Синтез и свойства двухспиральных ДНК, содержащих реакционноспособные межнуклеотидные группировки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ „ „ _ л п УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

РГ 5 Ой

^ 5 ДЕК 1938 ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.1 13.4

КАНЕВСКИЙ Игорь Эрнестович

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА ДВУХСПИРАЛЬНЫХ ДНК, СОДЕРЖАЩИХ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ МЕЖНУКЛЕОТИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор З.А. Шабарова

кандидат химических наук, старший научный сотрудник С.А. Кузнецова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник В. К. Потапов

кандидат химических наук, старший научный сотрудник H.H. Вейко

Ведущая организация:

Институт Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится 24 декабря 1996 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы. Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 22 ноября 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтетические ДНК-дуплексы, содержащие модифицированные фрагменты, широко используются в настоящее время для решения различных задач молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Особый интерес среди них вызывают ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки. Эти соединения, обладая способностью к образованию ковалентных связей с реакционноспособными группами биополимеров, являются чрезвычайно перспективными реагентами для изучения топографии активных центров белков и молекулярного механизма ДНК-белкового узнавания. В последние годы, в связи с развитием сенсовой биотехнологии резко возрос интерес к подобного рода соединениям. Особое внимание уделяется поиску новых реакнионноспособных групп и разработке методов их направленного введения в структуру нуклеиновых кислот. Для получения таких соединений, как правило, используют достаточно сложный- и трудоемкий органохимический подход, включающий разработку специальных методов синтеза исходных модифицированных мономеров. В связи с этим остается актуальной проблема создания методов, позволяющих просто, надежно и с высокой эффективностью получать новые структуры ДНК, содержащие реакционноспособные группировки и обладающие наряду с устойчивостью к нуклеазной деградации, способностью к образованию прочных и специфичных ковалентно связанных комплексов с ДНК-узнаюшими белками, в том числе и с белками, участвующими в экспрессии генетического материала. Такие соединения могут необратимо ингибировать экспрессию вирусных генов, мутантных генов или онкогенов и, в перспективе, могут быть использованы в качестве терапевтических препаратов для лечения широкого спектра заболеваний, включая раковые заболевания и СПИД.

Цель настоящей работы - дизайн, синтез и исследование свойств новых типов ДНК-дуплексов, содержащих в сахарофосфатном остове реакционноспособные замещенные пирофосфатные межнуклеотидные группировки.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе исследованы закономерности введения реакционноспособных замещенных пирофосфатных группировок в сахарофосфатный остов линейных ДНК-дуплексов. Изучена зависимость эффективности реакции от структуры узла, в котором

образуется модифицированная связь, а также от природы ненуклеотидного заместителя в пирофосфатном остатке. Подобраны условия быстрого и количественного расщепления замешенной пирофосфатной группировки.

Разработан метод синтеза нового типа ковалентно связанных ДНК-дуплексов, содержащих реаклионноспособную замещенную пирофосфатную группировку между комплементарными цепями. Изучены свойства образующихся соединений. Установлено, что замещённая пирофосфатная группировка в составе ковалентно связанных ДНК-дуплексов избирательно расщепляется под действием нуклеофильных агентов с переносом остатка одного из олигонуклеотидов, входящих в состав ковалентно связанного дуплекса, на нуклеофил. Впервые показано, что реакция нуклеофильного замещения идет одновременно по обеим фосфатным группам замещенной пирофосфатной группировки. Разработанные методы введения активных группировок между комплементарными цепями линейных ДНК-дуплексов, достаточно просты в экспериментальном отношении и могут быть использованы для введения реакционноспособных групп в ДНК-дуплексы любой длины и состава.

В настоящей работе предложен новый подход, позволяющий с высокой эффективностью получать ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы гантелеподобной структуры и вводить в их сахарофосфатный остов реакционноспособную замещённую пирофосфатную межнуклеотидную группировку. Он включает химическое лигирование в ДНК-дуплексах, образованных полинуклеотидом, концы которого сближены за счет введения гептануклеотидной последовательности, образующей

минишпилечную структуру 3 ...¿А дА • Изучена реакционная способность замещенной пирофосфатной группировки в составе полученных соединений. Показано, что ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы, содержащие замещённую пирофосфатную группировку, достаточно эффективно взаимодействуют с нуклеофилами в водной среде и в то же время обладают устойчивостью к действию клеточных экзонуклеаз. В связи с этим такие соединения, содержащие активную группу в участке узнавания ДНК-связываюишх белков, являются перспективными реагентами для зондирования активных центров белков, а также могут использоваться в качестве их потенциальных ингибиторов.

Полученные в работе соединения, содержащие реакционноспособные замещенные пирофосфатные группировки, бьши использованы для изучения

механизма действия ферментов рестрикции/модификации Я'^соЯП, II-&оП, К-МуаI, М-ЛоП, а также фермента репарации урацил-ДНК гликозилазы. В результате были выявлены новые закономерности их функционирования.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4 статьи. Результаты работы докладывались на Международном семинаре по биологической модификации ДНК (Вильнус, 1994), 16-ом Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью Дели, Индия, 1994 г.), 3-ей Международной конференции по молекулярной биологии (Сингапур, 1995 г.), Международном конгрессе "Терапевтические олигонуклеотиды" (Рим, Италия, 1996 г.), Летней научной конференции РАЗ ЕВ (Вермонт, США, 1996 г.) и 12-ом Международном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое использование", (Лахойя, США, 1996 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 13 0 СТр машинописного текста, содержит 1 ^ рисунков, ^ таблиц. Диссертация состоит из введения, литературного обзора на тему' "Реакционноспособные производные олигонуклеотидов: синтез и использование для ковалентного присоединения к биополимерам", обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основанием для выполнения данной работы послужил предложенный в лаборатории химии НК (МГУ) метод введения реакционноспособной замещённой пирофосфатной группировки в одну из цепей линейных ДНК-дуплексов. Было показано, что при взаимодействии двух олигонуклеотидов, фиксированных на комплементарной матрице, возможно образование ковалентной связи между сближенными в месте разрыва активированной концевой фосфатной группой одного олигонуклеотида и дизамещенной концевой фосфатной группой другого. Образующаяся в результате этой реакции замещённая пирофосфатная межнуклеотидная группировка была с одной стороны, стабильна в условиях близких к физиологическим в отсутствие сильных нуклеофилов, и в то же время эффективно расщеплялась при взаимодействии с нуклеофилами, такими как первичные

