Особенности механизмов взаимодействия с ДНК эндонуклеаз рестрикции типа II EcоRII и SsoII тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГО од

; , ^ООШВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ТРУДОВОГО КРАСНОГО 1 ^НКМЕНЙ И ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.113.4.

ПЯТРАУСКЕНЕ Ольга Васильевна

ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ ТИПА II ЕсоШ\ и &о11

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук

профессор ГРОМОВА Е.С.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

БЕРЛИН Ю.А.

доктор химических наук БУТКУС В.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. Энгельгардта РАН

Защита состоится "26" апреля 1994 года в 16 часов на заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "ЛЧ" марта 1994 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям белково-нуклеиновые взятмодейспзия лежат в основе регуляции процессов жшнеаеягелжост клетки, таких кик репликация, репарация и транскрипция. Интенсивное развитие методов исследования ДНК-белковых комплексов и успехи ошгонуклеощцного синтеза обесточивают широкие возможности для изучения механизмов этих взаимодействий и открывают пракпгюсхие перспектив!.! направленного влияния на регуляцию кгкгочных процессов. Рззвише наших щвдстаиленин о структурном многообразии форм существования ДНК in vivo за последнее десяшлегие предопределяя- новый взглад на многообразие механизмов специфических ДНК-белкошлх взаимодействий. С этим связан повышенный интерес к исследованию структуры белково-)1уклеиновыхкомплега», различных конформаций ДНК, узнаваемых специфическими бедками и реализующихся в переходных состояниях акшвных комплексов.

Эвдонуклеазы рестрикции П-го типа узнают и расщепляют в ДНК определенные нуклеощдные последовательности. Вместе с сопутствующими им метштрансферазами, энпонуклеазы рестрикции представляют собой защишую систему, функции которой направлены против проникновения в клетку чужеродной ДНК Помимо широкого прикладного значения, они являются прекрасными моделями для изучения ДНК-белковых взаимодействий. Несмотря га то, что к настоящему момешу их вьшелено около 1.5 тысяч, подробно изучены лишь комплексы ферментов üoRI и ü»RV с субстратом. Обоснование принципов узнавания и расщепления ДНК ферментами рестрикции требует расширения круга исследуемых объектов

Объектами нашего исследования явились эвдонуклеазы рестрикции типа П: üoRII и ДоП

_ ^CCTGG.. _ "'"CCNGG...

_ GGACC.. .. GGNCC-

t Г

(стрелки указывают место расщепления, N - любой из чегарех нуклеощдов), которые узнают

анллопгшые нуклеощдные последовательности с частично или псиносгао вырожденной

цешралшой нуклееггадной парой соответственно. Эвдонуклгаза рестрикции fi»RII (RJroRII)

выделена га шгамма-супергцхщуценга Eschaichia cali B834/pSK323 (Косых с соавт. 1980). Недавно

было обнаружено, что этот фермент не гияратоуег прогяженньк ДНК фагов ТЗ и Т7, содержащие

соотетспзенно один и три участка узнавания üoRII. Однако такое растепление стнмугшрусгся

добавлением "чувсшшеты!ых" к RfboRII ДНК (Крюгср с соавт., 1988; Пайн с соавг., 1991).

Природа механизма акмвации оставалась невыясненной. Эндонуклеаза рестрикции Solí (R&II)

выделена из клепж Súgeüa soma 47 (Никольская с соавт., 1983). На кафедре химии природных

соединений были получены первые данные о взаимодействии этого фермента с синтетическими

субстратами: выявлены некоторые особенности стадии образования ферматт-субстрашого

комплекса

Целью настоящей работы явилось исследование механизмов узнавания и расщепления ДНК эндонуютеазами рестрикции JEboRII и ЛязП. В случае эвдонуклеазы ¿coRTT предстояло шучтпъ механизм стимулирования гидролиза ДНК исследовать природу этого эффекта, оцешпъ

стцгаурные детерминанты о&трата-агаиватора, описать кинетческую схему и успиюшт. ciuxiiOMcripnio <]срменгоу<5страшого комплекса. Особый интерес представляло сравнение спукпуриых особенностей субстрата и акпшных комплексах с R£coRU и R&sll с целью прсолсшпъ молекулярные мсшели узнавания и рйсшепления ДНК этими фермалами. Дня решения поставленных задач мы использовали широкий набор немооифицирокишых п мощ котированных аналогов cjficiparoo различной длины.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основании анализа субстрашых свойств ДНК-дуплексов различной длины с сипим участком узнавания RiboRll и изучения и качестве акпшагоров широкого набора модифицированных и немсвифицированных аналогов субстратов исследован механизм активации фермента R£boRU. Показано, что эффективность гидролиза RfioRlI уменьшается с увеличением длины односайгового субстрата - эффект "изолированного сайга". Акпшация гидролиза наблвдагтея только в присутствии расщепляющегося актютора, который, таким образом, является вторым субстратом. Обнаружено, что некоторые устойчивые к действию R£»RI1 мсди4»1Цирош1и1ые ДНК-дуплексы начинают расщепляться и присутствии канонического субстрата. Описана кинетическая схема и разработан нрналнженный метод оценки кинегшческих парамстров кооперативного взаимодействия RixoRII с двумя участками узнавания. Предложена модель симметричного акшвного комплекса эндонуклеалл firoRlI ссу45страгом, состснищ) га двух о<л«щ1шщ белка и четырех тяжей ДНК.

На основании зондирования струюуры ДНК в акшвном комплексе с R&oII показано, что кон(|юрмационная дестабилизация учегка узнавания приводит к значигелыюму увеличению Э(|х|скп1ыюсп1 (¡¡ерменппивного пиролиза Впервые для эндонуклеаз рестрикции li-ro типа в случае .Soli обнаружена возможность направленного изменения специфичности растепления при вида шив участок уса авания этого фермента ненуклеоп-щных вставок. Высказано предположи те, что и актвном комалсксе с R-SoII ДНК находится в "старыгой" форме. Таким образом, были продемонстрированы принципиальные различия струюуры ДНК в акпшных комплексах ферментов RiboRII и R&oII, подтверждающие исключительное разнообразие структурных форм Д H К при usai шодеиспзии с экдонуклеазами рестрикции тепа П.

Агпхзбация работы. Результаты работы докладывались »а Пом симпозиуме New England Biolabs "Биологическая модификация ДНК" (ЗапБерлин, 1990), международном симпозиуме "Сшпстичиские олигонуклеотиды: проблемы и перспеюивы практического использовшшя" (Москва, 1991), конференции молодых ученых Межфш<ультегской проблемной НИЛ имАН.Белоэерского МГУ (Москва, 1991), Пом Всесоюзном симпозиуме 'Теоретические и прикладные аспегаы молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), международной конференции "Современная энзимолотия: проблемы и направления" (Санкт-Петербург, 1992), IVom симпозиуме New England Biolabs 'Эндонуклеазы рестрикции и метил1рана|)ер;оы: CipyKiypu и механизмы" (Вфмонт, США, 1993).

Публикации. По материалам д иссертации опубликовано 12 работ.

Структур:! и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментально!! части, выводов, списка литературы (165 ссылок), содержит 25 рисунков и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. В работе использованы коммерческие препараты эндонуклеаз рестрикции ЕсоШ (Завод химреактивов, Олайне и ИБФМ, Пушино), &оП (Институт Медицинской Биохимии АМН России), Mvd (НПО "Фермент1', г. Вилымс), &rFl C'Serva"). 2-амш lonjpn [содержащие олигонуклеощпы бьии синтезированы совместно с СШмидг (Гумбошдгский Ушпсраяст, Берти). Опте, очистка и подтверждение первичной структуры осгалшых олигонуклеощцов бьши провезены сотрудниками лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ.

