ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Романенков Андрей Сергеевич

ДНК-ДУПЛЕКСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ГРУППИРОВКИ В УГЛЕВОДОФОСФАТНОМ ОСТОВЕ, КАК РЕАГЕНТЫ ДЛЯ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА И ЛИЗИНА БЕЛКОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, в.н.с.

Метелев Валерий Георгиевич

кандидат химических наук, в.н.с. Кубарева Елена Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, в.н.с.

Туницкая Вера Леонидовна

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАМН Киселев Федор Львович

Ведущая организация: Институт химической биологии и

фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Защита состоится 21 февраля 2006 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 января 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

¿ообА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Белково-нуклеиновые взаимодействия являются определяющими для основных процессов, протекающих в клетке - репликации, транскрипции и трансляции ДНК, а также процессинга РНК. Структуру НК-белковых комплексов изучают как с помощью инструментальных методов, например, рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), так и методом ковалентного связывания белков с НК. Существует ряд задач, для решения которых этот метод на сегодняшний день представляется оптимальным. Прежде всего, он позволяет идентифицировать отдельные аминокислоты белка, сближенные с участком узнавания НК на разных стадиях белково-нуклеинового взаимодействия. Ковалентное связывание белков с НК-лигандами является уникальной возможностью получения белково-нуклеиновых комплексов в определенном структурном состоянии, и многими исследователями предлагается использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА.

В настоящее время существует большое число способов ковалентного присоединения белков к НК. Для аффинной модификации белков чаще всего используют аналоги НК, содержащие различные реакционноспособные группировки. Такие группировки могут быть введены в гетероциклические основания или углеводные остатки, по концевой или межнуклеотидной фосфатной группе нуклеиновой кислоты.

Известно, что контакты между белком и углеводофосфатным остовом НК составляют более половины всех взаимодействий в белково-нуклеиновом комплексе и вносят существенный вклад в его устойчивость и структурную организацию. В связи с этим для изучения особенностей функционирования ДНК-узнающих белков и ферментов необходимо создание ДНК-лигандов с модифицированными межнуклеотидными фосфатными группами и углеводными остатками. Наиболее перспективным представляется введение в состав синтетических олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов различных реакционноспособных группировок, способных селективно взаимодействовать с остатками лизина, аргинина или цисте ина, реализующими большую часть контактов белка с углеводофосфатным остовом ДНК. Подобные ДНК-реагенты представлены пока малочисленным классом соединений, к числу которых можно отнести дуплексы с межнуклеотидными замещенными пирофосфатными и ацил фосфатными группировками, а также диальдегидсодержащие аналоги НК.

Цель работы. Целью данной работы является дизайн, синтез и изучение свойств ДНК-лигандов, содержащих в заданном положении углеводофосфатного остова реакционноспособные группировки, которые могут образовывать ковалентную связь с пространственно сближенными в составе белково-нуклеинового комплекса нуклеофильны ми группами остатков лизина и цистеина белков.

Задачи работы: 1) разработка и оптимизация стратегии введения различных реакционноспособных группировок как в состав межнуклеотидных фосфатных групп, так и в 2'-положение остатков рибозы синтетических олигодезоксирибонуклеотидов; изучение свойств полученных ДНК-лигандов; 2) подбор условий аффинной модификации предложенными ДНК-лигандами модельных белков (гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции ОТ-кВ человека и ДНК-метилтрансферазы вздП (М-БвоИ)); 3) сопоставление результатов иодимера р50

субъединицы NF-кВ с имеющимися в базе данных трехмерных структур макромолекул (Protein Data Bank, PDB) результатами PCA по структуре комплексов NF-кВ'ДНК; 4) изучение методом аффинной модификации предложенными ДНК-лигандами особенностей взаимодействия бифункционального белка M.SsoII с участками узнавания в ДНК (данные РСА комплексов этого фермента с ДНК отсутствуют).

Научная новизна и практическая ценность. Синтезированы ДНК-дуплексы, содержащие в заданном положении углеводофосфатного остова реакционноспособные группировки, способные взаимодействовать с пространственно сближенными нуклеофильными группами остатков цистеина (а) и лизина (б) белков. К ним относятся:

а) • ДНК-дуплексы с единичными остатками уридина, содержащими в 2'-положении

углеводного фрагмента йодацетамидные (ДНК-лиганды I типа) или дисульфидные группы (ДНК-лиганды II типа), • ДНК-дуплексы с единичными межнуклеотидными фосфорилдисульфидными группировками (ДНК-лиганды III типа),

б) • ДНК-дуплексы, содержащие единичные 2'-0-(2-оксоэтил)уридиновые

(цитидиновые) звенья (ДНК-лиганды IV типа).

В процессе работы были впервые разработаны методы получения и изучены свойства ДНК-лигандов II типа, реакционная способность которых варьировалась путем замены остатка 2-тиопиридила в составе исходной 2'-(2-пиридил)дисульфидсодержащей группировки (IIa) на остатки тиогликолевой кислоты (Пб), цистеина (IIb) или глутатиона (у-Ь-глутамил-Ь-цистеинилглицина) (Пг).

Проведено всестороннее исследование ДНК-белковых контактов между остатками лизина и цистеина гомодимера р50 субъединицы [(р50)2] фактора транскрипции NF-kB и участком узнавания этого белка в ДНК (кВ-участком). В работе были использованы две последовательности кВ-участка - «идеальная» (Id-кВ: 5'-GGGAATTCCC-3') и последовательность из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов (Ig-кВ: 5'-GGGACTTTCC-3'), различающиеся числом и составом нуклеотидных пар между консервативными GG-корами (выделены жирным шрифтом). Структуры (p50)2»(Id-icB) и (p50)2*(Ig-idB) были проанализированы с помощью компьютерных программ на основании имеющихся в PDB рентгеноструктурных данных для различных комплексов NF-кВ»ДНК). Для экспериментальной проверки сближенности отдельных остатков Lys и Cys (р50)2 NF-кВ с кВ-участками различной нуклеотидной последовательности использован метод аффинной модификации белка ДНК-лигандами, несущими реакционноспособные группировки I-IV типов.

Продемонстрирована возможность использования ДНК-лигандов, содержащих единичные 2'-йодацетамидные, 2'-(3-цистеинилтио)пропионамидные или межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки, для эффективного ковалентного связывания пространственно сближенного в составе специфических ДНК-белковых комплексов (p50)2*(Id-KB) и (p50)2*(Ig-KB) остатка Cys59 белка. С помощью ДНК-лигандов III типа выявлен контакт тиогруппы Cys59 гомодимера р50 с 3'-фосфатной группой 7го нуклеотида (Ig-icB)-y4acTKa ДНК при комплексообразовании в растворе. Использование для аффинной модификации (р50)2 NF-кВ ДНК-лигандов I типа позволило также «зафиксировать» сближенность остатка Cys59 белка с углеводным фрагментом 7го нуклеотида как (Ig-кВ)-, так и (И-кВ)-участка. Установлена

корреляция полученных результатов с данными РСА по распределению контактов единственного остатка цистеина (Cys59) ДНК-узнающего центра белка р50 с углеводофосфатным остовом обоих кВ-участков.

Методом аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы NF-кВ ДНК-лигандами Пв типа установлены различия в расположении остатка Cys59 белка по отношению к углеводофосфатному остову (Ig-кВ)- и (1(1-кВ)-участка. Это подтверждает выдвинутое на основании данных РСА предположение о зависимости итоговой структуры комплекса NF-кВ'ДНК от нуклеотидной последовательности кВ-участка.

Исследование взаимодействия дуплексов, содержащих единичные 2-0-2-оксоэтильные группировки в составе кВ-участка, с гомодимером р50 субъединицы NF-кВ показало, что в образовании ковалентных связей с ДНК-лигандами ГУ принимают участие несколько остатков лизина, входящих как в состав С-концевого участка Rel-гомологичной области (Lys275, Lys360), так и в состав основной ДНК-узнающей петли L1 (Lys77) белка. Предполагается, что эти остатки лизина сближены с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания ДНК гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

В ходе аффинной модификации фосфорилдисульфид- и 2'-альдегидсодержащими ДНК-лигандами прокариотической С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII была получена информация, способствующая расширению представлений об особенностях действия этого бифункционального белка, способного выступать как в роли фермента модификации, так и в роли фактора транскрипции. С одной стороны, использование ДНК-лигандов III типа выявило сближенность остатка Cysl42 С-концевой (каталитической) области M.SsoII с углеводофосфатным остовом участка метилирования на стадии связывания ДНК-субсграта. С другой стороны, показано, что остатки лизина протяженной N-концевой области белка (1-71 а.о.), нехарактерной для семейства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, участвуют в образовании ковалентной связи с ДНК-лигандами IV типа, содержащими «регуляторный» участок из промоторной области генов системы рестрикции-модификации SsoII.

