Модифицированные ДНК-дуплексы с включениями тимидингликоля. Физико-химические свойства и взаимодействие с ДНК-узнающими белками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

004666324

Ян Фань

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДНК-ДУПЛЕКСЫ С ВКЛЮЧЕНИЯМИ ТИМИДИНГЛИКОЛЯ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК-УЗНАЮЩИМИ БЕЛКАМИ

02.00.10 - биоорганическая химия

2 4 ШОН ЦЦ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Лн

МОСКВА-2010

004606324

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Орецкая Татьяна Семеновна

доктор химических наук Кубарева Елена Александровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Кочетков Сергей Николаевич

доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Ведущая организация:

ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА

Защита состоится 15 июня 2010 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 14 мая 2010 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК в живых клетках непрерывно подвергается воздействию внешних факторов, таких, как ультрафиолетовый свет, ионизирующее облучение, агрессивные химические соединения. Во многих случаях в результате этих процессов возникают активные формы кислорода, которые атакуют ДНК, вызывая повреждения в углеводофосфатном остове или гетероциклических основаниях. Эти повреждения могут приводить к преждевременному старению организма, а также способствовать возникновению различных заболеваний, в том числе онкологических. Несмотря на наличие в клетке ферментов, направленных на удаление поврежденных нуклеозидов, полностью исключить влияние окислительных повреждений на функционирование клеточных белков невозможно. Одним из наиболее частых повреждений ДНК является окисление двойной связи тимидина с образованием 5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидина (тимидингликоля, Т8'). В недавних исследованиях методами спектроскопии ядерного магнитного разонанса (ЯМР) и рентгеноструктурного анализа (РСА) охарактеризованы свойства ДНК-дуплексов, содержащих Т81, динамика и стабильность двойной спирали [Rung et al., 1997; Brown et al., 2008; Aller et al„ 2007]. Показано, что эти параметры существенными образом зависят от первичной структуры ДНК. В связи с этим, актуальным является исследование структурных и биологических последствий окисления тимидина на ДНК-моделях, в которых варьируется нуклеотидный контекст, окружающий модифицированный остаток. Важными задачами остаются разработка методов обнаружения остатка Т8' в составе фрагментов ДНК, изучение влияния модифицированного нуклеозида на скорость формирования дуплексов, а также его роли в узнавании при формировании белково-нуклеиновых комплексов. На сегодняшний день накоплено много свидетельств того, что окисление тимидина имеет значительные последствия для функционирования клетки. В большинстве случаев удается наблюдать лишь конец цепи событий, первопричиной которых является появление единичного повреждения в ДНК. В последнее время предпринимаются попытки проследить реакцию отдельных клеточных ферментов на то или иное повреждение нуклеиновой кислоты. Так, широко изучается эффективность и специфичность действия ферментов репарации и различных полимераз в ответ на появление Т8' в матричной цепи ДНК или в пуле нуклеозидтрифосфатов [Aller et al., 2007; Wang, 2002; Brown et al., 2010; Purmal et al., 1998]. Вместе с тем, остается актуальным исследование влияния тимидингликоля на функционирование ряда важнейших белков, оперирующих на ДНК, например, таких, как ферменты рестрикции-модификации и факторы транскрипции.

Цель работы заключалась в оценке влияния тимидингликоля - окислительного повреждения ДНК, на физико-химические свойства ДНК-дуплексов и их взаимодействие с рядом ДНК-узнающих белков в зависимости от числа модифицированных звеньев в двойной спирали и природы нуклеотидных пар, фланкирующих поврежденное звено.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с сайт-направленными включениями Т8'.

2. Изучение влияния остатков Т8' на структуру двойной спирали и термическую устойчивость модифицированных ДНК-дуплексов.

3. Анализ взаимодействия ДНК-узнающих белков разных классов: фосфодиэстераз, эндонуклеаз рестрикции, ДНК-метилтрансфераз, фактора транскрипции ИР-кВ, ДНК-полимераз с олигонуклеотидными дуплексами, содержащими в заданном положении участка узнавания остатки Т8'; исследование влияния потери ароматичности гетероциклическим основанием на функционирование указанных белков.

Научная новизна и практическая значимость работы. В качестве адекватных моделей для изучения физико-химических и биологических свойств ДНК с окислительными повреждениями тимидина предложено использовать синтетические одно- и двуспиральные фрагменты ДНК с одним или двумя включениями Т8'.

Охарактеризованы физико-химические свойства модифицированных и немодифицированных ДНК-дуплексов различного нуклеотидного состава. Установлено, что величина дестабилизирующего эффекта, вносимого остатком Т8', характер кривых плавления и кооперативность перехода «спираль-клубок» непосредственно связаны с различием длины и состава фрагментов, примыкающих слева и справа к остатку Т8'. Показано, степень влияния Т8' на структуру двойной спирали зависит от длины олигонуклеотидного дуплекса, его стабильности, О-С-состава, природы и полярности нуклеотидных звеньев, фланкирующих тимидингликоль. Моделирование структуры дуплексов показало, что введение тимидингликоля в состав ДНК вызывает нарушение «стэкинг»-взаимодействий, изменение локализации фосфатных групп в районе модификации и структурной организации пары Т8'-А. Это, в свою очередь, приводит к увеличению площади гидрофобной поверхности и дестабилизации ДНК-дуплекса.

Впервые изучено взаимодействие синтетических фрагментов ДНК, содержащих Т8', на функционирование фосфодиэстеразы змеиного яда, эндонуклеаз рестрикции 11-го типа, С5-цитозиновой метилтрансферазы ЗбоИ, субьединиц р50 и р65 фактора транскрипции ОТ-кВ, ДНК-полимераз X и р.

Показано, что введение поврежденного основания в олигонуклеотидную цепь ингибирует действие фосфодиэстеразы змеиного яда. Полученная информация важна в связи с возрастающим интересом к фармакологическим свойствам нуклеаз.

Продемонстрировано, что эндонуклеаза рестрикции П-го типа ЗэоП может быть использована в качестве индикатора, позволяющего охарактеризовать локальные структурные изменения ДНК, вызванные остатком Т8'. Разница, обнаруженная в поведении двух ферментов - Рзр61 и Мзр1191, узнающих одну и ту же нуклеотидную последовательность, позволяет использовать их тандем для тестирования присутствия Т8' в ДНК.

При изучении взаимодействия ДНК-метилтрансферазы БбоН с ДНК-дуплексами, содержащими Т8' в участке метилирования и регуляторном участке, впервые обнаружено, что наличие окисленного основания приводит к нарушению связывания

фермента с обоими участками и негативно влияет на метилирование ДНК.

Замена тимидина на Т8' в одной из вырожденных позиций кВ-участка в целом не оказывает существенного влияния на функционирование р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ, но в 3-5 раз ухудшает связывание модифицированных дуплексов с р65 субьединицей. Обнаружена зависимость между значениями констант диссоциации ДНК-белковых комплексов и «контекстом» кВ-участка (его последовательностью, местоположением Tgl и микроокружением модифицированного нуклеозида).

Полученная в данной работе информация о влиянии окислительного повреждения тимидина на термодинамические свойства двойной спирали, ее структуру и взаимодействие с ДНК-узнающими белками может быть использована при моделировании протекания различных клеточных процессов в экстремальных условиях.

Возможности химического синтеза модифицированных фрагментов ДНК, содержащих модифицированный нуклеозид в заданном положении без ограничения количества включений, открывают перспективы для создания адекватных моделей НК-белковых комплексов, формирующихся и функционирующих в клетке.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российском и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на конференции «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, апрель 2009 г.), IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.), XlXth International symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Тулуза, Франция, апрель 2007 г.)

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 58 рисунками, 4 схемами, 19 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 160 цитированных работ. Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 09-04-0315, 10-04-01578), РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых» (грант 08-04-91974 ННИОМ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с включениями ти м и д и н гл и ко л я

Синтезирована серия 19-31-звенных олигонуклеотидов, содержащих один или два остатка Т8'. Для введения модификации был использован коммерческий модифицированый амидофосфит (Glen Research, США) (рис. 1). Модифицированные Т8'-содержащие олигонуклеотиды получали на автоматическом ген-синтезаторе по стандартному регламенту амидофосфитного синтеза. Время присоединения модифицированного производного было увеличено до 5 мин. Гидроксильные функции при С5- и Сб-атомах блокированы трет-бутилдиметилсилильными (TBDMS)

защитными группами. Учитывая возможность разрушения модифицированного звена в концентрированном растворе аммиака при нагревании, в олигонуклеотидном синтезе были использованы З'-амидофосфитные производные дезоксирибонуклеозидов с лабильными защитными группами гетероциклических оснований. Для удаления защитных групп и отщепления олигонуклеотидного материала от полимерного носителя его обрабатывали концентрированным раствором аммиака в течение 2 ч при комнатной температуре. После удаления ТЕШМЭ-групп (трштиламин тригидрофторид, 40°С, 18 ч) олигонуклеотиды подвергали гель-фильтрации.

Рис. 1. Строение амидофосфитного производного Т8' и его i/uc-(5R, 6S)-изомера.

А

Известно, что при деблокировании Т8'-содержащих олигомеров (аммиачная обработка) и далее при хранении олигонуклеотидов в водно-буферных растворах происходит эпимеризация при Сб-атоме Т8'. Таким образом, в растворе присутствуют оба изомера - цис-(5К, 6S) и транс-(5К, 6R), но преобладающим является (5R, 6S)-эпимер. Выделение чистого изомера не представляется возможным, поэтому в данной работе использовали смесь 511-эпимеров. Очистку и выделение модифицированных олигонуклеотидов проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину. Структуру модифицированных олигонуклеотидов подтверждали методом масс-спектрометрии. Последовательности полученных в работе тимидингликольсодержащих фрагментов ДНК представлены в табл. 1.

2. Влияние остатка тимидингликоля на устойчивость олигонуклеотидов к действию фосфодиэстеразы змеиного яда

Изучена кинетика гидролиза фосфодиэстеразой из яда гремучника ромбического (ФДЭ, Sigma, США) 20- и 31-звенных олигонуклеотидов (5-GCTGCCACCCTglGGGTCTAAC-3' и 5'-ATCAAAACAGGACAAATTGTglCCTAAAACC-АА-3') в сравнении с ^модифицированными аналогами. 32Р-меченные олигонуклеотиды инкубировали с раствором ФДЭ при 37°С в течение 1-20 мин. Реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 20%-ном ПААГ с 7 М мочевиной, строили кинетические кривые и определяли начальные скорости гидролиза олигонуклеотидов (рис. 2). Оказалось, что введение поврежденного основания в олигонуклеотидную цепь повышает её устойчивость к действию ФДЭ. Начальная

тТ^

DMTrO—| | |

И

скорость гидролиза этим ферментом модифицированных олигонуклеотидов примерно в 1,5 раза ниже, чем ^модифицированных аналогов.

