Диальдегидросодержащие ДНК-дуплексы как реагенты для аффинной модификации ДНК- метилтрансфераз MvaI и EcoRH и эндонуклеазы рестрикции EcoRH тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ГРИЦЕНКО ОКСАНА МИХАЙЛОВНА

ДИАЛЬДЕГИДСОДЕРЖАЩИЕ ДНК-ДУПЛЕКСЫ КАК РЕАГЕНТЫ ДЛЯ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ МЫ II ЕсоШ1 И ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ЕсоКП

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

V Й од

На правах рукописи УДК 547.963.32 577.113.4

•ч

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Е. С. Громова

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Г. В. Гурский

кандидат химических наук-H. Н. Вейко

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М. И. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 28 ноября 2000 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 26 октября 2000 г.

Ученый секретарь диссертащюнноцщм&та кандидат химических наук £ .</

Е W.SàtâUfO

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ферменты рестрикции-модификации (РМ) типа П с высокой специфичностью расщепляют (эндонуклеазы рестрикции) или метилируют (ДНК-метилтрансферазы) определенные короткие последовательности ДНК. Они выполняют функцию защиты прокариотической клетки от проникновения чужеродной ДНК. Со времени своего открытия ферменты РМ служат важнейшим объектом для изучения природы ДНК-белковых взаимодействий, прежде всего, ввиду своей уникальной специфичности. Особое значение имеет исследование прокариотических метилаз в качестве модельной системы для выяснения природы биологического метилирования ДНК, которое играет первостепенную роль в процессах транскрипции генов, канцерогенеза и др.

Объектами исследований в настоящей работе являются метилазы ¿TcoRK (С5-метилаза) и Mval (М-метилаза), а также эндонуклеаза рестрикции £coRH, которые узнают в ДНК одну и ту же пятизвенную последовательность Метилазы £coRH

3'... GGACCT...5'

(M.i'coRII) и Mval (M.,UvaI) катализируют перенос метильной группы от кофактора S-аденозил-Ь-метионина на атомы углерода С5 (M.fcoRII) или на атомы азота N4 (M.A/val) внутренних остатков цитозина в этой последовательности. Эндонуклеаза рестрикции £coRII (R.&oRII) в присутствии ионов магния гидролизует фосфодиэфирные связи участка узнавания в положениях, указанных стрелками. Специфическое узнавание ДНК ферментами РМ включает образование контактов между аминокислотными остатками белков и гетероциклическими основаниями и фосфатными группами ДНК. Для метилаз ЕсоКП. и Mval неизвестно, какие участки белков ответственны за специфическое узнавание ДНК. Для R.£coRII сделана попытка определить участки связывания ДНК путем экстраполяции данных по связыванию с ДНК всех составляющих эндонуклеазу EcoRIl пептидов на полноразмерный белок (М.Рейтер и др. 1999). В отсутствие рентгеноструктурного анализа (РСА) этих ферментов существует сравнительно небольшое число методов, позволяющих определять участки в белках, взаимодействующие с ДНК. Эффективным методом является аффинная модификация ферментов модифицированными ДНК-дуплексами с последующим определением участков белков, образующих контакты с ДНК. Чаще всего для аффинной модификации ферментов используются ДНК-дуплексы, содержащие фотоактивируемые аналоги гетероциклических оснований. Перспективной является разработка методов аффинной модификации ферментов аналогами ДНК, содержащими активную группу в углеводофосфатном остове.

Диальдегидные производные нуклеозидов и нуклеотцдов, а также тРНК, содержащие периодат-окисленные нуклеотидные остатки на 3'-конце, широко используются для аффинной модификации ферментов, кофакторами или субстратами которых являются нуклеозндтрифосфаты, и для тРНК-синтетаз соответственно. Однако для ДНК-связывающих белков такой метод не разработан.

Цель и задачи исследования. Целью работы является разработка нового метода аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз и эндонуклеаз рестрикции на основе диальдегкдсодержащих аналогов субстратов.

В работе решались следующие задачи: (1) конструирование и характеристика ДНК-дуплексов - аналогов субстратов ферментов РМ £coRII и метилазы Mval с направленно введенными альдегидными группами; (2) исследование субстратных свойств диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов и их способности специфически связываться с изучаемыми ферментами; (3) разработка реакции ковалентного присоединения диальдегидсодержащих аналогов субстратов к метилазам £coRII и Mval и эндонуклеазе £coRII; (4) зондирование участков метилаз £coRII и Mval, взаимодействующих с ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получены новые реагенты для аффинной модификации метилаз £coRII и Mval и эндонуклеазы рестрикции £coRII, содержащие реакционноспособную диальдегидную группу. Для введения диальдегидной группы в заданные положения ДНК-субстрата заменяли пиримидиновые нуклеозидные остатки на остатки 2'-0-р-0-рибофуранозилцитидина (Crib') или l-((3-D-галактопиранозил)тимина (Tgal'), содержащие i/ис-диольную группу, с последующим окислением. Оптимизированы условия окисления олигонуклеотидов, содержащих остатки галактопиранозилнуклеозидов и дисахаридных нуклеозидов.

Эффективность метилирования и расщепления аналогов субстратов зависит от природы модифицированного остатка, содержащего диальдегидную группу, локализации этого остатка в ДНК-дуплексе и природы фермента. ДНК-дуплексы, содержащие окисленный остаток 2'-0-р-0-рибофуранозилцитидина (Crib), метилируются метилазами £coRII и Mval лучше ДНК-дуплексов, содержащих окисленный остаток 1-(J3-D-галактопиранозил)тимина (Tgal), причем предпочтительной является локализация диальдегидной группы во фланкирующих нуклеотидных последовательностях по сравнению с участком узнавания. Эндонуклеаза £coRII намного более чувствительна к введению диальдегидной группы в ДНК-дуплексы по сравнению с метилазами. Практически все диальдегидсодержащие дуплексы связываются с изучаемыми ферментами независимо от их способности метилироваться или расщепляться. Исключениями являются несколько Tgal-содержащих ДНК-дуплексов, которые не связываются с R.EcoRII.

Подобраны условия ковалентного присоединения диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов к метилазам £coRII и Mval: соотношение ферментов и ДНК; концентрация восстановителя и время восстановления, необходимые для получения стабильного ковалентного комплекса. Показано, что Crib-содержащие ДНК-дуплексы стабильны в условиях ковалентного присоединения, а в случае ДНК-дуплексов, содержащих окисленный остаток галактозы, наряду с ковалентным присоединением к ферментам может происходить реакция расщепления модифицированной олигонуклеотидной цепи. Получен набор конъюгатов метилаз ЕсоКП и Mval с диальдегидсодержашими аналогами субстратов, и определены ковапентно связанные участки этих ферментов. Это позволило выявить остатки лизина, сближенные с углеводофосфатным остовом ДНК. Полученные данные являются первым экспериментальным зондированием ДНК-связывающих участков И4-метилаз (на примере Mval) и С5-метилазы £coRII.