Продемонстрирована возможность образования ковалентно связанного комплекса M.SsoII сразу с двумя различными участками узнавания в ДНК, содержащими реакционноспособные группировки. С-концевая область M.SsoII взаимодействует с фосфорилдисульфидной группировкой в составе метилируемой последовательности ДНК-лигаида, при этом N-концевая область фермента сохраняет способность к связыванию с 2'-альдегидсодержащим «регуляторным» участком другого ДНК-лнганда. С другой стороны, необратимое присоединение N-концевой области M.SsoII к модифицированному «регуляторному» участку, напротив, препятствует взаимодействию Cysl42 С-концевой области с фосфорилдисульфидной группировкой в участке метилирования ДНК. Таким образом, впервые обнаружена взаимосвязь между двумя различными ДНК-связываннцими центрами M.SsoII, которая, возможно, играет важную роль в регулировании активности белка в клетке.

Выявленные особенности взаимодействия M.SsoII с ДНК могут быть перенесены также на другие прокариотические и эукариотические С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы с похожей структурой и функциями (в частности, M.EcoRlI и M.MspI).

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в российских и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на конференции «Ломоносов-2002» (Москва, Россия, апрель 2002 г.), III-ем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, июнь-июль 2002 г.), конференциях «Nucleic Acids and Nucleo-Protein-complexes» (Гиссен, Германия, апрель 2003 г.) и «Molecular Biology and Genetics» (Киев, Украина, сентябрь 2003 г.), V-om симпозиуме «Nucleic Acids Chemistry & Biology» (Кембридж, Великобритания, сентябрь 2003 г.), конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, май 2004 г.) и «Restriction/Modification» (Бристоль, Великобритания, сентябрь 2004 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, литературный обзор (посвящен особенностям взаимодействия фактора транскрипции NF-кВ с участками узнавания в ДНК), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 60 рисунками, 24 схемами, 16 таблицами. Библиографический указатель включает в себя

2DO

цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена синтезу и изучению химических свойств, в частности, перспективности использования для аффинной модификации белков, следующих типов ДНК-лигандов, содержащих реакционноспособные группировки в углеводофосфатном

S'

о=Р-О I 1

9 HN^S-S-Я

о=р-о" д _о

п

0=р-0" ?

?

— ÇH,

ш

«а) Wo

о£о°Л

IV

Важной особенностью этих ДНК-лигандов является то, что предложенные модификации могут быть введены в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи. Кроме того, 2'-йодацетамидная, 2'-дисульфидсодержащая и межнуклеотидная фосфорилдисульфидная (ФДГ) группировки ДНК-лигандов I, II и 111-го типов потенциально способны селективно взаимодействовать с тиогруппами пространственно сближенных остатков цистеина белков, а 2'-0-2-оксоэтильная группировка ДНК-лигандов IV типа - должна подвергаться нуклеофильной атаке со стороны £-аминогрупп остатков лизина. Известно, что эти аминокислотные остатки реализуют большую часть контактов именно с углеводофосфатным остовом ДНК за счет формирования множества водородных связей, электростатических и ван-дер-ваапьсовых взаимодействий (ЬшсотЬе М а!., 2001).

В данной работе предложенные ДНК-лиганды применяли для аффинной модификации двух ДНК-узнающих белков: гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека и прокариотической ДНК-метилтрансферазы SsoII, входящей в систему рестрикции-модификации Shigella sonnei 47*. Следует отметить, что для фактора транскрипции NF-кВ в литературе имеются данные рентгеноструктурного анализа его комплексов с различными последовательностями участка узнавания ДНК (кВ-участка). Сравнение данных РСА с результатами аффинной модификации позволило оценить целесообразность использования тех или иных типов ДНК-лигандов для изучения структурно-функциональных аспектов взаимодействия различных белков, в частности M.SsoII, с ДНК. Данные РСА комплексов этого фермента с участками узнавания ДНК отсутствуют.

1. Анализ с помощью компьютерных программ данных РСА для трехмерных структур комплексов фактора транскрипции NF-кВ с участком узнавания ДНК различной нуклеотидной последовательности

Фактор транскрипции NF-кВ представляет собой гомо- или гетеродимер из двух субъединиц - членов семейства Reí, имеющих в своем составе участок высокой гомологии с белком - продуктом онкогена rel (Rel Homology Region, RHR). In vivo NF-кВ существует преимущественно в виде гетеродимера, состоящего из субъединиц р50 и р65, однако гомодимеры (р50)г и (р65)г также играют важную роль в клетке. В отличие от р50«р65 и (р65)2 NF-кВ, активирующих транскрипцию многих провоспалителькых, антиапоптозных и вирусных генов, гомодимер р50 субъединицы подавляет их экспрессию, возвращая клетки в нормальное физиологическое состояние. Конкурируя в ядре клеток с гетеродимером р50*р65 за связывание энхансерных областей генов-мишеней, он является своеобразным природным ингибитором (р50*р65)-индуцируемого развития многих хронических воспалительных заболеваний, прогрессирования канцерогенеза, а также вирусного размножения. Одним из аспектов, необходимых для понимания принципов функционирования (р50)2 NF-кВ, является изучение молекулярных основ его взаимодействия с ДНК.

Каноническая форма участка узнавания как гетеродимера р50*р65, так и гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ, представляет собой двуцепочечную нуклеотидную последовательность из десяти пар оснований 5'-GGGPuNNPyPyCC-3' (где Ри - А или G, Ру - Т или С, N - A, G, Т или С). Две внешние консервативные G*C пары (GG-коры), обеспечивающие специфичность узнавания, разделены внутренними вариабельными парами оснований (ВВПО). Важной особенностью белков семейства NF-кВ является способность избирательно активировать транскрипцию различных генов в зависимости от нуклеотидной последовательности присутствующего в промоторной области кВ-участка. На основании данных РСА предполагается, что нуклеотидная последовательность кВ-участка (число и состав ВВПО) определяет

* Субъединица р50 и ее мутантные формы, содержащие глютатион-5-трансферазу (26 кДа) на N-конце, любезно предоставлены сотрудниками Института белка РАН Колесниковым И В, Молочковым Н.В и Тимченко М.А ДНК-метилтрансфераза SsoII, ее мутантные и делеционные формы, содержащие шесть остатков гистидина на N-конце, любезно предоставлены сотрудниками ВНИИСБ РАСХН Карягиной A.C. и Лавровой Н В., а также сотрудником ИБФМ РАН Солониным А С

итоговую конформацию фактора транскрипции в составе ДНК-белкового комплекса и влияет на взаимодействие ОТ-кВ с другими белками, также вовлеченными в процесс транскрипции конкретных генов.

Для интерпретации результатов аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы ОТ-кВ ДНК-лигандами ЫУ типов и решения вопроса о целесообразности их применения для зондирования структуры ДНК-белковых комплексов необходимо было, на основании данных РСА, построить схемы ДНК-белковых контактов в комплексах (р50)2 с теми последовательностями кВ-участка ДНК, которые использовались в экспериментальной работе. Нами были выбраны две последовательности участка узнавания ОТ-кВ - «идеальная» последовательность (И-кВ: 5'-ССОААТТССС-3') и последовательность из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов (^-кВ: 5'-ОССАС 111СС-3'), различающиеся числом и составом ВВПО между Св-корами.

В базе данных трехмерных структур белков (РОВ) имеются данные РСА для комплекса (р50)г ОТ-кВ с (И-кВ)-последовательностью ДНК. Нами с помощью программы ЯазМо1 был проведен анализ и построена схема распределения водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий в составе этого комплекса (рис. 1, а). Считали, что образование водородной связи возможно, если доноры или акцепторы водорода в ДНК находятся на расстоянии не более 3,5 А от соответствующих атомов в белке. Взаимодействие между неполярными атомами считалось возможным, если С2'-атом углеводного фрагмента или С 5-атом цитозина (в случае тимина - углерод СН3-группы при С5-атоме) находятся на расстоянии не более 4,5 А от атомов углерода в белке.

