Белки, ковалентно связанные с вирусными и клеточными РНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

— п С '.)

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи

УДК 547.963.32.04; 577.122

ВАРТАПЕТЯН Андрей Борисович

БЕЛКИ, КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННЫЕ С ВИРУСНЫМИ И КЛЕТОЧНЫМИ РНК

02.СЮ.10 - Сиоорганическая химия, химия природных и ($изиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Москва 1993 г.

биохимии института МГУ им.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик, доктор биологических наук, профессор И.Г.Атабеков; доктор химических наук, профессор Э.И.Будовский; академик, доктор химических наук, профессор А.Д.Мирзабеков.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина РАН.

Защита состоится "ЛЗ" февраля 1993 г. в часов на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: П9899, Москва В-234, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан января 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

_——. российская

ГТг«Л'. * ГО С У ¡1 д р г т ¡-1^- , . : - ^ БИБЛИОТЕКА

Работа выполнена в лаборатории химии и нуклеопротеидов Научно-исследовательского

физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского М.В.Ломоносова

-------

Vе с ' " 7 * и. Г. Смирнова

^ : /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В процессах поддержания жизнедеятельности «ивой клетки и воспроизведения ее генетической информации центральное место занимают нуклеиново-белковые взаимодействия и, в частности, РНК-белковые взаимодействия. Круг биологических структур, состоящих из РНК и белка, очень широк, и в него попадают совершенно различные как в структурном, так и в функциональном отношении об'екты, такие как рибосомы и вирусы, информосомы и т.д. Существенной чертой известных до недавнего времени рибонуклеопротеидов являлось то обстоятельство, что взаимодействия между белком и РКК (ионные, гидрофобные, водородные связи) можно разрушить, используя жесткие денатурирушие обработки. РНК и белки довольно сильно различаются по своим свойствам, и поэтому после соответствующих обработок их можно отделить друг от друга.

Однако не так давно выяснилось, что круг рибонуклеопротеидов еще шире: были обнаружены вирусные РНК-белковые соединения, которые не удавалось разделить на составные компоненты, даже используя жесткие обработки. Причина заключалась в том, что белок был связан с РНК ковалентно. С функциональной точки зрения, целый ряд данных свидетельствовал об участии белка, входящего в состав ковалентного комплекса, з репликации той вирусной РНК, с которой он связан. В чем конкретно заключается эта роль, что общего в структуре и механизме функционирования таких соединений -предстояло выяснить. С другой стороны, если существуют вирусин-ковалентные РНК- белковые комплексы, то следует ожидать, Ч1о сходные структуры могут существовать и в нормальных, незараже;иых вирусами клетках. Какие белки входят в состав таких соединений, какова их роль в клетке, ззчем может быть нужна ковалентно связанная с белком РНК - вопросы далеко не праздные. Выбранное направление кажется тем более привлекательным, что новый тип РЖ-белковых структур подразумевает наличие у них и новых, возможно, неожиданных функция.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования яьилп-поиск новых вирусных, а также клеточных ковалзнтных РНК-белкош;/

соединений, характеристика составляющих их компонентов, определение структуры таких комплексов, выяснение функций белков, ковалентно связанных с РНК и характеристика их генов. Были поставлены и решались следующие задачи: I. Доказательство существования ковзлентного соединения вирусного белка vpg с вирионной РНК вируса энцефаломиокардита, характеристика бежа vpg - и 5'-концевой области вирусной РНК. 2. Установление структуры ковзлентного соединения vpg-PHK. 3. Моделирование репликации РНК вируса энцефаломиокардита in vitro и выяснение роли vpg в этом ¡Ü се. 4. Поиск клеточных ковалентных соединений белок-РНК, характеристика их компонентов и идентификация белка, связанного с РНК. 5. Характеристика генов этого бежа в геномах человека и е . сои. 6. Создание бактериального штамма-продуцента соответствующего белка человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Доказано наличие ковалентного соединения белка vpg с вирионной РНК вируса энцефаломиокардита; обнаружены две фзрмы бежа vpg. Определен тип связи между vpg и РНК. Определена первичная структура и предложена модель вторичной структуры 5'-концевой области РНК вируса энцефаломиокардита. Репликация РНК этого вируса моделирована в бесклеточной системе. Обнаружено образование соединения vpg-мононуклеотид, выполняющего, по всей видимости, функцию праймера, при инициации синтеза вирусной РНК.

Разработан подход для поиска клеточных РНК-бежовых комплексов. С его помощью в цитоплазме целого ряда клеток обнаружено ковалвнтное соединение белок-РНК. Показано, что бежовый компонент этих комплексов имеет МБ 13 кДа и идентичен протимозину а (ПроТа).' ПроТа связан с 5'-концом цитоплазматической РНК, имеющей длину около 20 нуклеотидных остатков. Обнаружено, что ПроТа эволюционно консервативен от бактерий до человека, что указывает на наличие у него универсальной клеточной функции. Амшшфщированы, клонированы и секвенированы безинтронные гены

ПроТа человеками—показана,_что они являются процв ссированными

псевдогенами. В геноме е. coli обнаружены-—нуклеотидаые последовательности, имеющие высокое сходство с различными областями гена ПроТа человека и ряд других особенностей, что

позволило высказать предположение о налички сплайсинга у эубактерий. Создан и использован для испытаний с целью создания медицинского иммуностимулирующего препарата бактериальный штамм-продуцент ПроТа человека.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XV и V Всесоюзных биохимических с'ездах, Ленинград, 1979 г., Киев, 1986 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Макромолекулы клетки. Структура, функции, вззимодейстие", Москва, 1979 г.; на Международном симпозиуме "Стратегия генома РНК-содержапда вирусов животных", Москва, 1980 г.; на Всесоюзном симпозиуме "Реализация наследственной информации", Паланга, 1980 г.: на и и IV двустороннем советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке", Пущино, 1980 г.. Киев, 1984 г.; на т Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии, Тбилиси, 1982 г.; на VI двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот", Цхалтубо. 1982 г.; на XVI конференции ФЕЮ, Москва, 1984 г.; на Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Москва, 1985 г.; на уиг об'единенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии", Рига, 1985 г.; на Всесоюзной конференции молодыа ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии", Москва, 1985 г.; на VIII двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот", Москва, 1986 г.; из Республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1986 г.; на Мевду народном симпозиуме "Фундаментальные я прикладные аспекты молекулярной биологии пикорнавирусов", Москва, 1988 г.; на VIII двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов", Иркутск, 1989 г.; на и двустороннем симпозиуме СССР-США "Структура эукариотического генома и регуляция его экспрессии", Тбилиси, 1989 г.; на х двустороннем симпозиуме СССР- Франция "Регуляция экспрессии генома зукзриот и прокариот", Киев, 1990 г.; на и и III Всесоюзной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия", Пущино, 1991 г., 1992 г.; на двустороннем российско-французском симпозиуме по физико-химическим основам

э

жизни, Конкарно (Франция), 1992 г.; на российско-американском симпозиуме "Геном человека", С.-Петербург, 1992 г.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ВИРУСНЫЙ ЕЕЯОК vpg, КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННЫЙ С ВИРИОННОИ РНК ВИРУСА ЭШШШЮМИОКАРДИТА

Об'ентом для этой части работы служил вирус энцефаломиокардата (ВЭМК) мышей, принадлежащий к семейству пикорнавирусов - мелких FHK-содержащих вирусов животных. Его геном - вирионнаа РНК - представляет собой одноцепочечную РНК положительной полярности длиной примерно 8000 нуклеотвдных остатков. Основанием для поиска белка, связанного с РНК ВЭМК, послужило обнаружение незадолго до этого низкомолекулярного вирус-специфического бежа VPg (ОТ viral grotein genome-linked ), ковалентно связанного с 5'-концом РНК другого представителя семейства пикорнавирусов - вируса полиомиелита <Lee et ai., 1977; Fianegan eu ai., i977>. Задача, таким образом, заключалась в том, чтобы понять, является ли такая структурная особенность как наличие ковалентно связанного с РНК белка общим свойством пикорнавирусов, и если да, то в чем может заключаться функция vpg и каков механизм образования этого соединения.

I.I. Обнаружение vpg ВЭМК

Бирионная РНК ВЗШГ, меченная изотопом in vivo, была выделена из вирусных частиц путем фенольной депротеинизации в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) для удаления нековалентно связанных структурных белков вируса и подвергнута исчерпывающему гидролизу РНКазами A, TI и Т2. В том случае, если с РНК ковалентно связан белок vpg, нуклеотид, принимающий участие в образовании данной связи, останется связанным с белком, т.к., какова бы ни была связь между vpg и РНК, РНКазы не способны ее гидролизовать. Так, в случае 5'-концевой локализации белка на РНК в результате гидролиза РНКазами должно образовываться соединение 32Р vpg-PHK, содержащее радиоактивный нуклеотид, что и позволит этот белок

обнаружить после его отделения от свободных нуклеотидов. Действительно, фракционирование гидролиззта РНК электрофорезом в полиакриламидном геле (ПАТ) выявило 32Р-содержащее соединение, и йе одно, а два, с годвижностями, соответствующими белкам размером

Рис. I.

