Синтез модифицированных по углеводному фрагменту олигодезоксирибонуклеотидов и получение на их основе ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

-О ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.963.32 577.113.4

АНЦЫПОВИЧ СЕРГЕЙ ИГОРЕВИЧ

СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПО УГЛЕВОДНОМУ ФРАГМЕНТУ 0ЛИГ0ДЕ30КСИРИБ0НУКЛЕ0ТИД0В И ПОЛУЧЕНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДНК-ДУПЛЕКСОВ С КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННЫМИ ЦЕПЯМИ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ

доктор химических наук, профессор З.А. ШАБАРОВА

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Т.С. ОРЕЦКАЯ

доктор химических наук, профессор Э.Е. НИФАНТЬЕВ

доктор химических наук С.Н. МИХАЙЛОВ

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится 26 ноября 1996 года в 17 часов на заседании Диссертационного Совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 24 " октября 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Научные руководите/не

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы модифицированные олигонуклеотиды находят применение для изучения механизмов действия ферментов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, закономерностей НК-белкового узнавания, для создания новых терапевтических средств. Наряду с такими физико-химическими методами исследования, как рентгеноструктурный анализ, двумерный ЯМР и масс-спектрометрня, все более широкое распространение приобретает органохимический подход, связанный с использованием модифицированных олигонуклеотидов для изучения механизмов взаимодействия белков с ДНК. Направленное изменение химической структуры ДНК в белково-нуклеиновых комплексах и изучение свойств сконструированных систем дает возможность получить информацию о пространственном строении таких комплексов и природе ДНК-белковых контактов. Актуальной задачей является создание модифицированных олигонуклеотидов, обладающих полезными свойствами, такими как устойчивость к нуклеазной деградации, повышенная термодинамическая стабильность, способность к проникновению через клеточные мембраны и к ковалентному связыванию с молекулами ДНК и белков.

Одним из перспективных типов производных на основе модифицированных олигонуклеотидов являются ДНК-дуплексы, тяжи которых соединены между собой ковалентными связями. Такие соединения могут найти применение для изучения белков взаимодействующих с НК, например для исследований функционирования ферментов, участвующих в экспрессии генетического материала клетки. Так, если механизм действия фермента связан с расплетанием двойной спирали ДНК, то связи между цепями будут препятствовать такому расплетанию и действие фермента будет затруднено. Дуплексы, стабилизированные поперечными связями, могут послужить ингибиторами НК-узнающих белков, что открывает путь к созданию новых терапевтических средств. Дуплексы с ковалентно связанными цепями способны влиять на трансляцию РНК по триплексному механизму. Они могут быть использованы для выделения НК-связывающих белков методом аффинной хроматографии. Ковалентные связи в заданных участках способны стабилизировать термодинамически невыгодные структуры НК. На сегодняшний день получение ДНК-дуплексов, содержащих поперечные связи между цепями, -активная область исследований, вызывающая повышенный интерес.

Цель работы. Настоящее исследование посвящено разработке нового эффективного метода получения ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями. Важнейшей частью работы является синтез направленно модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов для последующего получения на их основе ДНК-дуплексов со связями между цепями в заданных положениях двойной спирали. Целью работы стало также изучение физико-химических и субстратных свойств синтезированных соединений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Необходимость разработки простых, надежных и эффективных методов синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями не вызывает сомнения. Однако на сегодняшний день получение таких соединений связано с рядом проблем: часто связи между тяжами нестабильны, либо нарушают структуру двойной спирали ДНК. Используемые реагенты обычно обладают высокой химической активностью, но малой селективностью и сиквенс-специфичностью, дают примеси побочных продуктов, способны образовывать внутрицепочечные связи. Существует ряд трудностей и при получении ковалентно замкнутых по концам ДНК-дуплексов (дамблов) - ближайших аналогов дуплексов с ковалентно связанными цепями.

В настоящей работе предлагается новый эффективный метод получения ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями. Особенностью настоящего подхода является такая организация реакционного центра с участием пространственно сближенных цепей ДНК-дуплекса, что получение целевого продукта фактически сводится к реакции образования амидной связи с участием водорастворимого карбодиимида. Связь образуется между алифатической аминогруппой, расположенной в одном из тяжей ДНК-дуплекса, и карбоксильной группой - в другом. Выход ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями достигает 85%.

Применение такого подхода стало возможным благодаря разработанным методикам получения направленно модифицированных по углеводному фрагменту олигонуклеотидов, содержащих первичную алифатическую амино- и карбоксильную группу. Разработанные методики включения модифицированных звеньев в олигонуклеотиды предусматривают возможность их введения в любое заданное положение олигонуклеотидной цепи и встраивания нескольких модифицированных звеньев в один олигонуклеотид при сохранении стандартных процедур автоматического олигонуклеотидного синтеза. Впервые получены

олигонуклеотиды с включениями 9-(Р-0-2'-амино-2'-дезокси-о/>а6ино-пентафуранозил)аденина и 2-(2-аминопропионил)аминопропандиола-1,3.

На примере взаимодействия с транскрипционным фактором ЫИ-кВ показано, что ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями способны эффективно связываться с белками, узнающими определенные последовательности ДНК, что в сочетании с их повышенной термодинамической стабильностью и устойчивостью к действию гидролизующих ферментов позволяет рекомендовать данные соединения к использованию в качестве удобных "ловушек" для белков, связывающихся с нуклеиновыми кислотами.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: на Конференции "Терапевтические олигонуклеотиды - от клетки к человеку" (Сейяк, Франция, апрель 1995 г.), на Симпозиуме по химии нуклеиновых кислот (Лейден, Голландия, август 1995 г.), на Конференции аспирантов и студентов "Ломоносов-96", (Москва, май 1996 г.), на Конгрессе по олигонуклеотидной регуляции экспрессии генов (Рим, Италия, июнь 1996 г.), на XII Конференции "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологические применения" (ЛаХойя, Калифорния, США, сентябрь 1996 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного известным методам синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка использованной литературы (125 ссылок), содержит 16 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основной задачей настоящей работы было получение олигодезоксирибонуклеотидов, модифицированных таким образом, чтобы можно было на их основе получить олигонуклеотидный дуплекс, тяжи которого соединены между собой ковалентными связями. Для соединения цепей дуплекса нами была выбрана реакция между карбоксильной и первичной аминогруппой, активируемая водорастворимым карбодиимидом и приводящая к образованию амидной связи между тяжами (схема 1).

