Региоспецифическое ковалентное связывание ДНК-дуплексов с субъединицей р50 фактора транскрипции NF-kB тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГо ОД

О О А СП \ОГр

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И

ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На примах рукописи УДК 577.113.4

КОЗЛОВ Игорь Александрович

РЕГИОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ

ДИК-ДУПЛЕКСОВ С СУБЪЕДИНИЦЕЙ р50 ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ

^-кВ

02 00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных

веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре Химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Шабарова З.А.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Кубарева Е.А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Нифантьев Э.Е.

доктор биологических наук, профессор Поляновский О.Л.

Ведущая организация:

Государственный НИИ Генетики и Селекции промышленных микроорганизмов

Зашита состоится 25 февраля 1997 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы. Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 24 января 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.туалыгость проблемы. Изучение структуры и функций факторов транскрипции ляется- важным не только с точки зрения исследования ключевых процессов 1знедеятельности клетки, но и открывает возможности для направленного" здействия на биологические системы путем ингибирования этих белков.

Фактор транскрипции N Г-к В является основным элементом в системе регуляции >льшого числа генов, которая позволяет клеткам млекопитающих быстро шспосабливать свою транскрипционную программу к воздействиям окружающей еды. Фактор ОТ-кВ состоит из двух белковых субъединиц р50 и р65 и узнает в ДНК 'клеотидную последовательность из десяти пар оснований (кВ участок): -ОССРи^РуРуСС-3\ где Ри - А, О; Ру - С, Т; N - А, Т, С, С. Известно, что многие 1когены и вирусы используют №-кВ для активации транскрипции своих генов. В язи с этим большое внимание в настоящее время уделяется изучению процессов тивации и функционирования ЫР-кВ в клетке, а также поиску путей направленного аудирования его активности.

Для направленного ингибирования факторов транскрипции активно развивается звый метод, заключающийся в том, что олигонуклеотидные дуплексы, содержащие [астки узнавания этих белков, используются для их связывания и выведения из эоцесса активации транскрипции. Проведенные исследования показали, что такие шлсксы должны прочно связываться с фактором транскрипции, обладать термической ■абильностыо, быть устойчивыми к действию нуклеаз и проникать сквозь клеточную ембрану. Однако до сих пор не удалось получить ДНК-дуплексы, удовлетворяющие :ем этим требованиям. Для ингибирования активности факторов транскрипции Зычно используют ДНК-дуплексы, которые нековалентно связываются с белком. Это «чит, что процесс ингибирования носит обратимый характер и фактор транскрипции с удается вывести на продолжительный период времени из участия в процессах нициации транскрипции.

Поэтому необходим поиск новых структур ДНК-дуплскеов, содержащих одификашш различного рода, которые могут использоваться для эффективного нгибирования фактора транскрипции №-кВ. Особый интерес представляет проблема оздания таких ингибиторов ЫР-кВ на базе ДНК-дуплексов, которые обладают

В руководстве работой принимала участие к.х.н., с.н.с. Ивановская М.Г.

способностью ковалентно связываться с данным белком и являются, таким образом, ere необратимыми ингибиторами.

Целью настоящей работы является разработка ингибиторов для фактора транскрипшп NF-кВ на основе синтетических ДНК-дуплексов, а также исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействий в комплексе фактора транскрипции NF-кВ < ДНК.

Научная новизна и практическая ценность. Синтезированы ДНК-дуплексы, содержашш активную тризамещённую пирофосфатную межнуклеотшшую группу в различно( ориентации относительно 5' и 3' положений в месте ее введения в структур; олигонуклеотида (схема 4, стр. 6), и изучены их химические свойства. Причем ДНК дуплексы, в которых дизамешенная фосфатная группа, входящая в соста] тризамещённой пирофосфатной группировки, присоединена к 3' атому углерод; дезоксирибозы, получены и исследованы впервые. Установлено, что реакционна] способность тризамещённой пирофосфатной группы по отношению i низкомолекулярным нуклеофилам не зависит от ее ориентации в структур! олигонуклеотида.

С целью выбора оптимальной структуры ингибитора для NF-кВ исследован! взаимодействие с субъединицей р50 NF-кВ каждого из серии ДНК-дуплексо одинаковой первичной структуры, но различающихся положением тризамещенно! пирофосфатной группы в кВ участке. Показано, что ДНК-дуплексы, содержащи активную группу, в которой дизамешенная фосфатная группа присоединена к 3' атом углерода дезоксирибозы. не способны ковалентно связываться с р50 независимо о места положения активной группы в кВ участке. Для серии ДНК-дуплексоЕ содержащих активную группу, в которой дизамешенная фосфатная групп присоединена к 5' атому углерода дезоксирибозы. обнаружено четыре положения углеводофосфатном остове кВ участка, введение в которые тризамещенно пирофосфатной группы приводит к эффективному ковалентному связыванш модифицированных дуплексов с субъединицей р50 NF-кВ. Полученные результаты п ковалентному связыванию сравнены с данными рентгеноструктурного анали: комплекса димера р50 с ДНК, содержащей идеализированный кВ участок, показана и относительная корреляция. Использованный метод ковалентного связывания позволи скорректировать положение отдельных белково-нуклеиновых контактов в комплекс димера р50 с ДНК в растворе применительно к исследованному нами к В участку.

Синтезирован ДНК-дуплекс, содержащий ацилфосфатную межнуклеотидную уппу. Показана возможность его ковалентного связывания с субъединицей р50 1ктора транскрипции NF-кВ, что является первым примером использования тивированных дуплексов такого типа для ковалентного связывания с белками.

Предложен метод получения ДНК-дуплексов, содержащих кВ участок, типараллельные цепи в которых соединены с помощью мостиковых соединений, держащих две или более алифатические аминогруппы. Показано, что связывание плекса по кониевым фосфатным группам повышает его термическую стабильность и тойчивость к действию нуклеаз, а также не препятствует образованию специфичного |мплекса с димером субъединицы р50 фактора транскрипции NF-кВ, что позволяет осматривать такие соединения как потенциальные ингибиторы NF-kB.

Проведённое исследование представляет интерес с точки зрения конструирования -lK-дуплексов. содержащих химически активные группы, для направленного (гибирования факторов транскрипции в клетке, что может быть использовано при здании терапевтических препаратов нового поколения.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три атьи и одна принята к публикации. Результаты работы были доложены на 1-ом фопейскоч биотехнологическом симпозиуме (серия Майами Bio/Technology) (Монте-лрло, Монако, 1994 г.), на 7-ом Конгрессе FAOBMB "Новые направления в юхимии и молекулярной биологии" (Сидней. Австралия. 1995 г.) и 12-ом еждународном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотнды и их биологическое ¡пользование" (Ла Хоия, США, 1996 г.).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на /ЗО страницах 1Шинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения :зультатов. экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит icvhk^ и Ш таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основой конструирования ингибиторов для фактора транскрипции NF-kB ■»служил оригинальный подход для региоспецифического ковалентного связывания кросс-линкинга") белка с узнаваемой им последовательностью ДНК, предложенный в Моратории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ в 1990 году, гот подход заключается в использовании ДНК-дуплексов, содержащих в своей -руктуре химически активную тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную

группу (схема 1), способную образовывать ковалентную связь с нуклеофильными группами аминокислотных остатков белков.

