Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие аминогруппу при C2'-атоме углеводного фрагмента, и получение олигонуклеотидопептидов на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.963.32 577.113.4

Р/В о л

ЗУБИН Евгений Михайлович - г ■

- Д1П, < •

ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ АМИНОГРУППУ ПРИ С2'-АТОМЕ УГЛЕВОДНОГО ФРАГМЕНТА, И ПОЛУЧЕНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОПЕПТИДОВ НА ИХ ОСНОВЕ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

¡Шабарова З.А.|

доктор химических наук, профессор Орецкая Т.С.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Нифантьев Э.Е.

доктор химических наук Михайлов С.Н.

Ведущая организация: Государственный НИИ Генетики и

селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 10 октября 2000 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 10 сентября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета' уу

кандидат химических наук '. Смирнова ИГ.

го ая-А/ _0

Актуальность проблемы. Химический синтез модифицированных олигонуклеотидов представляет собой наиболее интересную и сложную область исследований в органической химии нуклеиновых кислот. В последние 10-15 лет это направление развивается достаточно быстрыми темпами, в первую очередь, благодаря автоматизации процесса получения олигонуклеотидов и их модифицированных производных. Последние могут использоваться как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и в качестве потенциальных терапевтических препаратов при лечении различных вирусных и наследственных заболеваний.

Основные усилия исследователей были направлены на решение, по крайней мере, двух ключевых задач. Первой из них можно считать разработку методов, использование которых позволяет трансформировать структуру нуклеиновых кислот с помощью направленных замен мономерных звеньев и их фрагментов различными аналогами либо за счет присоединения к олигонуклеотидам определенных химических группировок и соединений.

Вторая задача имеет непосредственное отношение к изучению взаимосвязи между структурой модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот и их свойствами. В данном случае целями исследований являются синтез олигонуклеотидных производных, обладающих набором определенных химических, физико-химических и биологических свойств, необходимых для успешного использования полученных соединений в молекулярно-биологических исследованиях, выявление взаимосвязи между этими свойствами и строением самих соединений и, наконец, решение обратной задачи: создание необходимых структур с заданными свойствами.

Вопрос о связи между строением вещества и его свойствами и функциями -основная проблема во многих областях науки. Однако в большинстве случаев установить четкие закономерности не удается. На таком общем фоне нуклеиновые кислоты представляют собой один из наиболее ярких примеров того, насколько тесно важнейшие биологические функции связаны со строением молекулы. Именно по этой причине существует абсолютно реальная основа для применения рациональных подходов к структурному моделированию и синтезу модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот. При этом обязательным условием является перевод молекулярно-биологических или медицинских терминов на специфический язык органической химии, а именно язык структурных формул, в результате чего становится возможным создание химических соединений,

с помощью которых можно в дальнейшем направленно влиять на те или иные процессы, протекающие в клетке.

Изложенные выше общие соображения должны играть ключевую роль при решении тех конкретных задач, которые ставят перед химиками молекулярные биологи или медики. Так, для использования фрагментов нуклеиновых кислот при изучении закономерностей нуклеиново-белкового узнавания или для успешного применения их в качестве высокоэффективных диагностических и терапевтических препаратов необходимым представляется синтез конъюгатов олигонуклеотидов с другими молекулами, обладающими рядом уникальных свойств. Иными словами, к фрагментам нуклеиновых кислот можно ковалентно присоединять различные реакционноспособные или репортерные группировки, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. В этой связи актуальной задачей становится получение одно- .или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп немодифицированных ДНК, что позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.

Целью настоящего исследования являются разработка эффективных методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, в которых алифатическая аминогруппа непосредственно либо с помощью линкера присоединена к С2'-атому углеводного фрагмента одного или нескольких нуклеотидных остатков, и изучение химических и физико-химических свойств полученных соединений. Важной частью настоящей работы также является получение олигонуклеотидопептидов на основе модифицированных таким образом олигодезоксирибонуклеотидов.

Основными этапами работы были синтез модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в автоматическом синтезе олигонуклеотидов, подбор оптимальных условий для встраивания модифицированных звеньев в олигонуклеотидную цепь, и собственно твердофазный синтез олигонуклеотидопептидов.

Научная новизна и практическая ценность. В представленной работе предложены новые эффективные методы синтеза ранее неописанных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 9-(2-амино-2-дезокси--р-0-арабинофуранозил)аденина, 9-[2-(3-аминопропионил)амино-2-дезокси-

-р-0-арабинофуранозил]аденина и 1 -[2-(3-аминопропионил)амино-2-дезокси--р-0-рибофуранозил]урацила соответственно. Особенностью настоящего подхода можно считать то, что алифатическая аминогруппа находится либо непосредственно

при С2'-атоме углеводного фрагмента модифицированного нуклеозида, либо присоединена к нему с помощью линкера. Следует подчеркнуть, что модификация 2-положения углеводного остатка представляется оптимальным вариантом, так как в этом случае возможное искажение структуры одно- и двутяжевых фрагментов ДНК будет относительно незначительным. Помимо этого, разработанная методика синтеза модифицированных олигонуклеотидов предусматривает возможность встраивания как одного, так и нескольких модифицированных мономерных звеньев в любое заранее определенное положение олигомерной цепи при сохранении в целом стандартного регламента автоматического олигонуклеотидного синтеза.

