Е с кепом.

Безлидерная мРНКС11асЛ эффективно транслируется при частичной инактивации е\Р2.

В стрессовых условиях клетке не выгодно поддерживать высокий уровень трансляции клеточных мРНК, поскольку это весьма энергоемкий процесс. Этого понижения уровня трансляции удается добиться инактивацией каких-либо компонентов инициации трансляции.

В случае вирусной инфекции в цитоплазме зачастую появляется вирусная двухцепочечная РНК. Клеткой выработан защитный механизм, призванный остановить развитие зараженной клетки путем глобального подавления уровня трансляции и клеточных, и вирусных мРНК, для того чтобы инфицированная клетка была уничтожена до того момента, как новые вирусные частицы покинут ее. Протеин-киназа Р{ (РКК) присутствует в цитоплазме в неактивной форме, после связывания в виде димера с двухцепочечной РНК активируется и фосфорилирует а-субьединицу фактора инициации е1Р2. Фосфорилированный е1Р2, связываясь со своим обменным фактором е1Р2В, не способен диссоциировать от него, и обменный фактор "запирается" в неактивной форме. Так как обменный фактор присутствует в значительном недостатке по сравнению с е1Р2, довольно быстро весь е1Я2 оказывается инактивированным, и за счет этого трансляция подавляющего большинства клеточных (и вирусных) мРНК драматически падает.

Как можно видеть из рис. 6, при инактивации е1Р2 в лизате ретикулоцитов кролика посредством добавления экзогенной двухцепочечной РНК наблюдается значительное понижение уровня трансляции мРНК с 5'НТО. Уровень ингибирования трансляции зависит от количества добавленной дцРНК. В случае безлидерной мРНК наблюдается лишь незначительное подавление ее трансляции.

То, что подавление трансляции мРНК с 5'НТО связано именно с фосфорилированием и инактивацией е1Р2, демонстрирует эксперимент по иммунопреципитации этого фактора инициации (рис. 6Б). Так как источником фосфата для фосфорипирования а-субьединицы е!Р2 служит фосфат из АТФ, добавление радиоактивно-меченого у-133Р]-АТР одновременно с добавлением дцРНК в лизат ретикулоцитов кролика позволяет оценить фософорилирование по авторадиограмме белкового геля (рис 6В).

А

Б f В

дцРНК Т - + - +

дцРНК - + ++- + ++

А_А А_i

cVscZ capbAct-tífscZ

Рис.6 Трансляция безлидерной CILacZ мРНК и ее производной с 5'НТО р-актина в бесклеточной системе трансляции, в которой инактивирован фактор инициации elF2.

A-зависимость уровня трансляции безлидерной мРНК и ее производной с 5'НТО от количества добавленной в систему дцРНК, Б-иммунопреципитация е№2 из ЛРК, в который была добавлена дцРНК и y-[32P]-ATP, гель покрашен Comassie Blue; Л и Т - легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина G, В - тот же гель, авторадиограмма (центральная и правая дорожка)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансляция безлидерной мРНК, в отличие от ее производной с 5'НТО, в бесклеточной трансляционной системе слабо зависит от концентрации активного e!F2.

Если рассмотреть все результаты, полученные при изучении трансляционных свойств безлидерной мРНК в ЛРК, то становится понятно, что инициация трансляции для этой мРНК протекает по нестандартному механизму. Полученные данные, хотя и не являются прямым доказательством нашей модели инициации трансляции через прямое связывание с 80S рибосомой, являются серьезными аргументами в ее пользу.

Свойства безлидерной мРНК С1, которые позволяют ей связываться с 80S

рибосомой

Для того, чтобы определить, какие именно особенности C1 lacZ мРНК позволяют ей связываться непосредственно с 80S рибосомой в отсутствии факторов инициации трансляции, мы решили проверить, способна ли 80S рибосома связываться как с уже имеющимися производными CMacZ мРНК с 5'НТО р-актина и с искусственной 5'НТО саа19, так и с другими производными этой мРНК с короткими 5'НТО, а также с искусственными безлидерными мРНК, полученными из природных мРНК путем удаления их 5'НТО. Нами были дополнительно получены две искусственные мРНК с короткими 5'НТО, за которыми следовал инициаторный триплет и кодирующая часть

e,F2cT

«-i»

мРНК C1lacZ. Одна из них содержала лидер GGGCCG (мРНК 5G-C1/acZ), другая - А-богатый лидер GAAAAG (мРНК 5A-C1/acZ).

Из рис.8 видно, что добавление 5'НТО к безлидерной мРНК (даже полностью неструктурированной последовательности CAAig и коротких 6 нт лидеров) полностью ингибирует образование тройного инициаторного комплекса 80S*C1 lacZ мРНК*Мет-тРНК„Мет, хотя в случае лидера GAAAAG и наблюдается незначительное образование такого комплекса.

Рис 7. Связывание 80S рибосомы с С1 lacZ

мРНК и ее производными с различными 5'НТО.

Полноразмерная кДНК и сигналы тоу-припта обозначены стрелками. Дорожка 6 соответствует продуктам обратной транскрипции, полученной с CllacZ прнДнк мРНК в отсутствие 80S рибосомы и Мет-тРНК„м<1Т. Для экономии места полноразмерная к ДНК не показана для дорожек 1 и 2 (поскольку эти сигналы располагаются значительно выше соответствующих сигналов на авторадиограмме)

|тоу-принт Таким образом, добавление 5' НТО к безлидерной мРНК полностью препятствует фактор - независимой инициации трансляции на таких мРНК.

Безлидерная мРНК, полученная из природной

,,„ - ■ мРНК 6-актина, оказалась полностью неспособной

1 2 3 4 5 6

связываться с 80S рибосомой. Методом компьютерного моделирования было показано, что кодирующая часть такой мРНК способна образовывать стабильные вторичные структуры. Следовательно, вторым фактором, препятствующим связыванию 80S рибосомы с безлидерной мРНК, является присутствие вторичных структур в области, прилежащей к инициаторному триплету. Тот факт, что вторичные структуры в области непосредственно после инициаторного триплета способны ингибировать связывание 80S рибосомы с мРНК, не кажется удивительным, поскольку рибосома сама по себе не обладает значительной хеликазной активностью, кроме того, по всей видимости для связывания необходима стерическая доступность 5' конца мРНК, что вряд ли возможно, если он участвует в формировании вторичных структур.

Заключение

В этой работе нами было рассмотрено два случая, при которой трансляционный эукариотический аппарат функционирует по механизму, напоминающему инициацию трансляции у прокариот.

В случае IRES-элемента вируса паралича сверчка RhPV нами было показано, что он способен направлять внутреннюю инициацию не только в бесклеточных трансляционных системах (имеющих свои недостатки), но и in vivo в клетках млекопитающих. Этот факт позволяет перенести результаты, полученные in vitro и говорящие об "упрощенном" способе инициации для такой мРНК, на реальную систему.

Основное внимание в данной работе было уделено изучению механизма инициации трансляции для безлидерных мРНК у эукариот. Главный вывод, который можно сделать из представленных выше данных, заключается в том, что безлидерная мРНК с неструктурированной областью непосредственно после инициаторного триплета способна к инициации трансляции, протекающей через связывание такой мРНК с 80S недиссоциированной рибосомой и инициаторной Мет-тРНК„Мвт. Такой способ инициации не требует ни одного фактора инициации трансляции.

Как уже упоминалось выше, безлидерные мРНК были обнаружены и у прокариот, и у архей, и у эукариот. Особенно часто безлидерные мРНК используются у архей и в клеточных органеллах. Хотя среди клеточных мРНК высших эукариот пока не обнаружено безлидерных мРНК, одна из РНК вируса кори не имеет 5'НТО, но, по всей видимости, все же транслируется. Кроме того, систематический поиск таких мРНК затруднен и вряд ли предпринимался ранее. Если такая клеточная безлидерная мРНК будет обнаружена, в свете нашей работы это не станет очень удивительным фактом.

Хотя безлидерные мРНК, возможно, могут транслироваться и по стандартному механизму через образование 48S инициаторного комплекса, можно предположить, что в условиях жесткой конкуренции с большим количеством стандартных клеточных мРНК за компоненты инициации трансляции, находящиеся в недостатке, бесфакторный способ инициации может стать единственно возможным.

Тот факт, что прокариотическая 70S рибосома и эукариотическая 80S рибосома способна связываться с одной и той же безлидерной мРНК, говорит о том, что эта функция рибосомы сохранилась в процессе эволюции. Возможно, способность к трансляции безлидерных мРНК представляет собой реликт эволюции трансляционного аппарата, и самые первые рибосомы были способны транслировать только такие мРНК.