Необходимым условием протекания реакции между тризамещенной пирофосфатной межнуклеотидной группой и нуклеофильной группой

белковой молекулы является только пространственная

сближенность реагирующих групп (реакция протекает на нулевом расстоянии реагирующих группировок). Дополнительной активации извне не требуется. Активная группа может быть введена вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной группы в заданное положение углеводофосфатного остова ДНК методом химического лигирования. Она не вносит значительных искажений в структуру ДНК и легко расщепляется под действием нуклеофилов, причем нуклеофильная атака осуществляется по дизамещенному фосфату с одновременным уходом алкилфосфата олигонуклеотида (аниона сильной кислоты).

В настоящем исследовании для конструирования ингибиторов фактора транскрипции NF-кВ в качестве базовых были выбраны ДНК-дуплексы, содержащие в своём составе последовательность из 10 пар нуклеотидов, которая соответствует кВ участку в энхансере легких цепей иммуноглобулинов: 5'-GGGACl 11СС-3'.

В качестве модели фактора транскрипции NF-кВ мы использовали субъединицу р50 NF-кгВ человека, которая в виде димера эффективно связывается с кВ участком. Химерный белок р50 с глютатион-Б-трансферазой (p50-GST) выделяли из культуры клеток E.coli методом аффинной хроматографии на агарозе, содержащей иммобилизованный глютатион. Известно, что GST (26 кДа) существенно • не влияет на способность р50 связываться с ДНК.

I. Выбор структуры ДНК-дуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу, для эффективного ковалентного связывания с фактором транскрипции NF-kB

Целью данного этапа работы являлся выбор структуры тризамещенной пирофосфатной группы и ее положения в ДНК-дуплексе, которые приводят к

о о о

И II II

R,—О-Р-О— R2 R|—О-Р-О-Р-О— R2

О' СН30 О"

природная тризамешенная пирофосфатная

дизамешенная фосфатная межнуклеотидная группа

межнуклеотидная группа

Ri. Rj - олигонуклеотиды Схема 1

ффективному ковалентному связыванию с субъединицей р50 ОТ-кВ, и доказательство

пецифичности реакций ковалентного связывания.

/. /. Синтез ДНК-дуплексов, содержащих тризамещенную пирофосфатную

межнуклеотидную группу

Синтезирована серия модифицированных ДНК-дуплексов с одинаковой [уклеотидной последовательностью, в каждом из которых одна фосфодиэфирная (ежнуклеотидная связь заменена на тризамешенную пирофосфатную межнуклеотидную руппу. Места введения активной группы в структуру ДНК-дуплекса показаны трелками на схсмс 2.

1 2 3 4 5 6 7

5' 3'

А-С-С-Т-С-С-С-А-А-А-С-Т-С-С-С-С-Т-С-Т

С-А-С-С-С-Т-Т-Т-С-А-С-С-С-С-А-С-А В

3' 5'

| АгвЗОз 1 1,^275

(¡т:7з 15141 ! 1

СИпЗОб | 1->ь(44 1 Ту, 57 | [

Суб59

кВ участок

Пхема 2

Выбор положений 1-6 (схема 2) Ш модификации основан на данных эентгеноструктурного анализа

комплекса димера субъединицы р50 ¡\Т-кВ с ДНК-дуплексом, содержащим сВ участок [СИскИ е1 а1., 1995]. Согласно этим данным функциональные группы аминокислотных остатков димера р50 взаимодействуют с межнуклеотидными фосфатными группами в центре кВ участка (схема 3). Положение 7 было выбрано в качестве контроля, так как по данным РСА в данном положении кВ участка межнуклеотидная фосфатная группа не контактирует с функциональными группами аминокислотных остатков белка.

5' С-С-С-А-А-Т-Т-С-С-С • •••••••••

3' С-С-С-Т-Т-Л-А-С-С-С кВ участок

Схема 3

Тризамешенную пирофосфатную межнуклеотидную группу вводили в положенш 1-7 путем химического лигирования под действием 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК) семи пар олигонуклеотидов (а) и (б) на 17-звенной матрице (в) (схема 2). Олигонуклеотиды (а) и (б), образующие дуплекс < одиночным разрывом в положениях 1-7, называли согласно номеру положения мест: разрыва: 1а-7а и 16-76, то есть при лигировании в одиночном разрыве в положении использовали олигонуклеотиды 1а (гептануклеотид) и 16 (додекануклеотид), в разрыве ; - олигонуклеотиды 2а (октануклеотид) и 26 (ундекануклеотид) и т.д.

Тризамешенная пирофосфатная группировка может различаться положением дизамещённой фосфатной группы, входящей в её состав: (А) - дизамещённая фосфатная группа присоединена к 5'-углеродному атому в дезоксирибозе (при этом тризамещённая фосфатная группа присоединена к 3'-углеродному атому) и (Б) - дизамещённая фосфатная группа присоединена к 3'-углеродному атому в дезоксирибозе (схема 4). Свойства тризамешенной пирофосфатной группы типа (А) в составе ДНК-дуплексо уже хорошо изучены в лаборатории Химии нуклеиновых кислот, в то время ка свойства тризамешенной пирофосфатной группы типа (Б) исследованы в настояще работе впервые.