Первоначально предполагали ввести аминогруппу в 2'-положение углеводного фрагмента нуклеозидов: цитидина и гуанозина. К началу настоящей работы (1992 г.) пиримидиновые 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозиды были

получены в лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ и одновременно в лаборатории Ф.Экштайна (Институт М.Планка, Геттинген, Германия), однако отдельные стадии их синтеза требовали доработки.

Я1 - Я4 - фрагменты олигонуклеотидных цепей

Была продемонстрирована высокая реакционная способность 2'-аминогруппы в реакциях ацилирования. Это свойство 2'-амино-2'-дезоксирибонукпеозидов привело нас к идее образования связи между 2'-аминогрулпой, локализованной в одном из тяжей, и карбоксильной функцией, полученной при ацилировании ангидридом дикарбоновой кислоты 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозида комплементарной цепи. Оказалось, однако, что получение 2'-амино-2'-дезоксирибогуанозина является сложной задачей. Синтез такого нуклеозида описан в литературе (Ф.Экштайн и др., 1992), его получали реакцией транс-гликозилирования (замещения гетероциклического основания) из предварительно синтезированного 2'-амино-2'-дезоксиуридина. Протекание данной реакции неизбежно связано с образованием сложной смеси продуктов и, как следствие, с крайне низким выходом целевого продукта.

Обойти эту проблему мы решили следующим образом. Вместо 2'-амино-2'-дезоксирибогуанозина была использована ненуклеозидная вставка. В данном случае приходилось считаться с некоторым искажением геометрии двойной спирали и, как следствие, снижением ее прочности, что связано с нарушением водородных связей в паре, где отсутствует одно из гетероциклических оснований. С другой стороны, использование такой замены нуклеозида дает ряд преимуществ. В отличие от 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозидов, предложенное соединение можно синтезировать, используя совокупность простых химических реакций, протекающих с высокими выходами (схема 2). Немаловажным является также

Схема 1.

условие сохранения в структуре ненуклеозидной вставки дистанции в три углеродных атома между фосфатными группами, что характерно для природных олигонуклеотидов, а также устойчивость данного соединения в процессе синтетических и постсинтетических обработок олигонуклеотида.

Возможность сохранения комплементарной пары в месте образования связи между цепями дуплекса мы связывали с использованием 2'-амино-2'-дезокси-арабипо-пуриновых нуклеозидов. При синтезе данных соединений можно обойтись без стадии транс-гликозилирования. Однако синтез этих соединений все же является сложной задачей. Амидофосфитные компоненты 2'-амино-2'-дезокси-арабино-пуртюшх нуклеозидов и олигонуклеотиды с включениями подобной структуры до сих пор не были описаны. Использование этих соединений могло бы оказаться удобным для получения дуплексов с ковалентно связанными цепями.

1. Получение модифицированных мономерных амидофосфитных компонентов олигонуклеотидного синтеза и модифицированных олигонуклеотидов

Синтез 3-диметокситритилокси-2-{[1Ч|-(9-флуоренилметоксикарбонил)-2-аминопропионил]амино}пропанола-1 (5) проводили в соответствии со схемой 2.

Схема 2.

омтг-о—сн2-|;н—сн2-он

Ртос-МН-(СН2)2-С— РШ (5) О

Получение соответствующим образом блокированных пиримидиновых 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозидов независимо от природы гетероциклического основания включает следующие стадии (см. схему 3): блокирование 5'-гидроксила нуклеозида (6) диметокситритильной защитной группой; получение О2,2'-ангидропроизводного нуклеозида под действием дифенилкарбоната; азидирование реакционноспособного ангидропроизводного азидом лития; восстановление 2'-азидо-2'-дезоксирибонуклеозида (8) до 2'-аминопроизводного (9) трифенилфосфином. Для блокирования введенной аминогруппы использовали трифторацетильную защитную группу, которая является щелочелабильной и удаляется при стандартной постсинтетической обработке олигонуклеотида.

Схема 3.

II II 2) ШМз

НО ОН НО ОН НО N3

(6) (7) (8)

БМТгО

СН2 |УГ о БМТгОСНг у^ СР3£оС2Н5 ^ Ц^

НО 1ЧН2 НО ГШССРз

Руг = Су^ ига (9) <10> О

Синтез 5'-0,Ы-защищенного 9-(Р-0-2'-амино-2'-дезокси-арабино-пентафуранозил)аденина (2'-амино-2'-дезокси-а/ад5|/но-аденозина) представлен на схеме 4 и включает ряд последовательных превращений: бензоилирование экзоциклической аминогруппы аденозина (11); блокирование 5'- и З'-гидроксилов Ы6-бензоиладенозина (12) с использованием реагента Маркевича; активацию 2'-гидроксила соединения (13) введением трифторметансульфогруппы; азидирование 2'-0-трифторметансульфопроизводного 5'-,3'-0,М6-блокированного аденозина (14) с обращением конфигурации при С2'-атоме; восстановление азидогруппы защищенного 2'-азидо-2'-дезокси-а/;ай/ко-аденозина (15) с образованием производного 2'-амино-2'-дезокси-а/>а6и«о-аденозина (16); удаление защиты Маркевича тетрабутиламмонийфторидом; блокирование 5'-гидроксила соединения (17) диметокситритильной защитной группой; ацилирование аминогруппы соединения (18) этиловым эфиром трифторуксусной кислоты.

Поскольку трифторацетильная группа является щелочелабильной, была определена следующая последовательность реакций: деблокирование 5'-,3'-гидроксильных групп соединения (16), введение диметокситритильной группы в 5'-положение углеводного остатка соединения (17), блокирование аминофункции соединения (18) (схема 4). В противном случае происходит одновременное удаление защитных групп с 5'-,3'-гидроксилов и 2'-аминогруппы, так как при десилилировании образуется гидроксид тетрабутиламмония (сильное основание).

Схема 4.

