Региоспецифическое ковалентное связывание РНК, содержащих активные группы, с регуляторными белками ВИЧ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский орденов Ленина, Октябрьской революции и Трудового красного знамени Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Г Г Б ол

-„ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

1 5 Д£К юоь

На правах рукописи УДК 577.113.4

НАРЫШКИН Николай Александрович

Региоспецифическое ковалентное связывание РНК, содержащих активные группы, с регуляторными белками ВИЧ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных

веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Шабарова З.А.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Ивановская М.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихоненко Т.И.

доктор химических наук, профессор Кочетков С.Н.

Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Зашита состоится 24 декабря 1996 года в 17 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ. Автореферат разослан 22 ноября 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусные транс-активирующие белки Tat и Rev необходимы для репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)*. Функция этих белков являются связанными и дополняют друг друга. Tat увеличивает уровень транскрипции вирусного генома, в то время как Rev отвечает за эффективную экспрессию в цитоплазме поздних мРНК, кодирующих вирусные ферменты и структурные белки. Потеря активности любым из этих двух белков приводит к полной остановке инфекции.

Указанные белки являются РНК-связываюшими и узнают двутяжевые участки с определенной нуклеотиднои последовательностью. Мишень для Tat - 59-звенная шпилечная структура (TAR), расположенная на 5'-конце всех мРНК транскриптов ВИЧ. Для проявления активности Rev также необходима разветвленная шпилечная РНК-структура длиной 351 нуклеотид (RRE), расположенная внутри кодирующей последовательности гена белка оболочки (env) ВИЧ. Эта протяженная последовательность может связывать одновременно до 11 молекул Rev белка.

Построение полной картины развития ВИЧ-инфекции в клетке и создание анти-ВИЧ терапевтических препаратов в существенной степени зависит от наличия информации о пространственной организации белок-РНК комплексов Tat-TAR и Rev-RRE. Несколько крупных лабораторий мира занимаются проблемой установления структуры этих комплексов методами рентгеноструктурного анализа и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. До настоящего времени не решена проблема получения комплексов Tat-TAR и Rev-RRE в виде монокристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Методом спектроскопии ЯМР с последующим компьютерным моделированием к настоящему моменту установлены пространственные структуры TAR РНК и RRE РНК в комплексе с Rev-пептидом. Однако построить полную структуру комплекса РНК-белок на основании данных ЯМР затруднительно. Для однозначного отнесения всех сигналов спектра ЯМР и для подтверждения корректности рассчитанных моделей требуются дополнительные данные по контактам РНК-белок, полученные с помощью биохимических методов.

Из биохимических методов наиболее точную информацию по контактам белок-НК позволяет получить метод ковалентного связывания. В лаборатории Химии

* Здесь и далее ВИЧ обозначает вирус иммунодефицита человека первого типа.

нуклеиновых кислот МГУ был предложен новый тип реагентов для ковалентного связывания НК с белками: олигонуклеотиды, содержащие в заданном положении сахаро-фосфатного остова химически активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу (ТЗП). В составе комплекса с белком такие реагенты способны фосфорилировать нуклеофильные группы белка, пространственно сближенные с данной межнуклеотидной связью. Однако до настоящего времени синтез реагентов, содержащих ТЗП, был разработан только для олигодезоксирибонуклеотидов и, соответственно, соединения этого типа использовались для изучения только ДНК-узнающих белков.

Настоящая работа посвящена синтезу реагентов подобного типа на базе олигорибонуклеотидов и их применению для изучения контактов в РНК-белковых комплексах Tat-TAR и Rev-RRE.

Целью настоящей работы явилось:

1) разработка синтеза олигорибонуклеотидов, содержащих активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу методом химического лигирования (ХЛ);

2) отработка условий специфичного ковалентного связывания фрагментов таких активных РНК с регуляторными белками Tat и Rev ВИЧ;

3) установление аминокислотных остатков Tat и Rev, контактирующих с межнуклеотидными фосфатными группами в определенных положениях TAR и RRE дуплексов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Изучена эффективность реакций химического лигирования в РНК и РНК-ДНК дуплексах. Исследована зависимость выхода продукта конденсации от структуры дуплекса и положения рибо- и дезоксирибо-фрагментов в дуплексе, а также от природы функциональных групп, сближенных в реакционном узле.

Установленные закономерности химического лигирования позволили впервые осуществить синтез РНК-дуплексов, содержащих активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу. Проведено изучение взаимодействия олигонуклеотидов, содержащих тризамещенный пирофосфат, с модельными соединениями, содержащими функциональные группы боковых цепей аминокислот. Установлена высокая реакционная способность этих соединений в реакциях с первичными алифатическими аминами и имидазолом, что показывает возможность их использования для ковалентного связывания с аминокислотными остатками белка, содержащими указанные группировки.

Полученные в работе двутяжевые РНК, содержащие тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу, в участках узнавания (TAR н RRE) регуляторных белков ВИЧ Tat и Rev, были использованы для изучения природы взаимодействий в комплексах Tat-TAR и Rev-RRE. Установлены три положения в сахаро-фосфатном остове TAR, введение в которые активной группы приводит к эффективному ковалентному связыванию Tat, что свидетельствует об участии фосфатов в этих положениях в прямых контактах с остатками лизина РНК-связывающего участка Tat. Для одного из этих положений - фосфата, расположенного между уридином 38 и цитидином 39 TAR (р38-39), - установлено, что этот фосфат контактирует с Е-аминогруппой Lys51 Tat. Для определения природы аминокислоты впервые использован метод избирательного расщепления ковалентносвязанного комплекса протеазами с последующим анализом продуктов протеолиза MALDI TOF масс-спектрометрией.

Эффективный синтез и успешное применение РНК, содержащих активные группы, для изучения пространственной организации Tat-TAR комплекса открывают новые возможности для изучения РНК-узн'ающих белков и принципов РНК-белковых взаимодействий.