Гипролиз субстратов RfioRII просадили в 10мкл 40тМ трис-НО, рН 7,6, содержащего 50mM NaQ, 5тМ MgQ^ 7тМ дитотреигал и 0,1-0,4 ед. акт. фермеша Гидролш субстратов RSkO осуществляли в 10мкл 100тМ трис-НО, рН 7,4, содержащего 10mM MgQ^ ImM р-меркагпшганол и 3 ед, акт R&fl. Реакции проводили при 37°С или 10°С Продукты пшрегага анализировали в 20%-ном ПААГ, содержащем 7М мочевину (Q, - конца гграция ДНК-дуплексов, Q, - концентрация сиигонуклеотедов га мономер).

1. Изучение механизма акпшаши эцпонуклеазы рестрикции £ЬзШ1 с помощью синппнчсскнх ДНК-ддакксое На первом этапе изучения природы механизма активации KEœRll преппсгагилось исследовать зависимость эффективности гилрализа этим ферментом от длины annexai пового субстрата. Далее необходимо было выбрать удобную модельную систему для тестирования набора ДНК-дуплексов различной длины, содержащих мощфтцировагатые и нсмсшфициронаниые участки узнавания Rfi»RIT в качестве активаторов. Основной целью непепьзования модифицированных субстратов являлось установление требований к активатору, его структуры, способности связывался и расцепляться эшонуклеазой Rfi»RII. Субстратные airnont были выбраны в соответствии с полученными ранее данными Громовой с соавг. (1991г.) о различной эффективности гидролиза этих модифицированных ДНК-дуплексов RiboRÏÏ. Некоторые из них являются усготивыми к гидролизу этим физматом.

Нами изучено расщгпление RExjRII ДНК-дуплексов различной длины, содержащих алии участок узнавания этого фермента. Обнаружено, что уже 14-звенный ДНК-дуплекс с тсм же бштжайшим нуклеощцным окружением участка узнавания, что и в 30-звенном субстрате I расщепляется более эффекшвно. Далшейшее увеличение длины субстрата вызывает еше большее понижение степени гидролиза ДНК-дуплекса R£boRII (табл.1). Начиная с ДНК длина"! 215 нуюксгпщных тир, расщепление пракшчески отсутствует. Таким образом, эффективность расщепления субстратов RJZoRII понижается с увеличением длины фланга ¡руюии к участок узнавания нуюкопшных послецователшостей. Добавляя 14-звенный ДНК-дуплекс в реакщ ioi п ото смесь, можно стимулировал» пиролиз всех протяженных субстратов, содержащих один у«псток узнавания 2ЫШ (табл. 1). Эффект "изолированного сайта" проявляется уже >и 30-ти зленном субстрате. KMvd (CC^T/aGG), в отличие от R£coRII расщепляет указанные ДНК-дутиексы с одинакоюй эффекгивносгао.

г

Таблица 1

Расшеитавк RfioRII и RJVflel cj&rparoo рзгшгшой дии, _соаужаи»« ощш участок умавшмя_

Длина ДНК-дутаскса, пл. Степень пдаролии ДНК-дутшэха (Q, 0,35-мкМ) за 60 мин, %

ZxüRII finRII в прсугсшш 14-ахнного ДНК-датокиа V (С, 10 мкМ) Л/ш1

14 60 . 90

30 33 67 90

47 17 61 91

89 12 56 90

215 8 31 88

Рис] Ришиииас ^Р-мэивюго ЭО-эоавиго ДНК- РисД Рладашаио ЭОаапио ДНК-дгазса (CN 21 дагакш I (CD 035мкМ) фсгмзпш EaRП, в мкМ, ЗЗр-ижа в шаасй «эти) £о!Ш (I) и £ЫШ в WVmwl^oßuoqGcpraIV.(2) и оборотов шклсм^ос mm (См 21

cd io.ikm (3), 1-cogcnab ufl псфатшднк-дапка i, тлйупгаимьгя

- -ЧЧспа в верней дай дшхеа I,-- в * 1' 4*

ишиг

С учетом получгнных результатов мы иакииовали систему, состоящую га 30-звенного ДНК-дуплекса ("базовый" субарат):

{5-У) GATGCTGCCAAC CT GG CT CT AG CT ТС AT АС

.............................. (D

(J-5) CTACGACGGTTG GA CC GAGATC GAAG TA TG

H широкого набора мсш4ишфованных и «модифицированных ДНК различной длины,

содержащих силн или несколькоучасшж узнавания fiuRII, (в качгепю акшвагоров) для изучения

малекучярного и кинетического мэянизма стимулирования KüoRIL Параллельно различные

аналоги субстратов были опробованы также в качестве активаторов щаролиза ДНК (Jura ТЗ.

В присутствии 11- (П), 13- (Ш) и 14-зпенных (ГУ и V) ДНК-дуплексов:

GAACCTGGAAG АССТАССТGGТGGТ

(П)

CTTGGACCTTC

AATGCCTGGCATT

TTACGGACCGTAA

(Ш)

TGGATGGACCACCA GCCAACCTGGCTCT CGGTTGGACCGAGA CACTCCTGGATC G CAGTGAGGACCTAG CA

(IV)

наблюдается ускорение расщепления 30-звенного субстрата 1 RüoRII. Эффект ускорения увеличивается с увеличением длины субстрага-акгшнтора от 11 до 14 нуклешндных пар. ДНК-дуплекс VI, состоящий из комплементарных 14- и 17-звенных олигонуклеолидов, уже не является лхтиштором процесса щпратаза ДНК-дугтскса I фсрмаггом £»RII. Увеличение концентрации актигатора IV от 0,35мкМ до 10мкМ (28-кратный избыток по ошошению к дуплексу I) приводит к увеличению скорости пшролша субстрата I (рис. 1).

Протяженные ДНК-дуплексы конкатемерного тала были использованы для выяснения вопроса, какая акшвация _TCCTGGAATTССAGGAGC„

4 .................. (vii)

является боже _AGGACCTTAAGGTCCTCG_

преяпечппелшой: п_мер

_ ___.... _ Трр CCTGG-AAT Трр CCAGG-AGC-.

внутримолекулярная С«иО №.......№.......

или межмолекулярная „ A- G G А С Qip ТТАА- GGTC Q>p Т С G ...

Стране"). Они были рр-п-мер

представлены n-мером (VII, п > 20), в котором канонический участок узнавания £»RII повторяется через каждьв 9 нуклесгщдных пар и рр-п-мером (Vila), в котором расщепляемые üoRII фосфсуцофирные связи тенены на негидролизуемые пирофосфогные.

При изучении кингшки расщепления 30-заенного ДНК-дуплекса в присутствии конкнгемера обиак/жено, что немедафицированный n-мер (VII) в начальный момап' i рема ni ингибирует пшрализ 30-зоенного ДНК-дуплекса I, а затем активирует его расщеплем« (рисД кривая 2). При этом необходимо отмелль существенное отличие этой кинетической кривой и кривой тдрсииза 30-звенного ДНК-дуплекса в присутствии 14-звенного субстрата IV (рис.1). Это свидетельствует об одновременном взаимодействии фермента j5»RII с двумя участками узнавания. По-видимому, в гсроом случае RüoRII сначала преимущественно связывается с протяженным п-мером, кооперативно взаимодействуя с двумя соседними сгерически сближенными участками узнавания конкагемера VH и образуя внутримолекулярный комплекс. Затем более короткие п-меры - продукт гидролиза дуплекса VII - ускоряют растепление 30-звенного субстрата. Таким образен "цис'-агаивация протекает более эффективно. Ранее МВиноградооой с соавт. (19S7r.) было показано, что величина места посадки R-ЕоЛШ на дуплекс VII сосгашяег 21±1 нуклеощдную пару, что и соошегавуст взаимодействию ферме] яа с двумя участками узнавания.

В присутствии n-мгра (VII), который хорошо связывается и хорошо расщепляется ферма пом £»1Ш (Виноградова с соавт.), наблюдается также значительная активация шлраноа ДНК фага 13 эцдонуклеазой üoRU. Добавление рр-п-мера - нещщхиизуемого ашога конкагемера VII - в реакционную смесь, содержащую R£ooRII и 30-звенный субстрат I, интбирует гилролш дуплекса L рр-п-Мер не активирует и гидролиз ДНК фага ТЗ.