Электрофоретический анализ продуктов гидролиза 32Р РНК ВЭМК. Приведены результаты радиоавтографа 12.5« ПАГ с ДСН.

1 - гидролиз РНКазами А, Т1, Т2;

2 - гидролиз РНКазами и фосфомоноэстеразой;

3 - гидролиз РНКазами и проназой.

Эти соединения обнаруживались лишь после исчерпывающего гидролиза вирусной РНК РНКазами и были чувствительны к обработке проназой, что ясно указывало на наличие в их составе белков. Эти белки являются вирус-специфическими, поскольку было показано, что их синтез происходит в условиях подавления трансляции клеточных, но не вирусных, мРНК. Обработка полученных соединений фосфомоноэстеразой высвобождала лишь половину радиоактивности в виде 32Р ортофосфата, сильно замедляя и нивелируя при этом разницу в электрофоретической подвижности исходных соединений. Более важно, что сохранение половины радиоактивности в составе соединений после дефосфоршшрования свидетельствует о вовлечении одного из фосфатов в образование связи с белками.

Таким образом, с геномной РНК ВЭМК, как и с РНК вируса полиомиелита, ковалентно связан урд. Обнаруженные белки были названы урдА и урдв. Их сравнительный анализ будет приведен ниже.

1.2. Соединение урд с РНК имеет структуру урд{Туг-о4)-ри " каким, образом урд присоединен к ежу для ответа на этот вопрос был охарактеризован тип связи между урд и РНК. и

10 кДа и 8 кДа - рис. I.

1 2 3

«Рв-ри — А

УРдА-рир• "РвВ-рОр-

идентифицированы аминокислотный остаток урд и нуклеотид РНК, принимающие участие в образовании этой связи. Анализ проводился как для урдА, так и для урдв по схеме, изображенной на рис. 2.

Рис. 2.

Схема анализа структуры

ковалентного соединения УРд-РНК ВЭМК. ФМЭ фосфэмонозстераза; ФДЭ -

фосфодиэстераза змеиного яда.

("р) РНК

^ РНКазы

("р)ура-ркр Кислотиый

ФМЭ.ФДЭ^Г ^^ гидролиз

(3'Р)РН+("Р)Р1 (э2 Р)амиш>кислотв- рНр | МИ

("Р) О-

Было показано, что оба исследуемых продукта гидролиза вирусной РНК действительно имеют структуру 3%> УРд-рир и, следовательно, отличаются лишь белковыми компонентами. После обработки фосфомоноэстеразой, отщеплявшей в каждом случав лишь один, 3'-концевой фосфат, обработка фосфодиэстеразой (ФДЭ) змеиного яда приводила к высвобождению оставшейся радиоактивной метки в виде 32Р уридин-5'-фэфата. Аналогичный результат -отщепление нуклеотида от урд - был получен и при жесткой обработке соединения урд-рир нуклеазой Р1. Чувствительность изучаемых соединений к обработке ФДЭ и нуклеазой Р1 подразумевает наличие фосфодиэфирной связи между урд и РНК. Об этом же свидетельствовали и химические свойства данной связи. Помимо этого, исходя из свойств использованных ферментов, вопрос о локализации связи урд-РНК решается в пользу 5'-концевого нуклеотида РНК, которым, таким образом, является уридаловая кислота.

Тот факт, что оба белка урд ВЭМК связаны с 5*-концевым нуклеотвдом РНК, следует интерпретировать так, что часть молекул вирусной РНК содержит на 5'-конце ковалентно связанный урдА, а другая часть - урдв. -

Последовательное расщепление урд в составе соединения урд-риг пронаэой и кислотой (см. схему 2) привело к образовашя

б

соединения, которое было идентифицировано как 32Р (туг-о4)-рир (рис. 3). Гидролиз фосфодиэфирной связи в этом соединении с помощью микрококковой нуклеазы в случае обоих белков уря привел к образованию равных количеств 32Р 0-фосфэтирозина и 32Р уридин-3'-фосфата.

40

ЭО (О

131

Tyr-pUp

-if)

рТуг

Lk

©

Up

JV

ф

рис. 3.

Идентификация соединения туг-о4- pup в качестве "узла связи" между vpg и РНК. Электрофорез на бумаге (рН 1,7) соединения 32р туг-рир (А) и продуктов его гидролиза микрококковой нуклеазой (Б).

Таким образом, vpg соединен макроэргической связью с фосфатной грутюй 5'-концевой уридиловой кислоты РНК БЭМК через жсигруппу остатка тирозина - рис". 4. Кстати говоря, это здинственный остаток тирозина в молекуле vpg, находящийся в 3-м толокении ОТ и-конца (Ра1тепЬегд а1., 1984),

[ФДЭ1

ЕВ

У|лил____^_ь о ОН

ФМЭ ПОСЛЕ РНКаэ

EBEi53

о

г |

)-Р-Ов ►ф

~РНК

Рис. 4. Ковалентное соединение урд-РНК ВЭМК имеет структуру

урд(туг-о4-ри)РНК. Стрелками показаны связи, гидролиз которых был использован для установления приведенной структуры. МН - микрококковая нуклеаза; , Р1 - нуклеаза Р1.

нелогичную структуру имеет ковалентное соединение vpg с РНК Яруса Шлиомиелита (Rothberg et al., 1978; Arabros and Baltimore,

1978). Эти данные позволяют заключить, что имеется общая для пикорнавирусов структура "узла связи" и должны существовать универсальные механизмы ее образования и гидролиза.

1.3. урдл и урдв - родственные белки

Для сравнения белков урдА и урдв их метили *251 реагентом Болтона-Хантера в составе комплекса УРд-РНК, выделяли

г

индивидуальные I урд-рир и сравнивали их двумерные пептидные карты, полученные путем гидролиза урд протеазой У8. Как следует из рис. 5, урдА и урдв обладают очень сходными пептидными картами, т.е. являются родственными белками.

*

Ф

Рис. 5. Пептидные УРдА (А)

карты

И УРдВ

(Б), полученные путем гидролиза урд стафилококковой протеазой у8.

9

Известно, что в геноме ВЭМК имеется лишь один ген урд

(РаХюепЬесд et а1., -1984). ПОЭТОМУ НЭИбОЛев рвВЛЬНОЙ ПРИЧИНОЙ

образования двух форм урд может являться неоднозначный процессинг вирусного полипротеина-предшественника при образовании зрелых

вирусных белков.

Другое замечание, которое уместно здесь сделать, касается размера vpg. Исходя из структуры гена, vpg имеет длину 20 аминокислотных остатков, т.е. это, по сути дела, пептид. Однако при гель-злектрофорезе он имеет аномальную подвижность (см. рис. I), что отмечалось и для vpg других вирусов.

1.4. 5*-концевая область РНК ВЭМК сильно структурирована

Нуклеотвднэя последовательность 5'-концевой области РНК ВЭМК

представляет определенный интерес уже хотя бы потому, что она непосредственно примыкает к vpg и мокет иметь отношение к образованию и гидролизу соединения vpg-PHK. Для определения этой нуклеотидкой последовательности было использовано то обстоятельство, что на расстоянии примерно 150 нуклеогидов от 5'-конца РНК ВЭМК расположена протяженная

poly (С)-последовательность (Чумаков и др., 1979).- РНК в этом месте была специфически гидролизована РНКазой Н в присутствии poiy(dG), образовавшийся 150-членный 5'-концевой фрагмент был мечен по З'-концу и секвенирован. Результаты представлены на рис. 6. Следует отметить, что инициаторше atg-кодоны в этой последовательности отсутствуют.

Шла построена модель вторичной структуры этой области вирусной РНК. Как видно из рис. 6, 5'-концевая область РНК ВЭМК сильно структурирована. Обращает на себя внимание тот факт, что в образование шпильки может быть вовлечен и 5'-концевой нуклеотид РНК, связанный с vpg. В настоящее время не ясно, в чем смысл наличия сильно структурированной области на 5'-конце РНК ВЭМК, Не. исключено, что структурированность 5'-конца плюс-цепи вирусной РНК , является лишь отражением соответствующей структуры 3'-концевой., области комплементарной минус-цепи РНК, необходимой, например, для узнавания соответствующего участка РНК репликазой (или vpg?) при инициации репликации вирусной РНК. .,

1.5. Репликация РНК ВЭМК in vitro с участием vpg

~ Естественно, возникает вопрос о том, как образуется соединение vpg-PHK и какова функция самого vpg. Ранее было высказано предположение, что vpg мог бы выполнять функцию праймерэ

с-с О-А С-С и*б С-С А~0

и.а и-а а-и

К .«

С-С С V

и с л л «•С/

№

к

и-А

&-С С'9 й-С б-С

ссс 10

А-и А-и

С-С_

О-л" о«-А

С с

6 с .

А С

^с-с

С-С

а-и и-А С-С . А-О

ис

А С . С-С ' С-С А-1) »-А

в

110 ^ 140 ^

Рис. 6.

Первичная и . вторичная структура 5'-концевой области РНК ВЭМК. Широкие стрелки указывают места расщепления РНК РНКазой Н в присутствии комплементарного олигонуклеотида, использованные при установлении нуклеотвдной последовательности РНК. Тонкими стрелками показаны участки РНК, доступные действию не специфиче ских РНКаз.