Легкость получения и высокая эффективность ковалентного связывания ТЗП-содержащих олигорибонуклеотидов с регуляторными белками ВИЧ позволяют использовать эти соединения для селективного ингибирования этих белков, что может быть использовано при создании терапевтических анти-ВИЧ препаратов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи и одна принята к публикации. Результаты работы были доложены на первом Европейском биотехнологическом симпозиуме (серия Майами Bio/Technology) (Монако,

1994 г.) и на четвертом курсе лекций Европейского союза биохимических обществ (FEBS) "Взгляд молодых ученых на молекулярную биотехнологию" (г. Льеж, Бельгия,

1995 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит Хт2-рисунков и

таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для построения полной картины развития ВИЧ-инфекции в клетке и создания анти-ВИЧ терапевтических препаратов необходимо установление пространственной

организации комплексов регуляторных белков Tat и Rev ВИЧ с соответствующими РНК-мишенями TAR и RRE. Метод региоспецифического ковалентного связывания позволяет получать информацию по контактам белок-НК. В лаборатории Химии нуклеиновых кислот МГУ был предложен новый тип реагентов для ковалентного связывания НК с белками: олигонуклеотиды, содержащие в заданном положении сахаро-фосфатного остова химически активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу. Наиболее удобным методом синтеза олигонуклеотидов, содержащих химически активные межнуклеотидные группы, является химическое лигирование. Поэтому

3' U^-!-

первой задачей настоящего исследования явилось '

изучение реакций химического лигирования в РНК-содержаших дуплексах.

тризамещенная пирофосфатная межнуклеотидная группа

о 9 —о-р—о—р-о

III OEt О"

I. Изучение реакций химического лигирования в РНК-содержащих дуплексах

Для детального изучения конденсации в РНК и РНК-ДНК дуплексах была составлена серия дуплексов, состоящих из 8-, 11- и 17-звенных олигонуклеотидов и различающихся взаимным расположением рибо- и дезоксирибо-фрагментов и природой функциональных групп в месте лигирования:

dGAACGGAT rGAACGGAU гGAACGGAdT

dCCAGGAGTGAC rCCAGGAGUGAC

5'

V

I I I I I I I I

■X Y

I I I I I I I I I

dGTTGCCTAGGTCCTCAC rGUUGCCUAGGUCCUCAC

fl Я

гд.е X = —ОН, -о-р-он, —-О—р—OEt;

¿© ¿0 •

Y = но-,

но-р-о-¿0

Химическое лигирование в этих дуплексах проводилось под действием двух конденсирующих агентов: 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил) карбодиимида (ЭДК) или бромциана (СЫВг). Использование олигонуклеотидных блоков, содержащих различные концевые группы, позволило изучить эффективность введения в олигонуклеотид трех

1

различных межнуклеотидных групп - 1) природной фосфодиэфирной, 2) простой пирофосфатной и 3) тризамещенной пирофосфатной.

1.1. Синтез олигонуклеотидов. содержащих фосфодиэфирную

химическом

<■ I-О-Р-О- НО-

Г|Щ О» III,

конл- агент

—о-р-о—Н

п ¿-in,

межнуклеотидную группу

Общий принцип химического лигирования заключается в конденсации олигонуклеотидов в пространственно организованном

комплементарном комплексе.

Для сравнительного изучения ,_он _

- 5 111 ° он°111

синтеза олигонуклеотидов с природной !• н- 1

фосфодиэфирной межнуклеотидной группой в РНК-содержащих дуплексах методом XJ1 были приготовлены шесть серий дуплексов, в которых варьировалась природа компонентов и положение фосфата в реакционном узле. Структуры дуплексов и выходы продуктов конденсации приведены в таблице 1.

Таблица 1. Эффективность синтеза олигонуклеотидов с фосфодиэфирной межнуклеотидной группой в РНК-содержащих дуплексах

№ серии Обозначение дуплекса Структура дуплекса Выход продукта ХЛ, % Конденсирующий агент t t CNBr ЭДК

1а г8он prl 1 г17 6 8

1 16 г80Н pdll г17 5 1-2

1в СО £: = sJ-O —1 8 3

1г г8он pdll d 17 ' 3 1-2

2а dSOH prl 1 г17 1-2 5

2 26 d80H pdll rI7 5 10

2в d8oH prl 1 dl7 1-2 15

2г dSOH pdll dl7 50 60

За r7dToH prl 1 rl7 3 5

3 36 r7dT0H pdl 1 rl 7 5 15

Зв r7dT0H prl 1 dl7 . 5 10

Зг r7dToH pdl 1 d 17 55 40

№ серии Обозначение дуплекса - —л. Структура дуплекса Выход продукта ХЛ, % Конденсирующий агент t t CNBr ЭДК

4а 'pr8p HOrl 1 г17 • — <1

4 46 pr8p HOdll rI7 —. <1

4в pr8p HOrll dl7 — <1

4г pr8p HOdll dl7 — <1

5а pdSp HOrl 1 rl7 35 10

5 56 pd8p HOdll rl7 45 50

5в pd8p HOrl 1 dl7 60 60

5г pd8p HOdll dl7 90 90

6а pr7dTp HOrll rl7 30 15

6 66 pr7dTp HOdll rI7 45 40

6в pr7dTp HOrl 1 dl7 60 60

6г pr7dTp HOdll dl7 85 80

t

Условия ЭДК конденсации: 0.05 М MES-буфер (рН 6.0), 0.02 М MgCl2, 0.5 М ЭДК, 5"С, 48 ч; концентрация олигонуклеотидов 5 мкМ. t

Условия CNBr конденсации: 1 М MES-буфер (рН 7.0), 0.02 М MgCi2, 0.5 М CNBr, 20°С, 5 мин; концентрация олигонуклеотидов 5 мкМ. Первичные структуры олигонуклеотидов:

г8 5' GAACGGAU

r7dT 5' GAACGGA(dT)

d8 5' dGAACGGAT

rll 5' CCAGGAGUGAC

dll 5' dCCAGGAGTGAC

rl7 5' CACUCCUGGAUCCGUUC

d 17 5' dCACTCCTGGATCCGTTC

^ по 5'-концу 8-звенных олигонуклеотидов в сериях 4-6 вводился 32Р.

Контроль за ходом реакций и выделение продуктов конденсации проводили методом гель-электрофореза в 20% ПААГ с последующей авторадиографией. Анализ данных химического лигирования в системах 1—6 позволил выявить следующие закономерности.

- 71. Влияние природы матрицы на эффективность конденсации, что проявляется при синтезе фосфодиэфирной и, как будет показано ниже, других межнуклеотидных групп. Это влияние заключается в повышении эффективности химического лигирования при использовании олигодезоксирибонуклеотидной матрицы по сравнению с ее рибо-аналогом (дуплексы а и в, б и г. табл. 1). Более конформационно подвижная олигодезоксирибонуклеотидная матрица, по-видимому, сглаживает локальные нарушения структуры двойной спирали в районе реакционного узла, вызванные одновременным присутствием в дуплексе г- и с!-олигонуклеотидных блоков. Это позволяет реагирующим группам принимать более выгодное для конденсации пространственное расположение.

2. Выход продукта конденсации всегда выше, если в реакционном узле сближены нуклеотиды, относящиеся к одному, г или <3, типу.