Рис. 2. Кинетические кривые гидролиза 20-звенных модифицированного (кривая 1) и немодифицированного (кривая 2) олигонуклеотидов ФДЭ.

10 12 14 16 18 20

Время, мин

3. Физико-химические свойства ДНК-дуплексов, содержащих тимидингликоль 3.1. Зависимость устойчивости дуплексов от температуры

Методом УФ-спектроскопии изучена термическая устойчивость ДНК-дуплексов I-XV, сформированных из олигонуклеотидов, содержащих один или два остатка Т8', и комплементарных им матриц (табл. 1). Определяли зависимость оптического поглощения исследуемого образца от температуры в буфере А: 10 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2.

Введение одного остатка Tgl в 19-звенный ДНК-дуплекс приводит к его дестабилизации на 8-13°С. Введение двух остатков Т8' в одну или разные цепи еще больше дестабилизирует двойную спираль (ср. дуплексы II и III и дуплексы VIII и IX). В случае дуплекса IX, в котором модифицированные остатки находятся в комплементарных цепях со сдвигом в 7 нуклеотидных пар друг относительно друга, наблюдается наибольший дестабилизирующий эффект (23°С). Очевидно, что понижение Т^ зависит от длины дуплекса и положения остатков Т8' относительно концов двойной спирали.

Эти же факторы влияют на кооперативность плавления ДНК-дуплексов и величину гипохромного эффекта. Как видно из табл. 1, величина гипохромного эффекта варьируется от 16 до 22%, при этом более низкие значения h характерны для ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные звенья. Введение одной или двух модификаций приводит к уширению кривых перехода «спираль-клубок», что отражает скрытую бифазность плавления таких ДНК-дуплексов.

Анализ методом ВЭЖХ в ион-парном варианте смесей после плавления показал, что деградации модифицированных олигонуклеотидов, входящих в состав Т8'-содержащих дуплексов, не происходит.

Таблица. 1. Некоторые физико-химические характеристики синтетических ДНК-дуплексов.

№ ДНК-дуплекс (5'-3'/3'-5') Т "С 111Л' ^ (±1) 1>260,% (±1) с„*, м'м* ДТ**, °с

I СТСАССТТССТСАСАТТТТ 6АСТ66ААС6АСТ6ТАААА 68 22 4,9 12

II СТСАССТд1ТССТСАСАТТТТ САСТССА-АСвАСТСТАААА 58 20 4,4 13

III СТСАССТ51Т6СТ6АСАТ5'ТТТ САСТббА-АССАСТСТА-ААА 55 19 3,7 16

IV ССТСССАСССТСССТСТААС С6АСС9Т66САСССАСАТТС 75 17 4,4 11

V ССТбССАСССТ'ЧИССГСТААС СбАСбСТСССА-СССАСАТТб 67 16 3,1 14

VI ТТбСТТТТАССАСААТТТСТССТСТТТТСАТ ААССААААТССТСГТАААСАбСАСААААСТА 72 22 2,6 9

VII ТТССТТТТАС6АСААТТТСТ51ССТСТТТТСАТ ААССААААТССТСГТАААСА-ССАСААААСТА 60 19 2,2 22

VIII ТТССТТТТАбСА-СААТТТСТССТСТТТТСАТ ААССААААТССТ'1СТТАААСАССАСААААСТА 62 19 2,1 21

IX ТТСбТТТТАССА-СААТТТСТ^ССТСТТТТбАТ ААССААААТССТд1СТТАААСА-ССАСААААСТА 49 16 2,1 23

X ССАССТСССАААСГССССТСТ САСССТТТСАССССАСАТС 70 17 1,6 11

XI ССАССТС66ААА6Т®'ССССТСТ САбССТТТСА-ССССАСАТС 62 68*** 16 1,6 18

XII ССАССТСССАААТТССССТСТ САСССТТТААССССАвАТС 68 22 1,4 12

XIII ССАССТСССАААТ,1ТССССТСТ САСССТТТА-АССССАСАТС 55 16 1,4 15

XIV ССАССТСССААТСТССССТСТ САСССТТАСАССССАСАТС 69 19 1,3 11

XV ССАССТСССААТ'^ТССССТСТ САСССТТА-САССССАСАТС 58 17 1,4 17

♦Со- концентрация ДНК-дуплекса.

♦♦ДТ- кооперативность перехода «спираль-клубок».

♦♦♦Верхнее и нижнее числа для соединения XI отвечают 1-й и 2-й ступеням на кривой его плавления.

Для выяснения влияния нуклеотидов, фланкирующих Т8''А-пару, на физико-химические свойства двойной спирали ДНК нами была охарактеризована термическая устойчивость трех пар модифицированных и немодифицированных дуплексов Х-ХУ. Все они имеют 17-звенную дуплексную часть. Показано, что наличие остатка Т8' в случае дуплексов XIII и XV несущественно сказывается на форме кривых плавления,

однако вызывает заметное уменьшение кооперативности плавления и сильную дестабилизацию двойной спирали (табл. 1). Максимальное различие в температурах плавления (13°С) наблюдается для дуплексов XII и XIII, в которых пара T'A или Т8'-А, соответственно, фланкирована парами А-Т и Т-А. Отметим, что дестабилизирующее влияние, вносимое остатком Т8' в G-C-окружении, минимально среди всех сравниваемых пар дуплексов и составляет ~ 7-8°С.

3.2. Характеристика структуры ДНК-дуплексов методом спектроскопии кругового

дихроизма

Влияние Т8' на структуру олигонуклеотидных дуплексов исследовали с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД). Изучены три семейства ДНК-дуплексов, различающихся длиной и содержанием G-C-nap: А-Т-богатые 31-звенные дуплексы VI-IX, 20-звенные дуплексы IV и V, содержащие 70% GC- пар, и ДНК-дуплексы X-XV, состоящие из 21-звенного и 19-звенного олигонуклеотидов, содержащие 53-59% G C-nap.

Спектры всех изученных ДНК-дуплексов имеют консервативный вид с положительным Коттон-эффектом при 260-280 нм, характерным для В-формы ДНК (рис. 3). Причем, кривые КД ДНК-дуплексов, принадлежащих к разным семействам, существенно различаются, демонстрируя характерные черты спектров А-Т и G-C-богатых ДНК (рис. 3,а и 3,6).

Наиболее интересны спектры КД третьей серии дуплексов. Когда окислительное повреждение фланкировано парами G C и C-G (дуплекс XI), наблюдается понижение амплитуды положительной и отрицательной полосы по сравнению с величинами, характерными для немодифицированного ДНК-дуплекса X (рис. 3,в). Аналогичный эффект наблюдался и для 31-звенных дуплексов VI-IX (рис. 3,а). Это, вероятно, связано с ослаблением «стэкинг»-взаимодействий в зоне модификации. В то же время, при замене остатка тимидина, окруженного парами А-Т и Т-А, на Т8' (дуплекс XIII) изменения в спектре КД носят более сложный характер: амплитуда положительной полосы существенно возрастает в случае модифицированного дуплекса, а точка нулевого перехода сдвигается в область более коротких длин волн на 8 нм. То есть степень влияния окислительных повреждений на спектры КД зависит также от того, насколько тимингликоль выведен из «стэкинг»-взаймодействия с соседними основаниями. Когда модифицированное основание окружено смешанными парами А-Т и G-C, различия спектров КД дуплексов XIV и XV, не содержащего и содержащего остаток Tgl, не такие существенные, как в случае дуплексов XII и XIII, в которых варьируемый остаток фланкирован парами А-Т, но сохраняют те же особенности: амплитуда положительной полосы выше для модифицированного дуплекса, чем для природного (данные не приведены).

Таким образом, замена тимидина на остаток Т8' приводит к существенным нарушениям локальной структуры двойной спирали. Причем, характер изменения вида спектра КД зависит от природы нуклеотидных пар (А-Т или G-C), фланкирующих модифицированный участок, и содержания G C-nap.

/„ нм л, нм

в Г

Рис. 3. Спектры кругового дихроизма ДНК-дуплексов в буфере А при 23°С. Сплошная линия соответствует немодифицированному дуплексу, пунктирная - модифицированному, а - 31-3венные А-Т-богатые ДНК-дуплексы У1-1Х (модифицированное основание окружено О С- и С О-парами); б -20-звенные вС-богатые ДНК-дуплексы IV и V (модифицированное основание окружено С О- и О С-парами); в - ДНК-дуплексы X и XI (модифицированное основание окружено О С- и С О-парами); г -ДНК-дуплексы XII и XIII (модифицированное основание окружено А Т- и ТА-парами).

Методом молекулярной динамики была рассчитана равновесная структура модифицированного ДНК-дуплекса XI, содержащего Т8'.* Пространственная структура центрального участка этого дуплекса представлена на рис. 4. Видно, что Т8' выпетливается в сторону большой бороздки, выводя из «стэкинг»-взаимодействия модифицированное основание.

"Работа проводилась совместно с аспиранткой Андреевой М.А. под руководством ст. преп. Головина A.B. (факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М.В. Ломоносова).

Рис. 4. Пространственная структура центрального участка ДНК-дуплекса XI, содержащего ТЕ'.

4. Взаимодействие тимидингликольсодержаших дуплексов с клеточными белками

Остаток Т8', включенный в ДНК-дуплекс, оказывает влияние на термодинамические свойства двойной спирали и на её структуру, и, как следствие, на узнавание ДНК белками. В работе изучено влияние окисления тимидина на функционирование ключевых клеточных белков, таких как эндонуклеазы рестрикции, метилтрансферазы, факторы транскрипции и ДНК-полимеразы.*

4.1. Эндонуклеазы рестрикции И-го типа

Эндонуклеазы рестрикции (R.) в присутствии ионов Mg2+ катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи в определенном положении каждой из цепей двутяжевой ДНК. Согласно базе данных REBASE двутяжевая последовательность нуклеотидов 5-CCWGG-3' (W = Т или А) представляет собой один из наиболее распространенных участков узнавания ферментов, входящих в системы рестрикции-модификации (Р-М). Эндонуклеазы с таким участком узнавания делятся на две группы в соответствии с местом гидролиза фосфодиэфирной связи в ДНК: 5'-CCJ,WGG-3' или 5'-|CCWGG-3' (стрелкой обозначено место гидролиза).

