Структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-лигандами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Рязанова, Александра Юрьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2012
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова
На правах рукописи
Рязанова Александра Юрьевна
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА С5-ЦИТОЗИНОВОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ вїоІІ И ЕЕ КОМПЛЕКСОВ С ДНК-ЛИГАНДАМИ
1
02.00.10 - биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
МОСКВА-2012
7 МАЯ 2012
005043402
005043402
Работа выполнена на факультете Биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в отделе химии нуклеиновых кислот Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научный руководитель: доктор химических наук, профессор
Кубарева Елена Александровна
Официальные оппоненты: доктор химических наук,
профессор, член-корреспондент РАН Цетлин Виктор Ионович
доктор биологических наук Лунин Владимир Глебович
Ведущая организация: Институт химической биологии и
фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Защита состоится 29 мая 2012 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Реакция метилирования ДНК является одной из основных в биохимии клетки. У млекопитающих метилирование ДНК играет существенную роль в регуляции экспрессии генов, импринтинге, упаковке хроматина, эмбриональном развитии, возникновении онкологических заболеваний. У прокариот метилирование ДНК обеспечивает защиту клетки от чужеродной ДНК, а также тесно связано с регуляцией экспрессии генов и с процессами репликации и репарации ДНК. Метилирование ДНК катализируется важнейшим классом ферментов нуклеинового обмена - ДНК-метилтрансферазами (МТазами).
С5-Цитозиновые ДНК-МТазы обнаружены как у прокариот, так и у эукариот. Аминокислотные последовательности каталитических доменов бактериальных и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-МТаз характеризуются общей структурной организацией. Не так давно было установлено, что многие МТазы в клетке осуществляют не только метилирование ДНК, но и обладают другими функциями (например, регуляторной). Так, в базе данных РГаш (http://pfam.sanger.ac.uk) содержатся 5065 аминокислотных последовательностей, в которых идентифицируется домен «С5-цитозиновая ДНК-МТаза» (РР00145). Из них лишь 61% содержит только один МТазный домен. В остальных 39% наблюдаются удвоения этого домена и/или какие-либо дополнительные домены. Молекулярные основы взаимодействия такого рода белков с ДНК, особенно с операторными (регуляторными) последовательностями, мало изучены.
Данная работа направлена на исследование механизмов узнавания ДНК бифункциональными МТазами на примере прокариотической С5-цитозиновой ДНК-МТазы ЭзоП (М^эоП), входящей в систему рестрикции-модификации (Р-М) [1-го типа ЭзоП. М.БвоП узнает в двутяжевой ДНК последовательность 5'-ССШО-3' (где N = А, С, в или Т) и в присутствии кофактора Я-аденозил-^-метионина (Лс1оМе1) метилирует внутренний остаток цитозина с образованием остатка 5-метилцитозина. Интересной особенностью М^оН является ее протяженный Ы-концевой участок (1-71 аминокислотные остатки (а. о.)), наличие в котором мотива «спираль-поворот-спираль» (СПС) обусловливает способность МТазы выступать в роли фактора транскрипции и регулировать экспрессию собственного гена, а также гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции ЗвоИ (Я^оН). Регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию М-БвоИ с промоторной областью генов системы Р-М 5бо11 (Karyagina е/ а1„ 1997; 5Уи7оу е( а!., ¡998). Основное число контактов М.БзоП с промоторной областью обеспечивает локализованный внутри последней 15-звенный инвертированный повтор (в дальнейшем называемый регуляторным участком).
Таким образом, М^оН представляет собой бифункциональный белок: с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования ДНК. Какова взаимосвязь между активностями, которые
обеспечиваются разными доменами в составе одной полипептидной цепи, - вопрос, для МТаз практически не исследованный. Это определяет актуальность всестороннего изучения структурно-функциональной организации комплексов М.ЭяоИ с участком метилирования и с регуляторным участком.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлась структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы БвоП и ее комплексов с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования и регуляторный участок.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Охарактеризовать третичную и четвертичную структуру апо-формы МЯвоП и ее делеционных мутантов.
2. Изучить комплексообразование МБвоП с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования или регуляторный участок:
• стехиометрию комплексов;
• эффективность связывания М.БзоН с ДНК-дуплексами;
• скорости комплексообразования М.ЭзоП с ДНК-дуплексами.
3. Проанализировать структурную организацию комплекса М.ЗэоН с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок.
4. Детализировать модель функционирования М^оП в клетке как фермента модификации и как фактора транскрипции.
Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что М^оП в апо-форме является мономером. Продемонстрировано, что при взаимодействии М.ЭзоП с ДНК-дуплексами различной длины (от 15 до 60 пар нуклеотидов (п. н.)), содержащими участок метилирования, образуются специфические ДНК-белковые комплексы со стехиометрией 1:1. Получены структуры низкого разрешения М^оП в апо-форме и в комплексе с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования. Радиус инерции комплекса уменьшается, что свидетельствует о его более компактной структуре по сравнению с апо-формой белка.
Показано, что делеционный мутант, представляющий собой Ы-концевую область БзоП-подобных ДНК-МТаз, сохраняет вторичную структуру: он содержит 32% а-спиралей и 20% Р-тяжей. Впервые подобраны условия, в которых данный делеционный мутант способен формировать специфические комплексы с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что в полноразмерной М.ЗэоН Ы-концевая область существует в виде структурно обособленного домена. С помощью внутримолекулярной «сшивки» под действием бис-малеимидоэтана продемонстрировано, что линкер, соединяющий Ы-концевую область М^оП с областью М.ЗбоП, ответственной за метилирование, является подвижным.
Показано, что при взаимодействии М^оИ с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок, образуются два специфических комплекса. Один
из них имеет стехиометрию 1:1, в то время как второй состоит из двух субъединиц M.SsoII и одного ДНК-дуплекса. Впервые показано, что в комплексе M.SsoII с регуляторной ДНК остаток Cysl42 в каталитическом центре фермента сближен с ДНК. Предложена структура комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок: N-концевые области белка специфически взаимодействуют с регуляторным участком, а области M.SsoII, ответственные за метилирование, неспецифическим образом связаны с ДНК, фланкирующей регуляторный участок. По-видимому, связывание области, ответственной за метилирование, с ДНК в непосредственной близости от регуляторного участка придает дополнительную стабильность этому комплексу.
Впервые показано, что метилтрансферазная и регуляторная активности M.SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Изучение кинетики взаимодействия M.SsoII с ДНК-лигандами свидетельствует о том, что связывание этого белка с участком метилирования происходит значительно быстрее, чем с регуляторным участком. Проведена теоретическая оценка числа участков метилирования и числа регуляторных участков в ДНК клетки. Эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается M.SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.
Полученные в настоящей работе данные о свойствах M.SsoII расширяют знания о бактериальных системах Р-М, позволяют понять особенности поведения МТаз как транскрипционных факторов и могут быть использованы для конструирования новых регуляторных белков. Так как ответственные за метилирование домены С5-цитозиновых ДНК-МТаз из разных источников имеют сходную первичную структуру и для них постулирован единый механизм метилирования ДНК, результаты исследования могут быть использованы для объяснения механизмов взаимодействия эукариотических МТаз с ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российском и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.), на конференциях «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, апрель 2009 г.), «Ломоносов-2010» (Москва, Россия, апрель 2010 г.), «IV Slovak Biophysical Symposium» (Модра-Гармония, Словакия, апрель 2010 г.), «Workshop "Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids" of the International Research Training Group GieGen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded)» (Вильнюс, Литва, май 2010 г.), «6th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification» (Бремен, Германия, август 2010 г.) и «Химия в молекулярной биологии» (Москва, Россия, декабрь 2011 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен структурно-функциональной характеристике доменов, входящих в состав С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 76 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 333 цитированных работы.