3. Фосфодиэфирная межнуклеотидная группа в исследованных дуплексах образуется под действием обоих конденсирующих агентов со значительно большей эффективностью при положении фосфатной группы на З'-конце олигонуклеотида по сравнению с 5'-положением (серии 2 и 5, 3 и 6). Причина заключается, по-видимому, в том, что первичный- 5'-гидроксил, во-первых, обладает большей нуклеофильностью, и во-вторых, большей конформационной подвижностью по сравнению со вторичным 3'- гидроксилом.

4. Присутствие в сайте лигирования З'-концевого рибонуклеотида всегда затрудняет конденсацию независимо от того, является ли он донором или акцептором фосфата (дуплексы 1а- 1г и 4а-4г).

Низкая эффективность лигирования при положении фосфата на З'-конце олигорибонуклеотида (серия 4) объясняется тем, что при добавлении конденсирующего агента в первую очередь идет образование г^З'-циклофосфата за счет внутримолекулярной атаки 2'-гидроксила.

Причинами малой эффективности химического лигирования в серии 1 при расположении фосфата на 5'-конце в реакционном узле могут быть, во-первых, более низкая реакционная способность вторичного гидроксила по сравнению с первичным. Во-вторых, СЗ'-эндо конформация рибозы в олигорибонуклеотиде может затруднять контакты гидроксил-фосфат в месте лигирования.

5. Эффективность синтеза олигонуклеотидов с фосфодиэфирной межнуклеотидной группой под действием ЭДК и СЫВг примерно одинакова.

Приведенные выше данные и выявленные закономерности позволяют сделать вывод, что оптимальная структура реакционного узла при синтезе природной межнуклеотидной связи в олигорибонуклеотидах выглядит так: олигодезоксирибонуклеотидная матрица и З'-концевой дезоксирибонуклеозидфосфат.

1.2. Синтез олигонуклеотидов. содержащих пирофосфатную межнуклеотидную группу

Общая схема введения пирофосфатной межнуклеотидной группы

5' | 3'

О О

II II

-О-Р-ОН НО-Р-О-

о©

о©

конденс. агент

О О 5' I-О-Р—О—Р-0-1

1 I I I 'о >о I I I 1

0е О*

3'

Для сравнительного изучения эффективности введения пирофосфатной группы в олигонуклеотиды были приготовлены две серии дуплексов, в которых варьировали природу олигонуклеотидных компонентов. Структуры всех дуплексов и выходы продуктов химического лигирования приведены в таблице 2.

Таблица 2. Эффективность синтеза олигонуклеотидов с пирофосфатной межнуклеотидной группой в РНК-содержащих дуплексах

№ Обозначение серии дуплекса

Структура дуплекса

Выход продукта ХЛ, %

Конденсирующий агент 1 1 СЫВг эдк

7а с18р рг 11 г17 75 99

7 76 ё8р рс!11 г17 30 90

7в с!8ррг!1 (117 99 99

7г d8p рё11 (117 75 95

8а г7с!Тр рг11 г17 40 80

8 «б r7dTp рс111 г17 30 60

8в r7dTp рг11 dl7 80 90

8г r7dTp рс! 11 dl7 50 80

* t , -условия ЭДК- и CNBr-кoндeнcaций приведены в подписи к таблице 1;

первичные структуры олигонуклеотидов приведены в подписи к таблице 1.

Методы анализа и выделения продуктов реакций были аналогичны описанным в разд. 1.1.

Из данных, приведенных в таблице 2, следует, что конденсация при введении пирофосфатной группы протекает высокоэффективно под действием и ЭДК, и CNBr. Выход продукта ХЛ под действием ЭДК обычно составлял 80% и выше. Эффективность CNBr-конденсации зависела от комбинации нуклеотидов в реакционном узле и изменялась в пределах от 30 до 99%. Олигонуклеотиды, содержащие пирофосфатную межнуклеотндную группу в составе сайтов узнавания Tat и Rev белков, были впоследствии использованы в контрольных реакциях с этими белками.

1.3. Синтез и химические свойства олигорибо- и смешанных олигорибо-яезоксирибо-нуклеотидов. содержащих тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу

Синтез олигонуклеотидов, содержащих тризамещенную пирофосфатную

межнуклеотидную группу (ТЗП), осуществлялся методом химического лигнрования по

следующей схеме:

J3

OAlk

I 1 0

5' -О-Р-О

II

О

3* Ь

о

но-р-о-

и

о

ЭДК

5' 3'

OAlk -О—Р—о-

II

о

0е

-р—о-1

" III'

о

где -ОА1к = Ме, Е1;

Для сравнительного изучения эффективности введения ТЗП в олигонуклеотиды

были составлены три серии дуплексов, структура которых приведена в таблице 3. В

указанных дуплексах в З'-положении реакционного узла располагался либо

рибонуклеозидэтилфосфат (г-ЫрОЕО, либо его дезоксирибо аналог (с1^рОЕ0.

Таблица 3. Эффективность синтеза олигонуклеотидов с тризамещенной пирофосфатной межнуклеотидной группой в РНК-содержащих дуплексах

№ Обозначение серии дуплекса

Структура дуплекса

Выход продукта XJ1, %

Конденсирующий агент t t CNBr_ЭДК

9а 96

r8poEt prl 1 г 17

<1

rSpoEt pdll rl7

<1

1-2

7-2

9в 9r

rSpoEt prl 1

............dl.7........

rSpoEt pdil dl7

1-2

"<"i.....

1-2

"1-2"

9

№ Обозначение серии дуплекса

Структура дуплекса

Выход продукта ХЛ, %

Конденсирующий агент t * С^г ЭДК

10а г7(1ТрОЕ1 рг11 <1 48ч 33

г17 72ч 48

10 106 г7с1ТроЕ1рсП1 1-2 48ч 48

г17 72ч 60

10в г7с!ТроЕгрг11 <1 48ч 25

с!17 72ч 34

Юг г7с!ТрОЕ1 рс! 11 <1 48ч 52

с!17 72ч 68

Па <18роЕ1 рсЗ 11 <1 48ч 28

г17 72ч 40

11 116 сгёроЕг Р<111 2-3 48ч 70

«317 72ч 90

условия СЫВг-конденсации приведены в подписи к таблице 1.

условия ЭДК-конденсации такие же, как в подписи к таблице 1; время реакции составляло 48 или 72 часа.

первичные структуры олигонуклеотидов приведены в подписи к таблице 1. Методы анализа и выделения продуктов реакций были аналогичны описанным в разд. 1.1 и 1.2.

Анализ данных по химическому лигированию в дуплексах 9а-116 (табл. 3) позволил сделать следующие выводы.