Возникает вопрос, какая из функций: связывание или расщепление акппятора является определяющей для стимулирования фермента £a>RIL Для этой цели мы изучили стимулирование гидрошш 47-звенного ДНК-дугоюха VIH ферментом üoRII в присугстшш ДНК-дуплексов VI и Vía, содержащих один участок узнавания эвдонукжазы.

С САА АТГ САС CTG GAA TTC AAA GGC ТСС ТТТ GGA GCC ТТГ ТТТТГГ Т

. ------ - - - - - - ---- (VIII)

CAG СТТ ТАА GTG GAC СТТ AAG ТТТ CCG AGG AAA ССТ CGG AAA AAA АААЛЗ

САСТр р CCTGG- -ATCCG • • • • ••••• ••••• (via) CAGTGA- -GGACCp pTAGGCA

В Д H К-дуплексе Via расщепляемые фосфодиэфирные связи бьпи заменены на негцпролизусмые

пирофосфигные. Как бьшо показано раке Виноградовой с coaur. (1987г), консгапы связывания

ДНК-дуплексов Via и VI с RfboRII близки. Как видно m рис.3, дуплекс Via инпйир>сг гипрсииз

47-звашого субстрата, в то время как субстрат VI стимулирует пшролш в тех же условиях.

Представленные результаты позволяют сделать вывод, 1гго талисо ДНК-дуплексы, которые сами

mapau суются энпонуклеазой рестрикции £a>RII, могут выступать в роли акшватсра.

IYic.314aiwaiiie ферматам £cRD ДНК-фшик а) МЦ (2), МП в гцмсуютащ киоориюго cjCapna M (3) и шкаролсасмого aitmu Ma (4); б) M (6), Ma (7) и Ma в прнсугсгаш юнавгсовго tlCcijun V1L1 (8). Дней сгагафктолцоо )шю цифрами шрода и от Вршя реакции 1 *пс, Cjj дапхкеа МП <Х 35 мкМ, С^) да шгксов M и Ma i5 мкМ

Для изучения влияния различных мощфвсашй гетероциклических оснований участка узнавания £соШ1 на свойства ДНК-дуплеш» стимулировать пшрсииз ЛДсКП в качестве активаторов пиролиза 30-звенного обстрела I и ДНК фпга ТЗ были опробованы модифицированные произвопные 14-зпенного субстрата IV, содержащие аналош нукпесоицов: (П, пА1С, пА1С и (ЙШ в силой (Г/а-ГУж, табл. 2) или обеих (1Уз и Г/и) цепях участка

узнавания:

лосглпЛхгс-сггоот лссглоп^-алшг

.........„.....те ........ ......№

тссотнсхисмкжхл ТХХ^ТС-САПРССЛОСЛ

В табл.2 привалены полученные ранее да шью о собственном пиратов эгах соединений Ш5зо1Ш. Фермент расщепляет их с различной эффективностью. ДНК-дуплексы, соаержащда (1\'б,1\'е и 1\'з) и пАтс (Г/г, Г/д и Г/и) устойчивы к действию В присутствии 2&-

крашого иэбьпка мсиифицированного ДНК-дуплекса по отношению к 30-звенному дуплексу I шСиодался либо ускорение (в случае дуплексов Г/а-1Ув), либо небалшюе ингибирование (в случае датиексов Г/г-Г/ж) гидролиза 30 звенного субстрата (табл. 2). При этом обнаружено, что акп шпорами могут быть ДНК-дуплексы, которые сами по себе 1 ю расщепляются (1Уб) или плохо расцепляются (1Ув) ферментом Ш-ЬоШ! Аналогично, в условиях бешытго избытка мод котированных 14-звенных ДНК-дуплексов (в расчете на участок узнавания ДНК фага ТЗ) баилпшсгио из них (соединения 1Уа-1Уг, ГУж) ускоряет щдротга фшэвой ДНК В их число также вдщгт несколько ДНК-дуплексов, которые плохо расщеплялись (Г/в и Г/ж) или совсем не

Тайн ни 2

Растяпа не 30-звапюго ДНК-дугсккса I Ш£оШ1 в присутствии

14-званых субстратов, содержат« нуклеозктчьс ,-и плота

Опюапошвя сгспаь Опюапешга V" 14-

Номер 14-апенньйдптах падратии* (%) за 30 мин субсгрпз I зишогодутажа

(СдС^З&жМ) в присушки 14- (Со ЮмхМ)

таш сто дутпгкеа (СЬ10 мкМ)

- 1Ю

ЛССТАССККЛССТ И»

ТССАТССЛОСЛСГЛ 170 100

...ООТ-1-а...~ 31

1Уа ...С-<3-А-СС... 160 30

...с-с-т-о -в... и

1МЗ ...О-а-А-СтС... 150 0

1

IV» ...С-С-тг/Л-СС... 130 3

...&&Т—с-о... 0

№ ...С-С-А-т'&О... 90 0

...С-т^С-Т-О-О... 0

№ ...О — в-А-С-С... 80 0

...т-ОС-Т-О-О... 0

Г/е ... О-С-А-СС... Ю 0

...ОС-Ри-СК}... 5

№ ...с-о-л-сс... 20 12

• 1Ъашгат опюсигоио степени шщхпга обеих испей ЗО-зюшого суборпа I в слхугепак даискса ЧЧста 1 ввдпея в обеих цатах субстрела I

•* Опшсние 1 спали гЯ сжросга гитраиги, (%), стеганых ютй маифшлрокиоых ДНК-дагихоп к \0 оосгпсгсшумиво базового датскса IV- Ш Дл о ьв верт сЛ и 1 ш «Я строк опкютя к рпашгап по гсрякЛ ю оси «1 I ¡спи субстрата ооогаетспа о ю (Громэоа с оооа, 1991).

***В дшэаах 1%-1Уис шоЕрпхны толиаэ мгщифпирооашыз фртмзпи ихиун осшнп,с ж !псгн 1ШШГ1 ы I «аадфиифоки и юму цбегрлу IV. Л атшгл и.с сокращения иикиьт^агся и датой

расщеплялись (Г/б и Г/г) ферментом ¿ЫШ (табл. 2). ДНК-дуплексы Г/д, Г/з и Г/и не являются

активаторами в этих условиях. Таким образом, эффективность стимулирования п шрот па

протяженных субстратов с изолированными участками узнавания эндонуклеазой ЕсоКП зависит от

типа модификации активатора и ее локализации в участке ул икания.

Для оценки связывания модифицированных 14-звенных ДНК-дутшексов 1\'а-1\'ж с

бьгоо изучено расщепление немодифищтрешнного субстрата V такой же длины в

присутствии различных концентраций модифицированных ДНК-дуплексов. Анализ зависимости

расщешкния ДНК-дугвккеа V от концетпрации добавляемых субстратов IV, 1Уа-1Уж показал

1шичие двух эффектов: активации и ингабирования (рис.4). При низких концетпрациях

добавляемого субстрата преобладает эффект активации, и все опробованные модифицированные

ДНК-дуплексы 1Уа-Г/ж могут быть активаторами. С увеличением концентрации соединений

Г/,Г/а и Г/ж преобладая- эффект интибирования, причем характер кривых ннгибирования

зависит от структуры добавляемого субстрата. Оювипно, "по указанные атталот субстрата IV

эффективно связываются ферментом ШЫШ, однако наложение двух эффектов (активации и

иншбироалния) делает невозможным коррекшую оценку связывания субстратов IV, !Уа-1Уж с

В целом, такой вид кривых зависимости расщепления одного субстрата в присутствии

различных концентраций лрутого свидетельствует в пользу кооперативного хг^хистсра

взаимсиействия фермента £ЪэШ1 с субстратом.