в 'Рг\ ¡г

носн2 Айе, СН ) ЯС1 НОСНг '¡Рг—|г

2.С6Н5СОС1 г .Рг^-С! ^ |

но он

I I 3. NH40H но он

(11)

(12)

>Рг

, Вг

Adez ,р[ Ade'

¡Рг—а-осн2 I ¡Рг—¿1—осн2 N31 1Р1—

(СЕз§02Ж А ни», А к^Ы (СбН5)зР,

(15) 1Рг—(16)

¡Рг-8!—¿ОБОгСРз

¡Рг (14) ¡Рг

¡Рг

О ОМТгО СР3СОС2Н5

НО (19)

На стадии удаления защиты Маркевича анализ реакционной смеси показал наличие двух продуктов. Один из продуктов был идентифицирован как Ь!6-бензо11л-2'-амино-2'-дезокси-д/ибу/;о-аденозш! (17). В связи с этим была предпринята попытка оптимизации схемы получения 5'-0-диметокситритил-Г^6-бензоил-2'-амино-2'-дезокси-а/>аби/(о-аденозина (18). Был опробован другой путь синтеза, связанный с проведением стадий восстановления азидогруппы и десилилирования в обратном порядке. Оказалось, что в этом случае также происходит образование побочного продукта. Было найдено, что образование побочных продуктов в обоих методах синтеза происходит на стадии восстановления производного 2'-азидо-2'-дезокси-а/ю£>ш/о-аденозина. Таким

образом, стадия восстановления азидогруппы требует доработки, связанной с подбором такого восстанавливающего агента, использование которого привело бы к повышению выхода целевого продукта.

Независимо от природы исходных соединений (5), (10), (19) получение амидофосфитных компонентов олигонуклеотидного синтеза (фосфитилирование) проводили на основе стандартной методики. В связи с тем, что заместитель в 2'-положении модифицированного нуклеозида затрудняет протекание реакции фосфитилирования, время реакции увеличивали до 15 минут для пиримидиновых 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозидов и до 20 минут для 2'-амино-2'-дезокси-арабино-аденозина. При увеличенном времени реакции для всех модифицированных нуклеозидов достигался выход, близкий к количественному. Полученные амидофосфитные производные являются полностью готовыми для направленного введения в заданное положение олигонуклеотидной цепи путем автоматического твердофазного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза.

Олигонуклеотидный синтез осуществляли амидофосфитным методом на синтезаторе фрагментов генов Applied Biosystems 380В (США) в соответствии со стандартным синтетическим регламентом. Модифицированные амидофосфиты вводили в синтез в концентрации 0,15М, время конденсации увеличивали до 5 минут. Степень превращения на стадии присоединения модифицированных звеньев была несколько ниже, чем для З'-амидофосфитов природных нуклеозидов, и составляла около 95%.

2. Подтверждение наличия модифицированных звеньев в полученных олигоиуклеотидах и изучение их реакционной способности

Наличие в олигоиуклеотидах модифицированных звеньев подтверждали их ферментативным гидролизом до нуклеозидов смесью фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфатазы с последующим анализом гидролизата методом обрашенно-фазовой ВЭЖХ. В продуктах гидролиза олигонуклеотидов, содержащих включения 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, обнаруживаются пять пиков, четыре из которых соответствуют природным нуклеозидам, а пятый - 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиду.

Была показана высокая реакционная способность введенных аминогрупп при взаимодействии с электрофильными реагентами (уксусным ангидридом, янтарным ангидридом, флуоресцеинизотиоцианатом). ВЭЖХ-анализ продуктов ацилирования одного из модифицированных олигонуклеотидов янтарным

ангидридом приведен на Рис. 1. Отмстим, что время удерживания модифицированных олигонуклеотидов при анализе методом ион-парной ВЭЖХ изменяется в полном соответствии с природой введенных функциональных групп. Так, модифицированный олигонуклеотид с алифатической аминогруппой имеет меньшее время удерживания по сравнению с немодифицированным олигонуклеотидом той же первичной структуры, что связано с появлением дополнительного положительного заряда. С другой стороны, ацилированный олигонуклеотид с карбоксильной группой имеет большее время удерживания по сравнению с немодифицированным аналогом в связи с появлением объемного гидрофобного заместителя, а также дополнительного отрицательного заряда.

Рис. 1. ВЭЖХ-анализ: I) 25-звенного немодифициро ванного олигонуклеотида 5'-

d(CGGTAGAGGGGACTTT CCGAGTGGC) (I), 2) олигонуклеотида

аналогичной первичной структуры, содержащего ненуклеозидную вставку (И), 3) реакционной смеси, полученной при ацилирова-нии олигонуклеотида (II) янтарным ангидридом, 4) той же реакционной смеси с добавлением олигонуклеотида (II). Условия реакции ацилирования: 1,0 ОЕ260 олигонуклеотида растворяли в 500 мкл 0,25 М бикарбонатного буфера, рН 8,0, прибавляли 500 мкл 40 мМ раствора янтарного ангидрида в ацетонитриле. Реакцию вели 60 минут при 20°С. Анализ проводили методом ион-парной ВЭЖХ на градиентной системе Waters (США) с шагом элюции 2 нуклеотидных звена в минуту. Условия аналитического разделения: колонка 4x250 мм, сорбент Диасорб С 16т (7 мкм), 48мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, градиент ацетонитрила 5-40%, скорость потока 1 мл/мин, температура 45°С.

t, мин

3. Получение олигонуклеотидных дуплексов с ковалентно связанными цепями

Для осуществления реакции между тяжами модифицированного дуплекса необходимо было в одну из цепей ввести карбоксильную группу. Карбоксильную группу вводили ацилированием ангидридом дикарбоновой кислоты предварительно включенной в состав олигонуклеотида аминогруппы. На основании данных молекулярного моделирования было принято решение использовать янтарный ангидрид.

Первоначально попытка получения ДНК-дуплекса с ковалентно связанными цепями была предпринята на системе, включающей два 20-звенных ДНК-дуплекса (В), (В') (см. схему 5). В каждом из дуплексов одна из цепей содержала аминогруппу, а вторая - карбоксильную группу.

З'-ТАСОАТАТТАССССССАССТ-З' 5'-АТССТАТААТО СОСССГС СА- 3'

Схема 5.