Полученные результаты позволяют рекомендовать диальдегидсодержащие реагенты для изучения взаимодействия различных ДНК-связывающих белков с углеводофосфатным остовом ДНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано б статей. Литературный обзор "Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислоты и их компоненты: синтез, свойства, аффинная модификация белков" опубликован в журнале "Успехи химии" (1999). Результаты работы были представлены на 4-ом международном симпозиуме New England Biolabs "Биологическая модификация ДНК" (Инсбрук-Иглс, Австрия, 1997), международных симпозиумах стипендиатов научного фонда Медицинского института Говарда Хьюза стран Балтии, Центральной Европы и бывшего Советского Союза (Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998), 4-ом международном симпозиуме по изучению узнавания в нуклеиновых кислотах NACON-IV (Шеффилд, Великобритания, 1998), международной конференции "Биокатализ-98" (Пущино, Россия, 1998), ХШ-ом международном симпозиуме "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Монпелье, Франция, 1998), 4-ой международной конференции по молекулярной биологии им. Энгельгардта (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 1999).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы ( цитируемых работ). Материал иллюстрирован рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе использовали препарат метилазы Мт1, предоставленный С-Климашаускасом (Институт биотехнологии, Вильнюс, Литва). Препараты метилазы и эндонуклеазы ЕсоКП, содержащих шесть остатков гистидина на М-конце, выделены А.Г.Евстафьевой, Н.В.Чичковой и А.Б.Вартапетяном (Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского).

1. Дизайн диальдегидсодержащих аналогов субстратов для аффинной модификации метилаз £соШ1 и ¡\ival и эндонуклеазы рестрикции £со1Ш.

Для зондирования участков ферментов РМ ЕсоЮТ и ¡\ival, взаимодействующих с ДНК, мы предлагаем использовать новый тип реагентов на основе ДНК-дуплексов, содержащих диальдегидную группу в определенном положении ДНК-дуплекса. Диальдегидные группы вводятся в углеводные остатки, поэтому сохраняются все функциональные группы канонического ДНК-дуплекса. Преимуществами этих реагентов является их специфичность, главным образом, к аминогруппе остатков лизина белков. Диальдегидсодержащие реагенты способны образовывать прочную ковалентную связь с белком после химического восстановления. В отличие от фотоактивируемых реагентов, ковалентно присоединяющихся к белку после облучения, в процессе аффинной модификации белков диальдегидсодержащими аналогами субстрата не происходит фотоповреждения белка и ДНК.

Чтобы получить диальдегидную группу в любом положении олигонуклеотида, нужно ввести дополнительную цыс-диольную группу. Для этого мы заменяли в ДНК-субстрате остатки дезоксицитидина на 2'-0-р-В-рибофуранозилцитшшн или остатки тимидина на 1-(Р-0-галактопиранозил)тимин. Остатки 2'-0-рибофуранозилрибозы или галактозы имеют четыре гидроксильные группы, две из которых могут быть использованы для введения модифицированного звена в олигонуклеотидную цепь, а две другие, входящие в состав цис-диольной группы, - для дальнейшей модификации. Последующая реакция периодатного окисления приводит к региоспецифическому введению диальдегида в олигонуклеотид (схема 1). Реакционноспособная диальдегидная группа входит в состав окисленного остатка галактозы или более объемного окисленного дисахаридного остатка, что позволит зондировать более сближенные или более удаленные аминокислотные остатки белков, взаимодействующие с ДНК.

Схема 1

Cyt

ъ*

3—, о

он он

NaI04

НО

О. Ity

. ^

сн нс

и и О о

Crib

Tgal'

Остатки Crib или Tgal вводились вместо каждого из пиримидиновых нуклеозидных остатков участка узнавания или фланкирующих нуклеотидных последовательностей канонического ДНК-дуплекса 1 (ДНК-дуплексы 2-9) (рис. 1, Табл. 1)

Рис. 1. ДНК-дуплексы 2-10, применявшиеся для аффинной модификации M.£coRH, U.Mval и R.£coRII. Стрелками обозначены остатки dC или dT ДНК-дуплекса

5 '-GCCATCCTGGC ТС Т З'-CGGTAGGACCGAGA (1),

которые заменяли на остатки Crib ( » ) или Tgal (-*■ ) соответственно (см. также Табл. 1). ДНК-дуплекс 10 имел структуру

5'-GCCA(Tgal)CCTGGCT СТ З'-CGGT A GGACCGAGA .

A-цепь Т-цепь

2. Синтез и свойства диальдегидсодержащих аналогов субстратов.

Олигонуклеотиды, содержащие остатки Crib' или Tgal', были получены Б.С.Ермолинским, Е.В.Ефимцевой, С.Н.Михайловым (Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта), А.Аэршотом и П.Хердевином (Pera Институт, Бельгия).

В настоящей работе были отработаны условия окисления ояигонуклеотидов, содержащих остатки Crib' или Tgal'. Для выбора условий окисления проводили модельные опыты с динуклеозидфосфатами, содержащими остатки 1-(р-0-галактопиранозил)тимина или 2'-0-р-0-рибофуранозилуридина (совместно с Б.С.Ермолинским). При обработке 10-кратным избытком периодата натрия 1-(Р-0-галактопиранозил)тиминаденозинфосфата или 2'-0-р-0-рибофуранозилуридинаденозинфосфата окисление проходило полностью за 1.5

СпЬ'

Таблица 1. Свойства диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов как субстратов М.АЛ>а1 и М.£соЫ1. Аффинная модификация М.Л/уа1 и М.£соЫ1 ДНК-дуплексами 2-9.

К; ДНК-дуплекс Т,„± 1"с Уоот* или отн. степень метилирования г Л0 Выход Ковалентного присоединения, %'

Буфер А" Буфер Б М.£со1Ш МЛЛ»оГ М.£со1Шж МЛЛ>аГ м.гсоягг

1 5'-СССААССТСССТСТ З'-СССГТССАСССАОА 65 45 1 1 1 1 - -

2 5'-ОССАА(СпЬ)СТСССТСТ З'-СССТТ С САССвАвА 65 - 0.20±0.05" 0.6210.14' - 0.1 3(6) 4

3 5'-СССААС(СпЬ)ТСССТСТ З'-СОСТТ в С АСССАОА 63 - 0.0410 02* 0.9010.10* 0.2 4(8) 5

4 5'-СССААССТС С СТСТ 3'-СССГТССАС(СпЬ)ОАОА 64 - 0.0610.02' 0.4610.10' - 0.1 3(9) 5

5 5'-СССААССТ в ССТСТ 3'-СССТТССА(СпЬ)СС АйА 63 42 0.03Ю.0Г 0 6610.10* - 0.2 4(11) 3

6 5'-аССААСС1'С;С(СпЬ)ТСТ З'-СССГТССАСС в АСА 62 40 0.4410.10' 0.4510.15* 0.4 0.1 2(5) 4

7 5'-СС(СпЬ)ААССТСССТСТ З'-Св в ТТССАСССАСА 61 - 0.4210.09' 0.9510.05* 0.3 0.1 6(12) 3

8 5'-СССААССО^а))СССТСТ З'-СССТТССА ССОАвА - - 0.01' 0' 0.3 - 2(10) 10

9 5'-СССААССГССС(ТЕа1)СТ з-сссггссАсса А ел - - 0.4 Г 0.52г 0.4 - 3(10) 15

' Буфер А': 40 мМ Тпб-НО, рН 7.0, 15 мМ МЙС12 6 Буфер Б: 50 мМ Т^-НС!, рН 9.0, 20 мМ №С1.