Для комплекса гомодимера р50 субъединицы №-кВ с (^-кВ)-участком ДНК данные РСА отсутствуют. Поэтому на основании всех имеющихся в базе данных РОВ структур комплексов КР-кВ*ДНК нами была построена обобщенная схема консервативных контактов между любым димером фактора транскрипции и кВ-участком структуры 5'-GGGAMWTTCC-3' (число ВВПО равно пяти; М - А или С, V/ -А или Т). Аминокислотные остатки различных субъединиц (р50 и р65), образующие одинаковые контакты, соответствовали друг другу согласно «выравниванию» аминокислотных последовательностей белков, выполненному с помощью программы ОепеОос. Предложенная обобщенная схема ДНК-белковых контактов была использована при компьютерном моделировании структуры комплекса (р50)г*(^-кВ). Для этого в программе 8\\ч8зРОВУ1елуег заменяли р65 субъединицу в составе закристаллизованного комплекса (р50*р65)«(^-кВ)) на р50 субъединицу из идентичного комплекса, совместив их по гомологичным аминокислотным последовательностям, являющимся участками взаимодействия данных белков с ДНК. Главным условием совмещения двух различных субъединиц являлось сохранение в итоговом комплексе (р50)2*(^-кВ) всех обнаруженных нами консервативных контактов. С помощью программы КаяМо1 был проведен анализ и построена схема распределения водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий в составе промоделированного комплекса (р50)2»(^-кВ) (рис. 1, б).

а б

Рис. 1. Схемы взаимодействия (р50)2 №-кВ с: а - (М-кВ)-участком (внешние СС-коры разделены шестью ВВПО), б - (^-кВ)-участком (внешние СС-коры разделены пятью ВВПО). Двойными стрелками (=>) показаны ван-дер-ваапьсовы взаимодействия между неполярными атомами, простыми стрелками (->) - водородные связи, точечными стрелками (•••>) - контакты.допускающие образование водородной связи (3,5-4,0 А); аминокислоты, относящиеся к одной субъединице заключены в прямоугольник к другой - в овал С5; СС-коры взяты в рамку.

2. Аффинная модификация остатков цистеина гомодимера р50 NF-кВ ДНК-лигандами I, II и III типов

Для выяснения особенностей комплексообразования и ковалентного связывания гомодимера р50 субъединицы NF-кВ с ДНК-лигандами I и II типов использовали два вида ДНК-дуплексов - 15N и 14N, содержащие (Ig-кВ)- или (М-кВ)-участок, соответственно (подчеркнуты). Модифицированные остатки уридина, содержащие в 2'-положении йодацетамидные или дисульфидные группы, вводили в 5, 6 или 1Ж

положение одной из цепей участка узнавания: 5 67

15N

5' TCGGAAAGTCCCCTC 3' AGCCTTTCAGGGGAG

567

14N 5' TGGGAATTCCCCTC 3' ACCCTTAAGGGGAG

Id-кВ

Выбор мест введения модифицированных звеньев в состав ДНК базировался на схемах взаимодействия гомодимера р50 с 0^-кВ)- или (М-кВ)-участком (рис. 1).

В качестве исходных соединений для синтеза модифицированных цепей 2'-йодацетамид- и 2'-дисульфидсодержащих ДНК-лигандов были использованы синтетические олигонуклеотиды с единичными 2'-амино-2'-дезоксиуридиновыми звеньями, любезно предоставленые науч. сотр. Химического факультета МГУ Е.М. Зубиным. Исходные олигонуклеотиды ацилировали избытками ангидрида йодуксусной кислоты в среде ацетонитрил / 1 М Ыа-боратный буфер (рН 8,3) или Ы-сукцинимидил-З-(2-пиридилдитио)пропионата в среде ДМФА / 1 М Ыа-боратный буфер (рН 8,3):

I . о о=Р-О

(ICHjCO)JO

О NHJ

---ö HN_

0=P-0"°

Анализ реакционных смесей методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте показал, что выход продуктов реакции ацилирования достигает 95%. Остаток 2-тиопиридила, входящий в состав 2'-(2-пиридил)дисульфидсодержащей группировки, был также заменен на остатки тиогликолевой кислоты, цистеина и глутатиона (y-L-глутамил-Ь-цистеинилглицина, Glut). Этот прием позволил варьировать реакционную способность ДНК-лигандов II типа. Все реакции протекали с количественным выходом и в дальнейшем были получены наборы модифицированных дуплексов четырех видов -Па, Пб, Пв и Пг:

оХо'У

о

IIa

-A

? "W-8.

о-Р-о Д _6 0

116

CHfiOO'

S-SCy«

-Tf

OHN^^^S-S-Glut _° О

Иг

Для введения в состав ДНК-лигандов III типа фосфорилдисульфидной группировки (ФДГ) использовали метод химического лигирования двух составляющих модифицированную цепь ДНК компонентов - З'-тиофосфорилированного олигонуклеотида и 2-пиридилдисульфидного аддукга 5'-дезокси-5'-меркаптопроизводного олигонуклеотида:

о=р-о"

9.

о

о=р-о"

Выходы продуктов реакции, проводимой в буфере с рН 4,5 достигали 95-98% при времени инкубации 15 мин. Протонирование атома азота пиридинового цикла, вероятно, увеличивало электрофильность атома серы, связанного с метиленовой группой олигонуклеотидного компонента и делало протонировэнный 2-тиопиридон лучшей уходящей группой. ФДГ вводили вместо фосфодиэфирных связей в следующие положения 19-звенной цепи (^-кВ)-содержащего дуплекса

19N

«W

5' ACCTCGGAAAGpTpCCCCTCT 3' GAGCCTTTC А GGGGAGA

1Е-кВ

Все типы ДНК-лигандов, как с 2'-йодацетамидными, так и с 2'-дисульфидсодержащими и фосфорилдисульфидными группировками, количественно реагируют с цистеинсодержащим пептидом глутатионом с образованием соответствующих олигонуклеотидопептидных конъюгатов. Установлено, что атака тиоловой группы остатка цистеина направлена на электрофильный атом серы ФДГ, связанный с метиленовой группой. Следовательно, для того, чтобы зафиксировать образование ковалентной связи между ДНК-лигандом III типа и гомодимером р50 субъединицы ОТ-кВ, необходимо использовать 3'-[Э2Р]-меченные дуплексы:

t/»

^ Л

-O-P-S-SFCHr

-ир 3*

9 . -о-р-з

Суа

S-CH,-

■ ир Г

з в ДСН-ПААГ

Су»

S-CH?

.«р 3"

В ходе аффинной модификации остатков цистеина (р50)2 ОТ-кВ ДНК-лигандами I и П-го типов мы использовали дуплексы, меченные 32Р по 5'-концу модифицированной цепи:

HS

-л

9 НН^в-8 I _6 0

(от-кв) /Су*

La Ч^Г & _6 0

(nm)

/'eye ii«

-а

YT& _6 °

Реакцию ковалентного связывания радиоактивно меченных ДНК-лигандов I, II и Ш-го типов с (р50)2 ОТ-кВ проводили в буфере с рН 7,5 в течение 30 мин при 2 5°С. Далее реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 8%-ном ПААГ, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН). Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции ОТ-кВ различными типами ДНК-лигандов.

ДНК-дуплекс (кВ-участок) Нуклеотидное звено, подвергнутое модификации Аминокислота, вовлеченная во взаимодействие, согласно данным РСА Выход ДНК-белкового конъюгата*, % (в зависимости от типа используемого ДНК-лиганда)

(D (И") (Пб) (IIb) (Пг) (Ш)

15N, 19N (Ig-кВ) А5 — 1 30 4 6 2 н/о

G6 Cys59 4 41 20 42 31 4

Т7 33 32 25 33 26 18

14N (Id-кВ) А5 — 4 29 4 8 6 н/о

Тб — 6 18 4 8 6 н/о

Т7 Cys59 26 27 7 23 12 н/о

Модифицированный ДНК-дуплекс без кВ-участка 2 19 2 5 3 4

'Указанные значения выходов конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10% «Н/о» - не определяли

Из табл. I видно, что аффинная модификация гомодимера р50 ДНК-лигандами I и 111-го типов, содержащими модификацию в 7ой положении кВ-участка, протекает с высокой эффективностью (выходы ДНК-белковых конъюгатов составляли 18-33%). При использовании дуплексов с 2'-йодацетамидной или фосфорилдисульфидной группировкой в других положениях кВ-участка или без него выходы ковалентно связанных комплексов с р50 субьединицей NF-кВ не превышали 6%.

Согласно полученным данным, гомодимер р50 эффективно взаимодействовал с любым из 2'-(2-пиридил)дисульфидсодержащих ДНК-лигандов (IIa) (табл. 1). Замена

остатка 2-тиопиридила в составе указанных дуплексов на остаток тиогликолевой кислоты (Пб), цистеина (Ив) или глутатиона (Пг) позволила повысить специфичность протекания реакции аффинной модификации. Однако максимальная эффективность ковалентного связывания (р50)2 в составе специфического комплекса с кВ-участком была достигнута при использовании ДНК-лигавдов Пв типа.

