С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Ssoll как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Ssoll тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Воробьева Ольга Валерьевна

С5-ЦИТОЗИНОВАЯ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА SsoII КАК БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ БЕЛОК: ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С УЧАСТКОМ МЕТИЛИРОВАНИЯ И С ПРОМОТОРНОЙ ОБЛ \СТЫО ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ SsoII

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2004

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Орецкая Татьяна Семеновна

кандидат химических наук, с.н.с. Кубарева Елена Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Швачкин Юрий Петрович

доктор биологических наук, в.н.с. Железная Людмила Алексеевна

Ведущая организация: Институт химической биологии и

фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Защита состоится 23 марта 2004 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан февраля 2004 г.

ф

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Метилирование ДНК ферментами модификации -ДНК-метилтрансферазами - является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. У эукариот метилирование ДНК неотделимо от протекания таких биологических процессов, как генная экспрессия, эмбриональное развитие, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, генетические мутации. Изменение «карты» метилирования ДНК приводит к нарушению генной экспрессии и, как следствие, влияет на возникновение и развитие некоторых заболеваний. У прокариот метилирование ДНК тесно связано с процессами репликации и репарации. В связи с этим актуальной задачей становится изучение особенностей регуляции экспрессии генов, кодирующих ДНК-метилтрансферазы (МТазы).

Объектом нашего исследования является С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII), входящая в систему рестрикции-модификации SsoII. Системы рестрикции-модификации (Р-М) служат защитным механизмом прокариотических организмов от проникновения в клетку чужеродной ДНК. Известно несколько типов регуляции экспрессии генов МТаз в системах Р-М. К началу выполнения настоящей работы было показано, что M.SsoII способна осуществлять авторегуляторную функцию, формируя специфический комплекс с промоторной областью генов системы Р-М SsoII (Karyagina е! а1., 1997; ЗНПоу & а1, 1998). Таким образом, M.SsoII действует в клетке не только как фермент модификации, но и как транскрипционный репрессор.

Информация, полученная в ходе выполнения работы, -способствует расширению представлений о структурно-функциональных аспектах поведения M.SsoII как бифункционального белка. Выявленные для M.SsoII особенности узнавания ДНК могут быть перенесены на эукариотические МТазы, так как все С5-цитозиновые МТазы имеют сходную первичную структуру и для них постулирован единый механизм катализа.

Целью настоящей работы являлось сравнительное биохимическое исследование специфических ДНК-белковых комплексов M.SsoII с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Для решения поставленной задачи использован комплексный подход, включающий идентификацию групп атомов ДНК (методом «отпечатков») и аминокислотных остатков фермента (методом региоселективного ковалентного присоединения нуклеиновой кислоты к белку), участвующих в формировании ДНК-белковы\ комплексов; расчет констант диссоциации при взаимодействии M.SsoII с ДНК-

лигандами; компьютерное моделирование белково-нуклеиновых взаимодействий в комплексах M.SsoII с промоторной областью генов системы Р-М SsoII и с участком метилирования в ДНК. Самостоятельной задачей стала разработка методики определения местоположения неметилируемого dC в участке узнавания цитозиновых МТаз.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые проведено всестороннее исследование ДНК-белковых контактов для фермента M.SsoII в комплексах с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Идентифицированы группы атомов ДНК, существенные для формирования специфических комплексов с M.SsoII. С помощью ДНК-дуплексов, содержащих фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, впервые показана сближенность Cysl42 каталитического центра M.SsoII с углеводофосфатным остовом ДНК при взаимодействии, как со специфическими, так и с неспецифическими лигандами. Методом ковалентного присоединения M.SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим альдегидную группу в Т-положении углеводного фрагмента, продемонстрировано, что в связывании с промоторной областью генов системы Р-М SsoII могут участвовать две молекулы фермента. Построены молекулярные модели комплекса С-концевой части M.SsoII с участком метилирования ДНК и аналогом кофактора 8-аденозил-Ь-гомоцистеином, а также комплекса N-концевого участка M.SsoII с промоторной областью. Проведенные исследования позволили сравнить специфические ДНК-белковые комплексы, формируемые M.SsoII с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII, и предложить модель взаимодействия этой МТазы с ДНК как бифункционального белка. Универсальная схема комплексного исследования М SsoII, предложенная в работе, может быть использована для изучения других ферментов нуклеинового обмена Разработана методика определения местоположения неметилируемого dC в участке узнавания цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, основанная на использовании бисульфитной реакции в сочетании с ферментом репарации урацил-ДНК-гликозилазой. С помощью предложенного подхода установлена специфичность действия метилтрансферазы NlaX.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ. Результаты были представлены на конференциях «Biocatalysis-2000: fundamentals and applications» (Москва, июнь 2000 г.), «Trends in Nucleic Acid Chemistry» (Москва, ноябрь 2000 г.), «5th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids (NACON-V)» (Шеффилд, Великобритания, апрель 2001 г.), Ш-м съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, июнь-июль 2002 г.), конференциях

«Computational Molecular Biology» (Москва, июль 2003 г.), «Molecular Biology and Genetics» (Киев, Украина, сентябрь 2003 г.), V-ом симпозиуме «Nucleic Acids Chemistry & Biology» (Кембридж, Великобритания, сентябрь 2003 г.), конференциях «Biochemistry of Nucleo-Protein Complexes» (Гиссен, Германия, апрель 2003 г. и январь 2004 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на /5 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен молекулярным аспектам взаимодействия белков семейства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз и семейства Cro-белков и репрессоров с ДНК), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован Рисунк^11* ^L схемами, /р таблицами.

Библиографический указатель включает в себя цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Фермент модификации SsoII как С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза

Объект нашего исследования - прокариотическая ДНК-метилтрансфераза SsoII - является типичным представителем класса С5-цитозиновых МТаз (т5С-МТаз). Вопрос о том, каким образом т5С-МТазы катализируют реакцию переноса метальной группы в С5-положение цитозина, практически решен. В то же время механизмы узнавания определенной нуклеотидной последовательности в ДНК и выбора метилируемого dC еще недостаточно изучены. Поэтому основное внимание в данной работе было направлено на изучение связывания M.SsoII с участком метилирования ДНК. Для этой цели был сконструирован ДНК-дуплекс I, содержащий канонический участок метилирования M.SsolI (табл. 1). Дуплексы II-IV являются аналогами дуплекса I. В ДНК-лигандах III, IV и V внутренний остаток dC участка метилирования заменен на остаток 5-метил-2'-дезоксицитидина (m5dC, M) в одной или обеих цепях соответственно. Немодифицированный ДНК-дуплекс II отличается от дуплекса I центральной нуклеотидной парой участка метилирования.

Для изучения особенностей комплексообразования M.SsoII с ДНК-лигандами был использован метод «торможения» в полиакриламидном геле (ПААГ) (рис. I). Исследования показали, что M.SsoII формирует с ДНК-дуплексом I два комплекса, характеризующиеся различной подвижностью в неденатурирующем ПААГ: А1 и А2. Образование комплекса А1 детектируется только после добавления в реакционную смесь аналога кофактора реакции метилирования - 8-аденозил-Ь-гомоцистеина (AdoHcy). Неспецифический ДНК-дуплекс VI, не содержащий участка узнавания M.SsoII, формирует с ферментом только один комплекс - А2 (как в присутствии, так

Таблица 1. Константы диссоциации комплексов М.БзоП с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования.

№ ДНК-дуплекс» К<ь нМ

I 5'-GATGCTGCCAACCTCGCTCTAGCTTCATAC-3' Т-цепь 3'-CTACGACGGTTGGACCGAGATCGAAGTATG-5' А-цепь 5,3 ± 0,6

11 5'-GATGCTGCCAACCCGGCTCTAGCTTCATAC-3' С-цепь 3'-CTACGACGGTTGGGCCGAGATCGAAGTATG-5' G-цепь 4,9 ±0,3

III 5'-GATGCTGCCAACMTGGCTCTAGCTTCATAC-3' Т-цепь 3'-CTACGACGGTTGGACCGAGATCGAAGTATG-5' А-цепь 2,6 ± 0,3

IV 5'-GATGCTGCCAACCIGGCTCTAGCTTCATAC-3' Т-цепь 3'-CTACGACGGTTGOaMCGAGATCGAAGTATG-5' А-цепь 2,3 ± 0,3

V 5'-GATGCTGCCAACMraGCTCTAGCTT САТАС-3' Т-цепь 3'-CTACGACGGTTGGffllCGAGATCGAAGTATG-5' А-цепь 55,8 ± 10,0

Жирным шрифтом выделен участок метилирования; М - 5-метил-2'-дезоксищггидин I_VI

Adolicy poly(dl-dC)

- + + + - +

- + + -

ÜU

И t

хё>*

-А2 -Al

M.SsoII с ДНК

ДНК

123456789

Рис. 1. Анализ равновесного

связывания M.SsoII с ДНК-

дуплексами I и VI методом

«торможения» в ПААГ. M.SsoII и Комплексы З2р.меченый дуплекс I/Vi

инкубировали в присутствии и в отсутствие AdoHcy и/или неспецифического фрагмента ДНК - poly(dldC) (указано над дорожками). Дорожка 1 - исходный ДНК-дуплекс. ДНК-белковые комплексы обозначены как Al и А2. Римскими цифрами указаны номера ДНК-дуплексов.

5' -GATCAGTACTAATTAGCATTATAAAGGATC-3' 3' -CTAGTCATGATTAATCGTAATATTTCCTAG-5' (VI)

и в отсутствие Ас1оНсу). Добавление в реакционную смесь неспецифического фрагмента ДНК - - приводит к вытеснению -меченого ДНК-лиганда из

комплекса А2 и не влияет на формирование комплекса А1. Это позволяет считать комплекс А1 специфическим. Таким образом, для М-БбоИ, как и для большинства наличие кофактора (или его аналога) является необходимым условием формирования специфического комплекса с метилируемой ДНК. В дальнейшем

специфическое комплексообразование M.SsoII с ДНК-субстратами проводили в присутствии AdoHcy И poly(dl'dC). В этих условиях наблюдалось образование только комплекса А1.

Для комплексов M.SsoII с дуплексами I-V были рассчитаны равновесные константы диссоциации по методу Скэтчарда (табл. 1). Замена центральной (вырожденной) dA/dT-пары участка узнавания на dG/dC-napy не влияет на степень сродства МТазы к субстрату. Сродство M.SsoII к ДНК-лигандам возрастает в ряду: диметилированная ДНК « неметилированная ДНК < монометилированная ДНК.