В работе продемонстрирована высокая реакционная способность алифатических аминогрупп в составе олигонуклеотидов в реакциях с электрофильными реагентами. Наличие подобного свойства позволило разработать общий метод получения олигонуклеотидопептидов - соединений, которые могут быть использованы в качестве потенциальных терапевтических агентов в антисмысловой биотехнологии. Основная суть данного подхода состоит в том, что реакцию образования амидной связи между заранее синтезированным №-блокированным пептидом с активированной а-карбоксильной функцией и защищенным олигонуклеотидом, содержащим селективно деблокированную МНг-группу, осуществляют после завершения автоматического олигонуклеотидного синтеза, при этом фрагмент ДНК иммобилизован на нерастворимом полимерном носителе. Проведение конденсации на твердой фазе существенно облегчает процесс выделения целевых олигонуклеотидопептидов. Предложенный подход представляется достаточно гибким, так как позволяет присоединять пептидный фрагмент к любому заранее определенному положению олигонуклеотидной цепи.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты настоящего исследования были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-97" (Москва, апрель 1997 г.) и на IV Международном симпозиуме по олигонуклеотидной химии и биологии (Кембридж, Великобритания, август - сентябрь 1997 г.).

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного методам синтеза олигонуклеотидопептидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылок), содержит рисунков, схем, таблиц.

Для успешного осуществления синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих в своем составе модифицированные нуклеотиды, необходимым представляется решение определенного ряда задач.

1. Синтез модифицированного нуклеозида.

2. Получение из него мономерного звена, которое может быть встроено в олигомерную цепь с минимальными изменениями стандартного регламента автоматического амидофосфитного олигодезоксирибонуклеотидного синтеза.

3. Осуществление синтеза модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов.

4. Выбор способов деблокирования функциональных групп модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов и их выделения.

5. Подтверждение строения синтезированных фрагментов ДНК.

Необходимым этапом исследования также является изучение химических и

физико-химических, свойств модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов. Если синтезированные фрагменты ДНК содержат в своем составе реакционноспособные группировки, очевидной задачей становится получение конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов с молекулами различных соединений. В представленной работе олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие алифатические аминогруппы, были использованы для синтеза олигонуклеотидопептидов.

В соответствии с этим планом построено обсуждение результатов настоящей диссертационной работы.

Синтез №-бензоил-9-(2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-трифторацетамидо--р-о-арабинофуранозил)аденина и М6-бензоил-9-[2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-(9-флуоренил-метоксикарбонил)амино-р-Р-арабинофуранозил]аденина

К началу 90-х годов в ходе исследований, проводившихся немецкими учеными под руководством профессора Ф. Экштайна в институте М. Планка и параллельно сотрудниками химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, были разработаны достаточно эффективные методы -получения олигонуклеотидов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксирибопиримидиновые звенья. Введение аминогруппы в 2'-положение углеводного фрагмента представляется крайне интересным с той точки зрения, что такая модификация остатка дезоксирибозы в олигонуклеотидах изменяет свойства последних, например, повышает их устойчивость к нуклеазному

гидролизу. Высокая реакционная способность 2'-аминогрупп в составе олигонуклеотидов была продемонстрирована в реакциях с флуоресцеинизотиоцианатом, а также с ангидридами уксусной и янтарной кислот. Встраивание в олигомерную цепь 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозидов может оказаться весьма полезным для последующего присоединения к олигонуклеотидам различных репортерных групп, синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями и конъюгатов с пептидами.

Результаты физико-химических исследований показывают, что введение 2'-амино-2'-дезоксирибопиримидиновых звеньев в одну из цепей ДНК-дуплекса приводит к существенному понижению его температуры плавления. В данном случае природу негативного влияния остатков 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозидов на термическую стабильность ДНК-дуплексов в какой-то степени могло бы прояснить обращение конфигурации у С2'-атома. С этой цепью, а также для определения того, в какой степени расположение 2'-аминогруппы в пространстве влияет на ее реакционную способность, мы осуществили синтез ранее неописанных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 9-(2-амино-2-дезокси--р-о-арабинофуранозил)аденина.

Схема получения целевого нуклеозида с защищенными функциональными группами (схема 1) предусматривает: бензоилирование экзоциклической аминогруппы аденозина (1); селективное блокирование 3'- и 5-гидроксильных групп ^-бензоиладенозина (2) с использованием 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропил-дисилоксана (Т1Р05-С12, реагент Маркевича); превращение 2'-гидроксила соединения (3) в реакционноспособную трифторметансульфонатную (трифлатную) Фуппу; нуклеофильное замещение 2'-трифторметансульфонатной группы 3',5-0,(^-блокированного аденозина (4) азид-ионом с обращением конфигурации при С2'-атоме; удаление защиты Маркевича фторидом тетрабутиламмония; блокирование 5-гидроксила соединения (6) диметокситритильной защитной группой; восстановление азидогруппы трифенилфосфином. Для блокирования введенной аминогруппы использовали либо трифторацетильную, либо 9-флуоренилметоксикарбонильную (Ятос) защитную группировку.

