Разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов с использованием Н-фосфонатной конденсации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Биологический факультет Московская государственная академия тонкой химической технологии

им. М.В.Ломоносова

На правах рукописи

Есипов Дмитрий Станиславович

Разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов с использованием Н-фосфонатной

конденсации

/

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: Доцент,

кандидат химических наук

Добрынин В.Н.

Член-корреспондент РАМН,

доктор химических наук, профессор Швец В.И.

Москва - 1999

Содержание

Список используемых сокращений......................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................6

н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов..........................................................6

Нуклеозид Н-фосфонаты (методы получения)....................................................................9

синтез олигодезоксирибонуклеотидов..............................................................................14

Стадия детритилированш..................................................................................................16

Стадия конденсации.............................................................................................................17

Стабильность олигонуклеотид Н-фосфонатов................................................................23

Стадия хеширования.............................................................................................................24

Стадия окисления.................................................................................................................25

синтез модифицированных олигонуклеотидов...............................................................28

заключение..............................................................................................................................40

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................................................41

Разработка методов синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по 5'- или 3'-концу..........................................................................................................................................43

Синтез 5 '-фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов......................................43

Синтез олигонуклеотид а, терминированного 3 '-азидотимидином.................................46

Разработка метода синтеза олигонуклеотидов, содержащих липофильные группы .....................................................................................................................................................52

Синтез церамидфосфотимидина........................................................................................52

Синтез церамидфосфоазидотимидина..............................................................................56

Разработка метода синтеза модифицированных олигонуклеотидов на основе реакции Тодда-Атертона......................................................................................................59

Изучение устойчивости амидофосфатной межнуклеотидной связи в условиях олигонуклеотидного синтеза...............................................................................................60

Синтез олигонуклеотид а с аминоспейсером и его иммобилизация на поверхности макропористого носителя...................................................................................................64

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................................................................69

Приборы и материалы..........................................................................................................69

Методы..................................................................................................................................71

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................87

Список используемых сокращений

ВЭЖХ - высоко-эффективная жидкостная хроматография

ДХУ - дихлоруксусная кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ABz - N6-6emomi 2' -дезоксиаденозин

Ас20 - уксусный ангидрид

AZT(azT) - З'-азидотимидин

В - нуклеиновые основания

CBz - ]Ч4-беюоил 2' -дезоксицитидин

CPG - control pore glasse (макропористое стекло с контролируемым

размером пор)

DBU - 1,8-диазобицикло-[5.4.0]-ундец-7-ен

DCCD - дициклогексилкарбодиимид

DEAE - диэтиламиноэтил

DMTr - диметокситритильная группа

D4T - 3'-дезокси-2',3'-дидегидротимидин

FmocCl - флуоренилметоксикарбонилхлорид

GlBu - М2-изобутирил 2'-дезоксигуанозин

Melrn - N-метилимидазол

N-MM - N-метилморфолин

(NPh-Et)p - и-нитрофенилэтил фосфат

PivCl - пивалоилхлорид

p-NPh-OH - л-нитрофенол

Ру - пиридин

RT - обратная транскриптаза

Т - тимидин (2'-дезокситимидин)

irei-BuDMe - /ире/и-бутилдиметил

TEA - триэтиламин

ТЕААс - триэтиламмония ацетат

ТЕАВ - триэтиламмония бикарбонат

THF - тетрагидрофуран

TPSC1 - триизопропилбензолсульфохлорид

Tri - триазол

Введение

Олигонуклеотиды в настоящее время являются незаменимыми инструментами для генной инженерии. В последнее время они находят все большее применение и в медицине для диагностики наследственных и вирусных заболеваний. Делаются попытки использовать олигонуклеотидные производные для генетической коррекции организма. Новейшие разработки по использованию иммобилизованных олигонуклеотидов дают возможность реализации высокоскоростного секвенирования нуклеиновых кислот. Модифицированные олигонуклеотиды, несущие различные активные группы, испытываются как терапевтические препараты. Поэтому разработка и совершенствование методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов, а также изучение их физико-химических и молекулярно-биологических свойств является одной из ключевых задач биоорганической химии.

Целью работы являлась разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов, содержащих функциональные группы ненуклеотидной природы или модифицированные нуклеозиды.