алифатические амины или Ы-метилимидазол, а также с нуклеофильными группами основных аминокислот. Было также показано, что введение этой группировки в сахарофосфатный остов ДНК не приводит к дестабилизации дуплексов и искажению геометрии двойной спирали, что важно для последующего изучения взаимодействия этих соединений с белками. В связи с этим стала очевидной перспективность использования такого рода реакционноспособных групп. Однако детального изучения закономерностей реакции образования замещённой пирофосфатной группы в ДНК-дуплексах не было проведено. В настоящей работе были изучены закономерности введения этой группировки в структуру линейных ДНК-дуплексов и, на основании полученных результатов, разработаны методы введения таких реакционноспособных групп между комплементарными цепями ДНК и в структуру ковалентно замкнутых гантелеподобных ДНК-дуплексов.

1. Синтез и свойства линейных ДНК-дуплексов, содержащих реакцнонноспособную группировку внутри одной из цепей

1.1. Изучение закономерностей введения реакционноспособных замещенных пирофосфатных группировок в структуру линейных ДНК-дуплексов

Для детального изучения реакции, приводящей к введению реакционноспособных замещенных пирофосфатных группировок в структуру линейных ДНК-дуплексов, был сконструирован набор модифицированных ДНК-дуплексов (1.1-1.VI), состоящих из гептадекануклеотидной матрицы и комплементарных ей октануклео гидов и модифицированных пентануклеотидов. Реакцию проводили в водном буферном растворе путем конденсации сближенных на комплементарной матрице концевой фосфатной группы одного олигонуклеотида с концевой алкил- или амидофосфатной группой другого:

где прямыми линиями обозначены олигонуклеотиды, X = -ОСгН^ -МНС4Н9, У- остаток 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида.

В ходе реакции варьировали природу ненуклеотидного заместителя, а также структуру узла, п котором образуется модифицированная межнуклеотидная группа. Так, в ДНК-дуплексах (1.Ш) и il.IV), в отличие от дуплексов (1.1) и (1.11), отсутствует одно нуклеозидное звено в реакционном узле образования модифицированной свя?.и, а в дуплексах (1.У) и (1.У1), наоборот, присутствует лишнее звено, представленное остатками пиримидинового или пуринового нуклеотида. Кроме того, варьировали природу нуклеотидов, непосредственно прилегающих к месту образования модифицированной связи.

(5') Т-С-С-С-СрХ рС-Т-С-С-Т-Т-Т-Т (1.1)

Т-С-А-С-С-б-С-----С-А-С-С-А-А-А-А-Т-С

(5') А-С-Т-С-СрХ рС-С-С-Т-С-С-Т-Т (1.11)

Т-С-А-С-С-----С-С-С-А-С-С-А-А-А-А-Т-С

(5') С-Т-С-в-СрХ рС-Т-С-в-Т-Т-Т-Т (1.111)

Т-С-А-С-С-С--С--С-А-С-С-А-А-А-А-Т-С

(5') А-С-Т-С-СрХ рС-С-Т-С-С-Т-Т-Т il.IV)

Т-С-А-С-С—в—С- С-А-С-С-А-А-А-А-Т-С

ТрХ

(5') Э-С-С-С рС-Т-С-С-Т-Т-Т-Т (1.V)

Т-С-А-С-С-С-С-----С-А-С-С-А-А-А-А-Т-С

^рХ

(5') С-Т-С-в рС-С-С-Т-С-С-Т-Т (1.VI)

Т-С-А-С-С----С-С-С-А-С-С-А-А-А-А-Т-С

где X = -ОС2Н5, -ЫНС4Н9

Этиловые эфиры и бутиламиды пентанукпеотидов, входящих в состав исследуемых дуплексов, получали путем прямой конденсации соответствующих пентануклеотидов с этанолом, либо бутиламином в водной среде под действием 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК). Выходы продуктов реакции составляли 80-98%.

Поскольку химическое лигирование протекает только в условиях существования устойчивых двухспиральных комплексов, методом УФ-спектроскопии была изучена термическая устойчивость дуплексов (1.1—1 ."VI) в условиях проведения реакции. Согласно полученным данным, все изученные комплексы оказались устойчивыми при температуре ниже 5° С.

Реакции химического лигирования проводили при температуре 0° С с использованием в качестве конденсирующего агента ЭДК как наиболее эффективного реагента при образовании замещенной пирофосфатной связи. Контроль за ходом реакции осуществляли электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле, используя 32Р-меченные олигонуклеотиды. В результате конденсации во всех изученных комплексах наблюдалось образование ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную группировку. Выходы продуктов реакции в ДНК-дуплексах (1.1-1.У1) приведены в Таблице I.

Таблица I.

Выходы (%) продуктов реакции химического лигирования в ДНК-дуплексах (1.1-1.VI).

Обозначение дуплекса 'X = -1ЧНС4Н9 X = -ос2н5

1.1 77 71

1.11 4.0 20

1.Ш 12 8

1.1У 39 19

1.У 5 18

1.У1 4 10

Как видно из приведенных экспериментальных данных, выходы продуктов химического лигирования выше в том случае, когда ненуклеотидный заместитель у концевого фосфата представлен остатком амида, что связано, видимо, с различием в нуклеофильности моноанионфосфатов амидоэфирной и фосфодиэфирной природы. Так, в случае образования правильных дуплексов (1.1) и (1.11) при использовании в качестве заместителя и-бутиламида соответствующие выходы составили 77 и 40%. В то же время, когда ненуклеотидный заместитель представлен остатком этанола, выходы продуктов были 71 и 20% соответственно. Значительную разницу в выходах продуктов лигирования в дуплексах (1.1) и (1.11) можно объяснить различной природой контактов в узле образования межнуклеотидной связи. Так, независимо от природы ненуклеотидного заместителя, более высокие выходы были получены при реализации контакта 5'С403' (дуплекс 1.1). При интерпретации данных по химическому лигированию в дуплексах (1.111) и (1. IV), в которых отсутствует одно нуклеозидное звено в узле образования модифицированной связи, равно как и в