'Уо0'" была определена как отношение начальных скоростей метилирования, Уо, ДНК-дуплексов 2-7 к Уо ДНК-дуплекса 1. Реакция метилирования проводилась при 10°С в буферах Б (МЛ/ия!) или А (40 мМ Тпб-НС!, рН 7.9) (М £го!Ш). Эффективность метилирования была определена по включению радиоактивности (кофактор Б-аденочил-Ь-метионин содержал С[3Н]3) в ДНК-дуплексы 2-7, используя фильтры ОБ 81.

'Огн. степень метилирования - отношение степени метилирования ДНК-дуплексов 8-10 к степени метилирования ДНК-дуплекса 1. Реакция

метилирования проводилась 30 мин при 20°С в буферах Б (МЛ/ш!) или А (М £соЮ1). Данные получены совместно с М.Г.Бревновым.

лК. - отношение выхода нековалентного комплекса аналога субстрата с ферментом к выходу нековалентного комплекса фермент-канонический дуплекс 1.

'Соотношение [фермент]/[ДНК-дуплекс] равно 1.6, а в скобках - 9.

"Соотношение [фермент]/[ДНК-дуплекс] равно 5.

выходы ковалентного присоединения определялись как отношение радиоактивности (32Р) ковалентного комплекса к суммарной радиоактивности ковалентного комплекса и ДНК.

часа или за 10 мин соответственно по данным анализа реакции методом ВЭЖХ.

Нами найдены условия полного окисления олигонуклеотидов, содержащих остаток галактозы, 5'-GCCAACC(Tgal')GGCTCT, 5'-GCCAACCTGGC(Tgar)CT и 5'-GCCA(Tgal')CCTGGCTCT: 0.05 М NaI04 (1000-кратный избыток относительно концентрации олигонуклеотнда), 37°С, 4 часа. Окисление олигонуклеотидов, содержащих дисахаридный остаток, 5'-GC(Crib')AACCTGGCTCT, 5'-GCCAA(Crib')CTGGCTCT, 5'-GCCAAC(Crib')TGGCTCT, 5 '-GCCAACCTGG(Crib')TCT, 5'-AGAG(Crib')CAGGTTGGC и 5'-AGAGC(Crib')AGGTTGGC, проводили в более мягких условиях: 0.02 М NalOi (100-кратный избыток относительно концентрации олигонуклеотнда), 37°С, 1.5 часа. Структура полученных диальдегидсодержащих олигонуклеотидов была подтверждена с помощью MALDI масс-спектрометрии.

Для оценки влияния вносимых модификаций на устойчивость двойной спирали бьии определены Та1 Crib-содержащих ДНК-дуплексов 2-7 (Табл. 1). Эксперименты проводили в условиях аффинной модификации ферментов РМ Mval и EcoWI (в буфере А' или в буфере Б). В обоих случаях введение Crib в канонический ДНК-дуплекс 1 приводило к незначительной дестабилизации (на 3-5 градусов) двухцепочечной структуры. Определить термодинамическую устойчивость Tgal-содержэщих ДНК-дуплексов 8-10 не удалось из-за деструкции олигонуклеотидов в условиях плавления.

На примере ДНК-дуплексов 4 и 7-9 была определена устойчивость Crib- и Tgal-содержащих ДНК-дуплексов в предполагаемых условиях ковалентного присоединения к M.Mval (буфер Б) и к ферментам РМ £coRII (буфер А) (рис. 2).

А

1 2 3 4 5 6

14-мер —К

Рис. 2. Устойчивость ДНК-дуплексов 4 и 7-9, содержащих Crib (А) и Tgal (Б), в буферах А и Б. Радиоавтограф 20%-ного полиакриламидного геля (ПААГ), содержащего 7М мочевину. А) Инкубация ДНК-дуплексов 7 (дор. 2 и 5) и 4 (дор. 4 и 5) в буферах Б (дор. 2 и 4) и А (дор. 5 и 5) в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 1 часа 15 мин при 0°С (причем в течение 1 часа в присутствии боргидрида натрия). 1 к 6 - ДНК-дуплексы 7 и 4 соответственно в воде.

Б) Инкубация ДНК-дуплексов 8 (дор. 2 и 4) и 9 (дор. 3 и 5) в буферах Б (дор. 2 и 3) и А (дор. 4 и 5) в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 1 часа 15 мин при 0°С (причем в течение 1 часа в присутствии боргидрида натрия). 1 - ДНК-дуплекс 8 в воде.

s

Crib-содержащие ДНК-дуплексы стабильны в условиях ковалентного присоединения к обеим метилазам (рис. 2А). Tgal-содержашие ДНК-дуплексы были неустойчивы, происходило частичное расщепление по механизму p-элиминирования с образованием олигонуклетид-3 '-фосфата (при расщеплении модифицированной цепи ДНК-дуплексов 8 или 9 образуются 7- или 11-звенные олигонуклеотиды соответственно) (рис. 2Б).

3. Взаимодействие диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов с метилазами Mval и ЕсоКП и эндонуклеазой ScoRH.

3.1. Субстратные свойства диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов.

Использование диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов в качестве реагентов для

аффинной модификации ферментов РМ Mval и £coRII требует оценки их способности

специфически связываться с ферментами и их субстратных свойств. Замещение dC в участке

узнавания окисленным дисахаридным остатком (ДНК-дуплексы 3-5) приводило к

значительному уменьшению эффективности метилирования M.Mval (Табл. 1). Один из ДНК-

дуплексов, содержащих Crib в участке узнавания (2), и ДНК-дуплексы, содержащие Crib вне

участка узнавания (б и 7), сохраняли способность метилироваться.

Введение остатка Crib в участок узнавания M-fcoRII или во фланкирующие

нуклеотидные последовательности участка узнавания практически не влияло на способность

ДНК-дуплексов 2-7 метилироваться (Табл. 1).

Наблюдалось расщепление ДНК-дуплексов 2-5, содержащих остаток Crib в участке

узнавания, эндонуклеазой £со RJI по модифицированным цепям. В качестве примера на рис.

ЗА приведено расщепление R.£coRII ДНК-дуплексов 2 и 3 (рис. ЗА, дор. 5 и 4).