(А)

З'-ТАССАТАТГАССС—О—СН2-СН-СН2-0-ССАССТ-5'

]|ш

О

? *

О—С-С Н 2-е Н 2- N Н-С-С Н 2-е Н 2-С-О Н

З'-АТССТАТААТССС-О

\

9У* ын2

ЬССТССА-З'

(В)

З'-ТАС ОАТАТТАСС С—О—С Н 2-С Н~С Н 2-0-0САСОТ-5'

ын

0-С-СН2-СН2-МН2

Су1

5-атсстатаатссс-о

N

^<?:-сн2-сн2-с-он

-мн—с—сн2—сн2-

-ССТОСА -3'

(В-)

3'- ТАвй АТАТТАСО С—О—С Н 2—С Н—С Н 2—О—вв АСвТ - 5'

0=С—С Н 2—С Н 2— N Н

5'-АТССТАТААТССС-0

N

0

1

о

Су1

- N Н-С-С Н 2-С Н 2 -ССТССА-З'

(Вс1)

Различие между данными дуплексами заключается в том, что в дуплексе (В) свободной является 2'-аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидина, тогда как в дуплексе (В') - аминогруппа, локализованная на ненуклеозидноп вставке.

Реакцию между цепями осуществляли в МЭС-содержащем буферном растворе при рН 6,7 в течение 3 суток при 20°С с использованием водорастворимого 1-этил-3-(3-диметиламино)пропилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента. Реакционные смеси анализировали с помощью ион-парной ВЭЖХ, а также методом денатурирующего электрофореза в 20% полиакриламидном геле (ПААГ).

При анализе методом ВЭЖХ в обоих случаях наблюдали появление продукта, по времени удерживания приблизительно соответствующего олигонуклеотиду, длина которого равна сумме длин двух исходных олигонуклеотидов. Продуктом реакции между цепями в каждом из дуплексов (В) и (В') является один и тот же дуплекс (Вс1)* с ковалентно связанными цепями (см. схему 5). Однако в зависимости от структуры исходных олигонуклеотидов выход дуплекса (Вс|) существенно различался. Выход дуплекса (Вс1) составил: в случае системы олигонуклеотидов (В') - 3%, а в случае системы (В) - 26%.

Существенное различие в выходе целевого продукта связано с тем, что рК 2'-аминогруппы 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидина значительно ниже (рК 7,4), чем рК обычной первичной алифатической аминогруппы. В связи с этим в условиях реакции между цепями 2'-аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидина в значительной степени остается в непротонированной форме, что сказывается на ее нуклеофильности.

Для изучения влияния на эффективность реакции между тяжами положения модифицированных звеньев друг относительно друга, их количества, нуклеотидного окружения, термодинамической устойчивости дуплекса-предшественника были выбраны две базовые системы, составленные из 25-звенных олигонуклеотидов (ДНК-дуплексы (С) и (I), таблица 1). Из синтезированных олигонуклеотидов были составлены восемь модифицированных ДНК-дуплексов (D) - (Н) и (J) - (L) (см. таблицу 1). В одной из цепей каждого дуплекса содержался 2'-амино-2'-дезоксинуклеозид, а во второй, комплементарной цепи, - ненуклеозидная вставка с локализованной на ней карбоксильной группой.

•Надстрочный индекс "cl" (cross-linked) использован для обозначения ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями.

В оптимальных условиях выход дуплексов (Ос1) - (Нс1), С7с1) - (Ьс|) с ковалентно связанными тяжами для отдельных систем достиг 85%. Профиль хроматографического разделения реакционной смеси после реакции между цепями дуплекса (Р) приведен на Рис. 2. Значительное различие в выходе целевого продукта для 20-звенной и 25-звенных систем (26% и 85% соответственно) объясняется тем, что эффективность реакции образования дуплекса с ковалентно связанными цепями зависит от термодинамической устойчивости модифицированного дуплекса-предшественника. Выход дуплекса с ковалентно соединенными тяжами существенно выше при более высокой температуре плавления исходного модифицированного дуплекса. Действительно, если при температуре плавления дуплекса (В), равной 37°С, выход дуплекса (Вс|) составил 26%, то при температуре плавления дуплексов (О) - (Н), (.1) - (Ь) около 75°С выход дуплексов (Ос|) - (Нс|), (.Iе') - (Ьс|) составил в среднем 80% (таблица 1).

Рис. 2. ВЭЖХ-анапиз: 1) реакционной смеси, полученной при синтезе ДНК-дуплекса (Рс1) с ковалентно связанными цепями, 2) ДНК-дуплекса (Р) без добавления КДИ.

Условия реакции между цепями: по 0,1 ОЕгбо комплементарных олигонуклеотидов растворяли в 37 мкл 0,05М МЭС-содержа-щего буфера, (рН 5,0, 0,02М хлорид магния), нагревали до 95°С, медленно охлаждали до 20°С и добавляли 37 мкл 0,4М раствора 1-этил-3-(3-диметилам ино)проп ил карбоди и мида в том же буфере. Реакцию вели в течение 48 часов при 20°С в темноте. Условия аналитического разделения см. подпись к рис. 1.