?н2

N---

о

х

^С6Н5

Схема 1

<х 3

(СН3)35Ю1

НО он 1

2. С6Н5СОС1

3. т3-н2о

оо

N

Ьг

Ade

У7

но он 2

ПРРв-С!; ¡-Ргч /0—

¡-Рг'

^—О ОН ¡-Рг/ У-Рг

3

Ade

Ьг

Ade

Ьг

Ade

Ьг

(СР3зо2)2О_ ¡-Р\

1-РГ

.У/

—о оэо2СР3 ¡-Рг/ \РГ

им, ¡-Ргч -О.

¡-Рг^|

о.

—О

¡-Рг/ \РГ

п-Ви^Т"

НО

НО

Ade

Ьг

ОМТгС!

ОМТЮ

1. РИ3Р

2. Н20

Ade

Ьг

ОМТЮ—1

СРзСОЭЕ!

или

но

V

но

рто°-05и - ".....

Ade

ОМТЮ—1 ^о.

V

но

9

Я = ТГа или Ртос

Ьг

Синтез 1-(2-дезокси-5-0-диметокситритип-2-трифторацетамидо--р-о-рибофуранозил)урацила

При получении пиримидиновых 2'-амино-2'-дезоксирибонуклеозидов чаще всего используется прием, при котором природный нуклеозид сначала превращают в Ог,2'-циклопроизводное с последующим раскрытием кольца под действием азид-иона в абсолютной среде и восстановлением азидогруппы.

Для оптимизации методики получения 02,2'-циклоуридина нами была предложена другая схема синтеза (схема 2), которая предусматривает селективное блокирование 3',5'-гидроксильных групп уридина (10) с помощью 1,3-дихлор--1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксана, получение 2'-0-метансульфоната уридина (12) с использованием хлорангидрида метансульфокислоты и, наконец, образование 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-02,2'-циклоуридина (13) при нагревании до 50°С в присутствии одного эквивалента органического основания 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундецена-7 (ЭВи) или 2-трет-бутилимино-2-диэтиламино--1,3-диметилпергидро-1,3,2-диазафосфорина (ВОЭОР).

Обычно при решении той или иной синтетической задачи стремятся сократить количество стадий, так как с увеличением числа последних уменьшается общий выход. В данном случае этого удалось избежать, так как выходы продуктов на каждой из трех стадий достаточно высоки и достигают 97-99%, что можно считать основным достоинством предложенного подхода.

Дальнейший этап синтеза 2'-амино-2'-дезоксиуридина включал ряд последовательных превращений (схема 2): обработку 02,2'-циклопроизводного уридина (13) азидом лития; удаление защиты Маркевича фторидом тетрабутиламмония, блокирование 5-гидроксила соединения (15) диметокситритильной защитной группой; восстановление 2'-азидогруппы трифенилфосфином. Для блокирования 2'-аминогруппы использовали щелочелабильную трифторацетильную защитную группу.

Схема 2

Синтез №-бензоил-Э-{2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-[М-(9-флуоренил-метоксикарбонил)-3-аминопропионил]амино-р-о-арабинофуранозил}аденина и 1-{2-дезокси-5Ю-диметокситритил-2-[^(9-флуоренилметоксикарбонил)-•3-аминопролионил]амино-р-0-рибофуранозил}ур&ЦиЛа

В ряде случаев синтез конъюгатов олигонуклеотидов с молекулами других соединений осуществляют таким образом, чтобы две части конъюгата были соединены между собой "мостиком". Этот "мостик" необходим для того, чтобы отодвинуть на определенное расстояние от олигонуклеотидной цепи фрагмент ненуклеотидной природы, так как последний может изменять характер взаимодействия олигонуклеотида с белками или с НК-мишенью нежелательным образом. Руководствуясь этими соображениями, мы предприняли синтез олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 2'-(3-аминопропионил)амино--2'-дезоксиарабиноаденозина и 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезоксиуридина. При этом в качестве линкера, содержащего на конце алифатическую аминогруппу, нами был использован р-апанин.

Ключевой стадией синтеза модифицированных нуклеозидов (20) и (21) (схема 3) является ацилирование 2'-аминогруплы 2'-амино-2'-дезоксиарабино-аденозина (8) или 2'-амино-2'-дезоксиуридина (17) активированным производным Ы-Ртос-блокированного р-аланина (19).

Схема 3

Ас1е

+ >—о.

ига

Г"

ОМТгО—, ^ \ н

7 -КРтос

Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов

З'-Амидофосфиты модифицированных нуклеозидов получали с использованием в качестве фосфитилируюицего агента 2-цианэтил--Ы^-диизопропиламидохлорфосфита. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов осуществляли по амидофосфитной схеме на синтезаторе Applied Biosystems 380В (США) с использованием коммерческих реагентов в соответствии со стандартным регламентом. З'-Амидофосфиты модифицированных нуклеозидов использовали в виде растворов в абсолютном ацетонитриле с концентрацией 0,15 М. На стадии присоединения модифицированных мономерных компонентов к олигомерной цепи время реакции увеличивали до 25-30 минут. Степень превращения на этой стадии была несколько меньше, чем для З'-амидофосфитов природных 2'-дезоксирибонуклеозидов, и составляла около 90-95%. Деблокирование модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов и их выделение проводили по стандартной методике.

