Эндонуклезы рестрикции MvaI и EcoRII: элементы механизма узнавания и расщепления синтетических субстратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ПУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ . им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи Уда 547.963.3

КУБАРЕВА Елена Александровна

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Ычв1 И ЕсоНт ЭЛЕМЕНТЫ МЕХАНИЗМА УЗНАВАНИЯ И РАСЩЕШШШ СИНТЕТИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных ■ и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени , кандидата химических наук

Москва

1988

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор ШАЕАРОВА З.А.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

ГРОМОВА Е.С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

КИРПИЧНИКОВ М.П.

кандидат химических наук ШШЪКИН А.С.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина АН СССР

Защита состоится "22 " 1988 года б часов

на заседании Специализированного совета Д 053.05.47 йохимичес-ш наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " $ " 1988 ;г.

Учёный св1фотарь Специализированного совета, кандидат химических наук,

доцент

Г.И.Лавренова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Способность эндонуклеаз рестрикции ша П узнавать и расщеплять строго определённые последовательности ЛНК обусловила их широкое практическое применение. Ферменты рестрикции используются для картирования ДНК, хромоеомного адаш» за, конструирования новых ДНК. Система эндонуклеаза рестрикции -ДНК-дуплекс является удобным объектом для выяснения центральной проблеш молекулярной биологии - вопроса о природе специфического белково-нуклеинового взаимодействия. Несмотря на большое тле- • до уже известных эндонуклеаз рестрикции (более 600), подробно изучено только несколько ферментов. Расширение исследований в области молекулярной биологии и генетической инженерии требует изучения новых рестриктаз, взаимодействующих с различными нуклеотид-ныш последовательностями.

Объектами настоящего исследования являлись эндонуклеазн рестрикции Mvai и EcoRll, которые узнают в ДНК одну к ту не нуклео-тидную последовательность, но расщепляют её в различных положениях (место расщепления отмечено стрелкой):

Mvai EaoRII

5*...C-Cil-G-G...3' 5«..ic-0-T-G-G.. .3'

У ...G-G-AjG-СГ. ..5' 3' -.. G-G-A-C-C .,. 5'

Особенностью участка узнавания этих ферментов является частично нарушенная симметрия второго порядка в районе центральной АТ-па-ры. Эндонуклеаза рестрикции EcoRii выделена из штамма-суперпродуцента Escherichia coli B834/PSK323 (Косых и др., 1930). В течение ряда лет она изучалась в нашей лаборатории. Выявлен ряд особенностей структуры фермент-субстратного комплекса и механизма ферментативной реакции. Эндонуклеаза рестрикции Mvai выделена в 1985 году Янулайтисом и др. из клеток Micrococcus varians RFL 19. Этот фермент является составной частью системы рестрикции-модификации нового типа: метилаза Mvai модифицирует второй с 5*-конца участка узнавания остаток dc по экзоциклической аминогруппе (iuticus et ai, 1985). Данные о механизме действия рестриктазы Mvai практически отсутствуют.

Целью настоящей работы явилось исследование механизма узнавания и расщепления субстратов эндонуклеаз ама рестрикщш Mvai и EcoRii. В случае эндонуклеазы EcoRii основное внимание уделено выявлению контактов этого йеталента с гетероциклическими основаны-

яки участка узнавания и углеводфосфатным остовом ДНК. Особый интерес представляет сравнение свойств эвдонуклеаз-изоинзомеров ЦуаХ И ЕсоНИ .

Для решения поставленных задач перспективно использовать синтетические субстраты, содержащие природные или модифицированные участки узнавания этих ферментов. Наряду с ДНК-дуплексами ко-икатемэркого г:ша, предложенными- ранее дал исследования эндопук-леагы Еооки (Громова и др., 1284), применяли субстраты, содержание только' одет участок узнавания ферментов Муа1 и ЕсоНИ. В задачу работы входил синтез ДЩ{-дуплексов длиной 29-30 нуклеотвдних паи со структурными аномалиями в участке узнавания и прилегающих к нему нуклеотпдных последовательностях.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основания аа&таза расцепления ДНК-дуплексов с различными типами кодификаций выявлены группы атомов готерсцгасличсских оснований и углеводфос-фатного остова, которые вовлечены во взаимодействие (или сблияень с функциональными группам;! эндонуклеаз рестрикции куа1 и Еоойи. Обнаружено валяние структура нуклеотиднцх последовательностей! прЕлегаасзк к участку узнавания, на скорость расщепления фермент; мл .'."уа1 к ЕсоТШ отдельных цепей субстрата. Впервые наблюдался ш обычный характер кинетики гидролиза протянонного ДНК-дуплекса эн-йонуклеазоп рестрикции ;Луа1, связанны;"! с накоплением в реакцконш смеси иктермедиата с одноцепочечным разрывом. Установлено, что и дродиз обеих цепе!; субстрата ферментом Куа1 мо:-:;ет проходить чере: стадию диссоциации фермент-субстратного комплекса поме первого акта расщепления. В отличие от эндонуклеазы рестрикции Есока, в случае фермента Г»*л-а1 наблюдается замедление расщепления немодифи цированной цепи ряда ДНК-дуплексов при отсутствии ингибирования гидролиза модиф;тированной цепи отих субстратов. Показана способ ноеть рестриктазы Цуа! с высокой эффективностью осуществлять нал разденные одноцепочечные разрывы'в некоторых модифицированных су бстратах. На основании полученных данных сделан вывод о том, что эндонукдеазы-изошпзомеры Муах и Есони узнают и расщепляют одну ту ге последовательность ДНК по различным механизма!.!.

Полученные результаты по механизму узнавания и расщепления субстратов эндонуклеазамп рестрикции М\-а1 и Есойи представляют интерес для понимания общих принципов белково-нуклеинового взаимодействия. Данные о расщеплении этими ферментами ДШС-дуплексов, содержащих в участке узнавания остатки т5ас, т4дс и т6аА,- а таю

некошлементарные аа, во- и тт-пары могут быть использованы з генетической инженерии.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на ГП Международном симпозиуме по химии нуклеиновых кислот и их когаонен-тов (г.Бехинь, ЧССР, 1987), на Ш Всесоюзном совещании по органической химии ДЖ-дуплексов (г.Тбилиси, 1987), на У Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (г.Юрмала, 1987) и на конференции молодых учёных Мекфакультетскг/й проблемной НИЛ им. А.Н.Белозерского МГУ (г.Москва, 1937).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 рг^от.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (168 ссылок), содертга 27 рисунков и 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и методы

В работе использованы коммерческие препараты эндонуклеаз рестрикции ЕсоИИ (Олайнский завод химреактивов) и Муа! (ШО "Фермент", г.Вильнюс). Препарат ЕсоНИ был дополнительно очищен -в Институте медицинской энзимологии АМН СССР Никольской И.И. и сотр. Субстраты I, П, 1У-1Ув, У, У1, УП-УПб, УШ-УТДи, Шл и УШн (табл.1) предоставлены сотрудниками кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ, ДНК-дуплексы УТШс и УШл - Буткусом В.В. (НПО "Фермент"), остальные субстраты синтезированы автором при при участии Орецкой Т.С. и Ломакина А.И.

