Исследование реакции межнуклеотидной конденсации в Н-фосфонатном методе синтеза олигодезоксирибонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИИ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОШГО КРАСНОГО ЗНАМЫШ ИНСТИТУТ БИООРШШЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М.М.ШЕМЯКИНА

На прнвах рукотюи

УДК 547.963.32 : 577.113.6

ДУБИЯ Игорь Ярослйноиич

ИССЛЕДОВАНИЙ РЕАКЦИИ МШ1УЮ1ЕОТИДНОЙ КОНДЕНСАЦИИ В Н-ФОМОНАТШМ МЕТОДЕ СИ ИТ К ЗА 0ЛИГ()ДЕ30КСИР1Ш0;Г/КЛЕ0ТИД0й

02.00.-10 - Пиоорганическая химия, химия природных и физиологически актиышх веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -.1990

Ра do та вннолнока п ордена Трудоного Красного Знамени Институте биооргошпеской химии им. М.М.Шемякина- АН СССР

Научные руководители:

академик МО.А.Овчинников

Официальные оппоненты :

доктор химических наут* В.А.Ефимов

доктор химических наук Ю.А.Берлин

кандидат химических наук В.Д.Смирнов

Ведущая организация -

Институт молекулярной биологии АН СССР •

Защита состоится

•2S

ЛМ$2

)2.35.0Т п

ЩИ 1990 г. на заседани

Специализированного совета Д 002.35.ОТ при Институте Оиооргани Ческой химии им. М.М.Шемякин' АН СССР по-адресу: II787I, Москв В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10. Ь 10.00

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ АН ССС

Автореферат разослан " ¿Ь " OiLT^Op'i 19Э0 г.

Ученый секретарь Специализированиого совета, кандидат химических наук

Б.А.Несмеянов

Актуальность проблемы. Химический синтез фрагментов нуклеиновых кислот относится к числу важнейших проблем биооргшшчеокоМ химий. Синтетические олигодеэоксирибонуклеотиды* сегодня стали универсальными инструментами для решения широкого круга задач молекуляпной биологии, генетической инженерии, биотехнологии, например, для создания искусственных генетических структур, экспериментов по бепконой инженерии наппав-лснного мутагенеза, научения структуры и функции нуклеиновых кислот и т.д. Поэтому разработка эффективных методов синтеза, выделения и очистки олигонуклеотодов является весьма актуальной зодяюй. В последнее upo-мя все большее распространение получает новый метод олнгопуклеотидпого синтеза, получивший название Н-фосфонатного. Его основные черти, простота получения и стабильность мономеров, высокая скорость и адвективное^ синтеза. Однако методу присущи и некоторые существенные недостатки, рт-проблем остается малоизученным. Необходимо дальнейшее усовершепствовв-ние метода.

1]ель_]таботн. Настоящая работа является частью исследований и области химического синтеза олигснуклеотидов, проводим'« в группе белковой инженерии Института0йоч)гштческой химии им. М.М.Шемякина AJI OCí'F, Цель работы заключалась в изучении механизмов процессов, пронглом^чих во время реакиии Н-фосФонатной межпуклеотцдной кондкрсшми, п vwm и усовершенствовании Н-ф*осфонатного' метода олигонуклеотидного синтеза па основе полученных данных. "...

Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено систематическое иослелопание роли оснований в Н-фосфонатпой конденсации. Поучен механизм активации П-фосиопатоя пцввлощшюридом л присутствии

О г

различцих оснований при помощи •1Р-Я!.;Р-спектроскогпш.. Подробно изучены процессы, происходящие при предактивации Р-комцоневта реакции н предложен ряд методов борьбы с ее отрицательным влиянием на эффективность твердофазного синтеза олигснуклеотидов. Получены лунные о существом-иии нуклеофилнюго катализа реакции меннуклеотидной конденсации л Н-фсг,-фснатном методе. Псследован механизм взаимодействия П-фосфонато« о PtvU в присутствии высоко.зфЬектпвпых нуклеофилышх катализаторов типа Г'е1м, ОМАР, П -окисей пиршпшов.

Полученные результаты позволили --т.. ряд рекомендации по усовершенствованию 1!-фосфонатного метода синтеза олпгонук.леотик.оа. Ря:1рябо-тнн. ыгосжозЭД«ктньниИ вариант твердофазного синтез..!, основанным па применении хинолина в качестве шетвори'геля длч пропе,пепин коплепогптин, что позволило практически устранить влияние крплпкгиши'кп i"» о^ттч'.

* Дм.¡ее iiu!(!ii>i»tíi "дозокси" (.i ) воапу O.v/VUM.

"осп. синтеза. Практическая ценность разработанного метода продемонстрирована па пшплере успешного синтеза ряда фрагментом ДНК.

' Анпобшптя работы и публикации. Результаты работы били представлены на Мвицународнои симпозиуме rio анализу нуклеозидннх, нуклоотидннх я оллгонуклеотидпих соединений (Антверпен, 1989) , симпозиуме по химии компонентом ¡ттсмютк кислот (Бехин, 1950). По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работ».

Структура дносеотаи'/и. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного fí-фосфопатному методу олигонуклеотидного оинтева (глава I), обсуждения пеэультатов (глава П), экспериментальной части '<глава ".)., виводов и списка цитируемо!! литературы.

■ • СОДКРШЛЕ РАБОТЫ

Н-фосфояатний метод синтеза олигонуклеотидов основан па примене-' нии а качестве Р-компоиектов пеакпии межнуклеотидной конденсации нук- • ЛР03И.Д—Ц.-фос1;>о!,::то1) I. Они представляют собой афири фосфористой кислоты, оуществувдне л тетскоординированной таутомерной форме и содержащие группировку Н-Р-0, т.е. принадлежат к так ноаыввемим гадрофосфо-рн.пьнцм. соединениям. Ппгч-ому правильное было б» называть их фосфитами, а метод, например, гпдпофосТорпльним. Однако в литературе, в т.ч. отечественной, у?:е прочно утьепдился термин "Н-фосфонатн", поэтому'он и употребляется н^мн. Н-фосфонатнн;1 метод сочетает скорость и пффектип-ность фоефитям'.уц.'ого метода с г.ядом достоинств фоофотриофирного. !."еж-нуклеотпдкш кондонсаппи- проводитег в присутствии копденсирунцпх реагентов и поэтому ко требуют строго соблюдения безводних условии проведении реакции. 3 качестве конденсирующего реагента применяется чаше всего пи-вадоилхлорид (PivCL). ¡'следствие наличия достаточно стабильно» Р-И—связи отсутствует необходимость блокирования мекнуклеотидинх гидрофоеФо-рильных групп. Окисление фосОитних функций синтезируемого олигонукле-отвда проводят однократно в конце синтеза (схема I). Все .что делает !!-■ фосфоназдшя метод весьма норспегстишпш. Однако при синтезе олигонуклеотидов данным методом поолвился'пяд значительных недостатков.