выводы

1. Показано, что безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой в отстутствие факторов инициации трансляции.

2. Установлено, что тройной комплекс, образуемый 80S рибосомой, С1 мРНК и Мет-тРНКцМат, способен участвовать в элонгации трансляции, т.е. является полностью функциональным инициаторным комплексом.

3. Показано, что С1 мРНК способна образовывать 48S инициаторный комплекс с 40S рибосомой и факторами инициации трансляции, однако выход такого комплекса сравним с выходом тройного 80S инициаторного комплекса. Кроме того, показано, что фактор инициации elF1 способен частично дестабилизировать инициаторный комплекс только в том случае, если в системе присутствует фактор инициации elF4F, а также то, что elF4F оказывает стимулирующий эффект на образование 48S инициаторного комплекса в присутствии АТР и активного фактора инициации elF4A.

4. Изучены трансляционные свойства С1 мРНК в бесклеточной системе трансляции ЛРК - показано, что трансляция С1 мРНК не ингибируется при повышении ее концентрации, что трансляция С1 мРНК не зависит от присутствия кеп-структуры на 5'-конце, и что С1 мРНК способна эффективно транслироваться при инактивации elF2.

5. Показано, что расположение инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечная конформация области непосредственно после инициаторного триплета являются определяющими факторами, позволяющими мРНК непосредственно связываться с 80S рибосомой в отсутствии факторов инициации трансляции.

6. Исследована трансляция неспецифического IRES-элемента вируса насекомых (RhPV) in vivo и в усовершенствованной бесклеточной системе. Полученные данные подтверждают кеп-независимый способ инициации трансляции на РНК RhPV, сходный с прокариотическим механизмом инициации трансляции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. D.E. Andreev, I.M. Terenin, Y.E. Dunaevsky, S.E. Dmitriev, I.N. Shatsky (2006) A Leaderless mRNA Can Bind to Mammalian 80S Ribosomes And Direct Polypeptide Synthesis in the Absence of Translation Initiation Factors. Mol. Cell. Biol., 26, 3164-3169.

2. I.M. Terenin, S.E. Dmitriev, D.E.Andreev, E. Royal, G.J. Belsham, L.O. Roberts (2005) A "cross-kingdom" IRES reveals a simplified mode jf internal ribosomal entry. Mol. Cell.Bio]., 25, 7879-88.

3. C.E. Дмитриев, H.B. Быкова, Д.Е. Андреев, И.М. Теренин (2005) Адекватная система для изучения инициации трансляции мРНК ретротранспозона L1 человека in vitro. Мол.Еиоп., 40, 25-30

4. D.E. Andreev, I.M. Terenin, Y.E. Dunaevsky, S.E. Dmitriev, I.N. Shatsky (2005) A Leaderless mRNA Can Bind to Mammalian 80S Ribosomes And Direct Polypeptide Synthesis in the Absence of Translation Initiation Factors. EMBO Conference on "Protein Synthesis and Translational Control", 14-18 September 2005, Germany

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 23.05.2006 г.

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1 Механизмы трансляции у прокариот и эукариот

1.1 Инициация трансляции

1.1.1 Прокариоты

1.1.2 Эукариоты

1.2 Элонгация

1.3 Терминация 17 2. Структура и функции рибосомы

3. Сравнение малых рибосомных субьединиц

3.1 рРНК

3.2 Рибосомные белки

3.2.1 Гомологичные рибосомные белки прокариот и эукариот

3.2.2 Рибосомные белки, уникальные для прокариот

3.2.3 Рибосомные белки, уникальные для эукариот

Результаты и их обсуждение

1. IRES-элемент вируса RhPV способен направлять внутреннюю инициацию in vivo

2. Безлидерная С1 мРНК способна связываться с недиссоциированной 80S рибосомой и инициаторной Мет-тРНКиМет в отсутствии факторов инициации трансляции

3. Тройной комплекс 808*С1мРНК*Мет-тРНК„Мет является функциональным элонгационным комплексом.

4. Образование 48S инициаторного комплекса на CllacZ мРНК 60 5 Необычные трансляционные свойства безлидерной мРНК С1 lacZ

5.1 Увеличение уровня трансляции безлидерной мРНК CllacZ при повышении ее концентрации в бесклеточной трансляционной системе

5.2 Трансляция безлидерной мРНК С1 lacZ не зависит от кепа

5.3 Безлидерная мРНК CllacZ эффективно транслируется при частичной инактивации eIF

6. Свойства безлидерной мРНК CllacZ, которые позволяют ей связываться с 80S рибосомой.

Материалы и методы

1 Реактивы и материалы

2 Плазмидные конструкции

3 Генноинженерные манипуляции

4 Получение РНК-транскриптов

5 Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика

6 Реконструкция инициаторных и элонгационных комплексов из очищенных компонентов

7 Количественная обработка результатов

8 РНК-трансфекция 82 Выводы 83 Обзор Литературы

Список сокращений.

5'-НТО 5'-нетранслируемая область;

JIPK лизат ретикулоцитов кролика;

Мет-тРНК„Мет инициаторная тРНК, заряженная метионином; мРНК матричная РНК;

ПААГ полиакриламидный гель;

ПЦР полимеразная цепная реакция;

ПЭГ полиэтиленгликоль;

CrPV вирус паралича сверчка (от англ. Cricket Paralysis Virus);

DTT 1,4-дитио-0,Ь-треитол;

EDTA этилендиаминтетраацетат elF эукариотический фактор инициации трансляции (от. англ. eucaryotic initiation factor);

EMCV вирус энцефаломиокардита (от англ. Encephalomyocarditis Virus);

GMPPNP гуанозин-5'-[Р,у-имидо]трифосфат;

GTP гуанозин-5'-трифосфат;

GTPa3a белок, гидролизующий GTP;

HCV вирус гепатита С (от англ. Hepatitis С Virus);

HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;

HPRI ингибитор рибонуклеаз из плаценты человека (от англ. human placenta ribonuclease inhibitor);

Hsp белок теплового шока (от англ. heat shock protein);

IRES участок внутренней посадки рибосомы (от англ. internal ribosome entry site);

RRM белковый мотив, узнающий РНК (от англ. RNA recognition motif);

RhPV вирус черемуховой тли (от англ. Rhopalosiphum Padi Virus)

SDS додецилсульфат натрия;

Tris трис-(гидроксиметил)-аминометан.

До недавнего времени считалось, что механизмы инициации трансляции у прокариот и эукариот кардинально различны. В последнее десятилетие, однако, появились данные, которые похоже начали "перекидывать мостик" между механизмами инициации трансляции у эукариот и прокариот. Обнаружено, что несмотря на отсутствие гомологии в первичной структуре и на различные размеры, эукариотические факторы инициации elFl, elFIA и eIF5B являются структурными и функциональными аналогами бактериальных IF3, IF1 и IF2. Кроме того, оказалось, что для некоторых эукариотических мРНК, прежде всего вирусного происхождения, несомненно возможен механизм связывания рибосомы на их специфических внутренних участках - т.н. IRES-элементах (от англ Internal Ribosome Entry Site). Следует подчеркнуть, что если в случае прокариотических мРНК внутренняя посадка рибосомы требует только белка S1 и/или наличия в них последовательности Шайна-Дальгарно, а также участия в процессе инициации только трех факторов инициации (IF1, IF2 и IF3), то IRES-элементы это протяженные участки с развитой вторичной структурой. Классические IRES-элементы РНК пикорнавирусов содержат высоко специфические сайты связывания для инициирующих факторов, чего нет в бактериальных мРНК. Для инициации трансляции на таких элементах РНК пикорнавирусов требуются почти все эукариотические факторы инициации трансляции (за исключением кеп-связывающего фактора eIF4E), и ряд вспомогательных мРНК-связывающих белков. Гораздо большее сходство с бактериальной системой обнаруживают IRES-элемент из РНК вируса гепатита С (Hepatitis С Virus, HCV), который для образования 40S инициирующего комплекса (48S комплекс) обходится всего двумя факторами инициации, eIF2 и eIF3, и таким образом не требует ни кепа, ни процесса сканирования цепи мРНК при выборе инициирующего кодона. До недавнего времени IRES-элемент HCV, не считая совсем экзотического случая IRES-элемента РНК вируса паралича сверчка {Cricket Paralysis Virus, CrPV), где не нужны никакие факторы инициации трансляции и даже инициаторная Мет-тРНК, был по-существу единственным примером, показывающим сходство в механизмах связывания мРНК у про- и эукариот.