дуплексах (1 .V) и (I .VI), в которых присутствует лишнее звено, следует учитывать существенное влияние стерического фактора, т.е. пространственной сближенности реагирующих группировок в процессе протекания реакции. Так, изменение пространственной ориентации реагирующих групп в дуплексах (I.V) и (1 .VI), связанное с наличием "лишнего" нуклеозидного звена, приводит к тому, что выходы продуктов лигирования существенно снижаются (4-18%), причем в этом случае производные с фосфодиэфирной связью реагируют несколько быстрее, чем аналогичные производные с фосфоамидной связью. Влияние природы контактов в "неправильных" дуплексах (1.1П-1.У1) в значительной степени нивелировано, поскольку в данном случае основным фактором, определяющим скорость протекания реакции и выходы продуктов химического лигирования, является стерический фактор. Так, во всех "неправильных" дуплексах выходы продуктов лигирования ниже, чем в дуплексах (1.1), (1.11).

1.2 Изучение свойств линейных ДНК-дуплексов, содержащих реакционноспособную группировку внутри одной из цепей

Свойства замещенной пирофосфатной группы в составе линейных ДНК-дуплексов изучали на примере соединений, полученных в результате реакции в дуплексе (1.1). В качестве ненуклеотидных заместителей использовали остатки этанола (1.1) и к-бутиламида (1.2).

Оказалось, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах (рН 6.0-8.5) при 37° С в течение нескольких суток. В то же время, при выдерживании модифицированных дуплексов в 0,4 М Ы-метилимидазольном буфере (рН 8.0), а также при их обработке 0.5 М водным раствором этилендиамина (ЭДА) (рН 8.0), эти соединения легко и количественно расщепляются по модифицированной межнуклеотидной группе. Было установлено, что скорость расщепления замещенной пирофосфатной группировки выше в том случае, когда связь между ненуклеотидныи заместителем и фосфатной группой имеет фосфодиэфирную природу (рис. 1). Нуклеофильная атака при этом осуществляется по ионизированной фосфатной

ОС2Н5 ТССССр-рОТСОТТТТ

МНС4Н9

тсссср-рстсстт

ТвЛСССв-САв СААААТО ТОАССОО

(1.1)

--САв СААААТО

(1.2)

группе замещенной пирофосфатной группировки и сопровождается переносом соответствующего олигонуклеотидного остатка на нуклеофил.

Рис. 1. Накопление продуктов/ образующихся в результате расщепления замещенной пирофосфатной

группировки; в ДНК-дуплексе (1.1) и (1.2) при их выдерживании в 0.4М 1М-метилими-дазольном буфере (рН 8.0) (кривые 1 и 2 соответ.), а также при их обработке 0.5М водным раствором ЭДА (рН 8.0) (5 и 4 соответ.)

20 • 24 Время, ч

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что эффективность образования замещенной пирофосфатной группировки выше в том случае, когда связь между фосфатной группой и ненуклеотидным заместителем имеет фосфоамидную природу. Вместе с тем ДНК-дуплексы, в которых связь между фосфатной группой и ненуклеотидным заместителем имеет фосфоэфирный характер, являются более лабильными, чем соответствующие соединения с фосфоамидной связью. •

Полученные в настоящей работе результаты могут быть использованы • при секвенировании ДНК методом гибридизации с набором олигонуклеотидов, что позволит устранить неоднозначность в определении нуклеотидной последовательности ДНК с повторами и тем самым существенно расширит границы применения метода.

2. Синтез и свойства ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную группировку между комплементарными цепями

На основании данных, полученных в настоящей работе при изучении реакции образования замешенной пирофосфатной межнуклеотидной группы в одной из цепей линейного ДНК-дуплекса, а также учитывая данные, полученные в лаборатории ранее, была предложена новая реакция образования замещенной пирофосфатной группы с участием межнуклеотидного фосфата олигонуклеотида и фосфата моноэфирной природы, связанного с комплементарным олигонуклеотидом через

спейсерное звено. В этой реакции моноалкилфосфат активируется с помощью ЭДК, а межнуклеотидный фосфат является* нуклеофильным агентом. Схематически этот процесс можно представить следующим образом:

где ^ - спейсерная группа; У - остаток ЭДК.

В результате реакции замещенная пирофосфатная группа оказывается расположенной между комплементарными цепями ДНК-дуплекса. Учитывая полученные нами данные о реакционной способности замещенной пирофосфатной группировки (см. раздел 1.2), интерес к получению такого рода ДНК-дуплексов связан с возможностью использования их для ковалентного присоединения к белкам.

2.1 Введение реакционноспособной замещенной пирофосфатной группировки между цепями ДНК-дуплексов

Для изучения реакции образования замешенной пирофосфатной

группировки между комплементарными цепями ДНК-дуплексов и подбора

оптимальных условий ее протекания были сконструированы два типа дуплексов:

5' ТСССССТСр(Х)р 3' 3' ТСАСССССАССАААА 5' (2.1)

5' ТСССССГСр (Х)р 3' 3' ТСАСССССАССААААТС 5' (2.11),

где р - фосфатная группа; X = -(СН2)Я-, п ~ 3, 4, 7, 12, либо остаток 1,2-дидезокси-О-рибофуранозы (сШ).

