Искусственные гены: проблемы химического синтеза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

¿0/6

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ни. М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи УДК 547.963.32:577.213.7

ЕФИМОВ Владимир Алексеевич

ИСКУССТВЕННЫЕ ГЕНЫ: ПРОБЛЕМЫ ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степеии доктора химических наук в форме научного доклада

МОСКВА 1989

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина Академии наук СССР.

Официальные оппоненты:

академик, профессор Д. Г. Кнорре,

член-корреспондент АН СССР, профессор Р. П. Евстигнеева,

доктор химических на да, профессор 3. А. Шабарова.

Ведущая организация — Институт молекулярной биологии АН СССР.

Защига состоится « » 1989 г. в часов на заседа-

нии специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганитеской химии им. M. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бкоорга-нической химии им. M. М. Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан « » 198 года.

Ученый секретарь специализированного совет;| кандидат химических наук

: НЕСМЕЯНОВ

'Атцахьностъ проблемы. Последние достижения генетической инженерии и биотехнологии сопровождались и в значительной степени были обусловлены существенным прогрессом в области направленного синтеза фрагментов нуклеиновых кислот, которые сейчас могут рассматриваться как универсальные инструменты для решения целого ряда молекулярно-би-ологических задач. Наличие синтетических олиго- и полинуклеотидоз предоставляет исследователю' практически неограниченные возможности для создания новых искусственных генетических структур, для направленного мутагенеза природных генови проведения экспериментов по белковой инженерии. Оно способствует также дальнейшему изучению структуры и функции нуклеиновых кислот и белков.

Первые успешные попытки создать мекнуклеотидную связь химическими зпоеобами были сделаны около 30 лет назад. С тех пор методы синтеза нуклеиновых кислот продолжали развиваться. Первоначально етот процесс аел медленно, усилиями небольшого числа химиков-органиков и прежде зсёго группы X.Г.Кораны, а затем все быстрее с привлечением усилий, целого ряда лабораторий во многих странах мира. Возникновение в начале 70-х годов генетической инженерии придало этому процессу новый им-тульс.

Начальной'стадией в такого рода работах является химический синтез >лигонуклеотидов. В настоящее время существует четыре основных подхо-ia к синтезу олигонуклеотидов: фосфодиэфирный, фосфотриефирный, фос-¡¡йтный и Н-фЬсфонатный (рис .1). Фосфодиэфирный метод, разработанный в iO-70-тые годы, явился исторически первым, позволившим получать фраг-¡енты ДНК длиной до 10-15 звеньев. Олигодезоксирибонуклеотиды, синте-1ироватше етим методом, были использованы при получении ряда неболь-atx функционально активных фрагментов ДНК, в том числе генов тРНК, шераторных и промоторных участков, генов коротких пептидов. Несмотря ia бто, диефирный метод имел целый ряд недостатков, куда прежде всего >ледует обнести низкие выходы и утомительную процедуру очистки интер-(едиатов, и в начале 80-х годов он уступил место фосфотриефирному ме-■оду и его разновидности - фосфитному методу синтеза олигонуклеоти-;ов; •'

Основным отличием втих методов от диэфирного является наличие до-олнительной защитной группы на фосфатной (или фосфитной) функции уклеотидного компонента. Это позволяет значительно сократить число озмокных побочных реакций при создании межнуклеотиднои связи, а сле-овательно повысить выход целевого соединения. Кроме того, фосфотрие-иры нуклеозидов и олигонуклеотидов хорошо растворимы в органических астворитолях, что создает возможности для использования с яростной' дсорбционной хроматографии при очистке интермедиатов. В начале 80.-х одов С.А.Нарангом и К.Б.Ризом был предложен улучшенный вариант фос-этриефирного метода,а-М.Карузерсом - фосфитнйго метода. С их помощью и."и синтезированы олигонуклеотидц, из которых Лыл получен ряд биоло-ически активных фрах-ментов ДНК, в том числе гены соматостатина, А и

В-цепей инсулина, человеческого интерферона. Однако, несмотря на достигнутые успехи, оба ети метода не были лишены-существенных недостатков и требовали доработки. Кроме того, они были еще достаточно трудоемки и длителены, а следовательно не могли удовлетворить возрастающих потребностей молекулярной биологии и биотехнологии.

В связи с этим во многих лабораториях были предприняты исследования .по разработке более эффективных подходов к синтезу олигонуклеотидов фосфотривфирным и фосфитным методами, позволяющих быстро й с высокими выходами получать протяженные олигонуклеотиды. Необходимо было разработать подходы к твердофазному синтезу и его автоматизации, совершенствовать защитные группы для различных активных центров нуклео-тидов, методы деблокирования олигонуклеотидов. Одной из самых важных частей етой работы должна была явиться разработка новых подходов I: созданию межнуклеотидной связи.

С другой стороны химический синтез олигонуклеотидов является только первой стадией при получении двухцепочечных ДНК. Второй стадией работы является превращение олигомеров в искусственные гены с помощью ферментов нуклеинового обмена. Первая методология сборки олигонуклеотидов в дуплексы была предложена около 20 лет назад и долгое время оставалась практически неизменной. Подход, разработанный в то время в лаборатории X.Г.Кораны для получения двухцепочечных ДНК .требовал большого расхода синтетических олигонуклеотидов и предусматривал Максимальный объем химического синтеза. Кроме того, он был рассчитан в основном на получение относительно коротких дуплексов. Необходимо было разработать усовершенствованные методы синтеза ДНК, уменьшающие объем експериментальной работы, сокращающие расход исходного Материала и- обеспечивающие получение, биологически активных фрагментов ДНК значительной длины. Цель работы.До недавнего времени химико-ферментативный синтез ДНК представлял собой очень сложную и длительную работу вследствие -отсутствия адекватной методологии. Поиск быстрых и эффективных подходов велся в последнее десятилетие многими учеными. Первой целью настоящей работы была разработка и усовершенствование методов химического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов. ., Следующей принципиально важной задачей явилось развитие современных подходов к конструированию синтетических фрагментов ДНК с целью создания достаточно универсальной методологии получения дуплексов практически неограниченной длины. Кроме того, было необходимо показать эффективность разработан-; ных подходов на примере синтеза ряда биологически активных фрагментов ДНК, в том числе, генов прлипентидов и регуляторных участков ДНК. Научная новизна и практическая, ценность работы.Изучено влияние нук- ,... леофилыюго катализа . на создание межнуклеотидной связи з фосфотрив- ' фирном методе синтеза олигонуклеотидов. В процессе исследований разработаны новые ускоренные варианты фосфэтриэфкрного метода. Первый из

них - М-метилимидазолидный метод синтеза олигонуклеотидов в растворе и на полимерных носителях, основанный на использовании смеси арилсуль-фохлоридов и 1-метилимидазола в качестве конденсирующего реагента при создании межнуклеотидной связи. Применение 1-метилимидазола в качестве катализатора сделало возможным проведение межнуклеотидких конденсаций на только в пиридине, который до втого являлся традиционным растворителем, для олигонуклеотидаого синтеза, но и в целом ряде других органических растворителей, например в ацетонитриле и дихлорэтане. Разработанный метод исключал также использование производных тетразола и триазола в качестве фосфорилирующих реагентов при приготовлении соответствующим образом защищенных мономеров. Впервые бил разработан твердофазный вариант олйгонуклеотидного синтеза, предусматривающий проведение всех операций в одном растворителе. Эффективность метил-имидазолидного метода была доказана успешным синтезом большого числа олнгодезоксирибонуклеотидов в различных лабораториях. Во втором, еще более быстром варианте, впервые в качестве нуклеофильных катализаторов в синтезе олигонуклеотидов были предложены производные Л-окиси пиридина. В результате проведенных исследований была показана высокая эффективность быстрого фосфотриэфирного метода с использованием О-нуклеофильных катализаторов, и особенно его разновидности, основанной на применении каталитических фосфат-защитных.групп. Использование етих защитных групп, которые одновременно являются внутримолекулярными О-нуклеофильными катализаторами реакции образования £»сфотриефирной свлзи, способствовало значительному повышению скорости и эффективности; синтеза, снижению уровня протекания побочных реак-щй. С применением етой методологии, пригодной для работы с болыаин-' зтвом.современных автоматических синтезаторов, скорость твердофазного [юсфотриефирного метода превысила скорость, обеспечиваемую наиболее )аспространенным в настоящее время фосфитамидным методом.

Кроме того, проведено изучение реакции межнуклаотидной конденсации 1 синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатшш методом с помощью ЯМР-спект-юскопии. На основании полученных данных предложена удобная модифика-(ия втого метода синтеза олигонуклеотидов на полимерных носителях, 'снованная на применешлш в качестве , растворителя хинолина.

Практическая ценность разработанных методов была продемонстрировав а на примере успешного синтеза большого числа олигонуклеотидов, редставлягацих собой" фрагменты генов ряда пептидов и белков, а также яда регуляторных участков ДНК. Кроме того., они использовались для вдедения, идентификации и. определения первичной структуры ДНК из азличных источников, в том.числе фрагментов хлоропластной ДНК ячме-я, кодирумздх Селки фэтосиотеш II. <

разработаны усовершенствованные; методы синтеза протяженных фраг-знтов ДНК, - ушньйащие. объем экспериментальной работы и сокращающие илод исходного материала. В частности подход, щзедполагающие син-

тез только одной цепи целевого гена'и универсальный подход к сборке нолинуклеотидов, позволяющий получать искусственные ДНК практически любой длины, основанный на модульном принципе и использовании временных рестриктных сайтов для клонирования и сборки отдельных модулей.

Практическая значимость диссертационной работы заключается в разработке подходов к синтезу двухцепочечных ДНК.и их использовании для .. получения биологически активных генетических структур. Был осуществлен химико-ферментативный синтез генов проинсулина человека, функционально важного фрагмента бактериородопсина, IgG-связывающего фрагмента белка A Staph, aureus, а также проМоторной, области генйХ. бактериофага fd, промоторной области рь бактериофага Л , серии статистических промоторов. Впервые был получен искусственный ген растительного белка - зеина кукурузы. Синтезированные,фрагменты ДНК были использованы при создании штаммов -Продуцентов важных с научной и практической точки зрения пептидов и белков.

I Химический синтез олигодезокснрибонуклеотидов

Ключевой стадией в синтезе олигонуклеотида является создание межнуклеотидной связи. В реакцию межнуклеотидной конденсации 'вводятся два соответствующим образом защищенных компонента: нуклеозидный (или ОН-компонент) и нукЛеотидный (или Р-компонент).Первый имеет свободную гидроксильную группу при блокированных остальных функциональных цент-. pax, а второй - свободную фосфатную функцию (рис.1).

1.1 .Ы~ШетшитЮазолудний фосфотриэфихшй метод.

Первым этапом в наших исследованиях явилась разработка ускоренного варианта фосфотриефирного метода', основанного на использовании в качестве конденсирующих,реагентов для создания .фосфотривфирной межнуклеотидной связи арилсульфонилхлоридов в присутствии нуклоофильного катализатора - _1-метилимидазола. -1.1.а. Создание лежнуклеотидной'связи.

' Арилсульфонилхлорида -.стандартные .конденсирующие реагенты для фосфодиэфирного метода синтеза, оказались неэффективными в триэфирном варианте из-за медленной скорости образования фосфотриефирной связи И низких выходов целевого продукта. Это является-следствием недостаточной реакционной способности активированного производного, образу- , ющегося при взаимодействии фосфодиефиров (I) с арилсульфонилхлоридами к пиридине и представляющего собой тетразамевденныи пирофосфат (II) (Схема 1). .■-'•, '■■■;. • , • :

Нами было показано, что арилсульфонилхлорида, в частности мезити-ленеульфонилхлорид (MSG1) . и 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорид (TFSC1), становятся высокоэффективными конденсирующими реагентами для создания фосфотривфирной связи в присутствии нуклеофильного каталйза-юрз - I-метилимидаоФла (Helm).' Прибавление последнего в реакционную СЧ.-51., седержздую 3'-фосфодатафирный .нуклеотидиый' компонент (I), !> • - гпл|.оксил1.ьый компонент и1Tf'SC 1 и'пиридине , резко ускоряет проте-

он - комаонкнт

-...-осу

нно

о=р

I

он

осн,. в

Г1

•"ОСН2- в

0

о=р-он

1 ■

0СН3 в -О-

/ р -кон и о у > вт

о

II

Ш + НО-Р-ОЙ'

о

0

-II ЮН + О-Р-ОЕ'

¿1Г

ОН + Х-Р-ОИ' -

1

ОН"

о

II

ОН + "С^Р-ОИ' (

н

о

II

РО-Р-СЖ'

0 II

- ГО-Р-СЖ'

1

Ой"

Ш-Р-ОИ' — I

Ой"

• о II

- ИО-Р-СЖ'-

Фосфодиэфирный метод

Ю-Р-Ой* Фосфотриэфирный метод 0~

о о

II 1! Фосфитшй

■ ИО-Р-ОН' ГЮ-Р-ОЙ' триэфирный

•] 1_ метод

' Ой" О

о

!1

Ю-Р-ОИ' Н-Фосфонатный метод I ■ 1_

Н О

?.1. Метода химического синтеза олигонуклеотидов.