1.1. Идентификация групп атомов участка метилирования ДНК, взаимодействующих с M.SsoII при формировании специфического комплекса

Для идентификации групп атомов участка метилирования ДНК, вовлеченных во взаимодействие с M.SsoII на стадии специфического узнавания, был применен «метод отпечатков, основанный на вмешательстве» (от англ. interference footprinting). В качестве модифицирующих реагентов были использованы муравьиная кислота, гидразин, Л-ЭТИЛ-М-нитрозомочевина и диметилсульфат. Содержащие 32Р-метку по 5'-концу Т(С)- или А(С)-цепи ДНК-дуплексы I-IV обрабатывали соответствующим химическим реагентом в условиях статистической модификации и затем инкубировали с M.SsoII в условиях специфического связывания. Методом «торможения» в ПААГ связавшийся с МТазой субстрат отделяли от ДНК-дуплекса, не связавшегося с ферментом. Олигонуклеотиды выделяли из геля, гидролизовали по месту модификации и анализировали в ПААГ, содержащем 7М мочевину. Определяли радиоактивность зон из дорожек, соответствующих разделению продуктов гидролиза ДНК, не связавшейся (R) и связавшейся (Rcb) с M.SsoII. Полагали, что фрагмент ДНК важен для формирования специфического комплекса с M.SsoII на стадии узнавания участка метилирования при В качестве

примера на рис 2. представлены данные метода «отпечатков» с муравьиной кислотой, характеризующие взаимодействие M.SsoII с пуриновыми основаниями дуплекса I.

Результаты, полученные методом «отпечатков» при анализе комплексов M.SsoII с немодифицированными ДНК-субстратами I и II, представлены на рис. 3 а, б. Видно, что во взаимодействии с M.SsoII на стадии узнавания участвуют все пурины участка метилирования дуплексов I и II. Помимо пуринов участка узнавания во взаимодействии также участвуют пурины, непосредственно примыкающие к нему с Только внешний цитозин обеих цепей участка метилирования вовлечен во взаимодействие с M.SsoII. Метилируемый цитозин не важен для узнавания МТазой субстрата. Данный факт согласуется с литературными данными, согласно которым

метилируемое гетероциклическое основание не играет роли в процессе узнавания МТазами участка метилирования в ДНК (Wyszynskt et ai, 1993; Yang et al, 1995). M.SsoII формирует контакты с 5'-фосфатными группами всех пяти нуклеотидов участка узнавания в обеих цепях ДНК-дуплексов I и И. Метод «отпечатков» с диметилсульфатом показал, что M.SsoII реализует часть контактов в большой бороздке ДНК. В формировании специфических контактов с M.SsoII участвуют N7-атомы всех остатков гуанина участка узнавания. Как и следовало ожидать, замена центральной вырожденной нуклеотидной пары участка метилирования не влияет на характер взаимодействия M.SsoII с ДНК. Все участвующие во взаимодействии с M.Ssoir группы атомов участка метилирования образуют единый кластер. Взаимодействие в пределах участка метилирования носит симметричный характер.

Проведено сравнение результатов, полученных методом «отпечатков» для комплексов M.SsoII с монометилированными ДНК-субстратами III и IV и Модифицированным субстратом I (рис. 3 а, в, г). Схемы распределения

б

контактирующих с M.SsoII групп атомов ДНК в неметилированных цепях дуплексов III и IV и в соответствующих им цепях дуплекса I практически идентичны. Замена внутреннего dC участка узнавания на m5dC приводит к увеличению числа гетероциклических оснований, фосфатных групп и NT-атомов остатков гуанина в метилированных цепях дуплексов III и IV, функционально важных для взаимодействия с M.SsoII. В узнавание вовлечены как группы атомов участка метилирования, так и группы атомов, примыкающие к нему с 5-конца.

Таким образом, согласно полученным нами данным, сродство M.SsoII к монометилированным субстратам выше, чем к неметилированным (табл. 1, рис. 3). Изменение степени сродства при образовании фермент-субстратного комплекса происходит за счет увеличения числа контактов между M.SsoII и цепью, содержащей остаток m'dC.

Рис. 3. Идентифицированные с помощью метода «отпечатков» группы атомов ДНК-дуплексов I (а), II (б), III (в) и IV (г), вовлеченные во взаимодействие с M.SsoII. Обозначены участвующие в узнавании ферментом гетероциклические основания (серые овалы), N7-атомы остатков гуанина (белые овалы) и фосфатные группы (стрелки). Участок метилирования выделен жирным шрифтом. М - З-метил^'-дезоксицитидин.

1.2. Роль Cysl42 каталитического центра M.SsoII в связывании с ДНК

Механизм реакции метилирования для m'C-МТаз предполагает нуклеофильную атаку Сб-атома цитозина консервативным остатком Cys каталитического центра фермента (Chen et al, 1993). Анализ аминокислотной последовательности M.SsoII показал, что фермент содержит единственный остаток

Сув — Суз142, причем именно в кат&тотическом домене. Ограничивается ли роль Суз142 участием в катализе, или он также вовлечен в узнавание ферментом участка метилирования в ДНК? Нами была получена и охарактеризована мутантная форма М^аэП (Суз142А1а). Константа диссоциации комплекса мутантной формы М.&оП с субстратом I, рассчитанная в присутствии АЛ)Нсу, всего в 2,5 раза больше аналогичной константы, рассчитанной для нативной формы фермента. Следовательно, консервативный остаток столь необходимый для

катализа, не вовлечен в специфическое узнавание М.БдаП участка метилирования в ДНК.

Однако вопрос о роли в процессе связывания ДНК в целом остался открытым. Не исключено участие данного аминокислотного остатка во взаимодействии с углеводофосфатным остовом ДНК. Для выяснения этого вопроса нами были сконструированы ДНК-дуплексы VII—XII, содержащие единичную фосфорилдисульфидную межнуклеотидную группу (ФДСГ) вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи (табл. 2). ФДСГ-содержащие ДНК-дуплексы VII—XII образуют конъюгаты с М^аоП с различной степенью эффективности в зависимости от наличия участка узнавания МТазы и места введения модификации (табл. 2, рис. 4).

Рис. 4. Анализ продуктов ковалентного связывания М с ДНК-дуплексами X (2, 3), IX (4, 5) и VIII (6, 7) Реакции проводились в присутствии (2, 4, 6) и в отсутствие (3, 5, 7) АсЬНсу. 1 - Исходный препарат М 8аоП. 12%-ный ПААГ, содержащий додецилсульфат натрия после электрофореза и прокрашивания раствором Кумасси 0-250

Для подтверждения дисульфидной природы ковалентной связи в образующихся конъюгатах ФДСГ-содержащий ДНК-дуплекс IX выдерживали с М&оП, затем к реакционной смеси добавляли дитиотреит, или р-меркаптоэтанол, или трис(2-карбоксиэтил)фосфин. Инкубация с данными дисульфид-восстанавливающими реагентами приводила к разрушению ковалентно связанных ДНК-белковых комплексов. Прямое доказательство участия Сув142 М^аэП в реакции тиолдисульфидного обмена было получено при изучении ковалентного связывания мутантной формы М^аэП (Суз142А1а) с ДНК-лигандами VIII, X, XI. Мутантный

белок не образует конъюгаты с ФДСГ-содержащими ДНК-дуплексами в отличие от нативной формы M.SsoII.

Таблица 2. Эффективность ковалентного связывания М^оН с ДНК-дуплексами, содержащими фосфорилдисульфидную межнуклеотидную группировку.

№ ДНК-дуплекс* Выход конъюгата, %

В отсутствие AdoHcy В присутствии AdoHcy

VII 5' ACCTCGGAAAGTpssCCCCTCT 3' 3' GAGCCTTTCA---GGGGAGA 5' _ * * 8

VIII 5' TCGGAAAGTpssTGACTGCACGGT 3' 3' GCCTTTCA---ACTGACGT 5' 16 22

IX 5' TCGGTTCpssCTGGCTCT 3' 3' GAGCCAAG---GACCGAGACT 5' 14 26

X 5' TCGGTTCCpssTGGCTCT 3' 3' GAGCCAAGG---ACCGAGACT 5' 9 24

XI 5' ACGTTCCpssTGGCTATTGACTGC 3' 3' CTGCAAGG---ACCTATAACTGACGT 5' - 25

XII 5' ACGTTCCTGGCTApssTTGACTGC 3' 3' CTGCAAGGACCTAT---AACTGACGT 5' - 17

♦Выделен участок метилирования; pss - фосфорилдисулъфидная группа.

**Для ДНК-дуплексов VII, XI и XII эксперименты по ковалентному связыванию с M.SsoII

в отсутствие AdoHcy не проводились.

• Выделен участок метилирования; pss - фосфорилдисульфидная группа.

**Для ДНК-дуплексов VII, XI и XII эксперименты по ковалентному связыванию с M.SsoII

в отсутствие AdoHcy не проводились.

В ходе ковалентного присоединения M.SsoII к ФДСГ-содержащим ДНК-

дуплексам зафиксировано образование единственного продукта (рис. 4). Сравнение

подвижностей полученных белково-нуклеиновых конъюгатов свидетельствует о том,

что нуклеиновой компонентой реакции является 5'-дезокси-5'-меркаптосоставляющая

модифицированного олигонуклеотида (схема 1). В дальнейшем при изучении

ковалентного связывания ФДСГ-содержащих ДНК-дуплексов с глутатионом было

доказано, что атаке тиолат-ионом в ФДСГ действительно подвергается атом серы,

связанный с атомом углерода.

С помощью других тиолсодержащих ферментов нуклеинового обмена -

эндонуклеазы рестрикции SsoII (R.SsoII) и фермента репарации урацил-ДНК-

гликозилазы Е. coli было показано, что необходимым условием протекания реакции

между ФДСГ и сульфгидрильной группой остатка Cys является нахождение

последней на поверхности белковой глобулы и пространственная сближенность

9

реагирующих групп при связывании белка с ДНК.

Т-А —

А—

0

1

О

о=р-о I.

I

о=р-о I

+

I

в —

Схема 1

Проведенные эксперименты по ковалентному присоединению М&оП к ФДСГ-содержащим лигандам позволили получить новую информацию об особенностях связывания М.БдаП с ДНК. Как видно из табл. 2, М.&оП взаимодействует с дуплексами IX и X, содержащими ФДСГ в участке узнавания, с образованием конъюгатов как в отсутствие, так и в присутствии АёоЫсу. В ДНК-лиганде XII ФДСГ локализована за пределами участка узнавания. В модифицированных дуплексах VII и VIII участок узнавания М.&оП отсутствует. Однако эти соединения также образуют конъюгаты с ферментом. Таким образом, нами впервые показано, что сульфгидрильная группа Сув142 М.БдаП сближена с углеводофосфатным остовом ДНК на стадии связывания как специфических (содержащих участок узнавания), так и неспецифических лигандов.