5»-концевую 32Р-метку вводили поочерёдно в оба тяжа ДНК-дуплексов 1-Шз и УЛ-УШн. В случае ДНК-дуплексов конкатемерного типа (1У-У1)- Р~метка находилась в обеих цепях субстратов по стыкам составляющих их нонануклеотидных блоков. Гидролиз рестрикта-зой ЕсойП проводили в 10 мкл 40 мМ буфера трис-нс1, рН 7,6, содержащего 50 мМ КаС1, 5 Ш МеС12, 7 мМ дитиотреитол (буфер А) и 0,1-0,4 ед. акт. фермента (концентрация 1,1.Ю"7М). Гидролиз ферментом МуаI проводили в 10 мкл 10мМ буфера трис-нс1, рН 8,5, содержащего 15 мМ МеС12, Х5И мМ ЫаС1, I мМ дитиотреитол, 100 мкг/ мл альбумин (буфер Б) и 0,04-60 ед. акт. фермента (концентрация 2,2.10" - 1,6.10" М). Концентрация субстратов в расчёте на дуплекс, Ср, составляла 4.10"8- 7.Ю"7 М. Реакцию проводили в течение 1-120 минут ирл 20 или 37 °С. Анализ продуктов гидролиза

Таблица I

Сиитетпческпо JtK-душюксы, содержащие природные ила модифицированные участки узнавания ферментов EcoRIl и Uval.

15 Д!Е^-дупле:-:с Je ДНК-дуплекс

Т 2 3 4

I (5'-3') AATGCCÏGGCAT2 1' (3'-5') TïÂcGGACСGTAÀ УП AACCTACCTGGTGGÏ TGGÂTGGÂCCÂCCÂ

П ■ GCCAACCTGGCTCT CGGÏTGGACCGAGÂ УПа ...C-C-xI-G-G... 2) * < » « « « 0»G-G—А-С—С••,

ш GATGCTGCCAACCTGGCTCTAGC2ÏCATAC УПб * #fC—G—î—G—G« «•

CTACGACGGTTGGACCGAGATCGAAGTATG •, •G-G-A-C-0•••

Ша ...C-A-A-C-C pï-G-G...2) УШ ACCTACC2GGTGGT

.. .G-T-T-G-G—A-C-C... ÏGGATGGACCACCA

Ш б .. .C-A-A-C-C-T-G-G... ...G-T-ïï-G-G-Âp C-C... УШа . ..C-Cpp2-G-G... 2) • • •G-G—А-С-С•« «

Шв ...C-A-A-C-C-T-G-G... ...G-T-T-G-G-Â C-C... УИМ ...C-CpîîiCHoJçKpï-G-Q... • • í. ¿ « • • ...G-G--A-C-C...

Шг ...C A-A-C-C-ï-G-G... ...G-T-î-G-G-À-C-C... УШв ...C-C-rtf-G-G... ...C—G—А—С—С • • «

Щд • ••С —A-A~C —С G—G • • • ...G-î-T-G-C-A-C-C... Mr .. .C-CpîI(CH2)3îïpG-G.. .

Шо ...C-A-A-C-C-Î-G-G... ...G-T-T-C-G C-C... УЩд ...G-GpCKCÍÍ^OpC-C...

№ж ...C-A-A-C-C-G-G... i..G-i-T-G-G-A-C-C... УШо ...C-C-fl5U-G-G... ...G-G-À-C-C...

lib ...C-A-A-C-C-T-G-G... • * • • • • • ...G-T-T-G-G-C-C... УШз ...C-n5C-í-G-G... ...G-G-Á-n5C-C...

и ...TCCAGGAGCTCCTGGAATTCCAGGAG... .. .ÁGGTCCXCGJLGGÁCCÉTÁÁGGÍCCÍO ... УШ з • • «C-ni^C-T-G-G. « • ...G-G-À-C-C...

1Уа ...TCCAGGAGCTCCUGGAAÏ... ...AGGÛéçicGÂGcÀcCîiÂ... УШи « • •C-C-Ï-—-G-G••» ...G-G-Á-m5C-C...

176 . . .TCC-AGGACC2CCbr5UGGAAÏ. .. m. «;••••*.......... ...AGGtï^UCCÏCGAGG-ÏCCÎTA... УШк ■ ...m^C-C-T-G-C-... • • * • • ... G-G-A-C-C...

Таблица I (продолжение)

I 2 3 4

ЗУв . . ЛССАС—С-АССТт5ССТОбААТ... • •••• •••••••• ...АйвТСт СТСйА—бвАССТТА... УШл .. .С—С—Т—0*™—и... .... .. ...О-й-А-С-ш С...

у .. .ТССТСОААТТССТОСгААМССТОСАА... УШм .. .С-С-Т-Б-Б...

. . .АСатССТТААССТССТТААОИССТТ... . . (С . . . ...с-а-и^А-с-с...

71 . . .ТССАССАСгСТССАОСАССТССАСбАС}... ...АСаАССТСаАСОАССТССАбаАССТС... УШн ...0-0-1-1-0... ...С-Ц-А-С-С...

1) Здесь .и далее префикс d (дезокси) опущен, направление связей во всех дуплексах такое ~:е кг:с.в дуплексе л.

2) Изображены только модифицируемые фрагменты молекул, остальные их части идентичны немодафицировгнным субстратам Ш, УП и УШ соответствешо.

проводами методом электрофореза в 20% полпакркламидноы геле, содержащем 7 М мочевину. После проведения авторадиографш из геля вырезали зоны, соответствующие исходному материалу и продуктам гидролиза. Их радиоактивность измеряли методом счёта по Черенко-ву. Для ДНК-дуплексов 1У-У1 рассчитывали относительное содержание каждого из продуктов реакции по массе и степень гидролиза субстрата (Уо1оу ег а1, 1985). Степень гидролиза остальных ДНК-дуплексов определяли отдельно для каждой цепи как отношение радиоактивности продукта гидролиза к суммарной радиоактивности продукта и нерасщепленного субстрата. На основании этих данных рассчитывали кинетические параметры ферментативной реакции.

