Олиго(2'-о-метилрибонуклеотиды) и их производные: синтез и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

о "> Нр<, Г-

СЕРГЕЕВА ЗИНАИДА АЛЕКСАНДРОВНА

ОЛИГО(2'<>-МЕТИЛРИБОНУКЛЕОТИДЫ) И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ: СИНТЕЗ И СВОЙСТВА

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

и

Новосибирск - 1996

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук Веньяминова АХ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Загребельный СН. кандидат химических наук Иванова ЕЖ

Ведущая организация:

на заседании диссертационного совета К 003. 52. 01. в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Автореферат разослан г

Ученый секретарь диссертационного совета

Институт молекулярной биологии Государственного Научного Центра Вирусологии и Биотехнологии "Вектор" Российской Федерации

(ГВЦ ВБ "Вектор").

Защита состоится

кандидат химических наук

Федорова О.С.

Актуальность проблемы. Конструирование модифицированных синтетических олигонуклеотидов и их производных как высокоизбирательных инструментов исследования природных структур и процессов реализации генетической информации in vitro и in vivo является актуальной задачей современной биоорганической химии и молекулярной биологии. Среди модифицированных олигонуклеотидов весьма привлекательными являются аналоги олигорибонуклеотидов, несущие алкильную группу в 2'-положеготи. Особенность данного типа модификации заключается в том, что при этом сохраняется A-тип двойной спирали, характерный для олигонуклеотидов рибо-ряда, и значительно повышается устойчивость к действию оснований и целого ряда нуклеаз. Термическая стабильность дуплексов и триплексов с участием 2*-0-алкилрибоолигомеров в большинстве случаев оказывается выше, чем при использовании олигонуклеотидов дезоксирибо-ряда. Такое благоприятное сочетание свойств делает 2'-0-алкилированные аналоги олигорибонуклеотидов, в том числе 2'-0-метилированные аналоги, удачной альтернативой природным олигоркбонуклеотидам.

Цель работы. Целью данной работы была разработка методов синтеза олиго(2'-0-метилбонуклеотидов), новых типов их производных и изучение их свойств.

Научная новизна и практическая ценность. Разработана схема твердофазного Н-фосфонатного синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) на отечественном синтезаторе "Виктория-5М" и в "ручном варианте". В рамках этой схемы выполнен синтез одиго(2 '-О-метилрибонуклеотидов), модифицированных путем превращения З'-концевой межнуклеотидной связи в фосфо-диэфирамидную или З'-З'-фосфодиэфирную ("инвертированную") связь. Продемонстрирована повышенная устойчивость этих новых аналогов к действию экзо- и эндонуклеаз. Синтезирован ряд новых конъюгатов олиго{2'~0~ метилрибонуклеотидов), несущих на 5'-конце остаток М-(2-гидрокси-этил)феназиния, алкилирующие или стероидные группировки. Для синтеза стероидных производных предложен защищенный патентом РФ эффективный метод, основанный на использовании в качестве ключевых соединений Н-фосфокатов гидроксилсодержащих стероидов. Показано, что синтезирован-

ные конъюгаты ояиго(2'-0-метилрибокуклеотидов) формируют с комплементарными РНК-последовательностями более стабильные дуплексы, чем с фрагментами ДНК. Впервые проведено сравнительное изучение реакции комплементарно адресованного алкилирования модельных ДНК и РНК- мишеней алкилирукяцими реагентами на основе гекса(2'-0-метилрибо)-. -рибо- и -дезоксирибонуклеотидов в отсутствие и в присутствии эффекторов - окта-нуклеотидов того же ряда, содержащих Н-(2-гидроксиэтил)-феназиниевую группировку на 5'-конце. При этом показано, что олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), несущие алкилирующую группировку, являются наиболее эффективными реагентами для комплементарно-адресованной модификации РНК. Таким образом, в результате проделанной работы в арсенал ген-направленных соединений включен ряд новых типов производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), обладающих повышенным сродством к фрагментам РНК и устойчивостью к нуклеолитической деградации. Такое сочетание свойств позволяет считать эти производные перспективными реагентами для применения в молекулярной биологии и медицина

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на рабочем совещании по синтезу олигонуклеотидов (Пущине, Россия, 1988 г.), на Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бехине, Чехословакия, 1989 г.), на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического использования" (Москва, Россия, 1991 г.), на второй планово-отчетной конференции по направлению "Генетическая и клеточная инженерия" (Пущино, Россия, 1991 г.) и на Международной конференции "Терапевтические олигонуклеотиды: от клетки к человеку" (Сейяк, Франция, 1995 г.)