Автор диссертации и его коллеги исходили из предположения, что сравнение не только структур рибосом или отдельных факторов трансляции, но и самих механизмов трансляции у бактерий и эукариот может быть весьма полезным для более глубокого понимания этого фундаментального процесса. Подробный анализ этих механизмов позволяет более четко выявить, что же в них является сходным, а что кардинально различным и тем самым „ сфокусировать внимание исследователей на еще совсем неисследованных проблемах. В данной работе обсуждаются новые примеры, которые показывают очевидное сходство во взаимодействии мРНК с рибосомами бактерий и эукариот (млекопитающих).

Нами было показано, что 'внутренняя инициация трансляции для IRES-элемента РНК вируса черемуховой тли (Rhopalosiphum Padi Virus, RhPV) возможна не только в бесклеточных системах, но и in vivo - следовательно, все данные, полученные ранее in vitro методом реконструкции инициаторных комплексов-из-очищенных компонентов (совместно с И.М. Терениным) отражают "упрощенный" способ инициации трансляции, который напоминает инициацию трансляции у прокариот.

Основное внимание в диссертационной работе было уделено изучению механизмов инициации трансляции для безлидерных мРНК. Ранее в нашей лаборатории Балакиным и др. было показано, что безлидерная С1 мРНК фага X способна связываться с недиссоциированной прокариотической 70S рибосомой и инициаторной тРНКи в отстутствие факторов инициации трансляции. В ходе данной работы было показано, что модельная безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой и инициировать белковый синтез в отсутствие факторов инициации трансляции. Установлено, что связывание безлидерной мРНК с 80S

1 рибосомой обусловливается расположением инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечной конформацией мРНК непосредственно за инициаторным триплетом.

Чтобы приблизиться к пониманию механизма инициации трансляции безлидерных мРНК, который может реализовываться in vivo в условиях конкуренции с обычными мРНК и в присутствии полного набора факторов инициации, нами был проанализирован возможный "стандартный" механизм инициации через образование 48S предынициаторного комплекса. Методом реконструкции 48S комплексов из очищенных компонентов было показано, что фактор инициации elFl оказывает дестабилизирующее влияние на 48S комплекс, собранный на безлидерной мРНК, что делает инициацию трансляции для безлидерной мРНК через связывание с 80S рибосомой предпочтительной.

Исследованные нами трансляционные свойства безлидерной мРНК в бесклеточной системе (JIPK) представили весомые аргументы в пользу того, что в системе, в которой присутствуют все компоненты трансляционного аппарата, для безлидерной мРНК реализуется (хотя бы частично) фактор -независимый механизм инициации через связывание с 80S рибосомой.

Таким образом, в данной работе был предложен новый механизм инициации трансляции у эукариот и показана практически полная аналогия в связывании безлидерной мРНК с 70S и 80S рибосомами.

Обзор литературы

Структура и функции рибосомы, ключевого компонента биосинтеза белка, с самого своего открытия привлекают внимание ученых. Действительно, сложно представить себе более фундаментальный процес в клетке, чем синтез полипептида, и более сложно устроенный рибонуклеопротеиновый комплекс, отвечающий вместе со вспомогательными белковыми факторами за выбор инициаторного триплета на мРНК, удлинение полипептидной цепи и ее высвобождение после окончания цикла трансляции.

В конце 1990 годов в изучении структуры рибосомы был сделан настоящий прорыв - увенчались успехом попытки закристаллизовать рибосомную субчастицу из термофильной бактерии Thermus thermophilics и получить ее рентген с атомным разрешением. В дальнейшем были решены структуры не только отдельных прокариотических рибосомных субъединиц и целой 70S рибосомы, но и комплексов рибосомы с мРНК, тРНК и белковыми факторами. В отличие от прокариотической, эукариотическую рибосому до сих пор закристаллизовать не удалось, однако в последнее время был достигнут значительный прогресс благодаря развитию метода криоэлектронной микроскопии. Сравнивая имеющуюся атомную структуру прокариотической рибосомы со структурой эукариотической рибосомы, полученную методом криоэлектронной микроскопии, можно с достаточно большой степенью надежности выдвигать предположения о структуре последней.

Все известные рибосомы выполняют очень похожие функции, и весьма схожи структурно. Однако механизмы трансляции в прокариотах и эукариотах отличаются довольно сильно, особенно на самом сложном этапе, который обычно и определяет уровень экспрессии данной мРНК -стадии инициации. Цель данного обзора литературы - попытка разобрать сходства (ввиду схожести функций) и различия (которые неизбежны из-за принципиально разных механизмов трансляции и биогенеза рибосом) прокариотической и эукариотической рибосомы. Для большей полноты такого сравнения необходим хотя бы краткий обзор основных трех стадий биосинтеза белка - инициации, элонгации и терминации.

Выводы

1. Показано, что безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой в отстутствие факторов инициации трансляции.

2. Установлено, что тройной комплекс, образуемый 80S рибосомой, С1 мРНК и Мет-тРНКиМет, способен участвовать в элонгации трансляции, т.е. является полностью функциональным инициаторным комплексом.

3. Показано, что С1 мРНК способна образовывать 48S инициаторный комплекс с 40S рибосомой и факторами инициации трансляции, однако выход такого комплекса сравним с выходом тройного 80S инициаторного комплекса. Кроме того, показано, что фактор инициации elFl способен частично дестабилизировать инициаторный комплекс только в том случае, если в системе присутствует фактор инициации eIF4F, а также то, что eIF4F оказывает стимулирующий эффект на образование 48S инициаторного комплекса в присутствии АТР и активного фактора инициации eIF4A.

4. Изучены трансляционные свойства С1 мРНК в бесклеточной системе трансляции ЛРК - показано, что трансляция С1 мРНК не ингибируется при повышении ее концентрации, что трансляция С1 мРНК не зависит от присутствия кеп-структуры на 5'-конце, и что С1 мРНК способна эффективно транслироваться при инактивации eIF2.

5. Показано, что расположение инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечная конформация области непосредственно после инициаторного триплета являются определяющими факторами, позволяющими мРНК непосредственно связываться с 80S рибосомой в отсутствии факторов инициации трансляции.

6. Доказана способность к трансляции неспецифического IRES-элемента вируса насекомых RhPV in vivo и в усовершенствованной бесклеточной системе. Полученные данные подтверждают сделанный ранее вывод о кеп-независимом способе инициации трансляции на РНК RhPV, сходным с прокариотическим механизмом инициации трансляции.

1. Butler J.S., Springer M., Dondon J., Graffe M., Grunberg-Manago M.(1986) Escherichia coli protein synthesis initiation factor IF3 controls its own gene expression at the translational level in vivo. J.Mol.Biol. 192,767-780.

2. Shine J., Dalgarno L.(1974) The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 71,1342-1346.

3. Calogero R.A., Pon C.L., Canonaco M.A., Gualerzi C.O.(1988) Selection of the mRNA translation initiation region by Escherichia coli ribosomes. Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 85,6427-6431.

4. Melancon P., Leclerc D., Destroismaisons N., Brakier-Gingras L.(l 990) The anti-Shine-Dalgarno region in Escherichia coli 16S ribosomal RNA is not essential for the correct selection of translational starts. Biochemistry 29, 3402-3407.

5. Szer W., Hermoso J.M., Leffler S.(1975) Ribosomal protein SI and polypeptide chain initiation in bacteria. Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 72,2325-2329.

6. Tedin K., Resch A., Blasi U.( 1997) Requirements for ribosomal protein S1 for translation initiation of mRNAs with and without a 5' leader sequence. Mol.Microbiol. 25,189199.

7. Boni I.V., Isaeva D.M., Musychenko M.L., Tzareva N.V.(1991) Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res. 19, 155-162.

8. Olins P.O., Devine C.S., Rangwala S.H., Kavka K.S.(1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene 73,227-235.

9. Olins P.O., Rangwala S.H.(1989) A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J.Biol.Chem. 264,16973-16976.

10. Gallie D.R., Kado C.I.(1989) A translational enhancer derived from tobacco mosaic virus is functionally equivalent to a Shine-Dalgarno sequence. Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 86,129-132.

11. Komarova A.V., Tchufistova L.S., Dreyfus M., Boni I.V.(2005) AU-rich sequences within 5' untranslated leaders enhance translation and stabilize mRNA in Escherichia coli. J.Bacteriol. 187,1344-1349.

12. Gualerzi C.O., Pon C.L.(1990) Initiation of mRNA translation in prokaryotes. Biochemistry 29,5881-5889.

13. Gualerzi С., Risuleo G., Pon C.L.(1977) Initial rate kinetic analysis of the mechanism of initiation complex formation and the role of initiation factor IF-3. Biochemistry 16,1684-1689.