О ■ о* о

M-P-Üe--М-Р-02,1-ЙО-Р-ОЙ'

1 н. i 'о« Схема 1

U.,8.' - здесь и далее остатки нуклеозкдов

Творло.^рнч''' К-<).ос^юнатннй синтез олнгонуклеотидрь

Синтез олигонуклеотидов II-« осфонатнш методом осуществляли, как правило, на полжерном носителе на основе пористого стекла CPGM000. Получен т.'лспс носитель ;?л оснозе сферического силикагеля "Силохром О-S0", с .которым нуслос"!:*,.'! п»яз.'ш через с по i ic е р- ССО (Cí io) р С OflH (С Нр) 2 -

NHCU(сн2)*T*eMK00Tb 25-35 мкыоль/г). Он не уступает по тцвности носителям на основе стекла CPG. Синтез, сели первоначально в ручном варианте в небольшой стеклянной колонке с одногзп^менним добавлением растворов мономеров и PivCt к носителю при помощи шприцов . Последовательность операций представлена в табл.1, Как правило, испольчовал! 10 экп Р-комяонента относительно присоединенного к носителю нуклао.чады: го компонента. После завершения наращивания олигопуклеотидноЛ цели проводили окисление гидрофосфорильних групп, odiraio 2 % I9 п смеси пиридин сода (98:2) в течение 10-15 мин. Затем .полимер обрабативали конц.аммиаком (ночь при 55°) и после детритилированил (00 % НОАс, 20 мин) пилено" олигои'уклеотид виделяли препаративным олектрофоре'зом в полиякрклямидно» геле. Индивидуальность полученных соединений нодтнорядачзсь Buoc.KO'vj.fei тивной обращенно-фазовой хроматографией. Таким обрчиом пол/ч"!« ряд оли-гонуклеотидов длиной до 20-звешшх (табл.2).

Таблшт I

Последовательность операций синтетического никло наращивания олигонуклеотидной пени

Операция ! Реагент или растворитель ! Время,

I. " ............. >£ Промивка Дихлорлтан 0,5

2. Де тритилинованне 3 % дихло руке ус ггая кислота в

дихлорэтане 3

3. Промивка Ацетонитрнл 0,5

4. Промивка Ацетошггрил-пиридин (4: Г) I

5. Конденсация Реакционная смесь 0

б. Проммвка Лцетонитр|!л-пкрид:ш (4:1) I

7. Промывка Ацетонитрнл 0,5

" Скорость подачи растворителей 2,5 мл/м:ш,

** 200 мкл 0,05 М фосфоната и 200 ыкл 0,25 М P.víC

u jmcch oiígCii-py

(4:1) подается поочередно порциями (6 сек со скорость« 0,4 ил/ми я, ду порциями пауза G сек).

При переходе ко к автоматическому синтеге пч синтезаторе liciu Usbcmíl'tr (Plui'nnuiü- , Швеция) обпг.пушилось образование я кот« cauri— па вместо гомогенного целевого продукта смоси опягомеооп гъшпноЯ дггт-¡111 (рис. 1,а). С.оиошюй причиной данного паления ииотут»»,- не пмюггное окисление ол:1го!!уклеотада па последней стадии cühw,, ч-^о »п:я»пдлт расшенлетш' гидролитически ноустоНчиг>1.!>* да. -тг^.т'ооТ.ит^мк емчя^Д по гя амтнчпии, поскольку апюхеигм п течение $ и 30 wu щни'лгша к об-^аповаш'Л о.'.окниошшх смоое!*. ПДСКТ;,ЧНО(Ч> i\vj,;.'ii ■'<. !¡ то .г: \

л?

54

_J

й nun

20

hO

ÖO'iUu

Püc.I. Обра^енно-фазоаая ВЭЯХ на ¿солонке LiCtirosurS RP-18 в градиенте концентрации ацетонмтрила в 0,1 М триэтиламмоний-ацетатном буфере: а) реакционной смеси, содержащий олигонуклеотнд после удаления ацильных зяшлтшхх гоуцп; б) полностью деблокированного олигонукле-отида 33^.

практически исчезал при увеличении продолжительности конденсации с 2 до 5 мин, что говорит о вероятной связи донного явления .с пополним протеканием реакций конденсация. Поскольку в ручном варианте синтеза такое явление практически но наблюдалось, ми предположили, что оно связано .с поедактивапией, т.о. взаимодействием Р-комионента с конден-сирующла реагентом в отсутствие Ch-компонснта, нагтимер, до поступления реагентов на нолнмернмй носитель, что особенно характерно для автоматического варианта синтеза. Действительно, такое влияние нредпк-тпвапки подтвеиздается результатами синтеза олигонтелеотидов с гтод-активацнеМ Р-компонептя на капцой стадии и без нее (см. рис.5,а,б). Одновременно после, про,».активации существенно снижается впход ремкпш' конденсации. 3 связи с этим следует, в максимальной степени исключить возможность ппедактиваиии в твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Среди прочего; нужно .отказаться, от используемого иногда нпосушиванин носителя перед конденсацией, т.к. при этом замедляется доступ реагентов в его пор», что открывает возможность предактивации. Нами бил внесен ряд конструктивных изменений в синтезатор для уменьшения возможности предварительного смешения реагентов в коммуникациях прибора; использована татсг.е поочередная подача порций раствопов П-фосфонатов и PivCl в реактор. Все ото дало возможность вести синтез о внеокой o V-фекпгввоотъю (рпс.1,6). Успотно получен рад олиронуклеотндоп длине;: св!Е';е 30 звеньев (табл.2).

однако яшттть предактивашц» позволгазг далеко не все kohotv.-k-

Таблица 2

Последовательности и выходы олигонуклеотвдов, полученных стандартным Н-фосфонатнш методом

Соедине-! ние !

Последовательность

! Общий ,,! !выход,ГI

Средний выхоц на стадию, %

91 Т2Т

Г41

151

152

153

154

155

156

161 162

171

1?2

191 ■201

211

212

241 33 г

ААОСТАССТ 73 97,3

ССАССТТСААТС . 63 93,2

ААТТСС'САТССТТТ . 67 97,2

САТСССШСАТССО 58 96,4

ААТТСАСАТСТТССО 60 96,7

Авашкоошксо 55 96,1

бАТССОТСОАССТТА 70 97,7

ССС ТТА йОАТССйОО 48 95,2

ТТСТСАТСАТСАТСО 60 96,7

ССССАТССТСАСССТС 60 96,9

СААСАОЛААвОАТССЙ 66 97,4

СТТССАСССАСТСАААО 58 96,8

СТТ'ТСОАООТбААТТТС 59 96,9

ААТТСССССАТССТААССб 56 97,0

ААвСВТОАТССАОАТСТОТА 55 97,1

АСОАСвАССАСОАССАССАСО 56 97,3

ССТССТССТССТССТССТССТ 48 96,6

АССТТАСАСАТСТССА'ГСАСССТТ 55 97,5

СССА&'САССАСОААССТАААТАССЦТСТТТСТб 47 97,7

В расчете на первое звено, присоединенное к носителю.