В каждое из семи положений, отмеченных на схеме 2, вводили два тип тризамешенной пирофосфатной группы: (А) и (Б) (схема 4). Полученны модифицированным олигонуклеотидам, содержащим в своей структуре модификаци; типа (А), присвоили номера 1А-7А, а содержащим модификацию типа (Б) - 1Б-7Б, соответствии с номером места введения активной группы в структуру олигонуклеотш (схема 2). При получении олигонуклеотидов 1А-7А в качестве исходных в реакци химического лигирования использовали олигонуклеотиды 1а-7а, содержацп метиловый эфир З'-концсвого фосфата, и 16-76, содержащие 5'-концевой фосфат, при получении олигонуклеотидов 1Б-7Б использовали олигонуклеотиды 1а-7 содержащие З'-концевой фосфат, и 16-76, содержащие метиловый эфир 5'-концево! фосфата. За ходом реакций химического лигирования следили методом гел электрофореза с последующей авторадиографией. 32Р-метку вводили в случ

(а)

А)

У I-

О О (6)

II II

-О-Р-О-Р-О-1

сн3о О" |||||

-1

(В)

5- н

(¡0

Б) ||

° 0 (6)

И II

-О-Р-О-Р-О-1-

О" ОСН, III

Схема 4

олигонуклеотидов 1А-7А на 5'-концы олигонуклеотидов 16-76, а в случае

олигонуклеотидов 1Б-7Б - на 5'-концы олигонуклеотидов 1а-7а. Выходы продуктов лигирования приведены в табл. 1. Полученные 19-звенные олигонуклеотиды 1А-7А и 1Б-7Б отличались по подвижности в теле от 17-звенной матрицы (в). Однотяжевые олигонуклеотиды. содержащие активную группу, выделяли из геля и затем формировали ДНК-дуплекс путём добавления олигонуклеотида (в). ДНК-дуплексам, содержащим в своём составе однотяжевые олигонуклеотиды 1А-7А и 1Б-7Б, присвоили, соответственно, номера 1А^'ПА и 1Б-УПБ.

Таблица 1. Выходы модифицированных олигонуклеотидов 1А-7А и 1Б-7Б

Олигонуклеотид 1А 2А ЗА 4А 5А 6А 7А

Выход, % 25 31 30 10 32 30 20

Олигонуклеотид 1Б 2Б ЗБ 4Б 5Б 6Б 7Б

Выход, % 81 82 79 70 71 72 48

Обнаружено, что выходы олигонуклеотидов IA-7A составляли 20-30%, в то время к ¡ж выходы олигонуклеотидов I Б-7Б - 70-80% Скорость активации карбодиимидом S'il З'-фосфатных групп в разрыве ДНК-дуплекса, по всей видимости, одинакова Увеличение выхода продуктов реакции при введении активной группы типа (Б), вероятно, связано с большей конформационной подвижностью выступающего в данном случае в качестве нуклеофила метилового эфира концевой 5'-фосфатной группы (по сравнению с метиловым эфиром З'-фосфатной группы), что позволяет ему более эффективно реагировать с активированной монозамещённой фосфатной группой при химическом лигированни.

Известно, что тризамешенная пирофосфатная группа расщепляется под действием нуклеофилов в водной среде. Олигонуклеотиды 1А-7А и 1Б-7Б обрабатывали 0.5М раствором пропнлендиамина (ПДА), рН 8.0, в течение 12 часов при 37°С. Показано, что олигонуклеотиды 1А-7А и 1Б-7Б расщепляются при действии ПДА. и, следовательно, содержат в заданном положении активную межнуклеотидную группу.

В структуре тризамешенных пирофосфатных групп типа (А) и (Б) имеется два центра, по которым может протекать нуклеофильная атака и присоединение ПДА. Определение места нуклеофильной атаки проводили на примере модифицированных олигонуклеотидов 6А и 6Б. Чтобы установить, какая фосфатная группа в тризамешенной пирофосфатной группировке подвергается нуклеофильной атаке, 32Р-метку вводили на 5'-конец каждого из лигируемых олигонуклеотидов 6а или 66 в случае

олигонуклеотида 6А и на 5'-конец олигонуклеотида 6а в случае олигонуклеотида 6Б. Олигонуклеотиды 6А и 6Б обрабатывали ПДА и по изменению подвижности в геле продуктов реакции по сравнению с исходными соединениями определяли, к какому из олигонуклеотидов 6а или 6б присоединялся ПДА. Было установлено, что при обработке ПДА расщепление олигонуклеотидов 6А и 6Б протекает по приведенной ниже схеме:

oj

<s»>

—О-Р—О—Р-О-I I

OCHj О"

(6A)

о

—О— l'—О"

(66)

H;N-(CH2)J-NH-P-0-О'

HpN-tCll|)»-MI,

о

-О- Р—о— Р-О—-I I

О'

ОС Hi

(6Б)

(6а)

О

-P-HN—(CHj)J-NH2 О"

0

II

О-Р-0

1

ОСИ,

(66)

Таким образом, нуклеофильная атака и присоединение ПДА происходит по дизамещенной фосфатной группе в тризамещенной пирофосфатной группировке. Полученные результаты согласуются с данными о свойствах ДНК-дуплексов, содержащих тризамешённую пирофосфатную группу типа (А), полученными ранее.

Степень расщепления олигонуклеотидов нуклеофильными реагентами оценивали по отношению радиоактивности продуктов реакции к общей радиоактивности всех компонентов реакционной смеси. Оказалось, что степени расщепления олигонуклеотидов, содержащих тризамещённую пирофосфатную группу типа (А) и (Б), под действием ПДА одинаковы (95%). Это говорит об одинаковой реакционной способности исследованных групп по отношению к низкомолекулярным нуклеофилам в растворе. Обнаружено также, что степени расщепления однотяжевых олигонуклеотидов 6А, 6Б и этих олигонуклеотидов в составе ДНК-дуплексов VIA и VIB под действием ПДА практически одинаковы (95 и 91%). Это свидетельствует о сходной реакционной способности тризамещенных пирофосфатных групп типа (А) и (Б) в составе однотяжевого олигонуклеотида и в составе ДНК-дуплекса при аминолизе под действием ПДА.

1.2. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих тризамещенпую пирофосфатную

межнуклеотидную группу, с димером субъединицы р50 фактора транскрипции

ЯУ-кВ_________________________________________________

Способность ДНК-дуплексов 1А-УПА л 1Б-\Т(Б образовывать комплекс с димером 50-ОЯТ анализировали методом "торможения в геле" в неденатурирующих условиях. 1редварительно к 32Р-меченным ДНК-дуплексам добавляли избыток рЗО-вБТ и нкубировали реакционные смеси в течение 30 мин. при 20°С в буфере А (7.5 мМ ТЕРЕЯ. 34 мМ ЫаС1. I мМ МёС12, 0.5 мМ дитиотреитол, 0.05 мМ ЕБТА и 25% лицерин), рН 8.0. Комплекс ДНК-белок имеет меньшую подвижность в геле, чем [есвязанный с белком ДНК-дуплекс. Было установлено, что ДНК-дуплексы 1А-УПА и Б-УИБ связываются с димером р50-СБТ (рис.1).

Рис. 1. Радиоавтограф 6%-ного ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях

реакционных смесей, содержащих рбО-СЭТ и модифицированные ДНК-дуплексы: 1А-УПА, (дорожки 28) и 1БЛ/ИБ (дорожки 9-15). дорожка 1 - ^модифицированный ДНК-дуплекс, содержащий кВ участок.