(, мин

Исходные дуплексы Дуплексы с ковалентно связанными цепями

Обозначение 5'-3' 3'-5' Тпл, °С Обозначение Выход продукта, % Тпл, °С

(А) ТО С АО О О СО С АТТАТАС й АТ АСОТСССОСОТААТАТССТА 63 - - -

(В) ТССАОй N° СО САТТАТАО вАТ АСОТСС С» йСОТААТАТССТА 34 (В") 26 67

(С) СООТАОАО ООвАСТТТСС ОАОТООС ОССАТСТС С С СТО АА АО О СТСАССС 77 -

(О) СООТАОАО в в й АСТТТСС О А № ТООС ОССАТСТС СССТОАААСО СТ и° АССО 74 52 84

(Е) ССОТАСАО ООО АСТТТСС ОА № ТООС ОССАТСТС СССТОАААСО СТ аА" АССО - (Ес1) 55 -

(Н СООТ № ОАО ООО АСТТТСС САОТОСС СССА ип СТС СССТОАААСО СТСАССС, 74 (Р1) 82 85

(О) СООТ № ОАО О й О АСТТТСС ОА № ТООС СССА и" СТС СССТСАААОО СТ и" АССО 70 (С1) 67 87

(Н) СООТАО № С ОССАСТТТСС ОАСТССС СССА и» СТС СССТОАААСО СТСАССС 75 (Нс|) 84 88

(I) СССТАС ЛССТСАСТТТСССАСТССС СССАТС ТССА СТСАААООСТСАССС 78 - " ~

и> ССОТАС ^ССГСАСТТТСССА № ТОСС СССАТС ТСвА ОТОАААООСТ и" АССО 72 (•Iе1) 40 85

(К) ССОТ № О /ШСГ САСТТТССОЛСТССС ОССА и° С 7ГСЛ ОТОАААООСТСАССО 73 (Кс|) 75 86

(Ц СООТ № в ЛССГСАСТТТССОА № ТООС ОССА У" С ТСвЛ ОТОАААООСТ и" АССО 69 (Ьс1) 62 88

Участок узнавания фактора транскрипции ЫР-кВ выделен подчеркиванием, участок узнавания экзокуедеазы А1и\ - курсивом. С" - 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидин Сс - 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидин с карбоксильной группой

N - ненуклеозидная вставка с аминогруппой № - ненукпеозидная вставка с карбоксильной группой

Оказалось, что сдвиг модифицированных звеньев на два нуклеозида друг относительно друга в сторону З'-конца (сравн. дуплексы (Рс|) и (Нс1)) существенно не сказывается на эффективности реакции. Это означает, что в обоих случаях возникает благоприятная для протекания процесса ориентация реагирующих групп в едином реакционном центре.

С другой стороны, последовательность нуклеотидов вокруг модифицированных звеньев заметно влияет на выход целевого продукта (напр., сравн. выходы дуплексов (Ос|) и (Рс|), (.Iе1) и (Кс|), см. таблицу 1). Причина этого явления, вероятно, связана с локальными сиквенс-зависимыми микроискажениями параметров двойной спирали исходного модифицированного ДНК-дуплекса, которые оказывают влияние на пространственное расположение реагирующих групп. Замена 2'-амино-2'-дезоксиуридина на 2'-амино-2'-дезокси-арабино-аденозин (инверсия аминогруппы в 2'-положении углеводного фрагмента, дуплекс (Е)) существенно не сказывается на выходе дуплекса с ковалентно связанными цепями.

4. Термодинамическая стабильность модифицированных ДНК-дуплексов

Термодинамическую устойчивость ДНК-дуплексов изучали методом УФ-спектроскопии. Устойчивость дуплексов с включениями модифицированных звеньев во всех случаях оказалась пониженной по сравнению с немодифицированными дуплексами соответствующей первичной структуры (см. таблицу I). Из данных по термодинамической устойчивости видно, что степень снижения температуры плавления модифицированных дуплексов по сравнению с природными аналогами зависит от длины и состава ДНК-дуплекса. Для дуплексов с ковалентно связанными цепями, напротив, наблюдали увеличение температуры плавления, которая оказалась выше температуры плавления не только для соответствующих модифицированных дуплексов, но и для немодифицированных дуплексов аналогичной первичной структуры. Для 20-звенного дуплекса (Вс1) увеличение температуры плавления по сравнению с природным дуплексом (А) составило 4°С, а с соответствующим модифицированным дуплексом (В) - 33°С. Для 25-звенных дуплексов (0е1) - (Нс|), (,1с|) - (Ьс1) значения температуры плавления оказались повышенными по сравнению с модифицированными дуплексами соответствующей первичной структуры (О) - (Н), (.1) - (Ь) в среднем на 15°С, а с соответствующими немодифицированными дуплексами (С) и (I) - на 8°С.

Таким образом, чем ниже стабильность ^модифицированного дуплекса, тем большее различие наблюдается в величинах температуры плавления между соответствующими модифицированными дуплексами и дуплексами с ковалентно связанными цепями.

5. Устойчивость модифицированных ДНК-дуплексов к действию фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфатазы

Устойчивость дуплексов с ковалентно связанными цепями к действию смеси фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфатазы в условиях исчерпывающего ферментативного гидролиза (56°С, 180 минут) оказалась существенно повышенной по сравнению с немодифициропанными дуплексами и дуплексами, составленными из модифицированных олигонуклеотидов. При анализе гидролизата методом ион-парной ВЭЖХ было обнаружено, что в данных условиях как природные, так и модифицированные дуплексы полностью гидролизуются до нуклеозидов, тогда как дуплексы с ковалентно связанными цепями не менее чем на 70% сохраняются без изменения. Столь незначительная степень гидролиза в этих условиях является результатом упрочняющего эффекта связи между цепями.

Для более полного исследования этого процесса было проведено сравнительное изучение кинетики реакции ферментативного гидролиза фосфодиэстеразой змеиного яда дуплекса (Dcl) с ковалентно связанными цепями и немодифицированного дуплекса (С) аналогичной первичной структуры (см. таблицу 1). Анализ реакционных смесей проводили методом ион-парной ВЭЖХ, в качестве внутреннего контроля использовали уридин.

Гидролиз одноцепочечных олигонуклеотидов, в том числе модифицированных, в выбранных условиях (см. подпись к Рис. 3) протекает с большой скоростью, модифицированные звенья не препятствуют гидролизу, происходит промежуточное накопление многочисленных продуктов частичного гидролиза различной длины, которые также подвергаются ферментативному гидролизу. В отличие от одноцепочечных олигонуклеотидов, хроматографический анализ смеси комплементарных олигонуклеотидов - компонентов дуплекса (С) осложнен неравновесным процессом ассоциации-диссоциации цепей (см. Рис. За). Это проявляется в появлении двух уширенных пиков, один из которых соответствует смеси диссоциированных олигонуклеотидов, а другой - ДНК-дуплексу. В процессе ферментативного гидролиза наблюдается уменьшение

площадей обоих пиков с одновременным образованием многочисленных продуктов гидролиза различной длины. Таким образом, ферментативный гидролиз дуплекса (С) также протекает достаточно эффективно, хотя и несколько медленнее гидролиза одноцепочечных олигонуклеотидов.