2. Синтез и свойства субстратов «-

9-16-звеннце олигонуклеотиди, необходимые для получения ДНК-дуплексов Щ-Шз, синтезировали триэфирным методом в растворо и на целлюлозных дисках па автомате-синтезаторе "Виктория-2". Затем с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы собирали отдельпо 21, 29 и 30 -звенные тяжи этих субстратов. Комбинируя олигонуклеотиды различной длины, получали ДНК-дуплексы Ш-Шз, в которых "разорвана" фосфодиэфирная связь,'.удалена фосфатная группа или нуклеоти-дное звено.

Для определения термической устойчивости ряда ДНК-дуплексов и оценки влцягал звздёшшх шдпфикаций на структуру двойной спирали были, исио^золаш методы Уй-сиектроскопии и КД. Согласно

результатам нашего исследования, а также данным ромовой и др., Кузнецовой и др., Тпл субстратов I-Шг, ЗУ, У, У1, УШ, УШг-УШн лета1 в интервале от 33 до 84°С (буфер А или буфер В - 0,015 M цит-ратный, рН 7,25, содержащий 0,15 H Nad, концентрация дуплексов в расчёте на нуялеотидное звено, см, 7,5. КГ6 - 3,0.Ю-4 Ш. С учётом этого гвдролаз ДНК-дуплексов ферментами рестрикции проводили в условиях, когда субстраты сохраняют двуспиральнуп форму. _Данные КД для ДЖ-дупдексов УШ, УЕл-УШн (буфер В, cN 4.Ю-4 - 5." 10"- Ы, 20°С) свидетельствуют о незначительных конформационных измепени- ■ ях, икдуцируе;.ых заменой остатков de, ¿A к dG на остатки m^dc, ¡a6dA и di соответственно. Аналогичные результаты были получены для ДОч-дуплексов УЫа, УШг-УЛ!й ранее в нааей лаборатории.

3. Влияние нуклсотстгкх угослетовательностеи, гаталкируших

. участок уз?'рт)я.нит, на взаимодействие энггопуклоаз тюст-ргкщщ nooriil и ;.:vaT с ]Щ

Дчя оценки влияния фрагментов Д1Ж, примыкающих к участку узнавания эндонуклеаз Hvai и EcoRli, на функционирование этих ферментов испол!зовали дуплексы I-Ш и УШ, в которых последовательности, фланкирующие участок узнавания, отличаются по длине и нукле-отидному составу. 14-звенный субстрат П, представляющий собой це-нтраяышй фрагмент 30-звенпого ЗШК-дуплекса Ш, эффективно расщепляется эндснуклеазой рестрикции EcoRli (рис.la). Следовательно, для протекания .ферментативной реакции достаточно, чтобы фланклру-кцие последовательности составляли 4-5 нуклеотвдпых пар с обеих агорой участка узнавания EcoRli. Однако, согласно нашел данным, K^ для субстрата Ш (4,6.ÏO"7 M) на два порядка mise по сравнению с K}ij для 14-звзнного дуплекса (Вшюгргдоза и др., I9S7). По-видимому, з случае фермента Егони длина ДпК-дуплекса, нообходиглая для образования полноценного фермент-субстратного комплекса, превышает 14 нуклеотидных пар.

Для эндонуклеаз EcoRli и Uval наблюдается влияние нуклеоти-дного окруяенпя участка узнавания на скорость гидролиза ДНК-дуп-лексоз одинаковой длины. Расщепление субстрата УШ характеризуется большей начальной скоростью по сравнению с дуплексом П (рис.1). Этот эффект может быть обусловлен особой A-подобной структурой дуплекса УШ, которая, возмокно, облегчает гидролиз соответствующих фосфодизфирных связей эндонуклеазами EcoRli и uval.

а (3

Рис.1. Расщепление ДНК-дуплексов П, Ш и УШ (ст) 3.5.I0"7 М) эндо-нуклеазами EcoRll, 0,4 ед. акт. (a) nEvai, 2 ед. акт. СоJ при 37"С.--Т-депь,-----А-цепь.

Как видно из рис.1а, фермзнт ЕсоНИ гддролнзует Т- и А-цепи (названы по центральным куклеоглдным звеньям участка узнавания) в дуплексах П, III и УШ с различными скоростями. Эффект предпочтительного расщепления одной из цепей субстрата монет быть связан с влиянием нуклеотиднкх последовательностей, фланкирующих участок узнавания, и/или с нарушением полной симметрии участка узнавания из-за вырожденности по центральной нуклеотидной паре (Виноградова и др. , 1987). Гидролиз Т- и A-целей ъ субстрате I, в котором нуклеотпднке фрагменты, примыкающие к участку узнавания, идентичны, протекает с одинаковой скоростью. Следовательно, наблюдаемое различие в расщеплении Т- я А-цепей ДГЖ-д^плексов П, Ш и УН обусловлено только влиянием фланкирующих последовательностей па взаимодействие фермента EcoRll с субстратом. В случае эндонукле-азы í.'vai A-цепь дуплекса I гидролизуется с большей начальной скоростью по сравнению с Т-цепьго этого субстрата. Таким образом, эффективность расщепления отдельных цепей субстратов,П, Ш и УШ (рис. 16) ферментом Mvai определяется совокупностью обоих указа-шых выше факторов. Различие в скоростях гидролиза отдельных тетей дуплекса I эндонуклеазой uval, по-видимому, связано с неэквивалентностью расщепляемых узлов в А- и Т-цепях субстрата.

Следовательно, в отличие от Есойи, фермент Ша1 отличает оста-то:: ад от остатка <11 в узнаваемой последовательности ДНК.

При анализе расщепления дуплексов Пий эндонуклеазой Нуа1 впервые дош ферментов рестрикции была обнаружена зависимость характера гидролиза отдельных цепей субстрата от длины фрагментов ДИК, примыкающих к участку узнавания. А-цепь дуплекса П гидроли-оуется с большей эффективностью, чем Т-цепь во всём временном интервала. Начальная скорость расщепления А-цепи в субстрате Ш так-ло вше, чем Т-цепи, однако через короткий промежуток времени скорость гидролиза А-цепи резко падает (рис.16,2).

Рис.2. Расщепление ДНК-дуплексов Ш (1-цепь Т, 2-цепь А, 3-цепь А после добавления Т-цепи через I час), Ша (4-цепь А), Шб (5~цепь Т) к Ив (6-цепь Т) зндонуклеазой Муа1, 24 ед. акт.. 20°С, Сп 1,6.10~7 М.

О 20 40 60 80 100 120 ИМ

В результате чераз I час после начала инкубации в реакционной смеси, наряду с продуктами полного гидролиза ДНК-дуплекса Ш, накапливается интермедиа! с разрывом только в Т-цепи. Сравнительное изучение расщепления дуплексов Ша и Шб, которые могут рассматриваться как промедутошше-продукты гидролиза субстрата Ш, показало, что ДШх-дащщс.-с .разрывом в Т-цепи менее эффективно взаимодействуете^фрргдантш .Муа1, чем субстрат с разрывом в А-цепи (рис..2,-табл.2). Это приводит к наблюдаемому увеличению скорости, расщепления Т-цепи и янгибировашш расщепления А-цепи душгокса Ш.