Для доказательства тиоэфирной (в случае ДНК-лигандов I типа) или дисульфидной (в случае ДНК-лигандов II и Ш-го типов) природы связи ДНК-белок в составе полученных конъюгатов была использована мутантаая форма р50 субъединицы, в которой остаток Cys59 заменен на аланин. Согласно построенным схемам распределения ДНК-белковых контактов в составе комплексов (р50)2«(И-кВ) и (p50)2*(Ig-KB), именно Cys59 является единственным остатком цистеина, входящим в состав ДНК-узнающего центра р50 (рис. 1).

Методом «торможения» в геле было показано, что гомодимер р50(С59А) образует специфические комплексы со всеми реакционноспособными ДНК-лигандами также эффективно, как и с немодифицированными дуплексами. Определенные методом Скэтчарда констаты диссоциации комплексов исходной и мутантной форм (р50)2 с немодифицированными ДНК-дуплексами 15N, 19N и 14N практически не отличались (табл. 2). Следовательно, замена остатка Cys59 на остаток Ala существенно не влияет на сродство р50 субъединицы NF-кВ к ДНК, и эту мутантную форму белка можно использовать в реакциях ковалентного связывания с ДНК-лигандами.

Таблица 2. Значения констант диссоциации комплексов гомодимера р50 субъединицы ОТ-кВ и его мутантной формы (С59А) с ДНК-дуплексами, содержащими кВ-участок.

ДНК-дуплекс (кВ-участок) К<1[(р50)2*ДНК], мкМ К<1[(р50(С59А))2»ДНК], мкМ

15N (Ig-кВ) 0,9 ±03

19N (Ig-кВ) 0,9 ±0,1 1,1 ± 0,1

I4N (Id-кВ) 0,3 ± 0,1 0,5 ±0,1

Аффинная модификация гомодимера р50(С59А) ДНК-лигандами 1-ГО типов не приводила к образованию ДНК-белковых конъюгатов. Следовательно, именно остаток Сув59 р50 субъединицы ОТ-кВ ответственен за образование ковалентной связи со всеми типами ДНК-лигандов.

Подводя итоги, отметим, что с помощью ДНК-лигандов III типа был выявлен контакт тиогруппы Сув59 белка с 3'-фосфатной группой 7го нуклеотида (^-кВ)-участка ДНК при комплексообразовании в растворе (табл. 1). Использование для аффинной модификации (р50)2 ОТ-кВ ДНК-лигандов I типа позволило «зафиксировать» сближенность остатка Суэ59 белка с углеводным фрагментом 7го нуклеотида как (1в-кВ)-, так и (М-кВ)-участка. Результаты ковалентного связывания гомодимера р50 субъединицы №-кВ ДНК-лигандами Нв типа продемонстрировали различное расположение остатка Сув59 р50 по отношению к 6°*" нуклеотиду (Ig-кB)- и (М-кВ)-участка. Установлена корреляция полученных результатов с данными РСА по распределению контактов единственного остатка цистеина (Суя59) ДНК-узнающего центра белка р50 с углеводофосфатным остовом обоих кВ-участков (рис. 1).

Таким образом, ДНК-лиганды, содержащие единичные 2'-йодацетамидные, 2'-(3-цистеинилтио)пропионамидные или межнуклеотидные фосфорилди сульфидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина белков, сближенных с углеводофосфатным остовом в составе специфического белково-нуклеинового комплекса.

3. Аффинная модификация остатков лизина гомодимера р50 1ЧР-кВ ДНК-лигандами типа IV

Из литературных данных известно, что добиться селективного связывания б-аминогрупп остатков лизина можно, используя для аффинной модификации белков НК-лиганды, содержащие в составе углеводного фрагмента альдегидные группы. Ранее в работах (Вге\по\ а/ а!., 1997; ТипШкауа а? а/., 1999) были описаны методы синтеза ди альдегид содержащих аналогов НК и их использование для зондирования остатков лизина в активном центре ДНК-метилтрансферазы Муа1 и РНК-полимеразы Т7.

В нашей лаборатории для аффинной модификации остатков лизина белков было предложено использовать ДНК-лиганды, содержащие единичные 2'-0-(2-оксоэтил)уридиновые (цитидиновые) звенья {2а!$ерт Ш а\, 2002). К их достоинствам следует отнести возможность введения в состав ДНК единичной 2'-альдегидсодержащей группировки, небольшой размер которой позволяет эффективно проводить реакцию ковалентного связывания с е-аминогруппами остатков лизина, максимально сближенными с углеводофосфатным остовом. Кроме того, используемая модификация углеводного фрагмента сохраняет его природную циклическую структуру и исключает возможность протекания реакции р-элиминирования в присутствии оснований.

Исходными соединениями для синтеза модифицированных цепей ДНК-лигандов IV типа служили олигодезоксирибонуклеотиды с единичными 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридиновыми (цитидиновыми) звеньями, любезно предоставленные науч. сотр. Химического факультета МГУ Зацепиным Т.С. 1,2-Диольную группировку исходных олигонуклеотидов окисляли периодатом натрия при комнатной температуре в ацетатном буфере (рН 4,5) и формировали ДНК-дуплексы (схема 1).

3' 5" 3' 51

3'

5" 3"

5' 3'

Схема 1,

Для выяснения особенностей комплексообразования и ковалентного связывания гомодимера р50 субъединицы ОТ-кВ с ДНК-лигандами IV типа использовали ДНК-дуплексы 19N и 14N с (Ig-кB)- и (М-кВ)-участком, соответственно (подчеркнуты). 2'-Альдегидсодержащие остатки уридина (и*) или цитидина (С*) вводили в указанные ниже положения одной из цепей кВ-участка:

и* с* и*

шип ш

19м 5' АССТСаЗАААВТССССТСТ 5' ТСЗСИЗААТТССССТС

3' САСССТТТСДевТСАСА 3' АСССТТМВввСАО

18-кВ И-кВ

Все полученные ДНК-лиганды IV типа связывались с гомодимером р50 субъединицы фактора транскрипции ОТ-кВ также эффективно, как и немодифицированные дуплексы 19N и 14N. Таким образом, введение единичной 2-0-2-оксоэтильной группировки в различные положения кВ-участка не препятствовало образованию специфических ДНК-белковых комплексов. Аффинную модификацию (р50)2 №-кВ 5'-[32Р]-меченными ДНК-лигандами IV типа проводили в условиях специфического связывания в течение 30 мин в буфере с рН 7,5 при 25°С. Образующееся в результате реакции основание Шиффа восстанавливали до вторичного амина 25 мМ раствором ЫаВН301 в течение 40 мин при 25°С (схема 1) и анализировали реакционные смеси методом электрофореза в 8%-ном ДСН-ПААГ. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты аффинной модификации исходной и мутантных форм гомодимера р50 субъединицы №-кВ ДНК-лигандами IV типа.

ДНК-дуплекс (кВ-учасгок) Нуклеотидное звено, подвергнутое модификации Аминокислота, вовлеченная во взаимодействие, согласно данным РСА Выход ДНК-белкового конъюгата*, %

(р50)2 Мутантные формы (р50)г

К144А К145А К241А К272А К275А

19И (1«-кВ) АЗ Ьуа272 25 23 20 21 13 11

А4 Ьу§144 22 24 24 19 19 24

А5 23 18 22 18 20 18

С6 — 7 9 10 8 11 8

Т7 — 9 6 7 5 8 10

С8 — 4 4 5 3 5 5

С9 — 4 4 4 3 3 5

^ (М-кВ) А5 Ьу$144 14 10 12 12 И 13

Т6 — 8 8 7 8 8 б

Т7 — 6 6 5 5 б 7

Модифицированный ДНК-дуплекс без кВ-участка 6 5 6 5 5 6

'Указанные значения выходов коньюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10%

Из табл. 3 видно, что ДНК-лиганды с 2'-<3-2-оксоэтильной группировкой в 3, 4 или 50М положениях (Ig-KB)-y4acrnca или в 5ой положении (И-кВ)-участка образовывали конъюгаты с (р50)2 NF-кВ с более высокой эффективностью, чем другие модифицированные кВ-содержащие дуплексы и дуплекс без кВ-участка.