ДНК-дуплексы структуры (2.1) и (2.II) сформированы октануклеотидами, содержащими на З'-конце присоединенную к ним через спейсерное звено фосфатную группу, и комплементарными пентадека- и гептадекануклеотидом соответственно. Наличие спейсерной группы в октануклеотидах обеспечивает пространственное

сближение реагирующих групп: активированного моноалкилфосфата октануклеотида и межнуклеотидной фосфатной группы комплементарного олигонуклеотида. В качестве спейсерных групп были использованы остатки пропан-, бутан-, гептан-, и додекандиолов, а также остаток с!Я. В последнем случае длина спейсерного звена соответствовала длине пропиленовой группы, однако конфортиионная подвижность атомов углерода рибофуранозного цикла ниже, чем в полиметиленовой цепи. Использование в качестве спейсерной группы фрагмента сЩ позволяет оценить влияние конформационной подвижности спейсерного звена на эффективность изучаемой реакции. Дуплексы типа (2.11) отличаются от аналогичных дуплексов (2.1) наличием динуклеотидного фрагмента СТ на 5'-конце гептадекануклеотида. Этот фрагмент может быть вовлечен в образование шпилечной структуры, стабилизированной двумя парами оснований так, что структуру ДНК-дуплексов, входящих в систему (2.И), можно представить следующим образом:

• /ХР

5 ТСССССГСр СТ А

з' ТСА£ссссас —СААА

Для определения оптимальных условий реакции варьировали следующие параметры: начальные концентрации реагентов, составы и рН буферных растворов, длину и природу спейсерного звена, а также температуру. Предварительно методом УФ-спектроскопии была изучена термическая устойчивость ДНК-дуплексов (2.1) и (2.П). Согласно полученным данным, эти дуплексы были устойчивы при температуре ниже 10° С. Поэтому реакции ковалентного присоединения для всех дуплексов (2.1) и (2.П) проводили при 10° С с использованием в качестве конденсирующего агента ЭДК. Контроль за ходом реакций осуществляли с помощью электрофореза в 20%-ном ПААГ, используя 32Р-меченные олигонуклеотиды. Метку вводили на 5'-концы пентадека- и гептадекануклеотидов, либо модифицированных октануклеотидов. Оптимальные условия подбирали на ДНК-дуплексах структуры (2.1). В качестве исходных выбрали условия, оптимальные для введения замещенной пирофосфатной группировки в одну из цепей линейных ДНК-дуплексов (см. раздел 1.1). На рис. 2 представлена авторадиограмма гель-электрофореза продуктов реакции ковалентного присоединения модифицированных октануклеотидов к пентадекануклеотиду (дуплексы (2.1)),

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Электрофорез реакционных смесей, образующихся в результате реакции в ДНК-дуплексах (2.1).

1 - [32Р]рААААССАССОССАОТ;

2 - реакционная смесь, образующаяся в ДНК-дуплексе, содержащем пропиленовое спейсерное звено; 3-6 - реакционные смеси, образующиеся в ДНК-дуплексах (2.1), содержащих соответственно бутиленовое, гептаметиленовое, додекаметиленовое и сШ спейсерные звенья. 32Р

вводили на 5'-конец пентадекануклеотида.

Как видно из этого рисунка, во вЬех случаях в результате реакции наблюдалось образование ковалентно связанных ДНК-дуплексов, причем выходы продуктов зависели от длины и природы спейсерного звена. Обозначения и выходы соответствующих ковалентно связанных ДНК-дуплексов приведены в Табл. 2.

Таблица 2

Выходы продуктов ковалентного присоединения модифицированных октануклеотидов к пента- и гептадекануклеотидам в ДНК-дуплексах структуры (2.1) и (2.11).

ДНК-дуплексы структуры (2.1) ДНК-дуплексы структуры (2.11)

№ Структура Выходы Обозначение № Структура Выходы Обозначение

п/п спейсера продуктов продуктов п/п спейсера продуктов продуктов

реакции, % реакции реакции, % реакции

25 Из'

1 -(СН2)3- 39 h 6 -(СН2)3-

43 1Ь2

7 II41

2 -(СН2)4- 35 14 7 ЧСН2)4-

9 II42

3 II71

3 -<СН2)7- 5 h В -(СН2)7-

5 1Ь2

10 п12>

4 -(СН2),г 19 112 9 -(СН2),2-

15 Пп2

21 HdR1

5 -dR- 40 IdR. 10 -dR-

47 Uhr2

Видно, что наиболее эффективно реакция протекает в дуплексах структуры (2.1),

содержащих пропиленовую, бугиленовую и с!!* спейсерные группы. Выходы продуктов реакции в этих случаях составили 35-40 %. Минимальная степень

превращения исходных соединений наблюдалась в ДНК-дуплексе с гептаметиленовым спейсерным звеном и составляла 5 %.

Варьирование начальных концентраций реагирующих соединений С0 от 10"3

М до 4-Ю"3 М, а также состава и рН буферных растворов не оказало существенного влияния на эффективность реакции.

Важно отметить, что при проведении реакции в ДНК-дуплексах (2.11) в отличие от (2.1) возможно одновременное протекание двух процессов: образования замещенной пирофосфатной связи .между цепями ДНК-дуплекса (направление а, схема 1) и реакции, протекающей между сближенными за счет образования шпилечной структуры 5'-гидроксилом гептадекануклеотида и активированным моноалкилфосфатом, связанным с октануклеотидом (направление б) (см. схему 1).

Схема 1.

У

I

-Р

ГГТТГ ТР

а

-V

б

л_р-

р }

(1)

(2)

где - спейсерная группа, У - остаток ЭДК.

Реакции в ДНК-дуплексах структуры (2.11) проводили в оптимальных условиях, подобранных для (2.1). На рис. 3 представлена радиоавтограмма гель-электрофореза продуктов ковалентного присоединения модифицированных октануклеотидов к гептадекануклеотиду (дуплексы (2.11)). Как видно из этого рисунка, во всех случаях, как и предполагалось, наблюдалось образование двух продуктов, обладающих различной электрофоретической подвижностью. Обозначения и выходы этих соединений приведены в Табл. 2.

Рис. 3. Электрофорез реакционных смесей, образующихся в результате реакции в ДНК-дуплексах (2.11).

1 - [32Р]рОТААААССАСОСССАОТ;

2 - реакционная смесь, образующаяся в ДНК-дуплексе, содержащем пропиленовое спейсерное звено; 3-6 - реакционные смеси, образующиеся в ДНК-дуплексах (2.II), содержащих соответственно бутиленовое, гептаметиленовое, додекаметиленовое и сЖ спейсерные

звенья. 32Р вводили на 5'-конец гептадекануклеотида

Для обозначения продуктов реакции с большей электрофоретической подвижностью использован надстрочный индекс "1" (И31, П41 ... и т.д.), продукты с меньшей подвижностью обозначены надстрочным индексом "2" (П32, П42 ... и т.д.). Как следует из экспериментальных данных, максимальная степень превращения исходных соединений была достигнута при использовании пропиленового и сЖ-спейсерных звеньев (дуплексы П3, 11<щ) и составила 68 %.