Общей тенденцией, наблюдающейся для всех ДНК-лигандов вне зависимости от нуклеотидной последовательности, является то, что эффективность образования ими конъюгатов с М.БдаП в 1,5-2,5 раза выше в присутствии АёоЫсу (табл. 2). Согласно литературным данным, присутствие кофактора или его аналога приводит к конформационным перестройкам фермента, что способствует фиксированию метилируемого цитидина в каталитическом центре МТазы и повышает константу ассоциации т5С-МТаз с ДНК (Klimasauskas еЛ ai, 1998). Вместе с тем, результаты ковалентного присоединения М&оП к ДНК-лигандам свидетельствуют о том, что в присутствии АёоЫсу конформационные перестройки, в результате которых Сув142 М.&оП оказывается сближенным с углеводофосфатным остовом, происходят при связывании МТазы с любой ДНК независимо от наличия участка узнавания.

2. Регуляция в системе рестрикции-модификации SsoП. Фермент модификации SsoП как регуляторный белок

К началу выполнения настоящей работы было показано, что М.&оП формирует специфический и стабильный комплекс с промоторной областью системы Р-М 8$оП. При этом происходит снижение уровня экспрессии гена, кодирующего М.&оП, и повышение уровня экспрессии гена, кодирующего К.&оП (Karyagina et al., 1997). Авторегуляторная функция М.&оП определяется его К-концевой частью. В этой части МТазы методом компьютерного анализа предсказано наличие структурного мотива «спираль-поворот-спираль» (СПС), представляющего собой вероятный участок связывания промоторной области. В промоторной области системы Р-М 8$оП идентифицирован 15-звенный инвертированный повтор (далее по тексту - «регуляторный» участок). Предполагалось, что он представляет собой участок ДНК, обеспечивающий максимальное число специфических контактов при взаимодействии с К-концевым участком М.БдаП. В качестве модели промоторной области системы Р-М 8$оП был выбран 31-звенный ДНК-дуплекс XIII, представляющий собой ее центральный фрагмент и включающий 15-звенный инвертированный повтор. Константа диссоциации комплекса М^аэП с ДНК-дуплексом XIII в пределах ошибки эксперимента совпадает с величиной константаны диссоциации комплекса М^оП со 140-звенным фрагментом ДНК, соответствующем промоторной области системы Р-М 8аэП (Shilov ^ al., 1998), что свидетельствует об адекватности выбора дуплекса XIII для исследования.

5 1 -АТСААААСАССАСАААТТСТССТААААССДА-З' 3 ' -ТАСТТТТ6ТССТСТТТААСАС(5АТТТТССТТ-5 ' (XIII)

Константа диссоциации комплекса мономера М^аэП с ДНК-дуплексом XIII, рассчитанная в присутствии ро!у(с11-сСС) и Ас1оНсу по методу Скэтчарда, составляет 36,4±1,9 нМ. Таким образом, сродство М^аэП к «регуляторному» участку в 7 раз меньше, чем к участку метилирования в ДНК (табл. 1).

2.1. Идентификация групп атомов «регуляторного» участка ДНК, взаимодействующих с M.SsoП при формировании специфического комплекса

Для идентификации групп атомов «регуляторного» участка ДНК, вовлеченных во взаимодействие с М&оП, использовали метод «отпечатков» с муравьиной кислотой, гидразином, диметилсульфатом и нитрозомочевиной в качестве

модифицирующих реагентов. Схема эксперимента аналогична описанной в разделе

1.1. Предварительно были подобраны условия формирования специфического комплекса М.БдаП с ДНК-дуплексом XIII. Показано, что формирование такого комплекса наблюдается только в присутствии

Во взаимодействие с М.&оП на стадии узнавания вовлечены три остатка гуанина, один остаток аденина и два остатка тимина «регуляторного» участка, образующие два блока: (ОСА) и (ТОТ) в каждой из цепей ДНК-дуплекса XIII (рис. 5). Метод «отпечатков» с диметилсульфатом показал, что М.БдаП образует контакты с атомами всех остатков гуанина инвертированного повтора. Поскольку атомы остатков гуанина экспонированы в большую бороздку ДНК, можно предположить, что значительную часть своих контактов с «регуляторным» участком М.БдаП реализует в большой бороздке ДНК. М.&оП взаимодействует с тремя фосфатными группами в каждой из цепей ДНК-дуплекса XIII. Важно отметить, что картины распределения контактов в комплексах М^аэП с «регуляторным» участком и участком метилирования различны. В случае 5-звенного участка метилирования «плотность» распределения контактов по нуклеотидной последовательности ДНК выше, чем в случае 15-звенного «регуляторного» участка (рис. 3, 5).

Рис. 5. Идентифицированные с помощью метода «отпечатков» группы атомов 15-звенного инвертированнного повтора, вовлеченные во взаимодействие с М^оП. Обозначены участвующие в узнавании ферментом гетероциклические основания (серые овалы), Ы7-атомы остатков гуанина (белые овалы) и фосфатные группы (стрелки).

Все участвующие во взаимодействии с М^оП группы атомов «регуляторного» участка образуют два симметрично расположенных кластера в пределах инвертированного повтора. Симметричное взаимодействие с обеими половинами участка узнавания ДНК характерно для специфических ДНК-белковых комплексов, использующих для узнавания спираль, локализованную в большой бороздке ДНК. В подобных комплексах белковый компонент связывается с ДНК в виде димера: каждая молекула белка контактирует с соответствующей половиной участка связывания. Аналогичный механизм взаимодействия с «регуляторным» участком ДНК мы предполагаем и для М^аэП.

и

)0 ООО

5' ..АССАСАААТТСТССТ...З'

3' ...ТССТСТТТаАСАОСА...5'

°|8|° У

2.2. Ковалентное присоединение М.БвоП к ДНК-лигандам, содержащим 2'-

альдегидную группу Все охарактеризованные к настоящему времени т5С-МТазы- являются мономерными белками. Данные, полученные к.ф.-м.н. Тимченко А.А (ИБ РАН) методом равновесного ультрацентрифугирования, показали, что М.&оП также является мономером в растворе. В то же время результаты метода «отпечатков» позволяют предположить, что с «регуляторным» участком ДНК могут связываться две молекулы М.БвоП. Для проверки этой гипотезы были сконструированы модифицированные дуплексы Х1У-ХУ1, являющиеся структурными аналогами ДНК-дуплекса XIII и содержащие одну или две альдегидные группы в 2-положении углеводного фрагмента (табл. 3). Модифицированный дуплекс XVII, не содержащий «регуляторного» участка, использовали в качестве контроля. Выбор позиций для введения модификации в ДНК-лиганды Х^-ХХТ основывался на результатах компьютерного моделирования комплекса димера М.&оП с «регуляторным»-участком ДНК (см. раздел 3.). Согласно модели в СПС-мотиве К-концевой части каждой молекулы М.БвоП остатки Ьу§21 и Ьу§31 вовлечены в узнавание ДНК.

Таблица 3. Эффективность ковалентного связывания М.ЗаэП с ДНК-дуплексами, содержащими альдегидную группу в положении углеводного фрагмента

№ ДНК-дуплекс* Выход конъюгата, %**

мономер М-БвоИ димер М^адП

XIII 5' -АТСААААСАССАСАААТТСТССТААААССАА-3' 3'-ТАСТТТТСТССТвТТТААСАС<гАТТТТССТТ-5' 2

XIV 5' -АТСААААСАввАСАААТТвТССТААААССАА-З' 3' -ТАСТТТТСТССТСТТТААСАСвАХТТТССТТ-5' 59

XV 5' -АТСААААСА&5АСАААТХвТССТААААССАА- 3' 3'-ТАСТТТТСТССТСТТТААСАСОАТТТТССТТ-5' 55

XVI 5' -АТСААААСАвйАСАААТТСТССТААААССАА-З' 3'-ТАСТТТТСТССТСХТТААСАвСАХТТТССТТ-5' 54 6

XVII 5' -АССТ ССЭАТ ТХСССТ Т СТ-3' 3' -ТССАСССТАААСССААСА-5' 4

*Выделен 15-звенный инвертированный повтор; X,- 2'-0-(2-оксоэтил)уридин.

** Соотношение концентраций ДНК-дуплекс/мономер М.^П составляло 1/60.

Ковалентное связывание ДНК-дуплексов XIII-XVII, меченных 32Р по 5'-концу модифицированной цепи, с M.SsoII проводили в условиях специфического связывания. При взаимодействии е-аминогруппы Lys белка с 2'-альдегидной группой образуется неустойчивое в условиях анализа основание Шиффа, которое восстанавливают до вторичного амина (схема 2).

Реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 12%-ном SDS-ПААГ (рис. 6а). Как видно из табл. 3, ДНК-дуплексы XIV-XVI ко валентно связываются с M.SsoII с образованием конъюгата с высоким выходом (55-60%). Следовательно e-аминогруппа Lys M.SsoII действительно сближена с теми положениями ДНК-дуплекса XIII, вместо которых введена модификация. Неспецифический модифицированный ДНК-дуплекс XVII образует конъюгат с M.SsoII с выходом только 4%. Следовательно, ковалентное присоединение M.SsoII к ДНК-дуплексам XIV-XVI носит специфический характер. ДНК-дуплекс XVI, содержащий две модификации, взаимодействует с M.SsoII с образованием двух продуктов ковалентного присоединения (рис. 6; Б1 и Б2). Прокрашивание SDS-ПААГ раствором Кумасси G-250 и последующее выравнивание с белковыми маркерами показало, что эти продукты соответствуют присоединению к ДНК-лиганду XVI одной и двух молекул M.SsoII.

С увеличением концентрации M.SsoII в реакционной смеси выход конъюгата димера белка с ДНК возрастает, в то время как выход конъюгата мономера МТазы с ДНК не изменяется (рис. 66). Вероятно, связывание M.SsoII с «регуляторным» участком ДНК in vivo наступает при значительном повышении концентрации фермента. Можно предположить, что эффект регуляции (снижение уровня экспрессии гена ssolIM и повышение уровня экспрессии гена ssolJR) связан со связыванием с промоторой областью генов системы Р-М SsoII двух молекул M.SsoII одновременно, что возможно при высокой локальной концентрации M.SsoII.

Схема 2

Рис. 6. а. Анализ ковалентного присоединения M.SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим альдегидную группу в 2'-положении углеводного фрагмента.

Соотношение концентраций ДНК-дуплекс/мономер M.SsoII составляло 1/60. Над дорожками указаны номера ДНК-дуплексов, б. Анализ ковалентного присоединения MSsoII к ДНК-дуплексу XVI. Цифрами над каждой дорожкой обозначены соотношения концентраций дуплекса и мономера M.SsoII, Стрелками указаны положения маркеров молекулярного веса белков, кДа.