же меаснуклеотндной конденсации и она заканчивается за 15 мин, цри-1 выхода олигонуклеотидов при етом колеблются от 90 до ЭВ% в зави-юсти от их длины и состава. Тогда как в отсутствие етого слеофального катализатора за,20 ч выходы олигонуклеотидов о тем г» аденоирующим реагентом редко превышают'25-50$.(рис.2)¿. Ускоренное протекание реакции конденсации под действием кзХпг; объ-1яется промежуточным образованием обладающего высокой фосфорилируга-г способностью четилимидазолиевого катиона фосфоди^фира нуклеозида г). Образование подобного соединения под действием ТРЭО! и Ы,11-ди-•иламинопирчдина (ОМАР), обладающего аналог? шым ускоряющим дейо-[еЦ, било показано а помощью ЯМР-спектроскопкн В.Ф.Зарцтовой.

- б -

'Б отличив от таких нуклеофильных катализаторов, как тетразол (Те) « З-нитро-1,2,4-триазол (NT), Melm наряду о нуклеофильным катализом может обеспечивать общий основной катализ и служить акцептором выделяющихся^ процессе реакции арилсульфокислоты и HCl. Это создает возмож-

Схема 1

0 О

II АгБОд C1 II ^ R0-P-0"-RO-P-OSCL Ar

1 I 4 OR' OR'

(I)

Melm.

0 0

II II R"OH, Py

. R0-P-0-P-0R —-—

I I 20 ч R'O OR* (II)

0

II

R0-P-0R" I

OR* (III)

R"0H 15 мин

0

Melm II /ГГЫ-РН (II). ——— RO-P-N0J

OR'O ' X~

IV)

R R',R"= защищенные нуклеозиды;

X = CI ,-OSO,Ar и. -OP(0)OROR*

ность для проведения межнуклеотидных конденсации•в присутствии Ме1т не только в пиридине, но также в ряде нейтральных органических растворителей, таких как хлорированные углеводороды, диоксан, тетрагидрб-фуран, нитрометан и ацетонитрил, 'без.добавления других оснований. Как видно из рис. 2, наибольшая скорость образования фосфотриефирной связи обеспечивается в ацетонитриле и нитрометане. В этих полярных, ап-ротонных растворителях в присутствии ТРБС1 и Ме1т конденсации заканчивались за 5 мин, тогда как в других, менее полярных растворителях . она протекала медленнее, ; однако во всех случаях заканчивалась' за 15 мин. Скорости реакций в присутствии МЗС1 и Ме1ш были в 2-3 раза выше. В' аналогичных условиях конденсации под действием ТРЗС1 и тетраэола (или МЙП.1. и №Г) завершались только через 30-40 мин. .

Известно, что пиридин способен вызывать частичную фрагментацию олигонуклеотидов за счет разрыва межнуклеотидных связей с образованием соответствующих 5'-С-пиридиниевых производных нуклеозидов и . олигонуклеотидов. Этот процесс становится особенно заметным при получении достаточно длинных олигонуклеотидов на последних стадиях синтеза. Проведение реакции межнуклеотидной конденсации в таком растворителе, как ' ацетонитрил, в отсутствие циридина и в присутствии минимпльного избытка Ме1т, имеет то преимущество, что степень прохождения реакция разрыва ■межнуклеотидной связи за этот счет сведена к минимуму. Это приводит к реальному увеличению выходов олигомеров. . :

с.2. Сравнение скоростей мезкнуклеотидных конденсаций в синтезе ЦеО)2Тг],1|т1!тТ(Вг) в пиридине (-о-), ацетонитриле (-•-), нитрометане 3-), THF'(-В-), хлористом метилене (-£-), хлороформе (-А-) и диок-не (-х-). Реакции проводились с использованием 0,125 М [ (МеО)2Тг]1-IPh) и 0,1 М ТтТ(Вг) в присутствии 0,25 М арилсульфонилхлорида и ' 5 М нуклеофильного катализатора: Melm (сплошная линия),NT (пунктир) а тетразола (точечная линия).(т) - фосфэтриэфирная связь.

Следует отметить, что применение Helm обеспечивает минимальное прощание такой побочной реакции, как сульфонилированяе 5'-гидроксила «теозидного компонента. Так, при сравнении скорости сульфонилирова-1 5'-ОН группы нуклеозидов под действием. TPSTfe и TPSCl+Melm, было «a3anoi что в первом, случае реакция проходит в два раза быстрее. Прямое .сравнение описанных ранее в литературе процедур фосфотрив-5Ного олигонуклеотидного синтеза с метилимидазолидным методом на ¡меро параллельного синтеза нескольких 16-звенных олигонуклеотидов (нелогичных условиях показало, что олигонуклеотиды, синтезированные '.га-методом были значительно чище и содержали по данным высоковффек-«ой обращённо-фазовой хроматографии и гелйэлектрофореза меньшее шчаотво модифицированных по гетероциклическим основаниям соедина-i (рис.Э). В результате реальные выходы целевых соединений после лэния защитных групп в случае Ме1т-метода оказались в 5-10 раз ш-по сравнению (3 выходами олигонуклеотидов, полученных методом На-га-Риза.

1.6. Получение защищенных доноясров.

В тривфирном подходе' мономерныьгл единицами являются. N-блокирован-5'-диметокситритайдезокмшуклоозид-З'-хлорфенидфосфаты и дезокси-леоьид-З'-хлорфенил-^-цианатилфосфаты , исходными сс-гдинениями д, i учения которых служат 5' -диметокситритальныа производные нуклеози-. Ранее для синтеза защищенных нуклеотидов етого типа применяли

20 30 40

20 .

Время, мин.

Рис.3. Проверка гомогенности полностью деблокированных гексадека^ нуклеотидов й'(00АОТСаАа0аТТ0СС) (1 ) и с! (ТатааААСАОТССТСС) (2), синтезированных с использованием в качестве конденсирующих реагентов ТРБЗЬ (А) и ТРЗС1+Ме1ш (В) обращенно-фаз'овой хроматографией на.колонке 2огЬах Св градиенте концентрации метанола (5-35%) в 0,1 М ацетате аммония.

фосфорилирование '5'-даметокситритилнуклеозидов бифункциональным фос-форилирующим реагентом ~ ариЛфосфодитриазолидом, в результате действия которого образуются фосфотриазолиды нуклеозйдов,Последние под действием избытка /3-цианетанола превращались в' соответствующие триэ-фирьг, которые в етом подходе являлись универсальными исходными соединениями для синтеза фосфодиефиров или тривфиров нуклеотидов со свободным 5'~гидроксилом. Альтернативой является . синтез полностью блокированного нуклеотида из предварительно полученного диэфира действием на последний избытка ^-цианатанола в присутствии конденсирующего реагента. В наших Исследованиях использовался второй вариант, который обеспечивает более высокие выходы защищенных мономеров.

'Нами была разработана модификация синтеза мономерных фосфодиефиров, в которой для введения остатка фенилфосфата в молекулу нуклеозида . по 3' -гидроксилу использовалось хлорфенилфосфопиридиниевое производное (VI) (Бр = 10,8 м.д.), представляющее собой монофункциональный фосфорилирующий реагент.Как известно, вто активное фосфорилирующее соединение образуется при действии арилсульфохлоридов на фос^фомонов-. фиры (VII) или при действии пиридина на арилметилхлорфосфаты. ,Мы нашли, что то жэ активное производное (VI) образуется при прибавлении одного еквивелента воды к раствору арилдихлорфосфата (V) в пиридине. Последний способ получения (VI), являющийся наиболее простым, и был использован.нами при синтезе защищенных мономеров (схема 2). При прибавлении к соединению (VI) 5'-даметокситритилтимидина (0Л5 екв) в 3(Р ЯМР-спектре происходило исчезновение сигнала с Sp 10,8 м.д. я по-

А

А

В

'.'■■•. - э -

явление сигнала, ' характерного для трехзамещенного пирофосфата (VII)(мультиплет о центром при бр 17,6 м.д.). Последующее добавление ч реакционную смесь воды приводило к быстрому разложению (VII) с образованием хлорфенклфосфата (Бр 4.1 м.д.), небольшого количества сим-«тричного хлорфенилпирофосфата (бр 16,2 м.д.) и З'-хлорфеНилфосфата ;• -дкетокситритилтимидинв '(I)(бр 6,5 м.д.). Таким образом, Сило по-сазано, что для количественного протекания реакции 3'-фосфорилирова-шя нуклеозйдов фосфопиридиниевнм<бетаином (VI) необходимо не менее 2 1KB фосфорилируздего реагента на 1.вкв 5'-диметокситритилнуклеозида.

Схэсфорилирование в препаративном масштаб« проводилось 3-5-кратшм габытком фссфорилирующего реагента (VI), предварительно отделенного, it осадка хлоргидрата пиридина, в течение 30-40 мин. Фосфодиефир нук-¡еозида отделяли от избытка арилфосфата экстракцией хлороформом'. Пол-оотью блокирорашше нуклеозид-3'-фосфаты получались'из соответ-ству-щих хлорфенилфоефатов (I) действием избытка ^-цианетанола в рисутстаии Т.Г5С1 или его' смеск с 1-метилимидазолом (схема 2). Фос-отриефир без выделения де три тилиро в а ли действием арилсул'ьфокислоты, .подготовленный таким образам мономерный 5'-ОН компонент выделяли доорбционной хроматографией на силикагеле.

Использование фссфорилирующего реагента (VI) и метод его получения иеют ряд преимуществ. В том числе: 1 .монофункциональность, что покачает возможность образования таких побочных продуктов, как симмет-«чше З'-З'-дт^клэозидмонофосфаты; ' 2.исходные соединения для его элучения - арилдихлорфосфаты, легко доступны я могут храниться при змнатной температуре длительное время; 3.избыток фосфорилируицего sагента после разложения водой легко удаляется экстракцией; 4.выходы >Сфодиефиров не уступают выходам,полученным при использовании других >тодов,- а экспериментальная процедура проще.

, Схема 2

0

1»

.C1-P-0R

1

С1 (V)

о

II

R9-P-0R' . I OR'

Ру, 1экв HgO

ArS0,Cl R'OH

О II

R0-P-M(+ (VI)

ArS02Cl, Ру

0

II

RO-P-

1

ОН

(VII)

-ОН

R'0H(0,5 экв) медленно

О И

RO-P-OR' l_ О

(УР^

бистро'

0 о II II

R0-P-0-P-CR,

1 1_

R'Q О (VII)

На0

0

' : II + H0-P-0R

1

• О"

- 10 - ■•■ ■.■; ■ I. f .6. Сижаз рлигонуклеотиОов Ы-жеггшгшЮдзомЮиш летодоя в растворе.

Несмотря на значительные успехи в развитии твердофазного, синтеза . олигонуклеотидов, синтез в растворе не теряет своего значения, особеннс в цех случаях, когда для проведения дальнейших исследований требуются большие количества нуклеотидного материала. Кроме того, синтез в растворе- имеет то преимущество, что обеспечивает постоянную очистку ; промежуточных соединений. Последнее в конечном счете приводит к более чистому'целевому продукту, а-следовательно к упрощению/процедуры его выделения после удаления всех защитных групп.

N-Метилимидазолидаый метод значительно ускоряет процесс синтеза . олигонуклеотидов в растворе по сравнению с методом Наранга-Риза. Кроме того, он позволяет получать соединения свободные от побочных продуктов, связанных с.модификацией гетероциклических оснований.Это создало предпосылки для разработки методики синтеза в растворе 'длинных олигодезоксирибонуклеотидов на уровне 10-100 мкмоль. При етом наращи-вшше цепи проводилось от 3'- к 5'-концу последовательным прибавлением к концевому динуклеозидмонофосфату ди-, тетра-, гекса-, сктанукле-отидных или. более длинных блоков. При ' получении коротких ■ олигонуклеотидов в межнуклеотидные конденсации обычно вводится 1,21 »5-кратный избыток Р-компонента относительно ОН-компонента,' а также; 2-3-кратный-избыток арилсульфохлорида и 4-6-кратшш избыток 1-метил-имидазолд относительно Р-компонента. При получении ди- и тетрануклео-тидных блоков в качестве растворителей использовались ацетонитрил и нитрометан. Реакции конденсации проводились в.течение 5-10 мин. Синтез более длинных олигонуклеотидов проводился в пиридине, хлорированных углеводородах или в смеси с последними, поскольку- растворимость олигонуклеотидов в чистом ацетонитриле(или нитрометане) .надаёт с ■ увеличением длины цепи. Поскольку скорость прохождения межнуклеотвд-ной конденсации также уменьшается с увеличением молекулярного веса реагирующих Р- и ОН-компонентов, время образования фоофотриафирной свИзи при синтезе олигомеров длиннее 16-, 20-звенных увеличивалось до 20 -40 мин , а избыток Р-компонента увеличирэ.лся-до Э-5-кратного относительно ОН-компонента. Выходы олигонуклеотидов составляли при етом 75-9056 на стадии получения 4-1 б-моров и уменьшались до 40-50% при . получении 32-62-звенных фрагментов. : ■ •

Для удаления 5'-диметокситритильной защитной группы с интермедиатов.. ..перед проведением очередной стадии наращивания цепи'наряду с традиционной обработкой 2% арилсульфокислотой б хлороформе, содержащем до 30?