Публикации. По материалам диссертации получен патент РФ и опубликовано 7 печатных работ.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 199 наименований и содержит 11 таблиц и 23 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез олиго(2'-0'1кетилрябоную1еотидов)

Для синтеза олиго(2'-0-метклркбонуклеотидов) впервые использован К-фосфонатный твердофазный способ синтеза. Предварительно был выбран метод введения 2'-0-метильной группы, универсальный для всех четырех рибонуклеозидов, и разработан метод синтеза 3'-Н-фосфонатов 5'-0-диме-токситритил-1*1-ацил-2'~0-метилрибонуклеозидов - ключевых синтонов для олигонуклеотидного синтеза. С использованием данных синтонов была разработана схема Н-фосфонатного твердофазного синтеза олиго(2'-0-метилрибо-нуклеотидов) на отечественном автоматическом синтезаторе "Виктория-5М" и в "ручном" варианте.

В1 В2 В1

(МоОЫКХ,

—ОСНз ^""•ЕРС)

(1).гг)

-ОСНз

(МоО^ТгОч

-О,

<г

-ОСНз

—о-^те)

п раз

(МаО^ТгСЦ

(3). (4)

-ОСНз

н"°ч1 ^ _ СГ 01

•0ч|

п+1

В1

ОСНз

Кен

(1) ГАСНОгСОгН в СНгС12

(2) 25 мМ

—ОСНз

(МеО)гТК\

125 мМ

(снз)зсоа в ру/снзсы

р '

/Ч О" н

(3)0.2М 12 в Ру/Н^О

(4) N^(04 конц

Цикл присоединения одного нуклеотидного звена состоял из двух операций, детритилирования и конденсации, и занимал вместе с промывками

Н

7-8 мин. На примере синтеза ряда алиго(2 -О-метилрибонуклеотидов) длиной до 15 мокомерных звеньев продемонстрирована эффективность разработанной схемы.

2. Синтез я свойства адяго{2'-0-мстнлрибоиуклеотидов), модифицированных во межнуклеотидвьш связям

Как известно, чувствительность олигонуклеотидов к действию ферментов является одной из наиболее важных проблем их использования в биологических средах. Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) стабильны к действию эндонуклеаз. Для увеличения устойчивости олиго(2'-0-метилрибонуклеоти-дов) к нуклеазам экзо-типа было предложено провести дополнительную модификацию З'-кокцевых межнуклеотидных связей. Н-Фосфонатиым твердофазным методом синтезированы два новых типа модифицированных 2'-0-метилированных аналогов олигорибонуклеотидов (12Л) и (110).

су«

0 осна

1

0= Р—О"

к- Сиа ^

ООСНз

I

0= р—о"

1 вив

у

0 ОСИз

1

о= Р-0"

ЧГ

ноосн, («01

V. Су>

ЧУ

ООСНз

1

о= Р—Э"

' биа

у

0 ОСНз

1

0= Р—Б-I

а_ <3иа

у

ООСНз I

0= Р-в"

чг

но оси, ("Ч

0 оси,

1

0= Р-0"

О ОСНз Г-\ I

1 Биа

у

ООСНз

I Л

О М—Р=0 ' ' СУ1

уг

НО ОСНз («Л}

■V <3иа

т/

ООСН,

I

0= Р—О"

I

<5иа

у!

0 оснз

1

о= Р—О" I

уг

ООСН, I

0=Р—О" О

(«О)

Олигомер (12Л) содержал две концевых межнуклеотидных фосфо-дизфирамидных связи, а олиго(2'-0-метилрибонуклеотид) (13ф имел на 3'-конце фосфодиэфирную связь с инвертированной полярностью (З'-З'-связь). Для сравнения были синтезированы немодифицированный олигонуклеотид

(120) и олиго(2'-0-метилрибонуклеотид) (125), содержащий тиофосфатные межнуклеотидкые связи по всей цепи. Для получения олиго(2'-0-метил-рибонуклеотида) (ггЛ) использовали реакцию окислительного фосфорилиро-вакия аминов (реакция Тодда-Аттертока). Синтез выполняли, проводя после первой й второй стадии олигонуклеотидной конденсации дополнительную обработку полимер-связанного олигонуклеозид-Н-фосфоната раствором морфо-лина в четыреххлористом углероде. Твердофазный Н-фосфонатный синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотида) (130) проводили с использованием в качестве первого нуклеозидного звена, связанного с полимерным носителем, 3'-О-диметокситритилтимидина.

Стабильность полученных олигомеров к нуклеазам была исследована в двух тест-системах. В качестве первой тест-системы использовали буфер, содержащий фосфодиэстеразу змеиного яда. Как и следовало ожидать, немо-дифицированный олиго(2'-0-метилрибонуклеотид) (12О) быстро подвергается расщеплению ферментом, фосфотиоатный аналог (12S) гидролизуется фосфо-диэстеразой очень незначительно, а аналоги (12Л) и (13О) практически полностью стабильны в условиях гидролиза (рис. 1 А).

В качестве второй тест-системы использовали культуральную среду Игла, содержащую 7%-ную непрогретую телячью сыворотку. Как видно из рис. 1 В, модифицированные по З'-концевой межнуклеотидной связи 2'-0-метилированные олигонуклеотиды (12Л) и (130) практически не подвергались

Рис. 1. Кинетические кривые деградации олигонуклеотидов: А ФДЭ змеиного яда (40 ед. акт./мл, 10 мМ трис-НС1 (рН 7.4), 10 мМ ЫаС1, 3 мМ MgClг, 37°С). Б. Культуралькая среда Игла, содержащая 7%-ную непрогретую телячью сыворотку (37°С). Концентрация олигонуклеотидов 5x10"6 М.

деградации в исследуемых условиях, проявляя устойчивость к нуклеазам эн-до- и экзо-типа.

Таким образом, показано, что олиго{2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие дополнительную модификацию по З'-концевой межнуклеотидной связи, имеют повышенную устойчивость к нуклеолитической деградации и представляют собой новый класс легко синтезируемых олигонукпеотидных производных, которые могут служить основой для создания реагентов с целью воздействия на НК в живых организмах.

3. Синтез кааыагатов олаго(2'-0-метилрибонуклеатидов) и изучение их термической стабильности

Ковалектное присоединение лигандов различной химической природы придает олигонуклеотидам новые свойства, полезные для их использования в качестве ген-направленных соединений. В данной работе в качестве лигандов для присоединения к олиго(2'-0-метилрибонуклеотидам) были выбраны стероидные группировки на примере холестерина и тестостерона, способные улучшать связывание с мембранами и проникновение синтетических олигонуклеотидов в клетки, и остаток Н-(2-гидроксиэтил)феназиния, который улучшает комплексообразующие свойства олигонуклеотидов (Зарытова, 1986).

3.1. Синтез и термическая стабильность стероидных конъюгатов олиго(2'-О-метилрибонуклеотидов)

Для синтеза конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) со стероидами был разработан новый метод, основанный на использовании в качестве ключевых соединений Н-фосфонатов гидроксилсодержащих стероидов.

вЮН = холестерин

ЫОН ~ тестостерон

Синтез стероид-Н-фосфонатов проводили по аналогии с синтезом Н-фосфонатов нуклеозидов взаимодействием соответствующего стероида с три-имидазолидом фосфора.

Строение синтезированных соединений подтверждено методами ИК-, !Н- и 81Р-ЯМР-спектроекопии. Реакционная способность полученных Н-фосфонатов была показана на примере синтеза ряда моконуклеотидных производных, содержащих холестерин или тестостерон на 5*- или 3'-конце. Полученные данные о высокой реакционной способности стероид-Н-фосфонатов в реакциях образования фосфодизфирной связи позволили перейти к твердофазному синтезу 5'-стероидных производных олигонуклеотидов.

и

I—осн

Н-1- Оч1°

эсн.

I—ОС .

ОчТ0*"*©

/. БЮ—Р—О _^Н

БЮ

0^,1,

о\|

и

—осн3

•ОЧ п

0.2 М и

—ОСН3 -г-

—о^кра) Ру/нр

деблокирование

Я

ею—

О'

и

-осн3

•0\

1_ о"'

(—ОСН,

о4"°м

Конденсацию стероид-Н-фосфонатов с 5'-гидроксилом защищенного олиго(2'-0-метилрибонуклеозид)-Н-фосфоната, связанного с носителем, проводили после окончания синтетического цикла и удаления концевой 5'-0-диметокситритнльной группы в стандартных условиях Н-фосфонатного метода, с последующим окислением и деблокированием олигонуклеотидных производных. Аналогичным образом были синтезированы стероидные производные олигонуклеотидов дезоксирибо- и рибо-ряда.

Для сравнительного исследования термической стабильности комплексов с участием 5'-стероидных кокъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их

н

Таблица 1. Температуры плавления дуплексов с участием стероидсодержащих олиго( 2 '-О-метилрибонуклеотидов) и их й- и г-аналогов

Дуплекс с <2(рА)16 Тш, °с Дуплекс с г(рА)16 Тол- °С

(реГС)10 29 (р<1Т)10 29

(СЬо1)рй(Т(рТ)в) 32 (СЬо1)р<1(Т(рТ)в) 31

(ри)ю- <5 (ри)1В 18

(СЬо1)ри(ри)8 <5 (СЬо1)рЩри)9 24

ит(рит)9 12 ит(ри^)9 23

(СЬоПри^ри^в 18 (СЬо1)рит(рит}в 31

(Те$1)рит(рит)9 13 (ТевфХЯЧри^в 27

Буфер 0.16 М N801, 0.02 М КаН2Р04(рН 7.4), 0.1 иМ ЕОТА, концентрация олигонуклеотидных компонентов 2.5 х 10"5 М

дезоксирибо- и рибо-аналогов были использованы системы дуплексов, приведенные в таблице 1.

Как можно видеть из таблицы, введение остатка холестерина в 5'-положение одигонуклеотида увеличивает температуру плавления всех типов исследованных дуплексов, причем в случае производных олиго(2,-0-метил-рибо)- и -рибонуклеотидов этот эффект выражен сильнее. Следует отметить более выраженное стабилизирующее влияние остатков как холестерина, так и тестостерона в случае дуплексов, образованных стероид содержащими дека(2'-0-метилуридилатами) с гексадекарибоадеиилатом.

На основании полученных данных можно заключить, что введение стероидного остатка в олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) положительно влияет на их физико-химические свойства, делая эти конъюгаты перспективными антисенс-реагентами.

3.2. Термическая стабильность олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих остаток М-(2-гидроксгшпил)фена.зиния

Введение в структуру олигонуклеотидов остатков полициклических ароматических красителей способствует упрочнению образуемых ими комплементарных комплексов. В данной работе проведено сравнительное изучение термической стабильности дуплексов с участием олиго(2'-0-метилрибо-

Таблица 2. Температуры плавления дуплексов олигонуклеотидов и их Г1-(2-гидрок-сиэтил)феназиниевых производных с 3с2(СрТрАрАрСрТрТрСрСрСрТрС)5'

Дуплекс Олигонуклеотид Т "С

А 5'рй(ТрТрСрАрАрСгрОрС) 3' 35

В 5'рирОрСрАрАрСрОрС 3' 38

С 5'ригпр1ТтрСтрА7ПрАтрОтрСтрС 3' 38

Б 5'Р1т_рсг(ТрТрСрАрАрарОрС) 3' 45

Е 5'РЬп.ритритрСтрАтрАтрСпрСпрС 3' 47

Буфер 0.16 М КаС1, 0.02 М КаН2Р04 (рН 7.4), 0.1 мМ ЕОТА, концентрация олигонуклеотидных компонентов 2.5 х 10"' М

нуклеотидов) и олигодезоксирибонуклеотидов, несущих остаток четвертичной

соли М-(2-гидроксиэтил)феназяна.

Сравнивая температуры плавления дуплексов А и Д и С и Е, можно сказать, что введение остатка М-(2-гидрокеиэ'Гил)феназикия в олиго(2'-0-ме-тилрибонуклеотид) стабилизирует комплекс в той же степени, что и наличие остатка этого красителя в олигодезоксирибонуклеотиде.

Эти данные позволяют предположить, что олиго(2'-0-метилрибонук-леотиды), содержащие остаток М-(2-гидрокеиэ™л)феназинии на 5'-конце, могут служить эффекторами реакции комплементарно-адресованной модификации НК-мишеней.

4. Сравнительное изучение ¡¡омилемеатарво-адресонаяной модификации .недельных РНК-и ДНК-шоиеней алкилирующими реагентами на основе олпго(2'-0-метилрибо)-, -рибо- и -дезоксирибонукясотидов

Комплементарно-адресованная модификация нуклеиновых кислот ре-акционноспособными производными олигонуклеотидов - один из наиболее перспективных подходов к регуляции экспрессии генов. Стабильность к действию нуклеаз и хорошие гибридизационные свойства олиго(2'-0-метил-рибонуклефидов) позволяют предположить, что введение реакционноспособ-ньгх группировок в эти аналоги позволит создать перспективные реагенты для аффинной модификации нуклеиновых кислот, в особенности РНК -

основной мишени антисенс-методологии.

Целью этого раздела нашей работы было сравнительное изучение модификации модельных ДНК и РНК алкилирующими производными олиго-нуклеотидов трех типов. В качестве модели нами была выбрана система, включающая эйкозануклеатид-мишень и комплементарные ей короткие оли-гонуклеотиды - гексануклеотид, несущий на 5'-конце алкилирующую группировку, и октануклеотид-эффектор, содержащий остаток Ы-(2-гидроксиэтил)-феназиния на 5'-конце. Мишенью служили олигонуклеотиды дезоксирибо- и рибо-ряда с одной и той же последовательностью оснований, а реагенты и эффекторы были трех типов: 2'-0-метилрибо-, рибо- и дезоксирибо-олиго-нуклеотиды.

ДНК-мишень

Дуплекс А1 Дуплекс А 2

5' {ЦТ ТАСАСАСАСТй ОвААСТТ)!

А С С С Т ТрКС1 ТОТОТОТ Ор-РЬя

а с с с и ириа

исооиви (хр-РИа

Дуплекс АЗ АтСтСтСшититрЛС/

ишОгаитОтитОтитОтр~РАя

Дуплекс В1 Дуплекс В2 Дуплекс ВЗ

РНК-мишень

У иНАСАСАСАСиС С С А А в Ц II 3'

А С С С Т ТрКС1 ТОТОТОТ (31у~Рк№

а с с с и иряа

иоисийи Сгр-Рйл

Атстсшстититр*а итОтитОтитОтитОпУ-/'йя

С|Нй /=\ -гт-н^ч ЩСНгЫМ-

СНзСНгОН

^нго^гг"«-- иди

Сравнение эффективности действия синтезированных алкилирующих реагентов проводили в отсутствие и в присутствии олигонуклеотидов-эффек-торов соответствующего типа, оценивая предельную степень алкилирования ЕГ-32Р-меченой мишени в интервале температур 20°-60°С.

Как видно из рис. 2, в отсутствие эффекторов степень алкилирования ДНК-мишеки всеми исследуемыми реагентами мала и в лучшем случае при использовании дезоксирибо-реагента RCld(pTpTpCpCpCpA) достигает 20% при 20°С. При этом реагенты по их эффективности при модификации ДНК-мишени можно расположить в ряду:

RCld(pTpTpCpCpCpA) > RClpUpUpCpCpCpA > RCIpUmpUmpCmpCmpCmpAm.

При алкилировакии в присутствии эффекторов порядок расположения реагентов по эффективности сохраняется и наблюдается значительное повышение степени модификации для всех трех типов реагентов в широком диапазоне темпрратур (при 20°С до 80-85%).

¡Модификации в ДНК-мкшени во всех случаях подвергаются основания G17 - G13 с различной эффективностью в зависимости от типа олигонуклео--тидвой части реагента. Так, при 30°С в комплексе А1 алкилировапшо преимущественно подвергалось положение G17 мишени (72%). В случае дуплекса А2 основания G17 и G13 алкилируются с близкой эффективностью (26% и 27%). Модификация же в комплексе A3 проходила преимущественно по положению G13 (16%).

Алкилирование РНК-мишени проводили а тех же условиях, что и ал-килирование ее ДНК-аналога. Эффективность модификации РНК-мишени

i 100 #

I 75

s

X

■9-

I 50 о S л

5 25

с

е

о

20 30 40 50

температура,°С

Ри=. 2.

Зависимости предельной степени модификации от температуры при алкилировании ДНК-мишени реагентами

КС1ритритрСтрСтрСтрАт (т), ИаририрСрСрСрА (г) и ЙСШ(рТрТрСрСрСрА) (с|) в отсутствие (нижняя группа кривых) и в присутствии эффекторов (верхние кривые). Концентрация реагентов и эффекторов 1х10"5 М, концентрация мишени 5х10"7М.

Рис. 3. Зависимости предельной степени модификации от температуры при ал-килироаании РНК-мишени реагентами КСИ(рТрТрСрСрСрА) («1), КС1ририрСрСрСрА (г) и ЕС1ригоришрСтрСтрСтрАт (го). А. В отсутствие эффекторов. Б. В присутствии эффекторов. Концентрация реагентов 1х10"5 М, концентрация мишени 5х10"'М.

всеми исследуемыми реагентами была значительно выше, чем в случае ДНК-мишени.

При 20°С даже в отсутствие эффекторов предельная степень модификации РНК-мишени достигает 80-90% в зависимости от типа олигонуклео-тидной части реагента (рис. 3). По эффективности алкилирования РНК-мишени реагенты можно расположить в следующий ряд:

КС1ритригорСтрСтрСтрАт > ЛОририрСрСрСрА > НСЫ(рТрТрСрСрСрА).

В присутствии эффекторов происходит возрастание предельной степени модификации РНК-мишени при сохранении порядка расположения реагентов по их эффективности, при этом максимальная степень предельной модификации достигается при использовании производных 2'-0-метилирован-ных олигонуклеотидов в качестве реагента и эффектора.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что алкили-рующие производные 2'-0-метилированных олигонуклеотидов являются высокоэффективными реагентами для комплементарно-адресованной модификации РНК.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема твердофазного Н-фосфонатного синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) на отечественном синтезаторе "Виктория - 5М" и в "ручном" варианте. С использованием этой схемы получен ряд олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) длиной до 15 мономерных звеньев.

2. Синтезирован ряд новых типов модифицированных олиго(2'-0-метилрибо-нуклеотидов):

а) впервые проведена модификация олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) по З'-концевой межнуклеотидной связи. Синтезированы 2'-0-метилированные олигомеры, содержащие фосфодиэфирамидную или З'-З'-фосфодиэфирную ("инвертированную") связь;

б) предложен новый метод синтеза стероидных производных мода- и оли-

гокуклеотидов на основе использования в качестве ключевых соединений

Н-фосфонатов гидроксилсодержащих стероидов. Этим методом с высоким выходом синтезированы олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), несущие остатки холестерина или тестостерона на 5'-конце;

в) проведен синтез ранее не описанных конъюгатов олиго(2'-0-метилибонуклеотидов), содержащих на 5'-конце остаток полициклического ароматического красителя Н-(2-гидроксиэтил)феназиния;

г) впервые получено реакционноспособное производное олиго(2'-0-метилибонуклеотида), несущее на 5'-конце 4-(Ы-2-хлорэтил-К-метилами-но)бензилметилфосфаш1дную группировку.

3. Исследованы свойства полученных модифицированных олиго(2'-0-метил-рибснуклеотидов):

а) показано, что модификация З'-концевой межнуклеотидной связи превращает олиго(2'-0-метилрибону:слеотиды) в соединения, практически стабильные к действию экзо- и эндонуклеаз;

б) на примере дуплекса окта{2'-0-метилрибонуклеотида) с додекадезокси-рибонуклеотидом продемонстрировано, что введение К-(2-гидроксиэтил)-феназиниевой группировки в 2'-0-метилированный аналог стабилизирует дуплекс в той же степени, что и наличие остатка этого красителя в олиго-дезоксирибонуклеотиде;

б) введение стероидных остатков в олиго(2'-0-метилрибонуклеотид) увеличивает термическую стабильность комплексов этих конъюгатов с олигори-бо- и олигодезоксирибонуклеотидама На примере дуплексов 5'-стероидных производных дека(2'-0-метилуридилата) с d(pA)ie и г(рА)^в показано, что в случае холестерина этот эффект выражен сильнее (ДТПЛ=5 и 8°С соответственно), чем в случае тестостерона (ДТПЛ= 1 и 4°С); г) впервые проведено сравнительное изучение реакции комплементарно-адресованного алкилирования модельных 20-звенных ДНК и РНК- мишеней 5'-алкилирующими реагентами на основе гекса(2'-0-метилрибо)-, -рибо- и -дезоксирибонуклеотидов в отсутствие и в присутствии эффекторов - октануклеотидов того же ряда, содержащих М-(2-гидроксиэтил)-феназиниевую группировку на 5'-конце При алкилировании ДНК-мишени предельная степень модификации уменьшалась в ряду реагентов следующим образом: дезоксирибо- > рибо- > 2'-0-метилрибо-реагент. В случае РНК-мишени предельная степень алкилирования РНК-мишени падала в ряду: 2'-<Э-метилрибо- > рибо- > дезоксирибо-реагент. Показано, что эффекторы повышают степень модификации всеми типами реагентов, в том числе и реагентамц на основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Косолапова (Сергеева) З.А., Веньяминова А.Г., Репкова М.Н. 0лиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) и их производные. I. Автоматический синтез оли-го(2'-0-метилрибонуклеотидов) через Н-фосфонаты. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. № 5. С. 635-642.

2. Веньяминова А.Г., Сергеева З.А., Баширова В.З. Н-Фосфонаты гидроксисте-роидов - новые ключевые соединения для синтеза стероидсодержащих moho- и олигонуклеотидов и их аналогов. //Биоорган, химия. 1991. Т. 17. № 9. С. 1294-1296.

3. Zarytova VS., Venyaminova A.G., Sergeyeva Z.A., Repkova M.N., Arnold L., Smrt J. 'Oligoribonucleotides and their 2'-0-Me-analogs carrying alkylating

and intercalating groups. // Nucleosides. Nucleotides. 1931. V. 10. Nv 1-3. P. 679.

4. Venyaminova A.G., Sergeyeva Z.A., Lokhov S. G,, Hepkova M.N. Synthesis of oligo(2'-0-methy!ribonucleotide) derivatives carrying S'-hydrophobic groups and thermal stability of their duplexes. // NucL Acids Symp. Ser. № 24. 1991. P. 264.

5. Venyaminova A.G., Sergeyeva Z.A., Bashirova V.Z. A new method (or introduction of steroid residues in mono- and oligonucleotides via H-phosphonates of hydroxysterols. // NucL Acids Symp. Ser. № 24.1991. P.265.

6. Веньяминова А.Г., Сергеева 3.A., Баширова В.З. Н-Фосфонаты гидроксил-содержащих стероидов в качестве реагента для твердофазного синтеза стероидных производных олигонуклеотидов или их аналогов: Патент РФ 2009147 // Б.И. 1994. № 5.

7. Boutorine A.S., Venyaminova A.G., Repkova М. N., Sergueyeva Z.A, Pyshnyi D.V. Effect of derivatization of ribophosphate backbone and terminal ribophosphate groups in oligoribonucleotides on their stability and interaction with eukaryotic cells. // Biochimie. 1994. V. 76. № 1. P. 23-32.

3. Сергеева 3.A., Лохов С.Г., Веньяминова А.Г. 0лиго(2'-0-метилрибонуклео-тиды) и их производные. II. Синтез и свойства олиго(2'-0-матилрибонук-леотидов) с №-(2-гидроксиэтил) феназиниевыми и стероидными группировками на 5'-конце. // Виоорган. химия. 1996. Т. 22. N. 12.