3. Моделирование ДНК-белковых взаимодействий в комплексах ДНК-метилтрансферазы SsoИ с «регуляторным» участком и участком метилирования

Для выявления участков полипептидной цепи и конкретных аминокислотных остатков MSsoII, вовлеченных в образование контактов с группами атомов ДНК, а также для понимания общей топологии ДНК-белковых комплексов, формируемых M.SsoII, был применен метод компьютерного моделирования. Работа проводилась совместно с д.б.н. Карягиной А.С. (ВНИИСБ РАСХН), к.ф.-м.н. Алексеевским А.В. (НИИФХБ МГУ) и к.ф.-м.н. Спириным СА (НИИФХБ МГУ).

Модель комплекса ^концевой части M.SsoII (1-71 а.о.) с «регуляторным» участком ДНК была построена исходя из гомологии аминокислотной последовательности МТазы с С1 репрессорами бактериофагов X, 433, Р22 и Сго-белком бактериофага 434, Согласно построенной модели К-концевая часть M.SsoII включает в себя пять а-спиралей, вторая и третья а-епирали формируют СПС-мотив, при этом третья спираль является «узнающей» (рис. М). Два Л-концевых участка M.SsoII расположены в большой бороздке ДНК с одной стороны двойной спирали. Модель комплекса С-концевой части M.SsoII (72-379 а.о.) с участком метилирования ДНК и АЛэНсу была построена исходя из гомологии аминокислотной последовательности изучаемого нами фермента с ДНК-метилтрансферазами НИа1 и НаеШ. Предлагаемая нами модель M.SsoII включает в себя большой и малый домены,

а

большая бороздка ДНК

кшгаа бороздка ДНК

хтораа очзщраль

тртпичвирт

М£ми,<7бшдм««а А

Т}«2(А>

да«

ШиЦ <у»»»дж««мЬ

нехжлвруеяЛ

ктона

ЛШгу

Еолшюйдомеж

лпса*

С?«М2

,ТТГт

иск*

ДНК, есоержнцал

Рис. 7. а. Пространственная модель комплекса димера М-концевой части М&оП с 15-звенным «регуляторным» участком ДНК. б. Схема контактов аминокислотных остатков N концевой части М&оП с ДНК, содержащей «регуляторный» участок. Основания и фосфатные группы, идентифицированные с помощью метода «отпечатков» как вовлеченные во взаимодействие с М^оП, выделены красным цветом, в. Пространственная структура С-концевой части М^оП с участком метилирования ДНК и ЛёоИсу. В структуре фермента Р* тяжи выделены желтым цветом, а-спирали — красным, петли - серым, г. Схема контактов аминокислотных остатков М&оП с группами атомов участка метилирования ДНК. Основания и фосфатные группы, идентифицированные с помощью метода «отпечатков» как вовлеченные во взаимодействие с М^оП, выделены красным цветом. Аминокислотные остатки, входящие в состав малого домена М&оП, выделены серым цветом, д. Пространственная модель полноразмерной М^оП в комплексе с «регуляторной» ДНК, двумя метилируемыми ДНК и двумя молекулами ЛёоИсу.

идентифицируемые для т5С-МТаз (рис. 1в). Структурное ядро большого домена М.БвоП состоит из семи Р-тяжей, которые окружены пятью а-спиралями.

Молекулярные модели ДНК-белковых комплексов, формируемых М.&оП с «регуляторным» участком и участком метилирования ДНК (рис. 7 б, г), согласуются практически со всеми результатами, полученными методом «отпечатков».

Существует ли возможность одновременного взаимодействия М&оП с метилируемым и «регуляторным» участками ДНК? Нами была построена гипотетическая модель, включающая в себя две полноразмерные молекулы М^оП, три молекулы ДНК и две молекулы ЛёоИсу (рис. 1д). Предлагаемая модель обладает осью симметрии второго порядка. Обе полноразмерные молекулы М&оП расположены с одной стороны «регуляторной» ДНК. Оси всех трех молекул ДНК расположены практически параллельно друг другу. Белок-белковые контакты между молекулами М.БвоП обеспечиваются за счет С-концевых частей. Из рис. 1д видно, что М.БвоП может одновременно участвовать в формировании специфического комплекса как с промоторной областью системы рестрикции-модификации 8воП, так и с участком метилирования. Исходя из представленной модели можно полагать, что регуляторная и метилирующая функции М.БвоП независимы.

4. Разработка методики определения неметилируемого остатка дезоксицитидина в участке метилирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз

Биохимические исследования свойств МТаз невозможны без определения участка узнавания в ДНК, места и типа метилирования. Нами разработан новый биохимический подход для определения местоположения неметилируемого в участке узнавания цитозиновых МТаз, основанный на использовании бисульфитной реакции в сочетании с ферментом репарации урацил-ДНК-гликозилазой (УДГ). В качестве модельной МТазы при разработке данного метода нами была использована

М.8аэ11, так как для данного фермента известна нуклеотидная последовательность участка метилирования и местоположение метилируемого остатка с!С. Предлагаемый подход представлен на рис 8. На стадии / ДНК-дуплекс, содержащий участок метилирования М.&оП, инкубируют с ферментом в присутствии Б-аденозил-Ь-метионина, добиваясь исчерпывающего метилирования ДНК-субстрата. Затем реакционную смесь обрабатывают К.8аэ11 для удаления неметилированных молекул ДНК (стадия 2). К.8аэ11 гидролизует участок узнавания, если внутренний или внешний остаток ёС неметилирован (Упорова и др., 1985). Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях разделяют цепи ДНК-дуплекса (стадия 3). Метилированные олигонуклеотиды выделяют из геля, обрабатывают бисульфитом натрия (стадия 4), обессоливают и выдерживают со щелочью (стадия 5). Бисульфит натрия обратимо присоединяется по двойной связи С5-С6 цитозина, образуя 5,6-дигидро-6-сульфонат, который при обработке щелочью быстро дезаминируется с последующим отщеплением бисульфита Полученный (Ш-содержащий олигонуклеотид инкубируют с УДГ, что приводит к выщеплению урацила с образованием апиримидинового участка (стадия б). После гидролиза по месту модификации 10%-ным водным раствором пиперидина реакционную смесь разделяют методом гель-электрофореза в ПААГ, содержащем 7М мочевину (стадия 7). Для определения длины образовавшегося олигонуклеотида в качестве маркеров

Рис. 8. Схема метода определения неметилируемого с1С в участке узнавания цигознновых ДНК-мешлгрансфераз с последовательным использованием бисульфигной реакции и УДГ. Рассмотрены два возможных варианта метилирования МТазой 5'-ССЫОО-3' последовательности в двугяжевой ДНК (А, Б). *р - 32Р.

удобно использовать фрагменты исходного олигонуклеотида, полученные по методу Максама-Гилберта.

Разработанный метод был успешно применен нами для определения специфичности. действия МТазы имеющей высокую гомологию

аминокислотной последовательности с М.БвоП. Совокупность экспериментальных данных позволила установить, что узнает в двутяжевой ДНК

нуклеотидную последовательность и метилирует

внутренний цитозин по положению.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное биохимическое исследование специфических ДНК-белковых комплексов М.БвоП с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации 8воП. Предложена модель взаимодействия этого фермента с ДНК как бифункционального белка.

2. Идентифицированы группы атомов участка метилирования и инвертированного повтора промоторной области генов системы рестрикции-модификации 8воП, существенные для формирования комплексов с метилтрансферазой 8воП. Построены молекулярные модели комплекса С-концевой части метилтрансферазы 8воП с участком метилирования в ДНК и аналогом кофактора 5-аденозил-Ь-гомоцистеином, а также комплекса >!-концевой части метилтрансферазы 8воП с промоторной областью.

3. Впервые продемонстрирована возможность использования ДНК-дуплексов, содержащих фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, для ковалентного присоединения к метилтрансферазе 8воП за счет реакции дисульфидного обмена. Показана сближенность остатка Сув142 каталитического центра фермента с углеводофосфатным остовом ДНК при взаимодействии как со специфическими, так и с неспецифическими лигандами.

4. Методом ковалентного присоединения метилтрансферазы 8воП к ДНК-дуплексам, содержащим альдегидную группу в положении углеводного фрагмента, впервые показано, что в связывании с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации 8воП могут участвовать две молекулы фермента.

5. Разработана методика определения местоположения неметилируемого в участке узнавания- цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, основанная на последовательном использовании бисульфитной реакции и фермента репарации урацил-ДНК-гликозилазы. С помощью предложенного подхода установлена специфичность действия метилтрансферазы

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Воробьева О.В.. Васильев СЛ., Карягина А.С., Орецкая Т.С., Кубарева ЕА. Анализ контактов между ДНК и белком в комплексе метилтрансфераза SsoII -промоторная область генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 1074-1080.

2. Кубарева ЕА., Вальтер Й., Воробьева О.В.. Разумихин М.В., Карягина А.С., Лау П.К.К., Траутнер Т. Определение неметилируемого остатка дезоксицитидина в участке узнавания метилтрансфераз. // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 1676-1681.

3. Воробьева О.В., Карягина А.С., Волков Е.М., Вирясов М.Б., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Анализ контактов в комплексе ДНК-метилтрансферазы SsoII с участком метилирования. // Биоорганическая химия. 2002. Т. 28. С. 402-410.

4. Kubareva E.A., Walter J., Karyagina A.S., Vorob'eva O.V.. Lau P.C.K., Trautner T. Determination of methylation site of DNA-methyltransferase NlaX by a hybrid method. // BioTechniques. 2002. V. 33. P. 526-531.

5. Воробьева О.В., Романенков А.С., Метелев В.Г, Карягина А.С., Лаврова Н.В., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Ковалентное связывание Cysl42 метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими фосфорилдисульфидную межнуклеотидную группу. // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 534-543.

6. Metelev V.G., Kubareva E.A., Vorob'eva O.V.. Romanenkov A.S., Oretskaya T.S. Specific conjugation of DNA binding proteins to DNA templates through thiol-disulfide exchange. // FEBS Letters. 2003. V. 538. P. 48-52.

7. Vorob'eva O.V.. Vasil'ev SA, Karyagina A.S., Kubareva EA Analysis of DNA-protein contacts in a complex between methyltransferase SsoII and a promotor region of the SsoII restriction-modification genes. // International Conference «Trends in Nucleic Acid Chemistry». 21-24.11. 2000. Moscow, Russia.

8. Vorob'eva O.V., Vasil'ev S.A., Karyagina A.S., Kubareva E.A Analysis of DNA recognition by (cytosine-5)-methyltransferase SsoII. // 5th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids (NACON-V). 8-12.04. 2001. Shefflld, UK.

9. Воробьева O.B., Кубарева ЕА, Лаврова Н.В., Романенков А.С., Метелев В.Г. ДНК-дуплексы, содержащие монофосфорилдисульфидную межнуклеотидную группировку, как новые реагенты для ковалентного связывания с белками. // Ш-ий съезд российского биохимического общества. 26.06.-1.07. 2002. Санкт-Петербург, Россия.