Было изучено влияние Т8' в центральной позиции участков узнавания R.MspR9I, R.Bmel390I, R.Mval, R.Bst2UI, R.BstSCI, R.SsoIl, R.PspóI на функционирование этих эндонуклеаз рестрикции. В качестве субстратов использовали дуплексы IV и V. содержащие радиоактивную метку на 5'-конце Т-, Т8'- или A-цепи (цепи названы по центральным нуклеотидным звеньям участка узнавания ферментов). Пробы анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Начальные скорости гидролиза отдельных цепей ДНК-дуплексов IV и V каждой из эндонуклеаз рестрикции приведены в табл. 2.

В том случае, когда Т8' непосредственно примыкал с З'-конца к месту гидролиза эндонуклеазы рестрикции (R.Mval, R.Bst2UI, R.MspR9I, R.Bmel3901), наблюдалось существенное замедление ее действия. Ингибирующий эффект Т8' проявлялся независимо от степени вырожденности центральной нуклеотидной пары участка

' Эндонуклеазы рестрикции MspR9I, Bst2UI, BstSCI и Psp61 - коммерческие препараты производства ООО «СибЭнзим» (Россия); Bmel390I и Mval - коммерческие препараты производства компании «Ферментас» (Литва). Эндонуклеаза рестрикции SsoII и метилтрансфераза SsoII предоставлены Карягиной A.C. (НИИЭМ РАМН) и Солониным A.C. (ИБФМ РАН). Субъединицы р50 и р65 фактора транскрипции NF-кВ выделены Молочковым Н.В. (ИТЭБ РАН).

узнавания (табл. 2). Отметим, что в условиях исчерпывающего гидролиза ^модифицированного дуплекса IV Н..В512Ш, степень расщепления немодифицированной цепи дуплекса V может достигать 70%. Однако гидролиз Т8'-цепи протекает с низкой эффективностью (не более 15%).

Таблица 2. Влияние тимидингликоля в участке узнавания на функционирование эндонуклеаз

рестрикции.

Эндонуклеаза Участок узнавания Температура Оти. начальная скорость гидролиза

рестрикции (5'—>3'/3'—>5') инкубации Дуплекс IV Дуплекс У

Т-цепь А-цепь Т'-цепь А-цепь

МврК91 37 100 100 1 3

Вте13901 Сб-ИтСС 37 100 100 1 5

Муа1 37 100 100 4 12

Вз12Ш 6С-КтСС 60 100 100 9 60

Вз15С1 ¿ССЫСС 55 100 100 70 100

ЗбоП ССЫССт 37 100 100 370 130

Рэр61 ¿ССЮСв СОТССт 55 100 100 110 85

I - место гидролиза; N = А, Т, в, С; \¥ = А, Т

В том случае, когда место гидролиза эндонуклеазы рестрикции (Я.ЬЫЗС!, Я.Рврб!) находилось перед участком узнавания, примыкая к нему с 5'-конца за два нуклеотида до места модификации, скорость гидролиза Те'-содержащего дуплекса V практически не изменялась по сравнению с дуплексом IV. Более того, введение Т8' в участок узнавания существенно ускоряет гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции БвоИ. Начальная скорость расщепления ТЕ'-содержащей цепи дуплекса V примерно в 4 раза выше, чем Т-цепи субстрата IV, а для немодифицированной А-цепи дуплекса V - в 1,5 раза выше по сравнению с этой же цепью дуплекса IV (табл. 2).

Увеличение эффективности расщепления дуплекса наблюдалось и ранее при замене остатка Т центральной пары участка узнавания Я&оП на ненуклеозидную вставку (в том числе структурный аналог апиримидинового сайта - производное тетрагидрофурана), введение неканонической ТТ-пары или гибридной пары ги-(1А {Виноградова и др., 1987; Громова и др., 1991; КиЬагеуа е/ а\., 1992). Известно, что конформационная подвижность ДНК-дуплексов, содержащих апиримидиновый участок, на 10-40% выше по сравнению с немодифицированными дуплексами и одноцепочечными ДНК (МагаМая е( а/., 1999). Учитывая экспериментальные данные, можно полагать, что ДНК-дуплексы, обладающие повышенной локальной гибкостью в участке узнавания, предпочтительней узнаются и гидролизуются Я^эоИ.

Разница, обнаруженная в поведении двух ферментов - Рэр61 и МБрЯ91, узнающих одну и ту же нуклеотидную последовательность, позволяет использовать их тандем для

тестирования присутствия Т§| в ДНК.

4.2. С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза ЗэоН

ДНК-метилтрансфераза ЗвоП (М.ЗвоП), второй компонент системы Р-М 8бо11, так же как и К.БзоП узнает в двутяжевой ДНК пентануклеотидную последовательность, полностью вырожденную по центральной нуклеотидной паре 5'-ССКОО-3'/3'-ООЫСС-5'. В присутствии кофактора реакции 8-аденозил-Ь-метионина (АёоМе!:) М.ЗэоП метилирует внутренние остатки С этого участка.

М^оИ - бифункциональный белок. ]Ч-Концевая область (1-71 аминокислотные остатки) обусловливает способность М.8зо11 выступать в роли фактора транскрипции и регулировать экспрессию собственного гена, а также гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции взоП. Регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию М.8зо11 с промоторной областью генов системы Р-М ЗэоП, в которой локализован регуляторный участок, представляющий собой 15-звенный инвертированный повтор: 5'-АССАСААТТТСТССТ-3' 3'-ТССТСТТАААСАССА-5'

В данной работе изучено влияние Т8' на взаимодействие М.БзоИ с обоими участками узнавания - метилируемым и регуляторным.

4.2.1. Взаимодействие с дуплексами, содержащими остаток тимидингликоля в

участке метилирования

Для характеристики сродства М.ЗбоП к участку метилирования использовали 20-звенные синтетические субстраты IV и V. Комплексообразование М.ЗвоИ с ДНК-лигандами IV и V изучали в присутствии поли(с!1-с1С), обеспечивающего специфическое связывание, и аналога кофактора 8-аденозил-Ь-гомоцистеина (АёоНсу). За образованием комплексов следили методом «торможения» в неденатурирующем 7%-ном ПААГ. Для комплексов М^воП с дуплексами IV и V были рассчитаны константы диссоциации по методу Скэтчарда (рис. 5).

1

4 5 6 7 8 9 К

ДНК-белковый

комплекс

-ДНК

1,4

1.2 — 1

й: о,8 и 0,60:4 0,20

10

20 |ЕЬ|

40

Рис. 5. а - Анализ комплексообразования МБвоП (концентрация 0,92 мкМ) с ДНК-дуплексом IV: 20 нМ (дорожка 1), 30 нМ (дорожка 2), 40 нМ (дорожка 3), 50 нМ (дорожка 4), 60 нМ (дорожка 5), 70 нМ (дорожки 6). 80 нМ (дорожка 7), 90 нМ (дорожка 8), 100 нМ (дорожка 9). К - Исходный ДНК-дуплекс, б - График зависимости доли ДНК-лмганда, связанного с М.БэоИ, от равновесной концентрации соответствующих ДНК-белковых комплексов с дуплексом IV.

Значения констант диссоциации комплексов М.ЗбоН с ДНК-лигандами отличаются примерно в три раза. МБвоП менее эффективно связывается с дуплексом V, содержащим Т8' (табл. 3).

Таблица 3. Взаимодействие ДНК-дуплексов с метилтрансферазой БзоП.

Днк- дуплекс Структура (5'->373'-»5')* К<1 комплекса с М.вэоП, нМ Отн. скорость метилирования М.ввоИ**

IV бСТбССАСССТОЗбТСТААС ССАСССТСССАСССАСАТТС 30 ±4 1,0

V ССТСССАСССТ51СССТСТААС ССАСССТбСвА-СССАСАТТС 86 ±7 0,18

*Выделен участок узнавания М.ЗвоП

"Данные соответствуют метилированию Т- или Тв'-цепи субстрата. Значения скорости метилирования для ДНК-дуплекса V приведены относительно скорости метилирования Т-цепи дуплекса IV.

Эффективность метилирования М.БзоП дуплексов IV и V, содержащих 32Р-метку в Т-цепи, оценивали по степени «защиты» субстрата от гидролиза Я^оП. Сначала ДНК-дуплекс IV или V инкубировали с метилтрансферазой в присутствии кофактора аденозил-Ь-метионина (АёоМе1). После инактивации фермента и медленного охлаждения реакционной смеси добавляли М§С12 и Я^оП. Я.ЗбоП не способна гидролизовать участок узнавания, если внутренний остаток С метилирован. В контрольном эксперименте дуплексы IV и V не модифицировали МТазой, но инкубировали с Я^воП. Полученные реакционные смеси анализировали методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 6).

Рис. 6. Анализ продуктов гидролиза ДНК-дуплексов IV и V (з2Р-метка в Тили Т8'-цепи) 11.85011. Дорожки 1 и 4 -исходные дуплексы IV и V; дорожки 2 и 5 - гидролиз дуплекса IV и V после обработки МБвоП; дорожки 3 и 6 -гидролиз неметилированных дуплексов IV и V. Концентрации: 0,35 мкМ дуплексов, 92 нМ М.ЗэоП, 4,8 мкМ -Я-БзоН. Условия метилирования - 37°С, 15 мин. Условия гидролиза - 37°С, 1 ч.

Нативный дуплекс IV после инкубации с М-БвоИ практически не расщепляется эндонуклеазой рестрикции, что свидетельствует о высокой эффективности его

Исходная ДНК

Продукты пиролиза

метилирования (90%). Инкубация дуплекса V, содержащего Т8', с М^оП почти не «защищает» его от гидролиза ферментом рестрикции (рис. 6). Следовательно, окисление тимидина в последовательности 5'-ССТОО-3' препятствует её метилированию (степень метилирования меньше 20%) С5-цитозиновой МТазой ЗэоП, несмотря на вырожденность участка узнавания этого фермента по центральной нуклеотидной паре. По-видимому, это связано с тем, что сродство М^оН к модифицированной последовательности ниже, чем к нативному участку узнавания.

4.2.2. Взаимодействие с дуплексами, содержащими остаток тимидингликоля в

регуляторном участке

Ранее было показано, что М.БбоП осуществляет регуляторную функцию, связываясь с участком ДНК. М^оП блокирует доступ РНК-полимеразы к промотору собственного гена и практически полностью ингибирует его транскрипцию. При этом происходит активация транскрипции гена Я.ЗзоП с более слабым промотором. Предположительно первые остатки Т из двух симметрично расположенных блоков 5'-ТОТ-З1 в инвертированном повторе промоторной области генов системы Р-М ЭзоП важны для функционирования М^оН как фактора транскрипции (Karyagina е1 а1., 1997; Karyagina е? а/., 2003). Для проверки этой гипотезы были сконструированы модифицированные дуплексы УП-1Х - структурные аналоги ДНК-дуплекса VI с регуляторным участком. Они содержат один или два остатка Т8' в заданной позиции олигонуклеотидной цепи (табл. 4).