метанола при о"с, использовалась обработка.трифторуксуснойкис- . •лстой в той,же смеси растворителей при,комнатной температуре. Как по-.-катали эксперименти по сравнению скоростей: реакции детритилировагшя. и побочной реакции апурицизлнии при действии ряд^.д^тритилирукдах pea-.' • гочтоп п различных рпгтиоритедях; 'п поолядш.-м рлучпо .процосс .разрыва, •

гликозидной связй у производных пуринов, в частности дезоксиаденозина, протекает значительно медленнее, чем при действии арилсульфокислоты, а скорость детритилирования остается на том же уровне. В связи с етим обработка трифторуксусной кислотой использовалась при удалении диме-токситритильных групп с длинных олигомеров, когда протекание апурини-зации особенно нежелательно и трудно контролируется.

. Защищенные олигонуклеотида на ранних стадиях синтеза выделялись фильтрацией через короткие и широкие колонки с силикагелем, а начиная С 6-12-звенных - хроматографией высокого разрешения на колонках с Llohrosorb Si в градиенте концентрации метанола в хлороформе. Очистку полностью блокированных олигонуклеотидов с большей длиной.цепи проводили - обращенно-фазовой хроматографией.на колонках с Nuoleosil30 G18 в эодном ацетонитриле, поскольку адсорбционная хроматография на силика-Г'еле не обеспечивала надлежащей разрешающей способности с увеличением уины олигомеров. Такая хроматографическая очистка была использована хля выделения полностью блокированных олигонуклеотидов, начиная с .12-шенных и вплоть до 62-маров. Полученные при етом результаты показы-)рют, что характер разделения при етом напоминает анионообменную хроматографию деблокированных олигонуклеотидов, когда соединения влюиру-)тся с колонки в соответствии с длиной цепи, а последний пик, как гравило, принадлежит целевому продукту (рис.4а).

Удаление защитных групп с олигонуклеотидов после окончания их хи-ического синтеза проводилось в три этапа без промежуточных очисток, [ервоначально проводили стандартную обработку, которая включала действие оксимат-иона'для удаления хлорфенильной защитной гузупгш с фос->атшх остатков, затем - конц.аммиаком для удаления ацилышх защитим рупп и, наконец, - 80Я уксусной кислотой для удаления 5*-концевой . иметокситритильной труппы. Затем для удаления межнуклеотидныд защит-ых групп нами было предложено действие 20$ раствора пиперидина в одной пиридине. Как показали эксперименты, этот реагент практически . е затрагивает ацильный остаток, блокирующий 3'-концевой гидрокоял ' лигонуклеотида, и в очень слабой степени удаляет N-защитные ациль- .'■ ае грушш.. В то -яе время полное удаление индивидуальной', эянуклеотидной п(о)-хлорфенильной группы под действием пиперидина, . ак было установлено с помощью ТСХ на силикагёле и Р-ЯМР-спектро- : й>пш, протекает практически количественно за Э ч при 50° С или за -1, ч при комнатной температуре. Действие пиперидина на мегкнуклестидгша -защитные гругпы в данном случае аналогично действию ранее предлежал-* эга для отих целей оксимат-иона. Однако в отличие от последнего пи-Фидии легко удаляется из реакционной смеси простим упариванием, что тродает обработку реакции. ■ "

Деблокированные блигонуилеотиды здесь и далее выделялись ггрэвдра-ганыч электрофорезом в 10-20Я полиакриламидиом геле. Индивиду¿i'V )сть полученных соединений подтварждаларь высокоэффективной ооращён-

"-' . - 12 - . • нр-фазовой хроматографией, а их последовательностьметодом хттэс-

ких модификаций Максама-Гилберта (рис.4 а и б).. ■ ■>,-.'

1.1.г~Твердофазкый синтез олигонуклеотидов Н-летшшлидаэоливния > . фосфотриэфиршя летодол. ■■■■' ' .. /.,...'-'■

В настоящее время синтез на полимерных носителях является наиболее быстрым и наименее трудоемким способом получения олигодезокси^рибо-н'уклеоц;идов в тех случаях, когда последние требуются в относительно небольших количествах. А числу преимуществ твердофазного синтеза относятся также отсутствие'стадий очистки промежуточных соединений и '': возможность автоматизации. , "

Применение метилимидазолидного метода значительно упростило оболу-; живание процесса фосфотриефирного синтеза олигонуклеотидов , на полимерных носителях, поскольку он обеспзчивает возможность проведения 'всех реакций на полимере й одном-и том ие растворителе. Кроме того, й отличие от фосфитного метода, где.удлиндние цепи возможно.только мо^ номерами, етот метод предусматривает также блочный способ синтеза с использованием для наращивания цепи ди-, > три- и более длинных олиго-нуклеотидных блоков. Это расширяет границы метода и позволяет в сжатые сроки с1Штезировать.длинные олигонуклеотиды. Причем блоки могу* быть синтезированы тем же методом в растворе или на полимерных носителях.

Так, для синтеза олигонуклеотидов с ,3'-концевой фосфодиефирной группировкой нами был предложен носитель, модифицирорэнный сульфоета-нольными группировками. На схеме 3 показано получение такого полимера на основе коммерчески доступного Меррифильдонского полистирола. Первый нуклеотид присоединялся к такому полимеру с помощью ТРЭС! в' при-

, Сяеьгг 3

CIPHi-3 =0

(VIII) 6 iHjCKj

1.H*

Ui,

0 и«1»

: ©-*>

3

Скеш. 4

С

О . си,

2 Helm

•о-с«о

I.IHtOyrO-^l ^ НО

TPSCI, м»1ш г. н* .

г.и j.tpscum» tiPi.0- а tif»o-f=o

ПМЮ-

Н 9

<[ I. -^PSCI, М«1"

C|PtiO-f=0

зутствии Malta. После блокирования непрореагироэавоа:: ОН-груяп на поли-i¿pв (кэширования) и удаления диметокситрнтильнсл группы о 5'-гид-юксила привязанного к полимеру нуклеотида, цепь удлинялась стандартна! способом. Посла окончания оинтеза требующегося олигснуклоотидного 5Лока он удалялся с .носителя действием тривтиламина в дооксане в те-гение 2-3 ч при 20° С и очищался обращенно-фззовой хроматографией на . юлонке о Nuoleosil 018 (рис. 40). Выходы тетрамерных блоков получен-, мх ВТим опособои составили 60-75%. ,

-В качестве полимерных носителей'первоначально использовались набу-;3идив смолы на основе полистирола, ■ модифицированного аминометильными •руппировками, а затем аыянировашгые носители на основе силикагеля и макропористого стекла, Предложенная нами процедура их быстрой модифи-;ацяи, приведена, на схеме 4. Нарашрвакие цепи проводилось с 3'- на '-конец последовательным присоединением к 3'-концевому нуклеозиду, меющему свободный 5'-гидроксил, «оно-, да-, тринуклеотидшх и более дишшх блоков со свободной З'-фоофодиофирной группировкой. В синтезе спользоваяся 3-4-кратшй избыток Р-кошонента относительно емкости олкмера, 1,5-2 екв арилсульфохлорида и 3-4 вкв Uelm относительно -Компонента. Использовались различные органические растворители: хло-ированные углеводороды, нитромвтан, ацетокитркл и их смеси. ■ Нами било показано, что использование 5PS03tltelm обеспечивает 0-9556 выходы в'реакциях конденсации на полисткродъном набухающем но-ителе в течение 20 мин, a MSOlfMelra --в течение 15 мин. Скорость ре-кции на ненабухавдем носителе на основе макропористого стекла была «me;'- 15 и 10 мин,- соответственно. Рто било в 3-5 раз выше, чем в

аблица 1.Последовательность операций в одном цикле наращивания при вдтезе олигонуклеотидов на полимерных носителях метилимидазолидным зтодом на носителях на основе пористого стекла или силикагеля.

Стадия Реагент ялн растворитель Время, ниц

Удаление тритильной 2% ТРА в смеси ацетонитрил- i

группы хлористый метилен (7:3) 5 •

Пройывка ацетонитрил-хлориотый метилен г

Конденсация* реакционная смесь 0,3 мл 10-15

. Промывка ацетонитрил-хлористый метилен г .

, Квотирование ацетонитрил-уксусный ангидрид-. ;. 'г

Ые1га . ■J ■■

Промывка ацетонитрил-хлористый. метилен г

[уклсотн.цный ксштонент (4-5 екп) и tfelra (16-20 вкв) i ысушивают, тем прибавляется раствор IPSC1 (8-10 екв) в сухом ацетонитриле, 'деуяздем 30¡í 0. Н 01, и смесь быстро переносится в реакционный- сосуд.

- 1ч - '•

А

^ Ри Ру С '

11 «э

Г")

еэ • о о

О

. О

о

**

>

О

-о )

о«

Га»

!С

а а а 9 а

с д

а Ч Ч а

О

а

с

с а

»Г» «•» с а

' а

ГГ> . !а

- а !

а

...3 Ри Ру С

О»

'сг.д

~ 19пСа

~ ^ адс —» „о

;а

Ч

— с

«я»

'.С

««в* |С

— л- ,с

1а

г

19 ! а I с

к а

1-с

г.

^0.4. А -' Препаративное выделение защищенных алигонуклеотидов об-эпщэннофазоиой хроматографией на колонке с НизХеоэНЗО С-18 в града-ште концентращш ацо'юнитрила 40-80% и диоксана 25-.5Й: 47-мера 1(ОАЛТТСЛТСасССТСТСОАТОСаССТССТОССТСа?ССТОССТСТССТ) (1 ) И 62-мера

ИОЛАТтсАТАластААТтсААААтасссотстааАа'асасс^сстосстстаотосстстост) (2).

>тмачеш1 ссбрмпше фракции. Вверху приведены кривые, полученные при шализе гомогенности олигонуклеотйдов после деблокирования. Б»-' Ана-гиз методом' химических модификаций'последовательности 32-меров НГСОАААСТСТТОТОМСАТСиТТСЯ'ТОАТата) (1) и а(ССаАААСС0А0АТТА0алаА4АСА'Г-¡иаААС) (2) . а также 42-иера <КССТ0САСГ,ТаСА'1,0АСаАСОСОАСАСА{;сОАОСАС\О-!СА0С). В- Профили елюции, полученные при выделзнии на колонке с ■ |цо1еоа1П0 С-18 в градиенте ацетонитрила 45-75Я в 0,025 М триатилац-к-лийацетате 61 (1!е0>, ЗД чпСр (01РЪ ) апСр ( С1И;) апОр (С1РК )>^гАр (С1РП) (1) И Ц (ЫеО^ТНапСр (СШ1)ЪаАр(С1РЬ)Тр (01РЬ )апСр (01Р1г) (2). 1!ик целевого , юеданения .отмечен пунктиром.

9

классическом варианте фосфотрпрфпрного метода. '

Л Было найдено, что непрореагировавшио 5'-гидроксилыше группы Иа полимере могут быть быстро (за.Я-З мин) блокированы обработкой 1055 •' раствором уксусного ангидрида в присутствии Ме1ш в различных растБО- . ■ рителях. Удаление ди&етоксйтритильной группы после каадогс цикла яа-: ' ращивания. осуществлялось Обработкой раствором грифторуксусной кислоты ацетошгериле или хлористом метилене; (дихлорэтане), содержащем ацетонитрила в точс-нио 3-5. мин при колсгатной температуре. Как показа- 1 •ли контрольные зксперименты, в этих.условиях практически '.полностью ¿ отсутствовала аггуриниззция-, в частности ■ разрыв гликогидной связи М-бензоилдезоксиаденозина. ' - , ■'• . . ' '■

; В табл.1 приведен типичный цикл обработки полимера при синтезе олигонуклеотидов метшимидазолидшм методом в одном растворителе На . каждый цикл затрачизается ЗО .мин, что.в З раза меньше,' чем при использовании ранее о писанной Гайтом.и сотр.1 ме то дологии.'. '

Удаление защитных групп солигонуклеотидов, ,, синтезированных,на ; полимерных носителях ггроводилось' аналогично тому,.. .как вто делалось ■ при синтезе'1 в растворе. Индивидуальность выделенных препаративным электрофорезом соединений показывалась высохоеффективной обращенное фазовой хроматографией под высоким "давлением на колонках с йогЬах С-8." После введения 5'- Р-метки структура полученных соединений подтверждалась методом химических модификаций Максама-Гилберта. -

Таким образом, разработанный налш. подход к гриэфирному методу'синтеза с успехом применялся для получения олигонуклеотидов большой длины как'в растворе , так и на полимерном носителе . Сочетание предложенг ... ных способов .фосфорилирования и образования межнуклеотидной. связи с новым способом выделения и очистки промежуточных и конечных олигоме-ров позволило при синтезе в растворе не только . значительно повысить • скорость синтеза, но и существенно увеличить реальные: выходы целевых олигонуклеотидов по сравнению с выходами, обеспечиваемыми стандартным подходом. Главным - образом за счет меньшей загрязненности олигомеров побочными продуктами, связанными с модификациями, гетероциклических-оснований. Это расширило границы фосфотриэфирного метода в растворе и гшарвые сделало возможным в достаточно короткие сроки 'получать поли-куклеотидо длиной более■ во звеньев.