t ■ М и н ¿¡. С, м IIII

Рис. 3. ВЭЖХ-анализ продуктов ферментативного гидролиза ДНК-дуплексов фосфодиэстеразой змеиного яда. (а) Ферментативный гидролиз немодифииированного дуплекса (С). I - исходный дуплекс, 2 - иремя гидролиза 5 минут, 3-10 минут, 4-20 минут, 5-40 минут, (б) Ферментативный гидролиз дуплекса (Dcl) с ковалентно связанными цепями. I - исходный дуплекс, 2 - время гидролиза I минута, 3-5 минут, 4 -10 минут. 5-20 минут, 6-40 минут, 7-60 минут, 8-90 минут, 9 - 180 минут. Условия ферментативного гидролиза: 0,2 ОЕ260 олигонуклеотидного материала и 1,0 ОЕ2бо уридина растворяли в 16 мкл 0,2 М Трис-HCI буфера (рН 8.5, 0.04М MgCl2x6H20), добавляли 4 мкл раствора фосфодиэстеразы змеиного яда (1.0 I0"4 ед.акт./мл). Реакционную смесь инкубировали при 37°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом по 4 мкл, реакцию в которых терминировали охлаждением жидким азотом. Условия аналитического разделения см. подпись к рис. 1.

Характер ферментативного гидролиза дуплекса (Dcl) с ковалентно связанными цепями принципиально отличается как от гидролиза одноцепочечных олигонуклеотидов, так и от гидролиза дуплекса (С) (см. Рис. ЗЬ). Это выражается как в значительно меньшей скорости гидролиза, так и в накоплении продуктов частичного гидролиза определенной длины. Полного гидролиза дуплекса с ковалентно связанными цепями не происходит даже за три часа. Теоретически

процесс гидролиза мог бы заканчиваться образованием структуры, которая по времени удерживания приблизительно соответствует 25-звенному олигонуклеотиду (см. схему 6). Однако фактически до такой глубины ферментативный гидролиз не проходит.

Схема 6.

5'-СГ,Г,ТЛСЛГ,СССЛСТГГССОЛ—ТССС -УфЛЭз„ СС,С.ТЛС,ЛСССС„\СТГТССС.\—

3'- СССЛТСТССССТСАЛАСССТ—и—АССС -Г 3'-11—ЛССС -5'

Метод эквидистантного ион-парного ВЭЖХ-анализа позволяет оценить длину разделяемых олигонуклеотидов. Как оказалось, происходит сравнительно легкое отщепление двух - трех звеньев и накопление продуктов частичного гидролиза, укороченных только на три - восемь звеньев. Отсутствие более коротких продуктов гидролиза в течение трех часов свидетельствует о том, что процесс затормаживается после отщепления максимум восьми звеньев. В пользу такого предположения говорит также тот факт, что сумма площадей пиков исходного ДНК-дуплекса и продуктов его частичного гидролиза, укороченных на три - восемь звеньев, убывает крайне незначительно в ходе всего процесса.

Таким образом, наличие связи между цепями вызывает существенное затормаживание процесса ферментативного гидролиза ДНК-дуплекса.

6. Расщепление ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями эндонуклеазой рестрикции А1и 1

Сайт-специфичное расщепление ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями эндонуклеазой рестрикции А1и\ проводили для доказательства способности полученных соединений выступать субстратами для ферментов, связывающихся с уникальными нуклеотидными последовательностями ДНК, а также для подтверждения структуры синтезированных соединений. Участок узнавания эндонуклеазы рестрикции АЫ был заложен в первичную структуру дуплексов (I), (.1), (К), (Ь) (см. табл. 1). Положение связей между цепями относительно участка узнавания эндонуклеазы рестрикции А1и\ в ДНК-дуплексах определяет состав гидролизата. Образование олигонуклеотидов - продуктов гидролиза различной длины при расщеплении дуплексов (,1с'), (Кс|), (1-с|) с ковалентно связанными цепями и дуплекса (I) иллюстрируется схемой 7.

Схема 7.

а)

Дуплекс (I) Alu I

25 р*-

50 р».

8 р*-

+ Alu I

б)

Дуплекс (Jcl) Alu I

50 р*.

8 р*-

+ Alu I

Р*'

+ +

+ +

34

В)

Дуплекс (Kd) Alu I

50 р*.

-Р*

-Р*

+ Alu I

Р*

+ +

-р*

Дуплекс (Ьс|) А1и I

+ Alu I

-Р*

Р* - [32Р1 фосфат

Р

Продукты реакции ферментативного гидролиза анализировали методом электрофореза в 20% ПААГ в денатурирующих условиях. При гидролизе ферментом А1и\ немодифицированного 25-звенного дуплекса (I) (схема 7 а) образуются два 8-звенных и два 17-звенных олигонуклеотида. Поскольку оба олигонуклеотида, составляющие дуплекс, содержали 32Р-метку, на радиоавтографе наблюдали две полосы, соответствующие 8-звенному и 17-звенному олигонуклеотидам. При гидролизе дуплекса (Jcl) на радиоавтографе наблюдали 8-звенные и 34-звенные олигонуклеотиды (схема 7 б, Рис. 4, 3), при гидролизе дуплекса (Кс1) - 16-звенные и 17-звенные олигонуклеотиды (схема 7 в, Рис. 4, 3), а при гидролизе дуплекса (Ьс|) - 16-звенные и 34-звенные олигонуклеотиды (схема 7 г, Рис. 4, 7). Как видно, состав реакционных смесей для всех дуплексов соответствует теоретической схеме 7. Таким образом, показано, что наличие связей между цепями в полученных ДНК-дуплексах не препятствует их расщеплению эндонуклсазой рестрикции А1и\.

2 3-4 5 6 7

■n • -

Рис.4.