Нами были синтезированы следующие олигодезоксирибонуклеотиды (5'—»3'):

TTTaAnTT (I)

CTACaA"CaAnCGC (II)

GaAnCCaA"CCGCGCT (III)

TGCGaAnGaAnGTAGG (IV)

GCCAaAnTCGGAAAGTCCCCTCTACCG (V)

GCTCCCAGGCTCaAnAA (VI), где aAn - остаток 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина (рис. 1).

TTTTAlnTT (VII)

GACCAlnCCGCGCT (VIII)

CGGTAGAGGGGACTTTCCGAaAlnTGGC (IX)

GCTCCCaAlnGGCTCAAA (X)

GCTCCCAGGCTCaA'nAA (XI),

где aAln - остаток 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезоксиарабиноаденозина (рис. 1).

AGCTCCCAGGCUlnCAA (XII),

где Uln - остаток 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезоксиуридина (рис. 1).

Олигонуклеотиды (I), (II) и (VII) - модельные соединения, полученные при отработке условий синтеза. Олигонуклеотиды (III) и (VIII) комплементарны участку 5S РНК рибосом Е. coli. Нуклеотидная последовательность олигомера (IV) была выбрана с учетом синтезированного ранее олигонуклеотида, содержащего остатки 2'-амино-2'-дезоксиуридина, с целью дальнейшего корректного сравнения свойств модифицированных олигонуклеотидов обоих типов. Олигонуклеотиды (V) и (IX) содержат участок связывания фактора транскрипции NF-кВ, а олигонуклеотиды (VI), (X), (XI) и (XII) комплементарны фрагментам TAR РНК - участка связывания белка Tat ВИЧ-1.

Ade

o-,

h2n-

aAn

Ade

o-, ^o.

hn,

aA

nh2

Ura

V4,

nh2

Uln

Рис. 1.

o

o hn

Нуклеозидный состав модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов подтверждали их исчерпывающим гидролизом до нукпеозидов смесью фосфодиэстеразы змеиного яда и щелочной фосфатазы в течение 3 часов при 37°С с последующим анализом гидролизата методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и сравнением с контрольными смесями 2'-дезоксинуклеозидов. При гидролизе олигодезоксирибонуклеотидов на хроматограмме наблюдали пять пиков, из которых четыре соответствовали природным нуклеозидам, а пятый - соответствующему модифицированному нуклеозиду. Соотношение пиков и последовательность выхода компонентов смеси соответствовали расчетным данным. Строение

олигодезоксирибонуклеотида (VIII) было также подтверждено с помощью масс-спектрометрии (MALDI).

Изучение реакционной способности алифатической аминогруппы модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов

Полученные модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды представляют собой малоизученный класс соединений, и исследование их химических свойств имеет большое значение, в том числе и для определения дальнейших областей их применения.

Высокая реакционная способность алифатической аминогруппы в составе олигонуклеотидов была продемонстрирована в реакциях ацилирования. Так, при действии на модифицированные олигонуклеотиды уксусного или янтарного ангидрида во всех случаях были получены продукты, отличающиеся по времени удерживания от исходных олигонуклеотидов со свободной 2'-аминогруппой при анализе методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте

Ранее [С.И. Анцыпович и др., 1995] был описан синтез ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями. Для соединения цепей дуплекса была выбрана реакция меоду 2-аминофуппой 2'-амино-2'-дезоксирибопиримидинового звена, находящегося в одном из тяжей, и карбоксильной группой, локализованной на ненуклеозидной вставке в комплементарной цепи. Эта реакция, протекающая в присутствии водорастворимого карбодиимида, приводила к образованию амидной связи между цепями. В данном случае приходится считаться с определенным искажением структуры и, как следствие, снижением прочности ДНК-дуплекса, что связано с отсутствием гетероциклического основания в одном из его тяжей. Решить в какой-то степени эту проблему можно, попытавшись сохранить комплементарную пару в месте образования связи между тяжами ДНК-дуплекса, например, если реакция будет протекать между алифатической аминогруппой остатка 2'-амино--2'-дезоксиуридина, локализованного в одном из тяжей, и карбоксильной функцией, полученной при ацилирования янтарным ангидридом остатка 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезоксиарабиноаденозина комплементарной цепи.

Для получения ДНК-дуплекса с ковалентно связанными тяжами были использованы два 25-звенных ДНК-дуплекса А и В (схема 4). В каждом из них одна цепь содержала карбоксильную группу, а вторая - аминогруппу. Различие между

данными дуплексами состоит в том, что в дуплексе А свободной является аминогруппа остатка 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезоксиарабиноаденозина, тогда как в В - 2'-аминогруппа остатка 2'-амино-2'-дезоксиуридина.

Реакцию между цепями осуществляли в буферном растворе, содержащем 2-(Ы-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), при рН 4,6 в течение 3 суток при 25°С с использованием водорастворимого 1-этил-3-(3-диметиламино)пропкп-карбодиимида в качестве конденсирующего агента. Реакционные смеси анализировали методом гель-электрофореза в 20%-ном ПААГ в присутствии 7 M мочевины.