Тот факт, что практически устойчивые к действию эцдонуклеазы рсстрикш!и йоЯП

аналога субстратов Г/б и Г/в акптируют гидролиз этого фермента, явился несксптко

неожиданным. С цепью прояснить этот на первый взотщ противоречивый факт мы изучили расщепление ДНК-дуплексов 1Уб, 1Ув и 1Уг, содержащих пА1С и пАЗА, в присутствии кат 1С« цгкхкого субстрата I. В этих условиях на&иддалось расщетаз те ДНК-дуплехст ГУб и 1Уе, а также стимулирование гидролиза даплекса Г/в (рис5). Таким образом, в присутствии "чувствительной" канонической ДНК, способной расщгплягься ферметггом £»1Ш, модифицированные ДНК-дуптюксы Г/б,1Ув и ГУе перестают быть устойчивыми и шдролизуются достаточно эффективно. Мы назвали это явление "обратным эффекта/Я. Эти данные показывают, что в активном комплексе ,Е»1Ш-ДНК два участка узнавания взаимосвязаны и, вероятно, локализованы в сином активном ценгре фермента. Из этого следует, что активатор представляет собой не просто аллосгеричгский эффектор, а выступает в роли второго субстрата.

Далее мы изучили гидролиз модифицированных ДНК-дуплексов Г/г, ГУд и Г/и в присутствии канонического субстрата V, отичающггося от IV первичной структурой. Эти аналоги субстратов содержат остатки пА1С, заменяющие те остатки (1С, которые ¡п шо мепиируются мешлаэой £Ьо1Ш. При этом мы наблюдали слабое рашитение

Рис.4 Раадапнгое ^Р-иямго оборота V (Со 0Д5мкМ; ^Р-*«яха в обеих иямх) в пркуютш ДНК-дтахоов 1У(1), ГОД, ПОД. РЛз(4), Щ5), Г/д®, лед и ГЛк{8) в розничных и» пищащих. Ойстоапюс раашхгниедаплаха V принято за 100%.

1 Д, Д Д Д 6 аабабабабаб

Ржх5 Раздана ас ДНК-дугосихс Г/ (2), 1Уе (3), Г/е в присутствии субарша I (4), 1\Ъ (5), ГЛ в присугспш суЗстрша I (б) федозеом ЕюКП. Линия 1 - даплехе IV. ■"Р-млха в вероей (а) или нижгей (Б) или ДНК-дгопшоаСр во« чблрвтов (Х35 мкМ. Бремя реакции 1 час ВРВ-СромфассныЛ синий.

эндонуктказой ЛсоКП «модифицированных цепей ДНК-дупжксоо Г/г и 1Уа Из рис.4 следует, что в этих условиях указанные ДНК-дапзкксы связываются ферментом ¿ЬзИП. Гидролиз медафицированной цепи протекал крайш слабо. Полностью метилированный субстрат Г/и не пщролизовался в присутствии канонического субстрата.

Таким образом, мы открыли эффект стимулирования гидролиза модифицированных аналогов субстратов, устойчивых к действию И-ЕдаЯН, добавлением в реакционную смесь канонического субстрата. В определенных условиях эндонуклеаза рестрикции способна расцеплял, полумяилированную ДНК, в том числе и содержащую остатки пАС, вводимые соответствующей ей мггалаэой. Эти данные показывают, что эффективность действия

эццонуюквы £ЬоШ определяется стюсобносшо фермата определенным образом координировал, два сайга ДНКв одном актином цетре.

2. Оцхделаие субьс***™сй структуры акпиюй формы фермента Ра.» М(»2+

Известно, что в растворе фермент существует в ввде набора шдакированных форм, начиная с димера, теярамера и тд (Косых с соанг., 1980). В связи с зшм закономерным явился вопрос какая субьепиничная структура ШаЯШ реализуется в активном комплексе ферма па с субстратом.

Для ответа на этот вопрос мы исследовали изменен« началжой скорости тдролша 14-звенного ДНК-дугпехса V ог концентрации фермента (рис.6). Мы показали, что максималытая начальная скорость продажа достигается, кода каждая субьединица фермэпа связывался с одной матгкулой субстрата. Следуя двухсайтооому механизму гидролиза ДНК эвдрнукжаэой рестрикции £»М1, можно заключить, что две субьепиницы этого фермента одновременно вовлечены в связывание и расщепление д^а: участков узнавания субстрата. Аналогичные результаты получены при изучении гидролиза ДНК рВК322 щи различных концентрациях фермента. Как следует из рис.7 при соотношении один дамер фермента на два учалка узнавания ,Е»ЬШ в плазмвдг активность ЯйоМ1 максималыи. Ингобированте раоцзтаения при высоких концентрациях фермента, вероятно, вызвано образованием неактивных кемгиэахю, состоящих из димера КййШ и одного учаспса узнавания ДНК.

у!0~? мкМоль/мин

[Д:оШ1] 3 [ДН К- дуплекс]

Рисб Завномхп. нгилиых скоростей шщхотт Ч'+ригао ДНК-дплжга V (ЗЯ пМ) ог ка ни прщии ШЫШ (т маклер)

в »

у М г-* • М

„им '

0.04 001 047 ОМ ОК* и! 2.7 К

0112 <и5 ои 1Д гл ¿0 11 112

Гмоиомс» И.Д»М11

(ЫИ дцц

[дтгу Я-£Ь|ЯП| [ГВХ322]

Рис.7 Зависимость раедатетм 87нМ ДНК рВЮ22 (5201М йеКП сайтов) К-ЕеКП от кацагграцин фгрмига (ш мономгр> 1-280Ш; 2-Ш)нМ; З-ТОтМ; 4-15СИМ; 5-175нМ; 7-44тМ; »-22кМ; «Ш.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отсутствие ионов Мг2+ в растворе фермент £»И1 образует с субстратом два типа комппехоов (Карпова с соавг, 1992). Оценка по молекулярному весу комплексов, разделенных гель-злегарофореэом, показала, что субстрат включен в этих условиях в комплекс с мономером и димером КЛЫШ. Для уточнения структуры кагаяипмески-актвнсго комплекса мы применили также метод гель-элэарофореза в исдантурируюших условиях. Было изучено комплехсообрзэование фермента £соШ1 с

модифицированными аналогами субстрата (в том числе негцаролизусмыми) в отсутствие и в присутствии Из таблицы 3 видно, что модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие в учалке узнавания ЮсоШИ^и (Г/ж) и гтАЗА (Г/в), которые слабо щпролизуклся ферментом в станцартных

Таблица 3

Ксмгокксообрзэовшие фермагга fiaaRll с субстратами и аналога*« субстратов_

ИШК-дпюх!/ Оязлвнк; RfirRIl

llcup 14<£СШ.ДУПХКС [йоКП] BorcyrcraieMgir В пгисуплши Mg'1"

иоилср &Ш1 димгрЛаЯШ mckcp ЕаШ дмз> firiUI

IV AOCIAOCIGGTCGT TGGATGGAOCXOCA 0,1:1 1:1 + + + : + +

Г/в ...СС—Т-СНЗ... ...G-G-m°A-CC... <до tl SI + + + + + - + + +

№ ...GCAJ-G-G... ...G-G-A-OC... 0,11 1:1 SI + + + + + - + + +

W5 ...COT-G-G... ...G-OA-Omt... ач ы SI - + - +

We ... mt-C-T-G-G... ... G-G-ACC... № tl SI - + - +

Via ...ppCC-T-G-G... ... G-G-A-C-Qjp. 021 t2 13 - + + + - +

условиях, в отсутствие Mg2+ образуют д ва типа комплексов аналогично каноническиму субстршу. ДНК-душккхы, содержащие в участке узнавания RJboRQ m4dC (Г/б и IVe) и нгщаралшушые

пирофосфашые связи (Via), которые соисем не расщепляются ферментом jEooRII в стандартных условиях, в отсутствие ионов образуют комплекс топко с димгром RJScoRIL Комплекс субстратов, содержащих nAlC, с димером R£bsRII (IV6 и IVe) наблюдается лишь при зютшелшом (Sra кратном) иэбьпке аналога субстрата по срвиению с фермзтгсм, что, Берояшо, вызвано слабым сродством этих ДНК-дуплексов к фермету £»RE Таким образсм, тивдропшуемые аналога субстратов различней природы ге образуют комплекса с мономером эвдонуклеазы ¿boRIL Негцпрсшзуемые модифицированные субстраты Via, Г/б и IVe не формируют активный комплекс с R£»RU из-за неспособности ферма па либо присоединял» вторую молекулу этих аналогов субстратов, либо формировал» акшвный комплекс из двух мод ифицированных сайтов.