Таблица 4. Комплексообразование тимидингликольсодержащих ДНК-дуплексов и их немодифицированного аналога с метилтрансферазой БэсН.

№ ДНК-дуплекс* (5'—>-3'/3'^.5') К,! комплекса дуплекса с \I.SsoII, нМ

VI ТТССТТТТА5^СДАТТТЙТССТСТТТТСАТ ААССААААТССТБТТАААСАС(ЗАСААААСТА 197±20

VII ТТСЕТТТТАСОАСААТТТСТд1ССТСТТТТСАТ ААССААААТССТЕТТАААСА-вйАСААААСТА 374±32

VIII ттеБТТТТДесД_с^тттетсстсттттБАТ ААССААААТССХ"СТТАААСАССАСААААСТА 363±25

IX ТТССТТТТАСЙА-СААТТТвТ51ССТСТТТТСАТ ААССААААТССТ'СТТАААСА-ССАСААААСТА >4000

♦Выделен регуляторный участок М^оП.

Комплексообразование М.ЗбоН с ДНК-лигандами УП-1Х изучали при 37°С в присутствии ро1у(с!1-с1С). Дуплекс VI использовали в качестве контроля. За образованием комплексов следили методом «торможения» в ПААГ в неденатурирующих условиях. Значения К^ комплексов М.ЭзоП с дуплексами,

рассчитанные методом Скэдчарда, приведены в табл. 4. Сродство M.SsoII к ДНК-лигандам, содержащим одну модификацию в одной из цепей регуляторного участка (дуплексы VII и VIII), примерно в 2 раза ниже, чем к немодифицированному дуплексу VI. Для ДНК-дуплекса IX, содержащего две модификации (по одной в каждой цепи), при 50-240-кратных избытках белка относительно ДНК комплекс M.SsoII не был зафиксирован. Очевидно, что окисление рассматриваемых остатков Tgl в регуляторном участке препятствует связыванию M.SsoII с ДНК и может привести к нарушению баланса между содержанием ЭР и МТазы в клетке и при определенных условиях к ее гибели.

4.3. Ядерный фактор транскрипции NF-kB

Фактор транскрипции NF-kB - основной индуктор воспалительных реакций и негативный регулятор клеточной гибели. Он способствует прогрессированию онкологических заболеваний, различных патологий и воспалительных процессов. Изучение влияния различных повреждений в ДНК на связывание этого фактора с нуклеиновой кислотой чрезвычайно важно для понимания последствий, связанных с изменением NF-кВ-индуцируемой экспрессии соответствующих генов.

Объектами исследования в данной работе являлись отдельные субъединицы р50 и р65 фактора транскрипции NF-kB человека. Каждая из субьединиц содержала на N-конце дополнительный белок - глутатион-8-трансферазу (GST). Наличие GST позволяет выделять практически гомогенные белки p50-GST и p65-GST из культуры клеток Е. coli в одну стадию методом аффинной хроматографии. Известно, что GST не влияет существенно на способность субъединиц р50 и р65 связываться с ДНК (Ташка et al, 1994).

Для выяснения влияния Т8' на ДНК-связывающую активность субьединиц р50 и р65 были синтезированы ДНК-дуплексы X-XV (табл. 1), содержащие участок узнавания фактора транскрипции NF-kB. Остаток Т8' вводили в одну из «вырожденных» позиций кВ-участка, которые заведомо не определяют специфичность белково-нуклеинового взаимодействия, а влияют только на сродство к фактору транскрипции: 5'-GGRRNNYCCC-3V3'-CCYYNNRGGG-5' (R = A, G; Y = Т, С; N = A, G, Т, С). Методом «торможения в геле» показано, что модифицированные и немодифицированные дуплексы X-XV формируют комплексы с белком. Как в случае p50-GST, так и в случае p65-GST, наблюдали преимущественно образование двух комплексов К1 и К2, различающихся подвижностью в ПААГ в неденатурирующих условиях (рис. 7).

Для доказательства специфичной природы комплексов К1 и К2 в качестве контроля был использован 17-звенный ДНК-дуплекс XVI, не содержащий кВ-участок:

5'- TCAGCACCCAGGGTGCC- 3' 3'-AGTCGTGGGTCCCACGG-5' (дуплекс XVI)

Показано, что в одних и тех же условиях белки p50-GST и p65-GST взаимодействуют с дуплексом X, содержащим участок узнавания фактора, и

практически не формируют комплексов с дуплексом XVI (выход комплексов менее 1%) (рис. 7).

6 7 8 9 10И12

ДНК-белковые К 1 комплексы К2-»

ДНК-

Рис. 7. Анализ комплексообразования P50-GST с ДНК-дуплексом X, содержащим участок узнавания фактора транскрипции NF-кВ (а), и с ДНК-дуплексом XVI без кВ-участка (б) в отсутствие поли((И-с1С). Радиоавтограф 7%-го ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях. Концентрация p50-GST в реакционной смеси составляла 1,9 мкМ (в расчете на мономер), концентрация ДНК-дуплексов - 40, 80, 120, 160, 200 нМ (дорожки 2-6 и 812, соответственно). Дорожки 1 и 7 -исходные ДНК-дуплексы. Условия инкубации'. 30 мин, 25°С.

Исследовано взаимодействие 32Р-меченного дуплекса X с р50-08Т в присутствии возрастающих концентраций немодифицированных ДНК-дуплексов XII и XVI. Как видно из рис. 8, взаимодействие дуплекса X с белком ингибируется избытком дуплекса XII с кВ-участком. Очевидно, происходит вытеснение дуплекса X из центра связывания р50-08Т, что снижает эффективность образования каждого из двух ДНК-белковых комплексов К1 и К2. В присутствии дуплекса XVI без кВ-участка наблюдается незначительное снижение эффективности связывания, которое может быть обусловлено небольшим сродством р50-С8Т к ДНК случайной последовательности. Аналогичные результаты были получены для субъединицы р65 фактора транскрипции №-кВ.

Рис. 8. Зависимость выхода ДНК-белковых комплексов К1 (сплошные линии) и К2 (пунктирные линии) с участием р50-С8Т от отношения концентраций дуплексов XII (кривые 1, 2) или XVI (кривые 3, 4) и дуплекса X. Концентрация дуплекса X - 50 нМ, концентрация р50-С8Т в расчете на мономер - 3,8 мкМ.

О 10 20 30 40

Отношение концентраций «конкурепт»/лнганд

Для определения стехиометрии комплексов субъединиц р50 и р65 с дуплексом

XII использовали метод «торможения» в геле в неденатурирующих условиях. Анализировали подвижность нативных белков - маркеров молекулярной массы в гелях с различным содержанием акриламида. По полученным данным строили калибровочный график в логарифмических координатах, по которому оценивали молекулярную массу ДНК-белковых комплексов К1 и К2 (рис. 9). Установлено, что комплекс с большей подвижностью в геле (К2) представляет собой димер белка : дуплекс = 1 : 1, а комплекс с меньшей подвижностью (К1) - тетрамер белка, взаимодействующий с двумя ДНК-лигандами (табл. 5).

1.4 1,21

£ 0,84

с? о/>-

0,4-

0,2-

уреаза, димер,

2 дуплекса XII +тетрамер р(>5 2 дуплекса XII + тетрамер р5(^

уреаза, мономер БСА, димер ■ VI ^шекс XII+димер рб5

БСА, мономер. / 1 ^Ш1СКС Ш + дамеР Р50

овальбумии

1 карбоангидраза ■ а-лактальбумин

4, 5

18(М„)

5,5

Рис 9. Определение молекулярной массы ДНК-белковых комплексов по калибровочному графику. • - Белки-маркеры, ■ - комплексы с р50-08Т; А - комплексы с р65-ОБТ; Ь| - наклон линейной аппроксимации зависимости относительной подвижности комплексов от концентрации геля, М1У - молекулярная масса.

Таблица 5. Стехиометрия комплексов белков р50-С5Т и р65-08Т с ДНК-дуплексом XII.

Комплекс м„ мономера белка, кДа ми дуплекса, кДа мя комплекса (эксперим.), кДа Стехиометрия комплекса, М„ расчет.

р5(М38Т с дуплексом XII, К1 70,1 6,3 302 тетрамер-2 дуплекса, 305

р50-05Т с дуплексом XII, К2 70,1 6,3 152 димердуплекс, 152,5

р65-05Т с дуплексом XII, К1 61,8 6,3 282 тетрамер-2 дуплекса, 271,8

р65<55Т с дуплексом XII, К2 61,8 6,3 136,8 димердуплекс, 135,9

Определены константы диссоциации белково-нуклеиновых комплексов,

образуемых дуплексами Х-ХУ с каждой из субъединиц фактора транскрипции №-кВ (табл. 6). Ка комплексов р50-08Т с ^модифицированными дуплексами X, XII и XIV имеют сопоставимые значения. Следовательно, замена одного пуринового нуклеозида на пиримидиновый (тимидин) в «вырожденной» позиции кВ-участка не влияет на сродство р50 субъединицы к ДНК. Для модифицированных дуплексов XI, XIII и XV К а комплекса с рэО-ОЭТ зависит от положения Т8' в кВ-участке. Замена Т на Т8' в 7-ом (дуплекс XI) или в 5-ом положениях (дуплекс XV) практически не влияет на сродство фактора к ДНК-лиганду. Введение модификации в 6-ое положение кВ-участка приводит к двукратному ухудшению связывания белка с дуплексом XIII по сравнению с немодифицированным дуплексом XII. Отметим, что в этом случае модифицированный нуклеозид находится в окружении А-Т-пар, что приводит к более выраженным локальным нарушениям в структуре ДНК.

Таблица 6. Значения констант диссоциации комплексов субъединиц р50 и р65 фактора транскрипции Ж-кВ с тимидингликольсодержащими ДНК-дуплексами и их немодифицированными аналогами.