Работа выполнена при поддержке РФФИ и программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ* 1. Характеристика объектов исследования
На данный момент известны шесть SsoII-подобных систем Р-М, обнаруженных в различных бактериальных штаммах. Помимо самой SsoII из Shigella sonnei 47, это Ecll8kl из Enterobacter cloacae 18k, Kpn2kl из Klebsiella pneumoniae 2k, StyD4I из Salmonella typhi D4, SenPI из Salmonella enteritidis PI, а также система Р-М, пока не получившая названия, кодируемая плазмидой рСЕЮС из штамма Е. coli 07:К1 СЕЮ (GenBank: СР003037.1). Во всех SsoII-подобных системах Р-М гены эндонуклеазы рестрикции (ЭР) и МТазы расположены дивергентно, их нуклеотидные последовательности идентичны на 99%, а соответствующие белки различаются одним-двумя аминокислотными остатками. Можно предположить одинаковый механизм функционирования этих систем Р-М.
Объектами изучения в данной работе являлись 4 белка - M.SsoII, M.Ecll8kI, делеционный мутант A(72-379)M.EcI18kI, который представляет собой N-концевую область M.Ecll8kI, ответственную за регуляцию транскрипции, и M.NlaX, которая является гомологом области M.SsoII, ответственной за метилирование. Плазмиды, несущие гены этих белков, были любезно предоставлены д.б.н. А. С. Карягиной-Жулиной (ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, г. Москва) и к.б.н. А. С. Солониным (НИИ физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН, г. Пущино). Все белки, использованные в данной работе, несут дополнительную N-концевую последовательность, содержащую блок из шести остатков гистидина, что позволяет выделять их методом аффинной хроматографии. Ранее было показано, что наличие такой дополнительной аминокислотной последовательностей на N-конце белковой молекулы не влияет на
' Отдельные части работы были выполнены под руководством д-ра Г. С. Качаловой в лаборатории проф. Х.-Д. Бартуника в Институте имени М. Планка (г. Гамбург, Германия); совместно с д-ром П. В. Коиаревым под руководством проф. Д. И. Свергуна и д-ра Г. С. Качаловой в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL; г. Гамбург, Германия); под руководством проф. П. Фридхоффа в Институте биохимии Университета имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия); под руководством проф. Т. Гианика в отделении ядерной физики и биофизики факультета математики, физики и вычислительной техники Университета имени Коменского (г. Братислава, Словакия).
ферментативную активность М.ввоП и М.Ы1аХ (Картина, 1997). Молекулярные массы рекомбинантных белков составляют 44,9 кДа (М.ЭзоП), 44,2 кДа (М.Ес118к1), 9,4 кДа (Л(72-379)М.Ес118к1) и 36 кДа (М.№Х).
Для изучения особенностей взаимодействия этих белков с ДНК использовали дуплексы, различные по длине и нуклеотидной последовательности, которые представлены в табл. 1.
Таблица 1
ДНК-дуплексы, использованные в работе
Название Нуклеотидная последовательность*
lSmet 5'-AGAGCCAGGAACCGA-3' 3'-TCTCGGTCCTTGGCT-5'
31raet 5' -GTATGAAGCTAGAGCCAGGTTGGCAGCATTC-3' 3'-CATACTTCGATCTCGGTCCAACCGTCGTAAG-5'
60met 5'-GACTTACAGTTGATAGTATGAAGCTAGAGCCAGGTTGGCAGCATTCTACTCATGTACTTG-3' 3'-CTGAATGTCAACTATCATACTTCGATCTCGGTCCAACCGTCGTAAGATGAGTACATGAAC-5'
31 reg 5' -ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3' 3' -TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT- 5'
60reg 5 r-ACGTTCATAATTGGAATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAACACTTAATTCTGGT-3 ' 3'-TGCAAGTATTAACCTTAGTTTTGTCCTGTTIAACAGGATTTTGGTTGTGAATTAAGACCA-5'
15ns 5'-AGTACTAATTAGCAT-3' 3'-TCATGATTAATCGTA-5'
31ns 5'-GATCAGTACTAATTAGCATTATAAAGGATCA-3' 3' -CTAGTCATGATTAATCGTAATATTTCCTAGT-5'
60ns 5' -GACTTACAGTTGATAGATCAGTACTAATTAGCATTATAAAGGATCATACTCATGTACTTG- 3' 3' -CTGAATGTCAACTATCTAGTCATGATTAATCGTAATATTTCCTAGTATGAGTACATGAAC-5'
* Синим цветом выделен участок метилирования, красным цветом - регуляторный участок.
2. Выделение рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз
Культуры клеток выращивали в присутствии канамицина и ампициллина. Экспрессию целевого белка индуцировали с помощью добавления изопропил-1-тио-ß-D-галактопиранозида. M.NlaX и A(72-379)M.Ecll8kI демонстрировали высокий уровень экспрессии. Напротив, уровень экспрессии M.SsoII и M.Ecll8kI был чрезвычайно низок, так как эти ферменты токсичны для клетки в высоких концентрациях (Карягина, 1997).
В данной работе была существенно усовершенствована методика выделения M.NlaX и M.SsoII, разработанная ранее (Karyagina et ai, 1995). Предложены два варианта выделения этих белков. Для изучения структуры M.NlaX и M.SsoII методами гель-фильтрации и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) использовали препараты, выделенные по Методике 1. Она включала лизис клеток в присутствии ДНКазы I и ингибиторов протеаз «Complete, EDTA free» (Roche, Швейцария), центрифугирование лизата и хроматографию надосадочной жидкости на
гепарин-сефарозе (как для M.NlaX, так и для M.SsoII), а затем - на Ni-сефарозе (для M.SsoII).
Во всех остальных экспериментах использовали препараты M.SsoII, M.Ecll8kI и Д(72-379)М.Ес118к1), выделенные по Методике 2. Она включала лизис клеток в буфере, содержащем 1 М NaCl, в присутствии фенилметилсульфонилфторида — ингибитора сериновых протеаз, центрифугирование лизата и хроматографию надосадочной жидкости на Ni2+-NTA-arapo3e (как для M.SsoII и M.Ecll8kI, так и для Д(72-379)М.Ес118к1), а затем - на гепарин-сефарозе (для M.SsoII и М.Ес118к1). Последней стадией был диализ. Высокая ионная сила в буфере для лизиса клеток приводила к разрушению любых комплексов изучаемых белков с нуклеиновыми кислотами клетки, что позволяло без использования ДНКазы I получать препараты белка, не содержащие примеси ДНК. Препараты белка не содержали и других веществ нуклеотидной природы - кофактора реакции метилирования AdoMet и его нереакционноспособного аналога S-аденозил-Л-гомоцистеина (AdoHcy), которые обычно выделяются в комплексе с ДНК-МТазами (Piekarowicz and Brzezinski, 1980; Kumar et al„ 1992; Szczelkun and Connolly, 1995; Schluckebier et al„ 1997).
Выходы M.SsoII составили 0,14 мг и 0,56 мг на 1 л культуры клеток при выделении по Методике 1 и Методике 2. соответственно. Таким образом, Методика 2 позволяет получить в 4 раза больший выход M.SsoII, чем Методика 1.
3. Олнго,мерное состояние и структура низкого разрешения ДНК-метилтрансфераз SsoII и МаХ в апо-форме
Большинство ДНК-МТаз являются мономерами в растворе, хотя существуют и исключения. Факторы транскрипции часто функционируют в форме димеров. Поскольку M.SsoII является и ДНК-МТазой, и фактором транскрипции, требовалось экспериментально определить олигомерное состояние этого белка. В качестве контроля использовали M.NlaX - гомолог M.SsoII, на 67% идентичный ее области, ответственной за метилирование, и не способный регулировать транскрипцию.
Методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 75 молекулярная масса M.NlaX была оценена как 36 кДа, a M.SsoII - как 41 кДа, Это свидетельствует о том, что оба белка существуют в растворе в мономерной форме. Тот же вывод следует из данных, полученных методом SAXS (табл. 2).