Оказалось, что все ковалентно связанные ДНК-дуплексы П32 - Н^2 представляют собой 25-звенные линейные олигонуклеотиды структуры (2) (см. схему 1). Это было подтверждено их секвенированием по методу Максама и Гилберта. Что касается дуплексов Н31 - Пая1, то в процессе секвенирования при обработке пиперидином наблюдалось их полное расщепление по модифицированной связи с образованием исходных олигонуклеотидов, формирующих ДНК-дуплексы (2.11). Это свидетельствовало о том, что такие соединения содержат реакционноспособную ковалентную связь между цепями дуплекса (структура (1), схема 1).

2.2 Свойства ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатиую группировку между комплементарными цепями

Проведенные исследования по изучению свойств ДНК-дуплексов, содержащих в одной из цепей замещенную пирофосфатиую межнуклеотидную группировку (см. раздел 1.2), показали, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах в диапазоне рН 6.0 - 8.75 в отсутствие сильных нуклеофилов. В то же время они обладали способностью эффективно расщепляться под действием нуклеофильных агентов, таких как первичные, вторичные амины и некоторые аминокислоты. Разработанные условия реакций являются условиями избирательного расщепления подобного рода двутяжевых ДНК и служат доказательством их структуры.

Для изучения гидролитической устойчивости ковалентно связанных ДНК-дуплексов 1з-1сщ и Пз'-Нак1, содержащих замешенную пирофосфатиую группировку между цепями, их инкубировали в водных буферных растворах^ не содержащих сильных нуклеофилов (рН 6.0-8.75). С целью изучения реакционнной способности этих соединений их выдерживали в 0.4 М М-метилимидазольном (Ме1т) буфере (рН 8.0) и в 0.5М водном растворе ЭДА (рН Б.О). Реакционные смеси анализировали с помощью электрофореза. Оказалось, что эти соединения устойчивы в течение трех

суток при температуре 20° С во всех буферных растворах, не содержащих сильных нуклеофилов. Под действием нуклеофильных агентов Melm и ЭДА ДНК-дуплексы h-'dR и ilj'-HjR1 расщеплялись избирательно по модифицированной связи. Следует отметить, что дуплексы [[32-1IdR2» содержащие стабильную межнуклеотидную связь, в этих условиях полностью устойчивы. Особое внимание следует обратить на то, что при обработке дуплексов IrldR и 1131 -1 Ijr 1 водным раствором ЭДА (рН 8.0) наряду с исходными олигонуклеотидами, входящими в состав ДНК-дуплексов (2.1) и (2.11), наблюдалось образование продуктов с меньшей электрофоретической подвижностью (рис. 4).

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Радиоавтограф электрофоретического разделения продуктов аминолиза ДНК-дуплекса II31 ЭДА. 1 - pp]pTGGCCGTCp(CH2)3p; 2 -NH2(CH2)2NH-[32P]pTGGCCGTCp(CH2)3p; 3 продукты аминолиза ДНК-дуплекса II31 ЭДА. шф Дуплекс был синтезирован с использованием ^^ 32Р-меченного октануклеотида;

4 - [32P]pGTAAAACGACGGCCAGT;

5 - NH2(CH2)2NH-[32P]pGTAAAACGACGGCCAGT;

6 - продукты аминолиза ДНК-дуплекса II31 ЭДА. qgpmm Дуплекс был синтезирован с использованием

м 32Р-меченного гептадекануклеотида.

Было установлено, что продукты с меньшей электрофоретической подвижностью являются аминоэтиламидами олигонуклеотидов, входящих в состав ДНК-дуплексов структуры (2.1) и (2.II). Образование этих соединений возможно в том случае, когда атака нуклеофила идет как по ди-, так и по тризамешенной фосфатным группам замещенной пирофосфатной группировки. Этот процесс представлен на схеме 2.

Схема 2

О О

„ R3(X)0-P-0" + Rr0-P-0-R2 R1-O-P-O-R2 ^r NH(CH2)2NH2 O-

o + NH2(CH2)2NH2 _____0 0

R3(X)0-P0~ n II

.6 Rr0-P-0-R2 + R3(X)0-P-0-

0 NH(CH2)2NH2 OH

где R|, R2, R3 - остатки олигонуклеотидов, X - спейсерное звено.

О

ы

Согласно этой схеме в результате аминолиза с помощью ЭДА в реакционной смеси образуются исходные олигонуклеотиды и их аминоэтиламидныс производные по концевой (направление а) и по- межнуклеотидной (направление б) фосфатным группам. Структура аминоэтиламидов олигонуклеотидов, в которых остаток ЭДА присоединен к концевой фосфатной группе, была подтверждена их встречным синтезом с последующим сравнением электрофоретической подвижности этих соединений, а также избирательным гидролизом фосфоамидной связи 15 % водным раствором уксусной кислоты при 50° С в течение 2-х час. В результате этой реакции наблюдалось полное расщепление фосфоамидной связи с образованием исходных соединений. Олигонуклеотиды, в которых остаток ЭДА присоединен по межнуклеотидной фосфатной группе, в условиях кислотного гидролиза также расщеплялись по фосфоамидной связи, что согласуется с литературными данными, однако они оказались значительно-устойчивее. При расщеплении под действием Мс1т ковалентно связанных ДНК-дуплексов 1з-1<ж и Из'-П^1 образуются только исходные олигонуклеотиды, входящие в их состав. Это объясняется крайней лабильностью Ме1т-производных олигонуклеотидов в водных растворах.