ции современных синтезаторов. Поэтому представляло большой интерес решение этой проблемы на химическом уровне. С этой целью п-ага баю* пред-« принято изучение механизма реакции меинуклеотпдной конденсации в II-фосфонатном подходе, в частности предактивации Р-компонента реакции, при ПСМ01ЦИ ТСХ и 31Р-ЯМР-спектроскогтаи.

Изучение механизма процесса пполактиванин

В результате проведенных* экспериментов показано, что при взаимодействии нуклеозид-Н-фосфоиата I (С • 2,10 м.д.) с в пигтдино сначала образуется смешанный ашидоид П (диастереомери, 6 2,62 и 2,72 м.д.), который в случае отсутствия ОН-ксмпонепта, что и наблюдается во время предактиваиии, ь основной среде вегуиачт в далтиейшез в;-*"-!':");!?йствнс" с избытком и достаточно бистро превращается и бт •

ыпилфосфит Ш ( б

- 6 -

122,7 м.д.). При взаимодействии со спиртом П и Ш

образуют соответственно диалкилфосфит 1У ( & 8,56 м.д.) и триал-

килфосфит У ( бр 139,9 м.д.)

о • КО-Р-О* Г н

1'иа

о

КО-Р-ОР1У п а [ пом

0

ио-р-оа

1

л н.

Р1уЦ Ру

(схема 2). Смешанный ангидрид П обра-0 Схема 2

К.ОР(ОРЫ)1 Р|<-сс- Ы-Р-оры

I

2Е1011

(I«

Ри

1(МеО)2Тг] Т-

(си3)3с-со-

Й0Р(ОЕ^)г

5

viii

Е.0-Р-0Е1

I

О 0115

зуется и в присутствии других оснований - хинолина,'2,2'-дипириди-нй, Ы.Я-ди'легаданнлина (рис.2). Анилироаанйе смешанного ангидрида П Ри СС с образованием Ш происходит с разной скоростью в зависимости от силц присутствующего основания (рис.3).

Образование бис-ацилфосфита Ш не завершается цепь процессов, происходящих, при активации нуклеозид-Н-фосфоната PwCl . Ш медленно взаимодействует с избытком Р1уС1 в пиридине с образованием смешанного ангидрида шдалфосфоната 71 (^иастереомеры с 5 - 5,3-1 и - 5,92 м.д., см. рис.12). Последний гидролизует с образованием ацилфосфо-ната УП ( Б - 1,70 м.д.) и реагирует со спиртом с образованием алилфосфоната УШ (ор - 1,90 м.д.). Соединение УП! образуется также при ацилировании диалкилфосфита 1У Р|уС1 в основной среде или же при конденсации УП со спиртом в присутствии ТР5С1. В обычных условиях олцгонуклеотвдного синтеза превращеште Н-фосфоната I в соединение У1 не представляет опасности (в пиридине в присутствии 5 экв С1 отот процесс пооходит за 3-4 ч).

. Способность активного фосфоршгирующего интермедката П к дальнейшему взаимодействий с конденсирующим реагентом - важнейший недостаток И-фосфонатного метода, причем внутренне присущий ему, т.к. определен химическими свойствами гидрофосфорильной группы, а именно ее. способностью взаимодействовать с олектрофилымми реагентами.

Бис-ацилфосфит, реагируя с ОН-компонентом при отсутствии избытка последнего образует диатаилацялфосфит IX, которнй легко гидролизует с образованием портального продукта конденсации X (схема 31. Таким об ту 13 оч, пси проведении конденсация в радтвпос поодактивавдп

а___

то

122

10

Ч

О

* £ ' 6

Рис.2. 3*Р-ЯМР-спектрц реакционных смесей: а - исходный [(МеО)2Тг]ТрН в смеси ацетонитрил-пиридин (хшюлин) (4:1); б - смесь [(МаО^Тг] ТрН И 3 экв Р^М в ацетонитриле, содержащей 20 % пиридина, через 3 мин после смешения; в - та же реакционная смесь, что и в (б), через 3 мин после прибавления 2 экв этанола; г - [(НеО)2Тг] ТрН в смеси ацетонитрил-хи-нолин (4:1) через 3 мин после прибавления 5 экв Р)VСХ; д - та же реакционная смесь, что и в (г), через 3 мин после прибавления 2 э/ш этанола.

101)

-Рис.3. Скорость образования бис-апилфссфита Ш при «папчо/пзИсиши [(МеО)2Тг)ТрН о 5 экв Р^«. я аде. .тонитриле, содержащем 20 % основания: триптиламша (I), у-пнколип, (2), пиридина (3), г.шолкна (4).

ео-р(ори)2 +

Н1

е'он

— ио-р-ор

I

М 0Р1У

Схема 3

ео-р-ои' Н х

не представляет особой опасности с препаративной точки зрения. Однако и при синтезе олигонуклеотидов на полимерном носителе с участием бис-апилфосфита в*конечном итоге образуется нормальный продукт, т.к. ин-термедиат вида IX гидролизуется с образованием гвдрофосфорильной связи во время промывок носителя растворителями, содержащими определенное количество влаги. Превращение IX в X может происходить и на стадии детритплирования.т.к.диалкилаадифосфити при взаимодействии о кар-боновыми кислотами бистро деашлируются с образованием диалкилфосфи-тов.

Био-ацилфосфит Ш является менее активным фосфорилирующим реагентом, чем смешанный ангидрид П. Так, если в нормальных условиях конденсации в пиридине нуклеозидный компонент полностью исчезает за 20-30 с, то после предактивашш - за 1,5-2 мин. Более низкая реакционная способность Ш довольно необычна, т.к. атом фосфора здесь, видимо, более электрофилен, чем в Г1. Полученные данные могут бить объяснены тем, что в бис-ашшбосфпте атом фосфора более экранирован пространственно. Возможно и другие объяснение:" отсутствие нуклеофилыгого катализа в реакциях Ш, в отличие от реакций со смешанным ангидридом. 3 результате вышеизложенного даже после непродолжительной предактивашш Р-ком-понента реакция конденсации на полимерном носителе не доходит до кон-иа за 2-3 шн., как это наблюдается в стандартных условиях. С увеличением времени предактивашш выход конденсации падает, стабилизируясь после ? мин (для реакции и'пиридине)., когда в реакционной смеси присутствует практически только соединение Ш (рис.4).

10а 90 (О 70

_6ихо8,уг

Рис.4. Зависимость выхода конденсации ,[(МеО)2Тг] ТрН с Т на полимерном носителе от продолжительности предактивации Р-компонента 5 экв •Р|.уС1 в смеси СНдСЫ-пиридин (4:1) (I) или СКдСН-хинолин (4:1) (2).