Реакцию копалснтного связывания модифицированных дуплексов 1А-\Т1А и 1Б-711Б с р50-С5Т проводили в буфере А в течение 12 часов при 20°С. В качестве примера |а схеме 5 приведена реакция ковалентного связывания ДНК-дуплекса 1ПА с рЗО-вБТ ля случая, когда нуклеофильной группой белка, взаимодействующей с активной руппой в ДНК, является г-аминогруппа лизина.

рЗО-СЭТ

1ЧН1

5' АССТСССАД—° г-"-г'"-АСТССССТСТ т

.......СИ,О о- ..........

з- САСССТТ----ТСАСС-ОСАС-А 5'

(дуплекс ИГА)

(6а)

(66)

>' I

5' АССТСССАА-о-ро" +

.......С1150

3' САСССТТТСАССССАСА 5' (>)

Схема 5

р50-сзт -нн-^-о—ДОТССССТСТ з о-

Реакционные смеси разделяли в 12%-ном ПААГ, содержащем SDS. Для разрушения нековалентных ДНК-белковых комплексов перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 10 мин. при 95°С в денатурирующем буфере (0.06М Трис, 7М мочевина, 0.1% глицерин, 2% SDS и 0.05% p-меркаптоэтанол), рН 6.8. В контрольных экспериментах (рис. 2) было показано, что в данных условиях нековалентный комплекс белка с немодифицированным олигонуклеотидом разрушается. В экспериментах по ковалентному связыванию 32Р-метку вводили на 5'-концы олигонуклеотидов 16-76, входящих в состав олигонуклеотидов 1А-7А, или на 5'-концы олигонуклеотидов 1а-7а, входящих в состав олигонуклеотидов 1Б-7Б, так как в ходе реакций именно эти олигонуклеотиды должны присоединяться к белку. Положение олигонуклеотида в геле определяли методом авторадиографии, а затем для определения положения белка тот же гель прокрашивали Кумасси G-250. За эффективность ковалентного связывания принимали отношение радиоактивности олигонуклеотида, связавшегося с белком, к суммарной радиоактивности исходного олигонуклеотида и продукта реакции. Белок p50-GST брали в избытке по отношению к ДНК-дуплексу.

Кинетику реакции ковалентного связывания исследовали на примере взаимодействия модифицированного ДНК-дуплекса VIA с p50-GST. Установлено, что за 12 часов инкубации происходит накопление значительного количества ковалентно связанного ДНК-белкового комплекса, и более длительное время реакции не приводит к существенному увеличению эффективности ковалентного связывания.

Данные по эффективности ковалентного связывания дуплексов IA-V1IA и IB-VIIB с белком приведены на рис. 2 и в табл. 2. Для дуплексов IА-VIIА эффективность ковалентного связывания с белком зависит от положения активной группы в углеводофосфатном остове ДНК. Ковалентное присоединение p50-GST к соответствующим олигонуклеотидам в дуплексах IB-VIIB протекает с низкой эффективностью независимо or места введения модификации (табл. 2). Это свидетельствует о низкой реакционной способности тризамещенной пирофосфатной межнуклеотидной группы в дуплексах IB-VIIB, что, вероятно, обусловлено пространственной структурой активной группы типа (Б) в составе ДНК-дуплекса. В данном случае атака нуклеофильной группы белка должна быть направлена по дизамещенной фосфатной группе, присоединенной к З'-атому углерода остатка дезоксирибозы олигонуклеотида (а) (схема 4). Положение в пространстве данной фосфатной группы таково, что для протекания реакции с белком нуклеофильная атака

- и -

олжна осуществляться практически параллельно углевояофосфатному остову двойной пирали, что может быть затруднено в ДНК-белковом комплексе. Кроме этого в анном случае пространственно затруднено формирование переходного состояния -бразование тригональной бипирамиды, где в аксиальное положение должна попасть уклеофильная группа белка. Жесткое закрепление в пространстве углеводного остатка, З'-углеродному атому которого присоединена атакуемая фосфатная группа, видимо, евыгодно для образования переходного состояния, в результате которого может еализоваться уход одного олигонуклеотида и ковалентное связывание другого с елком.

'ис. 2. Радиоавтограф 12%-ного 1ААГ после электрофореза родуктов реакций ковалентного вязывания P50-GST с

юдифицированными дуплексами: (А Юрожка 3), ПА (4), IIIA (5), IVA (6), А (7), VIA (8). VIIА (9); дорожка 1 -энтрольный немодифицированный уплекс, содержащий кВ участок, орожка 2 - контрольный юдифицированный дуплекс,

одержащий тризамещенную

ирофосфатную межнуклеотидную эуппу, но не содержащий кВ частка.

аблица 2. Эффективность ковалентного связывания олигонуклеотидов, входящих в состав юдифицированных дуплексов IA-VIIA и 1Б-У11Б, с p50-GST

Олигонуклеотидный дуплекс (А IIA IIIA IVA VA VIA VIIA

Эффективность связывания с p50-GST, % 1 1 50 30 15 35 2

Олигонуклеотидный дуплекс 1Б IIB ШБ IVB VB VIB VIIB

Эффективность связывания с pSO'GST. % 1 5 1 5 I 5 10

Для доказательства специфичности реакций ковалентного связывания юдифицированных ДНК-дуплексов 1А-УПА и 1Б-УПБ с рбО-СБТ был использован ЩК-дуплекс, который не содержит кВ участка, но имеет в своей структуре активную ризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу. Показано, что при [нкубации этого дуплекса с рЗО-СБТ в течение 12 ч. при 20°С в буфере А ковалентного вязывания практически не наблюдается (эффективность менее 1%, рис. 2).

1 2 3 4 ) 6 7 8 9

к8 участок

к В участок

5' acaagggactttccgctggggactttccaggg зу tttgttccctgaaaggcgÁcccctgaaaggtccc 5

viii

5' gatgctgccaacctggctctagcttcatac 3' 3' ctacgacggttggaccgagatcgaagtatg 5' ix

Для модифицированного дуплекса VIA исследована реакция ковалентного

связывания с p50-GST в присутствии возрастающих концентраций немодифици-рованных ДНК-дуплексов VIII и IX, первый из которых содержит два кВ участка, а второй не содержит кВ участков. Как видно из рис. 3, ковалентное присоединение олигонуклеотида в дуплексе VIA к белку ингибируется избытком дуплекса VIII. Очевидно, что происходит вытеснение дуплекса VIA из центра связывания белка, что делает невозможным протекание реакции ковалентного присоединения. В присутствии дуплекса IX наблюдается тенденция к незначительному снижению эффективности ковалентного связывания, которую можно объяснить небольшим сродством димера p50-GST к ДНК случайной последовательности.