10. Vorob'eva O.V., Yamskova O.V., Zatsepin T.S. Cross-linking of (cytosine-5)-methyltransferase SsoII with a DNA ligand bearing the 2'-aldehyde group. // International Quality Network Meeting «Biochemistry of Nucleo-Protein Complexes». 7-11.04. 2003. Giessen, Germany.

11 .Vorob'eva O.V., Zatsepin T.S., Karyagina A.S., Kubareva E.A. Probing the protein-DNA interface of the SsoII (cytosine-5)-methyltransferase bound to its own promoter region binding site. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. 25-27.09. 2003. Kyiv, Ukraine.

€-34 15

Подписано в печать 13 февраля 2004 г. Заказ 400. Формат 60 х 90/16. Тираж 120 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф. Москва, Б. Якиманка, 13, оф. 410. Тел. 778-97-47

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Молекулярные аспекты взаимодействия белков семейства С5-цитозиновых ДНК-мстилтрансфераз и семейства Сго-белков и рспрессоров с ДНК

Литературный обзор).

1.1. Классификация ДНК-связывающих белков.

1.2. Строение и свойства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.

1.2.1. Функции ДНК-метилтрансфераз.

1.2.1.1. Биологическое значение метилирования ДНК в прокариотах.

1.2.1.2. Биологическое значение метилирования ДНК в эукариотах.

1.2.2. Первичная структура С5-цитозиновых ДНК-мстилтрансфераз.

1.2.3. Пространственная структура С5-цитозиновых ДНК-мстилтрансфераз.

1.2.4. Механизм катализа переноса метальной группы С5-цитозиновыми ДНК-метилтраисфсразами.

1.2.5. Молекулярные механизмы взаимодействия С5-цитозиновых

ДНК-метилтрансфераз с ДНК-субстратом и кофактором.

1.2.5.1. Особенности связывания ДНК С5-цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами.

1.2.5.2. Структурные аспекты ДНК-белкового узнавания в комплексах

С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.

1.3. Строение и свойства Сго-белков и рспрессоров.

1.3.1. Структурный мотив «спираль-иоворот-спираль».

1.3.2. Представители, входящие в семейство Сго-белков и реирессоров.

1.3.3. Биологические функции фаговых репрессоров и Сго-белков. Регуляция генов в жизненном цикле бактериофага X.

1.3.4. Структура Сго-белков и репрессоров.

1.3.5. Механизм связывания Сго-белков и репрессоров с ДНК.

1.3.6. Белок-белковые взаимодействия в структурах Сго-белков и репрессоров.

ГЛАВА 2. С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза БэоН как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации БэоП

Обсуждение результатов).

2.1. Разработка методики определения неметилируемого остатка 2'-дезоксицитидина в участке метилирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.

2.1.1. Установление специфичности действия Д11К-метилтрансферазы Ы1аХ.

• 2.2. Фермент модификации БэоИ как С5-цитозиновая ДНК-метилтраисфсраза.

2.2.1. Равновесное связывание метилтрансферазы БэоН с участком метилирования.

2.2.2. Идентификация групп атомов участка метилирования, взаимодействующих с метилтрансферазой БэоП при формировании специфического комплекса.

2.2.2.1. Взаимодействие метилтрансферазы БэоН с ^модифицированными ДНК-субстратами.

2.2.2.2. Взаимодействие метилтрансферазы БэоН с ДНК-субстратами, содержащими 5-метил-2'-дезоксицитидин в одной из цепей участка метилирования.

2.2.3. Роль Суз142 каталитического центра метилтрансферазы БэоН в связывании ДНК.

2.3. Изучение роли метилтрансферазы БэоН в процессе дезаминирования метилируемого цитозина.

2.4. Регуляция в системе рестрикции-модификации БбоН. Фермент модификации БэоН как регуляторный белок

2.4.1. Исследование равновесного связывания метилтрансферазы SsoII с регуляторыым» участком ДНК.

2.4.2. Идентификация групп атомов «регуляторного» участка ДНК, взаимодействующих с метилтрансферазой SsoII при формировании специфического комплекса.

2.4.3. Ковалснтпос присоединение метилтрансферазы SsoII к ДНКлигандам, содержащим 2'-альдегидпую группу.

2.5. Анализ ДНК-белковых контактов в комплексах метилтрансферазы SsoII с «регуляторным» участком и участком метилирования.

2.6. Моделирование ДНК-белковых взаимодействий в комплексах метилтрансферазы

SsoII с «регуляторным» участком и участком метилирования.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы и материалы.

3.2. Приборы и методы.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Введение 32Р-метки в ДНК.

3.3.2. Определение пуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК.

3.3.3. Исследование равновесного связывания ДНК-метилтрансфсразы SsoII с ДНК-лигандами.

3.3.4. Метод «отпечатков» с использованием N-этил-М-нитрозомочевины в качестве модифицирующего реагента.

3.3.5. Метод «отпечатков» с использованием диметилсульфата в качестве модифицирующего реагента.

3.3.6. Метод «отпечатков» с использованием муравьиной кислоты в качестве модифицирующего реагента.

3.3.7. Метод «отпечатков» с использованием гидразина в качестве модифицирующего реагента.

3.3.8. Ковалентнос присоединение ДНК-метилтрансфераз 1Ч1аХ и БбоН к ДНК-дуплексам, содержащим 5-фтор-2'-дезоксицитидин.

3.3.9. Ковалентное присоединение ферментов нуклеинового обмена к ДНК-дуплексам, содержащим фосфорилдисульфидную межнуклеотидпую группу.

3.3.10. Ковалентнос присоединение ДНК-метилтрансфсразы БбоН к ДНК-дуплексам, содержащим 2'-альдегидную группу.

3.3.11. Определение эффективности взаимодействия метилтрапсфераз 1Ч1аХ и БбоП с ДНК-субстратами.

3.3.12. Определение пеметилирусмого остатка 2'-дезоксицитидина в участке узнавания цитозииовых ДНК-метилтрансфераз.

3.3.13. Молекулярное моделирование.

ВЫВОДЫ.

Метилирование ДНК ферментами модификации - метилтрансферазами - является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в пуклсотидной последовательности ДНК. ДНК-метилтрансферазы (МТазы) обнаружены в различных про- и эукариотических объектах [1]. У эукариот метилирование ДНК неотделимо от протекания таких биологических процессов, как генная экспрессия, эмбриональное развитие, геномный «импринтинг», инактивация Х-хромосомы, генетические болезни, генетические мутации и онкогенныс заболевания. В прокариотах МТазы в большинстве случаев являются компонентами систем рестрикции-модификации (Р-М). Системы Р-М являются защитным механизмом прокариотических организмов против проникновения в клетку чужеродной ДНК. Ключевыми процессами, сопровождающими функционирование систем Р-М, являются репликация и репарация ДНК.

Важным направлением современных исследований систем Р-М является изучение особенностей регуляции гсипой экспрессии образующих их ферментов - ДНК-метилтрансфераз и эпдопуклеаз рестрикции. ДНК клетки-«хозяина» защищена от гидролиза эндонуклеазой рестрикции посредством специфического метилирования. Очевидно, что нарушение механизма метилирования «хозяйской» ДНК приведет к ее фрагментированию эндонуклеазой рестрикции и, как следствие, к гибели клетки. Однако, несмотря на то, что потенциальная важность регуляции генной экспрессии в системах Р-М очевидна, механизмы, объясняющие этот процесс, всс еще мало изучены. Для ряда систем рестрикции-модификации (РуиН, ВатН1, Есо721) показано, что С-белок - продукт гепа С, лежащего сонаправлено с геном эндонуклеазы рестрикции, стимулирует экспрессию последнего [2-4]. В системах Р-М ЕсоШ1, Мвр1 и БбоИ метилтраисфсразы действуют не только как ферменты модификации, но и как транскрипционные рспрсссоры, которые способны связываться с собственными промоторными областями и регулировать экспрессию собственных генов [5Ч.

Объектом нашего исследования является метилтрансфераза БвоН (М-БбоИ), входящая в систему рестрикции-модификации БвоИ [9]. МБвоИ узнает в двутяжевой ДИК нуклеотидную последовательность б'-СХЖЮ-З' (Ы = Л, Т, С, в) и в присутствии кофактора Б-аденозил-Ь-мстиопина метилирует внутренний остаток цитозипа с образованием 5-метилцитозииа [10]. К началу выполнения настоящей работы была показана способность \1SsoII осуществлять регуляторную функцию, формируя специфический и стабильиый комплекс е промоторпой областью генов системы рестрикции-модификации БбоН [7, 8]. Однако, в отличие от систем Р-М Есо1Ш и Мвр1 для системы БбоН характерна сопряженная регуляция экспрессии генов эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы. М-БбоН не только ингибирует свой собственный синтез, но и активирует синтез эндонуклеазы рестрикции БбоИ.

Целью настоящей работы являлось сравнительное биохимическое исследование специфических ДНК-белковых комплексов М.БбоН с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М БбоИ. Для решения поставленной задачи использован комплексный подход, включающий идентификацию групп атомов ДНК (методом «отпечатков») и аминокислотных остатков фермента (методом региоселсктивного ковалентного присоединения нуклеиновой кислоты к белку), участвующих в формировании ДНК-белковых комплексов; определение констант диссоциации, характеризующих связывание М.БбоН с ДНК-лигандами; компьютерное моделирование белково-пуклсиповых взаимодействий в комплексах М.БзоН с промоторной областью генов системы Р-М БбоН и с участком метилирования ДНК. Отдельной задачей в рамках настоящего исследования стало определение субъединичной структуры М-БбоИ при связывании с промоторпой областью генов системы Р-М БвоП. Для этого впервые использованы ДНК-дуплексы, содержащие альдегидную группу в 2'-положснии углеводного фрагмента.

Вопрос о том, каким образом С5-цитозиновые МТазы катализируют реакцию переноса метальной группы в С5-положение цитозина практически решен. В то же время механизмы узнавания МТазами определенной нуклеотидной последовательности в ДНК и местоположения метилируемого (1С еще недостаточно изучены. Поэтому данная работа в значительной степени направлена на изучение связывания М.БзоН с участком метилирования ДНК. Особое внимание уделено исследованию роли Суз142 каталитического центра М-БбоН во взаимодействии с углеводофосфатным остовом ДНК. Впервые для изучения МТаз были использованы ДНК-дуплексы, содержащие фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

В ходе работы была предложена методика определения местоположения неметилирусмого (1С в участке узнавания цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, основанная на использовании бисульфитной реакции в сочетании с ферментом репарации урацил-ДНК-гликозилазой.