Применение данного подхода к твердофазному варианту синтеза Ьлиго- ' луклоотвдов .также позволило увеличить скорость реакции межнукле.отид-. гей конденсации. Кроме того, проведение всех операций'-цикла наращив.а-1-1!;4 >'у);леотидной ц/чш я одном и том же растворителе позволило резко

сократить общее время цикла, а также объем и ассортимент необходимых для етого высококачественных растворителей. Это унифицировало и значительно упростило обслуживание процесса синтеза, особенно в его автоматическом варианте. Эффективность синтеза олигонуклеотидов метили-мидазолидным методом на полимерных носителях была доказана успешным синтезом большого числа олигодезоксирибонуклеотидов в различных лабораториях как в СССР, так и за рубежом.

1.2 О-Нуклеофилъшй катализ в олигонуклеотиОнол синтезе.

1.2.а.Изучение реакции лехнуклеотидной конденсации в присутствии О-нуклеофилъных катализаторов.

• В дальнейшем нами был предпринят поиск новых, более мощных, чем 1-метилимидазол, нуклеофильных катализаторов, которые позволили бы одновременно увеличить скорость создания фосфотриэфирной связи и уменьшить количество побочных продуктов. Из литературы было известно, что К-окиси пиридинов являются в 50-100 раз более эффективными катализаторами в реакциях амидализа производных карбоновых и арилсульфо-новых кислот, чем соответствующие им пиридиновые основания. Это побудило нас исследовать потенциал подобных соединений в фосфотриефирном синтезе. Был испытан ряд производных гшридин-М-оксида, имеющих алектронодонорнае и' влектроноакцепторные заместители во 2-м и 4-м положениях пиридинового кольца (охема 5).

Схема 5

со. ' от <*ч)

. хсн3. vе2н5 . . • i-1.

х= -м , Г ], Г ]» I I;

чсн5 с?н5 Ч^

• I I '

. ± Ь £ а е

-оси,; -ос2н5; -осй2с6н5; -мо2; -о; _н '

1 д Л 1 11

Как показали проведенные эксперименты, скорость реакции конденсации в присутствии этих катализаторов зависит от природы и положения заместителя "X" в пиридиновом кольце. СЬединения с влектроноакцептор-ными ¡заместителями не дали ускорения реакции конденсации. Незамещенные И-огсиси пиридина'и хинолина только в незначительной степени ускоряли конденсацию. Наибольшая скорость реакции обеспечивалась пиридин-

Л-оксидами, имеющими електронодонорные Заместители в 4-ом положении (Х-Х11 а-К). Причем скорость реакции' мало зависела от 'структуры электронодонорного заместителя . хотя межнуклеоти,цные конденсации проходили все-таки быстрее в присутствие 4-диметйламино- и'4-апкокси-производных. Так, под действием арилсульфонилхлорюдв или МБИТ в присутствии этих катализаторов межнуклеотидная конденсация заканчивалась примерно за 1 мин, что в несколько раз быстрее, чем с Ме1т. В то же ? время в результате стерических затруднений скорости мёжнуклеотидных конденсаций в присутсвии производных И-окиси хинолина и 2,6-лутидитл были почти такими же, как в присутствии Ме1т. С другой стороны, каталитическое действие 2-замещенных производных .М-окиси пиридина Сыло: слабее, чей соответствующих 4-замещенных производных, вероятно вследствие как стерического, так и электронного (эффектов заместителей, -

Результаты, полученные при сравнительном анализе скорости1 реакции межнуклеотидной конденсации на примере получения тринуклеотидз,. приведет! на рис.5. В реакцию вбодился 1,3-кратный гзбиток Р-компонента относительно ОН-компонента, 2-кратный избыток Конденсирующего реаген-

" . Ссемя, мин.

Рис. 5. Скорости реакции в синтезе, тркнуклеотида <1[ (МеО)лТг]апСр(С1РЬ)Тр(С1РЮа,(В2) из мономерного Р-компонента<0,25 М) и димерного ОН-компонента.(0,05 М) с использованием ТРЗС1 (0,075 М) и нуклеофильного катализатора (0,15 М).. ' А. - нуклеофильные катализато-. ры: (Ха) (ХЬ~о) -Д-, (Хв),-о-, (Хк) -х-, (Х1а) -*- , (ХГк) -+-,

(ХИа) -д - Растворитель.-дихлорметан (сплошная линия) : или пиридин : (пунктирная линия). Б.- нуклеофильный катализатор-: (X) - (А); М.е 1т *-;:<' (•), (XI) - (Д) или пиридин (о)Сплошная линия - МБСХ, пунктир -М5ЫТ, точечная линия - ТРЗС1.

та л 4-йратвий избыток. нуклеофильного катализатора относительно Р-ксмпснента. Наибольшая скорость реакции наблюдалась при применении смеск м<-зити.ченсу.п.ьф<(ХЖ'рида с, 4-замещеинымИ; производными М-окиси пи-^нлпнч, ••щ?сколк:о'' м-даытя; ..см? си того же .катализатора и МЭЫТ,. еще

меньщр она была в "присутствии ТРБ01. Однако и в последнем случае реакция заканчивалась менее, чем за 2 мин. В тех же условиях межнуклео-тидная конденсация в присутствии Ме1ш заканчивалась за 8-15 мин в зависимости от использованного конденсирующего реагента.

' Следует отметить, что несмотря на свою относительно низкую основ-ность(рКа2-4)[для сравнения рКа Ме1т=7,3], Н-окиси способны обеспе- . чить, помимо нуклеофильного, основной катализ в реакциях образования. фосфотриефирной связи: и быть акцепторами выделяющихся в процессе реакции кислот. Поэтому также, как и в случае Ме1т, проведение реакций конденсации в их присутствии может быть осуществлено не только в пиридине, но ив целом ряде других органических растворителей.

Определение степени модификации гетероциклических оснований проводили на примере 3,,5,-ди-0-ацетил-И -изобутирилдезоксигуанозш!а, гетероцикл которого наиболее•подвержен действию влектрофильных реагентов. Исследовались реакции О -фосфорилирования и О^-сульфонилиро-рания, протекающие при действии Р-компонента, [ (Ме- )аТг]апСр(С1РК), в присутствии избытка конденсирующего реагента. В качестве последнего использовали смесь ТРБС1 с нуклеофильным катализатором: ЮМАР, МеХт или И-окисью 4-диметиламинопиридина (БМАРО). Было установлено, что в случае ЕМАР уж? через 10 мин происходило количественное фосфорилиро-вание гетероцикла гуанина;' О Ме1ш для завершения втой реакции требовалось 60 мин, а в присутствии ШАРО за то же время фосфорилировани© проходило только на 1056. В реакции 0в-сульфонилирования наблюдалась та же тенденция - наименьшая скорость етой побочной реакции была в присутствии Ш1АР0 (<1Я5 в час). Полученные результаты также показали, что степень прохождения побочных реакций модификации гетероциклов нук-леозидсш сильно зависит от основности среды, а следовательно от основных свойств нуклеофильного катализатора. Это подтверждалось експе- ' риментамц., в которых в реакционную среду наряду с нуклеофильными катализаторами и конденсирующим реагентом прибавлялся триэтиламин. При втом скорость побочных реакции возрастала в 2-3 раза. При проведении реакции 'в пиридине количество побочных продуктов также увеличивалось.

1.2.б.Твер0офазшй синтез олигонуклеотшЭов в присутствии ■ О-щмеофилъных катализаторов.

Применение производных И-окиси пиридина в полимерном фосфотри-ефирном синтезе олигонуклеотидов позволило сократить время, требующееся не проведение одного цикла наращивания гэпи до 10 мин. При втом собственно реакции межнуклеотидной конденсация заканчивались за 2-5 кия и проходили о практически количественным выходом. Растущая поли-; вукяеотидная цепь, удлинялао!» о* 3*- к 5'-концу пооледовательг-о<|,прибавлением предварительно приготовленных Р-компонентс к закрепленному на омоле нуклеозиду, имеющему свободный 5'-гидроксил. Синтез ооушсст- -

Таблица 2. Последовательность операций в одном цикле наращивания ' при синтезе олигонуклеотидов на полимерных носителях на основе пористого стекла или силикагеля фосфотриэфирным методом с использованием 0-нуклеофильных катализаторов.

Стадия Реагент или растворитель Время, мин

1. Удаление тритильной дихлоруксусная кислота в ди- 1-1,5 группы . хлорэтане или трифоруксусная

кислота-в смеси дихлорэтан- •

ацетонитрил (7:.Э) ' ' 4

.2. Промывка дихлорэтан 2

3. Конденсация* ' реакционная смесь, 0,3 мл 2-5

4. Промывка дихлорэтан 2

♦Нуклеотидный'компонент (30 мкмоль) высушивали упариванием о безвод-* ным растворителем. прибавляли раствор арил'сульфонилхлорида (60-75 мкмоль) и нуклеофильный катализатор (120-150 мкмоль) в том же растворителе и реакционную смесь прибавляли к 100 мг полимера с иммобилизованным нуклеозидом (20-50 мкмоль/г). Время реакции зависит от силы конденсирующего реагента. <

влялся на полимерах ненабухагацего типа на основе стекла и силикагеля,' а также, на дисках из бумаги Ватман ЗШ. На каждой стадии использовался 5-Ю-кратный избыток Р-компонента относительно присоединенного к смоле ОН-компоненга. Реакции конденсации осуществлялись в присутствии 2-кратного избытка арилсульфохлорида и 4-кратного избытка нуклеофиль-ного катализатора относительно Р-компонента. Условия проведения реакций. и типичный цикл обработки полимера приведены в табл.2. : Удаление защитных групп с олигонуклеотидов , их очистка проводились как описано выше.' . ' . 1.2.в.Иехстизл образования фосфотриэфирной-связи в при- ' г сутствии 0-нуклеофильных катализаторов.

Изучение механизма образования фосфотриэфирной связи в присутствии 0-нуклеофильных катализаторов показало,, что' ускорение в данном случае, достигается за счет промежуточного - образования высоко, реакциошгоспо-собного фосформирующего соединения. Выяснение механизма реакции, в частности структуры активного форфорилирующего производного нукле.оти-да, проводилось с помощью Р-ЯМР" спектроскопии. Прибавление ТРБС1 (2 экв) и А-диметиламинопиридин-К-оксида (4 экв) к раствору п(о)-хлорфе-штлового эфира защищенного нуклеозида, (1 экв/ бр 5>7 мд) в дихлорме-гпне приводило к немедленному появлению соединения.с бр 7,5 мд, которое в присутствии ЛТ(Ас) (1 экв) быстро превращалось в.соответствующий

Схема 6

Л1-5С1

ЙО-Р-ОН • ОТ

6я> (XIV)

АТ"

С1"

(хш)

ЯО-Р-ОН*

Я-СДС1 ЯрС* вадищенный нуклеоаид или РЬ

У • СГ, Аг5020"иди1Ш0<тРСГ

(ииуклеозидмонофосфат (6,7; 7.2 мд). Можно было предположить, что вы-юкореакционноспособный интермедиат представляет собой И-фосфорилок-¡щшридиниевую соль (Х1У) (схема 6).Образование соответствующего сое-(ииекия (XIII). при действии арилсульфохлоридов на пиридин -11-оксиды 1ыло показано ранее проф.Литвиненко и сотр. . •

"Гц

. МО

V ■ 01

1

1 I

сн,

3 -тог |

л

но.6. А.- Р-ЯМР спектр реакционной смеои, содержащей 0,1 М да- ' энялхлорфосфат и 0,1 М "Ы-окиси 4-диметиламинопиридина в хлорис- • эм метилене: при 30 и -40 С. Б.- Сигналы<¡1- и ^-протонов пиритового кольца а иетилыш*. групп в Л-окиси 4-диметиламинопиридина (а). РВОь-а-НО,Н(/-М(СН&)8С1 (Ь) и (РЬО)аРООт5Ну-М(С^)гС1(о).

. Структура активного интермедиата (XIV) подтверждалась на модельных' Соединениях :дифенилхлорфосфате и его производных.Обработка (РЬ.0)а 1*0,01 (б'р 5,5 мд) соединением (Ха) в метиленхлориде приводила к немедленному превращению дифенилхлорфогфата в соединение, представленное в ЯМР спектре синглетным сигналом при 12 мд. Аналогичный сигнал появлялся при действии ТРЭИ и (Ха) на дифенилфосфат. Прибавление 2-циаЙ-етанола (2 екв) к реакционной смеси в хлористом метилене приводило К исчезновению сигнала при 12 мд и появлению нового сигнала при 12,5 Мл-Последний был идентичен сигналу аутентичной пробы 2-цианетилдифенил-фосфата. Для доказательства существования соединения' (XIV) бьШ) использованы следующие данные. в'н-ЯМР спектре промежуточного соединения (XIV) сигналы<(- ир-протонов пиридинового кольца, , также как И протонов метильных групп были смещены'в слабое поле по сравнений Ь '(X), как и следовало бы ожидать вследствие появления' положительного заряда на атоме азота (рис.6). Аналогичные сдвиги наблюдались в спектре соединения (XIII). В 3,.Р-ЯМР спектре реакционной смеси, со дер кащей 1 екв дифенилхлорфосфата и 1 ек'в 4-диметиламинопиридин-^Ы-ок-оида, который был записан в хлористом метилене при -40°С, наблюдался дублет при 12 мд с константой спин-спинового взаимодействия около 4 Гц. Эти данные находятся в согласии с предложенной структурой.