Научная новизна и практическая значимость работы. С использованием Н-фосфонатной конденсации разработаны методы введения в олигонуклеотиды 5'-фосфатной группы, 3'-концевого остатка азидотимидина, спейсерной аминогруппы по межнуклеотидному фосфату, липофильного 5'-концевого остатка церамида. Изучена стабильность амидофосфатдиэфирной связи в условиях олигонуклеотидного синтеза. С

помощью разработанных методов осуществлен синтез ряда модифицированных олигонуклеотидов, которые были использованы при химико-ферментативном синтезе протяженного фрагмента ДНК rec А-промотора Е. coli*.

Разработанные методы дают возможность создания новых аффинных лигандов для изучения белок-нуклеиновых взаимодействий. Они также могут быть использованы для приготовления нового класса антисмысловых олигонуклеотидов - потенциальных регуляторов экспрессии генов.

Положения, выносимые на защиту:

Разработка метода получения 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов.

Разработка метода синтеза олигонуклеотидов, содержащих 3'-концевой азидотимидин.

Разработка метода получения липофильных аналогов олигонуклеотидов.

Разработка метода получения олигонуклеотидов, содержащих спейсерные аминогруппы.

* Эта часть работы выполнялась совместно с Калиниченко C.B. (сотрудником лаборатории химии генов ИБХ РАН)

Обзор литературы

Обзор литературы посвящен Н-фосфонатному методу синтеза олигонуклеотидов. В нем рассматриваются основные аспекты Н-фосфонатного метода синтеза олигонуклеотидов, такие как: 1) методы получения мононуклеозид Н-фосфонатов; 2) методы создания Н-фосфонатдиэфирной связи; 3) устойчивость Н-фосфонатдиэфиров, побочные реакции; 4) стадия кепирования; 5) стадия окисления. Обсуждены достоинства и недостатки метода применительно к синтезу модифицированных олигонуклеотидов. В отдельную главу собраны наиболее яркие примеры использования Н-фосфонатного метода для получения модифицированных олигонуклеотидов.

Н-Фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов

Рибонуклеозид Н-фосфонаты для синтеза олигонуклеотидов были впервые применены Тоддом в 1957 г. для приготовления дирибонуклеозид фосфатдиэфиров [1]. Н-Фосфонаты активировались с помощью дифенилхлорфосфата, в дальнейшем этот активатор был использован и в синтезе дезоксирибонуклеотидных димеров [2]. Различные Н-фосфонатные димеры дезокси- и рибо-ряда были получены в растворе и охарактеризованы с помощью физико-химических методов [3].

В дальнейшем, использование в качестве активаторов ацилхлоридов позволило проводить синтез олигонуклеотидов длиной более чем 100

оснований. Н-Фосфонатным методом был осуществлен химический синтез дезоксирибоолигонуклеотидов длиной 107 оснований [4,5]. Модифицированный Н-фосфонатный метод был применен для синтеза 32 олигодезоксирибонуклеотидов длиной от 23 до 28 оснований, которые были использованы для энзиматической сборки гена интерлейкина-4 человека [6, 7].

С развитием автоматического фосфорамидитного метода синтеза олигонуклеотидов делались попытки автоматизировать и Н-фосфонатный метод. Основным препятствием для автоматизации Н-фосфонатного метода являлась скорость прохождения конденсации, а точнее скорость активации Н-фосфонатов. Тем не менее в 1988 году в Новосибирске был разработан автоматический синтезатор "Ген-2", приспособленный к Н-фосфонатному методу. Модифицированная схема синтеза включала детритилирование трифторуксусной кислотой в дихлорметане, промывку ацетонитрилом, вместо смеси пиридина и ацетонитрила, и одностадийное окисление раствором йода в уксусной кислоте и пиридине, вместо двухстадийного в присутствии сильных оснований. Посредством этого метода было синтезировано более 160 полинуклеотидов, содержащих от 8 до 83 мономеров, которые затем были использованы для различных биохимических целей, включая синтез промоторной области (260 п.о.) гена металлотионеина-1 мыши [8].

Таким образом, Н-фосфонатный метод хорошо зарекомендовал себя для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, применяющихся при сборке структурных генов. Систематические исследования показали, что частота

возникновения ошибок после клонирования синтетических фрагментов, полученных с помощью Н-фосфонатного метода, составляет 1 на 241 основание, что являлось вполне приемлемой величиной [9].