Полученные в настоящей работе данные позволили охарактеризовать механизмы образования специфических ДНК-белковых комплексов М.БзоН с участком метилирования и промоторной областью системы Р-М БбоН и предложить модель взаимодействия С5-цитозиновой ДНК-мстилтрансферазы БбоП с ДНК как бифункционального белка.

Работа содержит литературный обзор, посвященный молекулярным аспектам взаимодействия семейства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз и семейства Сго-белков и репрессоров с ДНК.

выводы

1. Проведено сравнительное биохимическое исследование специфических ДНК-белковых комплексов М-БбоН с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации БэоН. Предложена модель взаимодействия этого фермента с ДНК как бифункционального белка.

2. Идентифицированы группы атомов участка метилирования и инвертированного повтора промоторной области генов системы рестрикции-модификации БэоН, существенные для формирования комплексов с метилтрансферазой БэоН. Построены молекулярные модели комплекса С-копцсвой части мстилтрансферазы БзоН с участком метилирования в ДНК и аналогом кофактора Б-адснозил-Ь-гомоцистеином, а также комплекса М-концевой части метилтрансферазы БзоН с промоторной областью.

3. Впервые продемонстрирована возможность использования ДНК-дуплсксов, содержащих фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межпуклеотидной связи, для ковалептпого присоединения к метилтрапсфсразе БзоН за счет реакции дисульфидного обмена. Показана сближенность остатка Суз142 каталитического центра фермента с углсводофосфатпым остовом ДНК при взаимодействии как со специфическими, так и с неспецифическими лигандами.

4. Методом ковалентного присоединения метилтрансферазы БзоН к ДНК-дуплексам, содержащим альдегидную группу в 2'-положении углеводного фрагмента, впервые показано, что в связывании с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации БэоН могут участвовать две молекулы фермента.

5. Разработана методика определения местоположения нсметилируемого ¿С в участке узнавания цитозиновых ДНК-мстилтрансфераз, основанная на последовательном использовании бисульфитной реакции и фермента репарации урацил-ДНК-гликозилазы. С помощью предложенного подхода установлена специфичность действия метилтрансферазы Ы1аХ.

1. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNAmethyltransfcrases. //ChcmBioChem. 2002. V. 3. P. 274-293.

2. Tao T., Bourne J.C., Blumenthal R.M. A family of regulatory genes associated with type IIrestriction-modification systems. // J. Bacteriol. 1991. V. 1. P. 1367-1375.

3. Ives C.L., Nathan P.D., Brooks J.E. Regulation of the BamHI restriction-modification system bya small intergenic open reading frame, bamlllC, in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. //J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 7194-7201.

4. Rimsclicne R., Vaisvila R., Janulaitis A. The eco72Icgcnc specifies a trans-acting factor whichinfluences expression of both DNA methyltransferasc and endonuclease from the Eco72I restriction-modification system. //Gene. 1995. V. 157. P. 217-219.

5. Som S., Friedman S. Regulation of EcoRII mcthyltransferase: effect of mutation on geneexpression and in vitro binding to the promoter region. // Nuclcic Acids Res. 1994. V. 22. P. 5347-5353.

6. Som S., Friedman S. Characterization of the intergenic region which regulates the Msplrestriction-modification system. //J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 964-967.

7. Karyagina A., Shilov I., Tashlitskii V., Khodoun M., Vasil'ev S., Lau P.C.K., Nikolskaya, I.,

8. Specific binding of SsoII DNA mcthyltransferase to its promoter region provides the regulation of SsoII restriction-modification gene expression. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2114-2120.

9. Shilov I., Tashlitskii V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Ya., Kuzubov A, Kubareva E.,

10. Karyagina A. DNA-methyltransfcrasc SsoII interaction with own promoter region binding site. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2659-2664.

11. Тедиашвили М.И., Упорова Т.М., Никольская И.И., Дсбов С.С. Обнаружение системы хозяйской специфичности у шигелл. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1980. Т. 90. С. 324-325.

12. Ю.Никольская И.И., Карташова И.М., Лопатина Н.Г. Ферменты новой системы хозяйской специфичности Sso47II. // Молекуляри. генетика. 1983. Т.12. С. 5-10.

13. Frishman D., Meves H-W. PEDANTic genome analysis. // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 415416.

14. Harrison S.C. A structural taxonomy of DNA-binding domains. // Nature. 1991. V. 353. P. 715719.

15. Luisi B.F. DNA-protein interaction at high resolution. // DNA-protein structural interactions. /

16. Eds Lilley D.M.J. New York: Oxford University Press. 1995. P. 1-48.

17. Saylc R.A., Milner-White E.J. RasMol Bimolecular graphics for all. // Trends Biochem. Sci.1995. V. 20. P. 374-376.

18. Luscombc N.M., Austin S.E., Berman II.M., Thornton J.M. An overview of the structures ofprotein-DNA complexes. // Genome Biology. 2000. V. 1. P. 1-37.

19. Oregano C.A., Taylor W.R. SSAP: sequential structure alignment program for protein structurecomparison. // Methods Enzimol. 1996. V. 266. P. 617-635.

20. Oregano C.A., Flores T.P., Taylor W.R., Thornton J.M. Identification and classification ofprotein fold families. // Protein Eng. 1993. V. 6. P. 485-500.

21. Drydcn D.T.F. Bacterial DNA methyltransferascs. // S-Adenosylmethionine-dependentmethyltransferascs: structures and functions. / Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific Publishing. 1999. P. 283-340.

22. Heitman J. On the origins structures and functions of restriction-modification enzymes. // Genet.

23. Eng. 1993. V. 15. P. 57-108.

24. Roberts R.J., Macclis D. REBASE restriction enzymes and methylases. // Nuclcic Acids Res.2001. V. 29. P. 268-269.

25. Roberts R.J., Ilalford S.E. Type II restriction enzymes cndonuclcascs. // Nucleases. / Eds. Linn

26. S.M., Lloyd R.S., Roberts R.J. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Press. 1993. P. 3588.

27. Sternberg N., Coulby J. Cleavage of the bacteriophage PI packaging site is regulated byadedenine methylation. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. V. 87. P. 8070-8074.

28. Messer W., Noycr-Weidner M. Timing and targeting: the biological functions of Dammethylation in E. coli. II Cell. 1988. V. 54. P. 735-737.

29. Modrich P. Methyl-directed DNA mismatch correction. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 65976600.

30. Marnus M.G. Methylation of DNA. // Escherichia coli and Salmonella typhimurium. / Eds

31. Neidhardt F.C. Washington: ASM Press Washington DC. 1996. P. 782-791.

32. Polaczek P., Kwan K., Liberies D.A., Campbell J.L. Role of architectural elements incombinatorial regulation of initiation of DNA replication in Escherichia coli. II Mol. Microbiol. 1997. V. 26. P. 261-275.

33. Vertino P.M. Eukaryotic DNA methyl transferases. // S-Adenosylmethioninc-depcndentmethyltransfcrascs: structures and functions. / Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific Publishing. 1999. P. 341-372.

34. Kass S.U., Pruss D., WolfTc A.P. How docs DNA methylation repress transcription? //

35. Trends Genet. 1997. V. 13. P. 444-449.

36. Siegfried Z., Cedar II. DNA methylation: a molecular lock. // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 305307.

37. Tilghman S.M. The sins of the fathers and mothers: gcnomic imprinting in mammaliandevelopment. // Cell. 1999. V. 96. P. 185-193.

38. Reik W., Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. // Nat. Rev. Genet.2001. V. 2. P. 21-32.

39. Li E., Beard C., Jaenisch R. 1993. Role for DNA methylation in genomic imprinting. //

40. Nature. V. 366. P. 362-365.

41. Beard C., Li E., Jaenisch R. Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryoniccells. //Genes Dev. 1995. V. 9. P. 2325-2334.

42. Panning B., Jaenisch R. DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence Xlinkcd genes. // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1991-2002.

43. Sado T, Fcnner M.H., Tan S.S., Tam P., Shioda T., Li E. X inactivation in the mouse embryodeficient for Dnmtl: distinct effect of hypomethylation on imprinted and random X inactivation. // Dev. Biol. 2000. V. 225. P. 294-303.

44. Smit A.F. Interspersed repeats and other mementos of transposable elements in mammaliangenomes. IICurr. Opin. Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 657-663.

45. Jackon-Grusby L., Beard C., Possemato R., Tudor M., Fambrough D., Csankovszki G.,

46. Dausman J., Lee P., Wilson C., Lander E., Jaenisch R. Loss of genomic methylation causes p53-depcndcnt apoptosis and epigcnctic deregulation. //Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 31-39.

47. Li E., Bestor T. II., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results incmbrionic lethality. //Cell. 1992. V. 69. P. 915-926.

48. Okano M., Bell D.W., Habcr D.A., Li E. DNA Mcthyltransferascs Dnmt3a and Dnmt3b arcessential for de novo methylation and mammalian development. // Cell. 1999. V. 99. P. 247257.

49. Warnccke P.M., Bestor T. H. Cytosine methylation and human cancer. // Curr. Opin. Oncol.2000. V. 12. P. 68-73.

50. Baylin S.B., Merman J.G. DNA hypermethylation in tumorigenesis: cpigenetics joins genetics. //

51. Trends Genet. 2000. V. 16. P. 168-74.

52. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of cpigenetic events in cancer. // Nat. Rev. Genet.2002. V.3. P. 415-428.

53. Issa J.P. CpG-island mcthylation in aging and cancer. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000.1. V. 249. P. 101-118.

54. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. The DNAcytosine-5) methyltransferases. //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 1-10.

55. Sankpal U.T., Rao D.N. Structure, function and mechanism of Hhal DNA methyltransferases. //

56. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2002. V. 37. P. 167-197.

57. Громова E.C., Хорошаев А.В. Прокариотические ДНК-метилтрапсферазы: структура имеханизм взаимодействия с ДНК. // Молекулярн. Биология. 2003. Т. 37. С. 300-314.

58. O'Gara М., Zhang X., Roberts R.J., Cheng X. Structure of a binary complex of Hhalmethyltransfcrase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short nonspecific DNA oligonucleotide. // J. Mol. Biol. 1999. V. 287. P. 201-209.

59. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X. Hhal methyltransferase flips its target baseout of DNA helix. // Cell. 1994. V. 76. P. 357-369.

60. Reinisch K.M., Chen L., Vcrdine G.L., Lipscomb W.N. The crystal structure of Haelllmethyltransferase covalently complcxed to DNA: at extrahelical cytosine and rearranged base pairing.//Cell. 1995. V. 82. P. 143-153.

61. Mi S., Roberts R.J. The DNA binding affinity of Hhal methylase is increased by a signal aminoacid substitution in the catalytic centre. //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 2459-2464.