Для проверки предположения об участии остатков Lys ДНК-связывающего центра белка в образовании ковалентных связей с данными 2'-альдегидсодержащими дуплексами, аффинной модификации ДНК-лигандами IV типа были подвергнуты мутантные формы (р50)2, в которых остатки Lysl44, Lysl45, Lys241, Lys272 и Lys275 были заменены на остаток аланина (рис. 1). Значения констант диссоциации комплексов мутантных белков и исходного (р50)2 с ДНК-дуплексами 19N или 14N лежат в пределах одного порядка (табл. 4).

Таблица 4. Значения констант диссоциации комплексов исходной и мутантных форм р50 субъединицы ОТ-кВ с ДНК-дуплексами 19N и 14^

ДНК-дуплекс (кВ-участок) К., [(р50)2.ДНК], мкМ

(р50)2 Мутантные формы (р50)2

К144А К145А К241А К272А К275А

19N (Ig-кВ) 0,9±03 1,1±0,3 1,0±0,1 1,5±03 1,2*0,1 0,6±0,3

14N (И-кВ) 0,3±0,1 0,7±0Д 0,3*0,1 0,8±0,2 0,5±0,2 0,9±0,3

Все мутантные формы гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-kB ковалентно связывались с 2'-альдегидсодержащими дуплексами практически с той же эффективностью, что и исходный белок. Исключение составляли белки с заменами К272А и К275А, для которых наблюдалось примерно двукратное падение эффективности образования ковалентно связанного комплекса с модифицированным по Зему положению дуплексом 19N (табл. 3). Подобные результаты, однако, не являются доказательством участия каждого из этих остатков лизина в образовании конъюгата с реакционноспособным олигонуклеотидом, входящим в состав этого дуплекса. Возможно, с 2'-0-2-оксоэтильной группой в 3е" положении 19N сближено несколько остатков лизина, в том числе и обсуждаемые выше. Не исключено также опосредованное влияние проведенных аминокислотных замен на взаимодействие с модифицированным звеном другого остатка лизина, действительно формирующего ковапентную связь с обсуждаемым ДНК-лигандом.

Для определения остатков Lys гомодимера р50 субъединицы NF-кВ, образующих ковалентные связи с ДНК-лигандами IV типа, модифицированными по 3, 4 или 5ому положениям (Ig-KB)-y4acTKa или по 50Му положению (И-кВ)-участка, было проведено протеолитическое расщепление соответствующих ДНК-белковых конъюгатов трипсином и последующий анализ m лученных олигонуклеотидопептидов мемдом масс-спектрометрии в варианте MALDI-TOF (табл. 5). Трипсинолиз каждого из конъюгатов р50 субъединицы с модифицированной цепью 0^-кВ)-содержащих ДНК-лигандов приводил к образованию двух олигонуклеотидопептидов с различной молекулярной массой.

Таблица 5. Анализ возможной структуры пептида в составе олигонуклеотидопеггтида, полученного в результате трипсинолиза конъюгата соответствующего ДНК-лиганда с р50 субъединицей ЫИ-кВ.

Модифицированный нуклесггид в составе кВ-участка Пептид в составе полученного в результате трипсинолиза олигонуклеотидопептида

Масса (экспер.)*, Да Масса (теорет.), Да Структура пептида

A3 (Ig-кВ) 1117; 947 1115,3; 945,1 273vqkddiqir291; 355eevqrkr361

A4 (Ig-кВ) 848; 557 850; 559,7 "ksypqvk89; 360krqk363

А5 (Ig-кВ) 849; 560 850; 559,7 "ksypqvk"; 3<0krqk343

А5 (Id-кВ) 558 559,7 360krqk363

* Значения представлены без указания ошибки метода измерения. В случае использования (1?-кВ)-содержащих ДНК-лигандов ошибка составляла (±7) кДа, а в случае (И-кВ)-содержащего - (±3) кДа.

Поскольку реакция присоединения 2'-альдегидсодержащих ДНК-дуплексов к белкам происходит селективно по остаткам лизина, на основании данных табл. S можно заключить, что в образовании ковалентных связей со всеми рассмотренными ДНК-лигандами принимает участие остаток Lys360 р50 субъединицы NF-кВ. Дуплексы, модифицированные по Зему или 4/5ому положениям (Ig-KB)-y4acnca, также взаимодействуют с остатками Lys275 или Lys77 белка. Выявленные остатки лизина входят как в состав С-концевых участков Rel-гомологичной области (Lys275, Lys360), так и в состав основной ДНК-узнающей петли L1 (Lys77) р50 субъединицы NF-kB.

Несоответствие полученных результатов (табл. 3, 5) данным РСА (рис. 1) показало, что ДНК-лиганды IV типа нецелесообразно использовать для зондирования остатков лизина белка, сближенных с углеводофосфатным остовом ДНК в специфических стационарных ДНК-белковых комплексах. Высокая реакционная способность 2-0-2-оксоэтильной группировки, введенной в состав ДНК-дуплекса, по-видимому, позволяет зафиксировать образование ковалентной связи с остатками лизина, сближенными с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания ДНК (Schulze et al, 1998).

4. Исследование возможности одновременного участия С-концевой (метилирующей) и N-концевой (регуляторной) областей M.SsoII во взаимодействии с ДНК методом аффинной модификации

M.SsoII представляет собой бифункциональный белок, выступая с одной стороны как С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза (Никольская и др., 1983), а с другой - как фактор транскрипции, связывающийся с «регуляторным» участком, локализованным в промоторной области генов системы рестрикции-модификации SsoII (Karyagina ai al, 1998). Такая двоякая роль M.SsoII в клетке обусловлена наличием в составе этого белка двух различных ДНК-связывающих центров. Один из них располагается в составе С-концевой области белка (72-379 а.о.), включающей в себя все 10 консервативных

мотивов 1-Х, характерных для семейства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз (рис. 2). Способность М-виШ выступать в роли фактора транскрипции определяется наличием в ее составе другого ДНК-связывающего центра - протяженной №концевой области (1-71 а.о.), предшествующей первому консервативному мотиву. Именно она определяет взаимодействие \i.SsoII с «регуляторным» участком ДНК. Следует отметить, что такая №концевая область обнаружена в составе лишь нескольких С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз (в частности, в М.ЕсоМ! и \lMspI).

К-концеввя область (1-71 а.а)

С-колдамя область (72-379 а.а)

Г

Суя142

Мотив

«спнряль-поворат-спнраль», ответственный и евюьвшше «регуляторного» участка

связывание участка метилирования

Рис. 2. Структурная организация ДНК-метилтрансферазы М.вэтП. Ы-концевая область белка (1-71 а.о.) предположительно содержит мотив «спираль-поворот-спираль», ответственный за связывание с «регуляторным» участком промоторной области генов системы рестрикции-модификации 8«>П. С-концевая область белка (72-379 а.о.) содержит мотивы 1-Х, консервативные для всех С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.

Нас заинтересовал вопрос, как связаны между собой две ДНК-узнающие функции М^оП, и может ли белок одновременно взаимодействовать с двумя различными участками узнавания - участком метилирования и «регуляторным» участком в ДНК? Карягиной и соавт. (Кагуа&па си а!., 2003) было проведено компьютерное моделирование и построена гипотетическая модель ДНК-белкового комплекса, демонстрирующая такую возможность. При отсутствии данных РСА метод аффинной модификации белка реакционноспособными ДНК-лигандами позволил нам проверить способность \l.SsoII формировать комплекс, в состав которого входит как участок метилирования, так и «регуляторный» участок, а также выявить некоторые особенности, сопровождающие образование такого комплекса.

Известно, что в процессе метилирования ДНК участвует единственный в М^воИ остаток цисте ина - Сув142, входящий в состав каталитического мотива IV С-концевой области белка (рис. 3). Поэтому для ковалентного присоединения М-ввоП к участку метилирования, были использованы ДНК-лиганды с фосфорилдисульфидными группами (21 N-111). Для получения конъюгатов между М.БбоН и «регуляторным» участком ДНК мы применили ДНК-лиганды с 2'-0-2-оксозтильными группировками (ЗШ-1У). Выбор такого способа модификации базировался на данных компьютерного моделирования (Karyagina а! а!., 2003), согласно которым, некоторые остатки лизина >4-концевой области белка могут участвовать в образовании контактов с «регуляторным» участком узнавания.