Н-Фосфонатный метод с успехом применялся и для синтеза рибоолигонуклеотидов с различными защитными группами по 2'-гидроксилу [10-13]. Олигорибонуклеотиды с длиной цепи от 7 до 34 были синтезированы с использованием о-нитробензильной защиты 2'-гидроксила как в ручном варианте твердофазного синтеза, так и на автоматическом синтезаторе [14]. В работах [15,16] были изучены различные группы для защиты 2'-гидроксильной группы в олигонуклеотидном синтезе с использованием Н-фосфонатного подхода.

Методы автоматизированного синтеза РНК были предложены для приготовления олигонуклеотидов, содержащих тиомодификации фосфатного остова и 2'-0-алкилированную рибозу. Разработаны комбинации фосфорамидитного и Н-фосфонатного методов для введения в олигонуклеотиды биотина, флуоресцентных агентов и других репортерных групп [17].

Таким образом, Н-фосфонатный метод используется не только для рутинного синтеза олигонуклеотидов - инструментов в классических методах генной инженерии, но и нашел широкое применение для синтеза модифицированных олигонуклеотидов - инструментов для изучения нуклеотид-нуклеотидных и белок-нуклеотидных взаимодействий.

Нуклеозид Н-фосфонаты (методы получения)

Нуклеозид Н-фосфонаты - стабильные гигроскопичные твердые вещества, которые могут храниться в атмосфере аргона при О °С более 3-х лет. В смеси пиридин/ацетонитрил Н-фосфонаты стабильны, хотя наблюдается медленная потеря диметокситритильной группы. Соли с 1,8-диазобицикло-[5.4.0]-ундец-7-еном (БВи) более устойчивы [18]. Нуклеозид Н-фосфонаты устойчивы к окислению и окисляются только сильными окислителями, например МПО4"1 [19]. Кроме того, моноэфиры устойчивы к кислотному и основному гидролизу, что является несомненным преимуществом Н-фосфонатов по сравнению с амидитами.

Н-Фосфонаты (III) можно получить при этерификации ОН-группы спиртов (I) фосфоновой КИСЛОТОЙ (НР(0)(0Н)2) (II) в присутствии различных конденсирующих агентов (Схема 1), таких, как триизопропилбензолсульфохлорид (ТРЭО), мезитиленсульфохлорид (М8С1), конденсацией спиртов с РС1з и дальнейшим гидролизом полученного дихлорфосфита (IV), реакцией трис(диалкиламидо)фосфитов (V) с ОН-компонентом и последующим гидролизом диамидофосфита (VI) [20].

1

0=р—о

(VI)

Схема 1

Для получения Н-фосфонатных производных нуклеозидов (IX) было предложено несколько способов синтеза, дающих хорошие результаты. Одним из первых был описан синтез нуклеозид Н-фосфонатных мономеров с использованием фосфитилирующего агента - салицилхлорфосфита (VIII) (Схема 2) [21].

Реакция проходит быстро и с хорошим выходом с образованием небольшого количества побочного продукта - симметричного З'-З' димера нуклеозида. 1 М раствор салицилхлорфосфита в хлористом метилене может храниться в течение 6 месяцев в эксикаторе при -20°С, и поэтому является удобным реагентом для быстрого и рутинного синтеза нуклеозид Н-фосфонатов. Этот реактив имеет два недостатка: 1) гидролиз

промежуточного фосфита приводит к образованию 5% исходного

нуклеозида (VII), который необходимо отделить от продуктов реакции; 2)

салициловую кислоту, образующуюся в ходе гидролиза, трудно отделить от

нуклеозид Н-фосфоната. Этот реагент также может вызвать модификацию

нуклеинового основания, когда используются нуклеозиды без защитных

групп, и приводить к образованию димеров.

о

DMTrO-

(VII)

Ь1

1)

DMTrO-

ОН

2) Aq. ТЕАВ

Схема 2

° (IX)

Н—Р-О"

о

Салицилхлорфосфит (VII) использовался не только для получения Н-фосфонатов нуклеозидов, с помощью этого реактива также были получены производные аминокислот серина (X), треонина (XI) и тирозина (XII).