Таблица 2
Параметры, определенные методом SAXS
Образец Rt, им f»„, HM M„ кДа
M.NlaX 2,36 ± 0,04 7,0 ± 0,5 33 ±4
M.SsoII 3,01 ±0,04 11,0 ±0,5 38 ±5
M.SsoII-AdoHcy-15met 2,79 ± 0,04 11,0 ±0,5 -
Rs- радиус инерции, Dmax- максимальный диаметр, М, - молекулярная масса.
Метод SAXS позволяет получить структуры низкого разрешения для белков в растворе. Такие структуры для M.SsoII и M.NlaX были получены моделированием ab initio - то есть только на основе экспериментальных данных по рассеянию рентгеновских лучей. Молекула M.NlaX представляет собой компактную глобулу, которая по своей форме и размерам близка к структуре гомологичной ДНК-МТазы Hhal (M.Hhal), полученной методом РСА (рис. 1а). Молекула M.SsoII, напротив, имеет продолговатую форму (рис. 16). При этом домен 1 молекулы M.SsoII по своей форме и размерам близок к структуре M.Hhal, что позволяет считать его областью белка, ответственной за метилирование. Можно предположить, что полость в домене 1 является ДНК-связывающим центром, а домен 2 представляет собой N-концевую область M.SsoII.
Рис. 1. (в) Совмещение модели M.NlaX (серые шарики), построенной ab initio с помощью программы DAMMIN, с кристаллографической моделью мономера M.Hhal (синие линии). (б) Модель M.SsoII, построенная ab initio в нрофамме DAMMIN.
4. Характеристика N-концевой области SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз
Для проверки гипотезы о том, что N-концевая область SsoII-подобных ДНК-МТаз является структурно обособленным доменом, использовали делеционный мутант A(72-379)M.Ecll8kI. Методом спектроскопии кругового дихроизма продемонстрировали, что он содержит 32% ot-епиралей и 20% ß-тяжей.
Д(72-379)М.Ес11Ш способен формировать специфические ДНК-белковые комплексы при взаимодействии с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок (рис. 2а). В контрольном эксперименте с 60-звеиным ДНК-дуплексом, не содержащим участков узнавания, комплексы не образовывались (рис. 26). Таким образом, делеционный мутант Д(72-379)М.Ес118к1 сохраняет ядро своей структуры, необходимое для узнавания специфической последовательности в ДНК. Эти данные свидетельствуют в пользу возможности существования N-концевой области M.SsoII в виде структурно обособленного домена в полноразмерной M.SsoII.
i" Домен 2
ДНК-связывающий центр
> Домен
К 1 2 3 4 5 6 7
К 1 2 3 4 5 6 7
Неспецифические ДНК-белковые, х"" комплексы
Специфический ДНК-белковый ^ комплекс
— ДНК-дуплекс ■ а 6
Рис.2. Анализ равновесного связывания 16,6 мкМ A(72-379)M.Ecll8kI с 0,12 мкМ 5'-32Р-меченными ДНК-дуплексами (а) 60reg и (6) 60ns в присутствии гепарина методом «торможения» в 12%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в неденатурирующих условиях. Дорожка К содержит свободный ДНК-дуплекс. Дорожки 1-7 содержат 0, 3,1, 9,4, 31,3, 62,5, 125 и 313 мкМ гепарина, соответственно.
5. Конформационная подвижность линкера, соединяющего домен ДНК-метилтрансферазы ввоП, ответственный за регуляцию транскрипции, с доменом, ответственным за метилирование
Анализ аминокислотной последовательности, а также данные БАХв позволяют предположить, что в полноразмерной М.ЗвоН остатки 56-71 формируют линкер, обеспечивающий определенную подвижность >}-концевого домена М.ввоИ, необходимого для регуляции транскрипции, относительно области белка, ответственной за метилирование. Для проверки этого предположения использовали метод поперечной «сшивки» полипептидной цепи за счет формирования двух ковалентных связей, В качестве реагентов выступали быс-малеимидоэтан (ВМОЕ) и 1,11-бнс-малеимидотетраэтиленгликоль (ВМ[РЕО]4) - соединения, имеющие две малеимидные группы, разделенные линкером разной длины, которые способны взаимодействовать с тиольными группами остатков цистеина белка (табл. 3).
Рекомбинантная М^воИ содержит 2 остатка цистеина: Суз 142 в каталитическом центре фермента и Сув(-1) в >1-концевом дополнительном пептиде, содержащем блок из шести остатков гистидина. Инкубация М.взоП с ВМОЕ или ВМ[РЕО]4 может приводить к одному продукту внутримолекулярной «сшивки», Су5(-1)-Су8142, и к трем продуктам межмолекулярной «сшивки»: Су5(-1)-Су8(-1), Суз(-1)-Су5142 и Суз142-Су$142. Для того чтобы различить эта продукты, аналогичные реакции параллельно проводили с М.Ес118к1, аминокислотная последовательность которой идентична М-ввоИ на 99%, но содержит только один остаток цистеина - Сув142 в каталитическом центре. Очевидно, что в случае М.Ес118к1 имелась возможность образования только одного продукта межмолекулярной «сшивки», Су5142-Сув142, а формирование продукта внутримолекулярной «сшивки» было невозможным.
В результате реакции М^оП с ВМОЕ или с ВМ[РЕО]4 получен продукт внутримолекулярной «сшивки» Сув-Суэ (рис. За, дорожка 1). Его выход близок к
50% для обоих реагентов, что свидетельствует об отсутствии стерических ограничений для сближения боковых цепей остатков Суз(-1) и Суз 142 на расстояние менее чем 10,5 А. В случае М.Ес118к1, содержащей только СувМг, данный продукт не образовывался (рис. За, дорожка 3). Высокий выход внутримолекулярной «сшивки» Сув-Сув свидетельствует о подвижности линкера, соединяющего М-концевой домен М.ЗвоН и область белка, ответственную за метилирование (рис. 36).
Таблица 3
Реагенты, использованные для ковалентной «сшивки» остатков цистеина ДНК-метилтрансферазы взоП
«Сшивающий» агент Формула Расстояние менаду прореагировавшими группами в продуте «сшивки» Модифицируемая группа
Бнс-малеимидоэтан (ВМОЕ) ,9 о <н> О 6' До 10,5 А -вн
1,11-£ис-малеимидо-тетраэтиленгликоль (ВМ[РЕОЬ) ,0 О. _ До 17,8 А -БН
4-(Лг-малеимидо)-бспзофенон (ВРМ) О О сЛх^ До 11,4 А -БНи неселективно
а «сшивка» б
Рис.3, (а) Продукты «сшивки» М^оН и М.ЕсПШ с помощью ВМОЕ. Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли. (б) Предполагаемое взаимное расположение остатков цистеина в молекуле М.ЭзоИ при образовании продукта внутримолекулярной «сшивки» Су8(-1)-Суз142 с помощью ВМОЕ. Голубым цветом выделен И-концевой домен М.ЗвоП (а. о. 1-59), желтым - линкер (а. о. 60-71), зеленым - область М.ЭвоП, ответственная за метилирование (а. о. 72-379). Остатки цистеина выделены синим, А(1оНсу - коричневым, ВМОЕ - красным. Из дополнительного М-концевого пептида, содержащего гексагистидиновый блок, показан только Сув(-1).
6. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-лигандами
Методом SAXS был исследован комплекс M.SsoII с AdoHcy и 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования (15inet). Максимальный диаметр комплекса совпадает с таковым для апо-формы M.SsoII, а значения радиуса инерции близки (табл. 2). Таким образом, M.SsoII в комплексе с 15met сохраняет мономерную структуру. Стоит отметить, что немного меньшее значение радиуса инерции в случае комплекса (2,79 ± 0,04 нм) свидетельствует о более компактной структуре комплекса по сравнению с апо-формой белка (3,01 ± 0,04 нм). Согласно данным для гомологичной ДНК-МТазы Hhal, компактизация происходит благодаря закрыванию каталитической петли при взаимодействии с субстратом и только в том случае, когда фермент связывается с ДНК, содержащей участок метилирования. Методом моделирования ab initio получена структура низкого разрешения M.SsoII в комплексе с lSmet (рис. 4).