2 , i

!> ■ б

■паи

Таблица 3

Соотношение выходов в реакциях фос<)юрилировании и ацилировашш ОН-компонеита в процессе межнуклеотидноИ конденсации на ное.пте.ле после предактивации

Время конденсации, мин ! 2 Г 4 ! О

Выход олигонуклеотида, %:

после 1-оЯ конденсации 73 02 85

после 2-ой конденсации* ез 86 65

Ненрофосф>оршгарованннй гюеле Г—ох1

конденсации ОН-компонент, % 27 18 I и

в том числе:'

анилировашш;! 12 14 15

свободный 15 4 -

4 Оба выхода лани в расчете на исходное для первой конденсации количество ОН-компопента.

(Первую конденсацию [(МеО)0Тг] ТрН с Т на носителе проводили после 7 мин предактивации Р-компонента 5 окв Р|у(Х в смеси СН^СЫ-Ру (4:1). Через определенное время находили выход конденсашш детрклиропштвм, затем проводили "нормальную" конденсацию. Приняв, что она проходи'!' количественно, рассчитали количество аишшрованннх и свободных СП-групп после первой конденсашш).

При стабильно высоких выходах конденсации (порядка 96 стчдия кзшпшга в Н-Ф^сфонатном синтезе, по нашему мнения, необязательна. Однако проблема относительно невысоко!! ацилирующеЯ активности Р|уС1 потает весьма остро, когда имеет место предактивация и значительно падают выходы реакции конденсации. При атом, во-первых, значительная часть СП-компонента на полимерном носителе остается непоофосфорилнро-впшгой, и, во-вторых, лишь часть на оставшихся гпдрокоилышх групп ,эи;т-лируется Р1УС1 (табл.3). НепрорзагпровавшиП ОН-компопеп? вступает ь следующую конденсацию, в результате чего происходит рост нвкрапилыплг после.;топательностей, содержащих пропуски звеньев. Поотому поели синтеза о лредйктт!шш(>а образуется яп&чягвлмшв количество олиголеров, па 1-3 звзиа короче, чем.целевой «ллгонукчйо-хид, чг.о .••атрудяивт е^о очп-с-.'ЧУ (рис. I,'Г',бI. Образование значительного колчч.-отрч снсбсгзш'с Ш-гоупл поо-ш концоноашга яодадерадено' синтезом модг.-лх.нц.. рннутпеотндоп

н-ылиер/Ю'! носителе с иродыстппаидеЗ Р-килпоиос.ч с последую:!;;;:! сеч;; . -о;.: реакционны/ опесеи лй ргсчемю-^аи. ЗУчч'':'.. п«>гг::;'>, б .леи чыр-:..-!1Л нернпх стл/шях синтеза и сня<п с дг.01

реагин;.:;! к Лктлпнпп цеш-р-Ч) на п.• рV¡ч/с:- : ';.■;:;.

Таким образом, нредактивация в Н-фосфонатном синтезе приводит к снижению выхода конденсаций и образованию делений в синтезируемых олигонуклеотидах.

Метод)I устранения отрицательных последствий предактиваиии в Н-фосфонатном синтезе

Нами разработан ряд простых методов, позволяющих значительно уменьшить отрицательное влияние предактиваиии на эффективность твердофазного синтеза олигонуклеотидов.

Введение стации кэппинга позволяет блокировать гвдроксильнне 1'руппы, оставшиеся свободными после конденсации, в результате чего предотвращается рост неправильных последовательностей на полимерном носителе и .значительно упрощается очистка целевого олигопуклеотода (гою.5,в). В качестве кэшшрующего реагента применяли изопрогтл-Н-фоофонат: проводилась обычная конденсация, в течение 2 мин с использованием 0,04 М раствора реагента и'0,2 М РиС1 в смеси СНдСЫ-Ру (4:1). Однако введение стадии кэппинга не решает проблему значительного падения выходов реакции межчуклеотидной конденсации после предактиваиии.

Увеличение времени конденсации с 2 до 4-5 мин в значительной степени нейтрализует факторы снижения выходафосфоршшрования и неполного ацилиронания ОН-комнонента; при этом выход конденсации после 2 мин предактиваиии Р-компонента составляет 94-96 %, и в то же время эффективно ощишруются оставшиеся ОН-гпуппы (см. табл.3). Это значительно увеличивает эффективность синтеза (рис.5,г). Такой простейший, но надежный метод может быть широко использован в олигонуклеотидном синтезе. Правда, кроме замедления синтеза в целом, как и в случае введения стадии кэппинга, здесь возрастает уровень образования побочных продуктов, : т.к. в 2-2,5 раза увеличивается время-воздействия конденсирующего и фосфорилирующего реагентов на растущую олигонуклеотидную'цепь.

Поскольку результатом' предактивация является превращение смешанного ангидрида П в бис-ацллфосфит Ш, для решения проблемы следует снизить скорость этого процесса. Этого можно добиться, снизив избыток Ри/С1 с 5 до 2,5-3 экв относительно Р-компонента.Действительно, в этих условиях скорость образования Ш заметно снижается, но одновременно снижается и выход реакции конденсации, а такие скорость аннотирования 011— компонента. 3 итоге в твердофазном синтезе результаты-неудовлетворительны и аналогичны полученным в синтезе о 5 экв Р1уС1 и предактнвл-гдаей. Снизить скорость образования бис-апилфосфита можно стеричсски, используя хлорашчшпиди с объемист!счи заместителя?®: в этом слгчле затруднено присоединение дпух ацильпых остатков к атому фоо.'ора. 0д1'*1К'>

Си AI U IL

A«

«4

..i.J 20

.Ш

Lift,И

1

Рис.5. Ионообменная ВЭКХ слигонукле-отнда (Tp)qT, синтезированного р стан-Q5 дартних условиях (а) и с 2 мин предал-тивации Р-комвонснта на качдой стадии (б-д), на колонке Nucicogcu ПГАС иО-7 в градиенте концентрации Lii't .в буфере, содержащем 20 % СгЦО'1 в 0,С2 М анетате натрия: б - времн конденсации 2 г.кш ,-в-го же, дополнительная стадия кэпшшга; г - время конденсации (5 мин; д - конденсация (2 мин) л смеси аце-тонитрил--> imomiH (1:1). (it) .uutt

изучешше соединения (тритплацетилхлорид, дифенилацетилхлорид) оказались недостаточно эффективными на практике.

Исследован и ряд других потенциальных конденсирующих реагентов -производных карбоноаых кислот. В присутствии таких соединений; как нзобутирндхлорид, бензоилхлорид, изобутилхлорформиат, конденсация проходит бистро, однако резко возрастает по сравнению с PtvU уровень протекания побочных процессов. Хлорангидрид мезитилепкарбоповой кислоты не обладает активностью конденсирующего реагента. Обнаружено, что дл1]:ен:у:кэрбаио:'Лхлорэд действует как мягкий конденсирующий реагент: в его присутствии реакция в пиридине проходит за 15-20 мин без образования побочных продуктов.