ССЦЙААСвС АС1>СССАССССААЛМ)АЛСААСА6ЛС...

)

11

при инициации синтеза РНК пихорнавирусов, т.е. синтез новых цепей РНК должен начинаться с присоединения к УРд первого нуклеотида будущей РНК, затем второго нуклеотида и т.д., приводя в конечном счете К образованию УРд-РНК (»)огао1:о et а1., 1977; Папедап а1., 1977). Данное предположение основывалось на том обстоятельстве, что урд локализован на 5'-конце РНК. и, в то же время, учитывало потребность пикорнавирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы в праймере для инициации репликации. Вообще говоря, такой механизм существует при инициации репликации некоторых ДНК, но не имеет прецедента в биосинтезе РНК. Поэтому в настоящей работе была предпринята попытка экспериментального подтверадения данной гипотезы. Наиболее веским доводом в ее пользу служило бы обнаружение гипотетического соединения урд с первым нуклеотидом вирусной РНК - урд-ри. В качестве экспериментальной системы была использовава содержащая мембраны фракция цитоплазмы клеток асцитной карциномы мышей Кребс 2, зараженных ВЭМК, содержащая, как ожидалось, полный набор компонентов для репликации вирусной РНК. Для детекции' продуктов репликации использовался а-3^р итр,

поскольку именно этот нуклеотид, как предполагалось, должен ПрИСОеДИНЯТЬСЯ К VPg.

Шло продемонстрировано, что в Оесклеточной системе происходит образование полноразмерных молекул вирусной РНК - рис. 7А. Анализ вновь синтезированной РНК путем гибридизации ее с вирионной РНК(плюс-цепь) и двуцепочечной репликативной формой РНК ВЭМК показал, что in vitro, как и in vivo, происходит эффективный синтез именно шпос-цепей РНК (рис. 7Б). Таким образом, элонгация молекул РНК ВЭМК в использованной Оесклеточной системе хорошо отражает ситуацию, существующую in vivo.

А

f

Рис. 7. Образование полноразмерных плюс-цепей РНК ВЭМК in vitro. А - электрофорез в агарозе 32Р-меченных продуктов репликации вирусной РНК; В - гибридизация 32Р РНК, синтезированной in vitro, с возрастающими количествами намеченной вирионной РНК (вРНК, плюс-цепь) и двухцепочечной вирусной репликативной формы (РФ) РНК.

Для анализа продуктов инициации синтеза вирусной РНК была использована способность vpg переводить ковалентно Связанные с ним короткие фрагменты РНК в органическую фазу при фенольной экстракции, что оказалось чрезвычайно удобным приемом для идентификации белка-праймера. Анализ соединений, перешедших п фенольную фазу и несущи радиоактивность, происходящую из р итр, позволил обнаружить среди продуктов репликации вирусной РНК искомое соединение Р vpg-pu, а также vpg, связанный с коротким олигонуклеотидом. Из рис. 8 следует, что in vitro происходит

-23 S -16 8

РФ РНК

образование трех основных соединений, в состав которых входит урд

с ковалентно присоединенным к нему коротким фрагментом РНК. Одно

из этих соединений имеет подвижность урд-ри и резистентно к

обработкам РНКазами и фосфомоноэстеразой. Тот факт, что

соединение, идентифицированное как урд-ри, действительно содержит

только один нуклеотид, связанный с урд, было дополнительно

ч?

подтвервдено анализом Р нуклеотид-пептидов, полученных при расщеплении белкового компонента протеазой. Два других продукта представляют собой урдА-олигонуклеотид и урдв-олигонуклеотид, поскольку их обработка РНКазами приводит к образованию из них урдА-рир и урдв-рир, соответственно. Длина олигонуклеотвдов, присоединенных к урд, очень мала: один из основных исследованных продуктов имеет структуру урд-ририрй, идентичную 5'-концевой структуре плюс-цепи РНК ВЭМК. _

1 2 3 4 5

I1

*

—Vf^-po

-VPgA-pUp

—VPgB-pOp

Рис. 8. При репликации РНК ВЭМК in vitro происходит образование vpg-моно- и vpg-олигонуклеотидов. Приведены результаты фракционирования в 12,5% ПАТ с ДСН: I - растворимые в феноле продукты репликации вирусной РНК; 2 - то же, после обработки РНКазами; 3 - то хе. после обработки РНКазами и проназой; 4 и 5 -маркеры vpg-pu и vpgA,B-pUp, соответственно.

В результате кислотного гидролиза 32Р vpg-pup удалось получить Э2Р О-фзсфотирозин в качестве единственной фосфосодержащей аминокислоты - рис. 9. Таким образом, образующееся

in vitro соединение имеет структуру VPg(Tyr-04)-pU..., что полностью соответствует определённой ранее структуре соединения vpg-вирионная РНК. Помимо этого, полученные в этих экспериментах данные прямо свидетельствуют о том, что все стадии процесса, приводящего к образованию vpg, связанного с растущей цепью РНК, в том числе уридилирование бежа и образование первой межнуклеотидной связи', могут происходить in vitro.

Рис. 9.

vpg присоединен к 5'-концевой уридиловой кислоте вновь синтезированных олигонуклеотидов через остаток тирозина. Электрофорез на бумаге (рН 1,7) продуктов кислотного гидролиза VPg-pUp (рис. 8, Ж, трек 2). cm

Следует отметить, что в обнаруженном процессе уридилирования vpg важную, хотя, возможно, и непрямую роль играет ассоциация вирусного репликативного комплекса с мембранами. Их солюбилизация приводит к неспособности осуществлять vpg-зависимую инициацию синтеза РНК, хотя способность к элонгации цепей в значительной степени сохраняется.

Среди продуктов репликации вирусной РНК были обнаружены также и более протяженные молекулы РНК, связанные с vpg, инициация синтеза которых происходила в бесклеточной системе. Количественная оценка утилизации праймера vpg-pu при репликации дала следующие-результаты: в системе образуется определенный избыток праймера, из которого 25-70$ vpg-pu злонгируется с образованием соединения vpg-олигонуклеотид. Дальнейшей же элонгации с образованием vpg-полинуклеотцдов подвергается не более 5% этих молекул. Накопление больших количеств соединения vpg-олигонуклеотид может быть следствием абортивной инициации синтеза вирусной РНК -явления, известного для РНК-полимераз. В то же время, надо

отметить, что низкая способность соединения урд-олигонуклеотид к элонгации может быть кажущейся и об'ясняться специфическим отщеплением урд от более длинных молекул вирусной РНК соответствующим ферментом (см. ниже). Количество таких молекул РНК, инициация синтеза которых происходила с участием урд, но которые затем утратили концевой белок, не могло быть оценено.

На рис. 10 представлена модель синтеза плюс-цепи РНК ВЭМК, основанная на полученных в данной работе результатах:

1 стадия: образование праймера для синтеза РНК, соединения урд-ри, путем уридилирования урд по остатку тирозина;

2 стадия: собственно инициация синтеза РНК, т.е. образование первой межнуклеотидной связи путем присоединения следующего нуклеотида к 3'-гидроксилу уридиловой кислоты праймера урд-ри; накопление соединения урд-олигонуклеотид; ~

3 стадия: дальнейшая элонгация с образованием полноразмерных Молекул вирусной РНК, несущих на 5'-конце ковалентно связанный урд в качестве воспоминания о механизме инициации синтеза РНК.

Рис. 10.

Модель инициации синтеза плюс-цепи РНК ВЭМК с участием белка-затравки УРд-рЦ.

VPg

|УРЁ1 ф + итр

э* е»—Цепь

ШЕЁШ 3"_"_^

_УРв

|УР8-рИео| ц^риис.^-*

УРе

Создается впечатление, что аналогичный механизм, использующий урд-ри в качестве праймера, может быть приложим и к инициации синтеза минус-цепи вирусной РНК, имеющей на 5'-конце олиго(и)-последовательность. Имеющиеся в литературе данные на этот

счет противоречивы (Baron and Baltimore, 1982; Tobin et al.,1989).

Наконец, стоит заметить, что следует ожидать участия vpg не' только в процессе репликации вирусной РНК, но и в других процессах жизненного цикла пикорнавирусов, таких как сборка вирусных частиц, регуляция трансляции и т.д. Действительно, было бы странно, если бы природа не извлекла максимум из существования такого ковалентного РНК-белкового соединения, ограничившись "всего лишь" затравочной функцией белка.

2. КЛЕТОЧНЫЙ БЕЛОК ПР0ТИМ03ИН а, КОВАЛШГНО СВЯЗАННЫЙ С КОРОТКОЙ ЦИТОППАЗМАТИЧЕСКОЙ РНК

На основании предыдущей части работа можно сделать заключение о существовании ковалентного соединения вирусного белка с РНК ВЭМК, составить представление о его структуре, механизме образования и функции белка. Вирусы можно рассматривать как полигон, на котором моделируются различные клеточные структуры и механизмы. В связи с этим возникает вопрос, существуют ли клеточные ковалентные соединения РНК с белком. Этот вопрос тем более правомерен, что в клетках эукариот был обнаружен фермент, способный отщеплять vpg от вирусной РНК, специфично гидролизуя фосфодиэфирную СВЯЗЬ мевду НИМИ (Arabros et al., 1978), И ЭТО был

клеточный, а не вирусный фермент. С другой стороны, вопрос о существовании клеточных коваленгннх РНК-белковых комплексов явно заслуживает внимания: коль скоро существование вирусных соединений с такой необычной структурой' оказалось связанным с совершенно необычной функцией - праймированием синтеза РНК белком, то можно надеяться, что, в случае существования аналогичного клеточного соединения, от него также следует ожидать сюрпризов.