■ 4. Взаимодействие эндонуклеаз тэееттакшга ЕсойП и Муа! с углеводфосфгднкм остовом участка_узнавания

С целью выявления возмогннх электростатических контактов зн-донуклеаз есойи и муаг с фосфатными грушами участка узнавания, а такке для выяснения влияния дефектов структуры углезодфосфатного остова на функционирование этих ферментов были изучены субстратные свойства ДНК-дуплексов Ша-Шг, УПа, УШа-УШв. При взаимодействии фермента Есойи с дуплексом Шб, в котором в участке узнавания "разорвана" одна из фосфодиэйирных связей, наблюдается замедление скорости гидролиза ^модифицированной Т-цепи и блокирование гидролиза модифицированной А-цепи (табл.2). В случае эндонуклеазы Куа1 рассматриваемый разрыв совпадает с потенциальным местом расщепления субстрата этим ферментом. Обнаружено резкое увеличение скорости расщепления рестриктазой Мта1 некодафицарованной Т-цепи субстрата Шб по сравнению с интактным дуплексом Ш (рис.2). Таким образом, деформация вторичной структуры участка узнавания за счёт увеличения конформадионной яодвигности групп атомов в узле

Таблица 2

Расщепление модифицированных ДНК-дуплексов эндонуклеазами рестрикции 1Дуа1 и ЕсойИ.

ДНК- Относительная начальная скорость гптгоолиза днк- Относительная начальная скотзость* гидролиза й

дуп- К уа! ЕооНИ дуп- Муа! ЕсоНИ

лекс Г-цеиь А-цепь Т-цепь А-цепь лекс Г-цепь А-цепь Т-цепь А-цепь

Ш,ЗУ, УП,УШ 100 100 100 100 УПб • О4 ■ З2» - -

Ша - 18 - Щд 0 0 0 0

И!б >100 - " 3 •о Ше 0 0 0 0

Шв >100 _ 3 0 Ша 0 0 0 0

Шг - - 2 6 Шз 0 0 0 0

УШа 0 100 0 0 У1Пг .0 9 0 0

УШб 0й 65я 0 . 0 УЩд '97* 0 0

УШв 100 46 - - УНк 0 110 0 0

УПа 77 4 - - Жл 89 0 0 0

У 77:* — УШ 99 й 0* I 3

71 0 - УШн 90" 39" 31 30

1) Для ДНК-дуплексов Ша-Шз, УПа-УПбл УШа-УЩд и УШктУШн дагшые приведены относительно соответствующей цепи немодифицирова:шцх дуплексов Ш, УП и УШ; для ДПК-дуплексов У и У1-относительно субстрата

и •

2) Приведены относительные степе!ш гидролиза за 60 шнут.

ю

ü.'Ap с.'."! по-разному влияет на функционирование эндонуклеаз EcoRll и Mvai. Искажение структуры в месте разрыва, вероятно, приводит к нарушению белково-нуклеиновых контактов, необходимых для узнавания субстрата ферментом EcoRll, причём в первую очередь нарушаются контакты с А-цепью.

На рис.3 суммирована информация о роли отдельных фосфатных -'?упп во -взаимодействии с эндонуклеазами EcoRll и Mvai.

Mv al

,0 и

5' . . .pCpCpTpGpG.,. 3' • • • é •

3'... CpGpApCpCp...5*

д{

Рис.3.- Влияние модификации межнуклеотидных узлов в участке узнавания на взаимодействие эндонуклеаз рестрикции EcoRll и Mvai с субстратами: а, д - удаление фосфатной группы из мекнуклеотидного узла; ф , л - замена фосфодиэйирной связи на пирофосфатную ( ▲, ф н д , () - влияние модификации на гидролиз немодифицированной цеди имеется или отсутствует соответственно, расщепления модифицированной цепи в обоих случаях не происходит); И - замена остатка ат на dxT (замедление гидролиза немодифицированной цепи при отсутствии ингибирования расщепления модифицированной цепи).

Сравнение кинетики гидролиза ферментом EcoRll дуплекса Шб и дуплекса Шв, в котором из места разрыва удалена фосфатная группа, по-кззало, что картина расщепления этих двух субстратов очень близка (табл.2). Следовательно, отсутствие указанной фосфатной группы не влияет на расщепление оадонуклеазой EcoRll Т-цешг в дуплексе Шв. Удаление 5'-фосфатной группы из потенциального места расщепления субстрата ферментом EcoRll приводило к блокированию гидролиза немодифицированной цепи (Yolov et al, 1984). Удаление фосфатной группы из межнуклоотидного узла,гидролизуемого эндонуклеазой uval в A-цепи (субстрат Шв), напротив, не влияет на расщепление ферментом Uval фосфодиэфирной связи в Т-цепи (рис.2). Таким образом, контакт с этой группой не существенен для взаимодействия эндонук-леазы рестрикции Uval с противоположной цепью ДНК-дуплекса. Отсутствие фосфатной группы в последовательности, примыкающей к участку узнавания EcoRll (дуплекс Шг), приводит к замедлению действия этого фермента (табл.2). Из этого следует, что эндснуклеаза EcoRll взаимодействует • с двойной спиралью ДНК и вне участка узнавания.

Hai.ni также изучено влияние модификации мешуклеотидных фос-

EcoRII

Р ❖

5'••IpCpCpTpGpG... 3'

3*... GpGpApCpCp...5' Д At

фатных груш на функционирование ферментов EcoRii л r.:vai. Эздону-клеаза EcoRii не расщепляет ни одну из цепей ДНК-дуплекса УШа (табл.2), в котором одна из фосфодиэфнрннх связей в центре участка узнавания заменена на пирсфосфатпую. Возмолшо, что блокирова-■ ние гидролиза дуплекса УШа рестриктазой EcoRix является следствием нарушения электростатического контакта этого фермента с фосфатной группой, подвергшейся модификации. ДНК-дуплекс УШб с другим ' типом модификации этой та фосфатной группы - этилевдиашнной вставкой менду остатками de и ат в участке узназания-такме не расщепляется эндонуклеазой рестрикции EooRil (табл.2).

При изучении расщепления субстратов УШа и УШб эндонуклеазой Mvai следует учитывать, что модифицированная фосфодиэфирная связь находится в расщепляемом межнуклеотидном узле. Как и в случае дру~ па изученных ранее в нашей лаборатории рестриктаз, замена фосфо-диэфкрной связи на пирофосфатную приводит к блокированию гидролиза модифицированной цепи эндонуклеазой iival. Отличительной особенностью фермента Uval является его способность расщеплять немоди-фицированную цепь субстратов УШа и УШб практически с той не эффективностью, что и соответствующую цепь дуплекса УШ (табл.2, рис.4).