Рис. 4. Пространственная структура комплекса M.SsoII с AdoHcy и ДНК-дуплексом )5met, полученная моделированием ab initio в программе MONSA. Желтым цветом выделена ДНК, красным - белок.
Для оценки стехиометрии комплексов M.SsoII с более длинными ДНК-лигандами (31- и 60-звенными) изучали их подвижность в гелях с различным содержанием полиакриламида. Молекулярную массу определяли по калибровочному графику, построенному на основе данных о подвижности в этих гелях белков-маркеров. При использовании 31-звенного ДНК-дуплекса, содержащего участок метилирования (31 met), наблюдалось образование ДНК-белкового комплекса, имеющего стехиометрию 1:1, с выходом более 95% (рис. 5а).
Рис. S. Анализ равновесного связывания 9мкМ M.SsoII с ДНК-дуплексами (a) 31met (10 мкМ) и 31ns (10 мкМ); (б) 31 reg (10 мкМ) и 60reg (3 мкМ) методом «торможения» в 9%-ном ПААГ в неденатурирующих условиях. Комплексообразование проводилось в присутствии AdoHcy. Гель окрашен кумасси.
M.SsoII M.SsoII
31 met 31ns 31 reg eOreg
—K4' — КЗ'
-К2' К2- I——I -К2
-К1
-кг „„_
Для сравнения изучали неспецифическое комплексообразование М.ЗвоП с 31-звенным ДНК-дуплексом 31пз, не содержащим участков узнавания этого белка. Были детектированы четыре ДНК-белковых комплекса, формировавшиеся с примерно одинаковым выходом (рис. 5а).
М,З.чоII связывается с 31-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок (31^), образуя ДНК-белковый комплекс со стехиометрией 1:1 (выход более 95%) (рис. 56). При увеличении длины ДНК-дуплекса до 60 п. н. наблюдаются два ДНК-белковых комплекса - К1 и К2 (рис. 56). Как показывают эксперименты с добавлением в реакционную смесь гепарина (рис. 6), оба этих комплекса являются специфическими. Комплекс К1 содержит один ДНК-дуплекс и одну субъединицу М^боП. Молекулярная масса комплекса К2 позволяет предположить, что он состоит или из одного ДНК-дуплекса и двух субъединиц М.ЗвоН, или из двух ДНК-дуплексов и одной субъединицы М.ЗвоН.
Неспецифические
ДНК-белкоаые
комплексы
Специфические
ДНК-белковые
комплексы
ДНК-дуплекс
Рис. 6. Анализ равновесного связывания 1,4 мкМ М.ЭзоИ с 0,12 мкМ 5'-32Р-меченным ДНК-дуплексом 60^ в присутствии гепарина методом «торможения» в 7%-ном ПААГ в неденату-рирующих условиях. Дорожка К исходный ДНК-дуплекс. Дорожки 1-8 содержат 0, 0,28, 0,70, 1,4, 2,8, 6,3, 18,7 и 31,3 мкМ гепарина, соответственно.
При добавлении глутарового альдегида в реакционные смеси, содержащие М.ЗбоП и различные 60-звенные ДНК-дуплексы, продукт «сшивки» наблюдался только при взаимодействии М.ЗвоН с 60^ (рис. 7, дорожки 5 и 6). Таким образом, в специфическом комплексе М.ЗвоП с 60^ имеются сближенные белковые субъединицы, то есть в состав комплекса М.БзоН-бО^ входят две субъединицы М.ввоП и один ДНК-дуплекс.
M.Ssoll M.Ssoll M.Ssoll
+ + + M.Ssoll 60met 60reg__60ns__
M ~1 2 Г ~4 5 б" 7 8 9~ 10 11 12
200 . , 160 ■ -
120 НЧ «Сшитые»
1J5 ИЯ*> -молекулы
70 К» M.Ssoll
50 ; 40
■M.Ssoll
Рис.7. Анализ продуктов «сшивки» М.ЗэоП (1,2 мкМ) с помощью глутарового альдегида
методом гель-электрофореза по Лэммли. Гель окрашен кумасси. Дорожки 1-3 содержат ДНК-дуплекс 60п^ (2,4 мкМ), дорожки 4-6 - ДНК-дуплекс 60^ (2,4 мкМ), дорожки 4-6 -ДНК-дуплекс бОм (2,4 мкМ). Реакционные смеси в дорожках 1, 4, 7 и 10 не содержат глутарового альдегида. В дорожках 2, 5, 8 и 11 реакция остановлена через 5 мин инкубации с глутаровым альдегидом, в дорожках 3, 6, 9 и 12 - через 17 мин. Дорожка М содержит белки-маркеры. Их молекулярная масса в кДа указана слева.
7. Взаимное расположение доменов ДНК-метилтрансферазы ввоН в ее комплексе с ДНК, содержащей регуляторный участок
Для изучения окружения остатка цистеина в комплексе М.БвоП с регуияторной ДНК использовали метод «фотосшивки» ДНК-белкового комплекса с помощью бифункционального фотоактивируемого реагента 4-(Лг-малеимидо)бензофенона (ВРМ) (табл. 3). Его малеимидная группа специфически реагирует с тиольной группой остатка Суэ. При облучении УФ-светом бензофеноновая группа возбуждается и может встраиваться по радикальному механизму в любую связь С-Н.
Смеси М^воП с ДНК-дуплексами выдерживали 30 мин при 37 °С для формирования комплексов. Затем добавляли ВРМ и облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм. Половину каждой реакционной смеси наносили на неденатурирующий гель для подтверждения комплексообразования М.ЗэоИ с ДНК (рис, 8а). Вторую половину наносили на гель по Лэммли для обнаружения продуктов «сшивки». Видно, что «сшивка» образуется только в комплексе М^яоП с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок (рис. 85), и ее выход увеличивается с увеличением времени УФ-облучения.
Контрольный эксперимент с М.Ес118к1, имеющей только один остаток Суз (в каталитическом центре), показал, что именно этот остаток Сув участвует в реакции с ВРМ. В экспериментах с 32Р-меченным ДНК-дуплексом наблюдалось включение радиоактивной метки в продукт «фотосшивки» (рис. 8в), что свидетельствовало об образовании ДНК-белкового, а не белок-белкового конъюгата. Следовательно,
происходила «пришивка» белка к ДНК. Таким образом, в комплексе М.ЗвоП с регуляторной ДНК остаток Суз142 каталитического центра фермента сближен с ДНК.
М.вэоН М.ЕсИ 8к1 Белок
бОте! бОгед — бОгед ДНК
Комплекс К2 Комплекс К1
ДНК
М.БвоИ М.ЕсИ 8к! Белок
60те1 бОгед — бОгед ДНК
О' 20' 60' 0' 20' 60' 0' 20' 60' 0' 20' 60' Время УФ-облучения
«Да М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
150 120 100
70 60
—«Сшивка» белок—ДНК
-Исходный белок
4 5 6
«•»■ —«Сшивка» белок-ДНК
Рис.8. Продукты «фотосшивки» М.БвоП, М.ЕсП8к1 и их комплексов с ДНК-дуплексами 60те1 и 60ге§ с помощью ВРМ. Время УФ-облучения указано над дорожками, (а) Анализ методом электрофореза в 6%-ном ПААГ в неденатурируклцих условиях. Гель окрашен бромидом этидия. (б) Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли. Гель окрашен кумасси. (в) Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли. 32Р-меченная ДНК детектирована методом авторадиографии.
Предполагаемая структура комплекса М.вБоИ-бО^ приведена на рис. 9. 1Я-Концевые области двух субъединиц М.ввоП взаимодействуют с регуляторным участком, каждая со своей половиной палиндрома. Область М.ЭвоН, ответственная за метилирование, связывается с ДНК, фланкирующей регуляторный участок. Поскольку участков метилирования в этом ДНК-дуплексе не содержится, такое связывание является неспецифическим, го есть основано на электростатических взаимодействиях М^эоИ с углеводофосфатным остовом ДНК и не зависит от нуклеотидной последовательности.