14. Wintermeyer W., Gualerzi C.(1983) Effect of Escherichia coli initiation factors on the kinetics of N-Acphe-tRNAPhe binding to 30S ribosomal subunits. A fluorescence stopped-flow study. Biochemistry 22,690-694.

15. Sussman J.K., Simons E.L., Simons R.W.(1996) Escherichia coli translation initiation factor 3 discriminates the initiation codon in vivo. Mol.Microbiol. 21, 347-360.

16. Haggerty T.J., Lovett S.T.(1997) IF3-mediated suppression of a GUA initiation codon mutation in the recJ gene of Escherichia coli. J.Bacteriol. 179,6705-6713.

17. Shapkina T.G., Dolan M.A., Babin P., Wollenzien P.(2000) Initiation factor 3-induced structural changes in the 30 S ribosomal subunit and in complexes containing tRNA(f)(Met) and mRNA. J.Mol.Biol. 299, 615-628.

18. Celano В., Pawlik R.T., Gualerzi C.O.(l 988) Interaction of Escherichia coli translation-initiation factor IF-1 with ribosomes. Eur.J.Biochem. 178,351-355.

19. Stringer E.A., Sarkar P., Maitra U.(1977) Function of initiation factor 1 in the binding and release of initiation factor 2 from ribosomal initiation complexes in Escherichia coli. J.Biol.Chem. 252,1739-1744.

20. Sundari R.M., Stringer E.A., Schulman L.H., Maitra U.(1976) Interaction of bacterial initiation factor 2 with initiator tRNA. J.Biol.Chem. 251,3338-3345.

21. Antoun A., Pavlov M.Y., Andersson K., Tenson Т., Ehrenberg M.(2003) The roles of initiation factor 2 and guanosine triphosphate in initiation of protein synthesis. EMBO J. 22,5593-5601.

22. Tomsic J., Vitali L.A., Daviter Т., Savelsbergh A., Spurio R., Striebeck P., Wintermeyer W., Rodnina M.V., Gualerzi C.0.(2000) Late events of translation initiation in bacteria: a kinetic analysis. EMBO J. 19,2127-2136.

23. Iborra F.J., Jackson D.A., Cook P.R.(2004) The case for nuclear translation. J.Cell Sci. 117,5713-5720.

24. Banerjee A.K.(1980) 5'-terminal cap structure in eucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiol .Rev. 44,175-205.

25. Lim L., Canellakis E.S.(1970) Adenine-rich polymer associated with rabbit reticulocyte messenger RNA. Nature 227,710-712.

26. Kozak M.(1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell 15,1109-1123.

27. Asano K., Clayton J., Shalev A., Hinnebusch A.G.(2000) A multifactor complex of eukaryotic initiation factors, elFl, eIF2, eIF3, eIF5, and initiator tRNA(Met) is an important translation initiation intermediate in vivo. Genes Dev. 14,2534-2546.

28. Fekete C.A., Applefield D.J., Blakely S.A., Shirokikh N., Pestova Т., Lorsch J.R., Hinnebusch A.G.(2005) The elFIA C-terminal domain promotes initiation complex assembly, scanning and AUG selection in vivo. EMBO J. 24,3588-3601.

29. Olsen D.S., Savner E.M., Mathew A., Zhang F., Krishnamoorthy Т., Phan L., Hinnebusch A.G.(2003) Domains of elFIA that mediate binding to eIF2, eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBO J. 22,193-204.

30. Marintchev A., Wagner G.(2004) Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q.Rev.Biophys. 37,197-284.

31. Rogers G.W., Jr., Richter N.J., Merrick W.C.(1999) Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A. J.Biol.Chem. 274,12236-12244.

32. Rogers G.W., Jr., Lima W.F., Merrick W.C.(2001) Further characterization of the helicase activity of eIF4A. Substrate specificity. J.Biol.Chem. 276,12598-12608.

33. Rogers G.W., Jr., Richter N.J., Lima W.F., Merrick W.C.(2001) Modulation of the helicase activity of eIF4A by eIF4B, eIF4H, and eIF4F. J.Biol.Chem. 276,30914-30922.

34. Rogers G.W., Jr., Komar A. A., Merrick W.C.(2002) eIF4A: the godfather of the DEAD box helicases. Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 72,307-331.

35. Yoder-Hill J., Pause A., Sonenberg N. Merrick W.C.(1993) The p46 subunit of eukaryotic initiation factor (eIF)-4F exchanges with eIF-4A. J.Biol.Chem. 268,5566-5573.

36. Altmann M., Muller P.P., Wittmer В., Ruchti F., Lanker S., Trachsel H.( 1993) A Saccharomyces cerevisiae homologue of mammalian translation initiation factor 4B contributes to RNA helicase activity. EMBO J. 12,3997-4003.

37. Ray B.K., Lawson T.G., Kramer J.C., Cladaras M.H., Grifo J.A., Abramson R.D., Merrick W.C., Thach R.E.(1985) ATP-dependent unwinding of messenger RNA structure by eukaryotic initiation factors. J.Biol.Chem. 260,7651-7658.

38. Pestova T.V., Kolupaeva V.G.(2002) The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev. 16,2906-2922.

39. Majumdar R., Maitra U.(2005) Regulation of GTP hydrolysis prior to ribosomal AUG selection during eukaryotic translation initiation. EMBO J. 24,3737-3746.

40. Kozak M.(l 999) Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234,187-208.

41. Fletcher C.M., Pestova T.V., Hellen C.U., Wagner G.(1999) Structure and interactions of the translation initiation factor elFl. EMBO J. 18,2631-2637.

42. Chaudhuri J., Si K., Maitra U.(l997) Function of eukaryotic translation initiation factor 1A (elFl A) (formerly called eIF-4C) in initiation of protein synthesis. J.Biol.Chem. 272, 7883-7891.

43. Chaudhuri J., Chowdhury D., Maitra U.(1999) Distinct functions of eukaryotic translation initiation factors elFIA and eIF3 in the formation of the 40 S ribosomal preinitiation complex. J.Biol.Chem. 274,17975-17980.

44. Raychaudhuri P., Chaudhuri A., Maitra U.(1985) Formation and release of eukaryotic initiation factor 2 X GDP complex during eukaryotic ribosomal polypeptide chain initiation complex formation. J.Biol.Chem. 260,2140-2145.

45. Pestova T.V., Lomakin I.B., Lee J.H., Choi S.K., Dever Т.Е., Hellen C.U.(2000) The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature 403, 332-335.

46. Jackson R.J.(2005) Alternative mechanisms of initiating translation of mammalian mRNAs. Biochem.Soc.Trans. 33,1231-1241.

47. Komar A.A., Hatzoglou M.(2005) Internal ribosome entry sites in cellular mRNAs: mystery of their existence. J.Biol.Chem. 280,23425-23428.

48. Pestova T.V., Kolupaeva V.G., Lomakin I.B., Pilipenko E.V., Shatsky I.N., Agol V.I., Hellen C.U.(2001) Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 98,7029-7036.

49. Ryabova L.A., Pooggin M.M., Hohn T.(2002) Viral strategies of translation initiation: ribosomal shunt and reinitiation. Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 72,1-39.

50. Ramakrishnan V.(2002) Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557-572.

51. Francklyn C., Perona J.J., Puetz J., Hou Y.M.(2002) Aminoacyl-tRNA synthetases: versatile players in the changing theater of translation. RNA 8,1363-1372.

52. Ogle J.M., Brodersen D.E., Clemons W.M., Jr., Tarry M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V.(2001) Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292, 897-902.

53. Rodnina M.V., Wintermeyer W.(2001) Fidelity of aminoacyl-tRNA selection on the ribosome: kinetic and structural mechanisms. Annu.Rev.Biochem. 70,415-435.

54. Uchiumi Т., Honma S., Nomura Т., Dabbs E.R., Hachimori A.(2002) Translation elongation by a hybrid ribosome in which proteins at the GTPase center of the Escherichia coli ribosome are replaced with rat counterparts. J.Biol.Chem. 277,3857-3862.

55. Kisselev L., Ehrenberg M., Frolova L.(2003) Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J. 22,175-182.

56. Spahn C.M., Beckmann R., Eswar N., Penczek P.A., Sali A., Blobel G., Frank J.(2001) Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae~tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions. Cell 107,373-386.

57. Wuyts J., Van de P.Y., Winkelmans Т., De W.R.(2002) The European database on small subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 30,183-185.

58. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M., Jr., Morgan-Warren R.J., Carter

59. A.P., Vonrhein C., Hartsch Т., Ramakrishnan V.(2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407, 327-339.

60. Demianova M., Formosa T.G., Ellis S.R.(1996) Yeast proteins related to the p40/laminin receptor precursor are essential components of the 40 S ribosomal subunit. J.Biol.Chem. 271,11383-11391.