Г.'2.&. Использование алшиышх защитных групп для фосфатных функций. '

Синтез фрагментов ДИК фосфотриэфирным методом чаще всего осуществляется с использованием аряльних защитных групп для фосфатов. Однако удаление етих защитных групп с конечных соединений обычно сопровождается нежелательными разрывами межнуклеотидных связей. Эти побочные реакции могут быть в значительной мере устранены при использовании фосфат-защитных групп, которые удаляются способами, .-отличными от прямой нуклеофилыгой атаки на атом фосфора. Ранее были предприняты попытки применения алкильных межнуклеотидных фосфатных защитных групп, уда-.лямцихся по механизму /5-элиминирования. Однако при этом наблюдалась пониженная реакционная способность фосфодиефиров нуклеозидов в реакциях конденсации под действием большинства реагентов. С. другой стороны с высокой скоростью протекала побочная реакция сульфоНилирова-ния 5'-ОН групп нуклеозидов. Нами был исследован потенциал некоторых конденсирующих реагентов в присутствий 0-нуклеофилышх катализаторов и ррякциях образования (¡'о сфо три эфирной связи с использованием алкиль-ных фпсфчт-пащитных групп, в частности 2-цианэтильной, 2-фенилсульфо-ни.ютильной и п-нитрофснилвтильной. Было показано, что скорость меж-нуклсстидной конденсации между эквимолекулярными количествами ОН- и Г-компонентов в присутствии 2-кратного избытка ТРЗС1 (или .1ШС1, МЗ№Г) н 4-крптного избытка нуклеофилъногб катализатора зависит от структуры моктронсдонорпого заместителя в пиридиновом кольце катализатора и «чгакггг» рпсп.юрнг"ля. Наибольшая скорость реакции обеспечивалась 4 ч.-.кок -и П'роия»:о.!Лшми пирилин -К-оксида. В присутствии этих соедине-

дай реакции завершались за 30,сек в хлористом метилене и 5а 1-1,5 мин р пиридине (рис.7).

: ' Сравнение скоростей 5'-ОН-сульфонилирования при действии ТРЗС1 и М5№Г*в присутствии И-оксидов и Ме1ш показало, что в стандартных для реакции конденсации условиях количество сульфонилированного побочного Продукта было в 2-5 раз ниже с Ы-оксидами, чем с Ме1ш (2-5ЯЕ и соответственно). __ _________________

В о

О . О0г

(МеО). (ХМ)

?

о=р-оя

I

0"

0=р-0й в ОВг

2 «

Время, ш

В=Т , апС , ЬМили ¡Ьб Н=-СН2СН2СН;

-СН2СН2С6Н/^02Шц -СН2СН2^С6Н5

0

Рис. 7. Скорость конденсации в синтезе, с1[ (МеО)£> Тг]^р(СЫЕ1;)Т(Ао) Цз мономеров (0,05 М) с использованием ТРБС1 (0,1 Ы) и 0-нуклео-фил'ьных катализаторов: (Хс)-о-, (Х£) или Ме1ш (-Д-)(0,2 Ы) в дихлормётане (сплошная' линия) или пиридине (пунктирная линия).

Тем не менее, проблема протекания побочной реакции 5'-сульфонили-рования нуклеозидного компонента была решена не до конца. Особое значение она приобретает В синтезе олигонуклеотидов на полимерных носителях, где избыток конденсирующего 'реагента относительно ОН-компонента значительно больше, чем при синтезе в растворе, что приводит к снижению выходов целевых олигомеров. Принципиальное решение а той проблемы состояло в избирательном ускорении при помощи катализатора только одной из двух параллельно Протекающих реакций - реакциг фоофорНяирова-ния. Один из вариантов такого решения состой-! но введении каталити-че¿крй группировки в. состав фосфат-защитной гру ни, чго должно обеспечивать более аффективный внутримолекулярный катализ итой реакции.

1.2.6. Внутримолекулярный О-нуклеофилъный катализ.

Матуччи и сотр. . было предложено использовать остаток 1-ме-. тил-2-(2-оксифенил)имидазола в качестве каталитической фосфатной защитной группы.Такая'защитная группа значительно ускоряет реакцию меж-нуклеотидной конденсации в присутствии ряда конденсруицих реагентов -производных арилсульфохлоридов. Увеличение скорости:, образования фос-фотриефирной связи происходит при этом скорее всего за счет образования активного циклического интермедиата. Аналогичный эффект наблюдался нами при использовании некоторых "других И- и О-нуклеофильных каталитических фосфатзащитных групп, таких как 1-оксидо-4-алкок-си-2-пиколильная, 4-алкокси-2-пиколгьльная' и 1-оксидо-2-пиколильная. Применение этих защитных групп, которые в то же время являются внутримолекулярными катализаторами,' позволило еще более ускорить фосфот-рирфпрный олигонуклеотидный синтез и понизить выход побочных реакций, связанных с сульфонилированием как 5'-ОН группы нуклеозидного компонента, так и гетероциклических оснований'нуклеотидов. " •■.■',

Приготовление мономеров, несущих каталитические фосфатзациткые группы, проводилось из соответствующих полностью блокированных фоофо-тривфиров нуклеозидов селективным удалением некаталитической арильной или алкильной (2-цивнэтильной) фэсфат-защитной группы.Синтез доходных тривфиров проводили различными способами (схема 7). Арилфосфотриефиры нуклеозидов количественно превращали в целевые фосфодиефиры (XV) действием ЬЮН. В то же время цианэтйльную защитную группу удаляли о фосфотриофира действием тривтиламина. Полученные при этом мономерные, нуклеотидные■компоненты выделяли хроматографией на сйликагеле.

На рис.8 показаны кинетические кривые, получения динуклеозидмоно-фосфата с использованием различных катализаторов и каталитических защитных групп. Наибольшая скорость образования фосфотриефирной связи Схема 8

обеспечивалась 1-оксидо-4-алкокси-2-Пиколильными производными. Конденсации с применением атих внутримолекулярных катализаторов и ТРЗС1 заканчивались меньше, чем за 0,5 мин. Использование М301 и НЗЫТ давало такие же результаты за 15-20 сек, В то же время на полимерных носителях те. же производные нуклеотидов в сочетании с ИЭСХ и МБИТ обеспечивали практически количественные выходы в реакциях межнуклео-тидных конденсаций в течение 30-45 сек,а в сочетании с ТРБС1 - в течение 1 мин. Скорость реакции практически не зависела от . структуры 4-алкокси группы. ■

Увеличение скорости межнуклеотидной конденсации с использованием втих каталитических фосфат-защитных групп может быть отнесено за счет образования активного циклического интермедиата (XVI), представляющего собой циклическую Н-фосфорилоксипириданиевую соль (охема 8). Исследование стабильности О-нуклеофильных защитных групп в различных условиях показало, что вти группировки устойчивы.к действию- кислых реагентов, которые используются для удаления 5'-тритильных защитных групп, и триетиламинй. Они также полностью устойчивы в ходе межнукле-отид1ШХ конденсаций, и в то же врем!) легко удаляются действием таких нуклеофшюв как, тио^енолят триьтиламмония ш пиперидин.

Следует отметить, что применение втих защитных групп дает минимум побочных-продуктов, связанных с 5'-0-сульфонилированием ОН-компонента при действии конденсирующего реагента, что является, по-видимому, .следствием дифференцированного катализа реакций фосфорилирования и сульф'жшшроиашш. При внутримолекулярном О-нуклеофильном катализе межнуклеотидной конденсации количество 5'-сульфонилированного побоч-ног-о продукта в 10 раз ниже, чем при межмолекулярном О-нуклеофильном катализе, а содержание его в реакционной'смеси составляет <0,2$.

Тьердо^а-шпй синтез олигонуклеотидов фосфотриефирным методом с применением каталитических фосфат-защитных групп был нами использован для ьМ«ктиы1чго синтеза большого числа олигонуклеотидов длиной от

■Гнолица Ч. Ре-.кциошшй цикл при синтезе олигонуклеотидов на не-наоухамцих носители* на основе пористого стекла с использованием внутримолекулярного 0-нуклеофилыюго катализа.

Стадии Реактив или растворитель Время,мин

1. Щюмиика Дихлорьтан . 0,5

2. Удаление тригиль- дихлоруксусная кислота в

ной грушш дихлорэтане 1 ,5

3. Проыиька Дихлорэтан • 0,5

4, Проыыька Ацетонлтрил-пиридин (8:2) . 0,5

5. Конденсаций* Реакционная смесь 1-1,5

6. Промывка Ацетонитрил-пиридин (8:2) 0,5

7. Квотирование Пиридин-Ые1ш-уксусный ангидрид

(8:1:1) 1,0

а. Промывка Ацетонитрил-пиридин 0,5

«НУклеотидный компонент (0,1 Ы, 100 мкл) прибавляется к раствору конденсирующего реагента (TPSC1, MSС1 или MSKTX0.3 Ы, 100 мкл) и полученная смесь немедленно переносится в реакционный сосуд, содержащий 30 мг носителя (оконо 30 мкмоль нуклеозига на г).

8 до 63 звеньев. Большая часть бтих олигонуклеотидов била получена с использованием ненабухающих полимерных носителей на основе пористых стеклянных шариков. На каждой стадии в реакцию вводили 10-кратный избыток Р-компонента относительно ОН-компонента, фиксированного на смо-' ле. Было показано, что Р-компоненты, несущие О-нуклеофильные каталитические защитные группы полностью стабильны в пиридиновых растворах в течение нескольких дней при комнатной температуре. В качестве растворителей для проведения межнуклеотидных конденсаций, наряду с пиридином , использовались 1095 растворы пиридина, ' 2,6-лутидина и ' 2,4,6-коллидина в ацетонитриле. Применение ацетонитрила позволила понизить вязкость реакционной смеси3 приблизительно вдвое ускорить протекание конденсации и довести время реакции в присутствие ТРЗС1 на полимерном носителе до 1 мин с выходами 98-99Ж на каждой стадии. Время, необходимое для проведения одного цикла наращивания цепи на поли-.мере, было сокращено до 6 мин (табл.3), что_быстрее, чем в наиболее распространенном в настоящее, время фосфитамидном методе синтеза, оли-гонуклеотидов. ' •' '

Применение 2,6-лутидина и 2,4,6-коллидина, вместо пиридина, приводит к значительному увеличению устойчивости .1-оксидо-4-алкокси-2-пи-колильной защитной группы в составе активированного■ Р-компонента к нуклеофильной атаке атомом азота пиридина. Эта'побочная реакция практически не наблюдается в "ручном" варианте синтеза Олигонуклеотидов, где стадия предактивации Р-компонента конденсирующим реагентом отсутствует. Однако она становится заметной при работе на некоторых типах автоматических синтезаторов, конструктивные особенности которых не позволяют избежать предварительного смешения Р-компонента с конденсирующим реагентом..

Для адаптации разработанной нами методологии к различным моделям автоматических'синтезаторов нами была исследовчна возможность использования в качестве фосфат-защитных групп производных Ы-окиси 2,6-лутидина. Было показано, что 1-оксидо-4-алкокси-6-метил-2-пиколильные защитные группы также очень активны как внутримолекулярные катализаторы в реакциях образования межнуклеотидной связи. Скорость конденсации в этом случае лишь в 1,5 раза ниже, чем с производными 11-окиси 2-• пиколинав то время, как устойчивость этих защитных групп в условиях предактивации с конденсирующим реагентом значительно выше. Так, при' использовании этих групп даже 2-3 ми^предактивация не приводит к падениям выходов межнуклеотидных конденсаций. Это делает фосфат-защитные группы на основе Н-окиси 2,6-лутидина более предпочтительными 'для автоматического варианта синтеза.

Удаление защитных групп с конечных олигонуклеотидов и с полимера проводилось последовательной обработкой пиперидином (или триэтиламмо-нийтиофенолятом) для удаления фосфат-защитных групп, затем конц. аммиаком - для удаления ацильных защитных, групп и снятия с носителя, а

ОМТ!<

»• ••

»о 5.

! -Тис.8.:- А.Скорость .образования мегауклеотидаой .связи, в синтезе динуклеотида. Реакции провопим ъ пиридине (1 ш) с ис-■ пользованием 0.05.,|у|иол..Т<Ас) и.0,05 ммол I ШеО)£Тг]Тр(^) в присутствии 0,1 ммол ТГБС1. В случае О-хлорфетешьных производных, прибавляли 0,2 ммол (Ха). Б.Анализ 31-мера -с1(СТАТС-САТСаТТССТФССТААСТТС.ТАаТТТД обращенно-фазовой ЕЖХ ъ градиенте концентрации ацетонитрила в 0,05 М ацетате аммон ия на колонке -2огЬах С-8: 1.- пссле удаления ацильных защитных ••ттятп? .2. полностью' 'деблоккрованнггс .ояггонуклестиДа.;

затем - 80Я5 уксусной кислотой - для деблокирования 5'-0Н групп (рис.8).

Полученные нами результаты продемонстрировали высокую еффективиость современного фосфотриефирного метода синтеза с использованием О-нух-леофильных катализаторов, особенно в качестве каталитических фосфат-защитных групп. Применение таких защитных групп способствует значительному повышению скорости и еффективности синтеза, стскению уровня побочных, реакций.что особенно важно при синтезе на полимерных носите- ' лях. С применением этой методологии скорость твердофазного фосфотриэ-фирного синтеза превысила скорость, обеспечиваемую фосфитамидным мет тодом. Кроме того, следует отметить, что фосфодиефиры, являющиеся мономерными единицами . в фосфотриефирном синтезе значительно стабильнее фосфоа'мидитов. Фосфотриэфирный метод не требует использования такого дорогостоящего соединения, как тетразол, и-не предъявляет таких жёстких требований к сухости реагентов, как фосфитамидный метод. Он может быть адаптирован к большинству.типов современных ситезаторов.