1. Синтез олигонуклеотидов с тризамещенной пирофосфатной межнуклеотидной группой в РНК-содержащих дуплексах возможен. Конденсация протекает эффективно (с выходом продукта до 60%) только в ^ случае, когда в реакционном узле З'-концевой нуклеотид является дезоксирибонуклеотидом. ~ "

2. Присутствие в 3'-положении одноцепочечного разрыва рибонуклеотида приводит к очень низкой эффективности ХЛ (серия 9а-г, табл. 3). По-видимому, 2'-гидроксил рибонуклеотида в 3'-положении реакционного узла внутримолекулярно атакует ближайший к нему фосфатный остаток, что приводит к расщеплению образующегося трлзамещенного пирофосфата с образованием циклофосфата.

О^-бН 0=Р-0Е|

0*\Е,

0=Р-О'

он

0=Р-0"

X?

0=Р-6

о

II

3. Из двух изученных конденсирующих агентов только карбодиимид оказался эффективным при введении тризамещенного пирофосфата в РНК-содержащие дуплексы.

Полученные в настоящей работе данные по синтезу рибо- и смешанных рибо-дезоксирибо-олигонуклеотидов позволяют проводить рациональный подбор компонентов реакционных систем для достижения максимальной эффективности реакций химического лигирования.

Химические свойства олигонуклеотидов, содержащих ТЗП, образованную с участием 3'- концевого дезоксинуклеозид о этилфосфата, оказались аналогичными свойствам 5'|-о-Р-О-Р-О-1з'

I 1

олигонуклеотидов дезокси-ряда, содержащих эту ОЕ1 /ш

г, ИиН

же межнуклеотидную группу. Полученные

соединения устойчивы в водных растворах при рН о

I_ II _ _и_

5.5-7.5 в отсутствие сильных нуклеофилов. При 5 ! 0-Р-о + Р-о-

ОЕ1 О"

взаимодействии этих соединений с

этилендиамином или лизином при рН 8 протекала где МиН = 'Ч,Н2~К

реакция нуклеофильного замещения у дизамещенного атома фосфора тризамещенного

пирофосфата, приводящая к расщеплению ангидридной связи с образованием

фосфамидного производного З'-концевого олигонуклеотида.

Высокая эффективность реакций с этилендиамином и лизином свидетельствует о том, что олигорибонуклеотиды, содержащие тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу, также как и их дезоксирибо-аналоги, могут быть использованы для ковалентного связывания с иуклеофильными группами белков, образующими с РНК специфические комплексы. В связи с этим было важно выяснить, какие из функциональных групп боковых цепей аминокислот способны взаимодействовать с ТЗП. Список потенциальных нуклеофильных групп включал гидроксил серина, треонина и тирозина, сульфгидрильную группу цистеина, гуанидиновую группу аргинина, аминогруппу лизина, имидазольную - гистидина, карбоксильную группу аспарагиновой и глутаминовой кислот. Поскольку свободные аминокислоты содержат первичную

алифатическую а-аМИНОфуппу, ТО ДЛЯ слдсоОЛ^О^О^О-ССЛССАСиОАС (I) изучения реакционной способности 0 °

функциональных групп боковых цепей

были использованы модельные соединения, содержащие только требуемые

функциональные группы. В таблице 4 приведены структуры модельных соединений и результаты их взаимодействия с 19-звенным олигонуклеотидом (I) - продуктом ХЛ в дуплексе 10а (табл. 3).

Таблица 4. Взаимодействие олигонуклеотида (I), содержащего ТЗП, с модельными соединениями, содержащими функциональные группы боковых цепей аминокислот^

Аминокислота Структура боковой группы Моделыюе соединение Взаимодействие с олнгорибонук-леотндом (I)

Лизин (К) -(CH2)4-NH2 • H2N-(CH2)2-NH2 +

Гистидин (Н) О +

Аргинин (Р) nh —(ch2)j-nh-¿-nh2 nh chj—ch¡-nh-(í-nh¡ -

Тирозин (У) —ОН СН]—^—ОН -

Серии(Б) Треонин (Т) —сн2-он —сн—ОН СНз CjHs-OH -

Цистеин (С) —CH2-SH hs-ch2-ch-ch-ch2-sh óh óh -

Аспарагиновая кислота (О) Глутаминовая кислота (Е) —СН2-СОО" —СН2-СН2-СОО- CHj-COO- -

§ Условия реакций: концентрации - олигонуклеотида (I) 0.5-5 мкМ, модельных соединений 200 - 300 мМ. Инкубацию проводили 18-24 часа при 10°С в воде и двух буферных растворах: 50 шМ Tris, 20 шМ КС1, рН 8.5 (ТК2) и 50 шМ l-Melm, 20 mM КС1, рН 8.5 (МК2).

Было установлено, что в условиях, указанных в таблице 4, только остатки лизина и гистидина могут реагировать в растворе с олигонуклеотидами, содержащими тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу (эффективность реакций составила 40-60%).

II. Изучение ковалентного связывания Tat и Rev с РНК-дуплексами, содержащими

активные группы

Задача следующего этапа работы заключалась в изучении природы взаимодействий в белок-РНК комплексах Tat-TAR и Rev-RRE. Для этого были сконструированы РНК-дуплексы, содержащие активную замещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу в участках узнавания этих белков (рис. 1).

5' GCUGCdUpOE t pCUCUGGCU

GCUGCdUpOMe pCUCUGGCU

GCUGCUdCpOE t pUCUGGCU

GCUGCUC dUpOE t pCUGGCU GCUGCUCUCdUpOEt pGGCUÄC

с) CACGACGAGAG-A---------CCGA(TGA)

TAR

(дуплексы серии 12)

AC GUGdUpOE t pGGGCGCAGC ACGUGUdGpOE t pGGCGCAGC dATGCACA-C-------CCGCGTCG

1. Химическое лигирование

2. Выделение в 20%-ном денатурирующем ПААГ

3. Отжиг с немодифицированным ТАП РНК тяжем

и ии

5' AGCCAGA GAGCAGC

RRE

(дуплексы серии 13)

12 II;

3' UCGGUCU-

«Э 42 41 С

-CUCGUCG

""',°4 G G 5' A-CGUGUG CGCAGC

3' (dT)GCACAC GCGUCG AUG

Н t I

4 3 2 1

Рисунок 1. Схема синтеза модельных TAR и RRE РНК дуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу. Сайты узнавания белков выделены жирным шрифтом.

Нумеоаиия дуплексов.

TAR* : ТЗП в положении 1 - дуплексы 12а (-OEt) и 126 (-ОМе), в положении 2 - дуплекс 12в, 3 - 12г, 4 - 12д;

BRE: ТЗП в положении 1 - дуплекс 13а, 2 -. 136.