ФДГ и 2'-0-(2-оксоэтил)уридиновые звенья вводили в определенные положения ДНК-лигандов:

1 <«><+0 ю в

Iii Ii

2JN5' ACGTTCCpTGGCTApTpTGACTGC зцу 5' ATCAAAACAGGÄCAAXTTQTXXITAAAACCAA 3' CTGCAABG AtTCGAT A ACTGACGT 3' TAGTTTTGTCCTGTTTAACftQBATTTTGGTT

участок ' t J «регуляшрный» t

метилироаани* {+4) 19 участок (-1)

(С* - метилируемый остаток цнтадина)

Реакцию аффинной модификации M.SsoII немеченными ДНК-лигандами III типа проводили в присутствии 0,1 мМ AdoHcy (нереакционноспособного аналога кофактора AdoMet) при 37°С в течение 1 ч. Взаимодействие M.SsoII с немеченными ДНК-лигандами IV типа осуществлялось в условиях специфического связывания белка с «регуляторным» участком (12,5 нг/мкл poly(dI»dC), 37°С, 30 мин). Соотношение концентраций ДНК:белок во всех реакционных смесях составляло 1:2. Продукты реакции анализировали в 12%-ном ДСН-ПААГ. Для определения положения белковых зон гель прокрашивали Кумасси R-250. Для контроля аффинной модификации ДНК-лигандами III и IV типов были подвергнуты также мутантная форма M.SsoII(C142A) и ее делеционные производные, содержащие аминокислотные последовательности только N- (1-71 а.о.) или С- (72-379 а.о.) концевых областей белка (табл. 6).

Таблица 6. Результаты аффинной модификации М SsoII, М SsoII(C142A) и делеционных форм M.SsoII, содержащих аминокислотные последовательности только N- или С-концевых областей, ДНК-лигандами Ш и ГУ типов.

ДНК-лиганд Положение модификации Выход ДНК-белкового конъюгата*, %

M.SsoII M.SsoII (С142А) Делеционная форма M.SsoII (1-71 а.о.) Делеционная форма M.SsoII (72-379 а.о.)

211Ч-1П (участок метилирования) X 2 85 0 0 60

(+3) 20 0 0 15

(+4) 10 0 0 8

Неспецифический дуплекс III типа 10 0 0 8

31N-IV («регуляторный» участок) (-1) 25 24 18 0

10 35 30 26 0

12 20 18 14 0

Y 15 85 86 65 0

(+4) 40 42 30 0

Неспецифический дуплекс IV типа 10 12 7 0

•Указанные значения выходов конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов Ошибка измерений не превышала 10%

Оказалось, что, что наибольший выход ДНК-белкового конъюгата наблюдается при использовании ДНК-лиганда, ФДГ в котором расположена рядом с метилируемым остатком цитидина (ДНК-лиганд X), те. по-видимому, пространственно сближена с остатком Суз 142 М.БвоИ в составе ДНК-белкового комплекса (табл. 6). С помощью

делеционных форм белка было показано, что остатки лизина К-концевой области М-ввоП участвуют в образовании ковалентной связи с «регуляторным» участком промоторной области генов системы рестрикции-модификации ЗвоП, содержащим 2'-О-2-оксоэтильные группу. Для аффинной модификации этого ДНК-узнающего центра белка наиболее эффективным оказалось использование дуплекса, содержащего модификацию в 15011 положении «регуляторного» участка (ДНК-лиганд У).

Полученные результаты по аффинной модификации М.8ю11 последовательно двумя типами ДНК-лигандов (3'-[32Р]-меченным X и немеченым У) подтвердили возможность ковалентного присоединения белка сразу к двум различным участкам узнавания ДНК. Если сначала С-концевая область М.ввоП формирует конъюгат с метилируемой последовательностью ДНК-лиганда X, то затем И-концевая область фермента также может ковалентно связаться с «регуляторным» участком ДНК-лиганда У (рис. 3, дорожка 5).

1 2 3 4 5

56 кД*-. 82 кД*-

- Р'-Р»Р1-Х)«М.8«оП.У

- М.Б»оЮТ

- (3'-[5гР]-Х)«М.81о11 -

- МвиП

Рис. 3. Анализ в 12%-ном ДСН-ПААГ продуктов реакции ковалентного связывания МБвоП с ДНК-лигандом У (4), с 3'-[32Р]-меченным ДНК-лигандом X (в присутствии (3) и в отсутствие (2) ЫаВНзСК) и последовательно с двумя ДНК-лигандами (5 - сначала с X, затем с У, б -сначала с У, затем с X). а - Результат прокрашивания геля раствором Кумасси 1*250 б - Радиоавтограф геля. 1 - исходный белок М^оП.

Следует отметить, что необратимое ковалентное связывание М-концевой области М.вюП модифицированным дуплексом с «регуляторнымо» участком, напротив, препятствует взаимодействию Суз142 каталитического центра с ФДГ участка метилирования. В этом случае образования конъюгата Х*белок*У не наблюдалось (рис. 3, дорожка 6). Такая, впервые обнаруженная нами, взаимосвязь между двумя различными ДНК-связывающими центрами М^оП, вероятно, играет важную роль в регулировании активности белка в клетке.

выводы

1. Сконструированы ДНК-лиганды для аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции ОТ-кВ и С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы вмН - синтетические дуплексы, содержащие единичную межнуклеотидную фосфорилдисульфидную, 2'-йодацетамидную или 2'-0-2-оксоэтильную группировку в заданном положении углеводофосфатного остова ДНК. Впервые разработаны методы получения и изучены свойства 2'-дисульфидсодержащих ДНК-лигандов, реакционная способность которых варьировалась путем замены остатка 2-тиопиридила в составе единичных 2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]уридиновых звеньев на остаток тиогликолевой кислоты, цистеина или глутатиона.

2. На основании имеющихся рентгеноструктурных данных с привлечением методов компьютерного моделирования проанализированы контакты в различных комплексах фактора транскрипции ОТ-кВ с ДНК. Построены схемы ДНК-белковых взаимодействий гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции ОТ-кВ с кВ-участком различной нуклеотидной последовательности: М-кВ (5'-(КХ}ААТТССС-3') и ^-кВ (5'-(ХЮАСТТТСС-З'). Полученная информация использована для выбора места введения реакционноспособных группировок в состав углеводофосфатного остова участка узнавания ДНК и интерпретации результатов аффинной модификации гомодимера р50 №-кВ различными ДНК-лигандами.

3. Установлено, что ДНК-лиганды, содержащие единичные 2'-йодацетамидные, 2'-(З-цистеинилтио)пропионамидные или межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка. Результаты аффинной модификации гомодимера р50 ОТ-кВ тремя типами модифицированных дуплексов свидетельствуют о сближенности остатка Суэ59 белка с 7м" нуклеотидом (1ё-кВ>- и (^-кВ)-участка и демонстрируют его различную локализацию по отношению к 6га1у нуклеотиду этих участков узнавания в составе специфических ДНК-белковых комплексов.

4. С помощью ДНК-лигандов, содержащих единичные 2'-0-2-оксоэтильные группировки в составе кВ-участка, выявлены остатки лизина р50 субъединицы ОТ-кВ, предположительно сближенные с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания ДНК-дуплекса гомодимером р50.

5. Методом аффинной модификации ДНК-метилтрансферазы ЗэоП ДНК-лигандами, содержащими фосфорилдисульфидную или 2'-0-2-оксоэтильную группировку, продемонстрирована возможность одновременного взаимодействия белка с метилируемой и «регуляторной» последовательностями ДНК. Установлено, что необратимое связывание Ы-концевой («регуляторной») области метилтрансферазы БздП препятствует взаимодействию Суэ142 каталитического центра фермента с фосфорилдисульфидной группировкой в составе участка метилирования.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Романенков A.C.. Борисова O.A., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С., Метелев В.Г. Синтез и свойства олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих фосфориддисульфидную группировку в заданном положении углеводофосфатного остова. // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. № 3. С. 208-213.

2. Воробьева О.В., Романенков A.C.. Метелев В.Г, Карягина A.C., Лаврова Н.В., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Ковалентное связывание Cysl42 метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими фосфориддисульфидную межнуклеотидную группу. // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. № 5. С. 534-543.

3. Борисова O.A., Романенков A.C.. Метелев В.Г., Кубарева Е.А., Зубин Е.М., Тимченко М.А., Орецкая Т.С. ДНК-дуплексы, содержащие 2'-дезокси-2'-йодацетамидоуридин, как реагенты для аффинной модификации белков. // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. № 3. С. 534-543.

4. Metelev V.G., Kubareva Е.А., Vorob'eva O.V., Romanenkov A.S.. Oretskaya T.S. Specific conjugation of DNA binding proteins to DNA templates through thiol-disulfide exchange. // FEBS Letters. 2003. V. 538. № 1-3. P. 48-52.