I.3.', Модифицированный- Н-фосфонаший летод синтеза олигонуклеатдов на полимерных носителях.

В последние года Матуччи и Ставинским был разработан метод синтеза олигонуклеотидов, получивший название Н-фосфонатного. Межнуклео-тидныё конденсации в "отом методе, как и в фосфотриефирном, проводятся в присутствие конденсирующего реагента. Основными чертами этого метода являются: простота получения мономеров, в качестве которых используются Н-фосфонаты нуклеозидов,. их стабильность, высокая скорость и эффективность синтеза. В качестве конденсирующих реагентов здесь применяются пивалоилхлорид (Р1уС1), адамантоилхлорид, МБ№Г. В отличие от фосфитамидного метода, скисление фосфитных функций синтезируемого олигонуклеотида здесь проводят однократно в конце синтеза. Кроме того, в нем отсутствует необходимость блокирования мекнуклеотидных гид-рофосфорильных групп вследствие наличия достаточно стабильной связи..Все это делает Н-фосфонатный метод весьма перспективным.

Однако данному методу присущи некоторые .недостатки. Так, часто, вместо гомогенного целевого продукта, в конце синтеза наблюдается образование смеси олигомеров различной длины. Одной из причин этого является недоокисление на конечной стадии синтеза некоторых межнуклео- • тидных гидрофосфорильных групп или образующихся из них в результате -' нежелательной'побочной реакции ацилирования - кетофосфонатных груш, что.в дальнейшем. - приводит к расщеплению гидролитически неустойчивых динуклеозидфосфонатных связей во время аммонолиза. Другой, причиной-является предактивация нуклеотидного компоента реакции,т.е. его взаимодействие с конденсирующим реагентом до поступления в реакционную сферу носителя," ,к которому прикреплен нуклеозидный компонент (схема 9). Последнее отмечалось рядом авторов.. Дяг устранения предактивации в автоматическом варианте синтеза,, где она протекает в наибольшей степени, необходимо не допустить предварительного смешения.этих ком-

- .¡о -

Cxf ua 9

II PivCl R-P-0~ -—PI

H

(XVIII)

О

II

RO-P-OPiV -fc» RO-P.

I ■ OPiv

Н

(XIX) (XX)

1 Et ОН I 2EtOH

1 II f /OEt

RO-P-OEt RO-P

1 NOEt

И

(XXI) (XXII)

R в dl (MeO)i Тг)Т-Piv» Ma3C-C0-

(40 ' 123 '' 10 • Ь

Рио.9. ЛР-ЯМР спектры реакционных смесей при ооалании меинукле- , отидной связи Н-фосзфона'пшм методом, а - Исходный Д[ (Ме0)аТг1ТрН в смеси.ацетапчтрнд - пиридин (хшюлин)(4:1); Q.-стсь df (tfeObTrJ'fpH (1 вкв) и Piv01(3 екв) я оцетонитрило,содержащем Р.ОЯ пиридина чер«з 3 мин пооло смешения; в.- Та *е реакционная пмезь, что я ь(в) после прибавления втаиола (2 екв)} г.- dC(lfeO)aTr]TpH в смеаи ацетонитрил-хиисмпш через Э мин после прибавления ?ivCl(5 ekbh л'.- Та же реакционная сиесь, что и в (г) чере;- 3 мин поело'прмвацлеиия 2 esn втаиола.

— Л I — .

понентов реакционной смеси в коммуникациях. Однако ето позволяют да- -леко не все конструкции современных синтезаторов. С целью решения этой проблемы на химическом уровне нами было предпринято изучение механизма предактивации при помощи Р-ЯМР спектроскопии.

В результате проведенных експериментов было показано, что

при взаимодействии Н-фосфоната (ХУИ1)[бр 2,10 мд] с Р1уС1 в пиридине сначала образуется смешанный ангидрид (XIX) [дяастереомеры с бр 2,62 и 2,72 мд], который в случае отсутствия нуклеозидного компонента (что. имеет место при предактивации) вступает в дальнейшее взаимодействие с избытком Р1уС1 и' за 5-7 мин превращается г; биеацилфосфит (XX) [бр 125,7 мд]. При взаимодействии со спиртом (XIX) и (XX) образуют соответственно диалкилфосфит (XXI) [бр 8,56 мд] и триалки.пфосфит(ХХП) (мультиплет при.139,9 мд]. Изучение, реакционной' способности бисацил-' фосфита (XX) показало, что он является менее активным фосфорилирупцим агентом, чем смешенный ангиДрид(XIX). Более того, даже после непродолжительной 'предйктгаации Р-комлонента реакция межнуклеотидной. конденсации уже не Доходит до конца в течение Ь-з мин, как это наблюда- , ется в стандартных условиях, а с увеличением времени предактивации выход продукта конденсации постепенно падает. Полученные данные можно объяснить пространственной экранированностью атома фосфора в бисацил-фосфитй, или отсутствием нуклеофильного катализа в реакциях с биса-цилфосфитом в отличие от реакции со смешанным ангидридом.

Возможными способами снижения уровня- образования бисацилфосфита являются: снижение избытка конденсирующего реагента и использование конденсирующих реагентов с объемистыми заместителями. Однако оба они оказались недостаточно эффективными на: практике. Другим вариантом решений етой проблемы является замена пиридина менее основным соединением,поскольку превращение•(XIX) б (XX) ускоряется в'более основных условиях.

По аналогии с'фосфодиефкрным и фосфотриефирным методами в Н-фосфо-натном можно предположить наличие нуклеофильного катализа в реакциях мекнукЛеотидной конденсации.- . : Кондесацию можно условно разделить на./; два Этапа: образований смешанного ангидрида и его взаимодействие с ОН ; -компонентом. Следует отметить, что в отсутствие основания реакция с Н-фосфонатом-проходит относительно медленно и не до конца. В то же ■ время в присутствии триетиламина (рКа=10,7 ) скорость реакции значи-' тельно ниже,' чем в пиридине (рКа=5,2). В случае Н,и-диметиланилина (рКа^5,1 ), не являющегося нуклеофильдам катализатором, скорость кон- , ценсации в 2,5 раза ниже,, чем в пиридине. Ускорение реакции в целом может быть, связано с нуклеофильным катализом на любом этане реакции. : Поскольку, как было- нами показано, скорость ацилирования нуклеозида Р1уС1 в присутствии пиридина и диметиланилина одинаковы, то можно тредположить,■что ■ и скорость взаимодействия РгуС! с Н-фосфонатом с. збразованиен смешанного ангидрида мало зависит от нуклеофильности растворителя. В ткком случае ускорение конденсации- в пиридине ко

сравнению с даыетшшшшшом; свидетельствует в пользу существования нуклеофильного катализа на стадии фосфорилирования ОН-компонента смешанным ангидридом. Поэтому для снижения уровня образования бисацил-фосфита целесообразно, использовать менее основной, чем пиридин, нук-леофилышй катализатор. Нами били опробована различные нуклеофилыше катализаторы, лучшие результаты показал хинолин (рКа=4,9).

В смеси ацетонитрила к хинолина (20%) реакции мекнуклеотидаой конденсации проходят столь же быстро,как и в пиридине (30 сек). При атом по данный !'.Р--ЯЫР спектроскоша при- взаимодействии Н-фосфоната с PivCl образуется только смешанный ангидрид. Даже через 5 мин наблюда-лиоь только следа бисацилфосфита, а следовательно практически отсутствовало снижение выходов в реакции конденсации за счет предактивации. На твердой фазе реакция проходила за 1,5-2 мин с высоким выходом (9399%). Следует отметить, что в хинолине PivCl менее активен как ацили-руюций агент, чем в пиридине, и скорость модификации гетероциклических оснований в атом растворителе почти вдвое ниже.

Синтез олигонуклеотидов Н-фосфонатним методом с использованием хинолина проводился нами как в ручном, так и в автоматическом варианте. Последовательность операций представлена в табл.4. Был получен ряд олигонуклеотидов длиной до ЗЭ-звешшх.

Таким образом в результате изучения процесса предактивации Р-ком-понеита при обр.-.зовании мекнуклеотидной связи в Н-фосфонатном методе синтеза было показано его отрицательное влияние на ход реакции кон-

Таблица 4< Последовательность операций одного цикла наращивания олигонуклеотидной цепи при синтезе Н-фосфонатным методом.

Операция Реактив или растворитель Время,мин

1. Промывка Дихлорэтан 0,5

2. Детритилирование 3$ дихлоруксусная кислота. в

дихлоретане • '1,5

3. Промывка Ацетонитрил : 0*5

4. Промывка Ацетонитрил-хинолин (4:1) 0,5

5. Конденсация» Реакционная смесь 2

6. Промывка Ацетонитрил-хшюлин (4:1) 0,5

7. Промывка Ацетонитрил 0,5

*Hj «еозид-фосфонат (0,05 М, 100 мкл) и PivCl (0,25-0,30 Ы, 100 . мкл) в смеси ацетонитрил-хинолин (4:1) подаются в реакционную сферу порциями по 6 сек со скоростью 0,5 мл/мин.

ДИК -поллиераза\^

«г*

^^^ -иуклеазэ

/ '

Т4-ДНК-липаза

иРЦК

ароиотор

-г.

Т-Т-Т-А-С-Т-С-С-А-С-А-Д-А-Т-С^и-О-А-С-А-О-А-Т-Л-А-^.

А-А-А-Т-С-А-О-О-Т-С-Т-Т-Т-А-С-С-С-Т-С-Т-С-Т-А-Т-Т-.Л* V \--. .-—(й)-

-ъо

т-т-с-т-с-с-т-т

-Т-Т-С-Т-О-А-А-О-Т-Т-Т

-Л-О-Л-С—О—Л—Л—О—С-С—С—О—Л-Л—Л—С-А-С-Т-Т—С-Л-Л-А

-—у. (С) V/-Ш) (

1' «-Н 3* (-1

Рис. 10. Два1 подхода к синтезу даухцепочочниг полицуклеотвдоз ■использованием, одноцепочечной ДНК фага в качестве 'матрицы.

деноации и ее выход. Нами были получены денные,■ подтверждающие возможность протекания нуклаофилыюго катализа в денной реакции. На основании полученных результатов предложена удобная модификация фоофо-натного метода синтеза олигонуклеотидов на полимерных носителях, основанная на применении хинолина в качестве растворителя, благодаря чему удалось в значительной степени исключить отрицательное влияние предвктиьации и ряда других факторов на синтез. '

• II. Получение двухцепочечны! фрагментов ДНК

Современные методы химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот позволяют получать протяженные двухцепочечные фрагменты ДНК. ГЬфыал этапом в такого рода работах является химический синтез олиго-дезоксирибонуклеотидов, который был рассмотрен выше. Синтетические олигоморц с помощь» ферментов нуклеинового обмена превращаются далее в искусственные геич. Первая методология сборки олигонуклеотидов в ду»иекси Сила предложена более 15 лот назад Кораиой и сотр. и долгое время оставалась практически неизменной.

Разработанный Кориной подход основан иа свойстве олиго- и поли-иуклеотидсл образовывать упорядоченные дяухспиральные комплексы с комплементарными одноцопочечными ДНК. Он состоит многократной последовательной сшивке с помощью фермента ДНК-лигазы химически полученных о лигоморое с комплементарными, взаимноперекрывйющимися последовательностями оснований п небольшие дуплексы с 1 ы;стулающими, одноцепо-чочныыи последоиитольност«ма на концах, а затем итих промежуточных дуплексов - в целевой нолинуклеотид, который клонируется в векторной моликулв (схома 10). Этот подход бил использован.для получения генов , Схема 10

Го.'й »111141 ИГ о* игону и л сит мл" м н ДУПОИКСЫ

"" '"«"4 "'НГомиэиксирмьонгкмотнпок

фисформаиропанк* Ъ'-ОИ |'р/о»

Роаарщик чостичпы« к^^наниг олтщп.п-, лунхгкгом оолииуилеотидон

^ Т4 л"* лчгляш |

"Ч^ПИК ат-аал/'

■ X ^

'.'ин-птч-ичггмм* ♦ |чгн«*т ДНИ

• * I Дну ПиЛИМРАМ

* 4

I 1*»СТриКЦИЯ

* I „ ■

» .(и-нтор , "ДНК

? .Каинмроилйие

■ , $ ■■

СШНТГТНЧГ.ГИМ*

фрагмент ДЧ*

Т4-ЛНК ли1м >.

Ыыжтор, дик лщ ^.Хшикромйин«

Смнтгтмчески* ф^мгмгнт Д11*

X

>:ло!пшоп«к и 'мролиноБой сунрессорной тГНК, соматостгтша, интерферона и др. Призером его использовал:.-) может.такжг слуккть осуществленный нами синтез гена пептида-анальгетика Хеи-енкефалина.