62. Chen L., MacMillan A.M., Vcrdine G.L. Mutation separation of DNA binding from catalysis ina DNA cytosine methyltransferase. //J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 5318-5319.

63. Wyszynski M.W., Gabbara S., Kubareva E.A., Romanova E.A., Oretskaya T.S., Gromova E.S.,

64. Shabarova Z.A., Bhagwat S.A. The cysteine conserved among DNA cytosine methylascs isrequired for methyl transfer, but not for specific DNA binding. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 295-301.

65. Hanck T., Schmidt S., Fritz H.J. Sequence-specific and mechanism-based crosslinking of Demcytosine-C5 methyltransferase of E. coli. K-12 to synthetic oligonucleotides containing 5-fluoro-2'-deoxycytidinc. // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 303-309.

66. Klimasauskas S., Nelson J.L., Roberts R.G. The sequence specifity domain of cytosine-C5methylases.// Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 6183-6190.

67. Mi S., Roberts R.J. How M.MspI and M.Hpall decide which base to methylate. //Nucleic Acids

68. Res. 1992. V. 20. P. 4811-4816.

69. Zimmermann C., Guhl E., Graessmann A. Mouse DNA methyltransferase (MTasc) deletionmutants that retain the catalytic domain display neither de novo nor maintenance methylation activity in vivo. // Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 393-405.

70. Gowher H., Jeltsch A. Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and

71. Dnmt3b DNA methyltransferases. //J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 20409-20414.

72. Chuang L.S-H., Ian H-I., Koh T.W., Ng H-H., Xu G., Li B.F.L. Human DNA (cytosine-5)methyltransferase PCNA complex as a target for p21WAFl. // Science. 1997. V. 277. P. 1996-2000.

73. Robertson K.D., Ait-Si-Ali S., Yokochi T., Wade P.A., Jones P.L., Wolffe A.P. DNMT1 formsa complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters. // Nat. Genet. 2000. V. 25. P. 338-342.

74. Rounntrce M.R., Bachman K.E., Baylin S.B. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-reprcssor,

75. DMAP1, to form a complex at replication foci. // Nat. Genet. 2000. V. 25. P. 269-277.

76. Malone T., Blumenthal R.M., Cheng X. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifsconserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. // J. Mol. Biol. 1995. V. 253. P. 618-632.

77. Cheng X., Kumar S., Posfai J., Pflugrath J.W. Roberts R.J. Crystal structure of the Hhal DNAmethyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. // Cell. 1993. V. 74. P. 299-307.

78. Kumar S., Horton J.R., Jones G.D., Walker R.T., Roberts R.J., Cheng X. DNA containing 4'thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by Hhal methyltransferase. // Nucleic. Acids Res.1997. V. 25. P. 2773-2783.

79. O'Gara M., Klimasauskas S., Roberts R.J., Cheng X. Enzymatic C5-cytosine methylation of

80. DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. //J. Mol. Biol. 1996. V. 261. P. 634-645.

81. O'Gara M., Roberts R.J., Cheng X. A structural basis for the preferential binding ofhemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. // J Mol Biol. 1996. V. 263. P. 597606.

82. O'Gara M., Horton J.R., Roberts R.J., Cheng X. Structures of Hhal methyltransferasecomplexed with substrates containing mismatches at the target base. // Nature Struct. Biol.1998. V. 5. P. 872-877.

83. Shcikhncjad G., Brank A., Christman J.K., Goddard A., Alvarez E., Ford Il.Jr., Marquez V.E.,

84. Marasco. C.J., Sufrin J.R., O'Gara M., Cheng X. Mechanism of inhibition of DNA (cytosine C5)-methyltransferases by oligodeoxyribonucleotides containing 5,6-dihydro-5-azacytosine. // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 2021-2034.

85. Vilkaitis G., Dong A., Weinhold E., Cheng X., Klimasauskas S. Functional roles of theconserved threonine 250 in the target recognition domain of Ilhal DNA methyltransferase. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 38722-38730.

86. Dong A., Yoder J. A., Zhang X., Zhou L., Bcstor II., Cheng X. Structure of human DNMT2, anenigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA. // Nuclcic Acids Res. 2001. V. 29. P. 439-448.

87. Vilkaitis G., Merkienc E., Serva S., Wienholrd E., Klimasauskas S. The mechanism of DNAcytosine-5-methylation. Kinetic and mutational dissection of Ilhal methyltransferase. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 20924-20934.

88. Bhattacharya S.K., Dybey A.K. Kinetic mechanism of cytosine DNA methyltransferase Mspl. //

89. J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 14743-14749.

90. Renbaum P., Razin A. Mode of action of the Spiroplasma CpG methylase M.SssI. // FEBS Lett.1992. V.313. P. 243-247.

91. Boye E., Marnus M.G., Lobner-Olesen A. Quantitation of Dam methyltransferase in

92. Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 1682-1685.

93. Kellehcr J.E., Raleigh E.A. Response to UV damage by for Escherichia coli. K-12 restrictionsystems.//J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 5888-5896.

94. Klimasauskas S., Szyperski Т., Serva S., Wuthrich K. Dynamic modes of the flipped-outcytosine during Hhal methyltransferase-DNA interactions in solution. // EMBO J. 1998. V. 17. P. 317-324.

95. Flynn J., Reich N. Murine DNA (cytosine-5-)-methyltransferase: steady-state and substratetrapping analyses of the kinetic mechanism. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 15162-15169.

96. Rcnbaum P., Razin A. Footprint analysis of M.SssI and M.Hhal methyltransferascs revealsextensive interactions with the substrate DNA backbone. // J. Mol. Biol. 1995. V. 284. P. 1926.

97. Finta С., Kiss A. Footprint analysis of the BspRI DNA methyltransferase-DNA interaction//

98. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2841-2846.

99. Dybey A.K., Roberts R.J. Sequence-specific DNA binding by the Mspl DNA methyltransferasc.

100. Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 3167-3173.

101. Rasko Т., Finta С., Kiss A. DNA bending induced by DNA (cytosinc-5) methyltransferascs. //

102. Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3083-3091

103. Nelson H.C., Bestor Т.Н. Base eversión and shuffling by DNA mcthyltransfcrases. // Chem.

104. Biol. 1996. V.3. P. 419-423.

105. Osterman D.G., DcPillis G.D., Wu J.C., Matsuda A., Santi D.V. 5-Fluorocytosine in DNA is amachanism-based inhibitor of Hhal methylase. // Biochemistry. 1998. V. 27. P. 5204-5210.

106. Pabo C.O., Saucr R.T. Transcription factors: structural families and principles of DNArecognition.//Annu. Rev. Biochcm. 1992. V. 61. P. 1053-1095.

107. Huffman J.L., Brennan R.G. Prokaryotic transcription regulators: more than just the helix-turnhclix motif. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 98-106.

108. Warren A.J. Eukaryotic transcription factors. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 107114.

109. Леднева P.K., Копылов A.M. Структурные аспекты ДНК-белкового узнавания. М.: МГУ,1999. 119 с.

110. Suzuki M., Brenner S.E., Gerstein M., Yagi N. DNA recognition code of transcription factors. //

111. Protein Eng. 1995. V. 4. P. 319-328.

112. Suzuki M. A framework for the DNA-protein recognition code of the probe helix intranscription factors: the chemical and stereochemical rules. // Structure. 1994. V. 2. P. 317326.

113. Suzuki M., Yagi N. DNA-protein recognition code of transcription factors in the helix-turnhelix, probe helix, hormone receptor and zinc finger families. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 12357-12361.

114. Anderson W.F., Takeda Y., Echols H., Matthews B.W. The structure of a repressor:crystallographic data for the Cro regulatory protein of bacteriophage lambda. // J. Mol. Biol. 1979. V. 130. P. 507-510.

115. Anderson W.F., Ohlendorf D.H., Takeda Y., Matthews B.W. Structure of the cro repressor frombacteriophage lambda and its interaction with DNA. // Nature. 1981. V. 290. P. 754-758.

116. McKay D.B., Steitz T.A. Structure of catabolite gene activator protein at 2.9 A resolutionsuggests binding to left-handed B-DNA. //Nature. V. 290. P. 744-749.

117. Dodd I.B., Egan J.B. Improved detection of helix-turn-helix DNA-binding motifs in proteinsequences. // Nucleic. Acids Res. 1990. V. 18. P. 5019-5026.

118. Harrison S.C., Aggarwal A.K. DNA recognition by proteins with the helix-turn-helix motif. // Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 933-969.

119. Wintjens R., Rooman M. Structural classification of HTH DNA-binding domains and proteinDNA interaction modes. //J. Mol. Biol. 1996. V. 262. P. 294-313.

120. Brennan R.G. DNA-recognition by the helix-turn-hclix motif. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1992. V. 2. P. 100-108.

121. Suzuki M., Suckow J., Kisters-Woike B., Aramaki H., Makino K. Multi-helical DNA-binding domains: their structures and modes of DNA-binding. // Adv. Biophys. 1996. V. 32. P. 31-52.

122. Suzuki M., Brenner S.E. Classification of multi-helical DNA-binding domains and application to predict the DBD structures of sigma factor, LysR, OmpR/PhoB, CENP-B, Rapl, and XylS/Ada/AraC. // FEBS Letters. 1995. V. 372. P. 215-221.

123. Пташнс M. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг X. М.: Мир, 1988. 158 с.

124. Dodd I.B., Perkins A.J., Tsemitsidis D., Egan J.B. Octamerization of lambda CI repressor is needed for effective repression of Prm and efficient switching from lysogeny. // Genes Dev. 2001. V.15. P. 3013-3022.

125. Johnson A.D., Poteete A.R., Lauer G., Sauer R.T., Ackcrs G.K., Ptashne M. Lambda repressor and cro-componcnts of an efficient molecular switch. // Nature 1981. V. 294. P. 217-223.

126. Hochschild A., Douhan J., Ptashne M. How lambda repressor and lambda Cro distinguish between OR1 and OR3. // Cell. 1986. V. 47. P. 807-816.

127. Albright R.A., Matthews B.W. How Cro and X-rcprcssor distinguish between operators: the structural basis underlying a genetic switch. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 3431-3436.

128. Anderson J.E., Ptashne M., Harrison S.C. Structure of the repressor-opcrator complex of bacteriophage 434. // Nature. 1987. V. 326. P. 846-852.

129. Aggarval A.K., Rodgers D.W., Drottar M., Ptashne M., Harrison S.C. Recognition of a DNA operator by the repressor of phage 434: a view at a high resolution. // Sciencc. 1988. V. 242. P. 899-907.

130. Shimon L.J.W., Harrison S.C. The phage 434 0R2/Rl-69complex at 2.5 A resolution. // J. Mol. Biol. 1993. V. 232. P. 826-838.