Поскольку существует общеосновный катализ реакшш ацшшровэния смешанного ангидрида с образованием бис-ацилфосфита, общим методом снижения скорости образовании последнего является снижение основности среди. Умонытеыш содержания пиридина в смеси с ацетонитрилом не дало реального улучшения. Решением проблемы является замена пнпидина менее -основным соединением, причел основание должно обладать свойствами нук-леофильного катализатора. Однако важен и об:-.;еосновный катализ конден-.сацлш; так, если в пиридине (рХа 5,2) реакция проходит за 20-30 с, то в присутствии 2,2'-дипиридина (pita 4,4) - за 5-6 мин. Среди ияда изученных соединении наилучшие результаты показал хинолин (оК 4,8). В смеси ацетопптрила с хгполином, содержащей 20-25 % последнего, реакция мвкнукяеоглдней конденсации проходит практически столь же бистро, как и в пиридине (30 сок). При этом, по данным 3*Р-Я.'.1?-опектроскошш, при взаимодействии П-фосфоната I с PivCt образуется только смешанный ангидрид П, и через 5 млн наблюдается образование лишь следов бис-ацилфосфита О! (рис.2,3). Следовательно, практически отсутствует снижение выходов реакции конденсации за счет предактивании (р::о.4). Использование хннолина позволяет даже в случае значительно"; предяктива-г.тдш добиться высокой эффективности синтеза (рис.5,д).

На основе полученных дашЬгх предложена годнфикзшш Н-фосфонатно-го метода олигоиуклеотздного синтеза.

Твердофазны;-1 синтез ачпгон.уклеотпдов с использованием хпполина

Разработанный нами метод основан на замене пиридина как растворителя для проведения конденсации менее основным хиколнном. Реакшгя проводится в смеск ацетонитрнл-хпнолин (4:1). Синтез на полимерном носителе осуществляли как в пучном, так и в автоматическом варианте. Конденсация проходит бистро (2-2,5 шн) и с высоким выходом - 93-99 ■ (н ручьем ьа'ря:шге синтеза выходы несколько ниже - 9г-9Я Г,'), "ослеп;-

Таблица 4

Последовательности и пнходн олигонуклеотидов, получении* в присутствии хинолинв

(kiemme-! ние !

32 х 120

Последовательность

!Общий .'Средний тщ1 !л1всод, !на стадии, % ! Ъ** !

3

12,

KÜ

м5 19о

27 j 331

381 39Г

39п

AAAATTGT 83 97,7

CGGATCCG 80 • 97,2

TTTTTACCGTTG 74 97,5

CGTTTACCGTTG 75 97,6

AATTCATTGAAGGTCG 61 97,0

AATTCAACGGTAAAAA 65 97,3

AATTCAACGGTAAACG ' 63 . 97,2

AATTCGATGATGACGACAA 68 98,0

GCGTCTCTCCCTCACCGGTT 70 98. 2

CCGGATCCTTATCTGCACTCAAGATG GG 98,5

CCGGATCCATGAGTTGCCAACCTTTCA 49 97,3

CGCACCACCACGAAGCTAAATACGGTGTTTCTG 60 99,5

GATCTTGACACJ7TATAATGGTAC 61 99,7

GGGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCT-

TTTTTTTT 72 99,2

AAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCGTT'fAAT-

TGTATCCC 52 98,3

* Олигонуклеотпди, синтезировпнннс на носителе на основе "Сплохрома С-80".

**Зиход дан в растете' на первое звено, присоединенное ¡с носители.

вателыюеть операций полностью совпадает с приведенной в табл.1, за од ним пснлююипсм: до н после конденсации проводится нромцвка сшсг.а СН^СМ-хинолин (4:1) и в той же смеси-готовятся раствори Н-фос^онатоп н Р1VС1 (0,05 1.1 и 0,25 М соответственно). Таким методом успеино получен ряд олигонуклеотидов длиной до 39-эвешшх (табл.4). Их чистота подтвержд.члась обращенно-фазово.1 ВЭ23С (рис.6), Как• апшшруючаД реагент (•IVII в хинолкне менее активен, чем в пиридине, однако в связи со стабильно высокими выходами реакций конденсации стадия коштнга, по па'лнм даннкм, необязательна.

Поскольку, как показано вют, им провеши:« кондопсатп в ;гшч> .'■.¡■ц^ лгхдлктнвяггм тактически не ;.-лияет на ин::о.а Ш'спуз га, •

¡.; дай1 нч П'у ос .ч-ссгг-'".-^ чся пп<. >'• .л V ■

Рис.6. Проверка гомогенности полностью деблокированного олигонуклеотида 39j обращен-но-фаэовой ЮКХ.

tl/jiN,'/«

■10

20

40 сОмии О

Чд ■ СО.иип

Рис.7. Обращенно- фазовая ВЭЖХ реакпиошшх смесей, оодерлацих олиго-нукдестид 5'-(ЫоО)2Тг-(Тр)j^T, полученный на синтезаторе "Виктория-4f.i" c. использованием пиридина (а) или хинолина (б) как растворителя для проведения конденсации.

шивание растворов Р-компонента и конденсирующего реагента с дальнейшей циркуляцией реакционной смеси Чорез реактор, таком как "Виктория-4М". Последовательность операций синтетического никла в таком варианте представлена в табл.5. Синтез в этом случае осуществляя!! на носителе на основе "Силохрома С-РО". Данным методом получен ряд олигонуклеотидов средней длины с выходом 97-99 % на стаиню (табл.5). При осуществлении синтеза по той :;:е стеке, по с нровсдинио.! тчшнаисйтпт в смеси ПН.-Г.'М-Ру 14: П, выходы бши суиестпсшю нияе (90-94 ?.'), i.e. лаблтда-

Таблица 5

Последовательность операций одного цикла наращивания олигонуклеотидной цепи для синтеза с использованием хинолина на синтезаторе "Викторил-4М"

Операция ! Реагент или растворитель ! Время, мин

Промывка н Дихорметан 0,5

Детритилировапие I % CFgCOOH в дихлорметане _ I

Промывка Ацетонитрил • 0,5

Промывка Анстонитрил-хинолин (4:1) I

Конденсация ** Реакционная смесь 2,5

Промывка Ацетонитрил-хинолин (4:1) Т

Поомншса Ацетонитрил 0,5

* Скорость подачи растворителей 2 мл/мин.

**ПуклеозшИИ>осфонат (0,05 М, 200 мкл) и PivCl (0,25 И, 200 мгл) в смеси аистонитрил-хииолин (4:1) смешиваются и реакционная смесь циркулирует через реактор.

лись обычные последствия предактинании (рис.7).

Таким образом, изучение механизма предактивании и роли оснований в данном процессе позволило предложить высокоэффективный метод, в котором удалось в значительной степени преодолеть один из важнейших недостатков Н-^осфонатпого синтеза - отрицательное влияние предактивации на его эффективность.