Рис. 3. Зависимость эффективности ковалентного связывания дуплекса VIA с p50-GST от соотношения концентраций дуплекса VIII (кривая 1) или IX (кривая 2) и дуплекса VIA. Концентрация дуплекса VIA -50 нМ. Концентрация p50-GST - 6 мкМ.

ДНК-дуплекс ША, который ковалентно связывается с p50-GST с наибольшей эффективностью, специфично взаимодействует с p50-GST в присутствии всех белков, полученных в результате лизиса клеток E.coli под действием ультразвука. Это является ещё одним доказательством специфичности реакций ковалентного связывания модифицированных ДНК-дуплексов с p50-GST (рис. 4).

. ~ л г Рис. 4. Взаимодействие модифи-

1 — -J ^ цированного ДНК-дуплекса II1A с р50-

47 4__111111 GST в лизате клеток E.coli. Дорожки

66.2_ " ~ ^^ДЩ^жйя-pSO-CST 1-3 - 12%-ный ПААГ, после

" 55 -----^------|ММ *5j|f---------------(76 кД:й электрофореза продуктов _реакции

_ ^ ХШрэт ковалентного связывания дуплекса

40 - ■»»*» ША с p50-GST, прокрашенный

__11 Кумасси G-250: ) - маркеры

Biff- молекулярной массы белков, 2 -

.»•ЯШ* продукты взаимодействия дуплекса

■м ___ША с p50-GST; 3 - продукты

f^jif взаимодействия дуплекса IIIA с р50-

¡4.4— в лизате клеток E.coli. Дорожки

4-5 - радиоавтограф 12%-ного ПААГ после электрофореза продуктов реакций ковалентного связывания

дуплекса ША с p50-GST: 4 - продукты взаимодействия дуплекса И!А с p50-GST; 5 - продукты взаимодействия дуплекса IIIA с p50-GST в лизате клеток E.coli. Слева на рисунке показан молекулярный вес белков-маркеров (в кДа).

Следовательно, в качестве ингибиторов NF-кВ наиболее целесообразно использовать ДНК-дуплексы, содержащие в своей структуре тризамещенную пирофосфатную группировку, в которой дизамешённая фосфатная группа

присоединена к 5'-углеродному атому в остатке дезоксирибозм ( тип (А), схема 4). Установлено, что наличие активной группы этого типа в 3. 4. 5 и 6 положениях кВ участка (схема 2) приводит к эффективному ковалентному связыванию модифицированных ДНК-дуплексов с белком. Тот факт, что ДНК-дуплекс, содержании'! активную группу, специфично реагировал только с p50-GST в присутствии исеч белков E.coli, полученных в результате лизиса клеток под действием ультразвука, говорит о высокой субстратной специфичности данных реагентов и, следовательно, о перспективности их использования в качестве ингибиторов ДНК-узнающих белков.

II. Структурно-функциональные аспекты ДНК-белковых взаимодействий в комплексе субъединицы р50 NF-кВ с ДНК

Для изучения реакционной способности боковых цепей аминокислот по отношению к ДНК-дуплексам, содержащим тризамещенную пирофосфатную межнуклеотидную группу, были использованы модельные соединения, содержащие функциональные группы боковых цепей аминокислотных остатков белка, которые потенциально могут взаимодействовать с активной группой.

Модифицированный ДНК-дуплекс VIA вводили в реакцию с модельными соединениями в условиях, использованных для ковалентного связывания модифицированных ДНК-дуплексов с p50-GST, но в отсутствие p50-GST. В качестве

модельных соединений использовали ПДА (содержащий функциональную группу боковой цепи аминокислотного остатка Lys), имидазол (His), этилгуанидин (Axg), дитиотреитол (Cys), я-крезол (Туг), этанол (Ser и Thr), ацетамид (Asn и Gin) и уксусную кислоту (Asp и Glu).

Только пропилендиамин и имидазол взаимодействуют с активной группой в дуплексе VIA в условиях реакции ковалентного связывания (рис. 5). В ходе данных реакций происходит расщепление активной группировки в составе олигонуклеотида 6А и образуется олигонуклеотид 6а, содержащий метиловый эфир З'-концевой фосфатной группы, и олигонуклеотид 66, к 5'-концевой фосфатной группе которого присоединён ПДА или имидазол. Структуру получившихся конъюгатов олигонуклеотида 66 с ПДА или имидазолом доказывали с помощью их встречного синтеза путем присоединения ПДА или имидазола по концевой фосфатной группе олигонуклеотида 66 с помощью конденсации под действием ЭДК и последующим сравнением электрофоретической подвижности этих соединений. На основании полученных данных можно сделать предположение, что в ходе реакций ковалентного связывания модифицированных ДНК-дуплексов с p50-GST с активной группой в составе ДНК-дуплексов вероятнее всего реагируют функциональные группы боковых цепей аминокислотных остатков лизина и гистидина. Следовательно, в получаемом ковалентно связанном ДНК-белковом комплексе должна быть фосфоамидная связь между концевой фосфатной группой олигонуклеотида и остатком лизина или гистидина. Из проведенного исследования следует, что остаток аргинина не взаимодействует с тризамещенной пирофосфатной группой в структуре ДНК-дуплекса. Это находится в полном соответствии с литературными данными о реакционной способности остатков аргинина в структуре белков.

I 2345678 9 Рис" 5" Радиоавтограф электро-

форетического разделения в 20%-ном

,_ожонуклсош 6А ПААГ ПР°ДУ|<Т0В Реакций после обработки

модифицированного дуплекса VIA модельными соединениями: дорожка 2 -этанолом, 3 - пропилендиамином, 4 -имидазолом, 5 - этилгуанидином, 6 -п-крезолом, 7 - дитиотреитолом, 8 -уксусной кислотой, 9 - ацетамидом, дорожка 1 - исходный олигонуклеотид 6А.

В 1965 году З.А. Шабаровой и соавт. было показано, что фосфоамидная связь специфично

расщепляется при обработке 4М NH2OH (рН 5.0) или 0.1М НС1 [Shabarova et al., 1970;

Рябова и соавт., 1965]. Обнаружено, что полученные в ходе реакций ДНК-дуплексов ША, IVA, VA и VIA с p50-GST ковалентно связанные ДНК-белковые комплексы расщепляются в указанных условиях (рис. 6). Этот результат подтверждает предположение о том, что с активной группой в составе ДНК-дуплексов реагируют функциональные группы боковых цепей остатков лизина или гистидина. Согласно литературным данным о свойствах N-фосфатов имидазола, фосфоамидная связь между олигонуклеотидом и белком, которая образуется при взаимодействии имино-группы боковой цепи имидазольного кольца гистидина с тризамещенной пирофосфатной группой, не очень устойчива и может частично разрушаться в ходе анализа продуктов реакции (нагревание перед нанесением в гель в денатурирующем буфере при рН 6.8, электрофорез), что может приводить к уменьшению наблюдаемого выхода ковалентно связанного ДНК-белкового комплекса.