Схема 4

В обоих случаях при анализе реакционных смесей на радиоавтографе наблюдали появление нового продукта, подвижность которого в геле соответствовала подвижности 50-звенного олигонуклеотида (рис. 2). Продуктом реакции между цепями в каждом из дуплексов А и В является один и тот же дуплекс С с ковапентно связанными цепями (схема 4). Однако в зависимости от структуры исходных олигонуклеотидов выходы целевого продукта существенно различались. В выбранных условиях выход дуплекса С составил: в случае А - 37%, а в случае В -63%. Такое различие выходов целевого продукта связано со специфическими свойствами 2-аминогруплы в остатке 2'-амино-2'-дезоксиуридина. Значение рКа этой аминогруппы существенно ниже (рКа 6,2), чем значение рК, обычной первичной алифатической аминогруппы. В связи с этим в выбранных условиях реакции между цепями 2'-аминогруппа 2'-амино-2'-дезоксиуридина в значительной степени остается в непротонированной форме, что положительным образом сказывается на ее нуклеофильности.

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Радиоавтограф гель-электрофореза (20%-ный ПААГ, содержащий 7 М мочевину) олигонуклеотида (IX) (1), реакционной смеси при проведении реакции между цепями ДНК-дуплекса А (2), олигонуклеотида (XIII) (3), олигонуклеотида (XV) (4), реакционной смеси при проведении реакции между цепями ДНК-дуплекса В (5), олигонуклеотида (XIV) (6). ХС - положение красителя - маркера ксиленцианола.

Изучение физико-химических и субстратных свойств олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 9-(2-амино-2-дезокси--Р-0-арабинофуранозил)аденина

Термическая устойчивость дуплексов, образованных модифицированными олигодезоксирибонуклеотидами и комплементарными им олигодезоксирибо-нуклеотидами, была изучена методом УФ-спектроскопии (таблица).

Таблица. Термическая стабильность ДНК-дуплексов

Шифр ДНК-дуплекс 5' -» 3' 3' 5' Тпл, °С (±1)

О СТАСТСТСвС вСАТСАСАСССТ 48

Е СТАС Т С Т ССС ССАТСаАпСаАпСССТ 44

? СТАСипСипССС СвАТСА вА ССвТ 30

в СТАС и"С ипССС ССАТСаАпСаА"СС6Т 29

Н АССАССССССТ ССТССТССССССАСГС 63

1 СаАпССаАпССССССТ СС Т йС Т ССССССАСТС 57

и АССАС"ССССС"Т ССТвСТС ССССв АвТС 53

II" - 2'-амино-2'-дезоксиуридин, С" - 2'-амино-2'-дезоксицитидин.

Было обнаружено, что введение двух остатков 2'-амино-2'-дезоксиарабино-аденозина в одну из цепей ДНК-дуплекса приводит к некоторому понижению его температуры плавления. Так, значения температуры плавления дуплексов Е (44°С) и I (57°С) оказались соответственно на 4°С и 6°С ниже значений температуры плавления немодифицированных дуплексов О и Н. При сравнении влияния, которое оказывает на термическую устойчивость ДНК-дуплекса введение в один из его тяжей остатков 2'-амино-2'-дезоксирибопиримидиновых нуклеозидов и 2'-амино-2'-дезокси-арабиноаденозина, можно утверждать, что наличие последнего приводит к значительно меньшему снижению термической устойчивости ДНК-дуплекса. Значения температуры плавления дуплексов Р и и с 2'-амино-2'-дезокси-рибопиримидиновыми вставками были на 18°С и 10°С ниже значений температуры плавления немодифицированных дуплексов О и Н. Интересно отметить, что температура плавления дуплекса в, в противоположных тяжах которого друг напротив друга находятся по два остатка 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 2'-амино--2'-дезоксиарабиноаденозина, оказывается ниже температуры плавления немодифицированного дуплекса на 19°С.

Для характеристики межплоскостных взаимодействий в модифицированных олигодезоксирибонуклеотидах были изучены КД-спектры динуклеозидфосфатов ТраА", аА"рТ и ТраА"р (рис. За,б).

220 240 260 280 300 320 X, им

240 260 280 300 320 X, нм

Рис. За,б. Спектры КД ТраА" (1), ТраАлр (2), ТрА (3), аА" + рТ (4), АрТ (5), аАпрТ (6) в БЭС-буфере (рН 7,25).

Спектр ТраА" (рис. За) имеет характерный экситонный тип, отличный от спектра невзаимодействующих компонентов, что свидетельствует о наличии стэкинг-взаимодействий. Заметим, что наличие фосфатной группы на З'-конце модифицированного динуклеозидфосфата ТраАлр не приводит к значительным изменениям КД-спектра. Напротив, спектр аАпрТ (рис. 36) близок к суммарному спектру составляющих его мономеров, что свидетельствует о почти полном отсутствии межпло'скостных взаимодействий гетероциклических оснований.