Побочные реакции, протекающие во время Н-фосфонатной конденсации

Ранее лог:а?airo, что низалоилхторид агшлнрует лантапнуэ систему г.узпозина, причем эта модификация обратима, т.к. 0^-эиилъное производное быстро пидролизует во время аглюнолиза, оегсгепируп исходный нук-леозид. Однако размытый вид пятен, наблюдаемый при электрофорезе, а тшехе данные обоащеннонфазовой хроматографии св'нетелъствуют о заметной модификации синтезировангих олигопуклеотвдов, особенно прч внео-K05J содертжишт гуанозина (рис.8,а). Вероятно, в той или иной степени происходит замещение О^-ашмышх групп пиридином. Общим пепгештем проб чеки является защита положения С'' в гуанпнових остатках. Для этой пели нами использована H,N-дифенмл;-:.!>5а>.*спльиоя (ПРО) зочиткач групп*«,

хотоозя легко удаляется во вгкг.п • "мополиза. Птжепете -orara -г

о -з.т'сглоиного гуег'оз,!''« позволило чолутш» чн-ч/.П'лмю чисти1-;

отнг'онукюотпдн ( реч; .с -, о) . ;:pyr:-:.i способе!-: ггчяг-нич vpo-ич г !.- \• т.( ч''.п-

а25ч

а

/

ClljCN, X

20

Ц0

60

20

40

óü

íojiiuii

Рис.8. Анализ обращенно-фазоьоМ ВЭЖХ полностью деблокированного олигонуклеотида 210, синтезированного в стандартных условиях (а) и с использованием 06-РРС-защитной группы гуанознна (б). tuxaj/A

0 М Чй И ÍJ во 120 лит

Рис. 9 . Кинетические кривые побомпгх реакций Н-фосфонатноА конденсации: а - скорость модификации гетероциклического основания при взаимодействии [(I.feCOgTrbfjuGdk) с 10 экв PivCÍ в ацвнгмитшле, содержащем 20 % пиридина (I) или хинолина (2); б - скорость аыилирова-ния Р-Н-свпзи диалкилфосфита 1У 5 экв PivCí. в апетонитрпле, содержащем 20 % триэтиламина (I), пиридина (2) или хинолина (3), с образованием ацпдфоефоната УШ:

пип гетероциклических оснований является cn.íKaiine основности среды: в шполнне скорость модификации значительно шп:е, ч«ч ъ ш:ршцше (рис. 9,а).

Другой ка:кно:1 побочно,, реакцией Н-фслф^н.тп.'л'; го,.,. -.всацп;. пгшь toí: аиащфошинш PivCf Р-Н-связн в щюдукъ'гпг í.i>í¡¡»c:í..jí;:í¡; - ¿»сдкна-r.áp-,;»сьаннсяi uiuui'i-o«¡•Giin-íс.». оф ...-ч.'новпон ка-

■i-i'hi' па.ыап; (оие.9,6). Она no.-x-r пр.чп-от;; к су,..".;твонног.:у

ь

снижению выхода целевого олигонуклеотида. В стандартных условиях синтеза это не особенно заметно, однако опасность возрастает, например, если пиридин'недостаточно очищен от примесей сильных оснований. Оли-гонуклеотид, в котором часть Р-Н-связей ацилирована во время аклополип а расщепляется в тех местах, где есть Р-С-связи..Так, если в ходе синтеза проводить конденсации в присутствии'0,5 % триэтиламина, или же олигонуклеотид на носителе перед окислением обработать 0,25 М PivCL в смеси СНдСП-Ру-ГЕА (80:20:5) в течение 3-5 мин, то после аммонолизя наблюдается практически полная деградация олигонуклеотида. То же происходит и при использовашга в Н-фосфонатном синтезе обычных для других методов кэппирующих реагентов на основе уксусного ангидрида. Расщепление олигонуклеотидной цепи связано с тем, что ацилфосфонаты типа УШ устойчивы к окислению водным иодом, tío распадаются в щелочной среде. Например, соединение У! 11 в смеси конц.ЫН^-диоксан (3:2) при 50° за ночь полностью расщепляется с образованием смеси нуклеозид-Н-фосфоната I и-нуклеозида [(MeO)gTr] Т.

Итак, злектрофильный реагент - PlvCl - во время Н-фоефонатной конденсации вызшает ряд побочных реакций, катализируемых основаниями, приводящих, к снижению выхода и затруднению очистки целевых олигонук-леотидов. Поскольку- в хинолине скорость побочных процессов в несколько раз ниже, чем в пиридине, и в то же время достигается высокая скорость реакции межнуклеотидной конденсации, его можно считать оптимальным растворителем для проведения конденсации в Н-фосфонатном твердофазном синтезе.

НуклеофилышЛ катализ в реакции Н-фосф-онатной межнуклеотидной конденсации

Известно, что существует нзчсчеофлльныЛ каталии реакции иежнук-леотидиой конденсации в фос-.}одиэфирном, фосфотриэфирном, фоофптньпщ-ном методах. Однако для Н-фосфонатноЛ кондснсашш вопрос до последнего времени оставался неизученным. В спектрах 3íP-H.\l? не удалось обнаружить сигналы соответствующих пиридинневых нрокзж'дних ишэ XI (<;хе-

,ма4)- о ó

11 »

eO-P-OPiv Ру ЙО-Р-Ру® ♦ PuO" Схема i

Однако и в других методах олигепук. -отндпого сингечл п;- -/.■-''мп'З j«»<w • пктпикме интермедиа';и обычно tío .^ткспруутся.л пч отри;, т.к. с».а»л>-.атся t: ¡x П!л;,к.нч1'л с;.--.:и в пн.'коЛ К'^п^итрац;;::. '.'?•.•••) :.■;.-. -s» :".

'■'И 11 о/-i.;'í;'i'jr,'-.;T равновесие пн

XI, сильно сдвинутое влево. Нами получены данные, свидетельствующие о существовании нуклеофилыюго катализа в реакции Н-фосфонзтной конденсации. Так, в присутствии трпзтиламина (pKQ 10,7) скорость конденсации значительно ниже, чем в присутствии на 5 порядков менее основного пиридина. В данном случае картина осложняется тем, что TEA резко ускоряет побочные реакции. Поэтому для из учения кинетики реакции использовали N,Н-диметиланилин (ДМА), по основности практически равный пиридину (рКа 5,1), но не обладающий свойствами нуклеофильного катализатора. Оказалось, что в его присутствии скорость реакции конденсации значительно ниже, чем в пиридине и даже менее основном хинолине (рис.10).. Такой результат свидетельствует в пользу нуклеофильного катализа конденсации пиридином и хинолином.