Относительная степень гидролиза (6-8%) была намного ниже степени гидролиза

канонического ДНК-дуплекса 1 (100%). Не происходило гидролиза R.£coRH

«модифицированных цепей ДНК-дуплексов 2-5. Следует отметить, что в ДНК-дуплексах 3

и 5, в которых внутренние остатки dC участка узнавания заменены на Crib, происходил

гидролиз фосфодиэфирной связи, расположенной между двумя остатками dC (соседней с

канонической расщепляемой связью). В качестве контроля подвижности продуктов

гидролиза в ПААГ был проведен гидролиз немодифицированного ДНК-дуплекса 1

эндонуклеазой рестрикции Mval (рис. ЗА, дор. 2), которая расщепляет фосфодиэфирные

5'CCiA GG3'

связи в последовательности 3'qq тТСС5' В положениях' указанных стрелками. В отсутствие. R-£coRII расщепления (дуплексы 2-5) не наблюдалось (рис. ЗБ). Обе цепи ДНК-дуплексов 6 и 7, содержащих Crib во фланкирующих нуклеотидных последовательностях, не расщеплялись R.£coRII. Характер расщепления ДНК-дуплексов, содержащих остаток Crib в участке узнавания, эндонуклеазой £coRII, а также то, что введение остатка Crib во

фланкирующие нуклеотидные последовательности приводит к блокированию расщепления, свидетельствуют об участии остатка Crib в каталитическом акте. Одним из возможных объяснений является то, что гадроксильная группа из дополнительного окисленного

7-мер 6-мер 5-мер

т*т

-5-мер

Рис.3. Гидролиз ДНК-дуплексов 1-3 эндонуклеазами £coRH и Mval.

\) Расщепление ДНК-дуплексов 1-3 эндонуклеазами рестрикции £eoRII (дор. 3-5) и Mval [лор. 2) в течение 30 мин при 37°С. Радиоавтограф 20%-ного ПААГ, содержащего 7М ночевину. ДНК-дуплекс 1 (дор. 2 и 5); ДНК-дуплексы 2 и 3 (дор.4 и 3 соответственно). Цор. 1 - ДНК-дуплекс 1 без фермента. 32Р находится в Т-цепи.

5) Инкубация ДНК-дуплексов 2 и 3 (дор. 2 и 3 соответственно) в условиях гидролиза ^.icoRII в отсутствие фермента и после гидролиза R.icoRH ДНК-дуплекса 1 (дор. /). Радиоавтограф 20%-ного ПААГ, содержащего 7М мочевину. Дор. 4 - ДНК-дуплекс 1.32Р 1аходится в Т-цепи.

эстатка рибозы может выступать в качестве нуклеофила вместо атакующей молекулы воды три гидролизе фосфодиэфирной связи. Наблюдаемое изменение места расщепления RJJcoRII шляется важным результатом в свете поиска возможностей изменения специфичности гействия эндонуклеаз рестрикции. Tgal-содержащие ДНК-дуплексы 8-10 не расщеплялись l.fcoRn.

Таким образом, MMval метилирует ДНК-дуплексы, в которых остатки dC или dT во [манкирующих нуклеотидных последовательностях заменены на остатки Crib или Tgal :оответственно, а также ДНК-дуплекс, в котором один из внешних dC заменен на остаток ]rib. Все Crib-содержащие ДНК-дуплексы и только один ДНК-дуплекс, содержащий Tgal во фланкирующей нуклеотидной последовательности, являются субстратами М.£со1Ш.

R.£coRH расщепляет только те аналоги субстрата, в которых остатки dC участка узнавания заменены на Crib.

3.2. Образование специфических комплексов.

Важным этапом являлось изучение процесса комплексообразования диэп.дегидсодержаших ДНК и изучаемых ферментов как для оптимизации условий последующей аффинной модификации, так и для ответа на вопрос, сохраняют ли способность связываться те аналоги субстрата, которые не метилируются или не расш:;ги;;зотся ферментами. Опыты по связыванию ДНК-дуплексов 1-9 с M.Mva\ и M.£coRH, также как и ковалентное присоединение были проведены в присутствии продукта реакции метилирования, природного аналога кофактора - Б-аденозил-Ь-гомоцистеина (AdoHcy). Использование AdoHcy необходимо для образования специфического правильного комплекса и исключает протекание метилирования. Кроме того, ранее в нашей лаборатории было показано, что в отсутствие AdoHcy комплексы метилаз Mval и £coRH с каноническим субстратом не образуются. Эксперименты по связыванию ДНК-дуплексов 1-10 с RJfcoRII проводили в присутствии или в отсутствие кофактора - ионов Mg2+. Образование комплексов изучали методом "торможения в геле".

M.Mval может образовывать два типа комплексов с каноническим субстратом 1 в зависимости от концентрации фермента (рис. 4). При увеличении избытка фермента количество комплекса с большей молекулярной массой ("верхнего") увеличивается. При 1.6-или 9-кратном избытке фермента образуются только "нижний" или только "верхний" комплексы M.A/val-ДНК-дуплекс 1-AdoHcy соответственно (рис. 4А, дор.5 и 4Б, дор./). В случае ДНК-дуплекса без участка узнавания

5'- GCCAACCGGCTCTA (11)

3'- CGGTTGGCCGAGAT

при любой концентрации M.Mval образуется только "верхний" комплекс (рис. 4А, дор. 2 и 3). Образование "нижних" комплексов соответствует специфическому связыванию. "Нижний" комплекс содержит одну молекулу M.Mval, связанную с одной молекулой ДНК-дуплекса, так как подвижность "нижнего" комплекса подобна подвижности тройного комплекса М.£соЫ1-ДНК-дуплекс 1-AdoHcy (данные не приведены). Молекулярные массы метилаз Mval и £coRII подобны (около 54 кДа). "Верхний" комплекс, вероятно, содержит две молекулы M.Mval. В случае метилаз Mspl и Hhal также наблюдалось образование двух типов комплексов фермент-ДНК (Дюби и др. 1992, О'Гара и др. 1999).

А

ДНК-дуплекс \l.Mval / ДНК-дуплекс

11 1

3.3 9^3.3 э' 12 3 4 5

в? •

ДНК-дуплекс 1 7 4 8 9 4 1 2 3 4 5 6

"Верхний" ' комплекс "Нижний" комплекс

Рис. 4. Связывание ДНК-дуплексов 1, 4, 7-9 и 11 с ММ^/а! в присутствии 0.1 мМ АёоНсу. Радиоавтограф 8%-ного ПААГ.

А) Связывание 0.35 мкМ 32Р-меченных немодифицированных ДНК-дуплексов 11 и 1 с 1.2 и 3.2 мкМ М.ЛЛ>а1 (дор. 2-3 и 4-5 соответственно); дор. 1 -ДНК-душтекс 11. Б) Связывание 0.35 мкМ 32Р-меченных ДНК-дутшекса 1 и диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов 4 и 7-9 с М.М>а1 (0.6 мкМ) (дор. 1-5); дор. б - ДНК-дуплекс 4.