Нами была исследована устойчивость модифицированного олигонуклеотида (II) к действию фосфодиэстеразы змеиного яда по сравнению с его ^модифицированным аналогом СТАСАСАССС. При анализе методом ион-парной ВЭЖХ было обнаружено, что ферментативный гидролиз немодифицированного элигонуклеотида (рис. 4а) протекает с большой скоростью, при этом наблюдается появление олигонукпеотидных фрагментов различной длины, которые подвергаются дальнейшему ферментативному гидролизу.

Зис. 4. ВЭЖХ-анализ (ион-парный вариант) продуктов гидролиза фосфодиэстеразой шейного яда: (а) - немодифицированного олигонуклеотида СТАСАСАССС; (б) -юдифицированного олигонуклеотида (II). Цифры над пиками соответствуют длинам ¡лигонуклеотидов.

Характер гидролиза олигонуклеотида (II), содержащего два кодифицированных звена, принципиально иной (рис. 46). В подобранных условиях юлный ферментативный гидролиз олигонуклеотида (II) не происходит за 60 мин в >тличие от его немодифицированного аналога. Наблюдается накопление 7-звенного

олигонуклеотида - продукта частичного гидролиза, содержащего модифицированное звено на З'-конце (рис. 46). Его дальнейший гидролиз протекает очень медленно. Это свидетельствует о том, что наличие 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина в олигомерной цепи существенно затрудняет действие экзонуклеаз.

Синтез олигонуклеотидопептидов

Комплексное решение проблем антисмысловой биотехнологии в общем случае предполагает дизайн и синтез такого олигонуклеотида, который проникал бы в клетку, обладал устойчивостью к действию экзонуклеаз, образовывал стабильный комплекс с НК-мишенью и при этом не был бы токсичным. Как известно, немодифицированные фрагменты ДНК плохо проникают в клетку. Успешное применение методов органического синтеза позволяет присоединять к олигонуклеотидам такие молекулы, которые обладают способностью проникать через клеточную мембрану, и таким образом облегчают внутриклеточную доставку олигонуклеотидов. При решении этой задачи перспективным подходом может оказаться использование конъюгатов олигонуклеотидов с различными пептидами. Кроме того, в ряде случаев конъюгация с пептидными фрагментами способствует также увеличению стабильности комплекса, образованного антисмысловым олигонуклеотидом с комплементарным одноцепочечным участком ДНК или РНК.

Анализ литературных данных показывает, что при синтезе олигонуклеотидопептидов существенными являются несколько параметров, от которых зависит, насколько успешно будут протекать процессы проникновения конъюгата в клетку и подавления с его помощью экспрессии генов. Решающее значение имеет тип и длина модифицированного фрагмента нуклеиновой кислоты, аминокислотная последовательность и размер пептида, а также способ конъюгации и строение звена, соединяющего между собой две части гибридной молекулы. Возможность в широких пределах варьировать все эти параметры и использовать их различные комбинации является причиной появления большого количества разнообразных методов получения олигонуклеотидопептидов. В то же время нельзя не заметить, что из-за ряда серьезных недостатков лишь малая часть из предложенных идей нашла реальное применение в синтезе конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов с пептидами, способными проникать через клеточную мембрану. В этой связи поиск оптимальных подходов к синтезу олигонуклеотидопептидов представляется крайне актуальным.

Суть предлагаемого нами метода состоит в том, что процесс получения олигонуклеотидопептидов осуществляют на нерастворимом полимерном носителе, к которому после завершения автоматического синтеза все еще присоединен полностью защищенный олигонуклеотид (схема 5). Сначала необходимо избирательно деблокировать алифатическую аминогруппу, присоединенную непосредственно либо с помощью линкера к С2'-атому углеводного фрагмента одного из нуклеотидных остатков. Затем в результате реакции свободной ЫНг-группы и а-карбоксильной группы защищенного пептидного фрагмента в присутствии конденсирующего агента происходит образование амидной связи между двумя молекулами. На завершающем этапе конъюгат отделяют от полимерного носителя и деблокируют функциональные группы олигонуклеотидного и пептидного <омпонентов.

Предложенный подход позволяет присоединять к олигонуклеотиду сразу ^сколько пептидных фрагментов, так как модифицированное звено, содержащее алифатическую аминогруппу, может быть встроено в любое заранее определенное юложение олигомерной цепи, а само количество вставок в принципе не ограничено. Серьезным преимуществом является также то, что 5'- и З'-концы олигонуклеотидного фрагмента конъюгата остаются свободными. Это обстоятельство позволяет фисоединять к ним различные репортерные группы, например, радиоактивные или флуоресцентные метки.

Для конъюгации с пептидами нами были использованы )лигодезоксирибонуклеотиды, содержащие в своем составе остаток одного из трех /юдифицированных нуклеозидов: 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезокси-фабиноаденозин (аА|л), 2'-(3-аминопропионил)амино-2'-дезоксиуридин (и'п) или !'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозин (аА").