Однако при синтезе длишшх генов увеличивается число последовательных лигаэных сшивок олигонуклеотидов и дунлзксон и' становится все труднее счищать продукты реакции и лдолять и* в достаточном коли-... честве для дальнейшей работы. Кроме тоге, пгот падход требует больного расхода исходных синтетических оллгонуклеотпдот' и предусматривает максимальный объем работы по химическому синтезу. Все это послужило толчком для 'разработки усовершенствованных методов синтеза ' ДНК, уменьшающих объем экспериментальной работы и-сокращавших расход исходного материала. • II.1. Метод матричного- копирования. ■ Для получения синтетических ДНК, имеющих последовательность оснований, совпадающую с последовательностью ДНК одненитевых векторов, был.предложен подход, опробированннй на примере синтеза промоторной области гена X ДНК.бактериофага Г<1. Этот подход предполагает синтез только одной цепи целевого Фрагмента, в качестве второй цепи используется соответствующий фрагмент ДНК вектора. Один из вариантов этого подхода состоит в ковалептнбм соединении с помощью Т4-ДНК-лигазн синтетических сегментов, составляющих в совокупности (-)-цепь промотора, . на одноцепочечной (+) -гити ДНК фага, как на матрице, с последугщим выщеплением образующегося при этом дуплекса с помощью Б^-нуклеазы (рис.10). Второй' вариант состоит в контролируемом удлинении синтети-ческ >го олигонуклеотнда-праймера. на одноцепочечной матрице, о помощью ДНН-полимэразн в присутствии олигонуклеотида-"стоппера", терминирую- • щего рост вновь образующейся цепи (рис.10). Этому методу можно -дать название метода ограниченного матричного копирования. Здесь возможны два варианта: а) элонгация обеих затравок,.при этом достройка первого 0ЛИ1 знуклеотида останавливается, доходя до 5'-конца "стоппера" и он не вводит в состав выделяемого дуплекса я б Использование в качестве "стоппера" олигонуклеотида с блокированным З'-концом, не являющимся субстратом для Д^гК-полимеразы. При этом стоппер может при желании быть включен в состав целевой ДНК и присоединен к продукту.достройки с помощью лигазы. Двухцеггочечные фрагменты отделяются от одноцепочеч-:шх обработкой З^-нуклеазой, а затем клонируются. Следует отметить, что оба варианта подхода предоставляют широкие возможности для-' модификации ДНК, "в частности паирзвлешюго' мутагенеза и получения фрагментов с модаЗлшировлнными. (напрж.мр-'фО'Гочуватвительннми) звеньями.

lioojioiji&e' было попользовано при провод.» нш;. • отруктурно-З&ункционалЫшх исследований РНК-полиыоразы E.coli, II.2. ¡ионироЬсяшв пдноцвпочечных ШК.

С развитием методов синтеза олш\знуклеотидов стало возможным бистро получать чисто химическими способами 30-бО-зввшше и оолее длинные олигонуюиотвд^. С одной стороны это создало основу для разработки новых подходов к получению синтетических ДНК, а с другой расширило возможности классического метода Кораны. Альтернативой ему является предложений Итакуроц и сотр. подход, заключакщийся в репаративаай доотройко с помощью Д1К-гкцнш4враза частичного дуплекса, образованного З'-коицевыия последовательностями двух двинных олигонуклеотадов, в полнйсты) двухцэпочечный фрагмент, который затем очищалря клонированием поолв образования на его конце ростриктных сайтов. Подобный метод значительно економмт время па химической части работы. Недавно Кумвредом я сотр. был предложен подход, предусматривающий синтез только одной на цопей целевого фрагмента ДНК л одигонуклеотмдов, комллементер-вых-З'- к 3'-концам згой ueiai. Частичный дуплекс, образованный в теми . последовательностями, клонируетоя без проведения постройки ДНК-поди-* иеразой непосредственно после опыта, И после (¡ирвчзддо Целевого фрагмента из вектора он мог.ат быть получек в виде правильного дуплекса ■ Схемя 11 . - ' ■■'.

|ш «гм» IjW «пи

¿.КЮПфОМЮО ¿^CTJMKPH.

ИзупттвчяиЯ «макукл*отод

. Поолрдш! процедур» .бдаа вами ещегб<ш»е уцрсвдка ¡за очч? Того, что' тс>мо одна из. йипей целевого дуплекса, долученгея m~L

fyjjew.'и №Н'е юн, Гакой одаоцапочечшй -^одаюуклвотид; йвсдится'1 In '

двухце-очечную 'векторную молекулу между двумя ресгрнктными сайтами, ■ зин из которых имеет выступающий 5'-. а«другой З'-конец, и после лидирования клонируется без достройки второй цепи. В-тем случае, когда оба сайта чндонуклеаз рестрикции, выбранных для «илнкрованин фрагмеь-' та имеют выступающие 5*-(или 3'-) концн, с той те цель» используется для прямого Клонирования частичный дуплекс, образованный двумя длинными Олигонуклеотидами, имеющими небольшие комплементар»ше последова-' тельноети на 3'- (или 5'-),' котах (схема, 11). В нашей лаборатории еги подходы были- использопаны при синтезе модельных промоторов. '

Для получения последних в специально сконструированном промотора-- i робном векторе( рРТ5 меяду Bglll и Kpnl сайтами полклиик^ра клоттропа-_ ли 38-звегоше олигонуклеотида состава й (ОАТСТТаЛСАтдашшШШНГанТ--ATAATOGTAC), где H4A,G,C'или Т, которые пгра.т роль участка промотор- ' ной области мевду (-1) и (-40) нуклеотидами. При отсм фрагменты Поля-' линкерр левее и правее етих рестриктных сайтоЕ играли роль, соответственно, '(-40)-(-50) района и участка инициации транскрипции, структура которых учитывала известные канонические последовательности для1, етих областей промоторов.

ДЦК вектора последовательно обрабатывали нуклеазой Bglll, фосфа-тазой, а затем лигировали с 5'-фосфорилированным олигонуклеотидом, используй последний в большом избытке. После' разбавления рэакциоштои ■ смеси рестрикционным буфером проводили обработку Kpril. По окончании реакции смесь подвергалась сильному ра'зведению, чте способствовало снижению-межмолекулярного лнгирования плазмидных ДНЯ. После проведе ния второй лигазной сшивки'и трансформации компетентных клеток E.ooli проводился скрининг колоний гибрйдизвацией in situ на нитро-целлюлозных фильтрах с меченым исходным, олигонуклеотидом. Последовательность полученных промоторов подтверждалась секвёнированием.

II.3.. Общий подход к синтезу дбухиепочечных фрог.еетов ДНК. .. ' ... Все рассмотренные выше способы синтеза ДНК гарантированно прййоДят к успеху ; при получении относительно коротких последовательнобтей, в ' среднем до 300 п.о. В случае же более длинных генов целесообразнее использовать промежуточное клонирование отдельных модулей целевой ДНК. Это облегчает сборку,гена, очистку его отдельных частей, екояомит' нуклеотидный материал при химическом синтезе. Кроме того, модульный-прлнцип облегчает, синтез нескольких вариантов гена и его направленный' мутагенез путём замены отдельных его модулей модифицированными последовательностями. . .;•.-• .';■-.

Для успешного клонирования модулей синтетического гена на определенных участках его цепи должны содержаться уникальные сайты, узнаваемые ендонуклеазамй рестрикции. Обычно для етого иопользуются-сайты, имеющиеся в последовательности синтетического гена. Однако чаще всего

- за -

■.....- "'. Смв

ПМ»»«1>1«ТМк»1КТ» <•««*

,,..смтеа.......,,,ттаж....

....отгасс..........месте....

ИСТ» ш ЯОЛНЧТИкНи»

ПСА I Т™ п<«:*'Повате»ьиости ио^М^ЛиИЛТвЛЦНОСТЬ с щ^нрнними ,.>:шцхгти:......... .тгомттсло...

...СТТТССЛКХ..........мсттметс...

; ЧМЧ1 • »«о"«

1>.х»*»ио ♦ириомтдтлини*

.сиитва £.К«|>нм|>омлииР

.. .СМЛОСГГОО.....СЛАССГГССТТОААГП:«:, ..

• ...сптссыих.....ОПСС**ССА*СТГА*;ПС...

' ■ 1со»1

|

■ ,. .аиииягш.....смссстгссттс **ттс*о...

.отселю:.....егкхомдеметтм отс...

.................сыи-ч-стгеитге ело .,

«,.1Яттсаисг.....оггесо**сс*ле стс... 1 лнкомгчл . ■■.,. .сыкмжтгео. *.. .сысотсотгосм...

Т*»Ч«4 С«*ЛММ«И»Ц

. .мтооптслс. ..6ПКССМЛСТС.

»-ыи модул |>

.смтост

.СТТАССЛЛЛ \

с

Цоклгпоиатимьит:'»

лнк

ШСТТ... Т1ССМ... I .Химик» фсрж-НтеТИЮИ Смите» ■ ч

Клонмрпнанмп

г-ея мЬду«!.

мятсм.....мвлп...

стс.... .птах»...

сеем

ь

игкл«*аяа

см.....меетт...

стс.,...тттел»...

.. .ситсатттсав...' ■ • .мветт. . . .СтССАА^ТС.............

точка соеаннгнми

ДНК -ЛИГ<1:м

цел'Врй

1ШЛИИУКЯСОТИ

таких участков либо но имеется, либо нашегея мало, что сильно ограни-чивиет возможности химико-ферментативного синтеза двух цепочечных ДНК И создает необходимость в использовании при получении хчэноз эначи-. Тыльной длшш каких-то специальных приемов или'подходов.

В качестве одного из возможных путей усовершенствования процесса сборки длишшх гоноп нами бил предложен подход, позволяющий в принципе синтезировать ЛИК практически любой длины и последовательности. В основу этого подхода били положены отдельные элементы, разработанные ранее как в других лабораториях, так и в нашей групп«, в частности модулышй принцип конструирования ДНК и использование' вреыекши сайтов крупнощетшшх ввдонуклоаз гаотрикцин для клонирования отдельных модусам и оборки целевого гена. Временные реотрактхыо сайты вводятся в последовательность гена, когда вто необходимо, в произвольно выбранные мостах ив стадии плакироввкня синтеза и образу*« границы модулей, ъ УДВЯЧРТйп либо и процесс© сборки гена, либо посла ее окончания. ., ;Вр»мэшм£ рестрикций раит можно юввотя на либом участке Щ{, со* даргкядэм ^ахоц:-лисй) сацокомшшмонтаршй динуклеотид: АТ. ТА, СО, 00. ПоолвАоватглы»оть гена квк бы раадвигаетоя, и меаду втиыи'двумя нук-лсотиданз впрдатоя твтра-(шш понте-)нуклеотид,, дополняющий его :до ' структуру одамгл из ^зддкиых' рветрдктных. сгштов(схеыа12), Для удчг

ления.такого временного сайта посла окончания синтеза гена, ДНК расщепляют соответствующей ендонуклеазой рестрикции, и образовадопеся .при этом выступающие концы удаляют действием Е^-нухлеазы. Полученные таким образом "тупые" концы соединяют с помощью ДНК-лигазы. Альтерна-' тивным способом удаления такого временного сайта может'слузять олиго-нуклеотид-направленный мутагенез.

Разбивка последовательности ДНК на модули может проводиться произ- ' вольцо. Однако при распределении дополнительных рестриктных сэйтов_ следует учитывать возмакности векторной молекулы, в'.которой предполагается клонировать модули гена и проводить их сборку. Для этих целей пригоден в принципе любой вектор, имеющий полилинкер. Отдельные коду.- ' ли могут быть'получены любым из вышеизложенных способов или их комбинацией. ... . ';

Сборку модулей можно проводить двумя способами. Один из них состоит. в последовательном их клонировании в векторе, в результате чего собирается полный' ген, содержащий все дополнительные рестриктные сайты, которые затем последовательно уничтожаются. Этот вариант сборки особенно полезен в тех случаях, когда предполагается получение нескольких мутантных -вариантов'гена, что легко осуществляется, простой ' заменой отдельных субфрагментов модифицированными последовательностя- , ми (рис. 11а). Второй, более быстрый способ сборки предусматривает последовательное соединение модулей друг с другом "с одновременным уничтожением вспомогательных временных сайтов (рис.116). В этом случае клонирование первого модуля проводится также, как и в первом способе, затем -после обработки соответствующей рестриктазой ¡временный сайт на одном из. концов модуля удаляется действием Б^-нуклеазы. На противоположном конце молекулы генерируется половинным сайт следующей эндонуклеазы рестрикции, И в подготовленный таким образом вектор вводится второй ' синтетический модуль, -. имеющий один "тупой", ' а другой "липкий" концы. При этом тупой конец присоединяется к первому, уже проклонированному модулю,- а липкий - соединяется со вторым концом векторной молекулы. На стыке двух-.модулей сразу образуется последовательность, соответствующая запланированной структуре гена.

Вышеизложенные, способы сборки ДНК учитывают также.возможность использования в. качестве, синтетических модулей дуплексов, имеющих оба' "тупых" конца. На'рис. 12 показано применение такого варианта подхода' при получении фрагмента гена бактериородопсина. Проблема определения ориентации модуля- в векторе - достаточно / просто решается с помощью, рестриктного анализа структуры полученной рекомбинантной ДНК, а также с помощью.метода гибридизации с мечеными синтетическими зондами.