Для того чтобы такая структурная организация была возможна, требуется высокая подвижность линкера, соединяющего М-концевую область М.БзоИ с областью, ответственной за метилирование. Эта подвижность была продемонстрирована в данной работе в ходе экспериментов по «сшивке» остатков Суз(-1) и СуБ142 М.взоП (см. раздел 5). По-видимому, связывание области М.ЗвоИ, ответственной за метилирование, с ДНК около регуляторного участка придает дополнительную стабильность этому комплексу, а также предотвращает связывание М.ЗбоП с участком метилирования.
Ч____У
Рис. 9. Предполагаемая структурная организация комплекса, состоящего из двух субъединиц M.SsoII и одного ДНК-дуплекса 60reg. Серым цветом обозначена ДНК, красным выделен регуляторный участок. Скобкой отмечена область, которую M.SsoII защищает от гидролиза ДНКазой I (Karyagina et al„ 1997). Голубым цветом выделен N-концевой домен M.SsoII (а. о. 1-55), желтым - линкер (а. о. 56-71), зеленым - область M.SsoII, ответственная за метилирование (а. о. 72-379). Остатки цистеина выделены синим. Из дополнительного N-концевого пептида M.SsoII, содержащего гексагистидиновый блок, показан только Cys(-1).
8. Сравнение сродства ДНК-метилтрансферазы взоН к ДНК-дуплексам, содержащим участки узнавания, в равновесных условиях
Поскольку взаимодействие МввоП с ДНК-дуплексом 60^ приводит к образованию двух специфических ДНК-белковых комплексов, а с ДНК-дуплексом 60ше4 - только одного, значения равновесных констант диссоциации (Кл) этих комплексов нельзя сравнивать напрямую. Наиболее простой эксперимент,
необходимый для сравнения сродства М.ЗэоН к ДНК-дуплексам 60гс£ и 60те(, состоит в изучении взаимодействия М.БяоП с ДНК-лигандами обоих типов, присутствующими в реакционной смеси одновременно. Для этого 5 нМ \lSsoIt добавляли к смеси, содержащей 5 нМ радиоактивно меченный ДНК-дуплекс и различные количества немеченого дуплекса-конкурента. Реакционные смеси выдерживали 40 мин при 37 °С, затем анализировали методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. В качестве контрольных использовали реакционные смеси, не содержащие дуплекса-конкурента. Выход радиоактивно меченного ДНК-белкового комплекса в этих смесях принимали за 100%. Строили график зависимости выхода радиоактивно меченного комплекса от концентрации дуплекса-конкурента. Экспериментальные точки аппроксимировали кривой и по ней определяли значение Ю50, то есть концентрацию дуплекса-конкурента, при которой выход радиоактивно меченного ДНК-белкового комплекса снижается на 50% (табл. 4).
Таблица 4
Значения Ю50 для дуплексов-конкурентов
ДНК-белковый комплекс Дуплекс-конкурент IC50,11M* Избыток дуплекса-конкурента относительно меченого дуплекса в точке 1С50
M.SsoII-iOmet 60reg 2,75 0,55
60ns 265 53
M.SsoII-60reg, Kl 60met 885 177
60ns 4805 961
M.SsoII-60reg, кг 60met 600 120
60ns 2575 515
Если М-ЯвоЦ способна связывать одновременно оба типа ДНК-лигандов, то на геле должна появляться дополнительная зона, несущая радиоактивную метку (второй ДНК-белковый комплекс в случае смеси М.ЭвоИ с меченым дуплексом 60ше1 и третий - в случае смеси, М^эоП с меченым дуплексом 60^). Однако экспериментально новых комплексов зафиксировано не было, несмотря на то что комплексообразование изучали в широком диапазоне концентраций дуплекса-конкурента. Напротив, добавление дуплекса-конкурента приводило к снижению выхода радиоактивно меченного ДНК-белкового комплекса. Это подтверждает вывод о невозможности одновременного связывания М.ЗэоП с обоими ДНК-лигандами, сделанный на основе результатов ковалентной «сшивки» М^оИ и бОгей с помощью ВРМ (см. раздел 7).
При добавлении к комплексу М^оН-бОп^ эквимолярного количества ДНК-дуплекса 60^ наблюдается более чем 50%-ное вытеснение М.8,чо11 из этого
комплекса. С другой стороны, для 50%-ного вытеснения М.ЭзоН из комплекса К2, содержащего две молекулы белка и один ДНК-дуплекс бОгей, требуется 120-кратный избыток дуплекса-конкурента 60те1 Следовательно, сродство М^оН к ДНК-дуплексу 60^ значительно превышает сродство к ДНК-дуплексу 60п^.
Стоит подчеркнуть, что хотя М.БзоН обладает высоким сродством к неспецифической ДНК, в качестве конкурента ДНК-дуплекс без участков узнавания значительно менее эффективен, чем ДНК-дуплекс, содержащий участок узнавания. Так, исходя из значений 1С50 (табл. 4), ДНК-дуплекс 60те1 является примерно в 5 раз более эффективным конкурентом ДНК-дуплекса 60^, чем ДНК-дуплекс 60пя. Кроме того, ДНК-дуплекс 60^ - почти в 100 раз более эффективный конкурент ДНК-дуплекса 60ше1, чем ДНК-дуплекс бОш.
9. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы БвоП с ДНК-дуплексами, содержащими участки узнавания
Для изучения кинетики взаимодействия М-БвоП с ДНК-дуплексами, содержащими участки узнавания, использовали метод акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре. Он позволяет регистрировать связывание белка с поверхностью, на которой иммобилизована ДНК. Константы скорости ассоциации показали, что связывание с ДНК-дуплексом б0ше1 происходит в 11 раз быстрее, чем с ДНК-дуплексом 60^ (табл. 5). Скорость диссоциации комплекса М^оН-бОте! в 2 раза выше, чем М^БоИ-бО^. Эти данные демонстрируют, что связывание М^воП с участком метилирования происходит более эффективно за счет большей скорости процессов ассоциации и диссоциации.
Кроме того, кинетику взаимодействия М.ЭбоН с ДНК-дуплексами изучали методом «остановленного потока». Этим методом также было показано, что связывание М.&оП с ДНК-дуплексом 60ше1 происходит быстрее, чем с ДНК-дуплексом 60^.
Таблица 5
Параметры связывания ДНК-метилтрансферазы БвоИ с ДНК-дуплексами, получеипые методом акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре
ДНК-дуплекс К, io4 JVTV k„, 10~V КІ, мкМ (A/U» Гц
60met 10,2 ±0,20 3,60 ±0,85 0,035 ± 0,008 47,0 ±4,6
60reg 0,93 ± 0,20 1,93 ±0,65 0,210 ±0,080 60,0 ±7,7
60ns 0,72 ±0,13 1,46 ±0,10 0,203 ±0,039 50,0 ±7,8
к, - константа скорости ассоциации; кЛ - константа скорости диссоциации; К& - кажущаяся равновесная константа диссоциации, рассчитанная как (Д/)ш«і - максимальное
изменение резонансной частоты сенсора, полученное в результате нанесения на сенсор 0,5 мкМ МвзоІІ.
10. Особенности существования системы рестрикции-модификации SsoII в клетке
Если бактериальная ДНК метилирована полностью, то после ее репликации все участки узнавания M.SsoII оказываются монометилированными, и МТаза выполняет функцию поддерживающего метилирования. Такое состояние не несет угрозы для клетки, поскольку R.SsoII неспособна гидролизовать монометилированные участки. Наиболее опасным для клетки является момент, когда в процессе конъюгации она получает систему Р-М впервые, поскольку в этом случае МТаза должна осуществить метилирование всей клеточной ДНК de novo. Хотя в случае отсутствия в растворе молекул M.SsoII транскрипция гена ssoIIM идет значительно более эффективно, чем транскрипция гена ssoIlR, некоторое количество молекул R.SsoII все же образуется (Karyagina et al., 1995). Вполне возможно, что M.SsoII не успевает метилировать de novo все участки до того, как в клетке появляются молекулы R.SsoII. В таком случае образуются двуцепочечные разрывы ДНК. По-видимому, некоторые клетки успевают репарировать их, а некоторые погибают. Однако после того как первый цикл метилирования клеточной ДНК пройден, существование системы Р-М становится практически безопасным для клетки, а также защищает ее от вторжения чужеродной ДНК.