Рис.4. Радиоавтограф гель-электрофореза продуктов расщепления ДНК-дуплексов УШ и УШа (CD 3,5. Ю-7 Ы) эндонуклеазой Uval, 24 ед. акт.(, 20°С. 5'-32Р-метка находится в "f-'' цепи (А) или в A-цепи (Б) дуплексов. Время реакции (мин) указано над колонками геля. ВРВ - положение бромфенолового синего.

Таким образом, электростатический контакт эндонуклеазы рестрикции Mval с фосфатной группой расщепляемого иатауклеотпдного узла несущественен для гидролиза противоположной цели (рис.3).

В ДНК-дуплексах УПа и УШв остаток di в участке узнавшей фермента Mval заменён на остаток dxi или ги. Согласно литературным " данным, введение остатка ru (сз-эндо-конформация фуранозы) сопровождается локальным искажением В-формы двойной спирали, обусловленным появлением домена с конформацией , подобной jl-форме. Дня остатка dxl в составе короткихДйи<-душгоксов предполагается С2' -эндо-конформация углеводного цикла, характерная для В-формы ДНК

УШ УШа

А А Б О 60 О 60 О 60

ВРВг

esss> _

«згэ

а^тович, 1988). Вместо с тем, обращение конфигурации З'-гидрок-сшхыюй группы фуранозы в случае остатка dxE доляно приводить к значительно;^ нарушению ориентации фосфатной группы в у зло ...SpG... Аномальная dA-rU-napa но препятствует эффективному взаимодействию растриктазы Mval с ДЕК-дуплексом УШв. Однако гидролиз этого субстрата носит необычный характер: наблюдается незначительное инги-бгрование расщепления только ^модифицированной цепи дуплекса УШв, шдпфщд11розачнач цепь расщепляется с той ;:;е начальной скоростью, что и 7-цепь субстрата УШ. Обнаруженный эффект особенно ярко вира^« в случае 13Ж-дуплокса УПа (табл.2). Наблюдаемое влияние модификации в Т-цепи субстрата УПа и УШз на расщепление немодифици-рованной А-цепп свидетельствует о взаимодействии эндонуклеазы рестрикция Uval с обеими цепями ДНК-дуплокса. Необычный характер гидролиза дуплексов "Па и УШв шлют быть связан с vom, что для расщепления фосфодяэфирной связи в А-цешг субстрата одной из субъ-едтшиц фермента lívul. необходим электростатический контакт этой субъединицы с фосфатной группой, расположенной могду остатками di и dG в Т-цепп субстрата.

5. эндонуклеапой

.-лдопуклеаза рестрикции ыолет совершать два разрыва в ДНК а составе одного формент-субстратпого комплекса или диссоциировать после совершеши разрыва в одной из цепей субстрата. Из анализа расщепления дуплексов I-UI ферментом Mval следует, что расщепление фосфодиэфирных связей в двух цепях субстрата происходит не одновременно, а через два одаоцепочечных разрыва. Эндонуклеаза рестрикции üivoi таксе способна расщеплять специальпо'-'сконструиро-вшншо субстраты, в которых разрыв одной из расщепляемых ферментом связей блокирован (дуплекс УШа) или, наоборот, одна цепь yaco расщеплена (дуплексы Ша и Шб).

При гидролизе 30-звонного ДНК-дуплекса Ы ферментом Uval в ходе реакции наблюдалось накопление продукта с разрывом в Т-цепи (рис.2). Следовательно, ферментативная реакция протекает по дву-стадш'Шсцу механизму, то есть с диссоциацией эндонуклеазы Uval после совершегшя разрыва в одной из цепей. Этот вывод подтверзда-ется следующим экспериментом. К иативному субстрату Ш через I час после начала инкубации, когда Т-цепь расщеплена практически нацело, а А-цепь - примерно на 60$, добавили Т-цепь в количестве, ра-

вном первоначальному. При этом наблюдалось увеличение скорости гидролиза Л-цепи (рис.2), Полученный результат связан с тем, что фермент Mval эффективно расщепляет вновь появляющийся в реакционной смесп дуплекс Ш, образование которого возмогло только при ус- ловил диссоциации комплекса эндокукдеаза рестрикции - интермедиа! с разрывом в одной из цепей. При взаимодействии эндонуклеазы Uval с ДИК-дуплексами УШа, УЩц, УШк-УШм наблюдается блокировала гидролиза модифицированной цепи, в то врет,я как немодпфицирован-ная цепь расщепляется с высокой эффективностью (табл.2). Эти данные таклео свидетельствуют о протекании ферментативной реакция с участием эндонуклеазы рестрикции "val по двустадийному механизму. 3 случае эпдопуклоазц SooRii любая модификация в одной из цепей участка узнавания вызывает дкглбнроваше гидролиза обеих целой субстрата (табл.2; ïolov ot al, 1985, Виноградова :: др., 1987). На основании этих фактов ранее било высказало предположение о том, что гидролиз двух цепей ДНК рестрлктазой ЕсоПИ происходит в составе одного фермспт-субстрзтного комплекса.

6. В?а'Я/:одейс'',1?т;г>.. пчдо?ггклояп •роеттопя.тта с i ]<НК-дуплексами. прт'тсплпчаптягцгго наш

Замена АТ-яары в участке узнавания "val рядом с -местом расцепления на ТТ-пару (дуплекс У) приводит к незначительному пони-;:сонкэ степени гидролиза по сравнению с номоднфивзфозанкым субстратом ЗУ, в то время как введение АА-пары (дуплекс 71) блокирует ферментативный гидролиз (табл.2). Эффективное расцепление поллме-ра У и замедление гидролиза субстрата 71 наблюдалось намл з слу- . чае эндонуклеазы рестрикции Ssoll, которая узнаёт любой из четырёх нуклеотцщшх остатков в центральном положении участка узнавания (•"'аШл'").!! в случае йссмента Есопп (Xolov et al, 1984).

.. .иьлоц,. . »

Полученные результаты, на паи; взгляд, связан с более значительным в случае АЛ-пары (по сравнению с ТТ-парой) отклонением структуры двойной спирали от классической В~формы (Arnold et al, 1987).

Замена внутреннего остатка на остаток dG в Т-цепп участка узнавания эндонуклеазы Uval приводит к блокированию расцепления модифицированной цепи ДШ{-дуплекса УПб; гидролиз немодифицирован-ной цепи протекает с низкой эффективностью (табл.2),. Вероятно, и в этом случае причиной ннгибированкя ферментативного гидролиза является локальное искажение структуры двойной спирали в районе

некомплементарной GG-пары.