5. Романенков A.C.. Устюгов A.A., Зацепин Т.С., Никулова A.A., Колесников И.В., Метелев В.Г., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. // Биохимия. 2005. Т. 70. № 11. С. 1474-1487.

6. Романенков A.C.. Борисова O.A. Синтез и свойства олигонуклеотидов с йодацетамидной группировкой или монофосфорилдисульфидной связью. // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002». 9.04-12.04. 2002. Москва, Россия.

7. Romanenkov A.S.. Metelev V.G. Synthesis and properties of oligodeoxyribonucleotides with phosphoryldithio group as sugarphosphate junction. // International Quality Network Meeting «Nucleic Acids and Nucleo-Protein-complexes». 7.04.11.04.2003. Giessen, Germany.

8. Romanenkov A.S.. Zubin E.M., Metelev V.G., Kubareva E.A., Oretskaya T.S.. DNA duplexes containing 2'-deoxy-2'-iodacetamidouridine as reagents for affinity modification of proteins. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. 25.09.-27.09.2003. Kyiv, Ukraine.

9. Романенков A.C.. Устюгов A.A., Тимченко М.А., Зацепин Т.С. Анализ белково-нуклеиновых контактов в трехмерных структурах комплексов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. // 8-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 17.05.-21.05. 2004. Пущино, Россия.

7JW

Подписано в печать 19 января 2006 г. Заказ 523. Формат 60 х 90/16. Тираж 130 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ nf-кВ с участками узнавания в днк (литературный обзор).

1.1. Функционирование и роль NF-кВ в клетке.

1.2. Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом рентгеноструктурного анализа.

1.3. Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК в растворе.

1.3.1. Использование метода химической модификации для зондирования контактов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК.

1.3.1.1. Химическая модификация ДНК.

1.3.1.2. Химическая модификация аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-кВ.

1.3.2. Использование мутантных форм белка для определения аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-kB, принимающих участие в связывании ДНК и димеризации.

1.3.3. Использование метода аффинной модификации белка реакционноспособными аналогами ДНК для зондирования контактов фактора транскрипции NF-кВ с кВ-участком.

2. ДНК-ДУПЛЕКСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ГРУППИРОВКИ В УГЛЕВОДОФОСФАТНОМ ОСТОВЕ,

КАК РЕАГЕНТЫ ДЛЯ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ

ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА И ЛИЗИНА БЕЛКОВ (обсуждение результатов).

2.1. Анализ бслково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК.

2.2. Аффинная модификация остатков цистеина белков ДНК-дуплексами, содержащими реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове.

2.2.1. Использование ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2'-дезокси-2'~ йодацетамидоуридиновые звенья, для аффинной модификации белков.

2.2.1.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичной 2-йодацетамидной группировкой.

2.2.1.2. Комплексообразование и ковалентное связывание 2'-йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.2.2. Использование ДНК-дуплексов с единичными 2 -дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями для аффинной модификации белков.

2.2.2.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичными 2'-дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями.

2.2.2.2. Ковалентное связывание ДНК-дуплексов с единичными 2'-дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.2.3. Использование ДНК-дуплексов, содержащих межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки, для аффинной модификации белков.

2.2.3.1. Синтез и свойства фосфорилдисульфидсодержащих олигонуклеотидов.

2.2.3.2. Комплексообразование и ковалентное связывание фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.2.3.3. Ковалентное связывание фосфорилдисульфидсодержащих

ДНК-дуплексов с ДНК-метилтрансферазой SsoII.

2.3. Аффинная модификация остатков лизина белков ДНК-дуплексами, содержащими реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове.

2.3.1. Использование ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2,-0-(2-оксоэтил)уридиновые (цитидиновые) звенья, для аффинной модификации белков.

2.3.1.1. Комплексообразование и ковалентное связывание 2'-альдегид-содержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.3.1.2. Ковалентное связывание 2'-альдегидсодержащих ДНК-лигандов с ДНК-метилтрансферазой SsoII. Исследование возможности одновременного участия С-концевой (метилирующей) и N-концевой («регуляторной») областей M.SsoII во взаимодействии с ДНК.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

Нуклеиново-белковые взаимодействия являются определяющими для основных процессов, протекающих в клетке - репликации, транскрипции и трансляции ДНК, а также при процессинге РНК. Структуру НК-белковых комплексов изучают как с помощью инструментальных методов, например, рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), так и молекулярио-биологических подходов: направленной замены определенных аминокислотных остатков белка и ковалентного связывания белков с НК. Безусловно, наиболее достоверная информация о структуре НК-белкового комплекса может быть получена методом РСА, однако выделение и кристаллизация соответствующего комплекса возможны далеко не всегда. Кроме того, РСА часто не позволяет выявить конформационные перестройки белков при их взаимодействии с НК и влияние нуклеотидной последовательности участков НК, фланкирующих участок связывания белка. ЯМР-спектроскопия, один из методов изучения динамики белково-нуклеиновых комплексов в растворе, не всегда может быть использована для изучения сложных мультисубъединичных комплексов, а также в том случае, когда в процессе взаимодействия происходит значительное изменение структуры биополимеров. Направленная замена определенных аминокислотных остатков белков является мощным и активно используемым методом анализа НК-белковых взаимодействий, однако он весьма трудоемок и в ряде случаев дает некорректную информацию из-за изменения структуры биополимеров, вызванной заменой функциональных остатков аминокислот.

В ряду молекулярио-биологических подходов важное место занимает метод ковалентного связывания белка с НК. Существует ряд задач, для решения которых этот метод на сегодняшний день представляется оптимальным. Прежде всего, он позволяет идентифицировать отдельные аминокислоты белка, взаимодействующие с заданным фрагментом НК в НК-белковом комплексе [1-5]. При изучении мультибелковых комплексов, образующихся при репликации, трансляции и т.п., возможно определение белкового компонента, взаимодействующего с определенным участком НК [6]. Этот подход может использоваться для поиска в клеточных экстрактах белков, селективно взаимодействующих с определенной нуклеотидной последовательностью, а также в технологии SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) для создания олигонуклеотидов специфической первичной структуры (НК-аптамеров), необратимо связывающихся с белком [7, 8]. В последние годы достигнуты определенные успехи в кристаллизации ковалентно связанных НК-белковых комплексов и изучении их структур методом РСА [9]. Авторы подчеркивают, что ковалентное взаимодействие ферментов нуклеинового обмена с НК является уникальной возможностью получения комплексов в определенном структурном состоянии и предлагают использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА.

В настоящее время наиболее широко используется фотоаффинная модификация белков, в основе которой лежит ковалентное связывание немодифицированных или модифицированных нуклеиновых кислот с белками под действием УФ-излучения [10-13]. Однако, из-за неспецифичности взаимодействия, происходящего при облучении УФ-светом, данный метод вряд ли можно признать универсальным. Кроме того, для него также характерны низкие выходы НК-белковых конъюгатов и деструкция биополимеров.

Химические методы присоединения белков к НК основаны на использовании неспецифических агентов, например, формальдегида [14-16], а также на селективном введении в состав белка или НК реакционноспособных группировок. В последнем случае основное внимание уделяется использованию модифицированных НК для зондирования белково-нуклеиновых контактов, т.е. определения аминокислот, сближенных с нуклеиновой кислотой в участке специфического связывания [17]. Возможность вводить активную группировку в любое заранее выбранное положение олигонуклеотидной цепи позволяет зондировать точечные контакты между различными участками биомолекул. Оптимальные для ковалентного связывания НК-реагенты должны обладать рядом характерных свойств:

1) селективно взаимодействовать со сближенными в пространстве функциональными группами аминокислот белка;

2) образовывать устойчивый конъюгат с белком без дополнительной активации извне при физиологических значениях рН (6,0-8,0);

3) сохранять стабильность в нейтральных водных растворах в течение длительного времени без потери реакционной способности.

Химически активные группы могут быть введены в любое положение НК -гетероциклическое основание и различные участки углеводофосфатного остова. Однако следует отметить, что наиболее часто используемая модификация гетероциклических оснований может нарушать как комплементационные взаимодействия в НК, так и специфические взаимодействия в белково-нуклеиновом комплексе. В тоже время, введение химически активных групп по концевым фосфатным группам не несет полезной информации о структуре НК-связывающего центра белка, так как аффинной модификации чаще всего подвергаются его нефункциональные участки.