Таким образом, в отличие от ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную межнуклеотидную группировку в одной из цепей, реакция нуклеофильного замещения у атома фосфора в ДНК-дуплексах, содержащих замещенную пирофосфатную группировку между комплементарными цепями, протекает одновременно как по ди- так и по тризамещенным фосфатным группам. Этот факт оказался неожиданным, т.к. уходящей группой при нуклеофильном замещении были анионы как сильной (с рК~1), так и слабой кислоты (рК-6-6.5). По-видимому, в данном случае основное влияние на направление реакции оказывает стерический фактор, а природа уходящей группы не играет определяющей роли. Указанная реакция является специфической для подобного рода соединений и может служить как для доказательства их структуры, так и для аффинной модификации белков.

Разработанный метод введения реакционнослособной замещенной пирофосфатной группировки между комплементарными цепями ДНК был использован для получения целевых ковалентно связанных ДНК-дуплексов на основе комплексов (2.Ш) и (2.IV):

5' ТСССССиСр(йЮр 3' 3' ТСАСССССАССАААА 5' (2.Ш)

5' АСТСТССГТААТС АТСТАС АСТТ (йЯ)р 3'

3' р (сЗИ) САССААТТАСТАСАТСТСААТААТТТ 5' (2.1У)

ДНК-дуплекс структуры (2.III), содержащий остаток (Ш, является аналогом субстрата фермента репарации урацил-ДНК гликозилазы (УДГ) и в настоящее время используется для изучения механизма действия и аффинной модификации этого фермента. Предварительные исследования взаимодействия ковалентно связанных ДНК-дуплексов с УДГ показали, что эффективность связывания фермента с такими модифицированными субстратами в 10 раз выше, чем с аналогичными соединениями природного строения. ДНК-дуплекс (2. IV) содержит участок узнавания транскрипционного фактора НЫР-1 (выделен жирным шрифтом) и в настоящее время изучается в качестве потенциального ингибитора этого белка.

3. Синтез и свойства ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатную или замещенную пирофосфатпую межнуклеотидные группировки

Получение двухспиральных фрагментов ДНК, обладающих повышенной устойчивостью к действию клеточных экзонуклеаз, стало актуальным в связи с развитием сенсовой биотехнологии. Создание таких структур, а также введение в них реакционноспособных групп, способных к образованию ковалентных связей с белками, ответственными за экспрессию генетического материала, позволит повысить эффективность их ингибирования и сделать его необратимым.

В настоящей работе предложен оригинальный подход, позволяющий с высокой эффективностью получать ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы гантелеподобной структуры и вводить в их сахарофосфатный остов пирофосфатную или реакционноспособную замещённую пирофосфатную межнуклеотидные группировки. Этот подход базируется на обнаруженном нами свойстве гептануклеотидной последовательности 5' ОТААААС 3' образовывать минишпилечную структуру 5* СТА

У ¿ддА , стабилизированную всего двумя парами оснований. Фланкирование ДНК-

дуплексов такой гептануклеотидной последовательностью с одного или одновременно с обоих концов приводит к образованию в растворе следующих структур:

I-Н ^ <?Т \ дААС-' Адс-Д' ^ СТ А

I-СА д АТС^н-, АдТС-САдА

где прямой линией обозначены комплементарные последовательности олигонуклеотидов, а стрелкой - место разрыва.

Особенностью такого рода структур является то, что в результате вовлечения в комплементационные взаимодействия З'-концевой нуклеотид одной из цепей ДНК-дуплекса оказывается сближенным с 5'-кониевым нуклеотидом другой цепи, и между ними становится возможным проведение химической реакции, приводящей к образованию ковалентной связи. Эта реакция аналогична химическому лигированию, протекающему между олигонуклеотидами, сближенными на комплементарной матрице (см. раздел 1.1). Проведение химического лигирования в ДНК-дуплексах, фланкированных 5' ОТААААС 3' - последовательностью с обоих концов, позволит получать циклические ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы, а также вводить в их •структуру реакционноспособную замещённую пирофосфатную межнуклеотидную группировку.

3.1 Получение ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатную и реакционноспособную замещённую пирофосфатную межнуклеотилные группировки

Для реализации предложенного подхода в качестве исходных были выбраны 42-звенные олигонуклеотиды, формирующие в водном буферном растворе ДНК-дуплексы (3.1), (З.Н) и (3.111) (рис. 5). ДНК-дуплексы (3.1) и (3.11) содержат остаток 2'-дезоксиуридина (и) и являются аналогами субстратов УДГ. В дуплексе (3.1) реакционноспособную замещённую пирофосфатую группировку вводили между нуклеотидами Т и О верхней цепи, содержащей остаток и, на расстоянии 6-ти нуклеотидов от нее. В дуплексе (3.11) активную группировку вводили в противоположную цепь между нуклеотидами в и С. В ДНК-дуплексе (ЗЛИ) активную группировку вводили в участок узнавания эндонуклеазы рестрикции ЛоП.

Синтез ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов (3.16), (З.Иб) и (З.Шб),

содержащих пирофосфатную межнуклеотидную группировку, проводили путем конденсации под действием ЭДК 3'- и 5'-концевых фосфатных групп 5'-фосфорилированных 42-звенных олигонуклеотидов, формирующих ДНК-дуплексы (3.1-3.III). 5'-Фосфорилирование проводили с помощью Т4-полинуклеотидкиназы. В результате химического лигирования во всех случаях наблюдалось образование продуктов, обладающих более высокой электрофоретической подвижностью по сравнению с исходными соединениями. Выход продуктов был близок к количественному . и составил 95-98%. Полученные в результате химического лигирования ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы (3.16-3.1116), содержащие пирофосфатную межнуклеотидную группировку, оказались, как и ожидалось, устойчивы к действию фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфотазы, что подтверждает их циклическую структуру.

Для синтеза ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов (3.1а), (З.Па) и (З.Ша), содержащих замещённую пирофосфатную межнуклеотидную группировку, использовали химическое лигирование под действием ЭДК. Было показано, что этот метод является оптимальным для введения замещенной пирофосфатной группировки в линейные ДНК-дуплексы. В качестве ненуклеотидного заместителя у З'-фосфата использовали остаток метанола, поскольку было установлено, что скорость расщепления замещённой пирофосфатной группировки под действием нуклеофилов выше в том случае, когда связь между ненуклеотидным заместителем и фосфатной группой имеет фосфодиэфирную природу (см. раздел 1.2). Следовательно, эффективность ковалентного присоединения к белкам в этом случае также должна быть выше, чем для аналогичных соединений, в которых связь между фосфатной группой и ненуклеотидным заместителем имеет фосфоамидную природу. Остаток метанола был выбран еще и потому, что он вносит минимальные искажения в структуру ДНК-дуплекса по сравнению с другими спиртами.