7. ДНК-дуплексы о нуклеотидннми делениями в реакциях с эндонуклеазами рестрикции BcoRii и Mval

Для выяснения роли каждого из нуклеотидных звеньев вырозден-ной АТ-пары участка узнавания использовали субстраты Щц-Шз, УШг и УЩд, в которых из узнаваемой ферментами EcoRli и Mval нуклеотид-ной последовательности удалено центральное нуклеотвдное звено или нуклеозидный остаток заменён на триметшгеновый мостик.- Использование протяжённых 30-звенных ДНК-дуплексов или проведение ферментативных реакций при пониженной температуре позволяет уменьшить дестабилизацию двойной спирали, возникающую при модификациях такого рода. Кроме того, применяя набор субстратов с разноплановыми модификациями одного и того же структурного фрагмента ДНК, можно сделать предположение об участии этого фрагмента в белково-нуклеиновом взаимодействии. Эндонуклеаза рестрикции EcoRli не расщепляет ДНК-дуплексы Щц-Шз и УШг (табл.2). Следовательно, наличие немодифицированного центрального нуклеотидного звена pdTp или pdAp в каждой из цепей участка узнавания необходимо для продуктивного взаимодействия фермента EcoRli с субстратом. Дуплекс УЩц также не расщепляется эццонуклеазой EcoRli (табл.2). Вероятен контакт этого фермента с остатком dA участка узнавания.

В случав эндонуклеазы рестрикции Mval было установлено, что не звено pdTp или pdAp, а звено dip или dAp играет существенную роль во взаимодействии этого фермента с ДНК. Сам по себе разрыв фосфодиэфирной связи рядом с центральной АТ-парой участка узнавания (субстраты Ша и Шб) или даже удаление либо модификация фосфатных групп, .примыкающих с 5'-конца к остатку dA (субстрат Шв) или dT (субстраты УШа и УШб), не вызывает блокирования расщепления немодифицированных цепей ДНК-дуплексов. В то же время, гидролиз субстратов Щц-Шз отсутствует (табл.2). Низкая эффективность гидролиза дуплекса УШг может быть обусловлена как' нарушением специфических контактов фермента Mval с остатком dT, так и заменой фосфодиэфирной связи, примыкающей с 3»-конца к остатку dT, на фосфоамвдную. Результаты расщепления ДЖ-дуплекса УЩц (табл.2) свидетельствуют о наличии контакта эндонуклеазы рестрикции Mval с остатком dA. В отличие от эндонуклеазы EcoRli, в случае фермента Mval это взаимодействие необходимо только для расщепления А-це-пи субстрата, в то время как гидролиз Т-цепи осуществляется неза-

висимо от него.

8. Роль отдельных групп атомов гетероциклических оснований участка узнавания во взаимодействии эндонуклеаз тзесттзи-• ядт Mval и EcoRTT с ДНК

Наличие гидрофобного контакта эндонуклеазы рестрикции с СНд-группой остатка dT можно установить, модифицируя этот остаток путём удаления CHg-группы (субстрат ЗУа) или замещения её на атом фтора (субстрат УШе) или брома (субстрат Пб). Дуплексы 1Уа и УШе расщепляются ферментом Uval так же эффективно, как и немодифици-рованные субстраты 1У (рис.5) и УШ соответственно.

!У Па 1У6 Г/в

о 10 60 о 10 60 О 10 60 о 10 60

* ч

за -»а

—as» «•ей

ta ««а "т®

=*ьЗ

re ,_ —лаэ

ваэСИЭ —'в—' .

31 67 32 77 53 26 67

Рис.5. Радиоавтограф гель-электрофореза продуктов расщепления ДНК-дуплексов 1У-1Ув <cN 8,8.Ю-6 М) эндонуклеазой Uval, 0,04 ед. акт., 37°С. Над колонками геля указано время реакции (мин), под колонками - степень гидролиза (£). ХС - положение ксиленцианола.

Эти результаты исключают возможность гидрофобного контакта реет-

риктазы Mval с CHg-группой остатка di. В отличие от эндонуклеазы Mvai, фермент рестрикции EcoRli взаимодействует с СН3-группой остатка di участка узнавания (¥oiov et al, 1985). Замена остатка di на остаток br5du приводит к замедлению расщепления ДНК-дуплекса ТУ б ферментом Mval примерно в 1,5 раза по сравнению с немодифицн-ровакным субстратом ЗУ (рис.5). Ингибирующий эффект, по-видимому, является результатом стерических препятствий, которые создаёт расположенный рядом с местом разрезания атом брома, тлеющий больший ковалентный радиус, чем СН3-группа.

С целью выявления возможных контактов эндонуклеазы рестрикции Mval с атомами водорода в пятом положении цитозиновых звеньев участка узнавания, изучали взаимодействие этого фермента с субстратами ТУ в, УШя-УШи, в которых остатки de в участке узнавания заменены на остатки яёйс. Гидролиз полимера ЗУв протекает с той же эффективностью, что и дуплекса ЗУ. Сравнение величин Kj} (табл. 3), полученных для, субстратов УШ и УШж-УШи, показывает, что заме-

Таблица 3

Кинетические параметры, характеризующие взаимодействие эндо-

нуклеазы рестрикции Mval с ДНК-дуплексами, содержащими остатки m^dc в участке узнавания

ДНК-дуплекс км, ю- v--- ' ы v Maitc 10~й Ы

Т-цепь А-цепь Т-цепь А-цепь

УШ 2,1 ± 0,2 2,0 ± 0,2 1,17 + 0,09 1,03 ± 0,04

УШж 1,8 ± ОД 1,9 + 0,6 1,00 ± 0,05 1,0 + 0,3

УШз 1,5 ± 0,1 ,1,8 + 0,1 1,07 + 0,04 0,55 ± 0,04

УШи 1,7 ± 0,3 2,0 + 0,6 0,6 ± 0,1 1,58 + 0,48

на второго с 5»-конца остатка йс в участке узнавания на остаток т^С в одной или обеих цепях ДНК-дуплекса УШ не приводит к существенному изменению этого параметра и, следовательно, не влияет я а сродство фермента Муа1 к субстрату. Значения УнакС дня мода-филированных цепей полукетилированных субстратов УШз и УШн, а также для обеих цепей "полностью" метилированного субстрата УШж практически совпадают с величинами умакс дай соответствующих цепей немодифицнрованного субстрата УШ. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии непосредственных контактов эндонуклеазы рестрикции МуаХ • с атомами водорода в пятом положении рассматривав-

ынх остатков de участка узнавания. ^модифицированных це-

пей полуметилированкых субстратов УШз и УШл имеют меньшую величину, чем vMaKC соответствующих цепей субстрата УШ (табл.3). Таким образом, как и в случае ДНК-душгексоз УШа и УШз, содержащих остатки п rü в участке узнавания, ингибируется расщеплете только ^модифицированной цепи.