131. Mondragon A., Subbiah S., Almo S.C., Drottar M., Harrison S.C. Structure of the amino-tcrminal domain of phage 434 repressor at 2.0 Л resolution. // J. Mol. Biol. 1989. V. 205. P. 189-200.

132. Pabo C.O., Lewis M. The operator-binding domain of lambda repressor: structure and DNA recognition. //Nature. 1982. V. 298 P. 443-447.

133. Jordan S.R., Pabo C.O. Structure of the lambda complex at 2.0 Á resolution: details of the repressor-operator interactions. // Scicnce. 1988. V. 242. P. 893-899.

134. Bcamer LJ, Pabo CO. Refined 1.8 Á crystal structure of the lambda repressor-operator complex.//J. Mol. Biol. 1992. V. 227. P. 177-196.

135. Lim W.A., Hodel A., Sauer R.T., Richards F.M. The crystal structure of a mutant protein with altered but improved hydrophobic core packing. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 423-427.

136. De Anda J., Poteete A.R., Sauer R.T. P22 c2 repressor. Domain structure and function. // J. Biol. Chcm. 1983. V. 258. P. 10536-10542.

137. Mondragon A., Harrison S.C. The phage 434 Cro/ORl complex at 2.5 Á resolution. // J. Mol. Biol. 1991. V. 219. P. 321-334.

138. Wolberger C., Dong Y.C., Ptashne M., Harrison S.C. Structure of a phage 434 Cro/DNA complex. //Nature. 1988. V. 335. P. 789-795.

139. Albright R.A., Matthews B.W. Crystal structure of X-Cro bound to a consensus operator at 3.0 A resolution. // J. Mol. Biol. 1998. V. 280. P. 137-151.

140. Matsuo H., Shirakawa M., Kyogoky Y. Three-dimensional structure of the X-Cro repressor in solution as determined by hetcronuclcar multidimensional NMR. // J. Mol. Biol. 1995. V. 254. P. 668-680.

141. Clarke N.D., Beamer L.J., Goldeberg H.R., Berkower C., Pabo C.O. The DNA binding arm of X repressor: critical contacts from a flexible region. // Science. 1991. V. 254. P. 267-270.

142. Eliason J.L., Weiss М.Л., Ptashne M. NH2-terminal arm of phage lambda repressor contributes energy and specificity to repressor binding and determines the effects of operator mutations. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 2339-2343.

143. Koudelka G.B., Harbury P., Harrison S.C., Ptashne M. DNA twisting and the affinity of bacteriophage 434 operator for bacteriophage 434 repressor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 4633-4637.

144. Bushman F.D., Anderson J.E., Harrison S.C., Ptashne M. Ethylation interference and X-ray crystallography identify similar interactions between 434 repressor and operator. // Nature. 1985. V. 316. P. 651-653.

145. Pabo C.O., Aggarval Л.К., Jordan S.R., Bcamer L.J., Obcysekare U.R., Harrison S.C. Conserved residues makes similar contacts in two repressor-opcrator complexes. // Science. 1988. V. 247. P. 1210-1213.

146. Wu L., Koudelka G.B. Sequcncc-dcpendent differences in DNA structure influence the affinity of P22 operator for P22 repressor. //J. Biol. Chcm. 1993. V. 268 P. 18975-18981.

147. Whipple F.W., Hou E.F., Ilochschild A. Amino acid-amino acid contacts at the cooperativity interface of the bacteriophage lambda and P22 repressors. // Genes Dev. 1998. V.12. P. 27912802.

148. Donner A.L., Carlson P.A., Koudelka G.B. Dimerization specificity of P22 and 434 repressors is determined by multiple polypeptide segments. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 1253-1261.

149. Карягина A.C., Лунин В.Г., Никольская И.И., Дебов С.С. Локализация генов рестриктазы и метилазы SsoII на карте плазмилы Р4. // Молекуляри. генетика. 1989. Т. З.С. 16-20.

150. Karyagina A.S., Lunin V.G., Nikolskaya I.I. Characterization of the genetic determinants of SsoII restriction endonuclcasc and modification mcthyltransfcrase. // Gene. 1990. V. 87. P. 113-118.

151. Karyagina A.S., Lunin V.G., Degtyarenko K.N., Uvarov V.Yu., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide sequence and derived amino acid sequences of the SsoII restriction cndonuclease and methyltransferase. // Gene. 1993. V. 124. P. 13-19.

152. Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Drousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The SsoII and NlaX DNA mcthyltransferases: overproduction and functional analysis. // Gene. 1995. V. 157. P. 93-96.

153. Boyer H.W., Chow L.T., Dugaczyk A., Hcdgcpcth J., Goodman H.M. DNA substrate site for the EcoRII restriction endonuclease and modification methylase. // Nature New Biol. 173. V. 224. P. 40-43.

154. May M.S., Hattman S. Analysis of bacteriophage deoxyribonucleic acid sequences methylated by host-and R-factor-controlled enzymes.//J. Bactcriol. 175. V. 122. P. 129-138.

155. Posfai G., Szybalski W. A simple method for locating methylated bases in DNA, as applied to detect asymmetric methylation by M.FoklA. // Gene. 1988. V. 69. P. 147-151.

156. Gopal J., Bhagwat A.S. Determination of methylation specificity of DsaV methyltransferase by a simple biochemical method. //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 29-35.

157. Vilkaitis G., Klimasauskas S. Bisulfite sequencing protocol displays both 5-methylcytosine and N4-mcthylcytosine. // Anal. Bioch. 1999. V. 271. P. 116-119.

158. Упорова T.M., Карташева И.М., Скриикин Е.Л., Лопарева Е.Н., Никольская И.И., Дебов С.С. Рсстриктирующие эндонуклеазы из S.sonnei 47. // Вопросы мед. химии. 1985. Т. 31. С. 131-136.

159. Громова Е. А., Кубарсва Е. А., Елов А.А., Акатова Е.А., Никольская И.И., Шабарова З.А. Расщеплсиис субстратов коикатемериого типа эндонуклеазами рестрикции Mval и SsoII. // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 552-559.

160. Shapiro R., DiFatc V., Welcher М. Dcamination of cytosine derivatives by bisulfite. Mechanism of the reaction. //J. Am. Chcm. Soc. 1974. V. 96. P. 906-912.

161. Wang R.Y.-H., Gehrke C.W., Ehrlich M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. // Nucleic Acids Res. 1980. V. 8. P. 47774790.

162. Sun В., Latham K.A., Dodson M.L., Lloyd R.S. Studies on the catalytic mechanism of five DNA glycosylases. Probing for cnzyme-DNA imino intermediates. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 19501-19508.

163. Maxam A., Gilbert W. A new method for sequencing DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P. 560-564.

164. Lau P.C.K., Forghani F„ Labbe D., Bergeron II., Brousscau R., Iloltke H.J. The NlalV restriction and modifications genes of Neisseria lactamica are flanked by leucine biosynthesis genes. //Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 24-31.

165. Lacmmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophageT4. //Nature. 1970. V.227. P. 680-685.

166. Варфаломеев С.Д., Гурсвич К.Г. Биокинетика. М.: Фаир-пресс, 1998. 720 с.

167. Yang A.S., Shcn J.-C., Zingg J.-M., Mi S., Jones Р.Л. Hhal and Hpall DNA mcthyltransfcrascs bind DNA mismatches, mcthylate uracil and block DNA repair. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1380-1387.

168. Klimasauskas S., Roberts R.J. M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base.//Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1388-1395.

169. Cal S., Connolly B.A. DNA distortion and base flipping by the EcoRV DNA mcthyltransfcrasc. A study using interference at dA and T bases and modified deoxynucleosides. //J. Biol. Chcm. 1997. V. 272. P. 490-496.

170. Allan B.W., Beechem J.M., Lindstrom W.M., Rcich N.O. Direct real time observation of base flipping by the EcoRI DNA mcthyltransferase. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 2368-2373.

171. Lhomme J., Constant J.-F., Dcmcunynck M. Abasic DNA structures, reactivity, and recognition. // Biopolymers (Nucleic Acid Sci.). 1999. V. 52. P. 65-83.

172. Мстелев В.Г., Кубарева Е.А., Романова Е.А., Орсцкая Т.С. Синтез и свойства олигодезоксирибонуклеотидов с моно- и дифосфорилдисульфидпыми межпуклеотидиыми группировками. // Биоорган. Химия. 2003. Т. 29. С. 57-63.

173. Singh R., Whitesides G. М. Chemistry of sulphur-containing functional groups. // The chemistry of sulphur-containing functional groups. / Eds. Patai S., Rappoport Z. New York: John Wiley & Sons Ltd. 1993. P. 634 658.

174. Zingg J.-M., Shcn J.-C., Yang A.S., Rapoport H., Jones P.A. Mcthylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosinc-5)-DNA mcthyltransfcrasc. // Nuclcic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3267-3275.

175. Bandaru B., Gopal J., Bhagwat A.S. Overproduction of DNA cytosinc mcthyltransferase causes methylation and C —» T mutations at non-canonical sites. // J. Biol. Chcm. 1996. V. 271. P. 7851-7859.

176. Shrath A.N., Weinhold E., Bhagwat A.S. Reviving a dead enzyme: cytosinc dcaminations promoted by an inactive DNA methyltransferase and an S-adenosylmethionine analogue. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 14611-14616.

177. Bandaru B., Wyszynski M., Bhagwat A.S. Ilpall methyltransferase is mutagenic in Escherichia coli. III. Bacterid. 1995. V. 177. P. 2950-2952.

178. Shen J.-C., Rideout W.M., Jones Р.Л. High frequency mutagenesis by a DNA mcthyltransferasc. //Cell. 1992. V. 71. P. 1073-1080.

179. Турутин Д.В., Зацепин T.C., Тимченко M.A., Кубарева Е.А., Орецкая Т.С. Ковалентнос присоединение фактора транскрипции NF-кВ к ДНК-лиганду содержащему 2'-альдегидную группу. // Молскулярн. Биология. 2003. Т. 36. С. 877-879.

180. Kaplan W., Littlejohn T.G. Swiss-PDB Viewer (Deep View). // Brief. Bioinform. 2001. V. 2. P. 195-197.

181. Vriend G. WHAT IF: a molecular modelling and drug design program. // J. Mol. Graph. 1990. V. 8. P. 52-56.

182. Alexeevski A., Spirin S., Alcxccvski D., Klychnikov O., Ershova A., Titov M., Karyagina A. CluD, the program for the determination of hydrophobic clusters in spatial structures of macromolcculcs. // Биофизика. 2004. Специальный выпуск.

183. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server.//Nucleic. Acids Res. 2003. V. 31. P. 3381-3385.

184. Lindahl E., Hess В., Spoel D. GROMAS 3.0: a package for molccular simulation and trajectory analysis. //J. Mol. Mod. 2001. V. 7. P. 306-317.