Связывание модифицированных ДНК-дуплексов 2-9 с Ы.Mval было изучено в условиях, когда в случае канонического ДНК-дуплекса 1 образовывался только "нижний" специфический комплекс. Однако в этих условиях СпЬ-содержащие ДНК-дуплексы образуют оба типа комплексов, причем способность образовывать "нижний" или "верхний" комплекс зависит от субстратных свойств дуплексов (рис. 4Б). ДНК-дуплексы б и 7, которые сохраняют способность метилироваться ММуо!, образуют с М.МуоI только комплекс с большей подвижностью в геле. ДНК-дуплексы 3-5, которые являются плохими субстратами, образуют комплекс с меньшей подвижностью в геле. ДНК-дуплекс 2, имеющий среднюю способность метилироваться, дает два вида комплексов. Тза1-содержащие ДНК-дуплексы 8 и 9 образуют только "нижний" комплекс (рис. 4Б, дор. 4 и 5). Были получены дополнительные доказательства специфического характера "нижних" комплексов диальдегидсодержащий ДНК-дуплекс-фермент. Во-первых, только "верхний" комплекс наблюдался при любых концентрациях М.ЛЛа1 с СпЬ-содержащим 21-звенным ДНК-дуплексом 12, не содержащим участка узнавания (данные не приведены).

5'-САСАОААТТ(СпЬ)ТАОАТАТСАСА (12)

З'-СТСТСТТАА О АТСТАТАОТОТ

Во-вторых, наблюдалось одинаковое поведение Crib-содержащего ДНК-дуплекса 6 и канонического ДНК-дуплекса 1 в экспериментах по конкурентному ингибированию связывания с М.ЛЛ>а1. Опьггы проводили в присутствии различных количеств ^модифицированных ДНК-дуплексов с участком узнавания

5 '-ACCTACCTG GTGGT (13)

3 '-TGGATGGACCACCA или без участка узнавания (11). На основании этих экспериментов было рассчитано соотношение констант специфического и неспецифического связывания. Это отношение равно приблизительно 1.7/1. Таким образом, сродство метилазы Mval к каноническому ДНК дуплексу и к ДНК-дуплексу, не содержащему участка узнавания, отличаются незначительно. ДНК-дуплексы 6-9, образующие специфические нековалентные комплексы с M.Mval (при 1.6- кратном избытке фермента), были отнесены к группе I. ДНК-дуплексы 2-5, образующие нековалентные комплексы с M.Mval с меньшей подвижностью в ПААГ (при том же избытке фермента), были отнесены к группе П. Следует отметить, что эффективность связывания ДНК-дуплексов группы I с метилазой Mval была ниже (в 2.5-3 раза) эффективности связывания канонического ДНК-дуплекса 1 (Табл. 1).

В случае M.jEcoRJI при любом избытке фермента образовывался только один вид нековалентных комплексов со всеми ДНК-дуплексами с одинаковой подвижностью в ПААГ. Crib-содержащие ДНК-дуплексы 2-7 образуют с M.^coRD менее прочные (в 5-10 раз) комплексы по сравнению с каноническим ДНК-дуплексом 1 (Табл. 1). Ранее бьио показано, что Tgal-содержащие ДНК-дуплексы связываются с M.iTcoRII связываются так же, как канонический субстрат.

Связывание Crib-содержащих ДНК-дуплексов 2-7 с R.£coRII проводили в присутствии ионов Mg2+, а связывание Tgal-содержэщих ДНК-дуплексов 8-10 с R.£coRII - в отсутствие ионов Mg2+. Все Crib-содержащие ДНК-дуплексы (2-7) и ДНК-дуплекс 9, содержащий Tgal во фланкирующей нуклеотидной последовательности, связываются с эндонуклеазой £coRII. ДНК-дуплекс 10, содержащий диальдегид возле расщепляемой фосфодиэфирной связи, очень слабо связывается с R.£coRII по сравнению с каноническим ДНК-дуплексом 1. ДНК-дуплекс 8, содержащий остаток Tgal в участке узнавания, не связывается с R.£coRII. Эффективность связывания ДНК-дуплексов 6, 7 и 9, содержащих диальдегид во фланкирующих нуклеотидных последовательностях, с R.£coRH (при соотношении [фермент]/[субстрат] ([E]/[S]), равном 4) была выше (R равно 0.8-1), чем эффективность связывания ДНК-дуплексов 2-5, содержащих Crib в участке узнавания (R равно 0.1-0.6).

Таким образом, практически все диальдегидсодержахдие дуплексы связываются с изучаемыми ферментами независимо от их способности метилироваться или расщепляться. ДНК-дуплекс 10, содержащий остаток Tgal возле расщепляемой фосфодиэфирной связи, очень слабо связывается с R.£coRII. ДНК-дуплекс 8, содержащий остаток Tgal в участке узнавания, не связывается с R.icoRII. Для аффинной модификации изучаемых ферментов будут использоваться ДНК-дуплексы групп I и П (в случае MMvaT), ДНК-дуплексы 2-9 (в случае M.£coRII) и ДНК-дуплексы 2-7 и 9 (в случае R.£coRII).

4. Аффинная модификация ферментов РМ Mval и ЛсоЯП диальдегидсодержащими ДНК-дуплексами.

Согласно литературным данным диальдегидсодержащие реагенты взаимодействуют со сближенными остатками лизина белка, образуя дигидроксиморфолиновое производное (путь 1) или основание Шиффа (путь 2) (схема 2). Для образования прочной ковалентной связи необходимо восстановление образующегося коньюгата боргидридом натрия.

Ранее для реакции ковалентного присоединения с Tgal-содержащими ДНК-дуплексами были подобраны условия инкубации (5 мин. при комнатной температуре и 15 мин. при 0°С). В настоящей работе мы проводили реакцию в этих же условиях. Использовали буферы Б (в случае M.MvaV), А (в случае M.£coRII) и 40 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 50 мМ NaCl (буфер В) (в случае R.jE'coRJI). Для оптимизации условий восстановления варьировали концентрацию боргидрида натрия и время восстановления. Оптимальным, как в случае Crib-, так и Tgal-содержэщих ДНК-дуплексов оказалось восстановление комплекса 0.75 мМ боргидридом натрия в течение одного часа. Для разрушения нековалентных комплексов реакционные смеси были обработаны додецилсульфатом натрия (ДДС). После восстановления боргидридом натрия продукты ковалентного присоединения были устойчивы. Если не проводить восстановление, промежуточные продукты легко разрушались ДДС. Образование ковалентных конъюгатов анализировали в 10%-ном ДЦС-ПААГ. Для подтверждения образования ковалентного коньюгата гель прокрашивали кумасси R-250 для обнаружения зон белка; затем проводили авторадиографию.

В Табл. 1 и на рис. 5 приведены результаты ковалентного присоединения диальдегидсодержащих дуплексов к Ы-Mval при различных соотношениях фермента и субстрата. Дуплексы 6-9 (группа I), образующие специфические нековалентные комплексы с M.A/vqI, при соотношении [E]/[S], равном 1.6, ковалентно присоединялись к ферменту с выходами 2-6%. При соотношении [E]/[S], равном 9, выходы продуктов увеличивались до 12% (Табл. !). Однако в этих случаях реакция аффинной модификации метилазы Mval ДНК-дуплексами группы I происходит в условиях, когда образуются "верхние" нековалентные

Схема 2

o—i Cyt

HO—, С

CH HC

II II

о о

но-сн

NaBIt,

но-сн2ч о .о

СН2 HjC

I I

NH , OH Era

комплексы. Выходы продуктов ковалентного присоединения ДНК-дуплексов, содержащих Crib вместо остатков dC во фланкирующих нуклеотидных последовательностях (6 и 7), или Tgal вместо остатков dT в участке узнавания (8) или рядом с ним (9), отличались незначительно. ДНК-дуплексы 2-5 (группа П) при обоих соотношениях [E]/[S], равных 1.6 и 9, присоединяются к M.Mvai примерно с такой же эффективностью, как и соединения группы I. Таким образом, выходы ковалентных конъюгатов диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов и MMval не зависели от места расположения модифицированного остатка в аналоге субстрата, а также от природы фермент-субстратного комплекса.