11.1. Синтез TAR и RRE РНК-дуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу

Схема синтеза TAR и RRE дуплексов приведена на рис. 1. В TAR дуплексе тризамешенный пирофосфат вводился в положения 1-4. Положения 1-3 находятся внутри сайта узнавания Tat и, как было показано ранее, могут участвовать в прямых контактах с белком. Положение 4 находится вне сайта узнавания Tat и согласно имеющимся литературным данным не контактирует непосредственно с белком. Соответствующий TAR дуплекс служил контролем специфичности связывания.

В RRE дуплексе тризамещенный пирофосфат располагался в положениях 1 или 2 внутри сайта узнавания Rev (рис. 1). Межнуклеотидные фосфаты в этих положениях необходимы для образования комплекса Rev-RRE.

Введение химически активных групп во все выбранные положения сахаро-фосфатного остова проводили методом химического лигирования. При планировании всех синтезов учитывались закономерности, установленные и описанные в разделе I.

Пяя удобства описания в ТАЯ межнуклеотидному узлу, расположенному между 1138 и С39, был дан номер 1, между С39 и 1/40 - 2. между 1140 и С41 - 3, между и42 и С43 - 4; в ЯЯЕ межнуклеотидному узлу, расположенному между 1Л03 и С104 - номер 1, между 0104 и 0105 - 2.

Конденсацию олигорибонуклеотидов проводили на комплементарной

олигодезоксирибонуклеотидной матрице. Для введения ТЗП использовался ЭДК.

З'-Концевой нуклеотид в месте лигирования заменяли на дезоксирибонуклеотид (рис.

I, табл. 5). Выходы продуктов конденсации приведены в таблице 5.

Таблица 5. Эффективность химического лигирования при синтезе модифицированных тяжей TAR и RRE в гибридных РНК-ДНК дуплексах^

Номер дуплекса Структура дуплексов для ХЛ Выход продукта,%

14а GCUGC(dU)pOMeJ.p*CUCUGGCU/TD 16 ¥ 35

146 GCUGC(dU)pÖa 38

14в GCUGCU(dC)pOEtVUCUGGCU/TD16 55

14г GCUGCUC(dU)pOEt4<p'CUGGCU/TD16 44

14д GCUGCÜCÜC(dÜ)pÖ 36

14е ACGUG(dU)pOEtlp'GGGCGCAGC/RD16 6

14ж ACGUGU(dG)pOEt4p*GGCGCAGC/RD16 8

§ -условия ЭДК-конденсации см. в подписи к таблице 1;

Первичные структуры олигодезоксирнбонуклеотидных матриц: TD16 5' d(AGCCAGAGAGCAGCAC) TD17 5' d(AGTAGCCAGAGAGCAGC) RD16 5' d(GCTGCGCCCACACGTA)

Присутствие в синтезированных олигонуклеотидах активной группы доказывали с помощью реакции с ЭДА при pH 8.0.

Отношения m/z (отношение молекулярная масса/заряд иона) соединений II и III, определенные масс-спектрометрически, соответствовали рассчитанным значениям. Эти данные являются первым ^г-. „е

прямым физическим доказательством того, что атака нуклеофила (амина) направлена по менее замещенному (дизамешенному) атому фосфора тризамещенного пирофосфата.

Олигорибонуклеотиды, содержащие активную группу и выделенные в индивидуальном виде, смешивались со вторым, немодифицированным синтетическим 17-звенным олигорибонуклеотидом и путем выдерживания при —20°С проводилось формирование дуплексов TAR и RRE (рис. I).

GCUGC(dU)-

OEt О" -О-Р—О—PrO—CUCUGGCU Ö

NH2-(CH2)J-NH

О

G С UG C(d U)-o~ р-о®

¿Et

II

+ h2n-(ch2)2-hn-p-o-CUCUGGCU о®

III

- 15 -

11.2. Tat-TAR ковалентное связывание

Ковалентное связывание в комплексе Tat-TAR изучалось с использованием

следующих компонентов: TAR РНК. была представлена пятью модельными TAR

дуплексами 12а - 12д (нумерация дуплексов - см. подпись к рис. 1), содержащими

активные группы. Белковая часть комплекса была представлена полным Tat белкой (86

аминокислот, рис. 2а) и Tat пептидом (36 аминокислот, рис. 26), содержащим большую

Л

часть кор участка, РНК-связывающий основной участок и Gin-богатый участок. Этот Tat пептид образует комплекс с природной TAR РНК со специфичностью, близкой к полному Tat белку.

а) Tat белок

1 22 32 48 60 72 86

б)

Рисунок 2. А) участки Tat белка; б) аминокислотная последовательность Tat пептида.

Прежде чем изучать реакции ковалентного связывания, было показано, что введение ТЗП группы в РНК дуплекс не препятствует образованию специфического комплекса Tat-TAR. Доказательство проводилось с помощью методов торможения в полиакриламидном геле и связывания на нитроцеллюлозных фильтрах.

Оптимальные условия ковалентного связывания Tat с TAR, содержащим ТЗП, были отработаны на примере системы Tat пептид - TAR дуплекс 12а. Для этого варьировали а) pH буферного раствора, в котором проводили реакцию; б) состав буферного раствора и в) температуру. Оптимальными условиями оказались: МК1 буфер (50 шМ 1-метилимидазола, 20 мМ KCl, 5 шМ DTT и 0.01% Тритон-ХЮО, pH 8.5) и температура +10°С. Присутствие в составе буфера дитиотреитола (DTT) и Тритона-ХЮО не влияло на эффективность ковалентного связывания Tat пептида, но было необходимо для предотвращения агрегации полного Tat белка в растворе.

В найденных условиях было проведено сравнительное изучение ковалентного связывания Tat с TAR дуплексами, содержащими ТЗП в положениях 1-4 (дуплексы 12а-д). Ковалентное связывание Tat с TAR РНК-дуплексами 12а-12д проводили

N-концевой Cys Кор Основной Gin-богатый Экзон 2

Tat пептид 37-72: ¿f 'Ij

37sfttkalgisygrkkrrqrrrppqgsgthqvslskq 72

основным, или по-английски basic, данный участок Tat был назван из-за высокого содержания аминокислотных остатков лизина и аргинина. .

при 10°С в течение 18 часов. Реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 8% ПААГ в денатурирующих условиях (в присутствии 0.1% SDS). Перед нанесением на гель образцы инкубировали 5 мин при 95°С в присутствии 0.5% SDS, 7М мочевины и 50 мМ DTT, что исключало образование нековалентных комплексов белок (пептид) — РНК. (Контрольные эксперименты с использованием немодифицированного TAR и TAR-дуплекса, содержащего простую пирофосфатную межнуклеотидную группу, подтвердили, что выбранная процедура приводит к полному разрушению нековалентных комплексов Tat-TAR).