Анализируя полученные результаты, можно заключить, что причиной появления комплексов субстрата с мономером фермента может бьпь отсутствие ишов Mg2+, которые кроме выполнения функций кофактора, способны компенсировать заряд фосфатных групп ДНК-дуплексов, ослабил» отталкивание двух молекул субстрата, участвующих в образовании агатного комплекса

Эту гипотезу подтверждает изученное нами связывание с ферментом ¿boRH канонического субстрата и упомянутых выше ДНК-дуплексов в присутствии ионов Mg?+. В этих условиях наблюдаются комплексы ДНК-дуплексов только с димером £х>КП (таблЗ). Комплексообразование R~E»RII с каноническим субстратом IV зависит от концентрации ионов

Ц»2+ (рис.8). При соотношении кокцапраций фермента и субстрата 1:1 и концентрации меньше 1мМ наблюдается пояшкние двух типов комплексов субстрата: с мономером и димером ферме»га £Ьо1Ш (рис.8).

10 5 1 0.1 0.01 О мМ Мг2+ Коитаююбрихиив ЯЙЫШ (1мкМ) с

90 цДа субарагом IV (СЬ 1мкМ в птисугспии различных 45 кДа шцащвдиЯ Элэарсх^орсз в

ндаидаруквди успиях, в пвдиапо мя«ипшиЯог5Ждо28% ПААГ.

Нами показано, что гидролиз при этом практически отсутствует или пропасет неэффективно. При увеличении концентрации М^+бсшше 1мМ наблюдается шю комплекс субстрата с димером Я^МШ. Гидрсига в эпк условиях протекает эффективна Таким образом, активной формой эвдонукдеазы рестриции £а>КП является дамер. В отсутствие ионов фермент в димерной и мономерной формах (Е^.и К соогаетственно) образует устойчивые комплексы с одной молекулой гидролшуемого субстрата. Такие комплексы являются неактивным! с Е2 + 5 Е;^ ^ [Е^^ ® 2ЕБ. Кшппжс Е^ в отсутствие ионсв Щр-+ является нестабильным, однако в присутствии стабилизирующих его ионов две субьепиницы фермента йоШ и д ва участка уга иванда посте аллосгеричяжой перестройки переходят в активное состояние.

3. Вамзжвьм мехавюи спмутсми 1СЕа>Ы1

На основании представденых выше данных, предполагается кооперативный характер взаимодействия дамфа энионукдеазы £»И1 с двумя участками узнавашм. Первой стадией такого шаимсдейсшия мажет быть образование кагалшичесхи неактивною кпмпжкса димера ШЫЩ с одним участком узнавания ДНК-дупгккса. Вторая стадия - формирование каталитически активного комплекса, стабилизированного ионами

димф фермента связан с двумя координированными утками узнавания. В присутствии д вух субстратов возможно образование несколысих каталитически активных комплексов с Прешотпелшосгь образования того

или иного кагалишчески-акшвного комплекса определяется соотношением концентраций субстратов и их статней связывания с ЯййШ, а также персятностыо нахождения ферментом своего участка узнавания. Возможно, щи взаимодействии фермента ¿ЬоКП с ДНК прсисхсшт формирование участка узнавания сложней стругауры, состшиего из двух симмеярично расположенных участков узнавания. Образование такого четырехцепочечного "сверхучастка" узнавания снимагг вопрос о взаимсдействии К_Е»1Ш с асимметричной централшой А • Т-парой, узнаваемой (¡ермэггом.

На основании экспериментальных данных мы предположили следующую кингшческую медаль взаимодействия двух субвдиниц этого фермента (Е2) с двумя субстратами (обозначение одного из субстратов I соответствует тому, что он является погенциалщым конкурентным ингибитором субстрата 5).

*и

Е2/,-^ Е2+Г

[ад; 1

Е^димер _Е»1ЭД, Б*, I* - продеты реакции, У, Г - переходы? состояния субстрата, Б, I - субстраты,

¿21, Е^, БД БгБг, Е^Г - ферматт-субстрашью компжксы, К^, К^ Ка, К^ Ко, - констанш равновесия, к5ь к^ка). - консгапы скорости щпрсиша

С помошио построенной математической монета щи условии квазисгационарносш процесса были оценены кинепмэскиг параметры, которые характеризуют постадийное тшимедакшиг К£ЬоКП с д вумя субстратами. Предлагаемый кинетический механизм апеквашо описывает эшгримзпалшьЕ данные.

в активных комплексах с ИЕхШ и ЯЗээП, порченные при исследовании взаимодействия этих форматов с атюгами субстратов, 1шеющсслакатыюмш»аа{ую ащхыую структуру. 4. Вза1М0ЕКЙсга«е эвдрщклеаз рсорикпм ЯоП и £ю1Ш с ДНК-душекеал«, аукржащми наою*озцгщьс вставки в участке уашаяя этих фериспгов

Мы изучили разцепгкниг эвденуюказами рестрикции &Л и й»М1 аналогов субстратов, в которых сдан ш нуклеозшиых остатков в участке узнавания заменен га остаток 1,3-пропанд иала (Ргф, 1Д-дгек*жси-Е)-рибофимноаы (сШ) или 9-[1'-щарокси-2-(щпроксимгшл)эп>-кси]мепш1уанина (¿в) с цепью выяснения участия отельных гетероциклических оснований и утлеодофосфагного остова в процессе специфичхкого взаимодействия этих ферментов с ДНК Предстояло выяаопь, способны ли ферменты рестрикции щпралиэовагь ДНК-дуплексы, содержащие апирнмид ин/апуриюоьк звенш в участке узнавания.

Замена остатков с!А или <ГГ в участке узнавания на остаток 1,3-пропандасяа или 1,2-дигккжси-Е)-рибофуранозы (пугаемы Г/л-Г/н, Уа и Уб) вызывает блокирование расщепления обеих цепей дутшгксов ферментом ¿соИП. Эта эццонуклеаза пракптчеоси не раацятляег также субстраты, у которых удалены остатки 1уанина (субстраты Г/о-Г/п). Если восстановить удаленный остаток гуанина, шеая ациклический аналог даошлуаназина (субстрат Гф), то активность фермента восстанавливается только частично (табл.4). Версишо, это связано с возможностью

12

свободного вращэои гуанинооого основания из-за ациклической природы углеводного остатка, что мажет привести к нарушению комплементационных взаимодействий в дЮ • С-паре и препятствовать белково-нуклеиновым кси пактам. Таким образом, для эффекшвного функционирования Я^ЬзЯЛ необходимо, чтобы во внутреннем дэоксигуаназине соединялись тщетными не только гетероциклическое основание, но и остаток дезокси£*тбозы.