ДНК-дуплекс 2 2 3 7 4 5

1 2 3 4 5 6

Ковалентный

конъюгат

ДНК

Рис. 5. Ковалентное присоединение MMval к ДНК-дуплексам 2-5 и 7 в присутствии 0.1 мМ AdoHcy. 10% ДЦС-ПААГ восстановленных реакционных смесей, содержащих иР-меченные ДНК-дуплексы 2-5 и 7 (0.35 мкМ) и MMval (0.58 мкМ) (дор. 2-6). Дор. 1 -ДНК-дуплекс 2.

В случае M.£coRH ковалентное присоединение Crib- и Tgal-содержащих ДНК-дуплексов проводили при избытке фермента относительно ДНК в буфере А (Табл. 1). Учитывая химическую нестабильность Tgal-содержащих ДНК-дуплексов (рис. 2), реакцию ковалентного присоединения Tgal-содержахцего ДНК-дуплекса 9 к MJicoRU пробовали проводить в 50 мМ КН2РО4, рН 7.0. Однако ббльший выход ковалентного присоединения наблюдается в буфере А. Все ДНК-дуплексы, содержащие остаток Crib (2-7), ковалентно присоединялись к M.£coRH, причем выходы ковалентных коньюгатов практически не зависели от локализации модифицированного нуклеозидного остатка и составляли 3-5%. Образование ковалентных коньюгатов Tgal-содержащих ДНК-дуплексов 8 и 9 a MJicoRU происходило более эффективно (с выходами 10-15%) по сравнению с Crib-содержащими ДНК-дуплексами (Табл. 1). Эффективность ковалентного присоединения ДНК-дуплекса 9 была несколько выше эффективности ковалентного присоединения ДНК-дуплекса 8.

Выходы продуктов ковалентного присоединения диапьдегидсодержащих ДНК-дуплексов к метилазам рассчитывались относительно суммарного количества ДНК. Достаточно низкие выходы ковалентного присоединения ДНК-дуплексов группы I к метилазе Mval и Crib-содержащих ДНК-дуплексов к метилазе £coRII можно объяснить низкой эффективностью связывания, а не низкой эффективностью ковалентного присоединения. Низкая эффективность связывания в случае MMval была обусловлена необходимостью проведения реакции ковалентного присоединения в условиях образования специфического комплекса. Следует отметить, что если оценивать выходы реакций ковалентного присоединения относительно связанной ДНК, то их величины высоки и составляют 15-50% (в случае MMval) и 50-90% (в случае M.£coRII).

Аффинную модификацию R.£coRH Crib-содержащими (2-7) и Tgal-содержэщим (9) ДНК-дуплексами, выбранными по критерию способности к комплексообразованию с

эндонуклеазой EcoRH, проводили при соотношении [E]/[S], равном 4. Реакцию проводили в в отсутствие или присутствии ионов Mg2+. В присутствии ионов Mg2* ковалентное присоединение ДНК-дуплексов, содержащих Crib возле расщепляемой фосфодиэфирной связи (2 и 4), может происходить к активному центру R.£coRII. Соединения 2-7 и 9 ковалентно присоединялись к R.£coRII, но выходы реакции были очень низкими (0.2-0.4%) как в отсутствие, так и в присутствии ионов Mg2+. Увеличение концентрации R.£coRII примерно на порядок (в случае конъюгата с ДНК-дуплексом 9) не приводило к заметному увеличению выхода коваленгного конъюгата, выход оставался меньше 1%. Таким образом, выходы ковалентного присоединения диальдегидсодержащих реагентов к R.£coRII крайне низки даже при наличии хорошего связывания в случае ДНК-дуплексов б, 7 и 9, содержащих диальдегид во фланкирующих нуклеотидных последовательностях, и намного ниже выходов, наблюдаемых в случае метилаз. По-видимому, в используемых ДНК-дуплексах в ближайшем окружении диальдегвда отсутствуют остатки лизина. Возможное участие остатков Crib в катализе (см. разд. 3.1) предполагает, что дополнительный окисленный остаток рибозы расположен вблизи активного центра R.£coRO. Значит, либо остатки лизина отсутствует в активном центре, либо конформационно недоступны.

5. Зондирование участков метилаз Mval и £соВД1, взаимодействующих с диальдегндсодержащими ДНК-дуплексами.

Следующим этапом явилось определение участков в метилазе Mval, к которым ковалентно присоединены все ДНК-дуплексы групп I и П, и участков в метилазе ЕсоКП, к которым ковалентно присоединены Tgal-содержащие ДНК-дуплексы 8 и 9 (они образуют конъюгаты с М.£соЯД с большими выходами по сравнению с Crib-содержащими ДНК-дуплексами). Одним из методов, позволяющих определить участки ферментов, ковалентно связанные с ДНК, является частичный гидролиз ковалентно связанного фермента химическими реагентами, специфически расщепляющими пептидные связи по остаткам определенных аминокислот. Реакция проводится в условиях одноударного расщепления, когда на молекулу белка приходится менее одного разрыва, с последующим анализом полученных олигонуклеотидопептидов. Было использовано несколько химических реагентов: 2-нитро-5-тиоцианобензойная кислота (НТЦБК), N-хлорсукцинимид (ХС) или бромциан (BrCN), расщепляющих пептидные связи остатков цистеина, триптофана или метионина соответственно.

Метилаза Mval содержит один остаток цистеина, четыре остатка триптофана и пятнадцать остатков метионина. Проводили расщепление конъюгатов M.Mval и Crib-содержащих ДНК-дуплексов группы I всеми тремя реагентами. При расщеплении конъюгата

дуплекса 6 с Ы.Муа1 с помощью НТЦБК получился один олигонуклеотидопептид, свидетельствующий о ковалентном присоединении аналога субстрата к С-концевому участку фермента (этот участок указан на рис. 6). Гидролиз конъюгата М.АЛ>а1-ДНК-дуплекс 6 с А

N -N-

N

166 288

152 ; 60 : 83 ; 85 i 74

1 * * * „ 1

1, 46 ,. 27 . 27, 27 . 52 23, 28 . 34 . 47 , 59 Í7 33 ,17,7,

кюое clyoewl-lee el с о о—el eloeloeetlee el ее е оо еф е|аз е tmel leí

XC(Trpj)

-С BrCN(Met I)

НТЦБК'.