Vй

h2n

о

о—R

v

сн.

h2n

О—R

h2n о—r

(X)

(XI)

(XII)

Н-Фосфонаты серина (X) или треонина (XI) являлись стартовыми компонентами при образовании фосфатдиэфирной связи с 5'-гидроксилом дезоксирибонуклеотидов. В качестве конденсирующего агента применялся пивалоилхлорид. В этой работе для получения модифицированных

аминокислот использовался также монофункциональный

фосфитилирующий реагент бис-(КГ,]\1-диэтиламино)хлорофосфин (XIII) [22].

Н3а ____СН;

з

н3с. .n. .сн3

-х/-

I

CI

(XIII)

Альтернативным фосфитилирующим агентом является производное РСЬ и триазола (XIV) (Схема 3). Несмотря на меньшую реакционную способность по сравнению с салицилхлорфосфитом (VIII), он широко используется для получения Н-фосфонатов нуклеозидов.

1)

% N-N

DMTrG—i

В

N—N

Р—N

/^N

DWlTr©—i

В

(VII)

И

ОН

N (XIV)

У

2) Aq. ТЕАВ

Схема 3

н—р-о" о

(IX)

Этот способ дает высокие выходы продуктов, которые проще очистить в отличие от производных салициловой кислоты.

Одним из самых надежных и простых способов получения Н-фосфонатов является способ с использованием трис-(1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропил)фосфита (XV) (Схема 4) [23].

ср>

ОМТгО-п

ОМТгО-,

В

(VII)

ох он

1)

/

(XV)

ср3 ср,

В

? (IX)

2) Ая. ТЕАВ

Схема 4

Н—Р-0

о

Метод позволяет получить нуклеозид Н-фосфонаты (IX) с высоким выходом, а избыток фосфитилирующего агента (XV) удаляется простым упариванием.

В работе [24] описан твердофазный синтез олигорибонуклеотидов с использованием Н-фосфонатного подхода, где в качестве защитных групп для 2'- и 5'-гидроксильных функций нуклеозидов применяли 1-[(2-хлоро-4-метил)фенил]-4-метоксипиперидин-4-ильную (Отр) и диметокси-тритильную (БМТг) группы, соответственно. Также подробно обсуждено использование трис-(1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропил)фосфита (XV) для приготовления нуклеозид Н-фосфонатных мономеров.

Недавно было предложено осуществлять синтез Н-фосфонатов нуклеозидов с помощью Н-фосфонатных производных замещенных фенолов (XVI). К-Ацил-5'-защищенные производные дезоксирибонуклеозидов конденсировались с Н-фосфонатными производными фенолов (XVI) в присутствие пивалоилхлорида, приводя к диэфир Н-фосфонатам (XVII) (Схема 5).

ОМТгО—|

йМТгО—

В

К

(VII)

н

он

^ о

Vм (XVI) .

сн3 с1

сн.

Л

сн, О

в

ОМТгО—1

В

.О.

Aq. ТЕАВ

И

(IX)

(XVII)

н—Р=0

о"

Схема 5

Дальнейший гидролиз диэфиров (XVII) в буферной среде (1 М ТЕАВ) приводил к получению З'-Н-фосфонатов нуклеозидов (IX). Эта реакция отличается высокими выходами и чистотой конечных продуктов [25].

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов

Одним из преимуществ Н-фосфонатного метода является короткое время цикла (4 мин и менее). Особенности, обеспечивающие небольшое время цикла: быстрая конденсация, необязательное кепирование и окисление, проводимое один раз в конце синтеза.

Нуклеозид Н-фосфонатные мономеры легко готовятся из коммерчески доступных реагентов и при хранении устойчивы к гидролизу и окислению, что делает эти реактивы простыми в использовании.

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов через Н-фосфонаты заключается в детритилировании (снятии диметокситритильной защитной группы с 5'-БМТг-нуклеозида (XVIII), иммобилизованного на твердой фазе) (А), реакции конденсации с Р-компонентом (IX) в присутствии хлорангидридов кислот, приводящей к Н-фосфонат диэфиру (XX) (В), необязательной стадии кепирования, и повторении стадии детритилирования (А') и стадии конденсации с соответствующими нуклеозидами необходимое число раз (А'—>В). В конце синтеза проводят окисление для перевода Н-фосфонатдиэфирных связей олигонуклеотида (XX) в фосфатдиэфирные (С), что приводит к продукту (XXI) (Схема 6).

Схема 6

Быстрота проведения конденсации и немногочисленн