В данной работе показано, что связывание M.SsoII с регуляторным участком делает невозможным связывание этого белка с участком метилирования, а значит, две функции этого белка являются взаимоисключающими. Роль «переключателя» между этими функциями для конкретной молекулы M.SsoII играют процессы ассоциации-диссоциации этой молекулы с регуляторным участком. В свете этих данных центральным становится вопрос о том, как происходит «выбор» МТазы между связыванием с регуляторным участком и связыванием с участком метилирования. Полученные нами результаты свидетельствуют о значительно большем сродстве M.SsoII к регуляторному участку по сравнению с участком метилирования. В таком случае как M.SsoII выполняет свою основную функцию - метилирование ДНК?
Впервые показано, что существенную роль играет кинетика связывания M.SsoII с ДНК: как ассоциация M.SsoII с участком метилирования, так и диссоциация полученного комплекса происходят значительно быстрее, чем с регуляторным участком. Кроме того, важную роль играет соотношение числа участков метилирования и регуляторных участков в клетке. В случайной последовательности ДНК участок метилирования 5'-CCNGG-3'/3'-GGNCC-5' (где N = А, С, G или Т) должен встречаться в среднем один раз на 44 = 256 нуклеотидов. Геном одного из штаммов S. sonnei составляет 4,8 * 106 п. н. (Yangetal., 1995). В таком геноме должно содержаться примерно 4,8 х 106 / 256 ~ 2 х 104 участков метилирования. С другой стороны, 15-звенный регуляторный участок должен встречаться в случайной последовательности ДНК в среднем один раз на 415 ~ 109 нуклеотидов, что значительно превышает размер генома S. sonnei. Следовательно, вероятность
обнаружить регуляторный участок в геноме чрезвычайно мала, и число регуляторных участков в клетке равно числу содержащихся в этой клетке плазмид Р4 (кодирующих систему Р-М SsoII). Наиболее вероятно, что в процессе конъюгации в клетку-реципиент попадает только одна плазмида Р4. Можно принять приближение, что в то время, когда M.SsoII метилирует ДНК данной клетки de novo, в клетке находится только одна такая плазмида. В этом случае число участков метилирования в 2 х 104 раз превышает число регуляторных участков в клетке, что должно обуславливать связывание M.SsoII именно с участком метилирования.
После проведения реакции метилирования M.SsoII диссоциирует от этого участка и связывается со следующим. Постепенно количество неметилированных и монометилированных участков снижается, их избыток относительно регуляторных участков уменьшается, и равновесие смещается в сторону комплексообразования M.SsoII с регуляторным участком. Это приводит к подавлению транскрипции гена ssoIlM. Однако к этому моменту концентрация M.SsoII в клетке, по-видимому, уже достаточно велика, поскольку при транскрипции одного гена может быть получено много молекул мРНК, а при трансляции одной мРНК - много молекул белка. Учитывая то, что число генов ssoIJM в клетке равно числу плазмид Р4 и числу регуляторных участков, количество молекул M.SsoII в клетке значительно превышает количество регуляторных участков. Поэтому после присоединения двух молекул M.SsoII к каждому регуляторному участку в клетке остается достаточно свободных молекул M.SsoII для проведения метилирования генома до конца.
Итак, в данной работе получила дальнейшее развитие и детализацию «маятниковая» модель функционирования системы Р-М SsoII in vivo {Карягина, 1997). Сформулированы два существенных уточнения этой модели.
1. Существование системы Р-М SsoII in vivo практически не представляет опасности для клетки-хозяина после того, как было проведено полное метилирование клеточной ДНК.
2. Продемонстрировано значительно большее сродство M.SsoII к регуляторному участку по сравнению с участком метилирования. По-видимому, эффективное выполнение M.SsoII функции МТазы обеспечивается за счет кинетических факторов и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков в клетке.
выводы
1. Впервые получены структуры низкого разрешения ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплекса с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования, в присутствии З-аденозил-^-гомоцистеина. ДНК-метилтрансфераза SsoII является мономером в апо-форме и в комплексе с метилируемой ДНК. Показана компактизация молекулы белка при связывании с ДНК-субстратом.
2. Экспериментально доказано, что ДНК-метилтрансфераза SsoII взаимодействует с регуляторным участком в составе межгенной области системы рестрикции-модификации SsoII с образованием комплекса, состоящего из двух молекул белка и одного ДНК-дуплекса. В этом комплексе остаток Cysl42 каталитического центра ДНК-метилтрансферазы SsoII сближен с ДНК, фланкирующей регуляторный участок.
3. Установлено, что делеционный мутант, представляющий собой N-концевую область SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз, сохраняет ярко выраженную вторичную структуру и способен специфически связывать ДНК, содержащую регуляторный участок. Продемонстрирована высокая подвижность линкера, соединяющего N-концевую область ДНК-метилтрансферазы SsoII (аминокислотные остатки 1-71) и область этого белка, ответственную за метилирование.
4. Впервые показано, что метилтрансферазная и регуляторная активности SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается метилтрансферазой SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.
Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:
1. Рязанова А.Ю., Молочков Н.В., Абросимова JI.A., Алексеевский A.B., Карягина A.C., Проценко A.C., Фридхофф П., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Вторичная структура N-концевой области SsoII-подобных С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, определенная методом спектроскопии кругового дихроизма. // Молекулярная биология. 2010. Т. 44, № 4, с. 1-11.
2. Ryazanova A.Yu., Kubareva Е.А., Grman I., Lavrova N.V., Ryazanova E.M., Oretskaya T.S., HianikT. The study of the interaction of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII with DNA by acoustic method. // Analyst. 2011. Vol. 136, No. 6, pp. 1227-1233.
3. Ryazanova A.Yu., Winklerl., Friedhoff P., Viryasov M.B., Oretskaya T.S., Kubareva E.A. Crosslinking of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII and its
complexes with specific DNA duplexes provides an insight into their structures. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2011. Vol. 30, No. 7-8, pp. 632-650.
4. Ryazanova A., Kubareva E., LavrovaN., KaryaginaA., KachalovaG., Konarev P., Svergun D.I., Bartunik H.D. Small-angle X-ray scattering studies of the (cytosine-5)-DNA methyltransferase NlaX from Neisseria lactamica. IIHASYLAB Annual Report 2006. Part II, pp. 369-370.
5. Рязанова А.Ю., Качалова Г.С., Конарев П.В., СвергунД.И., Кубарева Е.А., Бартуник Х.Д. Исследование структуры С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз SsoII и NlaX в растворе. // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск, Россия, с. 86.
6. Абросимова Л.А., Молочков Н.В., Рязанова А.Ю. ДНК-метилтрансфераза SsoII как фактор транскрипции: особенности структуры белка и стехиометрии его комплексов с ДНК. // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». Биоинженерия и биоинформатика. Физико-химическая биология. Москва, Россия, с. 1.
7. Абросимова Л.А., Рязанова А.Ю. Стехиометрия ДНК-белковых комплексов, образующихся при взаимодействии SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз с регуляторным участком ДНК. II Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Биоинженерия и биоинформатика. Физико-химическая биология. Москва, Россия, с. 1.
8. HianikT., Ryazanova A.Yu.. Kubareva Е.А., Grman I., LavrovaN.V., Ryazanova E.M., Oretskaya T.S. Application of surface acoustic method to study the interaction of proteins with nucleic acids. // Abstract book of IV Slovak Biophysical Symposium, 2010, Modra-Harraonia, Slovakia, p. 43.