Метилирование скзоцгжлической аминогруппы второго с 5'-конца остатка de в одной из цепей участка узнавания приводит к блокированию расщепления обеих цепей ДНК эндонуклеазой Kvsl (Butkus et al, 1985). На наш взгляд, это свидетельствует о контакте (или сближении) эндонуклеазы рестрикции Uval с аминогруппами внутренних остатков de участка узнавания. Моано предположить существование аналогичного взаимодействия фермента Uval с экзоциклическима ами-ногруппади внешних остатков de и остатка dA узнаваемой нуклеотид-пой последовательности. Для проверки этой гипотезы были сконструированы ДНК-дуплексы УШк-УШм, в которых остаток de заменен на остаток z^dc, а остаток dA - на остаток sfi&L. Зндонуклеаза рестрикция Eval но гидролизует кодифицированные цепи ДНК-дуплексов УШк-УШм, но ¡эффективно расщепляет немо,¡скицированные цепи этих субстратов (табл.2). По-видимому, фермент Uval специфически взаимодействует с аминогруппами модифицируемых остатков dC и остатка dA участка узнавания. Однако в отлично от аналогичного контакта с 4-i.TH2~rpynnon внутреннего остатка ¿с, наличие контакта Uval с 4-Ш2-груштой внешнего остатка з одной из цепей субстрата необходимо для расцепления только этой цепи ДНК-дуплекса, а гидролиз другой, цепи протекает независимо от осуществления этого контакта. Нарушение специфического взаимодействия эндонуклеазы Uval с остатком dji также не влияет на протекание гидролиза противоположной ^модифицированной цепи.

По данным Буткуса и др.? ДНК, модифицированная мотдлазоч Mvai по четвёртому положению внутреннего остатка de участка узнавания, не расщепляется эндонуклеазой рестрикции EcoRII. Нами показано, что метилирование аминогруппы внешнего остатка ас в одной из цепей участка узнавания или аминогруппы остатка dA также приводит к значительному ннгибировгыню расщепления обеих цепей ДНК-дуплексов УШк-УШм ферментом EooRir (табл.2). Эти результаты свидетельствует о сближении эндонуклеазы EcoRII с экзоциклическимп аминогруппами остатков de и dA участка узнавания.

Замена остатка dG, соседнего с центральны!/, остатком dT уча-

огйэ. узнавания ферментов Муа! и Есойн, на остаток еи (дуплекс УШн), с одровоадается удалением'2-1Ш2-грушш, экспонированной в малую бороздку двойной спирали. Контакт эндонуклеазы Есони с 2-ин2-группой рассматриваемого остатка маловероятен, т.к. наблюдается лишь небольшое замедление скорости гидролиза обеих цепей субстрата УШн этим ферментом. В случае эндонуклеазы Муа! отмечено замедление скорости гидролиза только немодифицированной цепи субстрата УШн (табл.2). Этот эффект аналогичен наблюдаемо^ для ДНК-дуплексов УПа и УШв. Таким образом, эндонуклеаза. рестрикции Муи1 не образует контакт с расположенной в малой бороздке аминогруппой внутреннего остатка ае участка узнавания. Однако её удаление косвенно влияет на взаимодействие фермента Муа1 с рассматриваемым остатком ав либо с примыкающей к нему с 5»-конца фосфатной группой-

Mval

4-МНг

-1- nh>

[S;CHsj

'JSßBJJ

G V

1-MHä

EcoRII

4-NHj

5-H

-t-NHt 5-H

5-СНз

g-JJHjj

s-h

3'

G

6-NHz

Рис.6. Схема возможных контактов эндонуклеаз рестрикции tival (а) и EcoRII (б) с группами атомов гетероциклических оснований участка узнавания.[""*]- группы атомов, не участвующие во взаимодействуй с ферментом.(Привлечены также литературные данные).

На рис.6 суммированы результаты изучения роли отдельных групп атомов гетероциклических ^оснований участка узнавания во взаимодействии эндонуклеаз рестрикции Mval и EcoRII с да. Оба фермента формируют контакты с участком узнавания в большой бороздке двойной спирали ДНК. Данные по расщеплению дуплексов УШк и УЖл, а также УШз и УШн (табл.2 и 3; Виноградова и др., 1987) свидетельствуют в пользу симметричного характера контактов эндонуклеаз

5

с

с

с

т

G

С

EcoRll и Hvai с асимметричным участком узнавания.

9. Пшотетическая модель узнавания ДНК эклокуклеазой •рестрикции Mval

Согласно данным о субъединичной структуре эндонуклеазы рестрикции Mvai (Овечкина и др., 1988) этот белок представляет собой-мономер, который дикеризуется при связывании с субстратом. Исходя из изложенных выше фактов, основные черты гипотетического иехарл-з:ла взаимодействия эндонуклеазы рестрикции Mval с участком узнавания могут быть представлены следующим образом. Каздая субъединица фермента взаимодействует с обеими цепями ДНК-дуплекса. Зто следует из обнаруженного влияния модификации з одной из цепей субстратов УПа, УШв, УШз, УШи и УН1я на расщепление друтой, неподи-фицированной цепи (табл.2, 3). Эффективный гидролиз эндоиуклеазой Mval немодифпцкрованной цепи субстратов УЩц, УШк-УШм при отсутствии продуктивного взаимодействия с модифицированной цепью свидетельствует о том, что каздая субъединкца фермента формирует специфические контакты только с одной цепью ДНК (например, с экзода-клическиш аминогруппами остатков de и dA в A-цепи участка узнавания) и гидролизуе.т фосфодиэфирную связь, находящуюся именно в этой цепи субстрата. В то же время, эта субъедшшца осуществляет ряд дополнительных контактов с противоположной цепью Д?Ж-дуплекса (таг:, она, по-видимому, образует электростатический контакт с фосфатной группой медду остатками ¿i a íg в Т-цепи субстрата). Наблюдаемый эффект избирательного влияния модификации б одной из цепей ДНК-дуплексов УЦц, УШк-УШм только на гидролиз модифицированной цепи (табл.2) свидетельствует также о том, что две субъединицы эндонуклеазы рестрикции Mval фувкцкошгруш достаточно независимо.

10. Отпшаково ли работают кзотизометн?