61. Tabb-Massey A., Caffrey J.M., Logsden P., Taylor S., Trent J.O., Ellis S.R.(2003) Ribosomal proteins RpsO and Rps21 of Saccharomyces cerevisiae have overlapping functions in the maturation of the 3' end of 18S rRNA. Nucleic Acids Res. 31,6798-6805.

62. Ford C.L., Randal-Whitis L., Ellis S.R.(1999) Yeast proteins related to the p40/laminin receptor precursor are required for 20S ribosomal RNA processing and the maturation of 40S ribosomal subunits. Cancer Res. 59,704-710.

63. Liotta L.A.(1986) Tumor invasion and metastases-role of the extracellular matrix: Rhoads Memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 1-7.

64. Torok I., Herrmann-Horle D., Kiss I., Tick G., Speer G., Schmitt R., Mechler

65. B.M.(1999) Down-regulation of RpS21, a putative translation initiation factor interacting with P40, produces viable minute imagos and larval lethality with overgrown hematopoietic organs and imaginal discs. Mol.Cell Biol. 19,2308-2321.

66. Keppel E., Schaller H.C.(1991) A 33 kDa protein with sequence homology to the 'laminin binding protein' is associated with the cytoskeleton in hydra and in mammalian cells. J.Cell Sci. 100, 789-797.

67. Valasek L., Mathew A.A., Shin B.S., Nielsen K.H., Szamecz В., Hinnebusch A.G.(2003) The yeast eIF3 subunits TIF32/a, NIPl/c, and eIF5 make critical connections with the 40S ribosome in vivo. Genes Dev. 17,786-799.

68. Ramakrishnan V., Graziano V., Capel M.S.(1986) A role for proteins S3 and S14 in the 30 S ribosomal subunit. J.Biol.Chem. 261,15049-15052.

69. Brandt R., Gualerzi C.O.(1992) Ribosomal localization of the mRNA in the 30S initiation complex as revealed by UV crosslinking. FEBS Lett. 311,199-202.

70. Takahashi Y., Mitsuma Т., Hirayama S., Odani S.(2002) Identification of the ribosomal proteins present in the vicinity of globin mRNA in the 40S initiation complex. J.Biochem. 132, 705-711.

71. Westermann P., Nygard 0.(1984) Cross-linking of mRNA to initiation factor eIF-3,24 kDa cap binding protein and ribosomal proteins SI, S3/3a, S6 and SI 1 within the 48S pre-initiation complex. Nucleic Acids Res. 12, 8887-8897.

72. Wilson D.M., III, Deutsch W.A., Kelley M.R.(1994) Drosophila ribosomal protein S3 contains an activity that cleaves DNA at apurinic/apyrimidinic sites. J.Biol.Chem. 269,25359-25364.

73. Hegde V., Wang M., Deutsch W.A.(2004) Human ribosomal protein S3 interacts with DNA base excision repair proteins hAPE/Ref-1 and hOGGl. Biochemistry 43,1421114217.

74. Sandigursky M., Yacoub A., Kelley M.R., Deutsch W.A., Franklin W.A.(1997) The Drosophila ribosomal protein S3 contains a DNA deoxyribophosphodiesterase (dRpase) activity. J.Biol.Chem. 272,17480-17484.

75. Yacoub A., Augeri L., Kelley M.R., Doetsch P.W., Deutsch W.A.(1996) A Drosophila ribosomal protein contains 8-oxoguanine and abasic site DNA repair activities. EMBO J. 15,2306-2312.

76. Kim S.H., Lee J.Y., Kim J.(2005) Characterization of a wide range base-damage-endonuclease activity of mammalian rpS3. Biochem.Biophys.Res.Commun. 328,962-967.

77. Saeboe-Larssen S., Lyamouri M., Merriam J., Oksvold M.P., Lambertsson A.(1998) Ribosomal protein insufficiency and the minute syndrome in Drosophila: a dose-response relationship. Genetics. 148,1215-1224.

78. Jang C.Y., Lee J.Y., Kim J.(2004) RpS3, a DNA repair endonuclease and ribosomal protein, is involved in apoptosis. FEBS Lett. 560, 81-85.

79. Pogue-Geile K., Geiser J.R., Shu M., Miller C., Wool I.G., Meisler A.I., Pipas J.M.(1991) Ribosomal protein genes are overexpressed in colorectal cancer: isolation of a cDNA clone encoding the human S3 ribosomal protein. Mol.Cell Biol. 11,3842-3849.

80. Jantzen H., Schulze 1.(1987) Effect of essential amino acids on the phosphorylation of a 40S ribosomal protein and protein synthesis in Acanthamoeba castellanii. J.Cell Physiol. 130,444-452.

81. Kim H.D., Lee J.Y., Kim J.(2005) Erk phosphorylates threonine 42 residue of ribosomal protein S3. Biochem.Biophys.Res.Commun. 333,110-115.

82. Kim T.S., Jang C.Y., Kim H.D., Lee J.Y., Ahn B.Y., Kim J.(2006) Interaction of Hsp90 with Ribosomal Proteins Protects from Ubiquitination and Proteasome-dependent Degradation. Mol.Biol.Cell. 17,824-833.

83. Markus M.A., Gerstner R.B., Draper D.E., Torchia D.A.(1998) The solution structure of ribosomal protein S4 delta41 reveals two subdomains and a positively charged surface that may interact with RNA. EMBO J. 17,4559-4571.

84. Spedding G., Draper D.E.(1993) Allosteric mechanism for translational repression in the Escherichia coli alpha operon. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90,4399-4403.

85. Tang C.K., Draper D.E.(1989) Unusual mRNA pseudoknot structure is recognized by a protein translational repressor. Cell. 57, 531-536.

86. Jinks-Robertson S., Nomura M.(1982) Ribosomal protein S4 acts in trans as a translational repressor to regulate expression of the alpha operon in Escherichia coli. J.Bacteriol. 151,193-202.

87. Stansfield I., Jones K.M., Herbert P., Lewendon A., Shaw W.V., Tuite M.F.(1998) Missense translation errors in Saccharomyces cerevisiae. J.Mol.Biol. 282,13-24.

88. Dahlgren A., Ryden-Aulin M.(2000) A novel mutation in ribosomal protein S4 that affects the function of a mutated RF1. Biochimie 82,683-691.

89. Westermann P., Nygard 0.(1983) The spatial arrangement of the complex between eukaryotic initiation factor eIF-3 and 40 S ribosomal subunit. Cross-linking between factor and ribosomal proteins. Biochim.Biophys.Acta. 741,103-108.

90. Antoine M., Reimers K., Wirz W., Gressner A.M., Muller R., Kiefer P.(2005) Identification of an unconventional nuclear localization signal in human ribosomal protein S2. Biochem.Biophys.Res.Commun. 335,146-153.

91. Antoine M., Reimers K., Wirz W., Gressner A.M., Muller R., Kiefer P.(2005) Fibroblast growth factor 3, a protein with a dual subcellular fate, is interacting with human ribosomal protein S2. Biochem.Biophys.Res.Commun. 338,1248-1255.

92. Kowalczyk P., Woszczynski M., Ostrowski J.(2002) Increased expression of ribosomal protein S2 in liver tumors, posthepactomized livers, and proliferating hepatocytes in vitro. Acta Biochim.Pol. 49, 615-624.

93. Chiao P.J., Shin D.M., Sacks P.G., Hong W.K., Tainsky M.A.(1992) Elevated expression of the ribosomal protein S2 gene in human tumors. Mol.Carcinog. 5,219-231.

94. Swiercz R., Person M.D., Bedford M.T.(2005) Ribosomal protein S2 is a substrate for mammalian PRMT3 (protein arginine methyltransferase 3). Biochem.J. 386, 85-91.

95. Bachand F., Silver P.A.(2004) PRMT3 is a ribosomal protein methyltransferase that affects the cellular levels of ribosomal subunits. EMBO J. 23,2641-2650.

96. Sylvers L.A., Kopylov A.M., Wower J., Hixson S.S., Zimmermann R.A.(1992) Photochemical cross-linking of the anticodon loop of yeast tRNA(Phe) to 30S-subunit protein S7 at the ribosomal A and P sites. Biochimie. 74,381-389.

97. Robert F., Brakier-Gingras L.(2003) A functional interaction between ribosomal proteins S7 and SI 1 within the bacterial ribosome. J.Biol.Chem. 278,44913-44920.

98. Dean D., Yates J.L., Nomura M.(1981) Identification of ribosomal protein S7 as a repressor of translation within the str operon of E. coli. Cell. 24,413-419.