Uxog,Я Рис.10. Скорость реакции конденсации

[(МеО)2Тг]ТрН и 2 экв EtOH в присутствии 5 8KB PivCC. в ацетонитриле, содержащем 20 % пиридина (I), хинолина (2), димегиланилина (3). Пунктиром обозначена кинетическая кривая реакции в присутствии ДМА после 2 мин • предактивации Р-компонента".

t, с

Реакцию конденсации можно■условно разделить на два этапа: образование смешанного ангидрида П (что для реакщга в присутствии ДМА под-тверадело с помощью 3*Р-ЯМР-спектроскопии) и его взаимодействие с 0Н-компонеитом. Ускорение реакции в целом может быть связано с цуклео-фильным катализом на любом атапе реакции. Поскольку, как было определено, скорости ацилирования нуклеозида PivCl в пиридине и диметилани-лине примерно равны, то можно предположить, что и скорость взаимодействия PivCt с другим нуклеофилом-Н-фосфонатом 1-е образованием смешанного ангидрида П мало зависит от растворителя. Тогда резкое ускорение реакции конденсации в пиридине и хинолине по сравнению с ДМА говорит- о существовании.нуклеофильного катализа на стадии фосфорилирбвания ОН-компонента смешанным ангидридом.

Скорость конденсации в смеси ацетонитрил-диметиланилин практически не возросла после 2 мин предактивации Р-компонента (риоЛО, пунктирная линия). По данным 31Р-ЯМР, к этому моменту в реакционной смеси присутству '.ли'яь смешанный ангидрид. Следовательно, общее ускорение реакции конденсации пиридином и хинолином лишь в незначительной степе-

ни связано с катализом реакции образования смешанного ангидрида, т.е. нуклеофилыше катализатор« ускоряют вторую стадию реакции межнуклео-тидной конденсации.

Зафиксировано также существенное ускорение конденсации по сравнению с ДМЛ N-окисями пиридинов: пиридин-Н-оксидом, 4-хлоп- и 4-иит-ропиоидин-М-оксидом (рис.11). Поскольку эти соединения значительно менее основнн, чем диметиланилии (так, для N-окиси пиридина рК„ 0,8), такой результат отчетливо свидетельствует о нуклеофидьном катализе конденсации.

Высокоэффективные нуклеофильные катализаторы в реакции Н-фосфонатной конденсации

Механизм взаимодействия Н-фосфопатов с PivCt в присутствии Me 1м, ОМАР.или М-окисей пиридинов отличается от механизма этого процесса в пиридине или хинолнпе. В спектрах 31Р-ШР не наблюдаются сигналы смешанного ангидрида П или бис-ацилфосфита Ш, вместо этого появляется сигнал в районе 0 —2 м.д. (табл.6). Отсутствие большой константы спин-спинового взаимодействия свидетельствуют об отсутствии Р-Н-связи в этих соединениях. При добавлении спирта эти сигналы не меняются. В связи с быстрым образованием неактивных ¡штермедиатов реакция конденсации в присутствии Me 1м проходит не до конца,- а в присутствии ОМАР или 4-этоксшпгоид;ш-Я-оксида практически не идет (рис.11). После нет продолжительной предактнвацич Р-по?.шонента PivCf (30 сск) в присутствии Me1м продукт конденсации с 10 экв спирта не образуется даже за час. Нормальная реакция конденсации Н-фосфоната с 10-15 экв спирта в

Основание !Б„. »-Д.* -

М-метилимидалол -1,23

4-Ы,М-диг,:ет:?лаг.:инопир;ш!н -0,90

4-метоксипиридин -1,84

Пиридин-л'-оксвд -0,25

4-Этоксирирпдгн-.Ч-оксид 0.43 •

Таблица 6. Данные спект-зт

ров АР-Ш.1Р для интермеди-атов ХП, образующихся при взаимодействии [(MeOg Тг]Тр с PiV Ct в присутствии ряда нуклпофчлышх гатп -изотопе

Реакция в смеси СН3С.Ч-основатте (9:1)

присутствии Pi.iA? проходит на 50-90 % за 30 сек. Эти данные гсвор'Г о том, что при взаимодействии П-фосфоыата с PivCl вначале оброзуетсл актипнкл ФосфсрилпруйтциЛ интермед—тг, видимо, сглешанилй онгидкш, г<.-т«>рый зате-:- с высокой скоростью ппегчэа:т<гтся в нгягтпвиое соедгчп::- •>. з прпсутсть';If! скорость этого ппсиоссз с.::"cvn'.г%ч со ско!Ч'л "■ •

^исну, 1. Рис .11. Скорость реакции, конден-

сации [(МеО)2Тг]ТрН'И 2 экв Е<:0Н в ацетонптриле в присутствии 5 экв Р|уа - и 10 окв МеТм (I), И !ЛАР (2), Н-окисой пиридина (3), 4-хлорпиридина (4), 4-нкт-рошрцдипа (5),. 4-этоксипириди-на (6). Пунктиром обозначена ки-тическая кривая реакции в присутствии Ме1м после 30 сек нред-активашш Р-компонента, точками -.оеакиии в смеси СНоСЫ-ДМА (4:1). .

: шденсации, а в присутствии СГЛАР даже.выше нее, и лишь большой избыток спирта успевает связать активный фосфорилирующий интермедиат. 4-Э.токси- и 4-Н,К-диметиламинопирид:ш-Ы-оксиды, подобно РМАР, ингибиру-ьт реакцию конденсации. Менее активные основания - Я-окись пиридина и ее 4-хлор- и 4-нитропроизводнне - вполне отчетливо ускоряют реакцию по сравнению с диметиланшпшом, но вид кинетических кривых говорит о том, что и в этих случаях образуются неактивные интермедиаты. Скорость образования последних растет в ряду:

4-1штротгридин-Н-оковд < 4-хлор1шридин-Н-оксид < пиридин-Ы-ок-сид < 4-этоксипиридин-Ы-оксид, т.е. одновременно с ростом основности и нуклеофнльных свойств оснований. Та же закономерность наблюдается и в другом ряду: 4-метоксипири-дин, Ме1м, ОМАР (рКа соответственно 6,6, 7,3, 9,6). '

Показано, что эт:. основания ускоряют процесс превраденип Н-фос-фоната в смешанный ангидрид ацилфосфоната У1 в присутствии РиС£ . Не7 активный интермедиат образуется при добавлении нуклеофильпого катализатора к У1, т.е. он представляет собой комплекс ацилфос^оната с основанием типа ХП (рис.12). Это их соединение образуется при добавлении нуклео.чшыюго катализатора к.бис-ацилфосфиту Ш в присутствии избытка РнС1 . Удалось зафиксировать промежуточное состояние для 4-метокси-пириднна: в реакционной спеси присутствуют одновременно бпс-ацил^ос'фит и интермедиат ХП (рис.12,д), и при добавлении еще 0,5-1 экв в эту

смесь сигнал ХП возрастает за счет.уменьшения сдавала Ш. Аналогичное промежуточное состояние зафжслровано и при актквашш П-^осфоната СС в п чсутствии небольшого количества Ме1м (рис.12,о); при добавлении в реакционную <~ -ось, содержащую одновремзнно соединения 11!, У1 и ХП до-пол!птолыгой порции Р|уС1 наблюдается переход бис ап;;лрос1кта в смесь

(22 6 !1 2 0 ^ -'I -Ь

Рис. 12. ^Р-НМР-спектры реакционных смесей: а - исходный [<Г0)}ТрГ{' и смеси С!13С!1-Ру (4:1); б - смесь 1(ЫеО)2Тг]ТрН л V) эк» Р|У11 чр'пез 10 мин после смешения; в - та же смесь через 'I часа после смешения; г - та г,ее смесь, что ив (<$) ил-и (в), через 3 мин после добавления Г.!е£м; или ;:;е [(МеО)2Тг] ТрН в смеси <Я^СМ-Ые1м (9:1) через 3 пш после добавления 3 экв р|у0. ; л - [(ГЛеО) 2Тг ] ТрН п смеси "С!13СК-4-:1стог.уич1?-пндин (4:1) через 3 мин после добавления 3 зкл Р1уСС;е - [(МеО),-.Тг |'! п!! п смеси СН^СН-ЛМА (9:1), содержаще« о экв Ме1к, через 3 икк №-.<•-.•• ба иле пня 3 окп Р|уГ( .