№ ДНК-дуплекс К(|, н\1

р50-ДНК р65-ДНК

X 5'-ССАССТСЕОАААСТССССТСТ-З' 3'-САеССТТТСАСЕССАСАТС-5' 140±29 243±19

XI 5' -ССАССТСБСАААСТ^ССССТСТ-З' 3' -СА6ССТТТСА-ССаСАСАТС-5' 100±20 1036±262

XII 5'-ССАССТСССАААТТССССТСТ-З' 3'-СА6ССТТТААОСССАСАТ6-5' 98±14 54±5

XIII 5'-ССАССТСбСААДТ^ГССССТСТ-З' 3' -СА6ССТТ£А-АССССА6АТС-5' 262±33 169±20

XIV 5' -ССАССТСССААТОГССССТСТ-З' 3' -САСССТТАСАССЕ6АСАТС-5' 107±15 104±7

XV 5' -ССАССТСССААТ'"СТССССТСТ-3' 3' — СА6 СС Т 2А-САССССАС АТС - 5 ' 79±12 437±26

Совсем другая ситуация наблюдается при взаимодействии с дуплексами Х-ХУ субъединицы р65 фактора транскрипции ЫР-кВ. Прежде всего, в отличие от рбО-ОЭТ, р65-05Т проявляет различное сродство к немодифицированным дуплексам. Наименее эффективно р65-08Т связывается с дуплексом X, содержащим ^-кВ-участок, наиболее эффективно - с дуплексом XII, кВ-участок которого сходен с кВ-участком Р-последовательности из промотора гена интерлейкина-4 человека (кВ-33). Введение Т8' в

любое из трех «вырожденных» положений участка узнавания фактора транскрипции NF-кВ в 3-5 раз ухудшает связывание белка р65 с ДНК (табл. 6). Причем чем хуже белок связывается с ^модифицированным субстратом, тем менее устойчив его комплекс с ДНК-дуплексом, несущим окислительное повреждение.

4.4 ДНК-полимеразы X и р

Система синтеза ДНК с поврежденной матрицы (translesion synthesis, TLS) - одна из основных систем, используемых клеткой при репликации поврежденной геномной ДНК. Исследование особенностей репликации с участием Т8'-содержащих фрагментов ДНК было проведено в лаборатории чл.-корр. РАН, проф. О.И. Лаврик (ИХБФМ СО РАН). Для моделирования синтеза ДНК с поврежденной матрицы в данной работе были сконструированы ДНК-дуплексы, в матричной цепи которых находился Т8' (табл. 7).

Изучали TLS-активность ДНК-полимераз X и р (pol X и pol Р) на ДНК-дуплексах XVII и XVIII с протяженными одноцепочечными участками матрицы, имитирующих интермедиаты синтеза лидирующей цепи ДНК, и на ДНК-дуплексах XIX-XXI с моно-, ди- или пентануклеотидными «брешами» с З'-ОН и 5'-фосфатной группами, имитирующих интермедиаты синтеза отстающей цепи ДНК. Показано, что dATP и dGTP являются предпочтительными субстратами для pol X при синтезе на матрице, содержащей Tgl, в то время как pol р не обладает определенной специфичностью при прохождении этого типа повреждений. Кроме того, pol X способна вести синтез ДНК непосредственно после встраивания корректного dAMP напротив тимидингликоля в ДНК-субстраты, содержащие протяженные 5'-одноцепочечные участки матрицы или пентануклеотидные «бреши».

Таблица. 7. ДНК-дуплексы с тимидингликолем - аналоги субстратов полимераз X и р.

№ ДНК-дуплекс

XVII 5'-GACTACATTTCATCTGGCTTGGGCTTCATCGTTGTCT5lCAGACCTGGTGGATACCG З'-GTCTGGACCACCTATGGC

XVIII 5'-GGCTTCATCGTTGTCTglCAGACCTGGTGGATACCG З'-GTCTGGACCACCTATGGC

XIX 5'-GGCTTCATCGTTGTCT5lCAGACCTGGTGGATACCG З'-CCGAAGTAGCAp GTCTGGACCACCTATGGC

XX 5'-GGCTTCATCGTTGTCT5lCAGACCTGGTGGATACCG З'-CCGAAGTAGCAACAp GTCTGGACCACCTATGGC

XXI 5'-GGCTTCATCGTTGTCT5lCAGACCTGGTGGATACCG 3'-ССGAAGTAGСAACAGp GTCTGGACCACCTATGGC

Исследовано влияние репликативных факторов RPA (репликативный белок А) и

PCNA (фактор процессивности репликативных ДНК-полимераз) человека на синтез ДНК на матрице с окислительным повреждением и в ДНК-дуплексах, содержащих «бреши». Впервые показано, что PCNA оказывает стимулирующее действие на TLS-активность pol к, в то время как RPA не проявляет специфического влияния на функционирование этого фермента. Синтез ДНК, катализируемый pol ß, как на поврежденной, так и на интактной матрице не зависит от присутствия обоих факторов.

Полученные результаты подтвердили предположение об общем негативном эффекте окислительных повреждений в ДНК на клеточные процессы, связанные с возможностью появления мутаций в ДНК в процессе матричного синтеза.

ВЫВОДЫ

1. С помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки тимидингликоля, показано влияние окислительного повреждения на термодинамические свойства двойной спирали, ее структуру и взаимодействие с ДНК-узнающими белками.

2. Осуществлен дизайн и синтез модифицированных фрагментов ДНК с одним или двумя остатками тимидингликоля в различных положениях олигонуклеотидной цепи.

3. Методами УФ- и спектроскопии кругового дихроизма показано, что окисление тимидина приводит к существенной дестабилизации двойной спирали и локальным нарушениям ее структуры. Степень влияния тимидингликоля на структуру и стабильность ДНК-дуплекса зависит от природы нуклеотидных пар, фланкирующих модифицированный участок.

4. Впервые показано, что эндонуклеазы рестрикции Н-го типа при взаимодействии с тимидингликольсодержащими ДНК-дуплексами могут служить инструментами для обнаружения окислительного повреждения в ДНК.

5. Впервые обнаружено, что наличие тимидингликоля в участке метилирования или регуляторном участке метилтрансферазы ЗбоИ приводит к нарушению связывания фермента с ДНК-лигандом и негативно влияет на осуществление его основной функции - метилирования ДНК.

6. Установлено, что эффективность связывания субъединиц р50 и р65 фактора транскрипции ОТ-кВ с модифицированными дуплексами зависит от положения тимидингликоля и его нуклеотидного окружения в кВ-участке.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Yang F., Romanova Е., Kubareva Е., Dolinnaya N., GajdoS V., Burenina О., Fedotova E., Hianik Т. , Thompson M., Oretskaya T. Detection of DNA damage: effect of thymidine glycol residues on the thermodynamic and interfacial acoustic properties of oligonucleotide duplexes. // Analyst (2009) 134. P. 41-51.

2. Федотова E.A., Ян Ф., Кубарева Е.А., Романова Е.А., Проценко А.С., Вирясов М.Б., Гианик Т., Орецкая Т.С. Синтез и свойства модифицированных ДНК-фрагментов с включениями тимидингликоля. // Биоорганическая химия (2008) 34. № 2. С. 236-244.

3. Belousova Е.А., Maga G., Yang F., Kubareva E.A., Romanova E.A., Lebedeva N.A., Oretskaya T.S., Lavrik O.I. DNA polymerases beta and lambda bypass thymine glycol in gapped DNA structures. // Biochemistry (2010) DOI: 10.1021/bi901792c; 27 April 2010.

4. Андреева M.A., Ян Ф. Анализ структуры и биологических свойств ДНК-дуплексов, содержащих остаток тимидингликоля. // Материалы XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ-2009». Секция Биоинженерия и биоинформация. С. 2.

5. Орецкая Т.С., Jle Тхи Хиен, Ян Ф., Федотова Е.А., Хомякова Е.А. Модифицированные олигонуклеотиды: химия и молекулярно-биологические исследования. // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, С. 99.

6. Romanova Е., Fedotova Е., Yang F., Kubareva Е., Gajos V., Barosik М., Hianik Т., Oretskaya Т. Chemical synthesis and properties of DNA fragments containing thymidine glycol residues. // Abstract book of XlXth International symposium on Bioeiectrochemistry and Bioenergetics, Toulouse, France, 1-4 April, 2007, P. 64.

Подписано в печать:

13.05.2010

Заказ № 3725 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДНК-ФРАГМЕНТОВ С ВКЛЮЧЕНИЯМИ ТИМИДИНГЛИКОЛЯ (Обзор литературы).

1.1. Характеристика тимидингликоля.

1.2. Синтез фрагментов ДНК, содержащих остатки тимидингликоля.

1.3. Влияние тимидингликоля на структуру ДНК-дуплекса.

1.4. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих тимидингликоль, с дистамицином А.

1.5. Репарация остатков ТБ' в составе ДНК.

1.6. Влияние тимидингликоля в составе ДНК на функционирование полимераз.

1.7. Трифосфаты тимидингликоля и дезоксиуридингликоля как субстраты ДНК-полимераз.

ГЛАВА II. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДНК-ДУПЛЕКСЫ С ВКЛЮЧЕНИЯМИ ТИМИДИНГЛИКОЛЯ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК-УЗНАЮЩИМИ БЕЛКАМИ (Обсуждение результатов).

11.1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с включениями тимидингликоля.

11.2. Влияние остатка тимидингликоля на устойчивость олигонуклеотидов к действию фосфодиэстеразы змеиного яда.

11.3. Физико-химические свойства ДНК-дуплексов, содержащих тимидингликоль.

11.3.1. Зависимость устойчивости ДНК-дуплексов от температуры.

11.3.2. Исследование свойств двуспиральных нуклеиновых кислот с помощью акустического метода.

11.3.3. Характеристика структуры ДНК-дуплексов методом спектроскопии кругового дихроизма.

11.3.4. Расчет равновесной структуры ДНК-дуплексов, содержащих остаток тимидингликоля, методом молекулярной динамики.

11.4. Взаимодействие тимидингликольсодержащих дуплексов с клеточными белками.

11.4.1. Эндонуклеазы рестрикции II-го типа.

11.4.2. С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII.

11.4.2.1. Взаимодействие с дуплексами, содержапщми остаток тимидингликоля в участке метилирования.

11.4.2.2. Взаимодействие с дуплексами, содержапщми остаток тимидингликоля в регуляторном участке.

11.4.3. Ядерный фактор транскрипции NF-kB.

11.4.4. ДНК-полимеразы X и р.

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

III. 1. Реактивы и материалы.

III .2. Приборы и методы.

III. 3. Общие методики.

ВЫВОДЫ.

ДНК в живых клетках непрерывно подвергается воздействию внешних факторов, таких, как ультрафиолетовый свет, ионизирующее облучение, агрессивные химические соединения. Во многих случаях в результате этих процессов возникают активные формы кислорода, которые атакуют ДНК, вызывая повреждения в углеводофосфатном остове или гетероциклических основаниях. Эти повреждения могут приводить к преждевременному старению организма, а также способствовать возникновению различных заболеваний, в том числе онкологических. Несмотря на наличие в клетке ферментов, направленных на удаление поврежденных нуклеозидов, полностью исключить влияние окислительных повреждений на функционирование клеточных белков невозможно. Если повреждение не репарируется до вхождения в репликативную вилку, оно способно блокировать ДНК-полимеразу и, таким образом, быть потенциально летальным. В случае, если повреждение не может существенно влиять на скорость репликации, оно, в зависимости от его способности к образованию неканонических пар, является потенциально мутагенным.