2.1. Обнаружение клеточного ковалентного соединения белок-РНК

Для поиска клеточного ковалентного соединения белок-РНК были выбраны клетки асцитной карциномы мышей Кребс 2, те самые клетки, в которых размножался вирус энцефаломиокардата, с геномной РНК которого, как показано в Части I, ковалентно связан белок vpg. Однако на сей раз тактика поиска была изменена. Чтобы обнаружить

ковалентный комплекс, клетки мьшей лизировали и нуклеиновые кислоты отделяли от нековалентно связанных белков путем .фенольной депртеинизации в присутствии мощного детергента ДСН. ДНК затем удаляли обработкой ДНКазой I. Логика при этом была такова: в случае существования ковалентного РНК-белкового комплекса, ковалентно связанный белок не должен отделяться от РНК, а оставаться вместе с ней в водной фазе. Этот простой прием позволил отделить нековалентно связанные клеточные белки от РНК, и задача была сведена к поиску в препарате суммарной РНК той из них, с которой связан белок, с этой цель» в полученный препарат суммарной

тос

клеточной РНК вводили _ 1-метку с помощью х реагента Болтона-Хантера, специфично метящего белки по аминогруппам, но не взаимодействующим с РНК. Затем РНК фракционировали по размеру, ожидая при этом, что га РНК, с которой связан белок, будет нести радиоактивную метку и может быть таким образом идентифицирована.

Рис. II демонстрирует, что действительно, при гель-электрофорезе РНК обнаруживается одна мажорная полоса с подвижностью, несколько превышающей подвижность тРНК. Это соединение чувствительно как к обработке РНКаэой, так и протеазой, что предполагает наличие в нем как РЖ, так и белкового компонента.

Полученные результаты позволяют сделать предварительное заключение о существовании в клетках мышей ковалентного РНК-белкового комплекса. Следует ли из полученных данных, что такой комплекс в клетке единственный? По-видимому, не следует, т.к. были выявлены и другие, минорные полосы, которые могут соответствовать РНК-белковым комплексам, судя по использованным критериям. Однако для дальнейших экспериментов было выбрано именно то соединение, которое изображено на рис. II, в силу значительных его количеств в клетке.

2.2. Белок ковалентно связан с короткой, но индивидуальной РНК

Электрофорегическая подвижность исследуемого соединения свидетельствует о небольшой длине РНК, связанной с белком. Для того, чтобы более точно оцределить размер РНК, белковый компонент комплекса был гидролизован протеазой и выделен 1251 пептид-РНК (рис. 12). Это соединение, как и следовало ожидать, могло быть

1 2 3

т РНК-

рис. II. .

Идентификация клеточного ковалентного ■ соединения белок-РНК. i-меченый

препарат суммарной РНК мыши фракционирован методом электрофореза в В% ПАТ: I - без дополнительных обработок;

2 - после обработки протеиназой К;

3 - после обработки РНКазой 12.

Щ 12 3 4

• i ••.

-i • •

Рис. 12.

Электрофоретический анализ соединения Г251 пептвд-РНК в 20% ПАТ. I - белок-РНК; 2 - пептид-РНК;

исчерпывающий (3) и частичный гидролиз (4) I25i пептида-РНК РНКазой 12.

исчерпывающе гидролизовано РНКазой. Если же обработка неспецифической РНКазой проводилась в условиях статистического гидролиза РНК, то после электрофоретического разделения продуктов гидролиза обнаруживался набор 1251-содержащих полос ("лестница"), соответствующий меченому пептиду белка, ковалентно связанному с молекулами РНК различной длины (рис. 12, трек 4). Пересчитав ступени этой "лестницы", можно прийти к заключению, что РНК имеет длину около 20 нуклеотидных остатков.

Данные, приведенные на рис. 12, позволяют сделать еще один важный вывод, о наличии ковалентной связи между белком и РНК в исследуемом соединении, подтверждая предположение, сделанное в более мягкой форме выше. Действительно, после удаления основной части белка в результате протеолитической обработки

ТОК

соответствующий 1-пептид остается связанным с РНК и с самыми короткими продуктами ее деградации, что невозможно себе представить при любом другом типе взаимодействий.

Эта маленькая РНК, связанная с белком, имеет свободный

•5?

3'-конец. Она способна акцептировать Р рСр в реакции с РНК-лигазой, хотя процесс этот крайне неэффективен. Помимо этого, ФДЭ змеиного яда гидролизует эту РНК, что также указывает на наличие свободной З'-гидроксильной группы. В то же время, 5'-конец РНК блокирован для действия полинуклеотидкиназы даже после удаления возможных 5'-концевых фосфатных и кэп-групп. Полученные результаты указывают на то, что белок присоединен к 5'-концу РНК, как было установлено и для вирусного соединения урд-РНК.

Не является ли малая длина РНК, связанной с белком, следствием ее деградации при выделении комплекса? Против этого предположения свидетельствует тот факт, что на 3'-конце РНК присутствует З'-гидроксильная, а не фосфатная груша, чего следовало бы ожидать в случае неспецифической деградации РНК РНКазами. С другой стороны, в исследуемом препарате суммарной клеточной РНК присутствуют высокополимерные РНК, что говорит об эффективности процедур, используемых для выделения РНК.

По причине низкого включения 3'-концевой метки в связанную с белком РНК секвенирование этой РНК затруднено. Но хотелось хотя бы ответить на вопрос, связана ли с белком какая-либо определенная РНК, или РНК-компонент комплекса гетерогенен по составу. Для

% TPS

ответа на этот вопрос РНК, содержащая на 5'-конце i-меченыП

пептид, была исследована методом так называемого векторного

анализа. РНК статистически гидролизовали ФДЭ змеиного яда, и

радиоактивные продукты гидролиза разделяли в двумерной системе.

Этот метод дал весьма предварительное представление о нуклеотидной

последовательности РНК, однако два вывода он позволил сделать

вполне определенно. Во-первых, с белком связана индивидуальная

РНК; во-вторых, в составе этой короткой РНК имеется олиго(А)-блок,

отстоящий на 5-6 нуклеотидных остатков от 5'-конца молекулы.

Наконец, для локализации соединения белок-РНК в клетках мышей

TPS

были отдельно проанализированы i-меченые препараты ядерной и цитоплазматической РНК. Выяснилось, что львиная доля комплекса (более 95%) локализована в цитоплазме, и лишь следовые количества его удается обнаружить в препарате ядерной РНК.

2.3. Белок, ковалентно связанный с РНК, идентичен протимозину а

Характеристика РНК-связанного белка была начата с определения

T?S

его молекулярного веса. Комплекс i белок-РНК обрабатывали РНКазой для удаления РНК-компонента и анализировали методом ' гель-электрофореза с ДСН - рис. 13. Удаление короткой РНК не

T9R

сказалось на электрофореотческой подвижности х-меченого соединения, которая соответствовала белку с MB 13 кДа. Этот результат хотя и кажется странным на первый взгляд, согласуется с наблюдениями, сделанными при изучении белков с искусственно пришитыми к ним короткими фрагментами РНК. Чувствительность

трс

исследуемого i-меченого соединения к обработке протеазой (рис. 13, трек 2) подтверждает его белковую природу.

Рис. 13.

Характеристика бежа, связанного с РНК.

т ос

Электрофорез соединения i белок-РНК в 20% ПАТ с ДСН: I - без дополнительных обработок; 2- после обработки протеиназой К; 3 - после обработки РНКазой Т2.

1 2 3

12.3-«

Для идентификации белка . был получен немеченый комплекс белок-РНК в количестве 50 мкг, для чего потребовалось разработать простую, ко эффективную процедуру его выделения и очистки. Заключительной стадией этой процедуры явилась обращенно-фазовая ВЭЖХ, пгодемонстрировавшая, что получено вполне индивидуальное соединение - рис. 14А. Прямое секвенирование белкового компонента комплекса не увенчалось успехом, по всей вероятности из-за наличия блокирующей группы на ы-конце белка. Проблему удалось решить, получив индивидуальные триптические пептиды данного белка (рис.

14Б). ---------- ------- ----------- ----------------

Б

з и 5

12 8

I

> I

10 20 30 40 •РШ1Ш (Щи)

16 13.6

5 « И 20 2& 10 35 40 45

«рхканн"'

Рис. 14. ВЭЖХ соединения белок-РНК мыши (А) и триптических пептидов белка, связанного с РНК (Б).