9. Ryazanova A.Yu., Abrosimova L.A., Winkler I., Oretskaya T.S., FriedhoffP., Kubareva E.A. Structural aspects of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII interaction with its target DNAs. // Abstract book of the Workshop "Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids" of the International Research Training Group GieBen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded), 2010, Vilnius, Lithuania, p. 19.
10. Ryazanova A.Yu,, Abrosimova L.A., Burenina O.Yu., Kubareva E.A. (Cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII interaction with its target DNAs: structural aspects. II Abstract book of the 6th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, 2010, Bremen, Germany, P52.
11. Ryazanova A.Yu., Winkler I., FriedhoffP., Oretskaya T.S., Kubareva E.A. Crosslinking of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII and its complexes with specific DNA duplexes provides an insight into their structures. // Abstract book of the Workshop "Chemistry in molecular biology", 2011, Moscow, Russia, p. 18.
Подписано в печать 24.04.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 130 экз. Заказ № 1217 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102
61 12-2/458
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени М.В. Ломоносова
ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
На правах рукописи
РЯЗАНОВА АЛЕКСАНДРА ЮРЬЕВНА
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА С5-ЦИТОЗИНОВОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ЭзоП И ЕЕ КОМПЛЕКСОВ С ДНК-ЛИГАНДАМИ
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
(Рщ/м^в--
02.00.10 - биоорганическая химия
<2—
V 94 /¿/Ы'^У Ч)
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор Кубарева Е. А.
МОСКВА-2012
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................6
ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................8
ГЛАВА 1. Структурно-функциональная характеристика доменов, входящих в состав
С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз (Обзор литературы)............................................10
1.1. Структурно-функциональная характеристика метилтрансферазного домена у прокариотических и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз..........13
1.1.1. Структурная организация метилтрансферазного домена..................................13
1.1.2. Механизм метилирования ДНК............................................................................15
1.2. ДНК-метилтрансферазы с неколькими метилтрансферазными доменами............21
1.3. Дополнительные функции С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз у прокариот 22
1.3.1. Дезаминирование остатков цитозина и 5-метилцитозина................................22
1.3.2. Эндонуклеазная активность................................................................................25
1.3.3. Топоизомеразная активность................................................................................25
1.3.4. С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы как факторы транскрипции..........28
1.4. Домены эукариотических ДНК-метилтрансфераз....................................................34
1.4.1. Функциональные домены ОптН млекопитающих............................................35
1.4.1.1. БМАР1 -связывающий домен........................................................................37
1.4.1.2. РСМА-связывающий домен..........................................................................38
1.4.1.3. КГТ8-домен....................................................................................................39
1.4.1.4. СХХС-домен..................................................................................................41
1.4.1.5. ВАН-домены..........................................................42
1.4.1.6. Кв-линкер......................................................................................................43
1.4.2. Функциональные домены ферментов семейства БппйЗ млекопитающих ... 44
1.4.2.1. РМ^-домен..................................................................................................45
1.4.2.2. АББ-домен....................................................................................................47
1.4.3. Домены ДНК-метилтрансфераз растений..........................................................49
ГЛАВА 2. Структурно-функциональная характеристика ДНК-метилтрансферазы 8зо11
и ее комплексов с ДНК-лигандами (Результаты и их обсуждение)..................................52
2.1. Характеристика объектов исследования....................................................................52
2.2. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз..........57
2.3. Структура апо-формы ДНК-метилтрансферазы БзоН и ее делеционных мутантов................................................................................................................................60
2.3.1. Определение олигомерного состояния ДНК-метилтрансфераз SsoII и NlaX методом гель-фильтрации............................................... 60
2.3.2. Структура низкого разрешения ДНК-метилтрансфераз NlaX и SsoII....... 61
2.3.3. Структурная характеристика N-концевой области SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз ....................................................... 66
2.3.4. Конформационная подвижность линкера, соединяющего домен ДНК-метилтрансферазы SsoII, ответственный за регуляцию транскрипции, с доменом, ответственным за метилирование......................................... 71
2.4. Метилтрансфераза SsoII как фермент, модифицирующий ДНК............... 78
2.4.1. Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы SsoII с кофактором и аналогом кофактора............................................................. 78
2.4.2. Особенности комплексообразования ДНК-метилтрансферазы SsoII
с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования...................... 83
2.4.2.1. Комплексообразование......................................... 83
2.4.2.2. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования....................... 85
2.4.2.3. Структура низкого разрешения комплекса ДНК-метилтрансферазы
SsoII с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования .... 93
2.4.2.4. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования.......................... 95
2.4.2.5. Кинетика «выпетливания» гетероциклического основания при взаимодействии ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования............................................... 99
2.5. ДНК-метилтрансфераза SsoII как фактор транскрипции: структурные особенности комплексов с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок .... 105
2.5.1. Комплексообразование N-концевой области SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок........ 107
2.5.2. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими регуляторный участок........................... 111
2.5.3. Сближенность белковых субъединиц в комплексе ДНК-метилтрансферазы SsoII с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок........ 114
2.5.4. Взаимное расположение доменов ДНК-метилтрансферазы SsoII в комплексах с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок .. 116
2.5.4.1. Ковалентная «сшивка» остатков цистеина с помощью ВМОЕ и ВМ[РЕО]4.......................................................... 117
2.5.4.2. Фотокросслинкинг с помощью ВРМ..........................................................118
2.5.5. Модель взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным участком ДНК..................................................................................................................121
2.5.6. Значение структурной организации комплекса ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным участком для функционирования ДНК-метилтрансферазы
SsoII в качестве фактора транскрипции........................................................................123
2.6. Сравнение эффективности взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с
ДНК-лигандами..........................................................................................................126
2.6.1. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-лигандами 126
2.6.1.1. Анализ кинетики методом акустической детекции на
пьезоэлектрическом сенсоре......................................................................................126
2.6.1.2. Анализ кинетики методом «остановленного потока»................................135
2.6.2. Сравнение сродства ДНК-метилтрансферазы SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим участки узнавания, в равновесных условиях........................................138
2.6.3. Особенности существования системы рестрикции-модификации SsoII в клетке................................................................................................................................141
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................................148
3.1. Реактивы и материалы..................................................................................................148
3.2. Приборы и методы........................................................................................................152
3.3. Общие методики............................................................................................................154
3.3.1. Приготовление компетентных клеток..................................................................154
3.3.2. Трансформация клеток методом теплового шока..............................................154
3.3.3. Экспрессия белков................................................................................................154
3.3.4. Выделение и очистка белков................................................................................154
3.3.5. Определение молекулярной массы белков методом гель-фильтрации............157