Ртос-группу удаляли под действием 50%-ного раствора морфолина в 1иметилф0рмамиде в течение 1 часа. Основное преимущество при использовании :гтюс-группы состоит в том, что ее можно удалить двумя разными способами. 1ервый вариант предполагает, что деблокирование ЫН2-группы происходит таким се образом, что и в случае применения трифторацетильной защиты, то есть при остсинтетической обработке олигонукпеотида насыщенным водным раствором ммиака. Другой метод заключается в удалении Ртос-группы морфолином в бсолютной среде, что позволяет избирательно деблокировать алифатическую миногруппу в составе олигонукпеотида. В данных условиях олигонуклеотид не тщепляется от полимерного носителя, а все остальные его функциональные

группы остаются блокированными, как было показано при обработке модельного димера ТрТ морфолином в течение нескольких часов.

Схема 5

рмтю-

защищенныи олигонуклеотид

НМРтос

Г~\ нм о

омтю-

защищенныи олигонуклеотид

N14,

РтосМ-Н

нвти

защищенный пептид

Vй

омтю-

защищенныи олигонуклеотид

ЙидЬ°-@)

Ятосы—(защищенный н i_пептил

V

1. NN3-420

2. 80%-ная СН3СООН

но—[олигонуклеотид]—он

Н2Ы-[ пептид

V"

Ртос-группу удаляли под действием 50%-ного раствора морфолина в диметилформамиде в течение 1 часа. Основное преимущество при использовании Ртос-группы состоит в том, что ее можно удалить двумя разными способами. Первый вариант предполагает, что деблокирование ЫНг-группы происходит таким же образом, что и в случае применения трифторацетильной защиты, то есть при

постсинтетической обработке олигонуклеотида насыщенным водным раствором аммиака. Другой метод заключается в удалении Ртос-группы морфолином в абсолютной среде, что позволяет избирательно деблокировать алифатическую аминофуппу в составе олигонуклеотида. В данных условиях олигонуклеотид не отщепляется от полимерного носителя, а все остальные его функциональные группы остаются блокированными, как было показано при обработке модельного димера ТрТ морфолином в течение нескольких часов.

Для синтеза олигонуклеотидопептидов были выбраны два коротких пептида №-Ртос-1_еи-С1у и №-Ртос-Туг-0-А1а-РЬе-С1у. В обоих случаях С-концевым аминокислотным остатком является остаток глицина. При активации а-карбоксильной группы этих пептидов нет опасности рацемизации из-за отсутствия в молекуле глицина асимметрического атома углерода.

В качестве конденсирующего агента был использован гексафторфосфат бензотриазолил-^окси-Ы.Ы.Ы'.Ы'-тетраметилурония (НВТ11). НВТ1) нередко применяют в твердофазном пептидном синтезе. Важным представляется также то обстоятельство, что использование данного реагента позволяет проводить конденсацию при наличии незащищенной гидроксильной функции остатка тирозина.

Реакцию между №-блокированным пептидом и олигодезоксирибо-нуклеотидом, иммобилизованным на СРС-500, проводили в абсолютном циметилформамиде в присутствии НВТ1) и этилдиизопропиламина. Реакция протекала за 1-2 часа, как правило, с высоким выходом (80-90%) (например, см. эис. 5). Использование твердофазного метода позволяет применять большие избытки пептидов и конденсирующего агента. Это повышает эффективность эбразования амидной связи, а избытки хорошо растворимых в диметилформамиде эеагентов легко удаляются тщательной промывкой полимерного носителя. После экончания реакции отщепление конъюгата от полимерного носителя и деблокирование функциональных групп осуществляли под действием насыщенного зодного раствора аммиака при 55°С в течение 12-18 часов. Гидрофобные свойства ^иметокситритильной группы, находящейся на 5'-конце олигонуклеотидного фрагмента, были использованы при выделении олигонуклеотидопептидов методом збращенно-фазовой ВЭЖХ. После удаления диметокситритильной группы 80%-ным юдным раствором уксусной кислоты анализ чистоты олигонуклеотидопептидов >существляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте. Строение полученных соединений подтверждали данными масс-спектрометрии МАШ1).

а

0 07

0.06

0 05

0.04

б

1

0.03

0 01

0 02

О.ОО

О

5

10

15

20

1, МИН

Рис. 5. ВЭЖХ-анализ (ион-парный вариант): а) реакционной смеси, полученной при синтезе конъюгата опигонуклеотида (X) с дипептидом 1еи-в1у; б) этой же смеси, но с добавлением в качестве контроля олигодезоксирибонуклеотида (X) (1 - продукт реакции, 2 - олигодезоксирибонуклеотид (X)).

Определенные трудности могут возникнуть при синтезе конъюгатов олигонуклеотидов с более длинными пептидами, так как в этом случае достаточно трудно активировать а-карбоксильную группу, и, кроме того, необходимые избытки едва ли оправданы с экономической точки зрения. В качестве альтернативного варианта можно использовать подход, предполагающий последовательное присоединение к олигонуклеотиду небольших пептидных фрагментов. После того как первый фрагмент уже присоединен, необходимо удалить ЬР-Ртос-группу. Далее можно вводить в реакцию следующий фрагмент. Таким образом, используя №-Ртос-1еи-С1у и №-Ртос-Туг-0-А1а-РЬе-С1у, нам удалось синтезировать конъюгаты олигодезоксирибонуклеотидов с пептидами, содержащими 4 и 8 аминокислотных остатков (например, см. рис. 6). Таким образом, предложенный нами метод может оказаться достаточно удобным для получения конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов с пептидами, способными проникать через клеточную мембрану.