99. Saito K., Mattheakis L.C., Nomura M.( 1994) Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation. J.Mol.Biol. 235,111-124.

100. Robert F., Brakier-Gingras L.(2001) Ribosomal protein S7 from Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA. Nucleic Acids Res. 29,677-682.

101. McKim K.S., Dahmus J.B., Hawley R.S.(1996) Cloning of the Drosophila melanogaster meiotic recombination gene mei-218: a genetic and molecular analysis of interval 15E. Genetics. 144,215-228.

102. Weijers D., Franke-van D.M., Vencken R.J., Quint A., Hooykaas P., Offringa R.(2001) An Arabidopsis Minute-like phenotype caused by a semi-dominant mutation in a RIBOSOMAL PROTEIN S5 gene. Development 128,4289-4299.

103. Williams M.E., Sussex I.M.(1995) Developmental regulation of ribosomal protein LI6 genes in Arabidopsis thaliana. Plant J. 8,65-76.

104. Fukushi S., Okada M., Stahl J., Kageyama Т., Hoshino F.B., Katayama K.(2001) Ribosomal protein S5 interacts with the internal ribosomal entry site of hepatitis С virus. J.Biol.Chem. 276,20824-20826.

105. Jagannathan I., Culver G.M.(2003) Assembly of the central domain of the 30S ribosomal subunit: roles for the primary binding ribosomal proteins S15 and S8. J.Mol.Biol. 330,373-383.

106. Mougel M., Allmang C., Eyermann F., Cachia C., Ehresmann В., Ehresmann C.(1993) Minimal 16S rRNA binding site and role of conserved nucleotides in Escherichia coli ribosomal protein S8 recognition. Eur.J.Biochem. 215,787-792.

107. Merianos H.J., Wang J., Moore P.B.(2004) The structure of a ribosomal protein S8/spc operon mRNA complex. RNA 10,954-964.

108. Dean D., Yates J.L., Nomura M.(1981) Escherichia coli ribosomal protein S8 feedback regulates part of spc operon. Nature. 289, 89-91.

109. Lavoie C., Tarn R., Clark M., Lee H., Sonenberg N., Lasko P.(1994) Suppression of a temperature-sensitive cdc33 mutation of yeast by a multicopy plasmid expressing a Drosophila ribosomal protein. J.Biol.Chem. 269,14625-14630.

110. Bonham-Smith P.C., Oancia T.L., Moloney M.M.(1992) Cytoplasmic ribosomal protein SI5a from Brassica napus: molecular cloning and developmental expression in mitotically active tissues. Plant Mol.Biol. 18,909-919.

111. Akiyama N. Matsuo Y., Sai H., Noda M., Kizaka-Kondoh S.(2000) Identification of a series of transforming growth factor beta-responsive genes by retrovirus-mediated gene trap screening. Mol.Cell Biol. 20,3266-3273.

112. Lian Z., Liu J., Li L., Li X., Tufan N.L., Wu M.C., Wang H.Y., Arbuthnot P, Kew M., Feitelson M.A.(2004) Human SI5a expression is upregulated by hepatitis В virus X protein. Mol.Carcinog. 40,34-46.

113. Yusupov M.M., Yusupova G.Z., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H., Noller H.F.(2001) Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292,883896.

114. Noller H.F., Hoang L., Fredrick K.(2005) The 30S ribosomal P site: a function of 16S rRNA. FEBS Lett. 579, 855-858.

115. Hoang L., Fredrick K., Noller H.F.(2004) Creating ribosomes with an all-RNA 30S subunit P site. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101,12439-12443.

116. Malygin A.A., Shaulo D.D., Karpova G.G.(2000) Proteins S7, S10, S16 and S19 of the human 40S ribosomal subunit are most resistant to dissociation by salt. Biochim.Biophys.Acta. 1494,213-216.

117. Tsugeki R., Kochieva E.Z., Fedoroff N.V.(1996) A transposon insertion in the Arabidopsis SSR16 gene causes an embryo-defective lethal mutation. Plant J. 10,479-489.

118. Zengel J.M., Lindahl L.(1990) Ribosomal protein L4 stimulates in vitro termination of transcription at a NusA-dependent terminator in the S10 operon leader. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87,2675-2679.

119. Mogridge J., Mah T.F., Greenblatt J.(1995) A protein-RNA interaction network facilitates the template-independent cooperative assembly on RNA polymerase of a stable antitermination complex containing the lambda N protein. Genes Dev. 9,2831-2845.

120. Nodwell J.R., Greenblatt J.( 1993) Recognition of boxA antiterminator RNA by the E. coli antitermination factors NusB and ribosomal protein S10. Cell. 72,261-268.

121. Friedman D.I., Schauer A.T., Baumann M.R., Baron L.S., Adhya S.L.(1981) Evidence that ribosomal protein S10 participates in control of transcription termination. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78,1115-1118.

122. Hermann-Le D.S., Sipiczki M., Thuriaux P.(1994) Suppression of yeast RNA polymerase III mutations by the URP2 gene encoding a protein homologous to the mammalian ribosomal protein S20. J.Mol.Biol. 240,1-7.

123. Goldstone S.D., Lavin M.F.(1993) Isolation of a cDNA clone, encoding the ribosomal protein S20, downregulated during the onset of apoptosis in a human leukaemic cell line. Biochem.Biophys.Res.Commun. 196,619-623.

124. David C.L., Keener J., Aswad D.W.(1999) Isoaspartate in ribosomal protein SI 1 of Escherichia coli. J.Bacteriol. 181,2872-2877.

125. Fewell S.W., Woolford J.L., Jr.(1999) Ribosomal protein S14 of Saccharomyces cerevisiae regulates its expression by binding to RPS14B pre-mRNA and to 18S rRNA. Mol.Cell Biol. 19, 826-834.

126. Tasheva E.S., Roufa D.J.(1995) Regulation of human RPS14 transcription by intronic antisense RNAs and ribosomal protein S14. Genes Dev. 9,304-316.

127. Jakovljevic J., de Mayolo P.A., Miles T.D., Nguyen T.M., Leger-Silvestre I., Gas N., Woolford J.L., Jr.(2004) The carboxy-terminal extension of yeast ribosomal protein S14 is necessary for maturation of 43S preribosomes. Mol.Cell. 14,331-342.

128. Moritz M., Paulovich A.G., Tsay Y.F., Woolford J.L., Jr.(1990) Depletion of yeast ribosomal proteins LI6 or rp59 disrupts ribosome assembly. J.Cell Biol. Ill, 2261-2274.

129. Ogle J.M., Murphy F.V., Tarry M.J., Ramakrishnan V.(2002) Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell 111, 721-732.

130. Wilson D.N., Nierhaus K.H.(2005) Ribosomal proteins in the spotlight. Crit Rev.Biochem.Mol.Biol. 40,243-267.

131. Synetos D., Frantziou C.P., Alksne L.E.(1996) Mutations in yeast ribosomal proteins S28 and S4 affect the accuracy of translation and alter the sensitivity of the ribosomes to paromomycin. Biochim.Biophys.Acta. 1309,156-166.

132. Alksne L.E., Anthony R.A., Liebman S.W., Warner J.R.(1993) An accuracy center in the ribosome conserved over 2 billion years. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90,95389541.

133. Cukras A.R., Southworth D.R., Brunelle J.L., Culver G.M., Green R.(2003) Ribosomal proteins S12 and S13 function as control elements for translocation of the mRNA:tRNA complex. Mol.Cell. 12,321-328.

134. Van L.M., Vanderhaeghen R., De B.M., Bauw G., Villarroel R., Van M.M.(1994) An SI 8 ribosomal protein gene copy at the Arabidopsis PFL locus affects plant development by its specific expression in meristems. EMBO J. 13,3378-3388.

135. Mishra-Gorur K., Singer H.A., Castellot J.J., Jr.(2002) The S18 ribosomal protein is a putative substrate for Ca2+/calmodulin-activated protein kinase II. J.Biol.Chem. 277, 33537-33540.

136. Khanna N., Sen S., Sharma H., Singh N.(2003) S29 ribosomal protein induces apoptosis in H520 cells and sensitizes them to chemotherapy. Biochem.Biophys.Res.Commun. 304,26-35.

137. Khanna N., Reddy V.G., Tuteja N., Singh N.(2000) Differential gene expression in apoptosis: identification of ribosomal protein S29 as an apoptotic inducer. Biochem.Biophys.Res.Commun. 277,476-486.

138. Zhou Z.D., Bao L., Liu D.G., Li M.Q., Ge Y.Z., Huang Y.L., Liu W.Y.(2003) Low content of protein S29 in ribosomes of human lung cancer cell line a549: detected by two-dimensional electrophoresis. Protein Pept.Lett. 10,91-97.