Для определения аминокислотной последовательности были выбраны пептида 1-у. Аминокислотные последовательности, полученные при их секвенировашш, представлены в Таблице. Как видно, пептида содержат большое количество остатков кислых аминокислот, 8 ароматические1 и серосодержащие аминокислотные остатки полностью

»

3

'отсутствуют. Этот вывод- справедлив и для Селка в целом, что следует из анализа его аминокислотного состава. Пептид V не был секвенирован до самого С-конца из-за его большой длины и присутствия протяженных блоков, состоящих из остатков глутаминовой кислоты. Пептид XV оказался устойчив к деградации по Эдману, по-видимому, из-за наличия блокирующей группы на и-конде. Это обстоятельство может служить критерием для идентификации его в качестве ы-концевого пептида РНК-связанного белка.

Таблица.

Аминокислотные последовательности триптических пептидов РНК-связанного белка из клеток асцитной карциномы мыши Кребс п.

NN последовательность

I 15вьх17

II э УАЕООЕБООУЕТК

III 21ЕУУЕЕАЕЫСИ30

IV блокированный и-конец(1-14?)

V 31ОАРАЫСЫА(ЭЫЕЕМСЕ0ЕАОЫЕ\ГОЕЕЕЕЕССЕЕЕЕЕЕЕ??.

Цифрами вверху указан порядковый номер аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности прогимозина а крысы (см.ниже).

Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов РНК-связанного бежа с банком известных белковых последовательностей выявило единственный сходный белок проткмозин а (ПроТа) КРЫСЫ. В СОСТЭВ ПроТа ВХОДЯТ ЭМИНОКИСЛОТНЫе последовательности всех секвенированных нами триптических пептидов РНК-связанного белка мыши без малейших изменений - рис. 15. В последовательности ПроТа эти участки фланкированы остатками основных аминокислот, т.е. именно они и ;должны выщепляться при триптическом гидролизе ПроТа. Поэтому неудивительно, что профили злюции при ВЭЖХ триптических пептидов этих двух белков практически

идентичны. Более того, ПроТа крысы имеет длину III аминокислотных остатков (MB 12,5 кДа), что соответствует, размерам РНК-связанного белка мыши. И наконец, ПроТа содержит на ы-конце блокирующую группу (ацетилсерин).

ю го

Де-SDAAVOTSSEITTIC OLK Е К К Е V V Е Е 30 Ю SO

А Е Н а ИOAPAHGHAQWEEtfgCQEADH

60 70

EVDEEEEE3BEEEEEEEE0DQEEED

80 90 100

QDEDEEAEAPTQKR VAEODEDDDVE 110

tjckqkkidedd

Рис. 15. Аминокислотная последоваельность ПроТа крысы. Подчеркнуты последовательности ' триптических пептидов РНК-связанного белка мыши (см. Таблицу).

На основании перечисленных выше данных следует заключить, что низкомолекулярный белок, ковалентно связанный с РНК, является ПроТа.

2.4. Протимоэин а - вездесущий белок

Щё перед тем, как стало ясно, что РНК-связанный белок является ПроТа и его следует искать у позвоночных, была исследована распространенность соединений белок-РНК в клетках различных организмов. С этой целью были получены и проанализированы препараты г251-меченых суммарных РНК из клеток человека (rd), дрожжей (s.cerevisiae) и бактерий (е.coli). Выяснилось, что в клетках всех исследованных организмов присутствует соединение, обладающее электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности комплекса ПроТа-РНК мыши -рис. 16. Более того, анализ этих соединений показал, что во всех случаях с белком связана РНК. Оценка содержания РНК-белкового комплекса в клетках различных организмов, хотя и весьма приблизительная, дала следуюцие результаты: клетки человека и мыши

'- примерно Ю5. копий комплекса на kjhj . ^у, клетки дрожжей - I02, клетки E.coii - 10 копий на клетку.

Рис. 16.

ОТ. А

• ,„ - Идентификация соедине-л* . , : ний, сходных с комплек-

'.••;■"..'.'■ '.'. СОМ ПроТа-РНК мыши, вы-

• * ' деленных из клеток раз" личных организмов.

1251-меченые препараты * суммарных РНК мыши (I),

• 17 дрожжей (2), человека " (3) и бактерий (4) фракционированы электрофорег -■• ' ' зом в 20% ПАТ с ДСН.

Были получены триптические пептидные карты ^^-меченых белков, входящих в состав комплексов из разных организмов. Они выявили удивительное сходство РНК-связанных белков меаду собой и почти полную идентичность их ПроТа мыши - рис. 17.

Этот результат свидетельствует об исключительно высокой эволюционной консервативности ПроТа, от бактерий до человека. Вообще говоря, круг белков с такой степенью консервативности весьма ограничен. Следует ожидать поэтому, что ПроТа обладает некой универсальной функцией и играет в клетке фундаментальную роль. По-видимому, во всех случаях помогает ПроТа играть эту, пока неизвестную, роль ковалентно связанная с ним РНК.

2.5. В каком соответствии находятся результаты, полученные в настоящей работе, с представлениями о ПроТа?

ПроТа был впервые выделен из тимуса млекопитающих в 1985 г. и первоначально классифицирован как тимусный гормон, или предшественник тимусного гормона тимозина а1 (отсюда и его название). Как химозин а1 (28-членный ы-концевой пептид ПроТа), так и сам ПроТа обладают иммуностимулирующей активностью, причем у ПроТа она гораздо более ярко выражена. Не исключено, что обнаружение тимозина «I является следствием протеолити-еской

! А '

о ^

о

♦ •

Б Б

TJC

Рис. 17. Триптические пептидные карты i-меченых РНК-связанных белков человека (А), мыши - ПроТа (Б), дрожжей (В) и E.coli (Г).

деградации очень лабильного ПроТа.

Несколько позже выяснилось, что ПроТа если и является тимусным гормоном, то очень необычным: он эксцрессируется в самых разных тканях, а не только в тимусе; у 'белка отсутствует N-концевая сигнальная последовательность, которая могла бы отвечать за его секрецию. Вместо этого вблизи С-конца ПроТа имеется последовательность, ответственная за транспорт этого белка в ядро ( "кариофильный сигнал" kkqk, см. рис. 15), и ПроТа действительно способен накапливаться в ядре.

Обнаруженный в настоящей работе факт присутствия ПроТа в клетках дрожжей и бактерий ясно демонстрирует, что ПроТа не является гормоном в обычном смысле слова, или, по крайней мере,

иммуностимулирующая активность не является единственной и основной функцией данного белка. У ПроТа должна быть и общеклеточная функция. Результаты, полученные за последние два года в разных лабораториях, свидетельствуют о том, что такой функцией ПроТа может быть участие в процессах клеточного деления. Действительно, стимуляция деления клеток приводит к резкому усилению транскрипции гена этого белка. Видимо, это связано с недавно обнаруженным свойством онкобелкз мус специфично активировать транскрипцию гена ПроТа. С другой стороны, блокирование образования ПроТа человека с помощью ангисмысловых олигонуклеотидов приводит к остановке клеточного деления. В чем конкретно заключается роль ПроТа -неизвестно. Имеющиеся у нас данные указывают на возможность участия ПроТа в транскрипции, по крайней мере, в клетках бактерий.

В этой связи уместно отметить, что, хотя ПроТа и способен транспортироваться в ядро, что логично для белка, участвующего в пролиферации клеток, данные о его внутриклеточной локализации очень противоречивы и указывают то на ядерную, то на цитоплазматическую локализацию ПроТа. В случае ковалентного соединения ПроТа-РНК, впервые обнаруженного в настоящей работе, данное соединение, как показано выше, локализовано почти исключительно в цитоплазме. Можно попробовать свести перечисленные выше данные в одну картину. В том случае, если ПроТа проникает в ядро для участия в делении клеток, то очевидно, этот процесс должен регулироваться. Регуляция может осуществляться на самых разных стадиях, включая образование самого белка и его транспорт в ядро. Можно представить, что, ковалентно присоединяясь к РНК, ПроТа утрачивает способность транспортироваться в ядро. Для такого допущения есть серьезные основания: показано, что фосфорилирование целого ряда ядерных белков препятствует их проникновению в ядро, йце логичней предположить, что ПроТа связывается со своей собственной мРНК или ее фрагментом, таким образом инактивируя ее и приводя к заякореванию самого белка в цитоплазме.

Понятно, что приведенные выше рассуждения умозрительны. Однако они и проверяемы. Определение нуклеотидяой последовательности присоединенной к ПроТа РНК может пролить свет на ход событий, связанных с клеточным делением.

2.6. Безинтронные гены ПроТа человека

Для понимания функций ПроТа было бы весьма желательно знать, каким образом устроены и как экспрессируются его гены. К моменту начала проведения этой части работы было известно, что в геноме человека имеется протяженный ген ПроТа, содержащий четыре интрона, и была определена его первичная структура. Помимо этого, были обнаружены несколько безинтронше генов ПроТ«, охарактеризованных лишь частично.

Рис. 18.

Анализ продуктов ПЦР, полученных при использовании в качестве исходного материала суммарной ДНК (I) и суммарной РНК (2) человека. Последовательности праймеров для ПЦР приведены на рис. 19. M - маркеры длины

(Mspi-гидролизат puci9: 501, 404, 332, 242, 190, 147, III пн).