У I 5'

дА-С-С-С-С-А-А-С-С-и-С-С-С-Т-С-Тр ' в-Т д

А А

А (3.1)

Т-С-С-С-С-Т-Т-С-С-А-С-С-С-А-С-А

С-А

О о

ii ii

..¡.Т-О-Р-О-Р-О-С. ! осн3о" „

• .;.А-С

дА-С

(3.1а) (3.16)

С-С-С-А-А-С-С-Ц-С-С-С-Т-С-Т-С-Т■

АТ-С рС-С-С-Т-Т-С-С-А-С-С-С-А-С-А-С-А А

5* Т 3".....о""о......1

(З.П)

.С-О-Р-О-Р-О-О.;..

.с ^

о о : и и .с-О-Р-О-Р-О-С.-.

„ ¿- 6-.о-с...

(3.11а) з, 5. (З.Пб)

дА-С-А-С-С-Т-А-С-Ср ' Т-в-С-Т-О-С-Т-С-Т д А А (3.1 И)

АТ-С-Т-С-С-А-Т-в-С - А-С-С-А-С-С-А-С-А А

О II

о

¡.с-о-р-о-р-о-т,

Р ОСНзО' и-А

(З.Ша)

(3.1 Нб)

Рис. 5. Структура олигонуклеотидов и сформированных ими ДНК-дуплексов, используемых в работе. Стрелкой обозначено место введения модифицированной группировки, пунктиром выделен модифицированный фрагмент ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов аналогичной структуры, полученных в работе.

Метилирование З'-концевой фосфатной группы олигонуклеотидов, формирующих ДНК-дуплексы (3.1-3.111), проводили путем прямой конденсации исходных 42-звенных олигонуклеотидов с метанолом в водной среде под действием ЭДК в условиях, подобранных в настоящей работе для модификации протяженных олигонуклеотидов. Эта реакция протекает с количественным выходом за 12 ч.

Синтез ковалснтно замкнутых ДНК-дуплексов (3.1а), (З.На) и (З.Ша) проводили конденсацией сближенных в результате комплементационных взаимодействий 5'-концевой фосфатной и З'-концевой метилфосфатной групп олигонуклеотидов, входящих в состав ДНК-дуплексов (3.1-3.III). Реакцию химического лигирования проводили при 4°С в течение 48 час. На рис. 6 представлен радиоавтограф реакционных смесей, образующихся в результате синтеза соединений (ЗЛа)-(З.Ша).

' ^ 3 4 рис ^ Электрофорез в 12% ПААГ реакционных

смесей, образующихся в результате синтеза ковалентно-замкнутых ДНК-дуплексов (3.1а), (З.Па) и (З.Ша).

1 -32рОТААААС АО АО ССАО СТТОС СОТААААСО ССААСС(и)ООСТСТрОСН3; 2 - реакционная смесь, образующаяся в результате его химического лигирования (ДНК-дуплекс (3.1а)); 3,4 реакционные смеси, образующиеся в результате синтеза соединений (З.Па) и (З.Ша).

Как видно из этого рисунка, в всех случаях наблюдалось образование продуктов с большей электрофоретической подвижностью, чем исходные соединения с выходом 12, 25 и 10% соответственно. Полученные в результате химического лигирования ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы (3.1а), (З.На) и (З.Ша) оказались устойчивыми к действию фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфотазы, что подтверждает их циклическую структуру.

3.2 Свойства ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов, содержащих реакцнонноспособную замещенную пирофосфатную группировку

Исследование реакционной способности замещённой пирофосфатной группировки в составе ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов вызывало особый интерес, поскольку реакционная способность ангидридной связи в трехзамешенных пирофосфатах в соединениях различной природы неодинакова. Так, в составе одноцепочечных олигонуклеотидов такая связь оказалось достаточно стабильной в водных буферных растворах при рН 6.0-8.5 и в то же время легко и количественно расщеплялась под действием нулеофилоп. Аналогичная связь в составе линейных ДНК-дуплексов оказалась более стабильной.

Реакционную способность ДНК-дуплексов (3.1а), (З.На) и (З.Ша), содержащих замещенную пирофосфатную группировку, изучали, используя в качестве нуклеофильных реагентов также ЭДА и Ме1т. Эту реакцию проводили в течение 16 час при 37°С. На рис. 7 в качестве примера приведен радиоавтограф реакционных смесей, образующихся в результате аминолиза соединения (3.1а) .

12 3 4 Рис. 7. Электрофорез в 12% ПААГ продуктов

аминолиза ковалентно замкнутого ДНК-дуплекса (3.1а) ЭДА и М-Мр1т.

1-32рОТААААСАОАСССАСОТГССССТААААСО ССААСС(и)СОСТСТрОСН3; 2-ДНК-дуплекс (3.1а); 3 и 4 - реакционные смеси, образующиеся в результате его расщепления под действием Ме1ш и ЭДА соответственно.

Как видно из этого рисунка, замещённая пирофосфатная группировка расщеплялась в этих условиях на 40% как под действием ЭДА, так и под действием Melm. Аналогичные результаты были получены для соединения (З.На) и (З.Ша). При повышении температуры реакции до 50° С эффективность расщепления составляла 70-80%. Эти данные свидетельствуют о том, что замещённая пирофосфатная группировка в составе ковалентно замкнутых ДНК-дуплексов является химически активной и взаимодействует с нуклеофилами в водной среде при pH 8.0. Вместе с тем такие соединения более устойчивы к действию нуклеофилов, чем линейные ДНК-дуплексы или одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие замещённую пирофосфатную группировку.