Таблица 4

Рааткпление ситгегтеских ДНК-ддиекоов эпдрнуюказаум ресгрии»<и

Нокр Опсоаоивтсюшыкгопга, %

ЛЫ1 АП И

^ОТАОсгазгает-4 100 100 100

IV тТазадойвосАССАс Ю0 100 100

...СОЛКЮ... 220 51 0

гл ...&ОА-СС... 118 100 0

...ос-т-оо... 211 106 0

Мл ...(ХМЧЮС... 136 17 0

...ооаж-оо... 237 28 0

М1 ...ас-А-сс... 1» 91 0

...СОТчШ-О... 195 79 0

м> 68 67 0

...сс-т-сиз... 33 53 0

№ ...¿имглсс... 163 18 0

...сст-дес... 37 89 4

...а&АгЮС... 86 36 3

*<ХХАКХЖЮС1СГ!> 100 103 ко

V 100 100 100

...ССШвО... 321 91 0

...ОС-А-Сгс... 174 71 0

...сс-т-снз... 237 85 0

...сиз-люс... 211 65 0

В присутствии канонического ДНК-дупгккса IV наблюдался шдролиз аналогов субстратов \'а и Х'б. Гидролизу подвергалась не только немсюифицированная, но и модифицированная цепь. В этих условиях К.£ЫШ начинает гидролизовап. также субстрат 1Уо, у которого удален остаток гуанина (рис.9). Таким образом, энцонуклеаза £»1111 в присутствии природного субстрата способ! и расщеплял. ДНК с апуршт/апирнмидиювыми звеньями в участке узнавания вместо одного го нуклеозидов центральной нуклеогазнон пары ши внутреннего остатка гуанозина. В рамках двухсубстрагного механизма взаиможйспзия с ДНК эти данные свидетельствуют о том, что

для эффективного гидролиза двух участков узнавания ферменгу не требуется взаимодействия со всеми десятью нуклеотидными осликами этих фрагментов ДНК Гидролиз модифицированных субстратов Уа, \'б и 1Уо в присутствии канонических субстратов показывает, что субстрат может не содержать важных функциональных элементов участка узнавания, при условии, что фермент узнает разные функциональные группы го двух сайтов ДНК.

12345« 7 8 9 10 1112 13

Вс.9 йоцагипс ферматгом ДНК-

ВРВ дуттажсов IV (2,3), Г/о (4,5), 1Уо в пристигши

дуплекса V (6,7), ГУп (8,9), ГУп в присушили дутгтага V (10,11). Гидролиз верхней ьепи дуплзха IV (¿2) и верхней шти дуплекса IV в пришлепни дупшэаа V (13). Лииия 1 - дуплекс IV. %-млга в верхней (2,4,6,8,10,12,13) или в нижней (1^.5,7,9,11) шли ДНК-дуппегазв. Сц всех субстратов 0,35 мкМ. Время реакции 1 ч.

Ферма гг ЯоН, участок узнавания которого пшносшо выраадел по центральной нуклеопщной парс, расшепшкт все модифицированные ДНК-дуплексы (табл.4). Замечательным явился тог факт, что введение ьенуклеощдных аналогов в участок узнавания приводит к юма кга 1Ю места расшргшедая фюсфсиюфирных связей этим ферментом. Замеза остатков (ЗА или сГГ це)пралыюй пары участка узнавания на пропиленовый мостик или 1,2-дадаокси-Е>-рибо^уранову приводит к значительному повышению эффективности расцепления каждой ю цепей ДНК-дутшексов 1Ул-1Ун, Уа и Уб Я&зП и к появлению наряду с каноническими неканонических разрывов (табл.4, схема). Замай одного ю внутренних оеппков (Ю участка узнавания 1И 1,2-дцдезокси-Е)-рибофур0ноау приводит к полному изменению специфичности пиратпш К.5в11 модифицированных цепей дуплексов 1Уо и 1Уп (ехша). При этом эффективность растепления модифицированной цепи возрастает, а немсиифицированная цепь расщепляется в каноническом положении, но с меньшей э<}>фекгиино<лъю (табл.4). Во всех случаях новое место расшепления ндаощтгся нспосредсттапю рядом с поденной ненуклеотидной вставкой (с 5-и» та).

..:с-с-т-с-с... ...С-С-А-С-^..

...С-С-РгЛ-С-С... ...СС-А—С-С...

,.^с-с—т-сс...

...С-С-РкГгС-С... ...С-С— А— С-С...

иди»

(II,К)

(Ш.Х)

( IV )

...с-с-т^й-с... ...С-С-А—С-С...

( V )

...с—с-т-с-с... ...СС-А—С-С...

( VI )

(VII)

Ргй: -чысНз^-О-

<Ш:

вЮ:

(

Си»

?

Схем! Каноничххое (зацлрихованные стрелки) и неканошисское (незаиприхованные стрелки) роацегпение эндануюеаэой ДоП. субстратов с ненукпеотидными замаоми

Тот фнкт, что 1Ъйэ11 способш эффективно и специфически расщеплял» ДНК-дуплексы 1Ул-1Ун, Уа и \'б указывает, чш эта эндонуклеаза беспрепятственно узнает такой 'Испорченный" сайг и по крайней мере на сгааии связывания ш пакты фермента с каждым из оснований централи юй вырожденной нуклеотидней пары огсутешуют. Появление неканонического разрыва вызвано, щхэяпю, сущхлвенным структурным шменением ДНК в месте модификации при удалении 1етероциклического основания. Это подтверждается тем, что фермент &Л осуществляет неканонический разрыв фосфсшиэфирных связей в дуплексах 1Ул, 1Ум, Уа, Уб, 1Уо и 1Уп только

рядом с нукпсотипным остатком, в котором отсутствует гетероциклическое основание. Это сшдаельствуст о необходимости контактов R&H с внутренним и внешним остатками dG для обеспечения специфического гидролиза. Для подтверждения этого заключения были i сучены субстратные свойства дуплекса IVp, в котором в отличие сгт субстрата IVo, сохранено 1етероциклическое основание, но нарушай углеводная часть внутреннего остатка dG. При этом наблюдалось значшелыюе снижение эффекптности расщепления мсетф'Шфоюннои цепи ДНК-дуплекса IVp. Замечателыю, что субстрат IVp парализуется специфически R-SöIL Это доказывает определяющее значаще данного гетероциклического осносанш для npaismuioro взаимодействия фермента ¿»II с двойной спиралыо ДНК Изменение специфичности пшратиза не наблюдалось при пиролизе дуплексов IVji-IVh, Va и V6 ферментом-изошизомером &FI (CC^NGG) (табл.4). Можно предположить, что ДНК в комплексе с R.MI претерпевает значителшые конформационные изменения. По-вцдимому, введение ненуклеошдной вставки вызывает увеличение конформационной подвижности двухспиралшого участка уз!йвзния, что и приводит к знанигелыгаму повышению эффекшвносш данной фермешативной реакции. При этом снижается энергешческий барьер структурного перехода ДНК в процессе образования (]крмент-субстрашого комплекса Важно также подчеркнуть, >по разные цепи одного и того же дуплекса (субстраты IVu-IVp, Va и V6) расщепляются R&oII с разной эффективностью (табт.4). Это мажет свидетельствовал, о том, что фермент &>П расщепляет разные цепи такого мопифищфованного ДНК-дуплекса независимо. Представленные данные пооваля ют предлодожшь, что ДНК в фермент-субстратом комплексе с R&dl находится в расплетенном состоянии в районе участка узнавания, образуя так называемый "открытый комплекс". Таким образом, RiSsoH является необычным ферментом, способным направленно изменять место пиролиза при взаимодействии с ДНК, содержащими в участке узявания этого фермагта апуриц/апиримидинссье звенья.

Обнаружено принципиалыюе различие во взаимодействии с аналогами субстратов, содержащими ненуклэотидные вставки, двух эндонуклеаз ресфикцин: R.&1I и RüoRII, имеющих участок узнавания с различной степеныо вырожденности централшой нуклеопшлон пары. Однако, обшим свойством ферментов ¿soll и £coRII при взаимолейстшм с ДНК, содержащими апурин/апирнмидиновые звенш в участке узнавания этих эндонуклеаз, состоит в том, что они способны гидролизовать такие ДНК в определенных условиях достаточно эффективно. Механизмы гидролиза при этом совершенно различны.