Одним из наиболее частых повреждений ДНК является окисление двойной связи тимидина с образованием 5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидина (тимидингликоля, Tgl).-Потеря ароматичности гетероциклическим основанием приводит к локальному нарушению двойной спирали ДНК и может влиять на важнейшие биологические процессы. Это обстоятельство обусловливает необходимость изучения влияния такого рода повреждений на вторичную структуру ДНК и взаимодействие с ДНК-узнающими белками. В недавних исследованиях методами спектроскопии ядерного магнитного разонанса (ЯМР) и рентгеноструктурного анализа (РСА) охарактеризованы свойства ДНК-дуплексов, содержащих Те', динамика и стабильность двойной спирали [1-3]. Показано, что эти параметры существенными образом зависят от первичной структуры ДНК. В связи с этим, актуальным является исследование структурных и биологических последствий окисления тимидина на ДНК-моделях, в которых варьируется нуклеотидный контекст, окружающий модифицированный остаток. Важными задачами остаются разработка методов обнаружения остатка ТБ' в составе фрагментов ДНК, изучение влияния модифицированного нуклеозида на скорость формирования дуплексов, а также его роли в узнавании при формировании белково-нуклеиновых комплексов.

На сегодняшний день накоплено много свидетельств того, что окисление тимидина имеет значительные последствия для функционирования клетки. В большинстве случаев удается наблюдать лишь конец цепи событий, первопричиной которых является появление единичного повреждения в ДНК. В последнее время предпринимаются попытки проследить реакцию отдельных клеточных ферментов на то или иное повреждение нуклеиновой кислоты. Так, широко изучается эффективность и специфичность действия ферментов репарации и различных полимераз в ответ на появление Те' в матричной цепи ДНК или в пуле нуклеозидтрифосфатов [3-6]. Вместе с тем, остается неизученным влияние тимидингликоля на функционирование ряда важнейших белков, оперирующих на ДНК, например, таких как ферменты рестрикции-модификации. Отсутствуют данные о взаимодействии Т8'-содержащих ДНК с факторами транскрипции.

Прогресс в химическом синтезе олигонуклеотидов дает возможность встроить специфические повреждения в заранее определенную позицию нуклеотидной последовательности, получить высоко чистые препараты ДНК в больших количествах, что особенно важно для их физико-химических и структурно-функциональных исследований.

Цель работы заключалась в оценке влияния тимидингликоля — окислительного повреждения ДНК, на физико-химические свойства ДНК-дуплексов и их взаимодействие с рядом ДНК-узнающих белков в зависимости от числа модифицированных звеньев в двойной спирали и природы нуклеотидных пар, фланкирующих поврежденное звено. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с сайт-направленными включениями тимиди нгли коля.

2. Изучение влияния остатков тимидингликоля на структуру двойной спирали и термическую устойчивость модифицированных ДНК-дуплексов.

3. Анализ взаимодействия ДНК-узнающих белков разных классов: фосфодиэстераз, эндонуклеаз рестрикции, ДНК-метилтрансфераз, фактора транскрипции NF-кВ, репликативных ДНК-полимераз Р и X, с олигонуклеотидными дуплексами, содержащими в заданном положении участка узнавания/связывания остатки тимидингликоля; изучение влияния потери ароматичности гетероциклическим основанием на функционирование указанных белков.

В представленной работе с помощью синтетических ДНК-дуплексов, содержащих остатки тимидингликоля, охарактеризовано влияние окислительного повреждения на термодинамические свойства двойной спирали, ее структуру и взаимодействие с ДНК-узнающими белками. Осуществлен дизайн и синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих один или несколько остатков тимидингликоля в различных положениях олигонуклеотидной цепи. Использование УФ-спектроскопии и метода кругового дихроизма позволило продемонстрировать локальные нарушения двойной спирали в Т8'-содержащих дуплексах и зависимость глубины этих нарушений от нуклеотидного окружения модифицированного нуклеотида. В целом проведенное в настоящей работе исследование расширяет накопленные знания о роли окислительных повреждений генома в биологических процессах.

выводы

1. С помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки тимидингликоля, показано влияние окислительного повреждения на термодинамические свойства двойной спирали, ее структуру и взаимодействие с ДНК-узнающими белками.

2. Осуществлен дизайн и синтез модифицированных фрагментов ДНК с одним или двумя остатками тимидингликоля в различных положениях олигонуклеотидной цепи.

3. Методами УФ- и спектроскопии кругового дихроизма показано, что окисление тимидина приводит к существенной дестабилизации двойной спирали и локальным нарушениям ее структуры. Степень влияния тимидингликоля на структуру и стабильность ДНК-дуплекса зависит от природы нуклеотидных пар, фланкирующих модифицированный участок.

4. Впервые показано, что эндонуклеазы рестрикции Н-го типа при взаимодействии с тимидингликольсодержащими ДНК-дуплексами могут служить инструментами для обнаружения окислительного повреждения в ДНК.

5. Впервые обнаружено, что наличие тимидингликоля в участке метилирования или регуляторном участке метилтрансферазы SsoII приводит к нарушению связывания фермента с ДНК-лигандом и негативно влияет на осуществление его основной функции - метилирования ДНК.

6. Установлено, что эффективность связывания субъединиц р50 и р65 фактора транскрипции NF-кВ с модифицированными дуплексами зависит от положения тимидингликоля и его нуклеотидного окружения в кВ-участке.

1. Kung Н.С., Bolton Р.Н. Structure of a duplex DNA containing a thymine glycol residue in solution. //J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 9227-9236.

2. Brown K.L., Adams Т., Jasti VP., Basu A.K., Stone M.P. Interconversion of the c«*-5R, 6S- and rram--5R,6R-thymine glycol lesions in duplex DNA. // J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 11701-11710.

3. Aller P., Rould M.A., Hogg M., Wallace S.S., Doublie S. A structural rationale for stalling of a replicative DNA polymerase at the most common oxidative thymine lesion, thymine glycol. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. N 3. P. 814-818.

4. Wang Y. HPLC isolation and mass spectrometric characterization of two isomers of thymine glycols in oligodeoxynucleotides. // Chem. Res. Toxicol. 2002. V. 15. P. 671-676.

5. Purmal A.A., Bond J.P., Lyons B.A., Kow Y.W., Wallace S.S. Uracil glycol deoxynucleoside triphosphate is a better substrate for DNA polymerase I Klenow Fragment than thymine glycol deoxynucleoside triphosphate. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 330-338.

6. Adelman R., Saul R.L., Ames B.N. Oxidative damage to DNA: relation to species metabolic rate and life span. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 85. P. 2706-2708.

7. Frenkel K., Goldstein M.S., Teebor G.W. Identification of the с «-thymine glycol moiety in chemically oxidized and gamma-irradiated deoxyribonucleic acid by high-pressure liquid chromatography analysis. //Biochemistry. 1981. V. 20. P. 7566-7571.

8. Teebor G., Cummings A., Frenkel K„ Shaw A., Voituriez L., Cadet J. Quantitative measurement of the diastereoisomers of cis thymidine glycol in gamma-irradiated DNA. // Free Radic. Res. Commun. 1987. V. 2. P. 303-309.

9. Zuo S., Boorstein R.J., Teebor G.W. Oxidative damage to 5-methylcytosine in DNA. // Nucl. Acids Res. 1995. V.23. P. 3239-3243.

10. Pfeifer G.P. p53 mutational spectra and the role of methylated CpG sequences. // Mutat. Res. 2000. V. 450. P. 155-166.

11. Frenkel K„ Goldstein M.S., Duker N.J., Teebor G.W. Identification of the с «-thymine glycol moiety in oxidized deoxyribonucleic acid. // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 750-754.

12. Ide #., Kow Y.W., Wallace S.S. Thymine glycols and urea residues in M13 DNA constitute replicative blocks in vitro. II Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 8035-8052.

13. Ide H., Melamede R.J., Wallace S.S. Synthesis of dihydrothymidine and thymidine glycol 5'-triphosphates and their ability to serve as substrates for Escherichia coli DNA polymerase I. // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 964-969.

14. Clark J.M., Beardsley G.P. Functional effects of с/л-thy mine glycol lesions on DNA synthesis in vitro. // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5398-5403.

15. Hayes R.C., LeClerc J.E. Sequence dependence for bypass of thymine glycols in DNA by DNA polymerase I. //Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P. 1045-1061.

16. Hatahet Z., Purmal A.A., Wallace S.S. A novel method for site specific introduction of single model oxidative DNA lesion into oligodeoxyribonucleotides. // Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 1563-1568.

17. Kao J.Y., Goljer /., Phan T.A., Bolton P.H. Characterization of the effects of a thymine glycol residue on the structure, dynamics and stability of duplex DNA by NMR. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 17787-17793.

18. В as и A.K., Loechler E.L., Leadon S.A., Essigmann J.M. Genetic effects of thymine glycol: site-specific mutagenesis and molecular modeling studies. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 7677-7681.

19. Tornaletti S., Maeda L.S., Lloyd D.R., Reines D., Hanawalt P.C. Effect of thymine glycol on transcription longation by T7 RNA polymerase and mammalian RNA polymerase II. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 45367-45371.

20. Miller H., Fermandes A.S., Zaika E., McTigue M.M., Torres M.C., Wente M., Iden C.R., Grollman A.P. Stereoselective excision of thymine glycol from oxidatively damaged DNA. // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32. P. 338-345.

21. Iwai S. Synthesis of a thymine glycol building block and its incorporation into oligonucleotides. //Nucl. Acids Symp. Ser. 2000. V. 44. P. 121-122.

22. Iwai S. Synthesis of thymine glycol containing oligonucleotides from a building block with the oxidized base. //Angewandte Chem. 2000. V. 39. P. 3874-3876.

23. Iwai S. Synthesis and thermodynamic studies of oligonucleotides containing the two isomers of thymine glycol. // Eur. J. Org. Chem. 2001. V. 7. P. 4343-4351.

24. Doi Y., Hitomi K., Tainer J.A., Iwai S. Synthesis of oligonucleotides containing 2'-fluorinated thymidine glycol as mechanism-based inhibitors of endonuclease III. // Nucl. Acids Symp. Ser. 2005. V. 49. P. 195-196.

25. Branco L.C., Afonso C.A.M. Ionic liquids as a convenient new medium for the catalytic asymmetric dihydroxylation of olefins using a recoverable and reusable osmium/ligand. // J. Org. Chem. 2004. V. 69. P. 4381-4389.