Чтобы восполнить этот пробел, в настоящей работе была проведена амплификация, клонирование и секвенирование безинтронных генов ПроТа человека. Для амплификации генов использовали суммарную ДНК человека, а праймеры выбирались таким образом., чтобы амплифивдровать белок-кодаруюцую часть этих генов. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) приведены на рис. 18 (трек I). Как видно, амплифицировались два близких по размеру фрагмента ДНК. Клонирование этих фрагментов и последующее секвенирование позволило выявить по меньшей мере пять вариантов безинтронных генов ПроТа человека. Их нуклеотидные последовательности представлены на рис. 19. Как видно, эти гены имеют более 95% сходства между собой и с экзонами ингрон-содержащего гена ПроТа человека. Часть из них содержат небольшие делении, не нарушающие,

■впрочем, рамки считывания - эти гены и соответствуют несколько укороченному продукту ПЦР (рис. 18). Сравнение этих последовательностей с нуклеотидными последовательностями частей известных оезинтронных генов ПроТа показало, что три из этих генов уже были клонированы ранее, а два других обнаружены впервые. Следует заметить, что количество безинтронных генов ПроТа в геноме человека, по-видимому, существенно больше, чем сейчас принято считать, т.к. среди пяти произвольно выбранных для секвенирования клонированных генов не нашлось двух одинаковых.

Коль скоро безинтронных генов, которые могли бы кодировать очень сходные, но все-таки различные молекулы ПроТа, в геноме человека много, хотелось бы знать, транскрибируются ли эти гены. Для ответа на этот вопрос из препарата суммарной РНК человека были амплифицированы путем обратной транскрипции+ПЦР с использованием той же пары праймеров белок-кодирующие части кДНК ПроТа. Из рис. 18 (трек 2) ясно, что произошла эффективная амплификация фрагмента ДНК рассчетной длины, несмотря на то, что в печени человека (откуда происходит использованная РНК) транскрипция гена ПроТа очень незначительна. Анализ пяти произвольно взятых клонированных кДНК показал, что все они соответствуют интрон-содержащему гену ПроТа человека. Можно отметить лишь микрогетерогенность в положении 76, приводящую к замене Иу-Уах в молекуле ПроТа.

Таким образом, безинтронные гены ПроТа человека следует, по-видимому, отнести к неактивным процессированным псевдогенам.

2.7. Бактериальный штамм-продуцент ПроТа человека

Как для выяснения.внутриклеточной функции ПроТа человека, так и ' для использования ПроТа в медицинских целях- в качестве иммуностимулятора необходимо иметь надежный источник этого бежа. Совершенно ясно, что выделение препаративных количеств ПроТа человека из его естественного хозяина нереально. Поэтому полученная в предыдущей части работы кДНК ПроТа человека была использована для создания бактериального штамма-продуцента ПроТа человека.

кДНК ПроТа человека была клонирована в векторе рЕГЗс под контролем сильного промотора бактериофага Т7 таким образом, чтобы рекомбинантный белок в точности соответствовал нативному 1роТа

10 20 30 40 50

КДНК: ATGTCAGACGCAGCCGTAGÀCACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTT

pHGl: ******************************************£*******

pHG2 : *********** ************* ****************^*********

pHG3: **************************************************

pHG4: **************************************************

pHG5: **************************************************

КДНК: ATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAGGACTT MSDAAVDTSSEITTKDL

60 70 80 90 100

КДНК: AAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAGGCAGAAAATGGAAGAGACGCCC

pHGlï ******************************g*******************

pHG2: **************************************************

pHG3: *c************************************************

pHG4: ************ *************-*****G*********** ********

pHGS: *c************************************************

КДНК: AAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAGAGGCAGAAAATGGAAGAGACGCCC KEKKEVVEEAENGRDA

110 120 130 140 150

КДНК: CTGCTAACGGGAATGCTAATGAGGAAAATGGGGAGCAGGAGGCTGACAAT

pHGl: ******* *д************************'***с************с

pHG2: ****************************************д*******с*

pHG3: **************************************************

pHG4': *****Q***----—-------****************д************

pHG5: ****************************************д*******^*

КДНК: CTGCTAACGGGAATGCTAATGAGGAAAATGGGGAGCAGGAGGCTGACAAT PANGNANEENGEQEAD N

160 170 180 190 200

КДНК: GAGGTAGACGAAGAAGAGGAAGAAGGTGGGGAGGAAGAGGAGGAGGAAGA

pHGl: ********т***************************************—

pHG2: **д*****т*****************************************

pHG3: ********T*****************************************

pHG4: **A*****T******C**********************************

pHG5: **д*****т*****************************************

КДНК : GAGGTAGACGAAGAAGAGGAAGAAGGTGGGGAGGAAGAGGAGGAGGAAGA EVDEEEEEGGEEEEEEE

210 220 230 240

КДНК : agaaggtgatggtgaggaaga-ggatggagÀtgaagatgaggaagctgag

pHGl: —********************—********************G*******

pHG2: *********************-****************************

pHG3: **---«A**************-*************************«**

pHG4: *********G***********A****************************

pHG5: A********************-****************************

КДНК: AGAAGGTGATGGTGAGGAAGA-GGATGGAGATGAAGATGAGGAAGCTGAG EGDGEEE DGDEDEEAE

250 260 - 270 280 290

КДНК: ТСАССТАСССССААССССССАССТСААСАТСАТСАССАТЙ АССАТСТССА

рНС1: **************************************************

рНС2: ***с**************************************** ******

рНб 3 * А* ************************************************

р1Ш4: ********с******т*******************************т**

рН25. **************************************************

КДНК: ТС АССТАСССССААйСССССАССТвААСАТСАТС АСЙ АТб АСС АТСГСС А' ЗАТСКЯААЕООЕОВОУи

кДНК

рНв1 рнвг рнсз

рНС1 рНв5

кДНК

300 310 320 330

ТАССААСААС-САбААСАСССАССАСЙАТСАСТАС

****с*****т************************ **********—************************

**********—************************ **********—************************ **********_************************

ТАССААСААС-САСААОАСССАССАССАТСАСТАа

Т К К <3 £ Т б Е~~

Рис. 19. Нуклеотидаыв последовательности пяти безинтронных генов ПроТа человека. Стрелками отмечены последовательности праймеров, использованных при проведении ПЦР. Идентичные нуклеотвды отмечены (*); делеции обозначены (-).

Рис. 20.

Рекомбинантный ПроТа человека получен в индивидуальном виде путем фенольной депротеинизации лизата клеток бактериального штамма-продуцента. 17,5% ПАТ окрашен Куша с си.

— ПроТ|а

человека. При трансформации полученной плазмидой клеток е.coli BL2i(DE3), содержащих в хромосоме ген РНК-полимеразы фага Т7, происходила эффективная транскрипция кДНК ПроТа человека и трансляция образующейся мРНК. В результате выход ПроТа составлял t до 30£ от суммарного, бактериального белка. Индивидуальный ПроТа человека был получен в результате одностадийной очистки - рис. 20.

Следует отметить, что ПроТа в клетках высших эукариот содержит на ы-конце остаток ацетилсерина, образующийся в результате посттрансляционного отщепления концевого метионина и ацетилирования остатка серина. Смысл этой модификации не ясен. Маловероятно, чтобы аналогичный прцесс происходил и у бактерий при биосинтезе ПроТа человека. Действительно, анализ л-концевой последовательности . ПроТа, выделенного из штамма-продуцента, показал, что n-концевой аминокислотой белка является неацетилированный серин. Несмотря на это отличие, рекомбинантный ПроТа оказался активным в иммунологических тестах.

2.8. Поиск гена ПроТа е.coli

~~' Поскольку в клетках е.сои был обнаружен белок, гомологичный ПроТа человека, то было бы интересно узнать, как устроен ген этого белка. Для идентификации гена бактериального гомолога ПроТа суммарную ДНК е. сои гидролизовзли рестриктазой Taqi, фракционировали гель-электрофорезом и анализировали методом блот-гибридизации. При использовании в качестве зонда олигонуклеотида, соответствующего центральной части кДНК ПроТа человека, был обнаружен единственный гибрвдизупцийся фрагмент ДНК - рис. 2IA. В то же время, при использовании в,качестве зонда кДНК ПроТа человека был выявлен набор умеренно гибридизупцихся фрагментов - рис. 21Б. Этот неожиданный результат мог означать, что в. геноме е.coli ген ПроТа представлен не одной непрерывной последовательностью, а набором относительно . коротких последовательностей, не связанных мевду собой непосредственно.

Несколько гйбридизупцихся фрагментов ДНК е. сои были клонированы и секвенированы. Один из них (тот, который гибридазовался с олигонуклеогвдным зондом, рис. 2IA) имел длину 590 пн и содержал внутри себя последовательность, названную областью гомологии «I, длиной 31 пн и имеющую 87* сходства с

Рис. 21.

А

Б

Анализ суммарной ДНК е.coli (mre600), гидролизованной

рестриктазой Taqi, методом блот-гибридизации. В качестве зонда использованы: А - ПроТа-специфичный олигонуклеотид; Б -кДНК ПроТа человека.