5. Взагосдоспме мдаоктсаз ресгрнювщ ДоП и £юМ1 с ДНК-душексачи, осодисвдмн остаток 2-ачинопурша в участке уаавшия этих ферментов

Было изучено расщепление RfiaRII модифицированных субстратов Vb-Vh, содержанок -9-(ß—Е)-2-деэошфибсх}уранозил)-2-аминопур|щ (2-АР) в участке узнавания этого фгрмеща (табл. 5). Замена ценгралыюй А'Т-пары участка узнавания на 2-АР• T-n.-ipy снижает пшратш немошфщированной и блокирует расщепление модифицированной цепи ДНК-дуплекса Va В присутствии канонического субстрата IV в качестве активатора наблюдался эффегаиш шй гидролиз обеих цепей ДНК-дуплекса Va С точки зрения двухсайгового механизма пиролиза ДНК этим ферментом, энцонуклеаза üoRII взаимодействуете четырьмя центральными неуклесштными.

Таблица 5

Расшсплате 1^£ЬзШ1 и И-йзН модфшлраашьк Д11К-д)и,хшж, содержащих 2-ачмюпурш

Ош. степень п-шраит (%) за 1 >ис, Сп

0,35мкМ

ЕсоШ £ю11

Номер 14-шенный дуплекс без в присущим Тпл,°С

аквпигора дуплекса IV С[}

0,35мкМ

5'- СКСАДССТСаЛСГ - 3' 100 100 62

V 3'- иьипъычлдЛЛ- Ь' 100 . 100

.. .с-с—т—ОС... 10 60 90 56

Ув .. .<3-&-2АР-С-С... 0 60 80

.. .С-С-Т-2А£МЗ... 0 5 0 34.4,44.0

Уг .. с—с... 0 10 0

... С-С-Т-Сг-2АР... 0 0 0 38,4; 50,0

Уд . .. (З-О-А-С—С ... 0 0 0

... С-С-Т-2АР-2АР... 0 0 0 ДО; 36,0

Уе ... ез-оА—с - с ... 0 0 0

.. .С—С—Т-й-С... 0 0 0 34,0; 42,5

Уж .. .СЗ-2АР-А-С-С... 0 0 0

.. .с—с-т-о-с... 0 0 0 37,0; 44,5

Уз . ..2АР-Сг-А-С-С ... 0 0 0

. . .С - С—■Т-&-С... 0 0 0 27,0; 58,0

...2АР-2АР-А-С-С ... 0 0 0

остатками, и в этом случае для эффективного пиролиза обеих участков узнавания требуется хотя бы сина аминогруппа в каноническом положении.

Замай одного или двух остатков туанина в участке уэивания (субстрады Уг и Уи) на 2-

ами! юпурин полностью блокирует тдролга ДНК-дуплексов эвдонукпеазой £»Ш1. В присутствии канонического субстрата IV гидролиз субстратов Уд - Уи также отсутствовал. Наблюдалось лишь слабое расщепление субстрата Уг (табл.5). Эпт результаты показывают, что конгакгы фермента с кислородом остатка 1уанина снень важны для образования специфического комплекса С учетом полученных нами данных по термической денатурации и КД дуплексов Уг и Уе это может бьпь связано с существенным искажением структуры двойной спирали. Вероятно, 2-АР образует с остатком ципвина неканоническую ("вогнутую") нуклеощдную пару.

В случае эвдонукпеазы ДоП аналог субстрата, содержащий 2-АР-Т-пару в центральной позиции участка узнавания (Ув), расщепляется с той же эффекшшостыо, как и исходный ДНК-дуплекс V (табл^. При этом не налвддаегся изменения специфичности фермента &>П, как в случаг субстратов 1Ум и 1Ун. По данным КД и термической денагурации дуплекса Ув введение 2-АР • Т-пары практически не нарушает конформации двойной сгафали ДНК Это подтверждает предположение, что именно структурная дестабилизация и информационная подвижность, вызываемая введением ненуклеощдных замен в 1Уо и 1Уп, приводила к увеличению эффективности действия К_>&>11 и появлению неспсцифического места расщегшеюш. Кроме того, можно предположить, что цешралытая нуклеощд ная пара узнается ферма пом ЛоП лишь "ш уровне" вторичной структуры дуплекса, а не "на уровне" образования с ней непосредственных контактов.

ДНК-дуплексы, ссвдмсиаде 2-АР вместо одного или доух остатков 1уанонпи участка узнавания эвдонуклеазы ДоП (Уг-Уи), этим ферментом не раодатляклся. ЯДоН не узнает 2-АР • С-пару. Замена остатка оанозина на 2-АР, в оиичие от замен на пропиленовый мостик или ддаоксирибооу, сохраняет все функция алы тые группы, кроме кислорода у Сб-агома основа! шя, I ю приводит к закреплению искаженней конформации двойной спирали.

Как уже описывалось выше, мы предположили, что ненуклесгпщные вепшки в участке узнавания ДНК моделируют переходное состояние ДНК-дуплекса (возможно расплетенное) в активном комплексе с И-ДоП. При этом расплетенное состояние ДНК реализуется, шреяпю, в районе мала расщепления. В природном субстрате, возможно, именно остатки гуанина играют важную роль в образовании переходного "акгавного" состояния ДНК в комплексе с фермягтом. Модификация этих остатков (замена на 2-аминопурин) приводит к тому, что Я&зП не образует- с ними спетф-геских контактов. Это препятствует деформации ДНК до "акшвного" состояния (возможно, "открытой" фермы) ДНК

6. &шмодсйсгвие эютуклеаз ресгрикки Яо11 и с одюиепекчъмл ДНК

Мы шучили расщепление К_£соШ1 и 14-звенных одноцепочечных

алиттиеэокафибонуклгопщов (табл.6). Фермент ¿азИП не парализовал ни одну ш представленных структур даже в присутствии ДНК-дуплекса V. Однако фермент &>П эффекшвно гидролизуег верхнюю или нижнюю цели ДНК-дутиекса IV, а также наблюд ается слабый пиролиз каждой го цепей дуплекса V. Более того, этот фермент типролизует верстою цепь дуплекса 1Ул, содержащую вместо ценгралшого тамидина пропандисганый остаток (табл.6). Вспет вопрос о том, в комплексе с какой кенформацией ДНК происходит взаимсоейстие: друхспиралыюй или

сшоспиралшой.

Таблица б

_Гклратш ИДоП 14-зрадд.к атгвдезаа^^цклеопирв_

14-ЗГ111 ъс спита |уклзопоы ДНК-длгохы Сгспаьшлрат>т%

ЗАСХЛАСХЛТЗСКХЗТ? IV 97

УАСХАССАССТАСХЗТЗ: IV 39

УЛаЛАСС-Г'вКЮТССТ! № 37

5 Аа^ос-тлзстлсст у № 0

3 АССГЛССкШ-ООТСОТ з: ГЛ| 0

улалАалчЖ-сгпзстз; № 0

5 АОС\СХЛОчШ<-Х\СаГ У ГЛт 0

5 ЛССТАОСТ-де-СГССГГ У г^ 0

5 оосААажххлсг з: V 8

5АСЛООСАССГГЮЗСЗ: V 4

5 СОСАСХ>Рп«Х71СаГ з: 0

5 А(1\ССС-РкКХШСОС 3' \б 0

Для исследования этого вопроса мы использовали разработанный нами отеюрофотслетр^ксютй

мегса тестирования процесса расщепления ДНК-дутшексов энаонуклеазами рестрикции,

основанный на гапсифомном эффекте, который проявляется только при гидролизе дуплексных

струкзур. Мы показали, что эндонуклеаза &з11 способна стабилизировать и тпролюовать

следующую аномалытую структуру:

5-3,АССтАССТООТ-ООТ

.............IV

3-5 ТОО - ТООТССАуССА

Таким образом, наблюдаются сушестпенные различия в способноои ффмсш1011 рестрикции £ЬоШ1 и ¿»II пирализовать одногажевые структуры: 1и£о1Ш не щдролизует одноцелочечные ДНК даже в присутствии канонического субстрата, а ГСЫ! способти пцролшовать некоторые из них очень эффективно, стабилизируя аномальную двухспиралтлую структуру. Сложные аллостерические и структурные преобразования в акгавном комплексе К.£ЬоК.П с двумя молекулами субстрата определяет строгие струкгурные ограничения для субстрппгых молекул. Поэтому данный фермент узнает только стабилыше ддуопчзалытые структуры, включающие участок узнавания &£Ьо1Ш. Напротив, эндонуклеаза &>П является структурю-"лабилытым" ферме!пом и эффективно расщепляет субстрат со значительными конфирмационными дестабилизациями вторичной структуры.