26. Wang Yu., Wang Yi. Synthesis and thermodynamic studies of oligodeoxynucleotides containing tandem lesions of thymidine glycol and 8-oxo-2'-deoxyguanosine. // Chem. Res. Toxicol. 2006. V. 19. P. 837-843.

27. Gasparutto D., Gognet S., Roussel S., Cadet J. Synthesis of a convenient thymidine glycol phosphoramidite monomer and its site-specific incorporation into DNA fragments. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2005. V. 24. P. 1831-1842.

28. Brown K.L., Basu A.K., Stone M.P. The cis-(5R, 6S)-thymine glycol lesion occupies the wobble position when mismatched with deoxyguanosine in DNA. // Biochemistry. 2009. V. 48. P. 9722-9733.

29. Haranczyk M„ Lupica G., Dabkowska I., Gutowski M. Cylindrical projection of electrostatic potential and image analysis tools for damaged DNA: the substitution of thymine with thymine glycol. // J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 2198-2206.

30. Clark J.M., Pattabiraman N., Jarvis W., Beardsley G.P. Modeling and molecular mechanical studies of the c/s-thymine glycol radiation damage lesion in DNA. // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 5404-5409.

31. Miaskiewicz JC, Miller J., Ornstein R., Osman R. Molecular dynamics simulations of the effects of ring-saturated thymine lesions on DNA structure. // Biopolymers. 1995. V. 35. P. 113-124.

32. Evans J., Maccabee M., Hatahet Z., Courcelle J., Bockrath R., Ide II., Wallace S. Thymine ring saturation and fragmentation products: lesion bypass, misinsertion and implications for mutagenesis. // Mutat. Res. 1993. V. 299. P. 147-156.

33. Katafuchi A., Nakano Т., Masaoka A., Terato H., Iwai S., Hanaoka E, Ide H. Differential specificity of human and Escherichia coli endonuclease ///and VIII homologues for oxidative base lesions. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 14464-14471.

34. McTigue M.M., Rieger R.A., Rosenquist T.A., Iden C.R., De Los Santos C.R. Stereoselective excision of thymine glycol lesions by mammalian cell extracts. // DNA Repair. 2004. V. 3. P. 313-322.

35. Haranczyk M., Gutowski M. Differences in electrostatic potential around DNA fragments containing guanine and 8-oxo-guanine. // Theor. Chem. Acc. 2007. V. 117. P. 291-296.

36. Haranczyk M„ Miller J.H., Gutowski M. Differences in electrostatic potential around DNA fragments containing adenine and 8-oxo-adenine: An analysis based on regular cylindrical projection. // J. Mol. Graph. Model. 2007. V. 26. P. 282-289.

37. Ikeda S., Biswas Т., Roy R., Izumi Т., Boldogh I., Kurosky A., Sarker A., Seki S., Mitra S. Purification and characterization of human NTH1, a homo log of Escherichia coli endonuclease III. // Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 21585-21593.

38. Dodson M„ Michaels M., Lloyd R. Unified catalytic mechanism for DNA glycosylases. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 32709-32712.

39. Saito V., Uraki F., Nakajima S„ Asaeda A., Ono K., Kubo K„ Yamamoto K. Characterization of endonuclease III (nth) and endonuclease VIII (nei) mutants of Escherichia coli K-12. // J. Bacteriology. 1997. V. 179. P. 3783-3785.

40. Le X., Xing J., Lee J., Leadon S., Weinfeld M. Inducible repair of thymine glycol detected by an ultrasensitive assay for DNA damage. // Science. 1998. V. 280. P. 1066-1069.

41. Purmal A.A., Lampman G. W., Bond J.P., Hatahet Z., Wallace S.S. Enzymatic processing of uracil glycol, a major oxidative product of DNA cytosine. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 10026-10035.

42. Serre L., Pereira de Jesus K, Boiteux S., Zelwer C., Castaing B. Crystal structure of the Lactococcus lactis formamidopyrimidine-DNA glycosylase bound to an abasic site analogue-containing DNA. // EMBO J. 2002. V. 21. P. 2854-286.

43. Takata K, Shimizu Т., Iwai S., Wood R.D. Human DNA polymerase N (POLN) is a low fidelity enzyme capable of error-free bypass of 5S-thymine glycol. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 23445-23455.

44. Clark J.M., Beardsley G.P. Thymine glycol lesions terminate chain elongation by DNA polymerase I in vitro. II Nucl. Acids Res. 1986. V. 14. P. 737-749.

45. McNully J.M., Jerkovic В., Bolton P.H., Basu A.K. Replication inhibition and miscoding properties of DNA templates containing a site-specific cis-thymine glycol or urea residue. // Chem. Res. Toxicol. 1998. V. 11. P. 666-673.

46. Goodman M.F. Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes. // Ann. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 17-50.

47. Штыгашева A.A., Белоусова E.A., Речкунова Н.И. Лебедева Н.А., Лаврик О.И. ДНК-полимеразы Р и I как потенциальные участники системы синтеза через повреждение в процессе репликации отстающей цепи геномной ДНК. // Биохимия. 2008. Т. 73. С. 1504-1512.

48. Ohmori Н„ Friedberg Е.С., Fuchs PR., Goodman M.F, Hanaoka F, Hinkel T.A., Lawrence C.W., Livneh Z, Nohmin Т., Prakash S., Todo Т., Walker GC., Wang Z, Woodqate R. The Y-family of DNA polymerases. // Mol. Cell. 2001. V. 8. P. 7-8.

49. Красикова Ю.С., Белоусова E.A., Лебедева H.A., Пестряков П.Е., Лаврик О.И. Взаимодействие ДНК-полимеразы X и репликативного белка А в процессе синтеза ДНК через повреждение. //Биохимия. 2008. Т. 73. С. 1294-1299.

50. Garcia-Diaz M., Bebenek К., Kunkel Т.A., Blanco L. Identification of an intristic dRP lyase activity in human DNA polymerase X: a possible role in base excision repair. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 34659-34663.

51. Ma Y., Lu H., Tippin В., Goodman M.F., Shimazaki N., Koiwai O., Hsieh C.L., Schwarz K., Lieber M.R. A biochemically defined system for mammalian nonhomologous DNA end joining. // Mol. Cell. 2004. V. 16. P. 701-713.

52. Kusumoto R., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F. Translesion synthesis by human DNA polymerase ti across thymine glycol lesions. // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 6090-6099.

53. Tornaletti S., Hanawalt P.C. Effect of DNA lesions on transcription elongation. // Biochimie. 1999. V. 81. P. 139-146.

54. Mellon I., Bohr V.A., Smith C.A., Hanawalt P.C. Preferential DNA repair of an active gene in human cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 8878-8882.

55. Ferrin L.J., Mildvan A.S. Nuclear Overhauser effect studies of the conformations and binding site environments of deoxynucleoside triphosphate substrates bound to DNA polymerase I and its large fragment. // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 6904-6913.

56. Ferrin L.J., Mildvan A.S. NMR studies of conformations and interactions of substrates and ribonucleotide templates bound to the large fragment of DNA polymerase I. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 5131-5145.

57. Rouet P., Essigmann J.M. Possible role for thymine glycol in the selective inhibition of DNA synthesis on oxidized DNA templates. // Cancer Res. 1985. V. 45. P. 6113-6118.

58. Achey P.M., Wright C.F. Inducible repair of thymine ring saturation damage in OX174 DNA. // Radiat. Res. 1983. V. 93. P. 609-612.

59. Moran E„ Wallace S.S. The role of specific DNA base damages in the X-ray-induced inactivation of bacteriophage PM2 // Mutat. Res. 1985. V. 146. P. 229-241.

60. Laspia M.F., Wallace S.S. Excision repair of thymine glycols, urea residues, and apurinic sites in Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1988. V. 170. N 8. P. 3359-3366.

61. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 7915-7922.

62. Miaskiewicz K., Miller J., Osman R. Ab initio theoretical study of the structures of thymine glycol and dihydrothymine. // Int. J. Radiat. Biol. 1993. V. 63. P. 677-686.

63. Miller J., Miaskiewicz K, Osman R. Structure-function studies of DNA damage using ab initio quantum mechanics and molecular dynamics simulation. // Ann. NY Acad. Sci. 1994. V. 726. P. 71-91.

64. Bandaru V, Sunkara S., Wallace S.S., Bond J.R A novel human DNA glycosylase that removes oxidative DNA damage and is homologous to Escherichia coli endonuclease VIII. I I DNA Repair. 2002. V. 1. P. 517-529.

65. Hayes R.C., Petrullo L.A., Huang H.M., Wallace S.S., LeClerc J.E. Oxidative damage in DNA. Lack of mutagenicity by thymine glycol lesions. // J. Mol. Biol. 1988. V. 201. P. 239246.

66. Дханаджая Б.Л., Д'Сауза К.Дэ/с. M. Общее представление о нуклеазах из яда змей: ДНКаза, РНКазаи фосфодиэстераза. // Биохимия. 2010. Т. 75. с. 5-11

67. Tinoco I.J., Borer P.N., Dangler В., Levin M.D, Uhlenbeck O.C, Crothers D.M, Bralla J. Improved estimation of secondary structure in ribonucleic acids. // Nature New Biology. 1973. V. 14. P. 40-41.

68. Gray D.M., Tinoco I.J. A new approach to the study of sequence-dependent properties of polynucleotides. // Biopolymers. 1970. V. 9. P. 223-244.

69. DeVoe H, Tinoco I.Jr. The stability of helical polynucleotides: base contributions. // J. Mol. Biol. 1962. V. 4. P. 500-517.

70. Hillen W., Goodman T.C, Wells R.D. Circular dichroism spectra of twelve short DNA restriction fragments of known sequence: a comparison of measured and calculated spectra. // Nucl. Acids Res. 1981. V. 9. P. 3029-3045.

71. Bujnicki J.M. Understanding the evolution of restriction-modification systems: clues from sequence and structure comparisons. // Acta Biochim. Pol. 2001. V. 48. P. 935-967.

72. Gromova E.S., Shabarova Z.A. DNA-protein interactions: the use of synthetic oligo- and polynucleotides for studying single-stranded-DNA-binding proteins and restriction endonucleases. // Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 1990. V. 39. P. 1-47.

73. Gromova E.S., Kubareva E.A., Vinogradova M.N., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Peculiarities of recognition of CCA/TGG sequences in DNA by restriction endonucleases Mval and EcoRII. // J. Mol. Recognit. 1991. V. 4. P. 133-141.

74. Suri В., Nagaraja V., Bickle T.A. Bacterial DNA modification. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1984. V. 108. P. 1-9.