ш»

■ 500«f -

центральной областью ПроТа-кодирупцей последовательности кДНК человека - рис. 22А. Выяснилось, однако, что последовательности, фланкирующие область гомологии #1, не имеют ничего общего ни с последовательностью ПроТа, ни с другими последовательностями в емвь банке. Следует подчеркнуть, что область гомологии нI встречается в геноме е.сои только один раз, и именно в таком окружении - рис. 21А. Самое удивительное, что левая граница области гомологии #1 точно совпадает с местом стыка интрон-зкзон в гене ПроТа человека. Учитывая это обстоятельство, заманчиво предположить, что и образование зрелой мРНК ПроТа е.сои происходит путем сплайсинга, если, конечно, имеются и другие ПроТа-кодирувдие "экзоны".

На расстоянии 275 пн от области гомологии #1 была обнаружена еще одна короткая последовательность, которая может иметь отношение к гену ПроТа - область гомологии #2. Она имеет 8256 сходства с нуклеотидной последовательностью, кодирующей самый ы-конец ПроТа человека, включая инициаторный мхз-кодон - рис. 22Б. Выяснилось, однако, что направление транскрипции области #2 должно

Область гомологии #1

точка сплайсинга

EEHG EQEAD

кДНК ПроТа человека aatgaggaaaatggggagcaggaggctgaca *******■********** * *** * * ****

Клен Е.coli AATGAGGAAAATGGGGAACTGGAAGCAGACA

L

б Область гомологии #2

M S D А Л V

кДНК iipota человека atgtcagacgcagccgt

*********** ***

Клон е.coli atgtcagacgcgagcgt

б. Расположение последовательностей и и |2 в области i.s мин карты е.coli #1 Р SD #2.

—»

275 bp

г. Область гомологии

EVDEEEEE

кДНК ПроТа человека atgaggtagacgaagaagaggaagaag

**** *. *******************

Клон е.coli atgacgatgacgaagaagaggaagaag

\

DD

д. Выравнивание областей т. »2 и #з с последовательностью ПроТа человека

10 20 30 40 50 60

ПроТа чел. msdaavdtsseittkdlkekkeweeaengrdapangnaneengeqeadnevdeeeeegg. .. **** * ****** ***** ******

е. coll msdasv-----------•----------------------neengeleadndddeeeee—. . ;

___I_

§2 #1 #3

Рис. 22. Сравнение "последовательности ПроТа человека (кДНК и белка) с нуклеотидныш и выведенными из них аминокислотными последовательностями областей гомологии #1, #2 и #з е.сои. Идентичные нуклеотидные и аминокислотные остатки отмечены (*). р и sd указывают положение вероятной промоторной области и последовательности Шайн-Дальгарно, соотве тственно.

быть противоположно направлению транскрипции области #1 - рис. 22В. В соответствии с этим, области гомологии #2 предшествует участок, весьма напоминающий промоторную область и участок связывания рибосом (рис. 22В), которые могли бы участвовать в транскрипции области #2 и трансляции зрелой мРНК. Любопытно, что промоторная область содержит также последовательность, очень напоминающую участок связывания триптофанового репрессора, что предполагает наличие регуляции транскрипции изучаемого участка ДНК.

И, наконец, третий проанализированный сегмент ДНК е.coli содержал область гомологии #3. Она имеет 89% сходства с последовательностью кДНК ПроТа человека, расположенной сразу за участком, совпадающим с областью гомологии #1 - рис. 22Г и Д. Более того, при об'единении областей #1 и #3 в месте их стыковки восстанавливается кодон для аспарагина (азп50, рис. 22 Д), который присутствует в этом месте в последовательности ПроТа человека. Области гомологии (2 и |3, расположенные как показано на рис. 22Д, вместе составляют примерно четверть длины ПроТа человека, имея при этом всего четыре аминокислотных отличия.

, Обнаруженные области гомологии были локализованы в геноме E.coii путем гибридизации с упорядоченной геномной библиотекой E.coii. Оказалось, что области #1 и #2 находятся на 1,5 минуте карты е.coli (рис. 23А), в то время как область #3 располагается на 86 минуте карты - рис. 23Б. Это обстоятельство делает крайне маловероятной возможность существования участков #1 и #3 в составе единого первичного гранскрипта.

Существуют две возможности для об'яснения полученйых результатов. Согласно одной из них, обнаруженные ПроТа-подобные последовательности с ~>сятся не к гену ПроТа. а к генам неизвестных бактериа. jx белков, обладающих общими доменами с

Б

г* -Ч ___^»

© «

¿- . - ■ ■•••г/к

:."г . -. -«

Рис. 23. Гибридизация сегмегтов #i (а) и #з (Б) с упорядоченной геномной библиотекой е.сои позволяет с высокой точностью картировать обнаруженные области гомологии в геноме

Е.coli.

. ...

ПроТа человека. Такая интерпретация , однако, не может об'яснить существование гомолога ПроТа, обнаруженного в клетках е.сои. Согласно второму предположению, области гомологии #1, #2 и #3 принадлежат гену бактериального ПроТа, но сам этот ген устроен очень необычно: отдельные его части несцеплены друг с другом. Очевидно, что в этом случае для об'единения обнаруженных областей в одну зрелую мРНК ПроТа необходим транс-сплайсинг. Такое строение гена (и такой механизм цроцессинга РНК) больше напоминает экзон-интронную структуру генов эукариот. До сих пор не было обнаружено ни одного хромосомного белок-кодирунцего гена эубактерий, состоящего из отдельных экзонов, что делает данное об'яснение довольно странным, однако альтернативы ему не видно.

Таким образом, локализация обнаруженных областей'гомологии в геноме е.сои и высокая степень их сходства с соответствующими участками гена ПроТа человека заставляет предположить, что ген ПроТа е.coli состоит из отдельных экзонов и что в клетках эубактерий должен осуществляться транс-сплайсинг, ответственный за об'единение экзон-кодаруемых последовательностей в одну непрерывную молекулу мРНК ПроТа.

Следует отметить, что проблемы, возникающие при изучении белков, ковалентно связанных с РНК, выходят далеко за рамки собственно ковалентных РНК-белковых соединений. Как видно, данная работа ставит больше вопросов, чем дает ответов. К счастью, она предлагает и пути для поиска ответов на поставленные вопросы, а значит, есть надевда лучше понять, как устроена живая клетка.

Благодарности

Для меня совершенно очевидно, что одному мне было бы не под силу провести до конца все описанные здесь исследования. Поэтому я пользуюсь случаем принести благодарность моим коллегам, чьи дела и неожиданные идеи сильно повлияли на ход настоящей работы. Исследование структура и функции вирусного белка урд было бы невозможно без активного участия Е.В.Кунина, а инициировал исследование урд Ю.Ф.Дрыгин. С Г.Н.Макаровой мы начали изучение клеточных РНК-белковых комплексов, и в том, что мы сегодня знаем о них - большая ее заслуга. Н.И.Гребенщиков убедил меня, что для характеристики клеточного бежа можно использовать ВЗЖХ, а Ц.А.Егорову для секвенирования пептидов понадобились доли микрограмма вещества. Основной вклад в создание бактериального штамма-продуцента протимозина а принадлежит А.Г.Евстафьевой. И.Г.Ляхов стал экспертом в области генной инженерии, и клонирование и секвенирование ряда фрагментов ДНК - его заслуга. Идея существования сплайсинга у е.соИ принадлежит Н.В.Чичковой и продолжает оставаться одной из наиболее захватывающих Частей наших исследований. Критические замечания В.И.Агола и А.С.Манькина в немалой степени способствовали осмыслению получаемых результатов. Наконец, я искренне признателен А.А.Богданову за благожелательный интерес к этой работе, поддержку и долготерпение, которые только и сделали возможным проведение настоящего исследования.

выводы

Г. К 5'-концу вирионной РНК вируса энцефаломиокардата ковалентно присоединен вирусный белок vpg. Соединение vpg-PHK имеет структуру vpg(Tyr-o4-pU)PHK. Определена первичная структура и предложена модель вторичной структуры 5'-концевой области вирионной РНК вируса энцефаломиокардата.-

2. Репликация РНК вируса энцефаломиокардата моделирована in vitro. Обнаружены продукты инициации синтеза плюс-цепи вирусной РНК -vpg-pu и vpg-олигонуклеотид, существование которых служит прямым экспериментальным подтверждением участия уридилированного белка-затравки в репликации вирусной РНК.

3. Идентифицировано клеточное ковалентное соединение белок-РНК. Белок присоединен к 5'-концу РНК длиной около 20 нуклеотидных остатков, и данное соединение локализовано в цитоплазме. Белковым компонентом комплекса является протимозин а. Комплекс протимозин а-РНК присутствует в клетках самых разнообразных организмов. Протимозин а является, таким образом, эволюционно консервативным белком, от бактерий до человека.

4. В геноме человека присутствует семейство безинтронных генов протимозина о. Эти гены являются, по Ьсей вероятности, процессированными псевдогенами.

5. Амшшфицирована и клонирована кДНК протимозина в человека, что позволило создать бактериальный штамм-продуцент этого белка.