(электрофорез u содержащем 7

Радиоавтограф 20% ПААГ. М мочевину)

реакционных смссси, полученных, при расщеплении дуплексов (-Iе1) (3). (К1') (5), (Ь*1) (7) эндонуклеазои рестрикции МЛ. I - 25-звснный олигонуклеотид, ХС 2. 4, 6 - дуплексы (Л. (К). (С) (контроли). Реакцию с эндонуклеазои рестрикции А.'иI проводили в 20 мкл 0.01 М Трис-НС1 буфера (15 мМ МяС12. 0,15 М ЫаС1, I мМ ВРВ дитиотреитол). 0,03 ОЕ260 дуплекса нагревали до 95°С, медленно охлаждали до 20°С и инкубировали 2 ч при 37°С в присутствии 25 ел.акт. А1п\. Реакцию останавливали кратковременным нагреванием реакционной смеси до 95°С.

7. Взаимодействие модифицированных ДНК-дуплсксов с фактором транскрипции NF-kB

Исследование взаимодействия синтезированных ДНК-дуплексов с ковалентно соединенными цепями с НК-узнающими белками представляет большой интерес как в связи с изучением свойств полученных соединений, так и для определения их возможных областей применения. Было изучено взаимодействие р50 субъединицы фактора транскрипции NF-kB человека с дуплексами (Dcl), (Fcl), (Gcl), (Hd) с ковалентно связанными цепями, содержащими участок узнавания этого белка (см. табл. I). В качестве контролен использовали дуплекс (С) и модифицированные дуплексы (D), (F), (G), (Н). Использовали образец химерного белка, состоящего из субъсдиницы р50 NF-kB и глютатион-Б-трансферазы (GST), что позволило провести его выделение с помощью аффинной хроматографии. Ранее установлено (Х.Танака и др., 1994), что белок p50-GST эффективно связывается с дуплексами, содержащими участок связывания NF-kB.

Связывание ДНК-дуплексов с p50-GST изучали методом торможения в 6% неденатурируюшсм ПААГ. 32Р-Мсченые ДНК-дуплсксы инкубировали с различными количествами белка в условиях образования ДНК-белкового комплекса. Для всех ДНК-дуплексов, содержащих участок связывания NF-кВ, на радиоавтографе наблюдали появление менее подвижной полосы по сравнению с полосой, относящейся к несвязанным с белком ДНК-дуплексам, которая соответствовала комплексу ДНК-дуплекса с белком (см. Рис. 5).

Первоначально проводили сравнение связывания белка с дуплексами (С), (Нс1) и (Кс|). Оказалось, что дуплексы (С) и (Нс|) связываются с p50-GST примерно в одинаковой степени, из чего можно было сделать вывод, что наличие связующего мостика между цепями не препятствует взаимодействию ДНК-дуплекса с этим белком. Следует отметить, что связывание носит специфичный

не содержащий участка связывания NF-

Рпс. 5. Радиоавтограф (электрофорез в 6% недснатурируюшем ПААГ при постоянном напряжении 100 вольт) реакционных смесей, образующихся при комплексообразовании дуплекса (С), модифицированных дуплексов (F), (G) и дуплекса (Нс|) с ковалентно связанными цепями с p50-GST. I, 3, 5, 7 - исходные дуплексы (С), (F), (G) и (Hd) соответственно, 2, 4, 6, 8 - дуплексы (С), (F), (G) и (Нс1) в присутствии p50-GST. Условия комплексообразования: ДНК-дуплекс, содержащий [32Р|-метку, нагревали до 95°С, медленно охлаждали до 20UC и инкубировали с p50-GST в буфере, содержащем 7,5 мМ HEPES,- 35 мМ NaCI, I мМ MgCI2, 0,5 мМ дитиотреит, 0,005 мМ ЭДТА и 15% глицерина по обьему в течение 30 минут при 20°С. Концентрация белка 3,95 мкМ, концентрация дуплекса 0.18 мкМ.

характер. Действительно, дуплекс (Кс|), кВ, не являлся субстратом для белка.

12 3 4 5 6 7 8

» » * M

хс

Для более подробного изучения закономерностей взаимодействия модифицированных ДНК-дуплексов с р50-ОБТ попарно сравнивали связывание с белком ДНК-дуплексов (Ос|), (Р1), (Ос|) и соответствующих модифицированных дуплексов, не содержащих связи между цепями (Э), (Р), (О). Для перечисленных ДНК-дуплексов на основании полученных данных были рассчитаны константы диссоциации комплекса ДНК-дуплекс - белок, величина которых характеризует степень сродства этих ДНК-дуплексов к р50-05Т. Выражение для константы диссоциации комплекса ДНК-дуплекс - белок выглядит следующим образом:

1 1 ГЕ51

- - 1 = К„ • щ- , где у = (при условии, что [8]0 « [Е]0, а у < 1).

По тангенсу угла наклона прямых в координатах 1 /у-1 от 1/[Е]0 были найдены константы диссоциации комплексов ДНК-дуплекс - белок (табл. 2).

Таблица 2.

Константы диссоциации комплексов ДНК-дуплексов с белком р50-ОБТ

Дуплекс К<), ткМ Дуплекс К<), ткМ

(О) 1,05 ±0,11 Фс|) 2,87 ± 0,23

(П 1,46 + 0,09 (Р1) 0,44 ± 0,04

(С) 1,50 ±0,33 (С") 1,46 ±0,19

Оказалось, что все модифицированные дуплексы, не содержащие сшивок между цепями, связываются с белком в степени, сравнимой со степенью связывания дуплекса (С) (см. Рис. 5). Это указывает на то, что введенные в ДНК-дуплексы модифицированные звенья не препятствуют взаимодействию с белком. В то же время степень сродства ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями к белку, как оказалось, зависит от местоположения связи между цепями по отношению к участку связывания №-кВ. Так, константа диссоциации комплекса р50-05Т с модифицированным дуплексом (О) почти в три раза меньше, чем константа диссоциации для соответствующего комплекса с дуплексом (0с1) с ковалентно связанными цепями (табл. 2). С другой стороны, для дуплекса (Рс|) наблюдается обратная картина: комплекс белка с дуплексом (Р) имеет в три раза большую константу связывания, чем комплекс с дуплексом (Рс|) (табл. 2).