75. Hattman S. Variation of 6-methylaminopurine content in bacteriophage P22 deoxyribonucleic acid as a function of host specificity. // J. Virol. 1971. V. 7. P. 690-691.

76. Brockes J.P., Brown P.R., Murray К The deoxyribonucleic acid modification enzyme of bacteriophage PI: purification and properties. // Biochem. J. 1972. V. 127. P. 1-10.

77. Boyer H. W. Chow L. Т., Dugaiczyk A., Hedgpeth J., Goodman H.M. DNA substrate site for the EcoRII restriction endonuclease and modification methylase. // Nat. New Biol. 1973. V. 244. P. 40-43.

78. Janulaitis A., Klimasauskas S., Petrusyte M., Butkus V. Cytosine modification in DNA by Bcnl methylase yields N4-methylcytosine. // FEBS Lett. 1983. V. 161. P. 131-134.

79. Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. // Chembiochem. 2002. V. 3. P. 274-293.

80. Михайлов B.C. ДНК-полимеразы эукариот. // Молекулярн. биология. 1999. Т. 33. V. 4. С. 567-580.

81. Hayden M.S., Ghosh S. Shared principles in NF-kappaB signaling. // Cell. 2008. V. 132, P. 344-362.

82. Roberts, R. J., Vincze, Т., Posfai,J. and Macelis, D. REBASE-enzymes and genes for DNA restriction and modification. // Nucl. Acids Res. 2007. V. 35. D169-D270.

83. Громова E.C., Кубарева E.A., Елов A.A., Акатова Е.А., Никольская И.И., Шабарова З.А. Расщепление субстратов конкатемерного типа эндонуклеазами рестрикции Mval и SsoII. // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 552-559.

84. Виноградова М.Н., Громова Е.С., Упорова Т.М., Никольская ИИ, Шабарова З.А., Дебое С. С. Эндонуклеаза рестрикции SsoII: взаимодействие с модифицированные^^ субстратами. //Доклады АН СССР. 1987. Т. 295. С. 732-736.

85. Marathias КМ, Jerkovic В., Bolton Ph.H. Damage increases the flexibility of duplex DNA. // Nucl. Acids Res. 1999. V. 27. P. 1854-1858.

86. Hoehn S.T., Turner C.J., Stubbe J. Solution structure of an oligonucleotide containing ^ abasic site: evidence for an unusual deoxyribose conformation. // Nucl. Acids Res. 2001.29. P. 3413-3423.

87. Greger В., Kemper B. An apyrimidinic site kinks DNA and triggers incision by endonuclease VII of phage T4. //Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 4432-4438

88. Bochtler M., Szczepanowski R.H., Tamulaitis G., Grazulis S., Czapinska H„ Manakova J? Siksnys V. Nucleotide flips determine the specificity of the Ecll8kl restriction endonuclease // EMBO J. 2006. V. 25. P. 2219-2229.

89. Szczepanowski R. H„ Carpenter M. A., Czapinska H., Zaremba M., Tamulaitis G, Siksnys Js Bhagwat A. S., Bochtler M. Central base pair flipping and discrimination by PspGI. // Nucl Acids Res. 2008. V. 36. P. 6109-6117.

90. Tamulaitis G., Zaremba M., Szczepanowski R. H., Bochtler M., Siksnys V. How PspQj catalytic domain of EcoRII and Ecll8kl acquire specificities for different DNA targets I I Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. P. 6101-6108.

91. Zhou X.E., Wang Y., Reuter M„ Mucke M„ Kruger D.H., Meehan E.J., Chen L. Crystal structure of type II restriction endonuclease EcoRII reveals an autoinhibition mechanism by a novel effector-binding fold. // J. Mol. Biol. 2004. V. 335. P. 307-319.

92. Golovenko D., Manakova E., Tamulaitiene G., Grazulis S. Siksnys V. Structural mechanisms for the 5-CCWGG sequence recognition by the N- and C-terminal domains of EcoRII // Nucl Acids Res. 2009. V. 37. P. 6613-6624.

93. Пятраускене О.В., Кубарева Е.А., Громова Е.С. Спектрофотометрический метод изучения расщепления ДНК-дуплексов эндонуклеазами рестрикции. // Молекулярн биология. 1991. Т. 25. С. 1424-1426.

94. Никольская И.И., Карташова ИМ., Лопатина Н.Г. Ферменты новой системы хозяйской специфичности Sso47II. // Молекулярн. генетика. 1983. Т. 12. С. 5-10.

95. Кубарева Е.А., Вальтер И, Воробьева О.В., Разумихин М.В., Карягина А.С., Лау П.К.ЬС., Траутпер Т. Определение неметилируемого остатка дезоксицитидина в участке узнавания метилтрансфераз. // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 1676-1681.

96. Katyagina A.S., Lunin KG., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya /./. The SsoII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis. // Gene. 1995. V. 157. P. 93-96.

97. Карягина А.С. Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47. // Дисс. док. биол. наук. Москва. 1997. 331 С.

98. Воробьева О. В. С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsoII. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2004. 120 С.

99. Варфоломеев С.Д., Гуревич КГ. Биокинетика. // М.: ФАИР-ПРЕСС. 1999. С. 335-496.

100. Упорова Т.М., Карташова ИМ., Скрипкин Е.А., Лопарева Е, Никольская И. И. Эндонуклеазы рестрикции из Shigella sonnei 47. // Вопросы медицинской химии. 1985. Т. 31. С. 131-136.

101. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun М., Vdsil'ev S., Alekseev Ya., Kuzubov A., Kubareva E„ Karyagina A. DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. // Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 2659-2664.

102. Федотова E.A. Особенности регуляции генной экспрессии в системе рестрикции-модификации SsoII. // Дисс. канд. хим. наук. Москва. 2009. 138 С.

103. Protsenko A., Zakharova М., Nagornykh М., SoloninA., Severinov К. Transcription regulation of restriction-modification system Ecll8kl. //Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. P. 5322-5330.

104. Sen R., Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein NF-кВ by a posttranslational mechanism. // Cell. 1986. V. 47. P. 921-928.

105. Schmitz M.L., Mattioli I., Buss //., Kracht M. NF-кВ: a multifaceted transcription factor regulated at several levels. // Chembiochem. 2004. V. 5. P. 1348-1358.

106. Perkins N.D. The i?e//NF-KB family: friend and foe. // Trends Biochem. Sci. 2002. V. 25. P. 434-440.

107. Barnes P.J., Karin M. Nuclear factor-kappa B: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases. //N. Engl. J. Med. 1997. V. 336. P. 1066-1071.

108. Barkelt M., Gilmore T.D. Control of apoptosis by Rel/NF-кВ transcription factors. // Oncogene. 1999. V. 18. P. 6910-6924.

109. Sylla B.S., Temin H.M. Activation of oncogenicity of the c-rel proto-oncogene. // Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 4709-4716.

110. Gilmore T.D., Koedood M., Piffat K.A., White D.W. Rel/NF-кВЛкВ proteins and cancer. // Oncogene. 1996. V. 13. P. 1367-1378.

111. N angler W.E., Karin M. NF-kappaB and cancer-identifying targets and mechanisms. // Curr. Opin. Genet. Dev. 2008. V. 18. P. 19-26.

112. Wang C.Y., Cusack J.C. Jr., Liu R., Baldwin A.S. Jr. Control of inducible chemoresistance: enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-кВ. // Nat. Med. 1999. V. 5. P. 412-417.

113. Bentires-Ali M., Barbu V., Fillet M., Chariot A., Relic В., Jacobs N., GielenJ., Merville M.P., Bours V. NF-кВ transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 90-97.

114. Kretzschmar M., Meisterernsl M, Scheidereit S., Li G., Roeder R.G. Transcriptional regulation of the HIV-1 promoter by NF-кВ in vitro. II Genes Dev. 1992. V. 6. P. 761-774.

115. Saccani S., Pantano S., Natoli G. Modulation of NF-кВ activity by exchange of dimers. // Mol. Cell. 2003. V. 11. P. 1563-1574.

116. Smith D„ Johnson K.S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion with glutathione S-transferase. // Gene. 1988. V. 67. P. 31-40.

117. Захарова Л.Ю., Гуляева Л.Ф., Нархова О.В., Каледин В.И. Активность глютатион-S-трансферазы в печени мышей, различающихся по чувствительности к гепатогенному действию о-аминоазотолуола. // Бюл. эксп. биологии и медицины. 2000. Т. 129. С. 174175.

118. Chen F.E., Huang D.B., Chen Y.O., Ghosh G. Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-кВ bound to DNA //Nature. 1998. V. 391 P. 410-413

119. Chen Y.O., Ghosh S, Ghosh G. A novel DNA recognition mode by the NF-kappa В p65 homodimer. //Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 67-73.

120. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М.: Наука. 1985. С. 153-177.

121. Berhowitz В., Huang D.B., Chen-Park F.E., Sigler Р.В., Ghosh G. The X-ray crystal structure of the NF-kappa В p50.p65 heterodimer bound to the interferon beta-kappa В site. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 24694-24700.

122. Тимченко M.A. Исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействия р50 субъединицы NF-кВ с ДНК-дуплексами в растворе. // Дисс. канд. биол. наук. Пущино. 2005. 129 С.

123. Phelps С.В., Sengchanthalangsy L.L., Malek S„ Ghosh G. Mechanism of kappa В DNA binding by Rel/NF-kappa В dimers. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 24392-24399.

124. Miiller C.W., Rey F.A., Harrison S.C. Comparison of two different DNA-binding modes of the NF-кВ p50 homodimer. // Nat. Struct. Biol. 1996. V. 3. P. 224-227.

125. Kow Y.W., Faundez G., Melamede R.J., Wallace S.S. Processing of model single-strand breaks in phi X-174 RF transfecting DNA by Escherichia coli. II Radiat. Res. 1991. V. 126. P. 357366.

126. Lindahl E., Hess В., Van der Spoel D. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis. // J. Mol. Graph. Model. 2001. V. 7. P. 306-317.

127. Dupradeau F.-Y., Cezard C., belong R., Stanislawiak E., Pecher J., Delepine J. C., Cieplak P. R.E.DD.B.: A database for RESP and ESP atomic charges, and force field libraries. // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. D360-D367.

128. Perez A., Marchan I., Svozil D., Sponer J., Cheatham Т.Е., Laughlon C.A. Orozco M. Refinement of the AMBER force field for nucleic acids: improving the description of alpha/gamma conformers. II Biophys. J. 2007. V. 92. P. 3817-3829.

129. Автор выражает благодарность своим научным руководителям Т.С. Орецкой и Е.А. Кубаревой за руководство и помощь в освоении методов органической химии и работе с ферментами.

130. Автор также благодарит членов своей семьи, родственников и друзей за помощь и поддержку.