уI ц ХП, а при добавлении Мо1м - превращение У1 в ХП (последнее говорит о существовании равновесия между соединениями У1 и ХП); Таким .образом, механизм образования интермедиата ХП заключается в превращении Н-фосфоната в бис-ацилфосфит Ш и его последующей реакции с Р|у С£ по' механизм/ решении Арбузова (схема 5). Обе стадии процесса резко ускоряются Ме1м и П.\1ЛР по сравнению с пиридином.

Схема 5

б О о

»■ Ря IС II 11 Ь: 11

КО-Р-О"---И)Р(01Чу), ——£0-Р-ОР|у ЯО-Р- В*

- I . Р>- _ В; ' I

I К ■ ы ,СЧ „А

о' снс5 о с.м11

И » [(МеО) оТг | Т - Л

В: - пуклеофнлышй катапизатор

Ацилфосфонатные соединения обладают невисокой реакционной способностью, что характерно для соединений с Р-С-связью. Так, ацилфос-фонатц УП значительно менее активны в реакциях конденсации, чем II-фосфонати, и близки по активности к метилфосфонатам. Смешанный ангидрид ацилфосфоната У1 довольно медленно реагирует со спиртом, а соединения ХП - еще медленнее. В случае производного 4-метоксипирвдина реакция ХП с 10 экв спирта с образованием ацилфосфоната УШ проходит за, 1,Ь.часа, для производного ГЛе 1ьл - за ночь; интермедиат, образованный 1П.1АР, еще менее активен (за ночь реакция проходит на 40-50 %), и удалось выделить его. Спектр ШР подтверждает структуру ХШ:

0

. [(ПсО)гТг]Т-0-Р-1)ПАР*

1 Р1у0®

XIII о сги,

Стабильность соединений ХП, следовательно, растет в том же ряду, что и скорость их образования, т.е. с ростом активности нуклеофильного катализатора. Одним из факторов стабилизации является способность основания, остаток которого входит в состав молекулы ХП, к делокачизаиии запада. Дополнительным фактором в низкой фосборилирующей активности ин~ термедиатов ХГ1, видимо, выступает пространственная ркранированность атома фосфора. • '

В присутствии К-окисеп ппридинов 11-фо&{онаты при активации Р|УС1 превращаются в аналогичные неактивные интермедиаты, вероятно, оксипи-

ридшшевие поонзьодные ацил'; йонатог. Однако на этом ооакция не оста-

зт

нрвлшзается, и в спектре Р-Я!,1? постепенно растут новые сигналы (например, для Ы-окиои шюидина - с £ - 8,8 м.д.). При анализе реакционной емеии пте пагати ТСХ обнаоухивается пят-но дег<окоигб|Чпоиылгого ос-

новация (например, 4-отокеиниридина при использовании 4-этоксипири-дин-Ы-оксида), т.е. происходит, видимо, некий окислительно-восстн-новителышй процесс, который пока не исследован.

выводи

1. Исследован механизм реакции межнуклеотидной конденсации в. Н-фосфонатиом методе олигонуклеотидного синтеза и роль оснований я протекающих при этом процессах при.помощи ^Р-ЯМР-снектроскопии и ТСХ. Изучена кинетика этих процессов, в т.ч. побочных реакция.

2. Изучен механизм процесса иредактивации, приводящего к снижению выхода реакций конденсации и образованию в ходе синтеза смеси али-гомероп разной длины. Предложен ряд методов борьбы с отрипательнш.1 влиянием предактивации на эффективность Н-фссфонатного синтеза. Разработан высокоэффективный вариант твердофазного синтеза олигонуклео-тидогг, основанный на исиользовашш в качестве растворителя для поведения конденсации смеси ацетонитрил-хинолин (4:1). Метод позволил практически решить проблему предактивации и, видимо, мо^ет быть адаптирован к синтезаторам любой конструктш.

3. Показано существование нуклеофильпого катализа цеакции Н-^Уе-фонатной конденсации. Такие основания, как пиридин и хинслпн, осуществляют нуклеофилышй катализ конденсации на стадии взаимодействия смешанного ангидоида с ОН-комнокептом. Изучен механизм превращения Н-фосфонатоп в неактивные. соединения при активации Р|\/С1 в присутствии высокоэффективных нуклеофильных катализаторов, таких как ИеГм, ОМАР, М-окиси ппрадинов.

4. Синтезировано как в ручном, так :: в автоматическом варианте •■ стандартным и модифицированным К-фосфонатннм методом около 40 сглиго-нуклеотпдоп длиной до 39-звенных для целей генетической шиснерии,молекулярной биологии, а также свше 20 моДелышх олигонукдеотидов длиной 0-15 звеньев во время изучения механизмов п оптимизации Н-фосф.о-натного синтеза.

Основные результаты диссертационной работа пзложсгн в . в следующих публикациях:

1. .Ефимов В.А., Дубе;! Л.Я. Модификация 1!-<фос1 скатного метода сянт>;•>•'<• олигонуклеотодоп на полимор»*их носителях. - Биоорган.химия, 19; О,

■ т.16, ..'.' 2, с.211-210. .

2. Дубей П.Я,, Ляпана Т.В., Оедсднгс Д..'.!. "ниверсатьныи вариант т.'.<■. у' дофазного Н-фосфонатного метод- синтеза слигодсзокоирнзонукл''1 ■-

■дои. - Бпоорган.химия, 1999, т.16, .'.* II, 0.1574-1576.

- at —

3. fcl'imov, V.A., Uubey I.Y., Chakljwakhciieva O.G. NUR study and improvement of H — phospbonate oligonucleotide synthesis nucleosides and Nucleotides, 1990, y.9, Ko.3, p. 1+0" I'M

fliuu. k t.c'i. rz..tCJ 0. <4>upMai<Si>x i'-t'/i liyuara Sf't

Hei. u+c. iVa. iic'i .1. ,W-iu.i .1. / T<ipajk/£>£>

3ju. jf-fäSi . bocnjiaiHO.

Khcaina« kiimikiian umui iiuy.iiüfi i.iiinil Khui, l'uuina, "t