L 2 3 4 5 6 7 8

«я» tes

Ковалентно связанным

комплекс ДНК-Г.Р.1()К

Рис. 6. Радиоавтограф 12%-ного ПМГ после

электрофореза продуктов

обработки 4M NH2OH при pH 5.0 ковалентно связанных ДНК-белковых комплексов,

полученных в ходе реакции модифицированных ДНК-

дуплексов IIIA, IVA, VA и VIA с p50-GST: дорожки 1,3,5,7 -контрольные реакционные

смеси после взаимодействия модифицированных ДНК-

дуплексоа IIIA, IVA, VA и VIA с P50-GST, дорожки 2,4,6,8 ■ продукты обработки 4M NH2OH при рН 5.0 реакционных смесей

после взаимодействия модифицированных ДНК-дуплексов IIIA, IVA, VA и VIA с p50-GST.

Представляет интерес сравнение полученных нами результатов по ковалентному связыванию p50-GST с ДНК-дуплексами, содержащими тризэмещенную пирофосфатную группу с данными рентгеноструктурного анализа (РСА), таблица 3. Результаты настоящей работы, по нашему мнению, лучше сравнивать с данными работы [Chosh et al., 1995], где использован ДНК-дуплекс, структура которого сходна со структурой ДНК-дуплекса, исследованного в настоящей работе. Для ДНК-дуплексов IA и VIIA, содержащих активную группу в положениях 1 и 7 кВ участка, обнаружена очень низкая эффективность ковалентного связывания с p50-GST (примерно 1%), что согласуется с данными РСА. Согласно РСА, с фосфатной группой в положении 1

взаимодействует гуанидиновая группа боковой цепи А^308, а с фосфатной группой в положении 7 не обнаружено контактов аминокислотных остатков димера р50.

Таблица 3. Сравнение эффективности ковалентного связывания модифицированных олигонукпеотидных дуплексов 1А-\/11А с рбО-вЙТ с данными РСА по расположению контактов ДНК с аминокислотными остатками белка в комплексе димера субъединицы р50 ЫР-кВ с ДНК*

Положение в кВ участке (схема 3) 1 2 3 4 5 6 7

Эффективность ковалентного связывания, % 1 1 50 30 15 35 1

Данные РСА для димера р50 мыши в комплексе с ДНК [ОккН ег а1., 1995] Arg308 Lys278 Gln309 Gln277 Lysl47 Hisl44 ТугбО Lysl47NH Lys148 Cys62 -

Данные РСА для димера р50 человека в комплексе с ДНК (МиНеге! а!.. 1995] Arg308 Lys278 Aig308 Lys275 Gln309 Gln277 Lys147 His 144 ТугбО Lysl47NH - -

* Lys147NH означает, что в образовании водородной связи принимает участие а-аминогруппа Lys147, вовлеченная в формирование пептидной связи. Учитывая гомологию полипептидных последовательностей белков р50 человека и мыши, номера аминокислотных остатков в белке р50 мыши для удобства сравнения заменены на соответствующие им номера в белке р50 человека.

Высокая эффективность ковалентного связывания дуплексов IVA и VIA, содержащих активную группу в положениях 4 и 6 кВ участка, (30% и 35% соответственно) с p50-GST позволяет предположить наличие контактов межнуклеотидных фосфатных групп в этих положениях с нуклеофильными группами боковых цепей аминокислотных остатков белка. Согласно данным РСА, фосфатная группа в положении 4 взаимодействует с аминогруппой боковой цепи Lys 147, а в положении 6 - с функциональными группами боковых цепей Lys 148 и Cys62. Из проведённых экспериментов с модельными соединениями и доказательства фосфоамидной природы связи в ДНК-белковых конъюгатах следует, что, скорее всего, с фосфатными группами в этих положениях взаимодействуют остатки лизина.

Эффективность ковалентного связывания p50-GST с ДНК-дуплексом VA, содержащим активную группу в положении 5 кВ участка, равна 15%. По данным РСА с межнуклеотидной фосфатной группой в этом положении участка узнавания взаимодействуют функциональные группы боковых цепей ТугбО и Hisl44, а также NH-группа пептидной связи, образованной Lysl47. Как уже обсуждалось выше, функциональная группа боковой цепи гистидина способна взаимодействовать с активной группой в ДНК. Эффективность ковалентного связывания, равная 15%,

жет быть вызвана частичным расщеплением связи в ДНК-белковом конъюгате в ходе шиза продуктов реакции.

Совпадение результатов ковалентного связывания ДНК-белок для дуплексов, 1ержаших активные группы в положениях 1, 4, 5, 6 и 7 кВ участка, с данными РСА <о иллюстрирует возможности метода ковалентного связывания по определению мест ^тактов нуклсофильных групп аминокислотных остатков белка с межнуклеотидными сфатными группами в ДНК.

Интересно, что олигонуклеотид в дуплексе IIA, содержащий активную группу в пожение 2 к В участка, реагировал с p50-GST с низкой эффективностью (менее 1 %). то же время, олигонуклеотид в дуплексе 111А эффективно реагировал с белком эфективность связывания 50%). Это не согласуется с данными РСА, согласно горым с межнуклеотидной фосфатной группой в положении 2 кВ участка шмодействует аминогруппа боковой цепи Lys278, способная реагировать с «амещенной пирофосфатной группой, а в положении 3 - функциональные группы ковых цепей Gln274 и Gln307, амидные группы которых в реакцию с тризамещенной рофосфатной группой не вступают. Следовательно, можно предположить отсутствие нтакта аминогруппы боковой цепи лизина p50-GST с фосфатной группой н ложении 2 кВ участка и его наличие в положении 3 вопреки данным РСА. Возможно, лученное несоответствие связано с незначительным отличием структур :сматриваемых кВ участков, что согласуется с гипотезой о зависимости положении нтактов белка с фосфатными группами ДНК от выбранной нуклеотидной следовательности кВ участка [Muller et а!.. 1996].

Тот факт, что в данном исследовании обнаружено не только совпадение 1ультатов РСА и метода ковалентного связывания, но и получены новые данные, зорит о возможности применения метода ковалентного связывания в качестве полнения к методу РСА в случаях, когда имеются спорные моменты в интерпретации зультато».

Следует заметить также, что метод РСА имеет ряд ограничений - различие данных конформации макромолекул в растворе и в кристалле, необходимость наличия льши.х количеств белка, проблемы с кристаллизацией и сложность получения ецифических комплексов с ДНК. В связи с этим настоящее исследование едставляет интерес, так как позволяет охарактеризовать структуру ДНК-белкового мплекса в условиях, близких к физиологическим.