Проведенный анализ структурных особенностей ДНК, входящей в состав каталшически-акп ты юга комплекса с эндонуклеазами рестрикции II типа £ЬэГШ и &эП, дополняет накопленный за последние годы материал об исключительном разнообразии механизмов взаимодействия эндонуклеаз рестрикции с ДНК Таким образом, становится более понятой проблема отсутствия значительных гомолошй в первичной структуре этих белков. Узнавание необычных конформационных форм ДНК эндонуклеазами рестрикции, кроме того, позволяет по новому взглянуть >и биологическую роль этих ферменте®. Некоторые авторы считают, что свойста К.£:о[Ш напоминают свойства рекомбиназ. Возможно также, что этот фермент обладет регутопорными свойствами. Полученные нами данные об одновременном узнавании эндонуклеазой атеменгов ДНК из ¡щук различных участков узнавания говорят в пользу этого предположения.

С другой стороны, данные по эффективному пиролизу Я&эП конформационно-дестабилизированных ДНК, содержащих внутри сайга апуриц/агвфимвдиновые зигнья, и рошшшю ферметпом £»£Ш мноптх модифицированных сайтов (метлированных и с элиминированными гетероциклическими основаниями) в присутствии канонических субстратов показывают, что эти ферменты облапают способностью узнавал, и в определенных условиях парализовать модифицированные ДНК, которые могут возникать в процессе жизнедопелшосш клетки.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что эффективность пиролиза эндонуклеазой £»И1 ДНК-дугшексов, сод ержат к один участок узнавания этого фермента, уменьшается с увеличением длины субстрата, гидрегао отсутствует при длине, гревышающей 200 куклеотидных пар. Их расщепление стимулируется добавлением коротких субстратов.

1 Разработана мопелыш система, включающая набор сингешческих субсгршш и их аналогов, с помошцо котсрых проанализированы механизм акшваци К..й»Ш1 и струкгурные детерминанты акшвагора.

3. Показано, "гго модифицированные ДНК-дуплексы могут стимулировать пшраигз lí./ioRII, однако активация гидролиза наблюдался только и присутствии расщепляющегося активатора, который, таким образом, является вторым субстратом.

4. Обнаружен эффект расщепления энаонуклеазой JSooRII апурин/апиримишш-солержащих и попумешлированных ДНК, изначально устойчивых к этому фкрме! rry, в присутствии канонического субстрата.

5. Показано, что эндонукпеаза fi»RII кооперативно взаимодействует с двумя участками уз! ивания, предложена кинепетеская схема этого процесса

6. Установлено, «по активной формой фермента £coRII является димер, фюрмщтуюшлй в присутствии Mg2+ активный комплекс с двумя участками узнавания ДНК Предложи а модель симметричного комплекса, состоящего из двух субьединиц белка и четырех тяжей ДНК, в которо» i восстанааттшается симметрия несимметричной централытой пары участка узнавания.

7. Эндонуклеаза &о11, в егшнчие от £coRH, эффекшвно пшрашоуст одноцепочечные атипздезоштрибонуклеотидьг определенной первнчной структуры, формируя и стабшганрта ai юмальные дуплексные структуры.

8. Введение ненустеотидных вставок в участок узнавания &>П приводит к зшчителыюму уаетичению эффекшвносш ферметпативного пиролиза Впервые для эндонукпеаз рестрикции типа II в случае ДоП обнаружена возможность направленного изменения специфичности растепления. Предполагается, что в активном комплексе с ферментом SsoII ДНК находится в 'опфьгтон" фюрме.

9. Продемонстрированы принципиальные различия структуры ДНК в акптных комплексах с фхрмекгами ¿boRII и ДоП, что подтверждает исключительное разнообразие структурных форм ДНК, вовлеченных во взаимодействия с эндонуклеазами рестрикции типа II.

Оаюиюе содержание диссертации отражаю в следующих публикациях:

1. Kubareva ЕА, Petraustene O.V., Gromova ES. - Acceleration cf the cleavage of 30-mcmbavd DNA diplex by EcoRII restriction endonuclease in the presence cf suhstrute with canoivca! and modified гссоджт sites. - Second New England Biolabs wortshop on biological modification, Beriin, 1990, p. 121.

2. Пяграускшг O.B., Кубарева ЕА, Громова ЕС - Оюопрофоптитрччсский метод иссаедовааы¡юаарпаае!ДНК-д}1иаахкзу/донукпеахашpccmpuKUfai.- Молекулярная биотопы, 1991, 25(5), 1424-1426.

3. Gromova ES., Petraustene O.V., Kubareva ЕА - Study cf the Mechanism of EcoRII Endonuchase Activation milt Syithctic Substrates.- NucL Acids Res. Symp.Ser., 1991, No 24, p.217-218.

4. Kubareva EA, Petraustene O.V., Gromova ES. - DNA dplexes Kith non-ntcleotidcs itisnts: interaction with reshictim atdomclcases. - NucL Acids Res. Symp.Ser., 1991, No 24, p.30S.

5. Пятраускене O.B., Кубарева ЕА, Громова ЕС - Вхпмодсйапвпе эпдонукказ реапрчацш с одпощзкмешш фрагментами ДНК Окхтрофотамет/хмсааш метод изучения (¡ериептативш.к реакцш. - Тезисы докладов И-го Всесоюзного симпозиума 'Теоретические и прикладные аспекты молекулярной бпатопш", Самарканд, 1991 г., с. 132

6. Кубарей ЕА, ГЪпрпуосене О.В., Громова ЕС - Стимулирование действия эндонуклеазы рестрикции EcoRII с немощью синтетшсских субстратов. - Тезисы докладов И-го Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991 г.,

7. Petraustene O.V., Kubaieva ЕА, Gtomova ES. and Shabarava ZA - Mechanisn <f the Interaction of EcoRII Restriction Enckrsuckax itii/i Two Rccogiilion Sites Probing cfModified DNA Duplexes as Activators of the Enzyme. - Eur. J. Biochemistry, 1992,208, p. 617-622.

8. Kubaieva EA, Petiauskene O.V., Karysgina AS., Taslilitsky V.N., Nikdstaya LI. and Gromova ES.- Cleavage of Synthetic Substrates Containing Non-nucleotide Inserts by Restriction Endomclmrs. Change in the Specificity cfEndonuclease SsoR - Nucl Acids Res., 1992,20, (17), 4533-4538.

9. Кубарева ЕА, ГЪпраускене O.B., Карягина AC, Никольская НИ., Громова ЕС -Изменение спауфнности рааиршш синтетшахих субстратов эпдопуклеаэой рестрищш SsoII щтс» введения ю$клеотидных вставок в участок узнавания фермента. - Биосрганичсская химия, 1992, 18(8), 1133-1135.

10. Пятраускию ОБ., Кубарева ЕА, Громова ЕС, Пайн К.-Д, Црс Д, Шабарова ЗА -Печение механизма аотааищ эндонуклеазы рестрищш EcoRII с помощью сиптетшеских ДНК-д>пкксов. - Молекулярная биология, 1993,27(3), 507-518.

11. Gromova ES., Slieflyan G.Ya, Petraustene O.V., Kubareva EA, Shabarova ZA. - The use if synthetic substrates for study cf restriction endonucleases - new developments. - New Englard Biolabs workshop "Restriction Endonucleases arrf Methytamsferases Structures and Mechanisms", Vemxxit (USA), July 3-8, 1993, p. 71.

12 Petrauskene O.V., Kaipova EA, Gromova ES. and Guschlbauer W. - 7Uo subunits of EcoRII reliction endonuclease interact with tm DNA recognition stes. - Biochem. Bicphys. Res. Comm., 1994, in press.

c. 111.