Положения в геле исходного меченого TAR дуплекса, продуктов его гидролиза и ковалентносвязанного комплекса РНК-белок определяли авторадиографией (рис. 3). Для обнаружения зон(ы) белка гель прокрашивали Кумасси G250. Совпадение зоны, содержащей белок (пептид), с радиоактивной зоной подтверждало образование ковалентносвязанного комплекса Tat-TAR. Второе доказательство заключалось в MALDI TOF масс-спектрометрическом анализе продуктов реакции ковалентного связывания. В масс-спектре детектировалось присутствие пика с m/z, соответствующим ковалентносвязанному комплексу.

Результаты ковалентного связывания Tat пептида и Tat белка с TAR дуплексами 12а-д суммированы в таблице 6.

Таблица 6. Эффективность ковалентного связывания Tat с TAR дуплексами 12а-д^

Объект Положение ТЗП в TAR Выход ковалентносвязанного

комплекса Tat-олигорибонуклеотид, %

1 (-OEt) 32-35

1 (-ОМе) 33-36

Tat пептид 2 19-22

3 28-30

4 0-2

1 (-OEt) 25-27

1 (-ОМе) 24-27

Tat белок 2 15-17

3 21-24

4 1-3

§ Концентрации: Tat пептида 500 нМ, белка 60 нМ; TAR дуплексов 100 нМ и 15 нМ соответственно.

На рис. За и б приведены авторадиограммы, полученные после проведения ковалентного связывания Tat белка (рис. За) или Tat пептида (рис. 36) с дуплексами 12а-д.

Из рис. 3 видно, что и полный Tat белок, и Tat пептид достаточно активны в реакции ковалентного связывания с TAR дуплексами и образуют ковалентные "сшивки" в трех положениях (1-3) из четырех выбранных. Введение ТЗП в положение 4 не приводит к образованию ковалентносвя-занного комплекса Tat-олиго-рибонуклеотид.

Эффективность ковалентного связывания Tat с TAR дуплексами, содержащими ТЗП (-ОСН3) и ТЗП (-ОС2Н5), практически одинакова.

11.3. Подтверждение специфичности ковалентного связывания Tat-TAR

Под специфичностью в рассматриваемых экспериментах имелось в виду следующее: ковалентное связывание белка с РНК происходит, только если в РНК-дуплексе присутствует корректный сдйт узнавания белка и если активная группа находится внутри этого сайта узнавания.

Первым доказательством специфичности ковалентного связывания Tat по положениям 1-3 TAR служит тот факт, что введение ТЗП в положение 4, расположенное за пределами сайта узнавания Tat, не приводит к образованию ковалентной связи с белком или пептидом.

Для дополнительного исследования специфичности ковалентного связывания Tat по положениям 1-3 TAR использовались: 1) TAR РНК-дуплекс, не содержащий ТЗП (12ж); 2) РНК-дуплекс, не имеющий участка узнавания Tat (12и); 3) гибридный РНК-ДНК дуплекс, содержащий ТЗП и не содержащий сайта узнавания Tat (12к). Дуплексы 12ж и 12и были использованы как конкурентные ингибиторы реакции ковалентного связывания Tat пептида с TAR дуплексом 12а. Полученные результаты представлены на рис. 4.

а)

- 17 -12 3 4

*тт

б)

12 3 4

Ковалентносвяэак-ный комплекс

«Л

■ TAR дуплекс

Продукты гидролиза T31ITAR

Рисунок 3. Ковалентное связывание Tat пептида (а) и белка (б) с TAR дуплексами 12а-г, содержащими ТЗП в положениях 1-4 соответственно.

Из рис. 4 видно, что 7-кратный избыток конкурентного ингибитора - дуплекса 12ж практически полностью ингибирует ковалентное связывание ТЗП-реагента - дуплекса 12а с Tat пептидом. В присутствии дуплекса 12и, не содержащего сайта узнавания Tat, наблюдается некоторое снижение выхода ковалентносвязанного комплекса, которое обусловлено способностью Tat узнавать случайные последовательности в НК.

Дуплекс }2ж гт

U U

5' AGCCAGA GAGCAGC

3' UCGGUCU-CUCGUCG

Дуплекс 12и

5' AGCCAGAGAGCAGC 3' UCGGUCUCUCGUCG

Дуплекс 12к

'd(AGCCAG---A-GAGCAGCAC)

3' UCGGUCbp(dü) CUCGUCG

I

О Et

Изучение взаимодействия Tat пептида с дуплексом 12к, содержащим ТЗП и не содержащим сайта узнавания Tat, показало, что в выбранных нами условиях (см. подпись к табл. 6) образуется только специфический ковалентносвязанный комплекс Tat-олигорибонуклеотид.

III. Определение аминокислоты, ковалентно связанной с олигорибонуклеотидом в результате ковалентного связывания Tat с TAR, содержащим ТЗП в положении 1

Высокая эффективность и специфичность реакции ковалентного связывания Tat по положениям 1-3 TAR открыли возможность исследования природы ковалентносвязанных комплексов и определения аминокислотных остатков в Tat, контактирующих с межнуклеотидными фосфатами TAR. В качестве объекта исследования был выбран продукт ковалентного связывания Tat пептида с TAR, содержащим ТЗП в положении 1.

I —•—дуплекс 12ж' j —О—дуплекс 12н '

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 125 15.0 См игибитор/См реагент

Рисунок 4. Зависимость степени ковалентного связывания Tat пептида с TAR дуплексом 12а в присутствии возрастающего количества дуплекса 12ж или 12и.

Остатки лнзнна основного и кор участков Tat как наиболее вероятные места ковалентного связывания

По литературным данным в Tat белке с TAR РНК непосредственно взаимодействует основной (см. сноску на стр. 15) участок (рис. 2 и 5).

Основной

КОР (РНК-связывающий) Gin-богатый

J _41 47J 50 51 I 7l| 72

SFTTKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSGTHQVSLSKQ

1 А / \ I

LysC Chy LysC LysC LysC

Рисунок 5. Аминокислотная последовательность Tat (37-72) пептида с указанием а) участков; б) положений остатков лизина 41, 50 и 51 и в) мест расщепления: химотрипсином (Chy) и эндопептидазой LysC (LysC).