Асимметричность участка связывания ЫР-кВ (см. табл 1), позволяет предположить, что данный белок связывается с ДНК-дуплексом в определенной ориентации. Полученные данные указывают на то, что связь между цепями, ч расположенная на З'-конце "Т-цепи"* (дуплекс (Ос1)), затрудняет связывание ДНК-дуплекса с ЫР-кВ. Аналогичная связь между цепями на 5'-конце "Т-цепи", наоборот, стабилизирует комплекс ДНК-дуплекса с белком (дуплекс (Рс1)). Комплекс белка с ДНК-дуплексом (0е1), содержащим две связи между цепями (как с З'-конца, так и с 5'-конца "Т-цепи" по отношению к участку связывания ЫР-кВ), как и следовало ожидать, имеет константу диссоциации, практически равную константе диссоциации комплекса белка с дуплексом (в) (табл. 2).

Таким образом, полученные результаты говорят в пользу предположения об определенной ориентации белка при образовании комплекса с ДНК. Действительно, если фиксация цепей в районе З'-конца "Т-цепи" критична для связывания белка, то подобная фиксация в районе 5'-конца "Т-цепи" не только не мешает связыванию, но даже способствует этому процессу.

Полученные результаты, в сочетании с данными о повышенной термодинамической стабильности синтезированных соединений и их устойчивости к нуклеазному гидролизу, позволяют рекомендовать ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями в качестве эффективных "ловушек" для НК-связывающих белков. Благодаря разработанным методикам синтез таких соединений уже не представляется задачей повышенной сложности. По нашему мнению, ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями могут стать удобным инструментом для изучения процессов НК-белковых взаимодействий.

* Пол "Т-цепыо" понимается та цепь в составе ДНК-дуплексов, которая содержит кластер Т3.

23

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый эффективный метод синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями на основе модифицированных олигонуклеотидов, один из которых содержит 2'-амино-2'-дезоксинуклеозид, а второй ненуклеозидную вставку с локализованной на ней карбоксильной группой. В оптимальных условиях выход ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями достигает 85%.

2. Показано, что разработанным методом можно получать ДНК-дуплексы с цепями, связанными в заранее заданных положениях двойной спирали, в том числе возможно получение ДНК-дуплексов с несколькими связями между цепями.

3. Разработаны методы получения модифицированных амидофосфитных компонентов автоматического олигонуклеотидного синтеза, содержащих первичную алифатическую аминогруппу, на основе 2'-амино-2'-дезоксиуридина, 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидина, 9-(р-В-2'-амино-2'-дезокси-арабино-пентафуранозил)аденина, 2-(2-аминопропионил)аминопропандиола-1,3.

4. Получен ряд модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих в своем составе 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды и 2-(2-аминопропионил)аминопропандиол-1,3. Показана высокая реакционная способность алифатических аминогрупп полученных соединений в реакциях с электрофильными реагентами.

5. Изучены физико-химические и субстратные свойства полученных ДНК-дуплексов. Показано, что термодинамическая стабильность ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями и их устойчивость к действию экзонуклеаз существенно повышена по сравнению с немодифицированными аналогами.

6. Показано, что наличие поперечных связей между цепями ДНК-дуплекса ■не препятствует функционированию эндонуклеазы рестрикции Л1а\. Набор продуктов, образующихся в результате ферментативного гидролиза, подтверждает наличие и положение связей между тяжами в полученных ДНК-дуплексах.

7. Показано, что ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями эффективно связываются с транскрипционным фактором ОТ-кВ. Этот факт в совокупности с высокой термодинамической стабильностью и устойчивостью к действию экзонуклеаз позволяет рекомендовать дуплексы с ковалентно связанными цепями для использования в качестве "ловушек" для НК-связывающих белков.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. С.И.Анцыпович. Е.М.Волков, Т.С.Орецкая, Е.А.Романова, В.Н.Ташлицкий, М.Блюменфельд, З.А.Шабарова. Синтез модифицированных олигонуклеотидов и получение из них дуплекса с ковалентно связанными цепями. // Биоорганическая химия, 1995, T.2I, №10, С.774-780.

2. S.I.Antsypovich. T.S.Oretskaya, E.M.Volkov, E.A.Romanova, V.N.Tashlitsky, M.Blumenfeld, Z.A.Shabarova. Synthesis of modified oligonucleotides and production of duplexes with covalently linked chains. // Nucleosides and Nucleotides, 1996, V.15, N.4, P.923-936.

3. С.И.Анцыпович. Т.С.Орецкая, Е.А.Романова, Е.М.Волков,

B.Н.Ташлицкий, М.Вассер, З.А.Шабарова. Синтез и свойства ДНК-дуплексов с ковалентными связями между тяжами. // Биоорганическая химия, 1996, Т.22, №4,

C.264-268.

4. S.I.Antsypovich. T.S.Oretskaya, E.A.Romanova, E.M.Volkov, V.N.Tashlitsky, M.Vasser, and Z.A.Shabarova. Synthesis and properties of cross-linked DNA duplexes. // FEBS Letters, 1996, V.378, P.224-226.

5. S.I.Antsypovich. T.S.Oretskaya, E.A.Romanova, M.Blumenfeld, M.Vasseur and Z.A.Shabarova. Properties and synthesis of cross-linked DNA duplexes. // International conference "Therapeutic oligonucleotides from cell to man", April 1995, Seillac, France. Abstracts Book, P 1-1.

6. T.S.Oretskaya, E.A.Romanova, S.I.Antsypovich. E.M.Volkov, V.N.Tashlitsky, M.Blumenfeld, Z.A.Shabarova. Synthesis of cross-linked DNA duplexes. // "Nucleic acids Symposium", August 1995, Noordwijkerhout, Leiden, the Netherlands. Abstracts of posters, P 22.

7. S.I.Antsypovich. T.S.Oretskaya, and Z.A.Shabarova. New, fast and efficient method to product the cross-linked DNA duplexes. // International congress on therapeutic oligonucleotides "Regulation of gene expression by targeting nucleic acids: chemistry, biology, pharmacology and clinical applications", June 1996, Rome, Italy. Abstracts Book, PC 15, P.77.

8. S.I.Antsypovich. T.S.Oretskaya, and Z.A.Shabarova. New, fast and efficient method to product the cross-linked DNA duplexes. // XII International roundtable "Nucleosides, nucleotides and their biological applications", September 1996, LaJolIa, California, USA. Conference Program and Abstracts, PP II 64, P.248. / I