III. ДНК-дуплексы, содержащие химически активную ацилфосфатную межнуклеотидную группу, - новые реагенты для ковалентного связывания с белками

В 1991 году в лаборатории Химии нуклеиновых кислот был разработан метод получения ДНК-дуплексов, содержащих в заданном положении углеводофосфатного остова вместо природной фосфодиэфирной химически активную ацилфосфатную межнуклеотидную группу.

В настоящей работе получен ДНК-дуплекс, содержащий ацилфосфатную межнуклеотидную группу в составе кВ участка, и показано, что он способен взаимодействовать с субъединицей р50 NF-кВ с образованием ковалентно связанного ДНК-белкового комплекса.

Ацилфосфатную межнуклеотидную группу вводили в положение 6 кВ участка в ДНК-дуплексе, приведённом на схеме 2. Для введения ацилфосфатной межнуклеотидной группы использовали метод химического лигирования олигонуклеотидов 6а и 66 на матрице (в). При этом олигонуклеотид 6а содержал концевую карбоксильную группу, а 66 - концевую фосфатную группу. Концевую карбоксильную группу вводили в олигонуклеотид 6а путем присоединения глицина по концевому фосфату с использованием метода предварительной активации фосфатной группы N-оксибензотриазолом (Ивановская и соавт., 1987].

Установлено, что обработка раствором ПДА приводит к расщеплению олигонуклеотида 6В, содержащего ацилфосфатную межнуклеотидную группу, причем атака аминогруппой и присоединение ПДА протекает только по карбонильному атому углерода в ацилфосфатной группе:

•Nlll

<sJ

<fa> ff

-O-P-NH-CHj-C-HN— <CH2b-NH.

-O-P-NH-CH.-C-O— P-O- 3' ---„

L'L [?

HO-P-O-

о О'

<6в) 6

Для изучения взаимодействия с рбО-СБТ использовали ДНК-дуплекс У1В, который формировали из олигонуклеотида 6В и комплементарного ему олигонуклеотида (в). Методом "торможения в геле" показано, что дуплекс У1В образует комплекс с димером р50-СБТ. То есть наличие модифицированной межнуклеотидной группы существеннс не влияет на способность дуплекса У1В связываться с белком.

о

>ис. 7. Радиоавтограф 12%-ного ПААГ после (лектрофореза продуктов реакций ковалентного

¡вязывания дуплекса VIB с p50-GST. Дорожка 1 -^модифицированный дуплекс, содержащий кВ Участок, после инкубации в условиях реакции

говалентного связывания с p50-GST; дорожка 2-1родукты реакции дуплекса VÍB с p50-GST.

Ковалентное связывание дуплекса V1B с 35Q-GST и анализ продуктов реакции проводили гакже, как в случае ковалентного связывания ДНК-хуплексов, содержащих тризамещенную 1ирофосфатиую группу. 32 Р^ метку вводили по 5'-кониу олигонуклеотида 6а, так как из данных по изучению свойств ацилфосфатной группы следует, что в ходе реакции ковалентного связывания к белку присоединяется олигонуклеотид, содержащий карбоксильную группу. Эффективность ковалентного связывания с белком дуплекса VIB составила 10% (рис. 7). Тем не менее, это первый пример использования ДНК-дуплексов с активными межнуклеотидными группами, являющимися ацилирующими агентами для ковалентного связывания с белками.

IV. ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями - потенциальные реагенты для обратимого ингибирования фактора транскрипции NF-kB

В настоящее время очевидно, что олнгонуклеотидные дуплексы с ковалентно связанными концами являются перспективными соединениями для направленного обратимого ингибирования ДНК-узнаюших белков in vivo. Ковалентное соединение цепей приводит к увеличению устойчивости дуплексов к действию экзонуклеаз и. следовательно, к увеличению "времени жизни" дуплекса в клетке; предотвращает его диссоциацию, происходящую до взаимодействия с белком. Это может позволить существенно повысить эффективность ингибируюшей способности подобных ДНК-дуплексов в клетке при их терапевтическом применении.

Нами предложен метод получения олигонуклеотидного дуплекса, концы которого ковалентно связаны, путем постсинтетической модификации. Основная идея подхода заключается в использовании мостикового соединения для связывания сближенных в пространстве З'-концевой группы одного олигонуклеотида и 5'-фосфатной группы комплементарного ему олигонуклеотида в ДНК-дуплексе. В качестве мостиковых использовали соединения: этилендиамин, гексаметилендиамин, октаметилендиамин,

антибиотики ристомицин А, содержащий две аминогруппы, и полимиксин М, содержащий пять аминогрупп. В качестве конденсирующего агента использовали ЭДК.

Предложено два пути получения ковалентно связанного олигонуклеотидного дуплекса: двустадийный, в котором на первой стадии мостиковое соединение (линкер) присоединяется к одному из олигонуклеотидов, а на второй формируется дуплекс и проводится конденсация с фосфатом второго олигонуклеотида под действием ЭДК, и одностадийный, заключающийся в том, что сначала формируется олигонуклеотидный дуплекс и затем добавляется мостиковое соединение, содержащее по крайней мере две аминогруппы, и ЭДК, что позволяет связать в одну стадию антипараллельные цепи в дуплексе.

Показано, что для получения ковалентно связанного по концевым участкам дуплекса наиболее простым и удобным является одностадийный метод, в котором связываемые олигонуклеотиды несут концевые 3'- и 5'-фосфатные группы, один из олигонуклеотидов содержит три выступающих нуклеотидных остатка на 5'-конце и в качестве мостиковой молекулы используется полимиксин М (схема 6). Выход ковалентно связанного ДНК-дуплекса практически не различался для одностадийной и двустадийной схем синтеза и составил при использовании в качестве мостикового соединения полимиксина М 30%, в то время как в случаях использования других мостиковых соединений не превысил 5%.

Наличие фосфоамидной связи в дуплексе X (схема 6) подтверждали кислотным гидролизом. Дуплекс X обрабатывали 80%-ной уксусной кислотой в течение 4 ч. при 37°С. В этих условиях наблюдали гидролиз данного соединения до исходных олигонуклеотидов. Подтверждением структуры дуплекса X является также изменение его термической устойчивости по сравнению с несвязанным ДНК-дуплексом. Температура плавления дуплекса. X оказалась равной 82°С, что на 17°С выше температуры плавления несвязанного дуплекса.

к В участок ;.............................О

5' АСАССССАСТТТСССАС-о-р-он

11111111111111111 О' о 3- ТСТССССТСАААСССТСССА-о-р-он .............................О"

I Полни»».