3.3.6. Определение вторичной структуры белков методом спектроскопии кругового дихроизма......................................................................................................157
3.3.7. Получение структуры низкого разрешения методом малоуглового
рассеяния рентгеновских лучей (SAXS)......................................................................157
3.3.8. Анализ эффективности взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с кофактором методом измерения собственной флуоресценции белка........................159
3.3.9. Конструирование 32Р-меченных ДНК-дуплексов..............................................160
3.3.10. Анализ кинетики метилирования ДНК-субстрата ДНК-
метилтрансферазой SsoII................................................................................................160
3.3.11. Комплексообразование ДНК-метилтрансфераз SsoII, Ecll8kl, NlaX и белка A(72-379)M.Ecll8kI с ДНК-дуплексами................................... 161
3.3.12. Определение стехиометрии ДНК-белковых комплексов................ 161
3.3.13. Анализ кинетики взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК методом акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре............... 162
3.3.14. Анализ взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с флуоресцентно меченными ДНК-дуплексами в равновесном состоянии...................... 162
3.3.15. Анализ кинетики взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК методом «остановленного потока»........................................ 164
3.3.16. Анализ доступности для модификации остатков цистеина ДНК-метилтрансферазы SsoII................................................. 164
3.3.17. Анализ структуры ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК с помощью бифункциональных «сшивающих» реагентов (метод кросслинкинга) 165
ВЫВОДЫ................................................................. 166
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................... 167
БЛАГОДАРНОСТИ......................................................... 193
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2-АП 2-аминопурин
АА 5 '-амино-5 '-дезоксиаденозин
а. о. аминокислотный остаток
БСА бычий сывороточный альбумин
БФС бромфеноловый синий
Да,кДа дальтон, килодальтон
ДМСО диметилсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНКаза I дезоксирибонуклеаза I
дсн додецилсульфат натрия
дтт дитиотреит (1,4-димеркапто-2,3-бутандиол)
иптг изопропил-1-тио-(3-/)-галактопиранозид
КД круговой дихроизм
мм молекулярная масса
МТаза метилтрансфераза
ПААГ полиакриламидный гель
п. н. пара нуклеотидов
Р-М рестрикция-модификация
РНК рибонуклеиновая кислота
РНКП РНК-полимераза
РСА рентгеноструктурный анализ
СПС спираль-поворот-спираль
ТЕМЕД М, Ы, Ы', тУ'-тетраметилэтилендиамин
Трис трис(гидроксиметил)аминометан
ХД хромодомен
хмт хромометилтрансфераза
ЧСА сывороточный альбумин человека
ЭДТА этилендиаминтетраацетат, натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
ЭР эндонуклеаза рестрикции
ЯМР ядерный магнитный резонанс
Ас1оНсу Я- аденозил-1-гомоцистеин
АсЬМег ¿»-аденозил-Х-метионин
ВМОЕ А/,у-гпа1е1ш1ёоеАапе; бг/с-малеимидоэтан
ВМ[РЕ0]4 1,11 -A/'s'-maleimidotetraethyleneglycol; 1,11 -быс-малеимидотетраэтиленгликоль
ВРМ 4-(iV-maleimido)benzophenone; 4-(А'-малеимидо)бензофенон
С5-МТаза С5-цитозиновая метилтрансфераза
DRM domains rearranged methyltransferase; семейство ДНК-МТаз, содержащих
консервативные мотивы в необычном порядке
EtBr этидия бромид
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography; быстрая жидкостная хроматография белков
HEPES А?-2-гидроксиэтшшиперазин-Л''-2-этансульфоновая кислота
Ml.LlaJI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза LlaJI, модифицирующая следующий
остаток цитозина: 5'-GACGC-373'-CTGCG-5'
М2.LlaJI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза LlaJI, модифицирующая следующий
остаток цитозина: 5'-GACGC-3'/3'-CTGCG-5'
M.Ecl 18kl С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Eel 18kl
М.Есо47П С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Eco47II
M.EcoRII С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза EcoRII
М.НаеШ С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза НаеШ
M.Hhal С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Hhal
M.MspI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Mspl
M.NlaX С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза NlaX
M.ScrFIA С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза ScrFIA
М.SsoII С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII
M.SssI С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SssI
N4-MTa3a Ш-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза
N6-MTa3a К6-адениновая ДНК-метилтрансфераза
PDB Protein Data Bank, банк пространственных структур макромолекул
PMSF phenylmethanesulfonylfluoride; фенилметансульфонилфторид
R.SsoII эндонуклеаза рестрикции SsoII
SAXS small-angle X-ray scattering; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей
TSM thickness shear mode; деформация сдвига по толщине
TRD target recognition domain; область в малом субдомене ДНК-МТаз,
обеспечивающая субстратную специфичность
Для обозначения аминокислотных остатков, нуклеотидов, олиго- и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и Международного союза биохимиков (ШВ).
ВВЕДЕНИЕ
Реакция метилирования ДНК является одной из основных в биохимии клетки. У млекопитающих метилирование ДНК играет существенную роль в регуляции экспрессии генов, импринтинге, упаковке хроматина, эмбриональном развитии, возникновении онкологических заболеваний. У прокариот метилирование ДНК обеспечивает защиту клетки от чужеродной ДНК, а также тесно связано с регуляцией экспрессии генов и с процессами репликации и репарации ДНК. Метилирование ДНК катализируется важнейшим классом ферментов нуклеинового обмена - ДНК-метилтрансферазами (МТазами).
С5-Цитозиновые ДНК-МТазы (С5-ДНК-МТазы) обнаружены как у прокариот, так и у эукариот. Каталитические домены бактериальных и эукариотических С5-ДНК-МТаз характеризуются общей структурной организацией. Систематический анализ аминокислотных последовательностей этих ферментов, имеющихся в базах данных, позволяет утверждать, что многие МТазы в клетке не только осуществляют метилирование ДНК, но и обладают другими функциями. Бифункциональность белков - это эффективный и экономичный способ связать друг с другом различные клеточные события, возникший в эволюции достаточно давно [1]. Однако из тысяч бифункциональных и мультифункциональных С5-ДНК-МТаз на данный момент изучены единицы.
Данная работа направлена на исследование механизмов узнавания ДНК бифункциональными МТазами на примере прокариотической С5-ДНК-МТазы БбоП (М.БзоП), входящей в систему рестрикции-модификации (Р-М) П-го типа 88о11. М.ЗяоИ узнает в двутяжевой ДНК последовательность 5'-ССНОО-3' (где N = А, С, О или Т) и в присутствии кофактора Я-аденозил-Х-метионина (А<1оМе1:) метилирует внутренний остаток цитозина с образованием остатка 5-метилцитозина. Интересной особенностью М.8зо11 является наличие протяженного Ы-концевого участка (1-71 аминокислотные остатки (а. о.)), структура которого обусловливает способность МТазы выступать в роли фактора транскрипции и регулировать экспрессию собственного гена, а также гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции БзоП (И^оП). Регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию М^оН с промоторной областью генов системы Р-М БбоП [2, 3]. Основное число контактов М.БзоП с промоторной областью обеспечивает локализованный внутри последней 15-звенный инвертированный повтор (в дальнейшем называемый регуляторным участком).
Таким образом, М^оП представляет собой бифункциональный белок: с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования ДНК. Какова взаимосвязь между активностями, которые обеспечиваются разными доменами
в составе одной полипептидной цепи, - вопрос, для МТаз практически не исследованный. Это определяет актуальность всестороннего изучения структурно-функциональной организации комплексов M.SsoII с участком метилирования и с регуляторным участком.
Целью работы являлась структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования и регуляторный участок.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Охарактеризовать третичную и четвертичную структуру ало-формы M.SsoII и ее делеционных мутантов.
2. Изучить комплексообразование M.SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования или регуляторный участок:
• стехиометрию комплексов;
• эффективность связывания M.SsoII с ДНК-дуплексами;
• скорости комплексообразования M.SsoII с ДНК-дуплексами.
3. Проанализировать структурную организацию комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок.
4. Детализировать модель функционирования M.SsoII в клетке как фермента модификации и как фактора транскрипции.
В данной работе впервые продемонстрировано, что МТазная и регуляторная активности M.SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Показано, что эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается M.SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.
Работа включает обзор литературы, посвященный структурно-функциональной характеристике различных доменов, входящих в состав С5-ДНК-МТаз.
ГЛАВА 1. Структурно-функциональная характеристика доменов, входящих в состав С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз
(Обзор литературы)
С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы (С5-ДНК-МТазы) катализируют перенос метильной группы с ¿у-аденозил-Х-метионина (АёоМе1) на атом углерода в пятом положении остатка цитозина. АёоМе! при этом превращается в З'-аденозил-Х-гомоцистеин (АёоНсу). Метилированы могут быть как одна, так и обе цепи молекулы ДНК. Метальная группа локализована в большой бороздке и не нарушает уотсон-криковских взаимодействий в двойной спирали ДНК. С5-ДНК-МТазы специфически узнают в двуцепочечной ДНК участки метилирования - короткие последовательности, в большинстве случаев палиндромные и имеющие длину 2-6 п. н.
У прокариот, помимо метилирования С5-атома остатка цитозина, также возможно метилирова