288

IX-N4 X

ХС

BrCN

_2á_

-5¡L

N

Ш IV V VI vn VSr Vffl1

LLLI I 1

Trp:

¡ro

Ib

_454 Met422

остатки Lys

Рис. 6. Картирование областей M.Mval, ковалентно связанных с диальдегидсодержащими аналогами субстрата.

А) Схематическое представление расщепления MMval с помощью НТЦБК, ХС и BrCN; о -остатки лизина; цифры указывают количество аминокислотных остатков. Б) Идентификация участка ковалентного присоединения по результатам гидролиза НТЦБК, ХС и BrCN; заштрихованные области на схеме представляют консервативные мотивы (1-Х);

I_I - предполагаемый участок ковалентного присоединения; определенный по

результатам расщепления НТЦБК, ХС и BrCN (<-»); количество аминокислотных остатков указано арабскими цифрами.

помощью ХС приводил к четырем основным олнгонуклеотидопептидам (рис. 7Б). Сравнение полученной картины распределения набора олигонуклеотидопептидов на радиоавтографе геля с теоретической картиной позволило установить, что ковалентная связь находится между остатками Val381 и Ser454 (рис. б и 7А). Далее был проведен гидролиз BrCN, результаты которого позволили нам предположить, что ковалентное присоединение происходит к участку метипазы Mval Lys373-Met422 (рис. 6 и 7В). При расщеплении продуктов ковалентного присоединения Crib-содержащего ДНК-дуплекса 7, а также Tgal-содержащих ДНК-дуплексов 8 и 9 к М.Л/val с помощью НТЦБК, ХС и BrCN были получены такие же картины распределения наборов олигонуклетидопептидов на радиоавтографе геля. Это позволяет предположить, что пептид Val381-Met422 - наиболее вероятный фрагмент, ковалентно связанный с ДНК в случае ДНК-дуплексов группы I. Можно предположить, что

остатки лизина этого участка фермента образуют контакты с углеводофосфатным остовом ДНК.

Следует отметить, что наборы олигонуклеотидопептидов, полученные при гидролизе ковалентных коньюгатов М.М>а1 и ДНК-дуплексов 2-5 (группа П) с помощью НТЦБК и ХС, а также конъюгата М.А/уд1-ДНК-дуплекс 5 с помощью ВгСИ, совпадали с соответствующими наборами, полученными при расщеплении ковалентных коньюгатов с ДНК-дуплексами группы I. Таким образом, ДНК взаимодействует с С-концевым участком М.Ша\ как в случае ДНК-дуплексов группы I, так и в случае ДНК-дуплексов группы П.

А

152

II IV'

. 60 , 83 , 85 | 174 С

ХС

Время, мин. 10 0

83

1 454

-X.

Мг, Ша ^ 58 -»

83

85

40 33

23

В

ВгСЫ

Время, мин. 10 0 Мг, Ша

48-58

85

X

13

X7

21 14

Рис. 7. Частичный гидролиз ковалентного конъюгата М.АЛ>а1-ДНК-дуплекс 6 с помощью ХС и ВгСЫ.

А) Теоретический набор олигонуклеотидопептидов, который мог быть получен при гидролизе с помощью ХС, если бы олигонуклеотид был ковалентно связан с С-концом ЪЛ.Муа1. Вертикальные линии представляют места расщепления ХС; цифры обозначают количество аминокислотных остатков;. 'У'- 32Р-меченный олигонуклеотид. Б) и В) Наборы олигонуклеотидопептидов, полученных при частичном пиролизе конъюгата М.ЛЛ>а1-ДНК-дуплекс 6 с помощью ХС (Б) или ВгСИ (В) в течение 0 и 10 мин. Радиоавтографы 10% ДДС-ПААГ.

Основываясь на полученной методом РСА пространственной структуре метилазы РуыП., которая как и М.Муа1 принадлежит к классу метилаз, метилирующих экзоциклическую аминогруппу цитозина (Ж-метилаз), можно сделать несколько предсказаний о структуре ДНК-связывающего участка Ы.Муа1. Такое сравнение допустимо ввиду наличия гомологий в первичных структурах ДНК-метилтрансфераз. Эти ферменты содержат десять консервативных аминокислотных мотивов (1-Х) (рис. 6, 8). Консервативный мотив VIII у К4-метилаз разделяется на два субмотива VIII' и VIII" (рис. 6). Анализ кристаллической структуры М.РуиЦ и теоретическая модель структуры комплекса М.РуиП с ДНК предполагают, что ДНК располагается в У-подобной бороздке белка. В структуре

1.Рчи11 есть антипараллельная Р-шпилька, состоящая из двух антипараллельных (3-цепей и оединяющей их петли. Аминокислотные остатки двух антипараллельных (5-цепей оответствуют субмотивам VIII' и УШ", а аминокислотные остатки соединяющей их петли оответствуют вариабельной области между этими субмотивами. Петля и прилегающие к' ей участки (3-цепей находятся на поверхности предполагаемой ДНК-связывающей бороздки содержат большое количество остатков лизинов и аргининов, способных заимодействовать с углеводофосфатным остовом ДНК.

Участок ковалентного присоединения МЛЛ<<з1, определенный в данной работе, эответствует консервативным субмотивам VIII' и VIII" и области между консервативным убмотивом VIII" и С-концом М.АЛ>а1 (рис. 6). Мы можем предположить, что участок вязьшания ДНК в метилазе Муа! содержит Р-шпильку. В этом участке Ы.Мт! находится ять остатков лизина. Эта работа является первым экспериментальным зондированием ДНК-вязывающего участка среди №-метилаз.

Для определения участка М.£со1Ш, взаимодействующего с ДНК, проводили полное и астичное расщепление (ВгСМ) ковалентных коньюгатов М.£со!Ш с ДНК-дуплексами, эдержащими Tgal в участке узнавания (8) и во фланкирующей нуклеотидной оследовательности (9), по остаткам метионина. При частичном гидролизе В г СМ этих эвалентных коньюгатов получилось три олигонуклеотидопептида. Сравнение с :оретическими картинами распределения наборов олигонуклеотидопептидов показало, что эвалентное присоединение происходило к области М.£соЫ1 01у268-Ме13" (рис. 8). В :ловиях полного расщепления с помощью ВгСЫ получался преимущественно один нигонуклеотидопептид с молекулярной массой 19 Ша. Это подтверждает, что ковалентное рисоединение происходит к одному из остатков лизина участка М.£со!Ш 01у"68-Ме(391. В гой области фермента содержится десять остатков лизина. Семь остатков лизина в участке 1.£со!Ш, определенном с помощью аффинной модификации Tgal-coдepжaщими ДНК-утшексами, находятся в вариабельном домене М.£соЫ1 между консервативными мотивами III и IX. Известно, что этот вариабельный домен определяет сиквенс-специфичность С5-етилаз. Два остатка лизина находятся в консервативном аминокислотном мотиве VIII и :ин остаток лизина - в вариабельной области, предшествующей консервативному мотиву III.