Имеются также данные о наличии контактов аминокислотных остатков соседнего с основным - кор участка Tat с TAR дуплексом. В составе основного и кор участков Tat присутствуют следующие аминокислоты, содержащие в боковой цепи потенциальные нуклеофильные группы: Lys, Ser, Thr, Туг, Arg. Как было установлено в экспериментах на модельных соединениях (см. разд. 1.3 и табл. 4), из всех перечисленных выше аминокислот только остатки лизина могут реагировать с олигонуклеотидом, содержащим ТЗП, с образованием фосфамидной связи. В 1965 году З.А. Шабаровой была предложена реакция для селективного расщепления фосфамидной связи под действием водного 4M раствора NH2OH с pH 5.0*. Обработка продукта ковалентного связывания Tat пептида с TAR, содержащим ТЗП в положении 1, в указанных условиях привела к полному расщеплению ковалентной связи между Tat и олигорибонуклеотидом, что подтвердило фосфамидную природу связи в ковалентносвязанном комплексе белок-РНК.

Еще одним подтверждением того, что именно остатки лизина, а не аргинина в РНК-связывающем участке Tat реагируют с ТЗП в TAR, являются полученные нами результаты по ковалентному связыванию в системе Rev-RRE. В Rev белке, также как и в Tat, есть РНК-связывающий основной участок. Этот участок Rev в отличие от Tat не содержит остатков лизина, но имеет 9 остатков аргинина. По данным ЯМР спектроскопии некоторые из этих остатков аргининов образуют прямые контакты с

*

Эта реакция позже была успешно использована для подтверждения фосфамидной природы связи ДНК-и РНК-лигазы с АМФ при доказательстве механизмов действия этих ферментов.

фосфатами в RRE, в частности с положением 1 (см. рис. 1). С фосфатом в положении 2, согласно тому же источнику, контактирует остаток треонина. Крайне низкая эффективность ковалентного связывания Rev белка с RRE дуплексами, содержащими ТЗП в положениях 1 и 2, которую мы наблюдали в экспериментах (<1% в обоих положениях), подтверждает тот факт, что гуанидиновая группа аргинина и гидроксильная - треонина неактивны в реакции с ТЗП.

Таким образом, по всем данным только остатки лизина основного и кор участков Tat могут участвовать в реакции с TAR, содержащим ТЗП в положении 1, в результате чего образуется продукт ковалентного связывания Tat с олигонуклеотидом. Кор участок содержит один остаток лизина - Lys4I,'основной участок - два: Lys50 и Lys51. Поэтому задача определения контакта сводилась к установлению остатка лизина, ковалентно связанного с олигорибонуклеотидом.

Для решения этой задачи прежде всего был осуществлен синтез TAR дуплекса с ТЗП в положении 1 и проведено его ковалентное связывание с Tat пептидом в препаративном масштабе. Предварительный масс-спектральный анализ показал, что в SDS ПААГ не достигается разделения продукта реакции ковалентного связывания и исходного пептида. Поэтому для выделения ковалентносвязанного комплекса в индивидуальном виде был разработан альтернативный подход с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 6). Разделение велось в градиенте концентрации ацетонитрила в присутствии 0.1 % CF3COOH. а) б)

ковалентное вязанный

Рисунок 6. Разделение продуктов ковалентного связывания Tat пептида с TAR дуплексом, содержащим ТЗП в положении 1, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Детекция при а) 260 нм и б) 218 нм.

Следующий этап исследования заключался в определении, какой из трех остатков лизина (Lys41, Lys50 или Lys51) ковалентно связан с олигорибонуклеотидом. Связь лизин-олигонуклеотид является фосфамидной и полностью гидролизуется в условиях

секвенирования пептидов по Эдману. Поэтому мы использовали альтернативный аналитический метод определения положения Lys в белке, с которым связан олигонуклеотид. Метод заключается в расщеплении ковалентносвязанного комплекса эндопептидазами с последующим анализом продуктов протеолиза MALDI TOF масс-спектрометрией. Для расщепления были использованы два фермента - химотрипсин и эндопептидаза LysC. Ковалентносвязанный комплекс и свободный Tat пептид обрабатывались ферментом в одинаковых условиях, и затем проводилось сравнение молекулярных масс продуктов. Обработка химотрнпсииом

Tat пептид содержит единственный сайт расщепления химотрипсином - Туг47 (рис. 5). Результаты обработки химотрипсином свободного и ковалентно связанного с олигорибонуклеотидом Tat пептидов суммированы в таблице 7.

Таблица 7. Отношения m/z продуктов расщепления химотрипсином Tat пептида и ковалентносвязанного комплекса Tat пептид- pCUCUGGCU§

Свободный Tat пептид Ковалентносвязанный комплекс Tat пептид-pCUCUGGCU

1189 (фрагмент 37-47) 3000 (фрагмент 48-72) 1189 (фрагмент 37-47) 5534 (фрагмент 48-72 + pCUCUGGCU)

§ Условия реакции: 500 нМ ковалентносвязанного комплекса Tat пептид-pCUCUGGCU, 3 мкг фермента/20 мкл реакционной смеси, 0.1 М NH4HCO3, pH 8.0, 37°С, 2 ч.

Из таблицы 7 видно, что химотрипсин расщепляет свободный Tat пептид на два фрагмента с m/z 1189 (фрагмент, включающий аминокислоты 37-47) и 2999 (фрагмент 48-72). Полученные значения m/z продуктов химотрипсинолиза свободного пептида соответствуют рассчитанным. Обработка ферментом ковалентносвязанного комплекса приводит к получению также двух продуктов с m/z 1189 и 5534. M/z первого продукта соответствует немодифицированному фрагменту Tat пептида с 37-ой по 47-ю аминокислоту. M/z второго продукта - 5534 - хорошо согласуется с ожидаемой величиной для фрагмента 48-72, ковалентно связанного с pCUCUGGCU (рассчитанное m/z 5531). Следовательно, Lys4I кор участка не участвует в образовании ковалентносвязанного комплекса, и местом "пришивки" является Lys50 или Lys51 основного участка.

Обработка эндопептидазой LvsC

Эндопептидаза LysC - это протеолитический фермент из Lysobacter enzymogenes, специфически гидролизующий пептидные связи, образованные карбоксильной группой лизина, но не аргинина. Свободный Tat пептид и ковалентносвязанный комплекс были обработаны этим ферментом. Результаты анализа полученных реакционных смесей представлены в таблице 8.

*

Таблица 8. Отношения m/z продуктов расщепления Tat пептида и ковалентносвязанного комплекса Tat пептид- pCUCUGGCU эндопептидазой LysC§

Свободный Tat пептид Ковалентносвязанный комплекс Tat пептид-pCUCUGGCU

964 (фрагмент 42-50) 1092 (фрагмент 42-51) 2530 (фрагмент 51-71 + 52-72) 2656 (фрагмент 51-72) 964 (фрагмент 42-50) отсутствует 1092 (фрагмент 42-51) 1117 2530 (фрагмент 52-72) отсутствует 2656 (фрагмент 51-72) 2687 ( И Lys- pCUCUGGCU) 2728 429?-...