Таким образом, ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы, содержащие замещённую пирофосфатную группировку, являются, с одной стороны, устойчивыми к действию клеточных экзонуклеаз и в то же время обладают способностью эффективно взаимодействовать с нуклеофилами в водной среде. В связи с этим, такого рода соединения, с указанной модификацией в участке узнавания ДНК-связываюших белков, являются перспективными реагентами для зондирования активных центров белков и выявления нуклеофильных аминокислот, находящихся в непосредственном контакте с сахарофосфатным остовом ДНК, а также могут использоваться в качестве потенциальных ингибиторов ряда ДНК-узнающих белков.

Полученные в настоящей работе ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы (ЗЛб-З.Шб) были использованы для изучения возможности расплетания двойной спирали ДНК в процессе функционирования ферментов рестрикции/модификации И'£соШ1, Я'&оН, Я-Л/усЛ, М'ЛоП, а также фермента репарации УДГ. Модифицированный дуплекс (ЗЛПа), содержащий реакционноспособную замещенную пирофосфатную групппировку в участке узнавания эндонуклеазы рестрикции &о11, был использован для ковалентного присоединения к этому ферменту. Было показано, что в результате взаимодействия &о!1 с модифицированным ДНК-дуплексом (ЗЛПа) происходит образование специфического ковалентно связанного комплекса ДНК-белок с выходом 20%. Показано, что комплекс хорошо отделяется от исходного олигонуклеотида и не прореагировавшего фермента в условиях анионообменной ВЭЖХ, что может быть использовано в последующих структурных исследованиях белка.

. ВЫВОДЫ

1. Изучены закономерности введения в одну из цепей ДНК-дуплексов реакционноспособных замещенных пирофосфатных группировок, в которых ненуклеотидный заместитель у атома фосфора представлен алкокси- или алкиламинной группами. Для получения этих соединенний использовали метод химического лигирования. Такие модифицированные ДНК-дуплексы эффективно и направленно реагируют с первичными аминами, причем нуклеофильной атаке подвергается дизамещенный атом фосфора, а уходящей группой является анион сильной кислоты (рК~1). Показано, что более реакционноспособными являются тризамешенные пирофосфаты, в .которых ненуклеотидный заместитель у атома фосфора представлен алкоксигруппой.

2. Разработана новая региоселективная реакция, протекающая в двухспиральных ДНК с участием межнуклеотидного фосфата олигонуклеотида и фосфата моноэфирной природы, связанного с комплементарным олигонуклеотидом через спейсерное звено. В результате такой реакции комплементарные цепи ДНК-дуплекса оказываются ковалентно связанными образующейся замещенной пирофосфатной группировкой. Впервые установлено, что реакция аминолиза таких соединений этилендиамином протекает с расщеплением замещенной

гшрофосфатной группы, причем нуклеофильной атаке подвергаются оба атома фосфора с образованием соответствующих аминоалкиламидов олигонуклеотидов. Установлено, что в присутствии N-метилимидазола, замещенная пирофосфатная группа эффективно расшепляется при pH 8.0.

3. Предложен новый подход, позволяющий с высокой эффективностью получать ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы гантелеподобной структуры и вводить в них реакционноспособную замещённую пирофосфатную межнуклеотидную группировку. Установлено, что модифицированная межнуклеотидная группа в таких ДНК-дуплексах является реакционноспособной и эффективно взаимодействует с нуклеофилами в водной среде. В то же время ковалентно замкнутые ДНК-дуплексы обладают устойчивостью к действию клеточных экзонуклеаз.

4. Показана перспективность использования синтезированных ДНК-дуплексов с реакционноспособными группами для детального изучения механизма функционирования ферментов рестрикции/модификации R-ffcoRII, R*&oII, K-Mva\, M-ÄoII, а также фермента репарации урацил-ДНК гликозилазы. С эффективностью 20% осуществлено специфическое ковалентное присоединение эндонуклеазы рестрикции &о1Р к ковалентно замкнутому ДНК-дуплексу, содержащему реакционноспособную группировку в участке узнавания фермента.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Кузнецова С.А., Каневский Н.Э., Флорентьев В.А., Мирзабеков А.Д., Шабарова З.А. Секвенирование ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами, иммобилизованными в геле. Химическое лигирование как способ расширения возможностей метода. Молекулярная биология. 1994. 28. С. 290-299.

2. Кузнецова С.А., Каневский И.Э., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. Синтез и свойства ковалентно замкнутых ДНК-Дуплексов, содержащих пирофосфатную и замещенную пирофосфатную межнуклеотидные группировки. Биоорган, химия. 1996. 22. С. 532-540.

3. Каневский Н.Э., Кузнецова С.А., Волков Е.М., Шабарова З.А. Синтез и свойства ковалентно связанных ДНК-дуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную

группировку между комплементарными цепями. Молекулярная биология. 1996. 30. С.

4. Kubareva E.A., Volkov E.M., Vinogradova N.L., Kanevsky I .A., Oretskaya T.S., Kuznetsova S.A., Brevnov M.G., Gromova E.S., Nevinsky G.A., Shabarova Z.A. Modified substrates as probes for studying uracil-DNA glycosylase. Gene. 1995. 157. P. 167-171.

5. Kubareva E.A., Volkov E.M., Vasilenko N.L., Kanevsky I.E., Kuznetsova S.A., Brevnov M.G., Nevinsky G.A., Shabarova Z.A. Modified substrates as probes for studying uracil-excision DNA repair enzymes. Proc., Workshop on biological DNA modification. Vilnus, May, 22-28, 1994.

6. Kanevsky I.E., Kuznetsova S.A., Shabarova Z.A. Synthesis and properties of cross-linked DNA-duplexes and DNA dumbbells containing chemically active substituted pyrophosphate groups. Proc., International Congress: "Therapeutic Oligonucleotides". Rome, June 9-12, 1996.

7. Shabarova Z.A., Kuznetsova S.A., Kozlov I.A., Kanevsky I.E., Ivanovskaya M.G., Kubareva E.A., Blumenfeld M., Vasseur M. Activated DNA-duplex binding and covalent cross-linking to transcription factors. Proc., XII International Roundtable: "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications". La Jolla, California, September 15-19, 1996.

1144-1157.