139. Yano R., Yura T.(1989) Suppression of the Escherichia coli rpoH opal mutation by ribosomes lacking S15 protein. J.Bacteriol. 171,1712-1717.

140. Serganov A., Polonskaia A., Ehresmann В., Ehresmann C., Patel D.J.(2003) Ribosomal protein S15 represses its own translation via adaptation of an rRNA-like fold within its mRNA. EMBO J. 22,1898-1908.

141. Braun F., Le D.J., Regnier P.(1998) Ribosomes inhibit an RNase E cleavage which induces the decay of the rpsO mRNA of Escherichia coli. EMBO J. 17,4790-4797.

142. Haugel-Nielsen J., Hajnsdorf E., Regnier P.(l996) The rpsO mRNA of Escherichia coli is polyadenylated at multiple sites resulting from endonucleolytic processing and exonucleolytic degradation. EMBO J. 15,3144-3152.

143. Kim K.Y., Park S.W., Chung Y.S., Chung C.H., Kim J.I., Lee J.H.(2004) Molecular cloning of low-temperature-inducible ribosomal proteins from soybean. J.Exp.Bot. 55,1153-1155.

144. Denis M.G., Chadeneau C., Lecabellec M.T., LeMoullac В., LeMevel В., Meflah K., Lustenberger P.(1993) Over-expression of the S13 ribosomal protein in actively growing cells. Int.J.Cancer. 55,275-280.

145. Beaud G., Masse Т., Madjar J.J., Leader D.P.(1989) Identification of induced protein kinase activities specific for the ribosomal proteins uniquely phosphorylated during infection of HeLa cells with vaccinia virus. FEBS Lett. 259,10-14.

146. Simitsopoulou M., Avila H., Franceschi F.(1999) Ribosomal gene disruption in the extreme thermophile Thermus thermophilus HB8. Generation of a mutant lacking ribosomal protein SI7. Eur.J.Biochem. 266,524-532.

147. Dabbs E.R.(1978) Mutational alterations in 50 proteins of the Escherichia coli ribosome. Mol.Gen.Genet. 165, 73-78.

148. Boni IV, Zlatkin IV, Budowsky EI.(1982) Ribosomal protein SI associates with Escherichia coli ribosomal 30-S subunit by means of protein-protein interactions. Eur. J. Biochem. 121(2), 371-376.

149. Karlin S., Theriot J., Mrazek J.(2004) Comparative analysis of gene expression among low G+C gram-positive genomes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101, 6182-6187.

150. Sorensen M.A., Fricke J., Pedersen S.(1998) Ribosomal protein SI is required for translation of most, if not all, natural mRNAs in Escherichia coli in vivo. J.Mol.Biol. 280, 561569.

151. Komarova A.V., Tchufistova L.S., Supina E.V., Boni I.V.(2002) Protein S1 counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. RNA 8,1137-1147.

152. Boni I.V., Artamonova V.S., Tzareva N.V., Dreyfus M.(2001) Non-canonical mechanism for translational control in bacteria: synthesis of ribosomal protein SI. EMBO J. 20, 4222-4232.

153. Schnier J., Kitakawa M., Isono K.(l 986) The nucleotide sequence of an Escherichia coli chromosomal region containing the genes for ribosomal proteins S6, SI8, L9 and an open reading frame. Mol.Gen.Genet. 204,126-132.

154. Arnold R.J., Reilly J.P.( 1999) Observation of Escherichia coli ribosomal proteins and their posttranslational modifications by mass spectrometry. Anal.Biochem. 269,105-112.

155. Brodersen D.E., Clemons W.M., Jr., Carter A.P., Wimberly B.T., Ramakrishnan V.(2002) Crystal structure of the 30 S ribosomal subunit from Thermus thermophilus: structure of the proteins and their interactions with 16 S RNA. J.Mol.Biol. 316,725-768.

156. Persson B.C., Bylund G.O., Berg D.E., Wikstrom P.M.(1995) Functional analysis of the ffh-trmD region of the Escherichia coli chromosome by using reverse genetics. J.Bacteriol. Ill, 5554-5560.

157. Held W.A., Nomura M.(1975) Escherichia coli 30 S ribosomal proteins uniquely required for assembly. J.Biol.Chem. 250, 3179-3184.

158. Ryden-Aulin M., Shaoping Z., Kylsten P., Isaksson L.A.(1993) Ribosome activity and modification of 16S RNA are influenced by deletion of ribosomal protein S20. Mol.Microbiol. 7,983-992.

159. Gotz F., Dabbs E.R., Gualerzi C.0.(1990) Escherichia coli 30S mutants lacking protein S20 are defective in translation initiation. Biochim.Biophys.Acta. 1050, 93-97.

160. Gotz F„ Fleischer C., Pon C.L., Gualerzi C.O.(1989) Subunit association defects in Escherichia coli ribosome mutants lacking proteins S20 and LI 1. Eur.J.Biochem. 183,19-24.

161. Wirth R., Littlechild J., Bock A.(1982) Ribosomal protein S20 purified under mild conditions almost completely inhibits its own translation. Mol.Gen.Genet. 188,164-166.

162. Parsons G.D., Donly B.C., Mackie G.A.(1988) Mutations in the leader sequence and initiation codon of the gene for ribosomal protein S20 (rpsT) affect both translational efficiency and autoregulation. J.Bacteriol. 170,2485-2492.

163. Mackie G.A.(1992) Secondary structure of the mRNA for ribosomal protein S20. Implications for cleavage by ribonuclease E. J.Biol.Chem. 267,1054-1061,

164. Van D.J., Wijnands R.(1981) The function of ribosomal protein S21 in protein synthesis. Eur.J.Biochem. 118,615-619.

165. Held W.A., Nomura M., Hershey J.W.(1974) Ribosomal protein S21 is required for full activity in the initiation of protein synthesis. Mol.Gen.Genet. 128,11-22.

166. Izutsu K., Wada C., Komine Y., Sako Т., Ueguchi C., Nakura S., Wada A.(2001) Escherichia coli ribosome-associated protein SRA, whose copy number increases during stationary phase. J.Bacteriol. 183,2765-2773.

167. Maki Y., Yoshida H., Wada A.(2000) Two proteins, YfiA and YhbH, associated with resting ribosomes in stationary phase Escherichia coli. Genes Cells 5,965-974.

168. Wada A.(1998) Growth phase coupled modulation of Escherichia coli ribosomes. Genes Cells. 3,203-208.

169. Lutsch G., Stahl J., Kargel H.J., Noll F., Bielka H.(1990) Immunoelectron microscopic studies on the location of ribosomal proteins on the surface of the 40S ribosomal subunit from rat liver. Eur.J.Cell Biol. 51,140-150.

170. Westermann P., Heumann W., Bommer U.A., Bielka H., Nygard O., Hultin T.(1979) Crosslinking of initiation factor eIF-2 to proteins of the small subunit of rat liver ribosomes. FEBS Lett. 97,101-104.

171. Nygard O., Nilsson L., Westermann P.(1987) Characterisation of the ribosomal binding site for eukaryotic elongation factor 2 by chemical cross-linking. Biochim.Biophys.Acta. 910,245-253.

172. Kho C.J., Zarbl H.( 1992) Fte-1, a v-fos transformation effector gene, encodes the mammalian homologue of a yeast gene involved in protein import into mitochondria. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 89,2200-2204.

173. Cui K., Coutts M., Stahl J., Sytkowski A.J.(2000) Novel interaction between the transcription factor CHOP (GADD153) and the ribosomal protein FTE/S3a modulates erythropoiesis. J.Biol.Chem. 275,7591-7596.

174. Reynaud E., Bolshakov V.N., Barajas V., Kafatos F.C., Zurita M.(1997) Antisense suppression of the putative ribosomal protein S3A gene disrupts ovarian development in Drosophila melanogaster. Mol.Gen.Genet. 256, 462-467.

175. Jegalian K., Page D.C.(1998) A proposed path by which genes common to mammalian X and Y chromosomes evolve to become X inactivated. Nature. 394,776-780.

176. Zinn A.R., Alagappan R.K., Brown L.G., Wool I., Page D.C.(1994) Structure and function of ribosomal protein S4 genes on the human and mouse sex chromosomes. Mol. Cell Biol. 14, 2485-2492.

177. Watanabe M., Zinn A.R., Page D.C., Nishimoto T.(1993) Functional equivalence of human X- and Y-encoded isoforms of ribosomal protein S4 consistent with a role in Turner syndrome. Nat.Genet. 4,268-271.