Недавно была построена гипотетическая модель пространственной структуры етилазы ЕсоКП и ее комплекса с ДНК (Шредер и др. 1997) на основании гомологии .шнокислотных последовательностей М.£со1Ш и метилаз НЬаI и НаеШ, для комплексов )торых с ДНК методом РСА были определены пространственные структуры. Согласно этой эдели несколько остатков лизина из вариабельной области в найденном нами участке

M.£coRII Gly268 -Met391 взаимодействует с фосфатами участка узнавания и ближайшего нуклеотидного окружения (рис. 8В). Таким образом, наши данные согласуются с теоретической моделью. Это подтверждает, что найденный в данной работе участок M.£coRII взаимодействует с утлеводофосфатным остовом ДНК. А

82

168

.16.

124

,29,

57

BrCN (Met )

477

ВгСЫ

IV V VI

К378

Met 267-

К351 N353

Lys

477

3'

CD Q © Се) 0 0 0 0

0jЙ00E

— Met 391 E28â

,GUCe>_CE> 0

3'

M

® ® ® ® ® ® &jQ) ® ® ®

K347

R375 Y376

R370

Рис. 8. Определение области M.£coRII, ковалентно связанной с Tgal-содержащими аналогами субстрата.

A) Схематическое представление расщепления M.£coRII с помощью BrCN; о - остатки Lys; цифры указывают количество аминокислотных остатков.

Б) Идентификация области ковалентного присоединения по результатам гидролиза BrCN; заштрихованные области на схеме представляют консервативные мотивы (1-Х); символом (<-») обозначен предполагаемый участок ковалентного присоединения; указано количество аминокислотных остатков в этом участке.

B) Контакты фермент-ДНК согласно модели комплекса М.£соШЗ-ДНК-Ас1оНсу (Шредер и др. 1997).

В заключение следует отметить, что в нашей работе для аффинной модификации ферментов рестрикции-модификации были применены новые аналоги субстратов, содержащие диальдегид в определенном положении олигонуклеотидных цепей. ДНК-дуплексы, содержащие остаток Crib, стабильны в условиях проведения аффинной модификации. При использовании для аффинной модификации этих ферментов Tgal-содержащих аналогов субстратов в условиях ковалентного присоединения параллельно может происходить реакция расщепления фосфодиэфирной связи, соседней с остатком Tgal. Введение остатка Tgal в участок узнавания приводит к более сильному искажению структуры двойной спирали. Так, ДНК-дуплекс, содержащий остаток Tgal в участке

N

с

I

□ ш

узнавания, не является субстратом ни для одного из изучаемых ферментов, а ДНК-дуплексы, содержащие остаток Crib в участке узнавания, являются субстратами для ферментов РМ fcoRII. При замене остатков dC на остатки Crib в ДНК-дуплексе практически не происходит дестабилизации двойной спирали. Интересно, что введение остатков Crib в участок узнавания ДНК может приводить к изменению места расщепления эндонуклеазой £со RII. Следует отметить более высокие выходы ковалентного присоединения Tgal-содержащих ДНК-дуплексов к M.iscoRII по сравнению с Crib-содержащими ДНК-дуплексами. Учитывая неустойчивость Tgal-содержащих ДНК-дуплексов, реальные выходы ковалентного присоединения еще больше. Аффинная модификация метилаз диальдегидсодержащими реагентами происходит с большими выходами по сравнению с аффинной модификацией эндонуклеазы рестрикции. Дня обеих метилаз вне зависимости от места расположения модифицированного углеводного остатка в ДНК-дуплексе ковалентное присоединение происходило к одному и тому же участку соответствующего фермента. Возможно, контакты с углеводофосфатным остовом ДНК образуют различные остатки лизина, расположенные в идентифицированных участках ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы новые реагенты для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз и эндонуклеаз рестрикщш на основе ДНК-дуплексов, содержащих реакциокноспособную диальдегидную группу. Изучены их физико-химические и субстратные свойства в реакциях метилирования метилазами Mval и £coRÍI и гидролиза эндонуклеазой £coRII.

2. Метилаза Mval образует два вида нековалентных комплексов в зависимости от соотношения концентраций фермента и субстрата и места расположения диальдегидсодержащего нуклеозидного остатка в субстрате.

3. Разработана реакция ковалентного присоединения диальдегидсодержащих аналогов субстратов к метилазам Mval и ícoRII и эндонуклеазе рестрикции £coRH. Получены ковалентные конъюгаты метилаз Mval и £coRII с ДНК-дуплексами, содержащими аиальдегид в участке узнавания и во фланкирующих нуклеотидных последовательностях.

4. Проведено расщепление различными химическими реагентами конъюгатов метилаз Mval и ícoRH с диальдегидсодержащими ДНК-дуплексами. Показано, что независимо от места расположения диальдегида в ДНК-дуплексе ковалентное присоединение происходит к участку метилазы Mval Val38'-Met422 и к участку метилазы EcoRII Gly^-Met39'.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. S.N.Mikhailov, E.V.Efimtseva, B.S.Ermolinsky, M.V.Fomicheva, O.M.Gritsenko, M.G.Brevnov, E.S.Gromova, G.Schepers, A.Van Aerschot, P.Herdewijn. Regioselective incorporation of reactive dialdehyde groups into synthetic oligonucleotides.// Collection Czech. Chem. Comm., 1996, v.61, p.210-212.

2. M.G.Brevnov, O.M.Gritsenko, S.N.Mikhailov, E.V.Efimtseva, B.S.Ermolinsky, A.Van Aerschot, P.Herdewijn, A.V. Repyk, E.S.Gromova. DNA duplexes with reactive dialdehyde groups as novel reagents for cross-linking to restriction-modification enzymes.// Nucleic Acids Res., 1997, v. 25, p.3302-3309.

3. О.М.Гриценко, Е.С.Громова. Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислоты и œ компоненты: синтез, свойства, аффинная модификация белков.// Успехи химии, 1999, v.68, р 267-278.

4. S.N.Mikhailov, B.S.Ermolinsky, E.V.Efimtseva, M.G.Brevnov, O.M.Gritsenko, E.S.Gromova, A.Van Aerschot, P.Herdewijn. Oligonucleotides with reactive dialdehyde groups as novel affinity reagents.//Nucleosides & Nucleotides, 1999, v. 18, p. 1469-1470.

5. S.N.Mikhailov, B.S.Ermolinsky, E.V.Efimtseva, G.P.Moiseyev, V.L.Tunifskaya, E.E.Rusakova, S.N.Kochetkov, O.M.Gritsenko, E.S.Gromova, A.Van Aerschot, P.Herdewijn Oligonucleotides containing hexapyranosyl nucleosides and disaccharide nucleosides: synthesis, incorporation of dialdehyde groups and use as affinity reagents.// Collection Symposium Series. 1999, v. 2, p. 141-144.

6. O.M.Gritsenko, S.N.Mikhailov, E.V.Efimtseva, A.Van Aerschot, P.Herdewijn, E.S.Gromova. Probing the Mval methyltransferase region that interacts with DNA: affinity labeling with the dialdehyde-containing DNA duplexes.// Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2000 v. 19, in press.