*

Масс-спектры снимались, начиная с m/z ,800.

§ Условия реакции: 500 нМ ковалентносвязанного комплекса Tat пептид-pCUCUGGCU, 0.0375 единицы фермента/20 мкл реакционной смеси, 0.1 М NH4HCO3, pH 8.0, 37°С, 1.5 ч.

Обработка свободного Tat пептида привела к получению четырех основных пиков (табл. 8), m/z отношения которых полностью согласуются с ожидаемым частичным или полным расщеплением пептида по всем четырем имеющимся лизинам: 41, 50, 51 и 71 (рис. 5). Масс-спектр LysC-расщепленного ковалентносвязанного комплекса отличается тем, что в нем отсутствуют пики всех протеолитических фрагментов,-содержащих Lys51, которые имелись в спектре LysC-расщепленного Tat пептида: 1092 (фрагмент 42-51) и 2656 (фрагмент 51-72). Вместо этих двух пиков появились новые с m/z 1117, 2687, 2720 и серия пиков, начинающаяся с m/z 4299. Есть все основания полагать, что пик с m/z 2687 соответствует соединению Lys-pCUCUGGCU (m/z рассчитанное 2679). Пики 1117, 2720 и 4299-... остаются неидентифицированными. Тем не менее, присутствие в масс-спектре LysC-расщепленного ковалентносвязанного комплекса пиков с m/z 964, 2530 и 2687 и отсутствие пиков 1092 и 2656 (см. табл. 8) может быть объяснено только наличием ковалентносвязанного комплекса Tat пептид-pCUCUGGCU с Lys51 основного участка Tat. Таким образом, все полученные данные позволяют сделать

вывод о том, что в комплексе Та^ТАЯ 1 контактирует с межнуклеотидным фосфатом в положении 1 (р38-39) ТАЯ.

ВЫВОДЫ

1. Проведено детальное изучение химического лигнрования в РНК-содсржащих дуплексах под действием двух конденсирущих агентов - ЭДК и CNBr. Исследование проводилось с целью введения в олигонуклеотид различных межнуклеотидных групп: фосфодиэфирной, пирофосфатной или активной тризамещенной пирофосфатной. Показано, что:

а) Для олигонуклеотидов с фосфодиэфирной и простой пирофосфатной межнуклеотидными группами эффективность конденсаци примерно одинакова при использовании ЭДК и CNBr. При введении тризамещенного пирофосфата в РНК-содержащие дуплексы эффективным конденсирующим агентом оказался только ЭДК.

б) При введении в олигорибонуклеотид тризамещенной пирофосфатной или фосфодиэфирной межнуклеотидных групп конденсация протекает эффективно только в том случае, когда углеводный фрагмент З'-концевого нуклеотида в реакционном узле представлен 2'-дезоксирибозой.

в) Химическое лигирование практически всегда эффективнее протекает на олигодезоксирибонуклеотидной матрице, чем на ее рибо-аналоге.

2. На основе установленных закономерностей химического лигирования в РНК-содержащих комплементарных комплексах проведен дизайн и синтез TAR и RRE дуплексов, содержащих активную тризамешенную пирофосфатную межнуклеотидную группу в определенных положениях сахаро-фосфатного остова, для ковалентного связывания с регуляторными белками Tat и Rev.

3. Показано, что введение в TAR и RRE дуплексы активной группы практически не изменяет сродства белка к модифицированной РНК.

4. Подобраны условия специфичного ковалентного связывания Tat белка и пептида с TAR РНК с высокой эффективностью (15 и 35% соответственно).

5. Путем замены межнуклеотидного фосфата на тризамещенный пирофосфат проведено тестирование четырех положений сахаро-фосфатного остова в TAR и двух - в RRE на наличие контактов с Tat и Rev белком соответственно. Установлено, что введение активной группы в положения 38-39, 39-40 и 40-41 TAR приводит к эффективному региоспецифическому ковалентному связыванию этой РНК с белком.

6. Показано, что только остатки лизина и гистидина способны взаимодействовать с тризамещенной пирофосфатной группой. Отсутствие остатков лизина и гистидина в РНК-связывающем участке Rev обусловило низкую эффективность ковалентного связывания в комплексе Rev-RRE.

7. Методом региоспецифического ковалентного связывания установлено, что остаток Lys51 Tat непосредственно контактирует с фосфатом в положении 38-39 TAR. Для определения аминокислоты, которая ковалентно связывается' с РНК, впервые использовано избирательное расщепление ковалентносвязанного комплекса специфичными эндопептидазами с последующим анализом продуктов протеолиза MALDI TOF масс-спектрометрией.

1. Нарышкин, Н.А., Ивановская, М.Г., Орецкая, Т.С., Волков, Е.М., Гейт, М.Дж., Шабарова, З.А. Синтез и свойства смешанных рибо-дезоксирибоолиго-нуклеотидных дуплексов, содержащих межнуклеотидную тризамещенную пирофосфатную связь. Биоорганическая химия, 1996, 22 (9), с. 691-698.

2. Ивановская, М.Г., Нарышкин, Н.А., Шабарова, З.А. Синтез и свойства новых производных олигонуклеотидов, содержащих химически активные уреидные группировки. Биоорганическая химия, 1995, 21 (6), с. 454-460.

3. Naryshkin, N.A., Farrow, М.А., Ivanovskaya, M.G., Oretskaya, T.S., Shabarova, Z.A., Gait, M.J. Chemical cross-linking of the Human Immunodeficiency Virus type-1 Tat protein to synthetic models of the RNA recognition sequence TAR containing site-specific trisubstituted pyrophosphate analogues. Biochemistry, 1997, in press.

4. Ivanovskaya, M.G., Naryshkin, N.A., Kozlov, I.A., Kuznetsova, S.A., Shabarova, Z.A. A novel approach to oligonucleotide reagents design for "sense" biotechnology. Miami Bio/Technology European symposium "Advances in gene technology: Molecular biology of human genetic disease", Monte Carlo (Monaco) 17-20 November, 1994, Short reports, 5, p. SU45a (suppl).

5. Naryshkin, N.A., Ivanovskaya, M.G., Shabarova, Z.A. Targeting of DNA modified by amino acids by water soluble carbodiimide. Synthesis of new chemically active ureid derivatives. - FEBS advanced lecture course "Young scientist's view of molecular biotechnology", Liege (Belgium) 27 August - 2 September, 1995, p. 21.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях: