Олиго(2`-O-метилрибонуклеотиды), содержащие терминальную 3`-3`-межнуклеотидную связь, и их конъюгаты: синтез и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Новопашина, Дарья Сергеевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Новосибирск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2009
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
□03463512
НОВОПАШИНА ДАРЬЯ СЕРГЕЕВНА
0ЛИГ0(2'-0-МЕТИЛРИБ0НУКЛЕ0ТИДЫ), СОДЕРЖАЩИЕ ТЕРМИНАЛЬНУЮ З'-З'-МЕЖНУКЛЕОТИДНУЮ СВЯЗЬ, И ИХ КОНЪЮГАТЫ: СИНТЕЗ И СВОЙСТВА
02.00.10 - биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Новосибирск - 2009
003463512
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Научный руководитель: к.х.н., доцент Вельяминова Алия Гусейновна
Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Готтих Марина Борисовна
к.х.н. Воробьев Павел Евгеньевич
Ведущая организация: Институт биоорганической химии
им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
Защита состоится « » ф^Ьси^Л- 2009 г. в в часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru
Автореферат разослан « » 2009 г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Поиск новых модифицированных синтетических олигонуклеотидов как платформы для создания высокоселективных инструментов для молекулярно-биологических исследований, а также терапевтических препаратов для лечения вирусных, онкологических и наследственных заболеваний является актуальной проблемой современной молекулярной биологии, бионанотехнологии и медицины. Среди модифицированных олигонуклеотидов весьма привлекательными для создания реагентов, направленных на РНК и дцДНК, являются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), обладающие повышенным сродством к РНК, высокой скоростью гибридизации с РНК-мишенями, способностью образовывать прочные триплексы с дцДНК, стабильностью к ДНК- и РНК- специфическим нуклеазам, способностью эффективно дискриминировать мисматчи, а также простотой синтеза и низкой токсичностью. Конструкции на основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) используются для выяснения функций отдельных генов и некодирующих малых РНК, регуляции экспрессии генов путем воздействия на уровне мРНК, микроРНК и геномной ДНК, детекции НК in vitro и in vivo, определения мутаций, а также для решения ряда других задач. В этой связи создание новых конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), обладающих улучшенными характеристиками, полезными для их использования в исследовательских, диагностических и терапевтических целях, является актуальной задачей. Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлся синтез и изучение свойств олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеотидную связь, и создание на их основе реакционноспособных, триплексформирующих и флуоресцентных конъюгатов как перспективных зондов и реагентов для использования в антисмысловой и антигенной биотехнологиях. В ходе исследования решались следующие задачи:
- синтез и изучение физико-химических и биологических свойств олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих на З'-конце дезоксирибонуклеозиды (дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин или тимидин), присоединенные З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью;
- создание на основе 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) новых конъюгатов с реакционноспособными и флуоресцентными группировками, а также с лигандами малой бороздки, и изучение их свойств на модельных системах.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые синтезированы олиго(2!-О-метилрибонуклеотиды), содержащие на З'-конце остаток любого их 4-х дезоксирибонуклеозидов, введенных посредством «инвертированной» связи, и детально изучены их свойства. Показано, что такие 3'-«инвертированные» олигонуклеотиды устойчивы к действию нуклеаз сыворотки в течение нескольких суток. В большинстве случаев «инвертированные» дезоксирибонуклеозиды улучшают комплексообразующие свойства олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) за счет образования дополнительных стэкинг-взаимодействий нависающего З'-дезоксирибонуклеозида с концевой парой дуплекса. Введение нависающего «инвертированного» тимидина на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) не нарушает A-форму дуплексов с их участием. Полипиримидиновые олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие на З'-конце
«инвертированный» тимидин, способны образовывать стабильные триплексы с полипуриновыми участками дцДНК. На основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с терминальной З'-З'-фосфодиэфирной связью впервые созданы конъюгаты, содержащие фотоактивируемые и-азидотетрафторбензамидные группы, способные эффективно модифицировать РНК и ДНК, конъюгаты, содержащие флуоресцентные пиренильные группировки, образующие стабильные комплексы с НК и обладающие высокой чувствительностью к образованию дуплексов, которые могут быть использованы для детекции НК. Разработан твердофазный метод синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих «инвертированный» тимидин на З'-конце и олигоэтиленгликольфосфат на 5'-конце. На их основе созданы новые конъюгаты 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащие один или два лиганда малой бороздки (гекса или окта (Ы-метилпиррол)карбоксамид) или лиганд малой бороздки и триплекспецифический интеркалятор (6-[(3-аминопропил)амино]-10-амино-13Н-бензо[6,7]индоло[3,2-с]хинолин), способные образовывать стабильные специфические комплексы с дцЦНК. Продемонстрирована перспективность использования этих конъюгатов как новых реагентов в области антигенной биотехнологии.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Результаты работы были представлены на XIV, XV и XVI международных круглых столах «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (Сан-Франциско, США, 2000г; Левен, Бельгия, 2002г; Берн, Швейцария, 2006г), на Ш-ем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002г), на 5-ом Кембриджском симпозиуме «Nucleic Acids Chemistry and Biology» (Кембридж, Великобритания, 2003г), на международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, Россия, 2006г), а также были доложены на летней школе «Nucleic Acid Chemical Biology» (Оденс, Дания, 2003г), на международном молодежном форуме «FEBS Forum for Young Scientists» (Варшава, Польша, 2004г), на международной конференции «Фундаментальные науки - медицине», (Новосибирск, Россия, 2007г), на международном симпозиуме «XIVth Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components» (Крумлов, Чешская республика, 2008г) и др.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 202 страницах, содержит 77 рисунков, 22 схемы и 24 таблицы. Библиография включает 378 литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие различные 3'-концевые «инвертированные» дезоксирибонуклеозиды, получали твердофазным Н-фосфонатным методом в «ручном варианте» или автоматическим фосфитамидным методом с использованием специально синтезированных полимерных носителей с присоединенными через 5'-гидроксил З'-О-димстокситритил-М-ацил-
дезоксирибонуклеозидами (Ia-г) (схема 1).
Для исследования свойств З'-модифицированных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) в зависимости от природы «инвертированного» дезоксирибонуклеозида нами была синтезирована серия модельных окта(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих на 3'-конце ;„„Г, ¡тС, ¡пуА или ,■„„<? (табл. 1).
Схема 1
(МеО) ,Тг(
(МеО) 2ТП
0_(МеО) гТгС1 ч ?
н</ РУ (МеО) 2ТгО диоксан (МеО) 2ТгО'
1-. В тр!!
| Ж I Ы-Мв1ш \ / СНдСЫ
о
(МеО) 2ТгО
а) В
" Л
I
(Т) 6) В = {_ (С)
-I в - Т £""> (Б)
а.ЪиНЫ
") : МПС-700 или СРС-500 ,
-^г-сн—ьга-со-сн—
Чг
Ц» (А) I
Таблица 1. Выходы и характеристики окта(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих различные
№ 0лиго(2'-0- метилрибонуклеотид) 5-3' Общин выход,%'* Нуклеозидный состав2"
II СгаАтСтСтитСтСтАт 13 Ст:Ат:Сш:ит=4.0:1.8:1.1:1.0
Ша стАт0тститстстдт^7. 21 Ст:Ат:Ст:ит:Т=3.9:1.8:1.0:1.0:1.0
Шб СТСГишСлС"А"„С 12 ст.Аш:0т:ит:(1С=4 2.1 ?:0 9., 0- ] 6
111 в стАт0тститс,„стАт(тС 10 Сш:Ат:Ст'.ига:(Ю=4.0:1.9:1.4:0.9:1.4
Шг СтАтОтСтитСп,СтАт,„^ 5 Ст:Ат:От:ит:(1А=3.8:1.8:1.0:1.0:0.4
Шд СтАтСтСтитСтСтАт7" 32 Ст:Ат:От:ит:Т=4.1:2.0:1.2:1.0:1.0
Ше СтАтОтСтитСгаСтАю1Г 16 Сш:Ат:Ст:ига=3.9:2.0:1.1:1.9
IV итСтОтАтСтСтитОт И Ст:Ат:Ош:ит=1.0:1.0:4.2:2.0
Уа ит(}т0тАт(3тститс}т.^7, 12 ст. д":от:ит:Т=4.1:1.9:1.0:1.1:1.1
Уб ит(3тС;тАт(}шсп,итат;тС 8 с»:А™:От:ит:(1С=4.0:1.9:0.9:1.0:1.1
Ув иш0т(3тАш(3тсшитст;^0 7 Сга:А1":От:игп:<Ю=4.1:1.8:1.2:0.9:1.0
Уг итст(;тАтстстит(;,т;п>л 7 Ст:Ат:От:ит:с1А=3.9:1.9:1.0:1.0:0.8
первый нуклеозид, присоединенный к полимеру). Условия ферментативного гидролиза олигонуклеотидов (II), (Шд,е) и (IV): ФДЭ (0.01 ед.акт.) и щелочная фосфатаза Е.соН (0.34 ед.акт.) в буфере (0.1 М Трис-НС1 (рН 7.8), 5 мМ М8С12), 5 ч, 37 °С. Условия ферментативного гидролиза олигонуклеотидов (Ша-г) и (Уа-г): нуклеаза Р1 (5 ед.акт.) в буфере (0.03 М СНзСООИа (рН 5.2), 1 мМ гп804), 16ч, 37 °С, щелочная фосфатаза (0.34 ед.акт.) в буфере (0.1 М Трис-НС1 (рН 7.8), 5 мМ МвСЬ), 4 ч, 37 "С.
2. Исследование устойчивости олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'- межнуклеозидную фосфодиэфириую связь, к действию нуклеаз
Исследование устойчивости 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-
метилрибонуклеотидов) в сравнении с их ^модифицированными аналогами, а также с рибо- и дезоксирибо-аналогами проводили в двух тест-системах: в буфере, содержащем ФДЭ змеиного яда, а также в культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Кинетические зависимости деградации 5'-[32Р]-меченых модифицированных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) (Ша-г) к действию ФДЭ змеиного яда приведены на рис. 1. Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие терминальную З'-З'-межнуклеотидную связь, были устойчивы к расщеплению ФДЭ змеиного яда независимо от типа «инвертированного» нуклеозида, в то время как контрольный олиго(2'-0-
метилрибонуклеотид) (II), не содержащий модификацию по З'-концу, полностью
деградировал уже за 5 мин, а нативные рибо- и дезоксирибо- октануклеотиды
деградировали в течение первой минуты инкубации.
Исходный олнгонуклсотнл, %"Р
юо ........................ .........~ | й Рис. 1. Кинетические кривые деградации
1 олигонуклеотидов ФДЭ змеиного яда. (1) - 5'; (¡(САвСТССА), (2) - 5'-САйСиССА, (3) - 5'-
75 _ 5,_
; с»А»ОшС,ипС°СшАт/„,7' (Ша), (5) - 5'-50 ¡1 СтАтСтСтитСтСтАт,-„,,С (Шб), (6) - 5'; СгаАтОтСтитСтСтАт/„,С (Шв), (7) - 5'> С-дшО'С-и'С-СТ^ (Шг). Условия: ! з буфер (10 мМ Трис-НС1 (рН 7.8), 0.5 мМ . МвСЬ), 5-10"4 ед.акт. ФДЭ, 37 °С. Концентрация
I '' _. ____. _ - , * . .
5'-[32Р]-меченого олигонуклеотида 1.5-10"5 М.
При инкубации в среде с сывороткой не содержащие 3'-«инверсии» олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) не детектировались уже через Зч, в то время как олигомеры с любым З'-концевым «инвертированным» дезоксирибонуклеозидом практически не подвергались деградации в исследуемых условиях (напр., см. рис.2).
к i 2 3 4 5 6 7 к 8 9 ю 11 1213 и к 1516171819 го 21 Рис. 2. Электрофоретический анализ
«— i...... —..—к' 5'-[32Р]-меченых олигонуклеотидов
и *pCmAmGmCmUmCmCmAmr(Шд) (дорожки
| 1-7), *pC",AmGmC'°UmCmCmAm,„v7"+ ! CmAIDGmCmUmCmCraAm,„v7p* (Illa*)
i (дорожки 8-14) и i(BP *pC",AmGmCmUmCmCmAm¡„Tp* (Illa**) ! (дорожки 15-21), инкубированных при 37 °С в культуральной среде IMDM, содержащей 10% эмбриональной телячьей Л| j сыворотки; время инкубации 5,10,30,180,
«Р*1 i 360 мин, 1 и 3 сут; к - исходный
олигонуклеотид. Концентрация олигонуклеотидов 10"5 М.
Таким образом, нами было показано, что введение на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) «инвертированного» дезоксирибонуклеозида (¡nvT, ínvC, ¡nvA или i„„G) повышает их устойчивость к действию ФДЭ и нуклеаз сыворотки.
3. Изучение структуры и стабильности комплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с фрагментами РНК и ДНК
3.1. Структура и стабильность дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную 3 '-3'- межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
Было изучено влияние «инвертированного» тимидина Q„VT) на термическую стабильность дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с РНК и ДНК. Влияние 3'-концевого «нависающего» нуклеозида зависело от типа соседней с ним пары дуплекса и ее ориентации (табл. 2). В большинстве случаев ¡nvT оказывал положительное влияние на температуру плавления дуплексов.
Таблица 2. Температуры плавления дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих и не содержащих /„„Г, с РНК и ДНК ._
и
ДНК следующего состава: 5'-САССиССА, 5'-с1(САОСТССА), 5'-1ЮОАССиО, 5'-(1(ТООАССТС), 5'-АШСОАССШиА, 5'-(1(АТТСОАССТОТА), 5'-'СССиоаАССиШАиСС, 5'-(1(СССТССАОСТТОАТСС). Условия: 0.1 М ЫаС1, 10 мМ какодилат натрия (рН 7.4), 1 мМ КагЕВТА; концентрации олигонуклеотидных компонентов 1.3-105 М.
Изучение влияния типа «нависающего» нуклеозида (¡,п,Т, ¡тС, ,„,,С или ¡П1А) на температуру плавления и термодинамические параметры дуплексов окта(2'-0-метилрибонуклеотидов) (табл. 3) позволило сделать вывод о том, что «нависающие» 3'-концевые «инвертированные» дезоксирибонуклеозиды вызывают в большинстве случаев повышение термической стабильности дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов). Этот эффект, вероятно, может быть объяснен возможностью стэкинг-взаимодействий между «нависающим» нуклеозидом и концевой парой дуплекса, изменением гидратации
и структурирования воды вблизи концевой пары.
Таблица 3. Термодинамические параметры и температуры плавления дуплексов
окта(2'-0-метилрибонуклеотидов) содержащих и несодержащих ¡„уУУ, и их рибо- и дезоксирибо-аналогов .
1 АН | ДБ 1 Ав,, 1 Т„„»С | АН 1 АЭ | ЛС,17 | Т„.„ "С
Система I
з'-оисодсои З'-СТСОАООТ
5,_стдт0тститстстАш -64.1 -171.3 -11.0 55.5 -42.1 -113.2 -7.0 34.1
5'-СшАшОтСтитСшСтАт/„„Г -72.6 -196.1 -11.8 57.3 -49.5 -138.4 -6.6 32.5
5,-СтАтОтСтитСтСтАт Т -66.6 -177.7 -11.5 57.6 -45.4 -125.3 -6.5 31.4
5'-СтАтОтСши'"СтСшАт/„„С -74.0 -200.3 -11.9 57.9 -49.9 -139.4 -6.7 32.7
5'-СТО°СтиТС"А°;»,е -62.9 -167.1 -11.1 56.8 -46.7 -129.4 -6.5 31.6
5'-СтАтСтСтишСшСтАш;„^4 -64.8 -171.7 -11.5 58.3 -47.7 -132.1 -6.7 33.0
Система II
З'-АССиСвАС З'-АССТСОАС
5,-итОтОтА"'ОтСтитОт -67.3 -182.1 -10.8 53.9 -59.3 -166.8 -7.5 38.0
5,-итО",ОтАтСтСтитОт,„„Г -71.6 -194.6 -11.3 55.0 -60.1 -168.5 -7.8 39.4
5,-итСтОгаАтОтСтитОт,тС -72.3 -196.1 -11.5 55.6 -64.0 -183.6 -7.0 35.3
5'-игаОтОп,АтСтСтиюОт,„,С -71.4 -194.6 -11.1 53.9 -67.7 -195.7 -7.0 35.5
5'-и°,ОтатАтОтСтитСга,„^ -80.7 -220.7 -12.2 56.9 -60.8 -168.8 -8.4 42.4
Система III
3'- Стип,СтСтАтСтСтит 3'- Г/„/}титстатАтотстит
У-СА^ГиГСТ -70.3 -187.6 -12.1 59.5 -75.4 -201.5 -12.9 61.6
5'-СтАтОтСтитСтСтАт,.„,7- -89.1 -242.1 -14.0 62.1 -91.8 -249.1 -14.5 63.3
АН (ккал/моль); Д8 (кал/моль-К); Айз7 (ккал/моль). АН и АЭ получены путем оптимизации оптических кривых плавления на трех длинах волн (260, 270 и 280 нм). Условия: буфер 0.1 М №С1, 10 мМ какодилат натрия (рН 7.4), 1 мМ Ка2ЕОТА; концентрации олигонуклеотидных компонентов 1.3-10"5 М.
Для подтверждения возможности стэкинг-взаимодействий «нависающего» нуклеозида с концевой парой дуплекса нами были изучены спектры кругового дихроизма
Олигонуклсотид 5'-3' Тпл» С (А Тпл, С)
РНК ДНК
ит0тстдтсшститсп1 53.9 38.0
и,„0т0тАп,с„,ститст;т7. 55.0С+1.1) 39.4М.4)
СТСГиГСТ 55.5 34.1
стдт0тсти„,стстАт.^7, 57.3 (+1.8) 32.5 (-1.6)
итАтстА„,(3тститстстАтАтит 59.2 38.7
итАтС|"АтО'"СтитС"'С|ПА°,Ати"1,-„,7' 58.2(-1.0) 39.0(+0.3)
р0тстАтитстАтАт0„,ститсшстАт0тс.п,ст 73.4 59.3
рОтСтАтитСтАтА°'ОтС'"итСтСтАю6п)ОтСт1„,7- 74.6(+1.2) 59.8(+0.5)
А Тпл - разница между Тш дуплекса олиго(2'-0-мстирибонуклеотида) с мишенью и Тщ дуплекса е: З'-модифицированного аналога. В качестве мишеней использовали комплементарные фрагменты РНК
дуплексов окта(2'-0-метилрибонуклеотида) и его аналога с «инвертированным» тимидином с РНК и ДНК, в которых «нависающему» нуклеозиду предшествует концевая 5'Ат/3'и или 5'Ат/3'Т пара дуплекса (рис. 3). В качестве контрольных были записаны КД-спектры дуплексов октадезоксирибонуклеотида и его З'-модифицированного аналога с РНК и ДНК.
дуплекс 1
З'-епссибо
дуплекс 5 5'-СА(ЗСТССА4п1Т 3 1 -СТСОЛ&СТ
5' -
З'-б и с с а б а и
дуплекс 6 51 -СД£ЗСТССД 3 1 -СТСОАССТ
дуплекс 3 З'-Б 1С Е а Е Б 1
дуплекс ^ 5 1 -сайстссд^г 3' -сисолеси
Дуплекс 4 5' -СтАтСтСт1/°СтСшйга 616« Т
дуплекс в 5 1 -сасзстсса 3 1
[$¡•10'' град.М~1.см'1
Рис. 3. КД-Спектры дуплексов окта(2'-0-
метнлрибонуклеотида), содержащего и не содержащего ,•„„Т, и их дезоксирибо-аналогов с РНК и ДНК. Условия: 0.1 М ЫаС1,10 мМ какодилат натрия (рН 7.4), 1 мМ 1Ма2ЕОТА; длина оптического пути 1 мм; температура 10 "С; концентрации олигонуклеотидных компонентов 5-10"5 М.
Спектры дуплексов окга(2'-0-метилрибонуклеотида) и его аналога, содержащего «инвертированный» тимидин, близки к КД-спектрам, характерным для спиралей А-формы (дуплексы 1-4). В КД-спектрах дуплексов окта(2'-0-метилрибонуклеотида) с «инвертированным» тимидином (дуплексы 1 и 3) наблюдали заметное увеличение амплитуды в районе 260-280 нм по сравнению с соответствующими КД-спектрами дуплексов окта(2'-0-метилрибонуклеотида), не содержащего «инвертированный» тимидин (дуплексы 2 и 4), что служит подтверждением дополнительных стэкинг-взаимодействий. В случае олигодезоксирибонуклеотида и его аналога разница в КД-спектрах была незначительной (дуплексы 5-8).
Итак, нами показано, что в большинстве случаев «нависающие» «инвертированные» дезоксирибонуклеозиды улучшают комплексообразующие свойства олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) за счет образования дополнительных стэкинг-взамодействий нависающего З'-дезоксирибонуклеозида с концевой парой дуплекса. Термическая стабильность дуплексов 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) выше, чем стабильность аналогичных дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), не содержащих З'-модификацию. Введение «нависающего» «инвертированного» тимидина на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) не нарушает А-форму дуплексов.
3.2. Стабильность триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с двуцепочечпой ДНК
Для изучения влияния «инвертированного» тимидина на способность олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) образовывать триплексы нами были использованы метод термической денатурации триплексов и метод задержки в геле. В качестве мишени мы использовали синтетический дуплекс (29 пар нуклеотидов), содержащий полипуриновый
участок генов nef и pol провнруса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) длиной 16 нуклеотидных пар (рис. 4).
„т„
ДЦДНК-мишень
ТТССАСТТТТТ AAAAGAAAAGGGGGGA CTGG -3' ,,„„ . TijiGGTGAAAAA ТТТТСТТТТССССССТ GACC -5" (HIV-Loop)
или
5 ' -ССАСТТТТТ AAAAGAAAAGGGGGGA CTGG -3' (HIV-DI)
З'-GGTGAAAAA ТТТТСТТТТССССССТ GACC -5' (HIV-D2)
5 ' -p-tftAjVVVVVVVVVVVVV11 (vi )
Тф0 5 ' -p-cVWVVWVWWWV1,,/ (vu)
5 ' -oVoVcVuVWWVWV1I„r (viii) 5 ' -p-T T T T C*T T T T C*C*C*C*C*C*T
Рис. 4. Структура дцДНК-мишеней и триплсксформирующих олиго(2'-0-метилрибоиуклеотидов) для изучения стабильности триплексов. С* - 5-метилцитозин.
Температуры плавления триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов с «инвертированным» тимидином, полученные методом термической денатурации, отличались друг от друга незначительно (24 и 22 °С) и были близки к температуре плавления триплекса олигодезоксирибонуклеотида, содержащего 5-метилцитозин (ТП | 24 °С). Константы диссоциации триплексов при pH 6.0, определенные методом задержки в геле (табл. 4), подтверждают способность олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) формировать триплексы с дцДНК, стабильность которых сравнима со стабильностью триплексов олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 5-метилцитозин. Введение 3'-«инвертированного» тимидина или 5'-фосфата в олигонуклеотид уменьшает его сродство к дцДНК за счет дополнительного электростатического взаимодействия.
Таблица 4. Константы диссоциации триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с фрагментом дцДНК
Триплексформирующие олигонуклеотиды, 5'-3' K„, iiM
VI pUmUmUmUmCmUmUmUmUmCraC,nCmCmCraCmUm 149±36
VII pUmUmUmUmCmUn'U'°UmUmCmCmC°CmCmCmUm;„vr 308±52
VIII UmUmUmUmCmUmUmUmUmCmCmCn,CmCmCmUra/„l,7' 150±70
T T T T C*T T T T C*C*C*C*C*C*T 66±12
Получены методом задержки в геле при 10 °С и рН 6.0 (50 мМ MES, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCk). Концентрация дуплекса 60 нМ, концентрацию ТФО варьировали от 0.5 до 50 мкМ. С* - 5-метилцитозин.
Полученные данные демонстрируют, что полипиримидиновые олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие на З'-конце «инвертированный» тимидин, способны образовывать стабильные триплексы с полипуриновыми участками дцДНК.
4. Синтез и изучение свойств «химерных» 2'-0-метилрибо/дезоксирибо-олигонуклеотидов, содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
Введение в 2'-0-модифицированные олигонуклеотиды, например, в олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), короткого (от 4 до 8 звеньев) олигодезоксирибонуклеотидного фрагмента позволяет получать «химерные» олигонуклеотиды, комплексы которых с РНК являются субстратами для РНКазы Н. Мы предположили, что введение 3'-«инвертированного» тимидина в «химерные» 2'-0-метилрибо-/дезоксирибо-олигонуклеотиды позволит значительно повысить устойчивость этих олигомеров к действию З'-экзонуклеаз. Для изучения влияния 3'-«инвертированного» тимидина на
способность РНКазы Н расщеплять РНК в составе дуплекса нами была получена серия «химерных» 2'-0-метилрибо-/дезоксирибо-олигонуклеотидов, представляющих собой олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) с «окном» в центре в виде короткого (8 звеньев) олигодезоксирибонуклеотидного фрагмента, комплементарные участку 123-137 нт мРНК гена тс1г 1, содержащие и не содержащие ,„„7" (IX, X), а также их 2'-0-метилрибо-аналоги (XI, XII) и дезоксирибо-аналоги (XIII, XIV).
Таблица 5. Температуры плавления дуплексов синтезированных «химерных» 2'-0-метилрибо-
Олигомер T °c
IX GraAmCmd(CTCGCGCT)CmCmUmUm 77.6
X GmAmCmd(CTCGCGCT)CmCmUmUm,„„7' 79.5
XI GmAmCmCmUmCmGmCmGraCmUmCmCmUn,Ura 85.0
XII GmAmCmCmUmCmGmCmGmCmUmCmCmUmUminv,r 85.0
XIII d(GACCTCGCGCTCCTT) 75.9
XIV d(G ACCTCGCGCTCCTT;„V T) 75.8
*Условия термической денатурации: 10 мМ какодилат Na (pH 6.0), 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2; концентрации олигонуклеотидных компонентов 1.3-10"6 М. РНК: 5'-UCCAAGGAGCGCGAGGUC.
Все исследованные дуплексы обладали высокой термической стабильностью (Тпл в пределах 75-85 °С), при этом наиболее стабильны были дуплексы РНК с 2'-0-метилированными олигомерами (табл. 5). Введение «инвертированного» тимидина на 3'-конец как в случае «химерных» конструкций, так и в случае 2'-0-метилированных олигорибонуклеотидов не снижало, а в некоторых случаях даже повышало термическую стабильность их дуплексов.
Исходный олигонуклеотмд, %ИР л
Рис. 5, Кинетические кривые деградации ФДЭ змеиного яда «химерных» олигонуклеотидов (IX) (кривая 1) и (X) (кривая 2), их 2'-0-метилрибо-аналогов (XI) (кривая 3) и (XII) (кривая 4), и дезоксирибоаналогов (XIII) (кривая 5) и (XIV) (кривая 6) (0.01 ед.акт./мл ФДЭ, 10 мМ Трис-НС1 (рН 7.8), 0.5 мМ М§С12, 37 °С; концентрация олигонуклеотидов 10"5М).
10 20 30 40 50
70 80 90 100 110
Введение «инвертированного» тимидина на З'-конец олигонуклеотидов, во всех случаях приводило к повышению их устойчивости к действию ФДЭ змеиного яда (рис. 5).
Степень расщеплении, % Р
60 80 время, мин
120
Рис. 6. Кинетические кривые расщепления 5'-[32Р]-меченого фрагмента mdr 1 мРНК (120-137 нт, 5'-UCCAAGGAGCGCGAGGUC) РНКазой H в составе дуплексов с олигонуклеотидами (1Х)(кривая 1), (Х)(кривая 2), (ХШ)(кривая 3) и (Х1У)(кривая 4). Реакцию проводили в буфере (20 мМ HEPES-KOH, pH 8.0, 4 мМ MgCl2, 5 мМ KCl, 0.05% BSA), содержащем 0.015 ед.акт. РНКазы H E.coli, РНК-мишень (10"7 M) и олигонуклеотид (10"5 М) при 37 °С.
2'-0-Модифицированные «химерные» конструкции в комплексе с РНК-мишенью вызывали ее гидролиз РНКазой Н на 70-95% за 2 ч, за это же время РНК-мишень в комплексе с дезоксирибо- аналогами расщеплялась на 85-95% (рис. 6). Введение
«инвертированного» тимидина на З'-конец олигонуклеотида приводило к некоторому уменьшению степени расщепления РНК-мишени как в случае олигодезоксирибонуклеотидов, так и в случае «химерных» олигомеров.
Таким образом, введение «инвертированного» тимидина на З'-конец «химерных» 2'-0-метилрибо-/дезоксирибо- олигонуклеотидов повышает их устойчивость к действию 3'-экзонуклеаз и термическую стабильность их дуплексов с РНК и практически не влияет на их способность в комплексе с РНК активировать РНКазу Н. «Химерные» 2'-0-метилрибо-/дезоксирибо- олигонуклеотиды, содержащие «инвертированный» тимидин на З'-конце могут рассматриваться как потенциальные ингибиторы экспрессии генов на уровне мРНК.
5. Синтез и изучение свойств конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
Введение реакционноспособных группировок в модифицированные олигонуклеотиды позволяет создавать реагенты, способные специфически узнавать и модифицировать НК и белки. Следующая часть работы посвящена синтезу различных типов конъюгатов на основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов, содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, и изучению их физико-химических и биологических свойств.
5.1. Фотоактивируемые конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
В качестве фотоактивных групп при создании реакционноспособных производных олигонуклеотидов успешно используют перфторированные ароматические азиды, проявляющие высокую эффективность в реакциях модификации биополимеров. Были сконструированы серии фотоактивируемых конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов, несущих на 5'- или 3'-концевых фосфатах и-азидотетрафторбензамидную группировку. Для синтеза использовали метод селективной активации концевого фосфата олигонуклеотида смесью трифенилфосфин/дипиридилдисульфид в присутствии диметиламинопиридина с последующей обработкой диамином и ацилированием аминогруппы с помощью М-оксисукцинимидного эфира я-азидотетрафторбензойной кислоты (схема 2).
О^__Схема 2
и—0-14 |
(РЦ.Р, (Рув), МН2(СН2)2Ш12 ■»—' II
О-Р-О-О^о 1П'1А|, -- РШ/СН^Н-Р-О-ОИео -°—- ИЧН(СН2)2МН-Р-0-0и80
О ¿- РН8.3 0-
(XV) (XVI)
01180 = незащищенный олигонуклеотид —(СН2)21ЧН- 11=14,——
Выходы и характеристики синтезированных фотоактивируемых производных представлены в табл. 6. При введении л-азидотетрафторбензамидной группировки на 3'-или 5'-конец олигонуклеотидов времена удерживания на аналитической офВЭЖХ во всех случаях увеличивались за счет увеличения гидрофобности. Влияние этой группировки на температуру плавления дуплексов зависело от ее расположения и было как положительным, так и отрицательным (1-2 °С).
Таблица 6. Выходы и характеристики синтезированных аминосодержащих и п-азидотетрафторбензамидных конъюгатов окта(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» и
№ Синтезированные производные Общий выход, %'* Время удерживания, мин2* Т °С3* * пл, ^
РНК ДНК
ХУа 5'-NH2LpCmAmGmC,nUmCmCmAm,•„v7' 70 6.7 56 35
ХУ1а 5'-1ШНЬрСшАшСтСП1ишСтСтАт[-„„Г 43 8.1 54 33
ХУб 5,-CmAmGmC,ПUmCmCraAm,■„vrpLNH2 60 6.7 56 35
ХУ16 5'-СТОГи"СГА"тдаНК 45 8.2 57 35
ХУв 5,^Н2ЬрС",АтСтСтигаС'"СтАт 62 10.4 - , -
ХУ1в 5'-ШНЬрСтАтОтСтитСтСтАт 48 11.7 - -
ХУг 5,-ГАТСпишС"С,АлрШН! 50 10.4 - -
XVI г 5,_стАт0тститстстАтрЬ]чнк 45 11.8 - -
ХУд 5'-CAGCTCCApLNH2 75 6.7 - -
ХУ1д 5'-CAGCTCCApLNHR 40 10.3 - -
ХУе 5'-1\Н3ЬрСАС1СТССА 80 6.7 - -
ХУ1е 5,-RNHLpCAGCTCCA 51 10.3 - -
ХУ1ж 5•-RNHLpCAGCUCCA4* 65 13.4 - -
- Выход после хроматографического выделения в расчете на 2* - По данным аналитической офВЭЖХ. 3 - Условия
Ь -(С1Ь)2Ы1[-, К = -СОС,Л74Нз. олигонуклеотид, содержащий концевой фосфат, термической денатурации см. табл.3.4* - Получен Мещаниновой М.И. (ИХБФМ СО РАН)
Изучение способности полученных перфторарилазидных производных к сайт-направленной фотомодификации ДНК- и РНК-мишеней в зависимости от типа олигонуклеотида, наличия З'-инверсии и расположения фотогруппы проводили на модельных 5'-[32Р]-меченых 20-тизвенных олигонуклеотидах с последовательностью, соответствующей фрагменту (+)-цепи ДНК ВИЧ-1 (нуклеотиды 7516-7535, ген ет) (рис. 7).
ДНК-мишень 5'-[32Р]-р(1(Т ОС С Т О О Л С С Т О С Т Т С Л Т О С) РНК-мишень 5'- [32Р]-р(и О С С и С С. А С, С и О СII и О А и О С)
100 80 60 40 20 0
Ковалентные аддукты, %
а
7}„ЛтСтСгаитСтОтАтСтрЬРШК НгаЬрГ;„ДЧ;тСтитСтО,,,АтСт
Атстститст0тдтстрЬ]чнк
ШЧНЬрАтСтСтитСшОшАтСт
А С С Т С й А CpLNHR RNHLpA С С Т С О А С
А С С II С в А CpLNHR
100 Ч Ковалентные аддукты, %
О 5 о^ О 20°С 80
(ХУ1а) (ХУ16) (ХУ1в) (Х\'1г) (ХУ1д) (ХУ1е) (ХУ1ж)
□ 40 '
ШИтШпьт,
I
60
о
б
абвгдеж абвгдеж
реагенты
реагенты
Рис. 7. Модельные системы для сайт-направленной фотомодификации и ковалентные аддукты, образуемые с РНК (а) и с ДНК (б) реагентами (ХУ1а-ж) при различной температуре (5, 20 и 40 °С). Условия облучения: 10 мин, 5-10 4Вт-см"2, 303-365 нм; буфер 0.1 М №С1, 1мМ БЭТА, 0.01 М Трис-НС1 (рН 7.2); [мишень] МО"7 М, [реагент] 1 • 10"5 М.
Сравнивая количество ковалентных аддуктов, образуемых реагентами с ДНК- и РНК-мишенями, можно сказать, что синтезированные реагенты образуют большее 10
количество ковалентных сшивок с ДНК-мишенью. Кроме ковалентных аддуктов при фотомодификации происходит образование продуктов «скрытой» модификации, которые, в случае ДНК мишени составляли от 2 до 22 %. Можно предполагать, что образование аналогичных продуктов, которые могут вносить значительный вклад в общую модификацию, происходит и при модификации РНК. К нашему удивлению, введение реакционноспособной группы на «дополнительный» 5'-фосфат у «инвертированного» тимидина (реагент Х\'1б) слабо влияло на количество ковалентных аддуктов с РНК- и ДНК-мишенями. Уменьшение концентрации комплекса мишени с реагентом с повышением температуры облучения с 5 ° до 40 °С приводило к снижению степени образования ковалентных аддуктов (рис.7). Количество ковалентных аддуктов с РНК-мишенью изменялось для изученных реагентов следующим образом: рибо- > «инвертированный»(2'-0-метилрибо)- > 2'-0-метилрибо- > дезоксирибо-реагент. В случае ДНК-мишени этот ряд выглядел следующим образом: дезоксирибо- > рибо- > «инвертированный»(2'-0-метилрибо)- > 2'-0-метилрибо-реагент.
Полученные данные говорят о том, что фотоактивируемые производные олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов, содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, могут быть использованы как эффективные реагенты для комплементарно-адресованной фотомодификации нуклеиновых кислот.
5.2. Синтез и свойства 5'-пирепильных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную 3 '-3 '-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
Следующий раздел нашей работы был посвящен синтезу новых флуоресцентных проб - 5'-пиренилметифосфамидных и 5'-биспиренилметилфосфодиамидных производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов, содержащих «инвертированный» тимидин на З'-конце, и изучению их гибридизационных и флуоресцентных свойств.
5.2.1. Синтез конъюгатов олиго(2'-0-метшрибонуклеотидов) с пиреном
Для селективного получения 5'-моно- и 5'-биспиренильных конъюгатов был использован метод активации концевого фосфата с последующим взаимодействием с пиренилметиламином в специально подобранных условиях (схема 3).
Следует отметить, что во всех случаях степень превращения исходного олигонуклеотида в пиренильные конъюгаты была не менее 80%. Как и -следовало ожидать, время удерживания при офВЭЖХ было различным в зависимости от количества гидрофобных пиренильных остатков, присоединенных к концевому фосфату олигонуклеотида (табл. 7). Для сравнительного изучения физико-химических свойств 5'-моно- и 5'-биспиренильных
конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) в аналогичных условиях был проведен синтез их дезоксирибо-аналогов (XVI 1н) и (ХУШв).
Таблица 7. Характеристики синтезированных 5'-пиренилметилфосфамидных и 5'-биспиренилметилфосфодиамидных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» и дезоксирибо- аналогов._____
№ Конъюгат о? "ч О И Ю Время удерживания, 2* мин Молекулярная масса
Эксперимен тальная, т/г3' рассчитанная, [М-Н]"
(ХУПа) КрОтСтАп,итСтАгаАтатСтитСтСтАтОтСтСт 60 21 5596.78 5594.53
(ХУПб) «рСтСтАтитСгаАтАтОтСтитСтСтАтОтОтСт,„у7' 74 21 5900.98 5898.93
(ХУНв) ДрССАТСААОСТССАООС 65 21 5144.42 5142.61
(ХУШа) К7рСтСтАтитСтАтАтСтСтитСтСтАтОгаОтСт 42 31 5810.06 5809.67
(ХУШб) Л2рОп,СтАтитСтАгаАтСтСтитСтСтАтОтОтСт,„„Г 47 32 6114.25 6111.90
(ХУШв) йгрССАТСААОСТССАССС 51 33 5357.70 5356.03
Д = РугСН2МН-. Выход после выделения офВЭЖХ в расчете на олигонуклеотид, содержащий концевой фосфат. 2*По данным офВЭЖХ. 3"По данным МА1ЛЭ1-ТОР масс-спектрометрии.
5.2.2. Свойства 5'-пиренилъных конъюгатов олиго(2'-0-метшрибонуклеотидов)
Было показано, что 5'-конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с пиреном образуют стабильные комплексы с фрагментами РНК и ДНК. При этом влияние остатков пирена на стабильность дуплексов зависит от концевой пары, с которой соседствует пиреновая группировка, длины олигонуклеотида и типа дуплекса. Монопиренильные группировки, вероятно, вступают в стэкинг-взаимодействия с терминальной комплементарной парой, что приводит к повышению термической стабильности дуплексов (на 1-2 °С). Биспиренильные группировки способны образовывать эксимер, при этом возможность пирена участвовать в стэкинг-взаимодействиях с концевой парой дуплекса ограничена, что приводит к меньшей стабилизации дуплекса (на 0.4-1.2°С) или даже его незначительной дестабилизации (на 0.4-1.9°С). Наличие 3'-«инвертированного» тимидина не уменьшает стабильности дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов).
Спектр и интенсивность эмиссии флуоресценции пиренильных производных зависят от локального окружения пиреновых остатков и, соответственно, от возможности образовывать эксимерные структуры. При образовании дуплекса исследуемых пиренильных конъюгатов с РНК и ДНК мы наблюдали изменение спектров эмиссии флуоресценции этих производных (рис. 8). Для 5'-моно-пиренильных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) (ХУПа,б) наблюдали существенное тушение мономерной флуоресценции (в 5 - 7 раз) при образовании дуплекса как с РНК, так и с ДНК (рис. 8а,б) за счет взаимодействия 5'-пиренильного остатка с последней парой дуплекса. Образование дуплексов 5'-бис-пиренильных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) (ХУШа,б) с РНК и ДНК приводило к увеличению эксимерной флуоресценции в 5-6 раз (рис. 8г,д). 3'-«Инвертированный» тимидин незначительно изменял флуоресцентные свойства конъюгатов. При гибридизации 5'-моно- и 5'-биспиренильных конъюгатов олигодезоксирибонуклеотидов (ХУПв) и (ХУШв) с РНК и ДНК интенсивность флуоресценции была ниже, чем для конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), что, вероятно, связано с различиями в структуре дуплексов олигодезоксирибонуклеотидов и олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с НК (рис. 8в,е).
360 410 460 510 560 нм 360 410 460 510 560 360
Рис. 8. Спектры флуоресценции дуплексов 5'-пиренильных конъюгатов олигонуклсотидов с фрагментами ДНК и РНК в буфере 0.1 М ИаС1, 10 мМ какодилат натрия (рН 7.4), 1 мМ Иа2ЕПТА; >.в0,б 345 нм: спектр 1 -исходный конъюгат, спектр 2 - дуплекс конъюгата с РНК (5ЧЗССиССАССииСА11СС), спектр 3 -дуплекс с ДНК (5'-ОССТОаАОСТТСАТСС). (а) Конъюгат ДрСтСтАтитСтАтАтОтСтитСтСтАтОп1Оп,Ст (ХУИа); (б) конъюгат йрОтСтАтитСтАп,АтОтСтитСтСтАтСтОп,Ст,„„Г (\VIIo); (в) конъюгат ДрОСАТСААССТССАССС (ХУПв); (г) конъюгат Д2рОгаСтАтитСтАтАтОтСтитСтСтАтОтОтСт (ХУШа); {<)) конъюгат й2рСтСтАтитСтАтАтОшСтитСгаСтАтОтСтСт/„у7' (ХУШб); (е) конъюгат Д^рОСАТСААОСТССАССС (ХУШв). Концентрации олигонуклеотидных компонентов 2-10"7 М.
Для проверки возможности использования синтезированных 5'-моно- и 5'-биспиренильных производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их З'-модифицированных аналогов для детекции однонуклеотидных замен нами были использованы их дуплексы с 16-звенными фрагментами РНК или ДНК, содержащие или не содержащие мисматч.
Таблица 8. Характеристики температурной зависимости флуоресценции дуплексов 5'-монопиренильных производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с РНК и ДНК1*._^__
Конъюгат Мишень"1' Тмакс» „сз- Флуоресценция, усл.ед. 0 10 20
ЯрОтСшАтишСтАшАтСшСшитСшСтАтОтОтСт (ХУНа) ДНК 61
ммДНК 50
РНК 80
ммРНК 71
ДрОтСтАтитСтАгаАтатСтитСтСтАтатСтСт1„Г (ХУИб) ДНК 63 а в
ммДНК 51
РНК 81
ммРНК 74
ДрОСАТСААОСТССАСОС (ХУНв) ДНК 62
ммДНК 55
РНК 59
ммРНК 49
Я = РугСН2МН-. Условия: буфер 0.1 М №С1, 10 мМ какодилат натрия (рН 7.4), 1 мМ №2ЕОТА; концентрация олигонуклеотидных компонентов 2-Ю"7 М; Х.воз6 345 нм; детекция флуоресценции на длине волны испускания 392 нм. 2*В качестве мишеней были использованы фрагменты НК: РНК - 5'-СССШОАОСШОАШС, ммРНК - 5'-ОССШССССЦиСАШС, ДНК - 5'-СССТООАОСТТСАТСС и ммДНК - 5'-СССТООСОСТТСАТСС.3 ТМакс— максимум дифференциальной кривой температурной зависимости флуоресценции. 4 Значения флуоресценции дуплексов при 10 (серый столбец) и 85 °С (черный столбец).
Была изучена температурная зависимость флуоресценции 5'-моно- и 5'-биспиренильных группировок в дуплексах пиренильных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) (ХУПа) и (ХУИб) с полностью комплементарными или содержащими однонуклеотидную замену фрагментами РНК и ДНК. Характеристики полученных температурных зависимостей флуоресценции для дуплексов 5'-монопиренильных производных приведены в табл. 8. К сожалению, в используемых условиях для дуплексов 5'-биспиренильных производных наблюдали постепенное уменьшение флуоресценции с ростом температуры и отсутствие выраженного перехода от дуплекса к свободным олигомерам.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что сконструированные на основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов с терминальной З'-З'-межнуклеотидной связью меченые одним или двумя остатками пирена по 5'-концу конъюгаты являются перспективными пробами для исследования процесса гибридизации олигонуклеотидов с НК, детекции НК в растворе и выявления однонуклеотидных замен в ДНК.
5.3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную 3-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с лигандами малой бороздки: дизайн, синтез и изучение свойств
Соединения, способные селективно связываться с определёнными нуклеотидными последовательностями двуспиральной ДНК, находят применение в изучении структуры и функций геномной ДНК и процессов регуляции экспрессии генов. Следующая часть нашей работы была посвящена конструированию и изучению физико-химических свойств конъюгатов триплексформирующих пиримидиновых олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки ДНК и интеркаляторами. Эта часть работы проводилась совместно с професором А. С. Буториным (лаборатория регуляции и динамики генома Национального музея естественной истории, Париж, Франция), к.х.н. В. Н. Синяковым и к.х.н. В. А. Рябининым (Лаборатория медицинской химии ИХБФМ СО РАН).
5.3.2. Синтез конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с лигандами малой бороздки
С использованием химии Н-фосфонатов нами был разработан простой метод синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), а также их 3'-«инвертированных» аналогов, несущих на 5'-конце гекса- или триэтиленгликольфосфаты и получена серия 5'-модифицированных пиримидиновых олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) (схема 4).
(М*0>,Тг0—у0 В-
р ом*
°'ГН Г 2 6—\ о В' -
о ом* 0=Р-Н
О—V о В'
р ом* 0=р-н
6—\ о В'
р ом*
0—О-Х
2) (МвО^Тг^^О^^Оу-О .ИУС1.РУ
н ч0"теан»
Vе
_ н о
\ г
о'п о—Р—о
Со 11
ч
н' В-
р^ом. о=р-н
р ом*
0=р-н
о-Х
|г(ОМе),
О ■
о" чо-л о в
о ОМ*
о=р-о"
но-х
Схема 4
(МвО^Тг"
*) 12, Ру/Н,0 5) НН40Н_
—' о т
п=1 р11ри™и™и™С™и™и™и™иЧ>љљљљС'»;„,Г (XIX) п=4 р!.гритититСтитип|ититС'пСп,СтСтСп,Ст(пуГ (XX)
-до В(В.>
(: ]_/ П=1 р^ри-и-и-с-и-и-и-и-с-с-с-с-с-с» (XXI)
^ом. п=4 р^и'"ититСти™и'"ититСтСтСтСтСтСт (XXII)
На основе синтезированных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов, несущих олигоэтиленгликольфосфат на 5'-конце, была получена серия конъюгатов с одним или двумя остатками ЛМБ (гекса или окта (Ы-метилпиррол)карбоксамид), а также конъюгатов, содержащих одновременно остаток ЛМБ и интеркалятор (6-[(3-аминопропил)амино]-10-амино-13Н-бензо[6,7]индоло[3,2-с]хинолин, В1р), и подтверждена их структура (рис. 9, табл. 9). Для синтеза данных конъюгатов была использована селективная активация концевого фосфата олигонуклеотида РРЬ3/(Ру8)2ЛЭМАР с последующим взаимодействием с аминосодержащим лигандом.
н.с
(РуМРуК-р-О^о
[(РуМРу)„Ь-р-ОИ8о
В1С!-(Ру)„-(Ру)„-р-0^о
он о Г о
0-01хдо
-о-оИдо
н,с
1 ^ т в
ОИдо: проиаводние олиго (21 -О-метилрибонуклеотидов) (VI .VII) или (Х1Х-ХХИ)
Рис. 9. Структура конъюгатов олнго(2'-0-метилрнбонуклеотидов) с одним или двумя остатками ЛМБ и конъюгатов, содержащих одновременно ЛМБ и интеркалятор (В1<3).
Таблица 9. Характеристики синтезированных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с лигандами малой бороздки и интеркалятором.__
№ Конъюгат 5'-3' Время удерживания, мин1* Молекулярная масса
Рассчитанная и*. S 43 il g § S s а H 0 g H
XXIIIa (Py)3-(Py)3-pUmUmUmUmCmUmUmU,"UmCn,C,nC,"CmCmCmUra 12.9 6121.33 6120.74
ХХШб 1(Ру)з-(Ру)з1г-рититититСтитититишСтСтС,"СтСтСтига 16.2 7108.45 7108.02
XXIVa (Ру)з-(Ру)з-р1/РититититСтититититСтСтСтСтСтСтит 12.9 6333.46 6332.77
XXIV6 (l(Py)3-(Py)3l2pt;pUmUmUmUmCraUmUmUmUmCmCmCmCmCmCmUm 16.1 7320.58 7319.86
XXVa (Py)3-(Py)3-pi2pUmUmUmUmCmUraUmUmUmCmCmCmCmCmCmUm 13.5 6465.62 6465.57
XXV6 1(Ру)з-(Ру)зЬ-р£2рититититСп,ип,итититСтСтСп'СтСтСтига 16.5 7452.7 7452.57
XXVIa (Py)3-(Py)3-pi2pUmUmUmUn,CmUmUmUn,UmCn,CmCmCmCmCmUm,„v7' 13.8 6689.8 6690.05
XXVI6 [(Py)3-(Py)3l2-pi2pUmUmUmUmCmUmUn,UmUmCmCmCmCmCmCmUml„vZ' 16.8 7676.95 7677.02
XXVIB ^е(Ру)з-(Ру)з-р^2рититититСгаититититСшСтСп,СтСтСтит,„7' 18.4 7140.36 7139.56
XXVIIa (Py)4-(Py)4-pI,pUmU"'UraUmCmUmUmUmUmCmCmCmCmCmCmUm,„v7' 14.0 6899.9 6898.25
XXVIIB ß/ß-(Py)4-(Py)4-pi;pUmUraUmUmCmUmUmUmUn'CmCmCmCn,CmC'nUmI„vr 20.3 7252.35 7253.16
XXVIIIa (Ру)4-(Ру)4-Р^2рититититСтитигаититСтСтСтСтСтСтит,„,Г 14.5 7032.08 7034.78
XXVIIIB B/ß-(Py)4-(Py)4-pI2pUmUmUmUmCmUn,UmUmUraCmCmCmCmCraCnlUm/„v7' 21.2 7252.45 7252.78
Li — триэтиленгликоль; L2 - гексаэтиленгликоль. По данным офВЭЖХ. По данным ESI Q-TOF масс-спектрометрии.