Известно, что контакты между белком и углеводофосфатным остовом НК составляют более половины всех взаимодействий в белково-нуклеиновом комплексе и вносят существенный вклад в его устойчивость и структурную организацию. В связи с этим для изучения особенностей функционирования ДНК-узпающих белков и ферментов необходимо создание ДНК-лигандов с модифицированными межнуклеотидными фосфатными группами и углеводными остатками. Наиболее перспективным представляется введение в состав синтетических олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов различных реакциопноспособных группировок, способных селективно взаимодействовать с остатками лизина, аргинина или цистеина, реализующими большую часть контактов белка с углеводофосфатным остовом ДНК [18]. Подобные ДНК-реагенты представлены пока малочисленным классом соединений, к числу которых можно отнести дуплексы с межнуклеотидными замещенными пирофосфатными и ацилфосфатными группировками [19-25], а также диальдегидсодержащие аналоги НК [26, 27].

В настоящей работе было проведено всестороннее исследование возможности использования для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2'-йодацетамидные, 2-дисульфидсодержащие, 2'-0-2-оксоэтильные и межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки. Важной • особенностью предложенных ДНК-лигандов является то, что модифицированные уридиновые или цитидиновые звенья могут быть введены в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи. Реакционноспособные группировки в составе 2'-йодацетамид-, 2'-дисульфид- и фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов способны селективно взаимодействовать с тиогруппами пространственно сближенных остатков цистеина белков, а 2'-0-2-оксоэтильная группировка ДНК-лиганда - подвергаться нуклеофильной атаке со стороны е-аминогрупп остатков лизина.

В процессе работы предложенные ДНК-лиганды применяли для аффинной модификации двух ДНК-узнающих белков: гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека и прокариотической ДНК-метилтрансферазы SsoII (M.SsoII), входящей в систему рестрикции-модификации Shigella sonnei 47. Следует отметить, что для фактора транскрипции NF-кВ в литературе имеются данные рентгеноструктурного анализа его комплексов с различными последовательностями участка узнавания ДНК. Сравнение данных РСА с результатами аффинной модификации позволяет оценить целесообразность использования тех или иных типов ДНК-лигандов для изучения структурно-функциональных аспектов взаимодействия различных белков, в частности M.SsoII, с углеводофосфатным остовом участка узнавания в ДНК. Для M.SsoII отсутствуют данные

РСА ее комплексов с ДНК, однако, известно, что в составе этого белка присутствуют два различных ДНК-связывающих центра, обуславливающие способность M.SsoII выступать, с одной стороны, как С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза, а с другой - как фактор транскрипции, связывающийся с «регуляторным» участком, локализованным в промоторной области генов системы рестрикции-модификации SsoII. При отсутствии данных РСА метод аффинной модификации белка предложенными реакционноспособными ДНК-лигандами позволял нам проверить способность M.SsoII формировать комплекс, в состав которого входит как участок метилирования, так и «регуляторный» участок, а также выявить некоторые особенности, сопровождающие образование такого комплекса.

Работа содержит литературный обзор, посвященный особенностям взаимодействия фактора транскрипции NF-кВ с участками узнавания ДНК, изученным с помощью различных методов.

выводы

Сконструированы ДНК-лиганды для аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ и С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII — синтетические дуплексы, содержащие единичную межнуклеотидную фосфорилдисульфидную, 2'-йодацетамидную или 2'-С>-2-оксоэтильную группировку в заданном положении углеводофосфатного остова ДНК. Впервые разработаны методы получения и изучены свойства 2'-дисульфидсодержащих ДНК-лигандов, реакционная способность которых варьировалась путем замены остатка 2-тиопиридила в составе единичных 2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]уридиновых звеньев на остаток тиогликолевой кислоты, цистеина или глутатиона.

На основании имеющихся рентгеноструктурных данных с привлечением методов компьютерного моделирования проанализированы контакты в различных комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. Построены схемы ДНК-белковых взаимодействий гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ с кВ-участком различной нуклеотидной последовательности: Id-кВ (5'-GGGAATTCCC-3') и Ig-кВ (5'-GGGACTTTCC-3')- Полученная информация использована для выбора места введения реакционноспособных группировок в состав углеводофосфатного остова участка узнавания ДНК и интерпретации результатов аффинной модификации гомодимера р50 NF-кВ различными ДНК-лигандами.

Установлено, что ДНК-лиганды, содерл<ащие единичные 2'-йодацетамидные, 2'-(З-цистеинилтио)пропионамидные или межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка. Результаты аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы NF-кВ тремя типами модифицированных дуплексов свидетельствуют о сближенности остатка Cys59 белка с 7Ь|М нуклеотидом (Id-кВ)- и (Ig-кВ)-участка и демонстрируют его различную локализацию по отношению к 60му нуклеотиду этих участков узнавания в составе специфических ДНК-белковых комплексов.

С помощью ДНК-лигандов, содержащих единичные 2'-0-2-оксоэтильиые группировки в составе кВ-участка, выявлены остатки лизина р50 субъединицы NF-kB, предпололсительно сближенные с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания ДНК-дуплекса гомодимером р50.

Методом аффинной модификации ДНК-метилтрансферазы SsoII ДНК-лигандами, содержащими фосфорилдисульфидную или 2'-0-2-оксоэтильную группировку, продемонстрирована возможность одновременного взаимодействия белка с метилируемой и «регуляторной» последовательностями ДНК. Установлено, что необратимое связывание N-концевой («регуляторной») области метилтрансферазы SsoII препятствует взаимодействию Cysl42 каталитического центра фермента с фосфорилдисульфидной группировкой в составе участка метилирования.

1. Шефлян Г.Я., Кубарева Е.А., Громова Е.С. Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам. // Успехи Химии. 1996. Т. 65. С. 765-781.

2. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции. // Успехи Химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.

3. Knorre D.G., Godovikova T.S. Photoaffinity labeling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes. // FEBS Lett. 1998. V. 433. P. 9-14.

4. Кнорре Д.Г., Годовикова T.C. Химические подходы к исследованию нуклеопротеидных структур. // Изв. РАН. Сер.хим. 1999. С. 1225-1231.

5. Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д. Химические подходы к изучению надмолекулярных биологических структур на примере хроматина. // Успехи химии. 1999. Т. 68. С. 365-375.

6. Kassabov S.R., Henry N.M., Zofall М., Tsukiyama Т., Bartholomew В. High-resolution mapping of changes in histone-DNA contacts of nucleosomes remodeled by ISW2. // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 7524-7534.

7. Golden M.C., Collins B.D., Willis M.C., Koch Т.Н. Diagnostic potential of PhotoSELEX-evolved ssDNA aptamers. II J. Biotechnol. 2000. V. 81. P. 167-178.

8. Smith D., Collins B.D., Heil J., Koch Т.Н. Sensitivity and specificity of photoaptamer probes. // Mol. Cell. Proteomics. 2003. V. 2. P. 11-18.

9. Verdine G.L., Norman D.P. Covalent trapping of protein-DNA complexes. // Annu.Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 337-366.

10. Rehrauer W.M., Kowalczykowski S.C. The DNA binding site(s) of the Escherichia coli RecA protein. II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 11996-12002.

11. Naryshkin N., Kim Y., Dong Q., Ebright R.H. Site-specific protein-DNA photocrosslinking. Analysis of bacterial transcription initiation complexes. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 148. P. 337-361.

12. Persinger J., Bartholomew B. Site-directed DNA photoaffinity labeling of RNA polymerase III transcription complexes. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 148. P. 363-381.

13. Robert F., Coulombe B. Use of site-specific protein-DNA photocrosslinking to analyze the molecular organization of the RNA polymerase II initiation complex. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 148. P. 383-393.

14. Gohring F., Fackelmayer F.O. The scaffold/matrix attachment region binding protein hnRNP-U (SAF-A) is directly bound to chromosomal DNA in vivo: a chemical cross-linking study. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 8276-8283.

15. Kuo M.-H., Allis C.D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. // Methods. 1999. V. 19. P. 425-433.

16. Orlando V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. // Trends Biol. Sci. 2000. V. 25. P. 99-104.

17. Luscombe N.M., Laskowski R.A., Thornton J.M. Amino acid-base interactions: a three-dimensional analysis of protein-DNA interactions at atomic level. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2860-2874.

18. Kozlov I.A., Kubareva E.A., Ivanovskaya M.G., Shabarova Z.A. Design of new reagents on the base of DNA duplexes for irreversible inhibition of transcription factor NF-kB. // Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 279-289.

19. Sheflyan G.Ya., Kubareva Е.А., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S., Shabarova Z.A. Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. // FEBSLett. 1996. V. 390. P. 307-310.

20. Козлов И.А., Кубарева E.A., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Определение положения контактов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом региоселективного ковалентного связывания. // Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 63-73.25