6. На основании изучения последовательностей из генома e.coii, гомологичных гену протимозина а человека, сформулирована гипотеза о существовании фрагоентированных генов и транс-сплайсинга у эубактерий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

1. Вартапетян А.Б., Дрыгин Ю.Ф., Чумаков К.М. Фосфодиэфирная связь РНК вируса знцефаломиокардита с остатком тирозина белка vpg, // Биоорган, химия, 1979, 5, 1876-1878.

2. Дрыгин Ю.Ф., Вартапетян А.В., Чумаков К.М. Ковалентное соединение РНК и белка в вирусе энцефаломиокардита. // Молек. биология, 1979, 13, 777-787.

3. Вартапетян А.Б., Дрыгин Ю.Ф., Богданов А.А., Чумаков К.М., Агол В. И. Природное ковалентное соединение РНК-белок в вирусе энцефаломиокардита. // Тез. докл. iv Всесоюзного биохимического с'езда - Ленинград, 1979, с.279.

4. Дрыгин Ю.Ф., Вартапетян А.Б., Чумаков К.М. Структура ковалентного соединения РНК-белок в вирусе энцефаломиокардита. // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Макромолекулы клетки. Структура, функции, взаимодействия" - Москва, 1979, с.19.

5. Вартапетян А.Б. 5'-концевой нуклеотид генома вируса энцефаломиокардита, ковалентно связанный с белком. // Вестн. Моск. ун-та, сер. Химия, 1980, 21, 89-91.

6. Дрыгин Б.Ф., Вартапетян А.Б., Богданов А.А., Чумаков К.М. Изучение структуры ковалентного соединения РНК-белок в вирусе энцефаломиокардита. // Тез. докл. Меадународного симпозиума "Стратегия генома РНК-содержащих вирусов животных" - Москва. 1980, с.16

7. Вартапетян А.Б., Дрыгин Ю.Ф. фосфодиэфирная связь 5'-концевого нуклеотида РНК с белками в вирусе энцефаломиокардита. // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Реализация наследственной информации" - Паланга, 1980, с.62.

8. Vartapetlan А.В., Drygln Y.F., Chumakov К.И., Bogdanov A.A. The structure of the covalent linkage between proteins and RNA in encephalomyocarditls virus. // Nucl. Acids Bes., 1980, 8, 3729-3742.

9. Вартапетян А.Б., Дрыгин Ю.Ф., Богданов A.A., Чумаков К.М. Белки vrg вируса энцефаломиокардита. // Тез. докл. • 2 советско-итальянского симпозиума "Макромолекулы в функционирующей клетке" - Пущино, i960, с.16.

10. Vartapetlan А.В., Drygln Y.P., Bogdanov A.A., Chumakov К.М.

The encephalomyocarditis viral proteins covalently linked to RNA. // In: Macromolecules in the Functioning Cell, book 2, Bayev A.A., ad., Nauka, Moscow, 1982, pp.175-176.

11. Вартапетян А.Б. Природные ковалентные соединения вирусных белков и нуклеиновых кислот. // Еиоорган. химия, 1982, 8, I581-1606.

12. Вартапетян А.Б., Манькин А.С., Чумаков К.М. Структура 5'-концевой области РНК вируса энцефаломиокардата. // Тез. докл. 3 Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии - Тбилиси, 1982, с.83-84. .

13. Вартапетян А.Б., Кунин Е.В., Агол В.И. Возможное участие белка vpg вируса энцефалсмиокардита в инициации синтеза вирусной РНК in vitro. // Тез. докл. 6 симпозиума СССР-Франция "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" - Цхалтубо, 1982, с.73.

14. Вартапетян А.Б., Кунин Е.В., Чумаков К.М., Богданов А.А., Агол Б.И. Инициация синтеза РНК вируса энцефаломиокардата в бесклеточной системе и возможное участие в этом процессе белка VPg. // Докл. АН СССР, 1982, 267, 963-965.

15. Vartapetian А.В., Mankin A.S., Skripkin Е.А., Chumakov К.Н., Smirnov V.D., Bogdanov A.A. The primary and secondary structure of the 5'-end region of encephalomyocarditis virus UNA. A novel approach to sequencing long RNA molecules. // Gene, 1983, 26, 189-195. -

16. Богданов АЛ., Дрыгин Ю.Ф., Жуклис К.Л., Золотухин А.С., Вартапетян А.Б. Ковалентные соединения нуклеиновых кислот и белков: строение и функции. // Тез. докл. 4 симпозиума СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" - Киев. 1984, с.20.

17. Вартапетян А.Б., Кунин Е.В., Богданов А.А., Агол В.И. Белок vpg участвует в инициации синтеза РНК вируса энцефаломиокардата. // Тез. докл. 16 конференции ФЕБО - Москва, 1984, с.231.

18. Vartapetian А.В., Koonin E.V., Agol V.I., Bogdanov А. А. Encephalomyocarditis virus RNA synthesis in vitro 1ь protein-primed. // EMBO J., 1984, 3, 2593-2598.

19. Кунин Е.В., Наслова С.В., Вартапетян А.Б., Богданов А.А. Вирус-специфический Овлок vpg участвует в инициации синтезе РНК пикорнавирусов в бесклеточной системе. // Тез. докл. Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы ыедицинской вирусологии" -

Москва, 1985, с.210.

20. Вартапетян А.Б., Кунин Е.В., Маслова С.В., Агол В.И., Богданов А.А. Механизм инициации синтеза РНК пикорнавирусов in vitro. // Тез. докл. 8 симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" - Рига, 1985, с.163.

21. Кунин Е.В., Вартапетян А.Б. Инициация синтеза РНК пикорнавирусов: использование бежа в качестве затравки. // Тез. докл. Всесоюзной конференции "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" - Москва, 1985, с.117.

.22. Вартапетян А.Б. Инициация синтеза РНК пикорнавирусов in vitro с участием вирус-специфического бежа vpg. // Тез. докл. 5 Всесоюзного биохимического сезда - Киев, 1986, с.145-146.

23. Богданов А.А., Вартапетян А.Б., Макарова Т.Н. Инициация синтеза РНК пикорнавирусов в бесклеточной системе. // Тез. докл. 8 симпозиума СССР-Франция "Молекулярная биология бежов и нуклеиновых кислот" - Москва, 1986, с.27-28.

24. Богданов А.А., Вартапетян А.Б., Макарова Т.Н., Кунин Е.В., Маслова С.В. Инициация синтеза РНК пикорнавирусов в бесклеточной системе" // Тез. докл. Республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки" - Ереван, 1986, с.13.

25. Vartapetian А.В., Bogdanov A.A. Proteins covalently linked to viral genomes. // Progr. in Nucl. Acid Res., 1987, 34, 209-251.

26. Вартапетян А.Б. Белки, ковалентно связанные с геномами ДНК- и РНК-содержащих вирусов. // Молек. биология, 1987, 21, 876-881.

27. Vartapetian А.В., Makarova T.N., Koonln E.V., Agol V.I., Bogdanov A.A. Small cytoplasmic RNA from mouse cells covalently linked to a protein. // FEBS Lett., 1988, 232, 35-38.

23. Вартапетян А.Б., Макарова Т.Н., Кунин Е.В., Гребенщиков Н.И., Егоров Ц.А., Богданов А.А. Протимозин а: консервативный белок, ковалентно связанный с РНК. // Тез. докл. 8 симпозиума СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" - Иркутск, 1989, с.31-32.

29. Makarova Т., Grebenshikov N., Egorov Т., Vartapetian А., Bogdanov A. Prothymosln a is an evolutionary conserved protdin covalently linked to a small RNA. // PEBS Lett., 1989, 257, 247-250.

30. Vartapetian А.в., Makarova T.N., Koonln- E.V., Grebenehlkov

N.I., Egorov Т.A., Bogdanov A.A. Prothymosin a is an ubiquitous protein. // Abstr. 2 USSR-USA symposium "Structure of eukaryotic g«i.noт-з and regulation of its expression" - Tbilisi, 1989, p.68.

31. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция. // Молек. биология, 1991, 25, 926-936.

32. Богданов A.A., Вартапетян А.Б. Клонирование и экспрессия гена эволюционно консервативного иммуностимулирующего бежа протимозина

'' Тез. докл. I Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия" - Пущино, 1991, с.122-123.

i3, Vartapeclan A., Chtchkova N.. Lyakhov I., Makarova Т., Ev3t«fieva A., Sogdanov A. Segments of Escherichia coll genome similar to the exor.s of human pro thymosin a gen a. // ?EBS Lett., 1392, 313, Э5-97.

34. Вартапетян. а.Б. Белхи myc, протимозин о и клеточное деление. // Биохимия, 1992, 57, 477-478.

35. Богданов A.A., Вартапетян А.Б., Гребенщиков Н.И., Евстафьева А.Г., Макарова Т.Н., Чичкова Н.В. Клонирование и экспрессия бактериального гена эволюционно консервативного иммуностимулирующего белка протимозина о и изучение функций этого белка. // Тез. докл. 2 Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия" - Пуяшно, IS92, с.104-105,

36. Vartapetian A.B. DNA recomMsctioa ia the course of PCR. // Ii:. PCB Technology: Current Innovations, Griffin H. and Griffin A , eds., CRC Press, 1993, in press.