5.3.2. Стабильность триплексов конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и лигандов малой бороздки с дцДНК
Способность синтезированных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов образовывать триплексы с дцЦНК была изучена с использованием синтетического дуплекса (29 пар нуклеотидов), содержащего полипуриновый участок генов nef и pol провируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) длиной 16 нуклеотидных пар. Сконструированные конъюгаты представляли собой олигопиримидиновый фрагмент, способный формировать тройную спираль с 16-звенным полипуриновым участком, к 5'-концу которого присоединены один или два лиганда малой бороздки (ЛМБ), или лиганд малой бороздки и остаток интеркалятора. Схематичная структура образующегося комплекса конъюгата и дцЦНК-мишени представлена на рис. 10.
н,с о н
7~\ s- 11 1
о H
Рис. 10. Структура тройного комплекса: конъюгат олиго(2'-0-метиярибонуклеотида), содержащего «инвертированный» тимидин, с ЛМБ (окга(1Ч-метилпиррол)карбоксамид), и дуплекс, содержащий полипуриновый участок генов nef и pol (участок 1) и участок связывания для олиго(ТЧ-метилпиррол)карбоксамида (участок 2).
Константы диссоциации триплексов при 10 °С и рН 6.0, полученные методом задержки в геле, приведены в табл. 10. Присоединение одного или двух остатков ЛМБ уменьшает константу диссоциации триплекса (для сравнения см. табл. 4). Наибольшей стабильностью обладал триплекс конъюгата олиго(2'-0-метилрибонуклеотида) с двумя ЛМБ, присоединенными к олигонуклеотиду через гекса(этиленгликолевый) линкер.
Таблица 10. Константы диссоциации триплексов дцДНК с олиго(2'-0-метилрибонуклеотидами) и их конъюгатами, содержащими один или два остатка ЛМБ, а также с конъюгатами, содержащими ЛМБ и интеркалятор .__
Конъюгат К„, нМ
(PyЬ-(Py)з-pUmUmUmUmC'nUmUmUmUmCmC,"CmCmCmC,nU,,, (XXlIIa) 68±9
[(Ру)з-(Ру)з]2рититититсгаититититстстстстстстит (ХХШб) 63±4
(Py)3-(Py)3-pi;pU"'UmUmU,nCmUmUmUmUmCmC",CmC'nC"'C°,U"' (XXÏVa) 81±6
([(Py)3-(Py)3]!-pi;pUmUraUmUmCmUroUmUmUmCmCmCmCmCmCmUm (XXIV6) 14±7
(Ру)з-(Ру)з-р^2рититититстититититстстстстстстига (XXVa) 7±3
[(Ру)з-(Ру)з12-рЬ2рититититСтититититСтСтСтСтСтСтит (XXV6) 6±2
(Ру)4-(Ру)4-рг2рититититСшитититипСтСтСтСтСтСтига;„„Г (XXVIIIa) 157±70
B/e-(Py)4-(Py)4-pi?pUmUmUmUmCmUmUmUmUmCmCraCmCmCmCmU" ,„v7"(XXVIIIB) 218±24
Константы диссоциации тройных комплексов получены методом задержки в геле при 10°С ирН 6.0 (50 мМ МЕБ, 50 мМ №01, 5 мМ М§СЬ). Концентрация дуплекса 60 нМ, концентрацию ТФО варьировали от 0.5 до 50 мкМ.
Было продемонстрировано, что конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с «инвертированным» тимидином, содержащие одновременно ЛМБ и интеркалятор, способны формировать триплекс с олигопуриновой*олигопиримидиновой последовательностью ВИЧ даже в условиях близких к физиологическим (табл.11). Таблица 11. Константы диссоциации триплексов конъюгатов 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-
Олигонуклеотид/конъюгат Кд, нМ
pH 6.0,10 "C pH 7.2,37 °C
pi2pUmUmUmUmCn,UmUmUmUmCmCmCmCmCmCmUra;„,7' (XXII) 187±30 н/д
(Py)3-(Py)rpi.2pUmUmUmUmCmUmUmU"'UmCmCmCmCmCmCmUm,„v7' (XXVIa) 85±4 600±140
[(Py)3-(Py)3]2-pi2pUmUmUmUmCmUmUmUmUmCraCmCmCmCmCmUm,„v7' (XXVI6) 65±10 70±15
B/ô-(Py)3-(Py)3-piîpUmUmUmUmCmUmUmUmUmCraCmCmCmCmCmUm1„vr(XXVlB) 150±65 90±20
Константы диссоциации получены методом задержки в геле при 10 °С и рН 6.0 (50 мМ MES, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2), при 37°С и рН 7.2 (50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2). Концентрация дуплекса 60 нМ, концентрацию ТФО варьировали от 0.5 до 50 мкМ.
Созданные конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих «инвертированный» тимидин, были апробированы в Лаборатории регуляции динамики генома Национального музея естественной истории (Париж, Франция) в качестве ингибиторов транскрипции и было продемонстрировано доз-зависимое ингибирование транскрипции in vitro в заданном полипуриновом тракте.
Полученные в работе результаты подтверждают перспективность использования олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, в качестве платформы для создания высокоселективных инструментов исследований в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины.
Выводы
На основе устойчивых в биологических средах олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с терминальной З'-З'-фосфодиэфирной связью создан ряд конъюгатов с группировками различной химической природы - перспективных флуоресцентных зондов и реагентов для использования в антисмысловой и антигенной биотехнологиях.
1. С использованием твердофазных Н-фосфонатного и фосфитамидного методов синтеза получены серии олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих на З'-конце дезоксирибонуклеозид (дезоксицитидин, дезоксигуанозин, дезоксиаденозин и тимидин), присоединенный З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью, и изучены их свойства. Показано, что:
а) введение на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотида) любого «инвертированного» дезоксирибонуклеозида (,„УГ, ,„УС, ¡1ПА или ¡тС) повышает их устойчивость к действию 3'-экзонуклеаз. Продемонстрировано, что такое сочетание модификаций по 2'-гидроксилам и З'-концу делает олигорибонуклеотиды устойчивыми к действию нуклеаз сыворотки в течение нескольких суток;
б) в большинстве случаев «инвертированные» дезоксирибонуклеозиды улучшают комплексообразующие свойства олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) за счет дополнительных стэкинг-взаимодействий «нависающего» «инвертированного» дезоксирибонуклеозида с концевой парой дуплекса;
в) введение 3'-«инвертированного» тимидина в «химерные» 2'-0-метилрибо-/дезоксирибо- олигонуклеотиды повышает их устойчивость к действию З'-экзонуклеаз и термическую стабильность их дуплексов с РНК и практически не влияет на их способность активировать РНКазу Н в дуплексе с РНК;
г) введение нависающего «инвертированного» тимидина на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) не нарушает А-форму дуплексов с их участием;
д) полипиримидиновые олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие на З'-конце «инвертированный» тимидин, способны образовывать стабильные триплексы с полипуриновыми участками дцДНК.
2. Созданы новые фотоактивируемые реагенты - 5'- и 3'- и-азидотетрафторбензамидные конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов, содержащих «инвертированный» тимидин. На модельных системах показано, что и-азидотетрафторбензамидные конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) эффективно модифицируют РНК и ДНК. Введение 3'-«инвертированного» тимидина в фотоактивируемые реагенты не снижает степень модификации НК.
3. Впервые синтезированы 5'-пиренилметилфосфамидные и 5'-биспиренилметилфосфодиамидные конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих «инвертированный» тимидин на З'-конце, и изучены их физико-химические свойства.
а) Показано, что введение остатка(ов) пирена в большинстве случаев повышает температуру плавления соответствующих дуплексов с РНК и ДНК.
б) Обнаружены характерные изменения мономерной и эксимерной флуоресценции моно-и биспиренильных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) при гибридизации с РНК и ДНК, что позволяет использовать эти производные олигонуклеотидов в качестве флуоресцентных зондов для детекции НК.
в) Продемонстрирована возможность использования 5' монопиренильных производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3' «инвертированных» аналогов в качестве зондов для детекции мисматчей в НК методом термической денатурации дуплексов, регистрируемой по изменению флуоресценции.
4. Разработан твердофазный Н-фосфонатный метод синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих «инвертированный» тимидин на З'-конце и олигоэтиленгликольфосфат на 5'-конце. На основе полученных модифицированных олигонуклеотидов созданы новые триплексформирующие конъюгаты, содержащие на З'-конце лиганды малой бороздки (гекса или окта(Ы-метилпиррол)карбоксамиды) и триплекс-специфический интеркалятор 6-[(3-аминопропил)амино]-10-амино-1ЗН-бензо[6,7]индоло[3,2-с]хинолин. Показано, что введение как одного, так и двух лигандов малой бороздки в олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) значительно усиливает их способность образовывать комплексы с дцЦНК при рН 6.0, а введение интеркалятора в конъюгат олигонуклеотида с лигандами малой бороздки приводит к заметному повышению стабильности комплексов в условиях близких к физиологическим.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Novopashina Р., Kuznetsova M., Venyaminova A. 2'-0-Modifïed oligoribonucleotides with terminal З'-З1 internucleotide linkage and their derivatives. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V.20. N.4-7. P.903-907.
2. Новопашина Д.С.. Кузнецова M.A., Комарова H.И., Веньяминова А.Г. Химерные олигонуклеотиды на основе 2'-0-модифицированных олигорибонуклеотидов с «инвертированной» З'-концевой межнуклеотидной связью как потенциальные ингибиторы экспрессии гена mdr 1. // Изв. Акад. Наук. Серия химическая. 2002. N.7. С. 1125-1128.
3. Novopashina Р.. Sinyakov A., Ryabinin V., Venyaminova A., Boutonne A. Conjugates of oligo(2'-0-methylribonucleotides) with minor groove binders as new sequence-specific agents recognizing both grooves of double-stranded DNA. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003. V.22. N.5-8. P.l 179-1182.
4. Boutorine A., Ryabinin A., Novopashina P.. Venyaminova A., Hélène С.,Sinyakov A. Stabilization of PNA double and triple helices by conjugation of minor groove binders to oligonucleotides. //Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003. V.22. N.5-8. P. 1267 - 1272.
5. Novopashina P.S.. Sinyakov A. N., Ryabinin V.A., Venyaminova A.G., Perrouault L., Brunet E., Giovannangeli C., Boutorine A.S. Binding properties of the conjugates of oligo(2'-0-methylribonucleotides) with minor groove binders targeted to double stranded PNA. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V.23. N.6-7. P.1019-1026.
6. Novopashina P.S., Sinyakov A.N., Ryabinin V.A., Venyaminova A.G., Halby L., Sun J.-S., Boutorine A.S. Sequence-specific conjugates of oligo(2'-0-methylribonucleotides) and hairpin oligocarboxamide minor-groove binders: design, synthesis, and binding studies with double-stranded PNA. //Chem. Biodiv. 2005. V.2. N.7. P. 936-952.
7. Novopashina D. S.. Totskaya О. S., Lomzov A. A., Venyaminova A. G. З'-Modified oligo(2'-O-methylribonucleotides) as improved probes for hybridization with RNA. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005. V.24. N.5-7. P.527-531.
8. Halby L., Ryabinin V.A., Sinyakov A.N., Novopashina D.S., Venyaminova A.G., Grokhovsky S.L., Surovaya A.N., Gursky G.V., Boutorine A.S. Head-to-head bis-hairpin polyamide minor groove binders and their conjugates with triplex-forming oligonucleotides: studies of interaction with target double-stranded DNA. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. V.25. N.l. P.61-76.
9. Новопашина Д.С.. Тоцкая O.C., Холодарь C.A., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г. 0лиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) и их производные. III. 5'-Моно- и 5'-биспиренильные конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их З'-модифицированных аналогов: синтез и свойства. // Биоорган, химия. 2008. Т.34. N.5. С.671-682.
10. Novopashina Р., Venyaminova A. The influence of dangling "inverted" thymidine on CD spectra and thermal stability of 2'-0-methyl RNA duplexes with RNA and DNA. // Collection Symp. Ser. 2008. V. 10. P.296-299.