178. Ashworth A., Rastan S., Lo veil-Badge R., Kay G.(1991) X-chromosome inactivation may explain the difference in viability of XO humans and mice. Nature. 351,406408.

179. Nygard O., Nilsson L.(1990) Translational dynamics. Interactions between the translational factors, tRNA and ribosomes during eukaryotic protein synthesis. Eur.J.Biochem. 191,1-17.

180. Hay N., Sonenberg N.(2004) Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev. 18,1926-1945.

181. Raught В., Peiretti F., Gingras A.C., Livingstone M., Shahbazian D., Mayeur G.L., Polakiewicz R.D., Sonenberg N., Hershey J.W.(2004) Phosphorylation of eucaryotic translation initiation factor 4B Ser422 is modulated by S6 kinases. EMBOJ. 23,1761-1769.

182. Pei L.(l 999) Pituitary tumor-transforming gene protein associates with ribosomal protein S10 and a novel human homologue of DnaJ in testicular cells. J.Biol. Chem. 274, 31513158.

183. Patel H.R., Terada N., Gelfand E.W.(1996) Rapamycin-sensitive phosphorylation of ribosomal protein S17 by p70 S6 kinase. Biochem.Biophys.Res.Commun. 227, 507-512.

184. Matsson H., Davey E.J., Draptchinskaia N., Hamaguchi I., Ooka A., Leveen P., Forsberg E., Karlsson S., Dahl N.(2004) Targeted disruption of the ribosomal protein SI 9 gene is lethal prior to implantation. Mol.Cell Biol 24,4032-4037.

185. Ellis S.R., Massey A.T.(2006) Diamond Blackfan anemia: A paradigm for a ribosome-based disease. Med.Hypotheses 66,643-648.

186. Soulet F., A1 S.T., Roga S., Amalric F., Bouche G.(2001) Fibroblast growth factor-2 interacts with free ribosomal protein SI9. Biochem.Biophys.Res.Commun. 289,591596.

187. Sato M., Saeki Y., Tanaka K., Kaneda Y.(1999) Ribosome-associated protein LBP/p40 binds to S21 protein of 40S ribosome: analysis using a yeast two-hybrid system. Biochem.Biophys.Res.Commun. 256, 385-390.

188. Xu W.B., Roufa D.J.(1996) The gene encoding human ribosomal protein S24 and tissue-specific expression of differentially spliced mRNAs. Gene. 169,257-262.

189. Bommer U.A., Lutsch G., Stahl J., Bielka H.(1991) Eukaryotic initiation factors eIF-2 and eIF-3: interactions, structure and localization in ribosomal initiation complexes. Biochimie. 73,1007-1019.

190. Uchiumi Т., Ogata K.(1986) Cross-linking study on localization of the binding site for elongation factor 1 alpha on rat liver ribosomes. J.Biol. Chem. 261,9668-9671.

191. Laine R.O., Hutson R.G., Kilberg M.S.(1996) Eukaryotic gene expression: metabolite control by amino acids. Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 53,219-248.

192. Laine R.O., Shay N.F., Kilberg M.S.(1994) Nuclear retention of the induced mRNA following amino acid-dependent transcriptional regulation of mammalian ribosomal proteins L17 and S25. J.Biol.Chem. 269,9693-9697.

193. Adilakshmi Т., Laine R.0.(2002) Ribosomal protein S25 mRNA partners with MTF-1 and La to provide a p53-mediated mechanism for survival or death. J.Biol.Chem. 277, 4147-4151.

194. Ivanov A.V., Malygin A.A., Karpova G.G.(2004) Human ribosomal protein S26 inhibits splicing of its own pre-mRNA. Mol.Biol.(Mosk). 38,676-683.

195. Baudin-Baillieu A., Tollervey D., Cullin C., Lacroute F.(1997) Functional analysis of Rrp7p, an essential yeast protein involved in pre-rRNA processing and ribosome assembly. Mol.Cell Biol. 17, 5023-5032.

196. Revenkova E., Masson J., Koncz C., Afsar K., Jakovleva L., Paszkowski J.(1999) Involvement of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S27 in mRNA degradation triggered by genotoxic stress. EMBO J. 18,490-499.

197. Redman K.L., Rechsteiner M.( 1989) Identification of the long ubiquitin extension as ribosomal protein S27a. Nature. 338,438-440.

198. Chan Y.L., Suzuki K., Wool I.G.(1995) The carboxyl extensions of two rat ubiquitin fusion proteins are ribosomal proteins S27a and L40. Biochem.Biophys.Res.Commun. 215, 682-690.

199. Olvera J., Wool I.G.(1993) The carboxyl extension of a ubiquitin-like protein is rat ribosomal protein S30. J.Biol.Chem. 268,17967-17974.

200. Nakamura M., Tanigawa Y.(1999) Biochemical analysis of the receptor for ubiquitin-like polypeptide. J.Biol.Chem. 274,18026-18032.

201. Baker R.T., Williamson N.A., Wettenhall R.E.(1996) The yeast homolog of mammalian ribosomal protein S30 is expressed from a duplicated gene without a ubiquitin-like protein fusion sequence. Evolutionary implications. J.Biol.Chem. 271,13549-13555.

202. Davis L., Engebrecht J.(1998) Yeast dom34 mutants are defective in multiple developmental pathways and exhibit decreased levels of polyribosomes. Genetics. 149,45-56.

203. McCahill A., Warwicker J., Bolger G.B., Houslay M.D., Yarwood S.J.(2002) The RACK1 scaffold protein: a dynamic cog in cell response mechanisms. Mol.Pharmacol. 62, 1261-1273.

204. Nilsson J., Sengupta J., Frank J., Nissen P.(2004) Regulation of eukaryotic translation by the RACK1 protein: a platform for signalling molecules on the ribosome. EMBO Rep. 5, 1137-1141.

205. Ron D., Chen C.H., Caldwell J., Jamieson L., Orr E., Mochly-Rosen D.(1994) Cloning of an intracellular receptor for protein kinase C: a homolog of the beta subunit of G proteins. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91, 839-843.

206. Liliental J., Chang D.D.(1998) Rackl, a receptor for activated protein kinase C, interacts with integrin beta subunit. J.Biol.Chem. 273,2379-2383.

207. Link A.J., Eng J., Schieltz D.M., Carmack E., Mize G.J., Morris D.R., Garvik B.M., Yates J.R., 111(1999) Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat.Biotechnol. 17, 676-682.

208. Gerbasi V.R., Weaver C.M., Hill S., Friedman D.B., Link А.Ц2004) Yeast Asclp and mammalian RACK1 are functionally orthologous core 40S ribosomal proteins that repress gene expression. Mol.Cell Biol. 24, 8276-8287.

209. Sengupta J., Nilsson J., Gursky R., Spahn C.M., Nissen P., Frank 1(2004) Identification of the versatile scaffold protein RACK1 on the eukaryotic ribosome by cryo-EM. Nat. Struct. Mol. Biol 11,957-962.

210. Baum S., Bittins M., Frey S., Seedorf M.(2004) Asclp, a WD40-domain containing adaptor protein, is required for the interaction of the RNA-binding protein Scpl60p with polysomes. Biochem.J. 380,823-830.

211. Shor В., Calaycay J., Rushbrook J., McLeod M.(2003) Cpc2/RACK1 is a ribosome-associated protein that promotes efficient translation in Schizosaccharomyces pombe. J.Biol.Chem. 278,49119-49128.

212. Balakin A.G., Skripkin E.A., Shatsky I.N., Bogdanov A.A.(1992) Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage lambda repressor. Nucleic Acids Дел 20, 563-571.

213. Tzareva N.V., Makhno V.I., Boni I.V.(1994) Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBS Lett. 337,189-194.

214. Terenin I.M., Dmitriev S.E., Andreev D.E., Royall E., Belsham G.J., Roberts L.O., Shatsky I.N.(2005) A cross-kingdom internal ribosome entry site reveals a simplified mode of internal ribosome entry. Mol.Cell Biol 25, 7879-7888.

215. Merrick W.C.(1979) Purification of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes. Methods Enzymol 60, 101-108.

216. Grifo J.A., Tahara S.M., Morgan M.A., Shatkin A.J., Merrick W.C.(1983) New initiation factor activity required for globin mRNA translation. J.Biol.Chem. 258, 5804-5810.

217. Schreier M.H., Erni В., Staehelin T.(l 977) Initiation of mammalian protein synthesis. I. Purification and characterization of seven initiation factors. J.Mol.Biol. 116,727753.

218. Shimizu Y., Inoue A., Tomari Y., Suzuki Т., Yokogawa Т., Nishikawa K., Ueda T.(2001) Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat.Biotechnol 19, 751755.