>ис. 6. ВЭЖХ-анализ (ион-парный вариант): а) реакционной смеси, полученной при :интезе конъюгата опигонуклеотида (XI) с пептидом Leu-Gly-Leu-Gly олигонукпеотидопептид получен в результате последовательного двукратного |рисоединения дипептида); 6) этой же смеси, но с добавлением в качестве контроля шигодезоксирибонуклеотида (XI); в) выделенного конъюгата опигонуклеотида (XI) с юптидом Leu-Gly-Leu-Gly (1 - продукт реакции, 2 - олигодезоксирибонуклеотид (XI)).

Полученные олигонукпеотидопептиды предполагается использовать для шокирования функционально значимой нуклеотидной последовательности, >бозначаемой TAR. Она находится на 5'-конце всех мРНК вируса иммунодефицита юловека и является участком связывания белка Tat, играющего ключевую роль в кспрессии генов ВИЧ-1.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены производные аденозина и уридина, содержащие алифатическую аминогруппу, присоединенную к С2'-атому углеводного фрагмента с помощью линкера: амидофосфиты Ы6-бензоил-9-{2-дезокси--5-0-диметокситритил-2-[Ы-(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-аминопропионил]-амино-р-о-арабинофуранозил)аденина и 1-{2-дезокси-5-0-диметокситритил--2-[Ы-(9-флуоренилметоксикарбонил)-3-аминопрогионил]амино-р-0-рибофурано-зил}урацила.

2. Предложен эффективный метод синтеза З'-амидофосфитных производных 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина - Ы6-бензоил-9-(2-дезокси-5-0-диметокси-тритил-2-трифторацетамидо-р-0-арабинофуранозил)аденина и Ы6-бензоил--9-[2-дезокси-5-0-диметокситритил-2-(9-флуоренилметоксикарбонил)амино--р-й-арабинофуранозил]аденина.

3. Впервые получены модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остатки 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина, 2'-(3-амино-пропионил)амино-2'-дезоксиарабиноаденозина и 2'-(3-аминопропионил)амино--2'-дезоксиуридина.

4. Показана высокая реакционная способность алифатических аминогрупп модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов в реакциях с электрофильными реагентами.

5. Обнаружено, что введение остатков 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина в одну из цепей ДНК-дуплекса приводит к некоторому понижению его температуры плавления. Наличие 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина в олигонуклеотидной цепи существенно затрудняет протекание ферментативного гидролиза под действием фосфодиэстеразы змеиного яда.

6. Предложен эффективный метод твердофазного синтеза олигонуклеотидопептидов, основанный на использовании олигодезоксирибонуклеотидов, в которых аминогруппа непосредственно либо с помощью линкера присоединена к С2'-атому углеводного фрагмента.

Список публикаций

. Зубин Е.М., Анцыпович С.И., Орецкая Т.С., Романова Е.А., Волков Е.М., Ташлицкий В.Н., Шабарова З.А. Синтез модифицированных олигодезоксирибо-нуклеотидов, содержащих 9-(2'-амино-2'-дезокси-р-о-арабинофуранозил)аденин. // Биоорганическая химия. 1997. Т. 23. N 10. С. 809-816. !. Zubin Е.М., Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Dolinnaya N.G., Shabarova Z.A. Synthesis and properties of modified oligodeoxyribonucleotides containing 9-(2-amino-2-deoxy-p-D-arabinofuranosyl)-adenine. // Nucleosides and Nucleotides. 1998. V. 17. N 1-3. P. 425-440. I. Качалова A.B., Зубин E.M. Синтез модифицированных олигодезоксирибо-нуклеотидов, содержащих 1 -(2-амино-2-дезокси-р-0-арабинофуранозил)урацил. //Доклады Академии наук. 1998. Т. 363. N 4. С. 507-509. I. Зубин Е.М., Крынецкая Н.Ф., Романова Е.А., Орецкая Т.С. Гибридазное расщепление РНК. Олигодезоксирибонуклеотидные зонды с включениями модифицированных нуклеозидов, содержащих при С2'-атоме амино- или гидроксильную группу. // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 1999. Т. 40. N 5. С. 330-334. i. Zubin Е.М., Romanova Е.А., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Korshunova G.A., Shabarova Z.A., Oretskaya T.S. Oligonucleotide-peptide conjugates as potential antisense agents. // FEBS Letters. 1999. V. 456. N 1. P. 59-62. i. Зубин E.M. Синтез и свойства модифицированных олигонуклеотидов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозин. // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-97". Апрель 1997. Москва. Т. 4. С. 14. '. Oretskaya T.S., Zubin Е.М., Antsypovich S.I. Synthesis and properties of modified oligodeoxyribonucleotides containing 9-(2-amino-2-deoxy-p-D-arabinofuranosyl)-adenine. // 4th Cambridge Symposium "Oligonucleotide Chemistry and Biology". 31 August - 3 September 1997. Cambridge, UK. P. 71.

¿¿cfJc^-