Подписано к печати «22» января 2009 г. Формат бумаги 60x84,1/16. Тираж 120 экз. Заказ № 0122. Отпечатано «Нонпарель», 630090, Новосибирск, ул. Институтская 4/1, тел 330-26-98
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ 0ЛИГ0(2'-0
МЕТИЛРИБОНУКЛЕОТИДОВ) (Обзор литературы)
1.1. 2'-0-Метилрибонуклеотиды - минорный компонент природных РНК
1.2. Свойства олиго(2'-0-метилрнбонуклеотидов)
1.2.1. Конформация рибозы в олиго(2'-0-метилрибонуклеотидах) и их 12 дуплексах
1.2.2. Стабильность комплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с НК
1.2.2.1. Стабильность дуплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с ДНК 14 и PIIK
1.2.2.2. Стабильность триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 15 дцДНК
1.2.2.3. Квадруплексы с участием олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)
1.2.3. Устойчивость олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) к действию 18 нуклеаз
1.3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)
1.3.1. Конъюгаты олиго(2'-0-метплрибонуклеотидов) с репортерными 21 группировками
1.3.1.1. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибоиуклеотидов) с биотином
1.3.1.2. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с флуоресцентными 24 группировками
1.3.2. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) со стероидами
1.3.3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 33 интеркалирующими группировками
L.3.4. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 36 реакциондоспособными группировками
1.3.4.1. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с алкилнрующими 36 группировками
1.3.4.2. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с 37 фотореакционноспособными группировками
1.3.5. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с пептидами
1.3.6. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с комплексами 43 металлов
1.3.7. Радиоактивно меченые конъюгаты олиго(2'-0- 47 метилрибонуклеотидов)
1.4. Применение олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их конъюгатов
1.4.1. Аффинная хроматография РНК и РНК-белковых комплексов
1.4.2. Изучение и регуляция процессов сплайсинга
1.4.3. Локализация РНК в клетке
1.4.4. Изучение пространственной структуры РНК
1.4.5. Ингпбированпе экспрессии генов
1.4.5.1. Антисенс-подход
1.4.5.2. Антиген-подход
1.4.5.3. Олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) как эффекторы при воздействии 63 на структурированные РНК
1.4.6. Изучение механизма действия микроРНК и siPHK
1.4.7. Конструирование функциональных НК с использованием 2'-0- 65 метилрибонуклеозидов
Глава 2. 0ЛИГ0(2'-0-МЕТИЛРИБ0НУКЛЕ0ТИДЫ), СОДЕРЖАЩИЕ
ТЕРМИНАЛЬНУЮ З'-З'-МЕЖИУКЛЕОТИДНУЮ СВЯЗЬ, И ИХ КОНЪЮГАТЫ:
СИНТЕЗ И СВОЙСТВА (Результаты и обсуждение)
2.1. Синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих 68 терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
2.1.1. Получение полимерных носителей с присоединенными 3'- 69 диметокситритил дезоксирибонуклеозидами
2.1.2. Твердофазный синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), 71 содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
2.2. Исследование устойчивости олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), 77 содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, к действию нуклеаз
2.3. Изучение структуры и стабильности комплексов олиго(2'-0- 80 метилрибоиуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с нуклеиновыми кислотами
2.3.1. Структура и стабильность дуплексов олиго(2'-0- 81 метилрибоиуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
2.3.2. Стабильность триплексов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), 95 содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь, с двуцепочечной ДНК
2.4. Синтез и изучение свойств «химерных» 2'-0- 98 метилрибо/дезоксирибо-олигонуклеотидов, содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
2.5. Синтез и изучение свойств конъюгатов олиго(2'-0- 103 метилрибоиуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
2.5.1. Фотоактивируемые конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и 103 их 3'-«инвертированных» аналогов
2.5.1.1. Синтез фотоактивируемых конъюгатов олиго(2'-0- 104 метилрибоиуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов
2.5.1.2. Свойства фотоактивируемых конъюгатов олиго(2'-0- 110 метилрибоиуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов
2.5.2. Синтез и свойства 5'-пиренилметилфосфамидных и 5'-бис- 118 пиренилметилфосфодиамидных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеогидов), содержащих терминальную З'-З'-межнуклеозидную фосфодиэфирную связь
2.5.2.1. Синтез конъюгатов олиго(2'-0-метилрибопуклеотидов) и их 3'- 119 «инвертированных» аналогов с пиреном
2.5.2.2. Свойства 5'-пирсннльных конъюгатов олиго(2'-0- 124 метилрибонуклеотпдов) и их 3'-«инвертированных» аналогов
2.5.3. Конъюгаты олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'- 133 «инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки: дизайн, синтез и изучение свойств
2.5.3.1. Синтез конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклсотидов) и их 3'- 134 «инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки
2.5.3.2. Стабильность триплексов конъюгатов олиго(2'-0- 141 метилрибоиуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов с лигандами малой бороздки с дцДНК
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Исходные материалы
3.2. Основные методы работы
3.3. Методики эксперимента 156 ВЫВОДЫ 172 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и международного союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:
В - гетероциклическое основание нуклеозида или нуклеотида р - концевой фосфат
Nm - 2'-0-метилированный нуклеозид i,lvA - дезокснрибоаденозин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью vT - тимидин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью i„vG - дезоксирибогуанозин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью invC - дезоксирибоцитидин, присоединенный на З'-конец олигонуклеотида З'-З'-фосфодиэфирной связью Me - метил Тг - тритил
МеОТг- монометокситритил (МеО)2Тг - диметокситритил bz - бензоил ibu - изобутирил Ас - ацетил
Fmoc- 1\Г-(9-фторметил)оксикарбонил
Im - имидазол
НК - нуклеиновая кислота
ДНК - дезоксирибонуклсиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
2'-0-метил)РНК — 2'-0-метилнрованная РНК siPHK - малая интерферирующая PIIK
ТФО - триплексформирующие олигонуклеотиды
ТСХ - тонкослойная хроматография офВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ - полиакриламидиый гель
УФ - ультрафиолетовое излучение
FRET - резонансный перенос флуоресцентной энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
ЛМБ - лиганд малой бороздки
Ах - оптическое поглощение раствора на длине волны X
Тпл - температура плавления комплементарного комплекса
КД - круговой дихроизм ед. акт. - единица активности фермента
ФДЭ - фосфодиэстераза
BSA — бычий сывороточный альбумин
PivCl - пивалоилхлорид
TPS - 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид
TEA — триэтиламин
N-Melm - N-метилимидазол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
Трис — трис(оксиметил)аминометан
ТЕААс — ацетат триэтиламмония
SDS - додецилсульфат натрия
MES - 2-(1М-морфолин)-этансульфоновая кислота
HEPES — 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-этансульфоновая кислота Ру - пиридин
DMFA - диметилформамид DMSO - диметилсульфоксид THF - тетрагидрофуран
B1Q - 6-[(3-аминопропил)амино]-10-амино-13Н-бензо[6,7]индоло[3,2-с]хинолин
DMAP - 4-МД'-диметиламинопиридин
РРЬз - трифенилфосфин
PyS): - 2,2'-дипиридилдисульфид
BP - бромфеноловый синий
МПС - макропористое стекло
CPG - стекло с контролируемым размером пор
Синтетические олигонуклеотиды, их аналоги и производные рассматриваются в настоящее время как высокоселсктивные инструменты для изучения молекулярно-биологичсских процессов, а также как перспективные терапевтические средства для лечения вирусных, онкологических и наследственных заболеваний. С)лиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) обладают рядом достоинств, полезных для создания реагентов, направленных на РНК и дцДНК: повышенным сродством к РНК, высокой скоростью комплексообразования с РНК-мишенями, способностью образовывать прочные триплексы с дпДНК [ 1 ], стабильностью к ДНК и РНК специфическим эндонуклеазам [ 2 ], способностью эффективно дискриминировать мисматчи [3], а также простотой синтеза [4] и низкой токсичностью [5]. Для решения задач современной молекулярной биологии необходимо создание конъюгатов олигонуклеотидов с различными группировками, обладающими рядом уникальных свойств. Конъюгпрование олигонуклеотидов позволяет модулировать их биосовмесгимость, коплексообразующие свойства, устойчивость к действию нуклеаз, токсичность, фармакокинетические свойства, способность проникать в клетки, сродство к определенному типу клеток, способность расщеплять и/или модифицировать НК и др. Конструкции на основе олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) используются для выяснения функций определенных генов и некодирующих малых РНК [6, 7], регуляции экспрессии генов путем воздействия на уровне мРНК, микроРНК и геномной ДНК [8,9, 10], детекции НК in vitro и in vivo [И, 12], определения мутаций [3, 12], а также для решения ряда других задач молекулярной биологии, бионанотехиологии и медицины.
Однако, обладая устойчивостью к действию эндонуклеаз, олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) являются уязвимыми к действию экзонуклеаз. Ранее Веньямнновои А.Г. с соавт. [ 13 ] было показано, что введение в олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) З'-концевого тимидина посредством З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связи делает их устойчивыми и к действию З'-экзонуклеаз.
Целью данной работы являлся синтез и изучение свойств олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих терминальную З'-З'-межпуклеотидную связь, и создание на их основе реакционпоспособных, триплексформирующих и флуоресцентных конъюгатов как перспективных зондов и реагешов для использования в антисмысловой и антигенной биотехнологиях.
В ходе исследования решались следующие задачи:
- синтез и изучение физико-химических и биологических свойств олиго(2'-0-мешлрибонуклеотидов), содержащих на З'-конце дезоксирибонуклеозиды дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин или тимидин), присоединенные З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью;
- создание на основе 3'-«инвертированных» олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) новых конъюгатов с реакдионноспособными и флуоресцентными группировками, а также с лигандами малой бороздки, и изучение их свойств на модельных системах.
Можно ожидать, что сочетание двух минимальных модификаций, а именно, замена 2'-гидроксила рибозы на 2'-0-метильную группу и «инверсия» З'-концевой межнуклеозидной фосфодиэфирной связи позволит создать универсальную платформу для конструирования широкого спектра конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), направленных на решение ряда задач в области молекулярной биологии, диагностики и терапии.
выводы
На основе устойчивых в биологических средах олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) с терминальной З'-З'-фосфодиэфирной связью создан ряд конъюгатов с группировками различной химической природы - перспективных флуоресцентных зондов и реагентов для использования в антисмысловой и антигенной биотехнологиях.
1. С использованием твердофазных Н-фосфонатного и фосфитамидпого методов синтеза получены серии олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих на З'-конце дезоксирибонуклеозид (дезоксицитидип, дезоксигуанозин, дезоксиаденозин и тимидин), присоединенный З'-З'-фосфодиэфирной («инвертированной^ связью, и изучены их свойства. Показано, что: а) введение на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотида) любого «инвертированного» дезоксирибонуклеозида (,-„,,Г, ;,1VC, ,-,„,4 или ;/il,G) повышает их устойчивость к действию З'-экзонуклеаз. Продемонстрировано, что такое сочетание модификаций по 2'-гидроксилам и З'-концу делает олигорибонуклеотиды устойчивыми к действию нуклеаз сыворотки в течение нескольких суток; б) в большинстве случаев «инвертированные» дезоксирибонуклеозиды улучшают комплекс ообразующие свойства олиго(2'-0-метилрнбонуклеотидов) за счет дополнительных стэкинг-взаимодействий «нависающего» « инвертированного» дезоксирибонуклеозида с концевой парой дуплекса; в) введение 3'-«инвертированного» тимидина в «химерные» 2'-0-метилрибо/дезоксирибо-олпгонуклеотиды повышает их устойчивость к действию З'-экзонуклеаз и термическую стабильность их дуплексов с РНК и практически не влияет на их способность активировать РНКазу Н в дуплексе с РНК; г) введение нависающего «инвертированного» тимидина на З'-конец олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) не нарушает А-форму дуплексов с их участием; д) полипиримидиновые олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие на З'-конце «инвертированный» тимидин, способны образовывать стабильные триплексы с полипуриновымп участками дцДНК.
2. Созданы новые фотоактивируемые реагенты - 5'- ч п 3'- и-азидотетрафторбензамидные конъюгаты олпго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их аналогов, содержащих «инвертированный» тимидин. На модельных системах показано, что /г-азпдотетрафторбензамидцые конъюгаты олпго(2'-0-метилрибонуклеотидов) эффективно модифицируют РНК и ДНК. Введение 3'-«инвертированного» тимидина в фотоактивируемые реагенты не снижает степень модификации НК.
3. Впервые синтезированы 5'-пиренплметилфосфамидные и 5' биспиренилметилфосфодиамидные конъюгаты олиго(2'-0-метплрибонуклеотидов), содержащих «инвертированный» тимидин на З'-конце, и изучены их физико-химические свойства. а) Показано, что введение остатка(ов) пирена в большинстве случаев повышает температуру плавления соответствующих дуплексов с РНК и ДНК. б) Обнаружены характерные изменения мономерной и эксимерной флуоресценции моно- и биспиренильных конъюгатов олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) при гибридизации с PIIK и ДНК, что позволяет использовать эти производные олигонуклеотидов в качестве флуоресцентных зондов для детекции НК. в) Продемонстрирована возможность использования 5'-монопиренильных производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) и их 3'-«инвертированных» аналогов в качестве зондов для детекции мисматчей в НК методом термической денатурации дуплексов, регистрируемой по изменению флуоресценции.
4. Разработан твердофазный Н-фосфонатный метод синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), содержащих «инвертированный» тимидин на З'-конце и олпгоэтиленгликольфосфат на 5'-конце. На основе полученных модифицированных олигонуклеотидов созданы новые триплексформирующие конъюгаты, содержащие на З'-конце лиганды малой бороздки (гекса или окта(ЪГ-метилпиррол)карбоксамиды) и триплекс-специфический интеркалятор 6-[(3-аминопропил)ампно]-10-амино-1ЗН-бензо[6,7]индоло[3,2-с]хинолин. Показано, что введение как одного, так и двух лигандов малой бороздки в олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) значительно усиливает их способность образовывать комплексы с дцДНК при рН 6.0, а введение интеркалятора в конъюгат олигонуклеотида с лигандами малой бороздки приводит к заметному повышению стабильности комплексов в условиях, близких к физиологическим.
1. Manoharan М. 2'-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. // Biochem. Biophys. Acta. 1999. V.1489. N.l.P.l 17-130.
2. Hutvagner G., Simard M., Mello C.C., Zamore P.D. Sequence-specific inhibition of small RNA function. // PLoS Biology. 2004. V.2. N.4. P.465-474.
3. Ravichandran L.V., Dean N.M., Marcusson E.G. Use of antisense oligonucleotides in functional genomics and target validation. // Oligonucleotides 2004.V. 14. N.l. P.49-64.
4. Prakash T.P., Bhat B. 2'-Modified oligonucleotides for antisense therapeutics. // Curr. Opin. Med. Chem. 2007. V.7. N.7. P.641-649.
5. Majumdar A., Puri N., Cuenoud В., Natt F., Martin P., Khorlin A., Dyatkina N., George A.J. Miller P.S., Seidman M.M. Cell cycle modulation of gene targeting by a triple helix-forming oligonucleotide. //J. Biol. Chem. 2003. V.278. N.13. P. 11072-11077."
6. Kehlenbach R.H. In vitro analysis of nuclear mRNA export using molecular beacons for target detection. // Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N. 11. e64.
7. Antisense research and applications. / Eds Crook S.T., Lebleu B. Boca Raton; Ann Arbor; London; Tokyo: CRC Press, 1993.
8. Wilson С., Keefe A.D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2006. V.10. N.6. P.607-614.
9. Iribarren A.M., Sproat B.S., Neuner P., Sulston I., Ryder U., Lamond A. I. 2'-0-Alkyl oligoribonucleotides as antisense probes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. N.10. P.7747-7751.
10. IComatsu Y., Nobuoka K., Karino-Abe N., Matsuda A., Ohtsuka, E. In vitro selection of hairpin ribozymes activated with short oligonucleotides. // Biochemistry. 2002. V.41. N.29. P.9090-9098.
11. Komatsu Y., Yamashita S., Kazama N., Nobuoka K., Ohtsuka E. Construction of new ribozymes requiring short regulator oligonucleotides as cofactor. // J. Mol. Biol. 2000. V.299. N.5. P.1231-1243.
12. Komatsu Y., Ohtsuka E. Regulation of ribozyme cleavage activity by oligonucleotides. // Methods Mol. Biol. V.252. Ribozymes and siRNA protocols. / Ed. Sioud M. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2004. P. 165-177.
13. Hovig E., Maelandsmo G., Mellingsaeter Т., Fodstad O., Mielewczyk S. S., Wolfe J., Goodchild J. Optimization of hammerhead ribozymes for the cleavage of S100A4 (CAPL) mRNA. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001. V.l 1. N.2. P.67-75.
14. Fokina A.A, Kuznetsova M.A, Repkova M.N, Venyaminova A.G. Two-component 10-23 DNA enzymes. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V.23. N.6-7. P.1031-1035.
15. Meister G., Landthaler M., Dorsett Y., Tuschl T. Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. // RNA. 2004. V.10. N.3. P.544-550.
16. Disney M.D., Haidaris C.G., Turner D.H. Uptake and antifungal activity of oligonucleotides in Candida albicans. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. N.4. P.1530-1534.
17. Dunckley M. G., Manoharan M., Villet P., Eperon J.C., Dickson G. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscule cells by antisense oligoribonucleotides. // Human Mol. Gen. 1995. V.5. N.l. P.1083-I090.
18. McGail J.C., O'Keefe R.T. The Ul, U2 and U5 snRNAs crosslink to the 5' exon during pre-mRNA splicing. //Nucleic Acids Res. 2008. V.36. N.3. P.814-825.
19. Tamura M., Nashimoto C., Miyake N., Daikuhara Y., Ochi K., Nashimoto M. Intracellular mRNA cleavage by З'-tRNase under the direction of 2'-0-methyl RNA heptamers. // Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N.15. P.4354-4360.
20. Werner M., Rosa E., Nordstrom J.L., Goldberg A.R., George S.T. Short oligonucleotides as external guide sequences for site-specific cleavage of RNA molecules with human RNase P. // RNA. 1998. V.4. N.7. P.847-855.
21. Ma M., Benimetskaya L., Lebedeva I., Dignam J., Takle G., Stein C.A. Intracellular mRNA eleavage induced through activation of RNase P by nuclease-resistant external guide sequences. // Nature Biotcch. 2000. V.l8. N.l. P.58-61.
22. Li H., Liang R., Turner D.H., Rothberg L.J., Duan S. Selective quenching of fluorescence from unbound oligonucleotides by gold nanoparticles as a probe of RNA structure. // RNA. 2007. V.13. N.l 1. P.2034-2041.
23. Rozenski J., Crain P.F., McCloskey J.A. The RNA modification database: 1999 update. // Nucleic Acids Res. 1999. V.27. N.l. P.196-197.
24. Hall R.II. On the 2'-0-methylribonucleoside content of ribonucleic acids. // Biochemistry. 1964. V.3.N.7. P.876-880.
25. Li C., Xia Y., Gao X., Gershon P.D. Mechanism of RNA 2'-0-methylation: evidence that the catalytic lysine acts to steer rather than deprotonate the target nucleophile. // Biochemistry. 2004. V.43.N.19. P.5680-5687.
26. Kiss T. Small nucleolar RNAs: an abundant group of noncoding RNAs with diverse cellular functions. // Cell. 2002. V.109. N.2. P. 145-148.
27. Tran E.J., Zhang X., Maxwell E.S. Efficient RNA 2'-0-methylation requires juxtaposed and symmetrically assembled archaeal box C/D and C'/D' RNPs. // EMBO J. 2003. V.22. N.15. P.3930-3940.
28. Спирин A.C. РНК мир и его эволюция. // Молекулярн. биология. 2005. Т.39. N.4. С.550-556.
29. Poole A., Penny D., Sjoberg В.-М. Methyl-RNA: an evolutionary bridge between RNA and DNA? // Chem. Biol. 2000. V.7. N.12. P. R207-R216.
30. Helm M. Post-transcriptional nucleotide modificaton and alternative folding of RNA. // Nucleic Acids Res. 2006. V.34. N.2. P.721-733.
31. Satoh A., Takai K., Ouchi R., Yokoyama S., Takaku H. Effects of anticodon 2*-0-methylations on tRNA codon recognition in an Escherichia coli cell-free translation. // RNA. 2006. V.6. N.5. P.680-686.
32. Maden B.E.H., Hughes J. M.X. Eukaryotic ribosomal RNA: the recent excitement in the nucleotide modification problem. // Chromosoma. 1997. V.105. N.7-8. P.391-400.
33. Sweet Т., Yen W., Khalili K., Amini S. Evidence for involvement of NFBp in processing of ribosomal RNA. //J. Cell. Physiology. 2007. V.214. N.2. P.381-388.
34. Li J., Yang Z., Yu В., Liu J., Chen X. Methylation protects miRNA and siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis. II Cum Biol. 2005. V.15. N.16. P.1501-1507.
35. Yang Z., Ebright Y.W., Yu В., Chen X. HEN1 recognizes 21-24 nt small RNA duplexes and deposits a methyl group onto the 2' OH of the 3' terminal nucleotide. // Nucleic Acids Res. 2006. V.34.N.2. P.667-675.
36. Yu В., Yang Z., Li J., Minakhina S., Yang M., Padgett R.W., Steward R., Chen X. Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis. // Science. 2005. V.307. N.5711. P.932-935.
37. Hartig J.V., Tomari Y., Forstemann K. piRNA the ancient hunters of genome invaders. // Gen. Develop. 2007. V.21. N.14. P.1707-1713.
38. Kirino Y., Mourelatos Z. The mouse homolog of HEN1 is a potential methylase for Piwi-interactmg RNAs. // RNA. 2007. V.13. N.9. P.1397-1401.
39. Kirino Y., Mourelatos Z. Mouse Piwi-interacting RNAs are 2'-0-methylated at their 3' termini. //Nature Struct. Mol. Biol. 2007. V.14. N.4. P.347-348.
40. Kirino Y., Mourelatos Z. 2-O-Methyl modification in mouse piRNA and its methylase. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2007. V.51.N.1. P.417-418.
41. Faehnle C.R., Joshua-Tor L. Argonautes confront new small RNAs. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2007. V. 11. N.5. P.569-577.
42. Maden B.E., Corbett M.E., Ileeney P.A., Pugh K., Ajuh P.M. Classical and novel approaches to the detection and localization of the numerous modified nucleotides in eukaryotic ribosomal RNA. // Biochimie. 1995. V.77. N.l-2. P.22-29.
43. Maden B.E. Mapping 2'-0-methyl groups in ribosomal RNA. // Methods. 2001. V.25. N.3. P.374-382.
44. Yu Y.T., Shu M.D., Steitz J.A. A new method for detecting sites of 2'-0-methylation in RNA moleculcs. // RNA. 1997. V.3. N.3. P.324-331.
45. Buchhaupt M., Peifer C., Entian K.-D. Analysis of 2'-0-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. // Anal. Biochem. 2007. V.361. N.l. P. 102-108.
46. Zmudzka В., Janion C., Shugar D. Poly 2'-0-methylcytidilic acid and role of the 2'-hydroxyl in polynucleotide structure. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. V.37. N.6. P.895-902.
47. Zmudzka В., Tichy M., Shugar D. The structure of poly 2'-0-methylcytidilic acid and its complexes with polyinosinic acid. // Acta Biochim. Pol. 1972. V.19. N.2. P.149-160.
48. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот: Пер. с англ. М.: Мир, 1987.
49. Lesnik Е.А., Freier S.M. What affects the effect of 2'-alkoxy modifications? 1.Stabilization effect of 2'-methoxy substitutions in uniformly modified DNA oligonucleotides. //Biochemistry. 1998. V.37. N.19. P.6991-6997.
50. Micklefield J. Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications. // Curr. Med. Chem. 2001. V.8. N.10. P.l 157-1179.
51. Kaukincn U., Lyytikainen S., Mikltola S., Lonnberg II. The reactivity of phosphodiester bonds within linear single-stranded oligoribonucleotides is strongly dependent on the base sequence. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. N.2. P.468-474.
52. Kaukinen U., Venalainen Т., Lonnberg Ii., Perakula M. The base sequence dependant flexibility of linear single-stranded oligoribonucleotides correlates with the reactivity of the phosphodiester bond. // Org. Biomol. Chem. 2003. V.l. N.14. P.2439-2447.
53. Kaukinen U., Lonnberg H., Perakyla M. Stabilisation of the transition state of phosphodiester bound cleavage within linear single-stranded oligoribonucleotides. // Org. Biomol. Chem. 2004. V.2. N.l. P.66-73.
54. Inoue H., Hayase Y., Imura A., Iwai S., Miura K., Ohtsuka E. Synthesis and hybridization studies on two complementary nona(2'-0-methyl)ribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. N. 15. P.6131-6148.
55. Pitts A.E., Corey D.R. Inhibition of human telomerase by 2'-0-methyl-RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. N.20. P.l 1549-11554.
56. Rozners E., Moulder J. Hydration of short DNA, RNA and 2'-OMe oligonucleotides determinated by osmotic stressing. // Nucleic Acids Res. 2004. V.32. N. 1. P.248-256.
57. Auffmger P., Westhof E. Hydrophobic groups stabilize the hydration shell of 2-0-methylated RNA duplexes. // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V.40. N.24. P.4648-4650.
58. Popenda M., Biala E., Milecki J., Adamiak R.W. Solution structure of RNA duplexes containing alternating CG base pairs: NMR study of r(CGCGCG)2 and 2'-0-Me(CGCGCG)2 under low salt conditions. //Nucleic Acids Res. 1997. V.25. N.22. P.4589-4598.
59. Adamiak D.A., Milecki J., Popenda M., Adamiak R.W., Dauter Z., Rypnievvski W.R. Crystal structure of 2'-0-Me(CGCGCG)2, an RNA duplex at 1.30 A resolution. Hydration pattern of 2'-O-methylated RNA. //Nucleic Acids Res. 1997. V.25. N.22. P.4599-4607.
60. Umemoto К., Sarma M.H., Gupta G., Luo J., Sanna R.H. Structure and stability of a DNA triple helix in solution: NMR studies on d(T)6-d(A)6'd(T)6 and its complex with a minor groove binding drug. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V.l 12. N.l 1. P.4539-4545.
61. Arnott S., Chandrasekaran R., Hukins D.W.L., Smith P.J.C., Watts L. Structure details of a double-helix observed for DNA containing alternating purine and pyrimidine sequences. // J. Mol. Biol. 1974. V.88. N.2. P.523-533.
62. Escude Ch., Sun J.-S., Rougee M., Garestier Th., Helene C. Stable triple helices are formed upon binding ofRNA oligonucleotides and their 2-O-methyl derivatives to double-helical DNA. // C.R. Acad. Sci. Paris. 1992. V.315. Ser.III. P. 521-525.
63. Beban M., Miller P.S. Pyrimidine motif triplex containing polypurine RNA or DNA with oligo 2'-0-methyl or DNA triplex forming oligonucleotides. // Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1492. N.l. P.155-162.
64. Torigoe H., Shimizume R., Sarai A., Shindo H. Triplex formation of chemically modified homopyrimidine oligonucleotides: thermodynamic and kinetic studies. // Biochemistry. 1999. V.38.N.44. P.14653-14659.
65. Dapic V., Abdomeroic V., Marrington R., Peberdy J., Rodger A., Trent J.O., Bates P.J. Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N.8. P.2097-2107.
66. Dapic V., Bates P.J., Trent J.O., Rodger A., Thomas S.D., Miller D.M. Antiproliferative activity of G-quartet-forming oligonucleotides with backbone and sugar modification. // Biochemistry. 2002. V.41. N.ll. P.3676-3685.
67. Cramer H., Pfleiderer W. Nucleotides LXIV1.: synthesis, hybridization and enzymatic degradation studies of 2'-0-methyl-oligoribonucleotides and 2'-0-methyl/deoxy gapmers. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2000. V.19. N.10-12. P. 1765-1777.
68. Czauderna F., Fechtner M., Dames.S., Aygun H., Kippel A., Pronk G.J., Giese K., Kaufmann J. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. //Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N.ll. P.2705-2716.
69. Inoue H., Hayase Y., Iwai S., Ohtsuka E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H. // FEBS Lett. 1987. V.215. N.2. P.327-330.
70. Sproat B.S., Lamond A.l. 2-O-Alkyloligoribonucleotides. // Antisense research and applications. / Eds Crooke S.T., Lebleu B. Boca Raton; Ann Arbor; London; Tokyo: CRC Press, 1993. P.351-362.
71. Zamaratski E., Pradeepkumar P.I., Chattopadhyaya J. A critical survey of the structure-function of the antisense oligo/RNA heteroduplex as substrate for RNase H. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V.48. N.3. P. 189-208.
72. Venkateswarlu D., Lind K.E., Mohan V., Manoharan M., Freguson D.M. Structural properties of DNA:RNA duplexes containing 2'-0-methyl and 2-S-methyl substitutions: a molecular dynamics investigation. //Nucleic Acids Res. 1999. V.27. N.10. P.2189-2195.
73. Blencowe B.J., Lamond A.I. Purification and depletion of RNP particles by antisense affinity chromatography. // Meth. Mol. Biol. V.118.'RNA-protein interaction protocols. / Ed. Haynes S. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 1999. P.275-287.
74. Dirks R.W., Molenaar C., Tanke H.J. Methods for visualizing RNA processing and transport pathways in living cells. // Histochem. Cell. Biol. 2001. V.115. N.l. P.3-11.
75. Dirks R.W., Molenaar C., Tanke HJ.Visualizing RNA molecules inside the nucleus of living cells. //Methods. 2003. V.29. N.l. P.51-57.
76. Connolly B.A. The synthesis of oligonucleotides containing a primary amino group at the 5'-terminus. //Nucleic Acids Res. 1987. V.15. N.7. P.3131-3139.
77. Pieles U., Sproat B.S., Lamm G.M. A protected biotin containing deoxycytidine building block for solid phase synthesis of biotinylated oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1990. V.18.N.15. P.4355-4360.
78. Kricka L.J. Stains, labels and detection strategies for nucleic acids assays. // Arm. Clin. Biochem. 2002. V.39.N.2. P. 114-129.
79. Astakhova I.V., Korshun V.A., Wengel J.Highly fluorescent conjugated pyrenes in nucleic acid probes: (phenylethynyl)pyrenecarbonyl-functionalized locked nucleic acids. // Chemistry. 2008. V.14.N.35. P.l 1010-26.
80. Fisher T.L., Terhorst Т., Cao X., Wagner R.W. Intracellular disposition and metabolism of fluorescently-labeled unmodified and modified oligonucleotides microinjected into mammalian cells.//Nucleic Acids Res. 1993. V.21. N.l 6. P.3857-3865.
81. Hwang J.T., Baltasar F.E., Cole D.L., Sigman D.S., Chen C.H., Greenberg M.M. Transcription inhibition using modified pentanucleotides. // Bioorg. Med. Chem. 2003. V.ll. N.10. P.2321-2328.
82. Carmo-Fonseca M., Pepperkok R., Sproat B.S., Ansorge W., Swanson M.S., Lamond A.l. In vivo detection of snRNP-rich organelles in the nuclei of mammalian cells. // EMBO J. 1991. V.10. N.7. P.1863-1873.
83. Glen Research Corp.: Modification Booklet, http://www.glenres.com.
84. Ranasinghe R.T., Brown L.J., Brown T. Linear fluorescent oligonucleotide probes with an acridine quencher generate a signal upon hybridization. // Chem. Comraun. 2001. P.1480-1481.
85. Arzumanov A., Walsh A.P., Rajwanshi V.K., Kumar R., Wengel J., Gait M.J. Inhibition of HIV-1 Tat-dependent trans activation by steric block chimeric 2-O-methyl/LNA oligoribonucleotides.//Biochemistry. 2001. V.40. N.48. P. 14645-14654.
86. Stetsenko D. A., Gait M.J. A convenient solid-phase method for synthesis of 3'-conjugates of oligonucleotides. //Bioconj. Chem. 2001.'V.12. N.4. P.576-586.
87. Mahara A., Iwase R., Sakamoto Т., Yamana K., Yamaoka Т., Murakami A. Bispyrene-conjugated 2'-0-methyloligoribonucleotide as a highly specific RNA-recognition probe. // Angew. Chem. Int Ed. 2002. V.41. N.19. P.3648-3650.
88. Mahara A., Iwase R., Sakamoto Т., Yamaoka Т., Yamana K., Murakami A. Detection of acceptor sites for antisense oligonucleotides on native folded RNA by fluorescence spectroscopy. // Bioorg. Med. Chem. 2003. V.ll. N.13. P.2783-2790.
89. Sakamoto Т., Kobori A., Murakami A. Microarray-based label-free detection of RNA using bispyrene-modified 2-O-methyl oligoribonucleotide as capture and detection probe. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V.18. N.8. P.2590-2593.
90. Tsourkas A., Behlke M.A., Bao G. Hybridization of 2'-0-methyl and 2-deoxy molecular beacons to RNA and DNA target. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. N.23. P.5168-5174.
91. Oberhauser В., Wagner E. Effective incorporation of 2'-0-methyloligoribonucleotides into liposomes and enhanced cell association through modification with tiocholesterol. // Nucleic Acids Res. 1992. V.20.N.3. P.533-538.
92. Manoharan M., Johnson L.K., Bennett C.F., Vickers T.A., Ecker D.J., Cowsert L.M., Freier S.M., Cook P.D. Cholic acid-oligonucleotide conjugates for antisense applications. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994. V.4. N.8. P.1053-1060.
93. Horwich M.D., Zamore P. Design and delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophila and human cells. // Nature Protocols. 2008. V.3. N. 10. P.1537-1549.
94. Krutzfeldt J., Rajewsky N., Braich R., Rajeev K.G., Tuschl Т., Manoharan M., Stoffel M. Silencing of microRNA in vivo with 'antagomirs'. //Nature. 2005. V.438. N.7068. P.685-689.
95. Nelson P.S., Sherman-Gold R, Leon R. A new and versatile reagent for incorporating multiple primary aliphatic amines into synthetic oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1989. V.17. N. 18. P.7179-7186.
96. Nelson P.S., Frye R.A., Liu E. Bifunctional oligonucleotide probes synthesized using a novel CPG support are able to detect single base pair mutations. // Nucleic Acids Res. 1989 V.17. N.18. P.7187-7194.
97. Sergeeva Z.A., Venyaminova A.G., Zarytova V.F. Comparative study of modification of DNA and RNA by oligo(2'-0-methylribonucleotide) derivatives. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V.17. N.9-11. P.2153-2156.
98. Johansson H.E., Belsham G.J., Sproat B.S., Hentze M.W. Target-specific arrest of mRNA translation by antisense 2'-0-alkyloligoribonucleotides. //Nucleic Acids Res. 1994. V.22. N.22. P.4591-4598.
99. Cassidy R.A., Kondo N.S., Miller P.S. Triplex formation by psoralen-conjugated chimeric oligonucleoside methylphosphonates. //Biochemistry. 2000. V.39. N.29. P.8683-8691.
100. Cassidy R.A., Puri N., Miller P.S. Effect of DNA target sequence on triplex formation by oligo-2'-deoxy- and 2'-0-methylribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N. 14. P.4099-4108.
101. Jonkheijm P., Weinrich D., Schroder H., Niemeyer C.M., Waldmann H. Chemical strategies for generating protein biochips. // Angew. Chem.Int. Ed. 2008. V.47. N.50. P.9618-9647.
102. Turner J.J., Jones S., Fabani M.M., Ivanova G., Arzumanov A.A. Gait M.J. RNA targeting with peptide conjugates of oligonucleotides, siRNA and PNA. // Blood Cells Molec. Deseases. 2007. V.38.N.1. P. 1-7.
103. Lebleu В., Moulton H. M., Abes R., Ivanova G.D., Abes S., Stein D.A., Iversen P.L., Arzumanov A.A., Gait M.J. Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. V. 60 N.4-5. P.517-529.
104. Reed M.W., Fraga D., Schwartz D.E., Scholler J., Hinrichsen R.D. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates. // Bioconj. Chem. 1995. V.6.N.I. P.101-108.
105. Stetsenko D.A., Malakhov A.D., Gait M.J. Total stepwise solid-phase synthesis of oligonucleotide-(3'-N)-peptide conjugate. // Org. Lett. 2002. V.4. N.19. P.3259-3262.
106. Stetsenko D.A., Gait M.J. Chemical methods for peptide conjugate synthesis. // Meth. Mol. Biol. V.288. Oligonucleotide synthesis. / Ed. P.Herdewijn. Totowa, NJ: Humana Press Inc.,2005. P.205-224.
107. Казанова E.B., Зубин E.M., Качалова A.B., Стеценко Д.А., Гейт М.Дж., Орецкая Т.С.Синтез олиго-2'-0-мстилрибонуклеотидов, содержащих в положении 2' остатки а-аминокислот. // Изв. Акад. Наук. Серия химическая. 2007. Т.56. N.4. С.775-783.
108. Shimizu М., Morioka Н., Inoue Н., Ohtsuka Е. Triplex-mediated cleavage of DNA by 1,10-phenantro 1 ine-linked 2'-0-methyl RNA. // FEBS Lett. 1996. V.384. N.3. P.207-210.
109. Perrin D.M., Chen C.-H. В., Xu Y., Pearson L., Sigman D.S. Gene-specific transcription inhibitors.Pentanucleotides complementary to the template strand of transcription start sites. // J. Amer. Chem. Soc. 1997. V.119. N.24. P.5746-5747.
110. Chen C.-H. В., Milne L., Landgraf R., Perrin D.M., Sigman D.S. Artificial nucleases. // ChemBioChem. 2001. V.2. N10. P.735-740.
111. Astrom H., Stromberg R. A method for synthesis of an artificial ribonuclease. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V.20. N.4-7. P. 1385-1388.
112. Inoue H., Furukawa Т., Tamura Т., Kamada A., Ohtsuka E. Rapid RNA cleavage using an antisense system with two terpyridine*Cu(II) complexes. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V.20. N.4-7. P.833-835.
113. Boudvillain M., Guerine M., Dalbies R., Saison-Behmoatras Т., Leng M. Transplatin-modified oligo(2'-0-methyl ribonucleotide)s: a new tool for selective modulation of gene expression. // Biochemistry. 1997. V.36. N.10. P.2925-2931.
114. Hilger C.S., Willis M.C., Wolters M., Pieken W.A. Tc-99m-Labcling of modified RNA. // Nucleosides Nucleotides. 1999. V.18. N.6-7. P.1479-1481.
115. Hicke B.J., Stephens A.W., Gould Т., Chang Y.-F., Lynott C.K., Heil J., Borkowski S., Hilger C.-S., Cook G., Warren S., Schmidt P.G. Tumor targeting by an aptamer. // J. Nucl. Med.2006. V.47. N.4. P.668-678.
116. Liu N, Ding H., Vanderheyden J.-L., Zhu Z., Zhang Y. Radiolabeling small RNA witli tcchnetium-99m for visualizing cellular delivery and mouse bio distribution. // Nucl. Med. Biol.2007. V.34. N.4. P.399-404.
117. Kuhnast В., de Bruin В., Hinnen F., Tavitian В., Dolle F. Design and synthesis of a new 18F.fluoropyridine-based haloacetamide reagent for the labeling of oligonucleotides: 2-bromo
118. N-3-(2-[18F.fiuoropyridin-3-yloxy)propyl]acetamide. // Bioconj. Chem. 2004. V.15. N.3. P.617-627.
119. Fang X., Zhanga W.-W. Affinity separation and enrichment methods in proteomic analysis. // J. Proteomics. 2008. V.71. N.3. P.284-303.
120. Blencowe B.J., Sproat B.S., Ryder U., Barabino S., Lamond A.I. Antisense probing the human U4\U6 snRNP with biotinylated 2'-0-Me RNA oligonucleotides. // Cell. 1989. V.59. N.3. P.531-539.
121. Barabino S., Sproat B.S., Ryder U., Blencowe B.J., Lamond A.I. Mapping U2 snRNP: pre-mRNA interactions using biotinylated oligonucleotides made of 2'-0-Me RNA. // EMBO J. 1989. V.8. N.13. P.4171-4178.
122. Lamm G.M., Blencowe B.J., Sproat B.S., Iribarren A.M., Ryder U., Lamond A.I. Antisense probes containing 2-aminoadenosine allow efficient depletion of U5 snRNP from HeLa splicing extracts. //Nucleic Acids Res. 1991. V.19. N.12. P.3193-3196.
123. Ryder U., Sproat B.S., Lamond A.I. Sequence-specific affinity selection of mammalian splicing complex. //Nucleic Acids Res. 1990. V.l8. N.24. P.7373-7379.
124. Wassarman D.A., Steitz J.A. Structural analysis of the 7SK ribonucleoprotein (RNP), the most abundant human small RNP of unknown function. // Mol. Cell. Biol. 1991. V.ll. N. 15. P.3432-3440.
125. Palfi Z., Gunzl A., Cross M., Binderif A. Affinity purification of Trypanosoma brucei small nuclear ribonucleoproteins reveals common and specific protein components. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88.N.20. P.9097-9191.
126. Lingner J., CechT.R. Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. N.20. P.10712-10717.
127. Schnapp G., Rodi H.-P., Rettig W.J., Schnapp A., Damm K. One-step affinity purification protocol for human telomerase. //Nucleic Acids Res. 1998. V.26. N.13. P.3311-3313.
128. Kole R., Vacelc M., Williams T. Modification of alternative splicing by antisense therapeutics. // Oligonucleotides. 2004. V.14. N.l. P.65-74.
129. Moore M.J., Silver P.A. Global analysis of mRNA splicing. // RNA. 2008. V.14. N.2. P. 197-203.
130. Kang H., Alam R., Dixit V., Fisher M., Juliano R.L. Cellular delivery and biological activity of antisense oligonucleotides conjugated to a targeted protein carrier. // Bioconj. Chem. 2008. V.19. N.l 1.P.2182-2188.
131. Alam M.R., Dixit V., Kang H., Li Z.-B., Chen X., Trejo J.A. Fisher M., Juliano R.L. Intracellular delivery of an anionic antisense oligonucleotide via receptor-mediated endocytosis. // Nucleic Acids Res. 2008. V.36. N.8. P.2764-2776.
132. Guterstam P. Lindgren M., Johansson FT., Tedebark U., Wengel J., Andaloussi S.E., Langel U. Splice-switching eficiency and specificity for oligonucleotides with locked nucleic acid monomers. //Biochem J. 2008. V.412. N.2. P.307-313.
133. Sazani P., Kang S.-H., Maier M.A., Wei C., Dillman J., Summerton J., Manoharan M., Kole R. Nuclear antisense effects of neutral, anionic and cationic oligonucleotide analogs. // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. N.19. P.3965-3974.
134. Wee K.B., Pramono Z. A. D., Wang J.L., MacDorman K.F., Lai P.S., Yee W.C. Dynamics of co-transcriptional pre-mRNA folding influences the induction of dystrophin exon skipping by antisense oligonucleotides. //PloS ONE. 2008. V.3. N.3. el844.
135. Yoo H., Juliano R.L. Enhanced delivery of antisense oligonucleotides with fluorophore-conjugated РАМАМ dendrimers. //Nucleic Acids Res. 2000. V.28. N.21. P.4225-4231.
136. Molenaar C., Marras S.A., Slats J.C.M., Truffert J.-C., Lemaitre M., Raap A.K., Dirks R.W., Tanke H.J. Linear 2'-0-Methyl RNA probes for the visualization of RNA in living cells. // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. N.17. e89.
137. Kehlenbach R.H. In vitro analysis of nuclear mRNA export using molecular beacons for target detection. // Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N.l 1. e64.
138. Yeh H.-Y., Yates M.V., Mulchandani A., Chen W. Visualizing the dynamics of viral replication in living cells via Tat peptide delivery of nuclease-resistant molecular beacons. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105. N.45. P.17522-17525.
139. Silverman A.P., Kool E.T. Detecting RNA and DNA with templated chemical reactions. // Chem. Rev. 2006. V.106. N.9. P.3775-3789.
140. Abe Y., Kool E.T. Flow cytometric detection of specific RNAs in native human cells with quenched autoligating FRET probes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103. N.2. P.263-268.
141. Silverman A.P., Kool E.T. Quenched autoligation probes allow discrimination of live bacterial species by single nucleotide differences in rRNA. // Nucleic Acids Res. 2005. V.33. N.15. P.497S-4986.
142. Silverman A.P., Abe H., Kool E.T. Quenched autoligation probes. // Meth. Mol. Biol. V.429. Molecular beacons: signalling nucleic acids probes. / Eds. Marx A., Steitz O. Totowa NJ: Humana Press Inc., 2008. P. 161-170.
143. Fclden B. RNA structure: experimental analysis. // Curr. Opin. Microbiol. 2007. V.10. N.3. P.286-291.
144. Sakamoto Т., Kobori A., Shigezawa M., Amitani Y., Higuchi M., Murakami A. Homogeneous fluoescent assays for RNA diagnosis by pyrene conjugated 2'-0-methyloligonucleotides. //Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2007. V.26. N.10-12. P.1659-1664.
145. Duan S., Mathews D.H., Turner D.H. Interpreting oligonucleotide microarray data to determine RNA secondary structure: application to the З'-end of Bombyx mod R2 RNA. // Biochemistry. 2006. V.45. N.32. P.9819-9832.
146. Opalinska J.B., Gewirtz A.M. Therapeutic potential of antisense nucleic acid molecules. // Science's STKE. 2003. V.206. pe47.
147. Dias N. Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Mol. Cancer Ther. 2002. V.l. N.5. P.347-355.
148. Esau C.C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. // Methods. 2008. V.44. N.l. P.55-60.
149. Chu C.-Y., Ran a T.M. Translation repression in human cells by mircoRNA-induced gene silencing requires RCK/p54. // PloS Biology. 2006.V.4. N.7. e210.
150. Krutzleldt J., Rajewsky N., Braich R., Rajeev K.G., Tuschl Т., Manoharan M., Stoffel M. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. //Nature. 2005. V.438. N.7068. P.658-689.
151. Krutzeldt J., ICuwajima S., Braich R., Rajeev K.G., Pena J., Tuschl Т., Manoharan M., Stoffel M. Specificity, duplex degradation and subcellular localization of antagomirs. // Nucleic Acids Res. 2007. V.35. N.9. P.2885-2892.
152. Horn S., Schwenzer B. Oligonucleotede facilitators enhance the catalytic activity of RNA-cleaving DNA enzymes. // Antisense Nucl. Acids Drug Dev. 1999. V.9. N.5. P.465-472.
153. Hovig E., Maelandsmo G., Mcllingsaeter Т., Fodstad O., Mielewczyk S.S., Wolfe J., Goodchild J. Optimization of hammerhead ribozymes for the cleavage of S100A4 (CAPL) mRNA. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 V.l 1. N.2. P.67-75.
154. Фокина A.A., Зенков A.H., Зенкова M.A., Веньямииова А.Г., Франсуа Ж.-К., Власов В.В. двухкомпонентные ДНКзимы 10-23.// Информационный вестник ВОГиС. 2006. Т.10. N.2. С.ЗЗ 1-341.
155. Fokina A., Novopashina D., Meschaninova М., Francois J.-C., Venyaminova A. 3'-Modified oligo(2'-0-methylribonucleotides) improve cleavage of long structured RNA by DNAzyme 10-23. //Collection Symp. Ser. 2008. V.10. P. 420-422.
156. Brown K.M., Chu C.-Y., Rana T.M. Target accessibility dictates the potency of human RISC. //Nature Struct. Mol. Biol. 2005. V.12. N.5. P.469-470.
157. Hutvagner G., McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint E., Tuschl T. Zamore P.D. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-1 small temporal RNA. // Science. 2001. V.293. N.5531. P.834-838.
158. Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington J.C., Jacobsen S.E. RNA silencing genes control de novo DNA methylation. // Science. 2004 V.303. N.5662. P.1336.
159. Dykxhoorn D.M., Novina C.D., Sharp P.A. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V.4. N.6. P.457-467.
160. Kim K., Lee Y.S., Carthew R.W. Conversion of pre-RISC to holo-RISC by Ago2 during assembly of RNAi complexes. // RNA. 2007. V.13.N.1. P.22-29.
161. Navani N.K., Li Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2006. V.10. N.3. P. 272-281.
162. Zinnen S.P., Domenico K., Wilson M., Dickinson B.A., Beaudry A., Mokler V., Daniher A.T., Burgin A., Biegelman L. Selection, design, and characterization of a new potentially therapeutic ribozyme. // RNA. 2002. V.8. N.2. P.214-228.
163. Schubert S., Furste J.P., Werk D., Grunert H.-P., Zieehhardt H., Erdmann V.A., Kurreck J. Gaining target access for deoxyribozymes. // J. Mol. Biol. 2004. V.339. N.2. P.355-363.
164. Schubert S., Gul D.C., Grunert H.-P., Zieehhardt H., Erdmann V.A., Kurreck J. RNA cleaving '10-23' DNAzymes with enhanced stability and activity. // Nucleic Acids Res. 2003. V.31.N.20. P.5982-5992.
165. Trepanier J.B., Tanner J.E., Alfieri C. Reduction in intracellular HCV RNA and virus protein expression in human hepatoma cells following treatment with 2'-0-methyl-modified anti-core deoxyribozyme. //Virology. 2008. V.377. N.2. P.339-344.
166. Behlke M.A. Chemical modification of siRNA for in vivo use. // Oligonucleotides. 2008. V. 18. N.4. P.305-320.
167. Choung S., Kim Y.J., Kim S., ParkH.-O., Choi Y.-C. Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy. // Biochem. Biophys. Res. Comun. 2006. V.342.N.3. P.919-927.
168. Peek A.S., Behlke M.A. Design of active small interfering RNAs. // Curr. Opin. Mol.Ther. 2007. V.9. N.2. P. 110-118.
169. Hoerter J.A.H., Walter N.G. Chemical modification resolves the asymmetry of siRNA strand degradation in human blood serum. // RNA. 2007. V.13. N.l 1. P. 1887-1893.
170. Hermann Т., Patel D.J. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. // Science. 2000. V.287. N. 5454. P.820-825.
171. Boiziau C., Toulme J.-J. A method to select chemically modified aptamers directly. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2001. V.ll. N.5. P.379-385.
172. Burmeister P.E., Lewis S.D., Silva R.F., Preiss J.R., Horwitz L.R., Pendergrast P.S., McCauley T.G., Kurtz J.C., Epstein D.M., Wilson C., Keefe A.D. Direct iv vitro selection of a 2'-0-methyl aptamer to VEGF. // Chem. Biol. 2005. V.12. N.l. P.25-33.
173. Levy-Nissenbaum E., Radovic-Morcno A.F., Wang A.Z., Langcr R., Farokhzad O.C. Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery. // Trends Biotech. 2008. V.26. N.8. P.442-449.
174. Navani N.V., Li Y. Nucleic aid aptamers and enzymes as sensors. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2006. Y.10. P.272-281.
175. Mairal Т., Ozalp V.C., Sanchez P.L., Mir M., Katakis I., O'Sullivan C.K. Aptamers: molecular tools for analytical application. // Anal. Bioanal.Chem. 2008. V.390. P.989-1007.
176. Wincott F.E. Strategies for oligoribonucleotide synthesis according to the phosphoramidite method. // Protocols in nucleic acid chemistry ./Eds. S.L. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, R.A. Jones: John Wiley & Sons, Inc. 2003. Unit 3.5.
177. Ефимов B.A., Бурякова A.A., Ревердатто C.B., Чахмахчева О.Г. Применение N-метилимидазолидного фосфотриэфирного метода для получения олигонуклеотидов, полезных при изучении рекомбинантных ДНК. // Биоорган, химия. 1983. Т.9. N.10. С.1376-1381.
178. Fuijimoto M., Kuninaka A., Yoshino H. Substrate specificity of nuclease PL // Agr. Biol. Chem. 1974. V.38. N.9. P.1555-1561.
179. Volbeda A., Dietrich C., Romier S. Nuclease PL // Handbook of Metalloproteins. Zinc Hydrolases: Acting on Ester Bonds. / Eds. A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulas, K. Wieghardt, M. Cygler, W. Bode. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2006.
180. Silberklang M., Gillum A.M., RajBhandary U.L. The use of nuclease PI in sequence analysis of end group labeled RNA. //Nucleic Acids Res. 1977. V.4. N.12. P.4091-4108.
181. Wang Y., Taylor J.-S., Gross M.L. Nuclease PI digestion combined with tandem mass spectrometry for the structure determination of DNA photoproducts. // Chem. Res. Toxicol. 1999. V.12.N.11. P. 1077-1082.
182. Kihara K., Nomiyama H., Yukuhiro M., Mukai J.I. Enzymatic synthesis of a "P.ATP of high specific activity. // Anal. Biochem. 1976. V.75. N.2. P.672-673.
183. Van Houten V., Denkers F., van Dijk M., Brekel M., Brakenhoff R. Labeling efficiency of oligonucleotides by T4 polynucleotide kinase depends on 5-nucleotide. // Anal. Biochem. 1998. V.265. N.2. P.386-389.
184. Duan S., Mathews D.H., Turner D.H. Interpreting oligonucleotide microarray data to determine RNA secondary structure: application to the З'-end of Bombyx mori R2 RNA. // Biochemistry. 2006. V.45. N.32. P.9819-9832.
185. Inoue H., Hayase Y., Asaka M., Imura A., Iwai S., Miura K., Ohtsuka E. Synthesis and properties of novel nucleic acid probes. //Nucleic Acids Symp. Ser. 1985. N.16. P.165-168.
186. Johnson W.C., Jr. Determination of the conformation of nucleic acids by elecronic CD. // Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules. / Ed. G.D. Fasman. New York; London: Plenum Press, 1996. P.433-468.
187. Sabahi A., Guidry J., Inamati G.B., Manoharan M., Wittung-Stafshede P. Hybridization of 2!-ribose modified mixed-sequence oligonucleotides: thermodynamic and kinetic studies. // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. N.10. P.2163-2270.
188. Keller D. Theories of circular dichroism for nucleic acids. // Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules. / Ed. Fasman G.D. New York: Plenum Press, 1996. P.413-468.
189. O'Toole A.S., Miller S., Haines N., Zink M.C., Serra M.J. Comprehensive thermodynamic analysis of 3' double-nucleotide overhangs neighboring Watson-Crick terminal base pairs. // Nucleic Acids Res. 2006. V.34. N.l 1. P.3338-3344.
190. Limmer S., Hofmann H.P., Ott G., Sprinzl M. The З'-terminal end (NCCA) of tRNA determines the structure and stability of the aminoacyl acceptor stem. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. N.13. P.6199-202.
191. Xu J., Craig S.L. Thermodynamics of DNA hybridization on gold nanoparticles. // J. Amer. Chem. Soc. 2005. V. 127. N.38. P. 13227-13231.
192. Isaksson J., Chattopadhyaya J. A uniform mechanism correlating dangling-end stabilization and stacking geometry. // Biochemistry. 2005. V.44. N.l4. P.5390-5401.
193. Freier S.M., Kierzek R., Jaeger J.A., Sugimoto N., Caruthers M.H., Neilson Т., Turner D.H. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83. N.24. P.9373-9377.
194. Freier S.M., Alkema D., Sinclair A., Neilson Т., Turner D. Contribution of dangling end stacking and terminal base-pair formation to the stabilisation of XGGCCp, XCCGGp, XGGCCYp, and XCCGGYp helixes. // Biochemistry. 1985. V.24. N.l 7. P.4533-4539.
195. Sugimoto N., Kierzek R., Turner D.H. Sequence dependence for the encrgetics of dangling ends and terminal base pairs in ribonucleic acid. // Biochemistry. 1987. V.26. N.14. P.4554-4558.
196. Ohmichi Т., Nakano S., Miyoshi D., Sugimoto N. Long RNA dangling end has large energetic contribution to duplex stability. // J. Amer. Chem. Soc. 2002. V.124. N.35. P.10367-10372.
197. Долинная Н.Г., Грязнова О.И. Комплексы олиго(поли)нуклеотидов со структурными аномалиями. //Успехи химии. 1989. Т.58. Вып. 8. С.1318-1353.
198. Senior М., Jones R.A., Breslauer К.J. Influence of dangling thymidine residues on the stability and structure two duplexes. // Biochemistry. 1988. V.27. N.10. P.3879-3885.
199. Bommarito S., Peyret N., Santa Lucia J. Thermodynamic parameters for DNA sequences with dangling ends. //Nucleic Acids Res. 2000. V.28. N.9. P. 1929-1934.
200. Bozza M., Sheardy R.D., Dilone E., Scypinski S., Galazka M. Characterization of the secondary structure and stability of an RNA aptamer that binds vascular endothelial growth factor. // Biochemistry. 2006. V.46. N.24. P.7639-7643.
201. Giovannangeli C., Diviacco S., Labrousse V., Gryaznov S., Charneau P., Helene C. Accessibility of nuclear DNA to triplex-forming oligonucleotides: the integrated HIV-l provirus as a target. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. N.l. P.79-84.
202. Inoue H., Hayase Y., Iwai S., Ohtsuka E. Sequence-specific cleavage of RNA using chimeric DNA splints and RNase H. //Nucleic Acids Symp. Ser. 1988. V.19. P.135-138.
203. Crooke S.T., Lemondis K.M., Neilson L., Griffey R., Lesnik E.A., Monia B.P. Kinetic characteristics of Escherichia coli RNase HI: cleavage of various antisense oligonucleotide-RNA duplexes. // Biochem. J. 1995. V.312. N.2. P.599-608.
204. Chan J.H.P., Lim S., Wong F.W.S. Antisense oligonucleotides: from design to therapeutic application. // Clin. Exp. Pharm. Physiol. 2006. V. 33. N.5-6. P.533-540.
205. Kostenko E.V., Beabealashvily R.S., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Secondaiy structure of the 5'-region of PGY1/MDR1 mRNA. // FEBS Letters. 2000. V.475. P.181-186.
206. Robert J., Jarry C. Multidrug resistance reversal agents. // J. Med. Chem. 2003. V.46. N. 23. P.4805-4817.
207. Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Топин А.Н., Мчедлидзе М.Т. Фотоактивируемые реагенты на основе арил(трифторметил)диазиринов: синтез и использование для изучения нуклеиново-белковых взаимодействий // Молскулярн. Биология. 2000. Т.34. N.6. С.966-983.
208. Lavrik O.I., Khodyreva S.N., Photoaffinity probes in molecular biology of DNA replication and DNA repair. // Chemical probes in biology. / Ed. Schneider M.P. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2003. P. 193-205.
209. Belousova Е.А., Crespan Е., Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Hubscher U., Magaand G., Lavrik O.I. Photoreactive DNA probes as a tool for studying the translesion synthesis system in Mammalian cell extracts. // Med. Chem. 2008. V.4. N.2. P. 155-162.
210. Venyaminova A.G., Repkova M.N., Ivanova Т.М., Dobrikov M.I., Bulygin K.N., Graifer D.M., Karpova G.G., Zarytova V.F. New photoreactive mRNA analogues for the affinity labeling of ribosomes. //Nucleosides Nucleotides. 1995. V.14. N.3-5. P.1069-1072.
211. Булыгин К.Н., Бау-Драи 3., Фавр А., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Окружение З'-конца тРНК в А- и Р-участках 80S рибосомы. // Биоорган, химия. 2008. Т.34. N.I.C. 96-106.
212. Хайрулина Ю.С., Молотков М.В., Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. С-Концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека. // Молекулярн. Биология. 2008. Т.42. N.2. С. 306-313.
213. Garegg P.J., Lidh I., Regberg Т., Stawinski J., Strombcrg R., Henrichson C. Nucleoside H-phosphonates. IV. Automated solid phase synthesis of oligoribonucleotides by the hydrogenphosphonate approach. // Tetrahedron Lett. 1986. V.27. N.34. P.4055-4058.
214. Коваль В.В., Максакова Г.А., Федорова О.С. Фотомодификация ДНК перфторарилазидопроизводными олигонуклеотида. // Биоорган, химия. 1997. Т.23. N.4. С.266-272.
215. Казанцев А.В., Максакова Г.А., Федорова О.С. Кинетика фотомодификации ДНК производными 1-3-(п-азидотетрафторбензоил)аминопропил.-5'-фосфамидов дезокси-рибонуклеотидов в составе модельных дуплексов. // Биоорган, химия. 1995. Т.21. N.10. С. 767-773.
216. Wilson J.N., Kool Е.Т. Fluorescent DNA base replacements: Reporters and sensors for biological systems. // Org. Biomol. Chem. 2006.V.4. N.23. P.4265-4274.
217. Birks J.B. Photophysics of aromatic molecules. London: John Wiley&Sons, 1970.
218. Winnik F.M. Photophysics of preassociated pyrenes in aqueous polymer solutions and in other organized media. // Chem. Rev. 1993. V.93. N.2. P.587-614.
219. Masuko M., Ohtani H., Ebata K., Shimadzu A. Optimization of excimer-forming two-probe nucleic acid hybridization method with pyrene as a fluorophore. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. N.23. P. 5409-5416.
220. Fujimoto K., Shimizu H., Inouye M. Unambiguous detection of target DNAs by excimer-monomer switching molecular beacons. // J. Org. Chem. 2004. V.69. N. 10. P. 3271-3275.
221. Christensen U.B., Pedersen E.B. Intercalating nucleic acids containing insertions of l-0-(l-pyrenylmethyl)glycerol: stabilisation of dsDNA and discrimination of DNA over RNA. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. N.22. P. 4918-4925.
222. Hwang G.T., Sco Y.J., Kim S.J., Kim B.H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrcnyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. //Tetrahedron Lett. 2004. V.45. N.18. P.3543-3546.
223. Yamane A. MagiProbe: a novel fluorescence quenching-based oligonucleotide probe carrying a fluorophore and an intcrcalator. // Nucleic Acids Res. 2002. V.30. N. 19. e97.
224. SNP analysis of 23S rRNA gene in clarithromycin-resistant Helicobacter pylori strains. // Mut. Res. 2006. V.599. N.l-2. P.144-151.
225. Shimada N., Mahara A., Sakamoto Т., Yamaoka Т., Murakami A. Transcriptome analysis using fluorescence-labeled oligonucleotide. // Nucleic Acids Symp. Ser. 2004. V.48. N.l. P.301-302.
226. Sakamoto Т., Kobori A., Murakami A. Solid-phase detection of RNA using bispyrene-modified RNA probe. // Nucl. Acids Symp. Ser. 2006. V.50. N.l. P.215-216.
227. Yamana K., Iwai Т., Ohtani Y., Sato S., Nakamura M., Nakano H. Bis-pyrene-labeled oligonucleotides: sequence specificity of excimer and monomer fluorescence changes upon hybridization with DNA. // Bioconj. Chem. 2002. V.13. N.6. P. 1266-1273.
228. Nagatoishi S., Nojima Т., Juskowiak В., Takenaka S. A pyrene-labeled G-quadruplex oligonucleotide as a fluorescent probe for potassium ion detection in biological applications. // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V.44. N.32. P.5067-5070.
229. Looser V., Langenegger S.M., Haner R., Hartig J.S. Pyrene modification leads to increased catalytic activity in minimal hammerhead ribozymes. // Chem. Commun. 2007. N.42. P.4357-4359.
230. Mann J.S., Shibata Y., Meehan T. Synthesis and properties of an oligodeoxynucleotide modified with a pyrene derivative at the 5'-phosphate. // Bioconj. Chem. 1992. V.3. N.6. P.554-558.
231. Yamana K., Nunota K., Nakano H., Sagen O. A new method for introduction of a pyrene group into a terminal position of an oligonucleotide. // Tetrahedron Lett. 1994. V.35. N.16. P.2555-2558.
232. Kierzek R., Li Y., Turner D.H., Bevilacqua P.C. 5'-Amino pyrene provides a sensitive, non-perturbing fluorescent probe of RNA secondary and tertiary structure formation. // J. Amer. Chem. Soc. 1993. V.115. N.12. P.4985-4992.
233. Hrdlicka P.J., Ravindra Babu В., Sorensen M.D., Harrit N., Wengel J. Multilabeled pyrene-functionalized 2-amino-LNA probes for nucleic acid detection in homogeneous fluorescence assays. //J. Amer. Chem. Soc. 2005. V.127. N.38. P.13293-13299.
234. Balakin K.V., Korshun V.A., Mikhalev I.I., Maleev G.V., Malakhov A.D., Prokhorenko I.A., Berlin Yu.A. Conjugates of oligonucleotides with polyaromatic fluorophores as promising DNA probes. // Biosensors Bioelectronics. 1998. V.13. N.7-8. P.771-778.
235. Nakamura M., Ohtoshi Y., Yamana K. Helical pyrene-array along the outside of duplex RNA. // Chem. Commun. 2005. N.41. P.5163-5165.
236. Дюбанкова H.H., Малахов А.Д., Стеценко Д.А., Коршун В.А. Детекция точечных му таций с помощью ДНК-зондов, меченных пиреном. // Изв. Акад. Наук. Серия химическая. 2004. N.2. С.443-449.
237. Okamoto A., Kanatani К., Saito 1. Pyrene-labeled base-discriminating fluorescent DNA probes for homogeneous SNP typing. // J. Amer. Chem. Soc. 2004. V.l26. N.l5. P.4820-4827.
238. Silverman S.K., Deras M.L., Woodson S.A., Scaringe S.A., Cecil T.R. Multiple folding pathways for the P4-P6 RNA domain. // Biochemistry. 2000. V.39. N.40. P. 12465-12475.
239. Blount K.F., Tor Y. Using pyrene-labeled HIV-1 TAR to measure RNA-small molecule binding. //Nucleic Acids Res. 2003. V.31. N.19. P.5490-5500.
240. Dioubankova N.N., Malakhov A.D., Stetsenko D.A., Gait M.J., Volynsky P.E., Efremov R.G., Korshun V.A. Pyrenemethyl ara-uridine-2'-carbamate: a strong interstrand excimer in the major groove of a DNA duplex. // ChemBioChem. 2003. V.4. N.9. P.841-847.
241. Рябиннн В.А., Буторин А.С., Элен К., Денисов А.Ю., Пышный Д.В., Синяков А.Н. Влияние структурных факторов на стабильность дуплексов, образуемых конъюгатами олигонуклеотидов с малобороздочными .лигандами. // Биоорган, химия. 2005. Т.31. N.2. С.159-166.
242. Solinas A., Brown L.J., McKeen С., Mellor J.M., Nicol J.T.G., Thelwell N., Brown Т. Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications. // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. N.20. e96.
243. Howell W.M., Jobs M., Brookes A.J. iFRET: an improved fluorescence system for DNA-melting analysis. // Genome Res. 2002. V.12. N.9. P.1401-1407.
244. Ranasinghe R.T., Brown T. Fluorescence based strategies for genetic analysis. // Chem. Commun. 2005. N.44. P.5487 -5502.
245. Gudnason H., Dufva M., Bang D.D., Wolff A. Comparison of multiple DNA dyes for real PCR: effects of dye concentration on DNA amplification and melting temperature. // Nucleic Acids Res. 2007. V.35. N.19. el27.
246. Dervan P.В., Burli R.W. Sequence-specific DNA recognition by polyamides. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V.3. N.6. P.688-693.
247. Szewczyk J.W., Baird E.E., Dervan P.B. Sequence-specific recognition of DNA by a major and minor groove binding ligand. // Angew. Chem. Int. Ed. 1996. V.35. N.13-14. P.1487-1489.
248. Синяков A.H., Рябинин В.А., Гримм Г.Н., Буторин А.С. Стабилизация тройных спиралей ДНК с помощью конъюгатов олигонуклеотидов и синтетических лигандов. // Молекулярн. Биология. 2001. Т.35. N.2. С.298-308.
249. Silver G.C., Sun J.S., Nguyen C.H., Boutorine A.S., Bisagni E., Helene C. Stable Triple-helical DNA complexes formed by benzopyridoindole- and benzopyridoquinoxaline-oligonucleotide conjugates. // J. Amer. Chem. Soc. 1997. V. 119. N.2. P.263-268.
250. Schmitt P., Sun J.S., Garestier Т., Helene C., Nguyen C.H., Grierson D.S., Bisagni E. 13H-benzo6-7.indolo[3,2-c]quinolines (B[6,7]IQ): optimization of their DNA triplex-specific stabilization properties. // Chem. Commun. 2000. N.9. P.763-764.
251. Королева O.H., Волков E.M., Друца B.Jl. Конструирование смешанных полимеров на основе ДНК с консенсусными элементами промоторов, разделенных ненуклеотидными участками. // Биоорган, химия. 1994. Т.20. N.4. С.420-432.
252. Bellon L. Oligoribonucleotides with 2'-0-(tert-butyldimethylsilyl) groups. // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry./Eds. S.L. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, R.A. Jones. New York: John Wiley & Sons, Inc. 2004. Unit 3.6.
253. Borer P.N. Optical properties of nucleic acids, absorption and circular dichroism spectra. // V. 1. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3rd Edn. / Ed. Fasman G.D. Cleveland, OH: CRC Press, 1975. P.589-595.
254. Биофизическая химия. Методы исследования структуры и функции биополимеров / Кантор Ч., Шиммел П.: Пер с англ. М.: Мир, 1984. Т.2. С.496.
255. Stahl D.A., Krupp G., Stackebrand E. RNA sequencing. // Nucleic Acids Sequencing: a Practical Approach. / Eds. Howe C.J., Ward E.S. Oxford; New York; Tokyo: IRL Press, 1989. P.137-182.
256. Harama Т., Saleh A., Huq I., Rana T.M., Miller P.S. Inhibition of HIV Tat-TAR interactions by an antisense oligo-2'-0-methylribonucleoside methylphosphonate. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. V.13. N.ll. P. 1845-1848.
257. Belikov S., Wieslander L. Express protocol for generating G+A sequencing ladders. // Nucleic Acids Res. 1995. V.23. N.2. P.310.
258. Barker R.F. Maxam and Gilbert sequencing using one meter gel system. // Nucleic Acids Sequencing: a Practical Approach. / Eds. Howe C.J., Ward E.S. Oxford; New York; Tokyo: IRL Press, 1989. P. 126-127.