«■»ЛИ

5

ЭДК

Г АСАСОССАСТТТСССАС -О-Р-РШ-

II I I I II II I I I I I II I О- о

3- ТСТССССТСАААСССТСССА-О-Р-ИИ

О'

дуплекс X

Схема 6

Обнаружено, что дуплекс X не гидролизуется фосфодиэстеразой змеиного яда за 1

1С при 54сС, в то время как контрольный несвязанный дуплекс в этих условиях элностью расщеплялся до нуклеотидов.

Способность ДНК-дуплексов образовывать комплекс с димером рЗО-СЭТ чализировали методом "торможения в геле" в неденатурируюших условиях, рисутствие молекулы полимиксина М практически не влияет на узнавание дуплекса имером белка р50-05Т. Устойчивость дуплекса X к действию нуклеаз и их овышенная термическая стабильность позволяют сделать предположение о том, что одобные соединения могут быть использованы для направленного регулирования стивностн факторов транскрипции в клетке.

V. Выбор оптимальной структуры ингибитора для фактора транскрипции М^-кВ на основе ДНК-дуплекса

На основании полученных нами результатов и литературных данных можно редложить оптимальную к настоящему времени конструкцию ДНК-дуплекса для })фективного ингибирования фактора транскрипции ИР-кВ:

0 0

Сстссрлл-о-р-о-^-о—астсссстст\

¡МИМ ОСИ) О" ; I

слосетт-тслсссслсл^/

к В участок

Такой ДНК-дуплекс должен содержать тризамешенную пирофосфатную группу в оложении 3 к В участка (схема 2), так как введение активной группы в это положение риводит к максимальной эффективности ковалентного связывания с субъединицей р50 Для обеспечения высокой термической стабильности и устойчивости к уклеазному гидролизу комплементарные цепи в дуплексе должны быть соединены с омощью ненуклеотидной последовательности (мостика из триэтиленгликоля, остатка олимиксина М или других соединений, которые могут способствовать проникновению аких дуплексов в клетку).

ВЫВОДЫ

1. Синтезирована серия модифицированных ДНК-дуплексов одинаковой первичной структуры, но различающихся положением химически активной тризамещенной пирофосфатной межнуклеотидной группы в одной из цепей участка узнавания фактора транскрипции ОТ-кВ, а также ориентацией активной группы относительно 5' и З'-положений в модифицированной цепи дуплексов. Установлено, что химические свойства и реакционная способность данной активной группы по отношению к низкомолекулярным нуклеофилам не зависит от ее ориентации. Наличие модифицированной межнуклеотидной группы в структуре полученных дуплексов не препятствует образованию их специфичного комплекса с субъединицей р50 фактора транскрипции КР-кВ.

2. Определены четыре положения в углеводофосфатном остове кВ участка ДНК-дуплекса, введение в которые тризамещенной пирофосфатной группы, содержащей дизамещенный фосфат присоединенный к 5'-атому углерода дезоксирибозы, приводит к эффективному специфичному ковалентному связыванию субъединицы р50 ИИ-кВ.

3. Установлено, что ДНК-дуплексы, содержащие активную группу, в которой дизамещенный фосфат присоединен к З'-атому углерода дезоксирибозы, не способны ковалентно связываться с р50 ЫР-кВ, независимо от положения активной группы в кВ участке.

4. Проведено сравнение полученных результатов по эффективности ковалентного связывания ДНК-дуплексов, содержащих тризамещённую пирофосфатную группу в различных положениях кВ участка, с р50 ^-кВ и данных РСА по контактам аминокислотных остатков белка р50 с фосфатными группами кВ участка и обнаружена их относительная корреляция.

5. Получен ДНК-дуплекс, содержащий химически активную ацилфосфатную межнуклеотидную группу, и показано, что этот дуплекс способен ковалентно связываться с субъединицей р50 ЬТ-кВ.

6. Предложена реакция ковалентного связывания антипараллельных цепей ДНК-дуплекса, содержащего кВ участок, с помощью антибиотика полимиксина М. Результатом такой модификации ДНК-дуплекса является повышение его термической стабильности и устойчивости к действию нуклеаз при сохранении способности образовывать специфичный комплекс с субъединицей р50 ЫИ-кВ.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

Козлов И.А., Ивановская М.Г., Кубарева Е.А., Волков Е.М., Шабарова ЗА. Синтез и свойства ковалентно связанного ДНК-дуплекса, содержащего участок^ узнавания фактора транскрипции NF-кВ. Молекулярная биология, 1996, том 30, № 4, с. 852-863.

Козлов И.А., Ивановская М.Г., Кубарева Е.А., Шабарова ЗА. Определение положения контактов фактора транскрипции N'FkB с ДНК методом региоселективного ковален того связывания. Молекулярная биология. 1997, том 31, № 1, с. 65-75.

Ивановская М.Г., Козлов И.А., Нарышкин Н.А., Шабарова З.А. Новый подход к проблеме иммобилизации олигонуклеотидов на карбоксилсодержаших нейлоновых мембранах для гибридизации с нуклеиновыми кислотами. Биоорганическая, химия, 1995, том 21, №7, с. 535-538.

Ivanovskaya M.G., Naryshkin N.A., Kozlov I.A., Kuznetsova S.A., Shabarova Z.A. A novel approach to oligonucleotide reagents design for "sense" biotechnology. Miami

Bio/Technology European symposium "Advances in gene technology: Molecular biology of human genetic disease", Monte Carlo (Monaco) 17-20 November. 1994. Short reports. 5, p. SU45a (suppl).

Kozlov 1.А., Ivanovskaya M.G., Kubareva E.A., Shabarova Z.A. Introduction of interstrand covalent crosslink into DNA duplex for interaction with transcription factor NF-кВ. 7th Congress of tiie federation of Asian and Oceanian biochemists and molecular biologists, Sydney (Australia), 24-29 September, 1995, V.27, № 2-74.

Shabarova Z.A., Kuznetsova S.A., Kozlov I.A., Kanevsky I.E., Ivanovskaya M.G.. Kubareva E.A., Blumenfeld M., Vasseur M. Activated DNA-duplex binding and covalent cross-linking to transcription factors. XII International Roundtable: nucleosides, nucleotides and their biological applications. "Making drugs out of nucleosides and oligonucleotides", La Jolla (USA), 15-19 September, 1996, p. 247.

Ивановская М.Г., Козлов И.А., Кубарева E.A., Таран Е.А., Серазев Т.В., Шабарова З.А. ДНК-дуплексы, содержащие активные межнуклеотидные группы, применяемые для эффективного ковалентною связывания фактора транскрипции NF-кВ. Молекулярная биология, 1997, в печати.