На основании данных по расщеплению эндокуклеазами рестрикции EooRii и Uval одних и тех же кодофицированиых субстратов ныли установлено, что имеются принципиальные различия в механизме узна-а вания и расщепления этими ферментами последовательности "" gga¿o*" з ДНК. При взаимодействии эндонуклеаз рестрикции Uval и EcoRll с участком узнавания реализуются различные белково-нуклзиновке контакты (pwc.6). Любое изменение конформации участка узнавания, его гидрофобных свойств, введение в него дополнительных отрица-

тельных зарядов существенно лнгибирует гидролиз обеих цепей ДНК эндонуклеазой рестрикции EcoRlI. Фермент Uval в большинстве случаев нечувствителен к перечисленным модификациям. Гидролиз субстратов эндонуклеазой рестрикции Mvai может проходить по двуста-дийному механизму, в то время как рестриктаза EcoRlI расщепляет ДНК-дуллексн в состазе одного фермент-субстратного комплекса.

Вместе с тем, существуют некоторые общие принципы функционирования ферментоз рестрикции EcoRlI и Uval: взапмодействйе с обеими цепями участка узнавания; способность гидролизовать ДНК в одной цепи, несмотря на искусственный запрет расщепления другой цепи или если другат цепь уже расщеплена; необходимость центрального нуклеотпдного звена в любой из цепей участка узнавания для проявления ферментативной активности; влияние нуклеотидных последовательностей, прилегающих к участку узнавания, на скорость расщепления А- и Т-цепей субстрата.

ВЫВОДЫ

1. С целью установления механизма узнавания и расщепления ДНК эн-донуклеазами рестрикции Uval и EooRii изучено взаимодействие этцх ферментов с синтетическими субстратами различной длины, в том числе со структурными аномалиями в участкеузнавания. Осуществлён синтез 30-звенных субстратов.

2. Эвдонуклеаза рестрикции Mvai не расщепляет модифицированную цепь ДНК-дуплексов, в которых в участке узнавания один из внешних остаткоз ас заменён на т4ас, остаток аа. наткал, гндроли-зуемая фосфодиэфирная- связь на пирофосфатную, но с высокой эффективностью расщепляет ^модифицированную цепь этих субстратов. В случае эндонуклеазы EcoRlI метилирование экзоцикличес-ких аминогрупп внешних остатков ас и остатка ад. участка узнавания приводит к резкоцу замедлению гидролиза обеих цепей субстрата.

3. Обнаружен эфрект замедления расщепления эндонуклеазой Uval не-модифицированной цепи ДНК-дуплексов, содержащих остаток и^ас во втором, остатки ги ши ¿хт в третьем я остаток ai в четвёртом положении с 5'-конца участка узнавания, при отсутствии ингибирования гидролиза модифицированной цепи этих субстратов.

4. На основании анализа расщепления синтетических ДНК-дуплексов с различными типами модификаций участка узнавания выявлены группы атомов гетероциклических оснований и углеводфосфатного

остова ДЖ, которые вовлечены во взаимодействие (ш сблшкенн) с функциональными группами эндонуклеаз рестрикции Mvai и ваоШЕ. Показано, что контакты эндонуклеазы Mvai с участком узкавачия реализуются даже при изменении его электронных и гидрофобтсс свойств, а такге вторичной структуры.

5. Обнаружен необычный характер кинетики расщепления протяжённого ДЖ-душгекса эндонуклеазой рестрикции Líval, связанный с накоплением в реакционной смеси интермедиата с одноцепочечшм разрывом. Установлено, что гидролиз обеих цепей субстрата фермек-том Mvai молсет проходить по двустадийному механизму через стадию диссоциации фермент-субстратного комплекса после первого акта расщепления.

6. Структура нуклеотидных последовательностей, примыкающих к участку узнавания эндонуклеаз рестрикции Mvai и EcoRll, оказывает влияние на скорость расщепления этими ферментами отдельных цепей субстрата. С помощью' гсвазипалиндромного ДНК-дуплекса показано, что з отличие от эндонуклеазы рестрикции ЕеoRii, фермент uval отличает остаток üa. от остатка dï в узнаваемой последовательности ДЖ.

7. Установлено, что эндонуклеазы-изошнзомерн Mvai и EcoRll узнают и расщепляют одну и ту se последовательность ДЖ по различным механизмам.

Основные результаты диссертации излогазны в публикациях:

1. Орецкая Т.С., Кубарева Е.Л., Грязпоз С.1.1., Ломзкин А.И., Потапов В.К. Изменения в регламенте синтеза олигодезоксирибонукле-отидов на азтоматах-сиптезаторах "Виктория-2". л "Виктория-4М". - Химия природа, соедин., 1987, й I, с.153-155.

2. Кузнецова С.Л., Кубарева Е.Л., Орецкая Т.С., Долинная Н.Г., Крынецкая Н.Ф., Громова Е.С., Шабарова З.Л., Цех Д. Взаимодействие ферментов рестрикции и модификации EooRll с синтетических! фрагментами ДЖ. Синтез субстратов с одним участком узнавания. - Биополимеры и глотка, 1987, т.З, й 6, с.283-289.

3. Кубарева Е.Л., Громова Е.С., Орецкая Т.С., Шабарова З.Л. Вза-шлодействие ферментов рестрикции и модификации EcoRll с синтетическими фрагментами ДЖ. X. Гидролиз субстратов со струк-турныш аномалиям!. - Биоорган, химия, 1987, т. 13, il 9, c.I205-I2II.

4. Громова Е.С., Кубарева Е.А., Пайн К.-Л., Средой Т.С., Шаба-рова З.А., Цех Д., Прокофьев М.А. Изучение механизма расщепления ДНК-дуплексов андонуклеазой рестрикции Mval. - Доклады АН СССР, 1987, т.295, Л 6, с.1493-1497.

5. Pein C.-D., Cech. D., Gromova Б.S., Oretzkaya T.S., Shabarova Z.A., Kubareva E.A. Interaction of the Mval restriction enzyme with synthetic ВДА fragmenta. - Nucleic Acids Res.,. 19B7, Syrop. Ser., Ж 18, p.225-228.

6. Упорова T.M., Акатова E.A,, Никольская И.И., Кубарева Е.А., Громова Е.С., Шабарова З.А., Дебов С.С. Анализ чистоты препарата рестриктазы Sao II с помощью синтетического субстрата. -В кн.: Методы получения и анализа биохимических препаратов. Тез. докл. У Всес. конф., Юрмала, 26-28 окт. 1987, Рига, 1987, с.50.

7. Kubareva Е.А., Pein C.-D., Gromova E.S., Kuznezova S.A., Taah-litzki V.H., Cech D., Shabarova Z.A. The role of modifications in oligonucleotides in sequence recognition by Mval restriction endonuclease. - Eur. J. Biochem., 1988, v.175, H 3, p.615-618.

Л-63174 28.09.1988 г. Тш.ВНИИВС, зак. №

Z. Тир. 100 экз.