Эффективность этого- подхода была нами продемонстрирована на примере синтеза ряда ДНК,'.в том числе его элементы были использованы при. синтез« гена проинсулина челоьека и гена препроинсулина, промоторной области рь «фага-Д , а -так»- гена зеина кукурузн, который це-

-ооог-тм-.о рг|ОС!.ютр«ть ■ подробней. ■ '. ' • -

Лав1эЬм&юст те

I I \

ркя?* ютш г {Мы» Н

В-гдиянвуц ■ ЖЕ 1Ш*УЖ0 - г?

Слм*т9тя#стт мсдут ло - б •

А ■

"Ыгт Щ I ИмчкЛФПМ

г (тфтпшш ИыЧ

1 Нен&яееш -

I ЛШ- /шгги ж.

4. Мчуыляали Ы/гЫ

1 ¡/Ш-лпи», мвйм в / ЯктуоЭнт '

<. лай».

меЬпС 3 Кмошр*Ь** ■ У ti.it'ЧИГ^ии

а

< ЩЛ-миы.нОт I г ммшрЫж* 1. -«ум«»» V. Ътрштлм //

Сиыгмешгк»!*} г»»

V'^ подход к синтезу двухцепочечных ДНК. А.- Схема

модулей гена с сохранением временных сайтов .Б -Схема "бопки 'Модулей гена е диновременным удалений временных ™айтэт Р

.'5' АЛТТСЛТСАТССТТССССТСААСАТССАААСТСТТСГСТТСЛТСОТТСТГСАТСТТГСТССТАЛЛСТСССТТТССС" 3" еТАСТАССААССССАетТСТАССТТТСАСААСАСААСТАДСААСААСТАСАААйАСеАТТГСАССеААЛОеС-

' 111 L«tJlleÍ4^lL«ц^r']SerAr^]Alлtl*Ph4GlvTлr Н- IV .-—И

ССТСАТССТССТТССТТеТССТСССЛТСТТСССТТАЛО ] ■

ССАСТАССАССААССААСАССЛСССТАСААСССААТТСАССТ I" И-VII -"Н

янк-яигаэа

ЯНК-пояинераза цезоксингкяеоэидтри^осфати

_ргг2----ОТСАССС--

.-САСТОСС—

1. днк-лягаза

2. клонирование,

---------ССЛТСС----

-Е------гССТАОО---р ■

ВатПХ

' —--ЛЛССТТ—— Г"-«-----ТТССАА----:

1. в5се11

I. 5,-кгклеаза

1. н1п41и, дик-цояии«р»за

4. днк-лигаза, модуль (В)

5. клонирование, селекция

—в—сссс------{—--СОЛТСС— ри!,

-С ССС—»-------ССТАСС---г

НаеХН ваших

1. Н1псП11

2. з.-иуклеаза

3. ЕсойХ

«. днк-лигаза. нопуиь (а) 5. клонирование, селекция

--Г.ААГГС----;---АТ---

—СТТААО--------ТА----

ЕсоЕХ

-5----сасс-----я----сслтсс—

.3----СССО----------ССТЛМ-

ХааНХ ВалНХ

рйН

Рио. 12. Схема синтеза гона сегмента 198-231 бактериородопсин&З Точками показаны 5'-концевые фосфатные группы.

II:4. Синтез zem sewia пикируем-• Зчины - ооноыше запасные белки кукурузы, представляют собой мик-рогеторогеш1ую смесь гидрофобных белков, локализованных в вндосперма зерна в виде нерастворимых в воде белковых тел. С целью изучения структурно-функциональных отношений в атих .белках, а также для разработки подходе:) к конструированию мутантних земное был предпринят химико-ферментативный синтез искусственного фрагмента ДНК длиной . около 800 П.о., кодирующего зеин с молек. массой 22000. Последовательность 'полученного гена практически полностью соответствовала .структуре гена OZ22B1, определенной Ларкинсом и сотр. Некоторые незначительные изменения были внесены для облегчения процесса сборки гена и его последующего мутагенеза (рисЛЭ). Ген синтезировался в двух вариантах: с включенном последовательности, кодирующей лидерный пептид и без нее. Схема оборки i-eiifj предусматривала использование модульного способа синтеза. Последовательность гена зеииа Сила разбита на 8 модулей Длиной от 60 до 180 п.о. каждый,■ мс-пуцг которыми содержались сайты вндо-нуклезз рестрикции. Причем некоторые из них присутствовали в последовательности природного гена, другие (Clal, HihdIII, Saol и Xhol) были введены в нее в результате замены некоторых кодонов согласно генетическому коду, а третьи (Kpnl, üamHI и Bglll) вводились временно и должны были бить убра!ш после окончания сборки гена. На 5'- и 3'-конца* гена били запланированы KaoRI и Sali сайти. .

Первой стадией получения искусственного гена явился химический синтез олигонуклеотидов, Было получено 40 олигодезоксирйбонуклеотидов длиной от 30 до ЬО иоаоивртх зьсньсб каждый. Синтез проводился в автоматическом и полуавтоматическом режимах с использованием фосфита -мидного метода, о также фосфотривфирного метода , в основу которого положен О-нуклеофклышй внутримолекулярный катализ.

Следующая стадия - соединение отдельных олигонуклеотидов в модули я1-5:8 о помощью ДНК лигазы фага ,Т4. Клонирование и сборка отдельных •модулой осуществлялись в ллазмидах pBR322 (z1 и г2), га также в плаз-мвде pPLE2, сконструированной нами, ранее (рис.14). Фрагменты z1* z2, йЗ ооединяли омюьреисшю в плазмиде pPLEZi2j, тогда как модули zb-z8 объединяли последовательно в плазшде рГЬК£5б78. Соединение етих крупных фрагментов гона с модулем z4 проводилось также в одном експе-.риманте. Получоннал • при итом плазмида pPLEZAl содержала ПОЛ1ШЙ ген зеана, включая последовательность, кодирующую лидерный пептид, и три временных реотриктных сайта, KpnX-Сайт удаляли направленным мутагенезом о использованием в качестве праймера-мутагена оЛигонуклеотида <КААОААС1СОААСАОТТ) по ранее разработашюму нами методу мутагенеза на двухцепочечных ДНК, а другие два сайта - обработкой плазмида соответствующей ондоцуклеаэой рестрикции и'затем Б^-нуклеа'зой о промежуточным отбором интермедиатов клонированием. В качестве' гибридизацион-вых зондов при -скрининге колоний "использовались 16-мерц

d(AamciATOTnOAAC) для BglII-райта и d(AOCAACAGCTCCTGCC) -для BamHI-

nu. CM]

«ТГС1ПТ

вТАСЛОС

вша eut

Roo. 14- Схеме койструирования зекновых генов из отдельных модулей.

сайта. В результате была получена плазмидная ДНК рРЬЕгА, несущая ген биосинтетического предшественника зеина. Для превращения последнего в ген, кодирующий зрелый зеин, плазмиду рРЬЕЙА обрабатывали ондонуклеа-зами ЕсоЫ и СХа1, выщепившийся'модуль а1 заменяли на небольшой синтетический дуплекс, содержащий ЕсоМ и С1а1-сзйты и метиешпюЕий ко-дон. В, результате'была получена плазмида рРЬЕ2В. Аналогично получали плазмиду рРЬЕгВ1, содержащую укороченный ген зеина (без модуля 21) о временными рестриктными сайтами. .

выводы ,

1. Разработан ускоренный вариант фосфотриэфирного метода синтеза олигодезоксирибонуклеотидов в растворе и на полимерных носителях, основанный на использовании для создания межнуклеотидной связи высоко-еффективных конденсирующих реагентов - арилсульфохлоридов'в присутствии 1-Метилимидазол.а. Основными чертами втого метода являются: высокое качество синтетических олигонуклеотидов; возможность проведения синтеза не только в пиридине, но и в других органических растворителях, таких как ацетонитрил, хлорированные углеводороды и др.; применение для очистки промежуточных соединений при синтезе в растворе обращенно-фазовой хроматографии..

2. Изучена реакция образования фосфотривфирной связи под действием конденсирующих.реагентов в присутствии ряда О-нуклеофильных катализаторов -/производных И-окисИ пиридина. Показано, что применение ряда 4-замещенных производных М-окиси пиридина позволяет резко сократить время межнуклеотидной конденсации и уменьшить количество побочных продуктов. С помощью!ЯМР-спектроскспии показано, что промежуточно образующееся при этом активное фосфорилирующее соединение представляет зобой Н-фосфорилоксипиридилиевую соль нуклеозида. На основашш полуденных результатов разработан быстрый фосфотриэфирный метод синтеза злигонуклеотидов с использованием в качестве конденсирующих реагентов арилсульфонилхлоридов или -нитротриазолидов в присутствии О-нуклео-Екльных катализаторов, а в качестве фосфатблокирующих - арильных или злкильных защитных групп. ■

3. Разработан подход к скоростному автоматическому синтезу олиго- • гуклеотидов с применением в качестве мономеров нуклеотидов, у которых' фосфатный остаток блокирован 1-оксидо-4-алкокси-2-Пиколилышми или 1-оксидо-4-алкокси-6-метил-2-пиколильными группами, являющимися одно-зременно внутримолекулярными О-нуклеофильными катализаторами. Этот тодход.позволил сократить время одного цикла обработки полимера до ,

5 мин. ■ .

4. С помощью ЯМР-спектроскопш изучены некоторые побочные реакции три синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом, протекающие в 1эстяости при предактивации нуклеотидного компонента конденсирующим зеагентом.1 На основании полученных данных предложена модификация этого метода, заключающаяся в использовании в качестве растворителя при

создании мекнуклеотидной связи смеси ацетопитрила с хинолином и позволяющая практически избежать прохождения этих побочных реакций»

5. Для получения синтетических ДНК, последовательность которых совпадает с последоБательно"ть'ю однонитевых век горев, предложен подход, продоолагаыций синтез только одной цепи целевого, полинуклеотида, в качестве второй цепи используется соответствующий фрагмент ДНК вектора. Подход применен к синтезу промоторной области гена X бактериофага id и ее модификаций. Кроме того, разработана процедура клонирования длинных одиоцепочечных химически^ синтезированных ролинуклеотидов в плагмидных векторах, позволяющая значительно сократить объем химического синтеза щ>и получении искусственных дуплексов. Эта процедура опробована на примере получения серии среднестатистических лромогероа.

• 6. Разработан общий подход к синтезу "прот-явдшшх двухцепочочнцх ДНК, в основу которого бил положен модульный принцип конструирования генов и использование временных сайтов ендонуклваз ^рестрикции для оборки и клонирования отдельных модулей-

7. С применением вышеупомянутых методов осуществлен синтез большого числа олшчдозоксирибонуклеотидов, имеющих длину цели от в до 65 мономерных звеньев, а также цчлого ряда искусственных генов пептидов и белков,' в том числа генов нроинсулина человека, функционально активного фрагмента бактериородопсиня, IgO-связывающего домена белка А Staph, aureus и гона запасного белка кукурузы - зеина, длина которого ростаьлнет около 800 п.о.

Основной результаты диссертационной работы излохеш в следу -кода- публикациях:

1 .Овчинников ¡O.A., Ефимов В.А., Чашахчеви О.Г. Синтез промоторной области ДНК бактериофага fd. - Биоорган, химия, 1979, т.5, N1, 0.138 -144.'

г.Ефаожэв В.А., Чахыахчееа О.Г, Синтез структурного, гена лейцин-онке Фалина. - Биооргад.химия, 1979, т.5. N 2, с.305- 307.

3.0vohinnikov Yu.A., Efiroov V.A., ühaidmashoheva 0.0. Mynthetila oí a polynucleotide corresponding to the . promoter - region , of bacteriophage id DNA. - F£bS Letters, 1979, v.100, N 2, p.341-34b.

4.Ефимов B.A., Чахмахчева О.Г. Синтез промоторной области ДНК бакто риофага fdЛ Химическим синтез олигодезокейрибонуклеотидов, соответс-твусщих 5'-концевому участку "минус"-ц«пи промотора - Биоорганическол химия, 1979, т.5, К 9, о. 1329-1340. л

5.Овчинников O.A., Ефимов P.A., Чахмахчева О.Г. Сщ.тез промоторной области ДНК бакториофага fd II. Химико-фэрмантативннй синтез неиоди-филированного промотора с помощью ДНК-лигьзы и нуклеазы 3,- Биоорган, химия. '1979, Т.5, Í.' 12, с.1782-1792. •

fi.OvcMníii'.T'ív Yu.A.» JSfímoy 7.Л., "Chf,¡üa)iM¡otu:v>i .'O.Q; ' ' Ikw approucheß to i.yritheei!; 'víi t'U'Á.- Xrugwvi:;. / Щи thiuie *f\%:-pw^lir

•egion of , bacteriophage id DM. - Hoppe-Seyler'a .Physiol.Chem.,1979, v.360,p.1026.

7.Chakhmakhoheva 0.0., Efjmov V.A., Ovohinnikov Yu.A. hemioafinzymatio synthesis of biologically active DNA fragments.-uol.Acids Symp.Ser. No 7, 1980, p.345-363. В.Щимов В.А., Ревердатто с.В., Чахмахчева О.Г. Применение триизоп-опилбензолсульфохлорида и ГЬметилимида зола для создания фосфзтрйэ-ирной межнуклеотидной связи.- Биооргая.химия, т.8, N 2, с.231-236. . 9.Efimov V.A., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva O.G. Aryleulfonyl hloridcs in the presence of N->.iethyli.nicIasole ав efficient ondensing reagents in phosphotriester oligonucleotide eynthesis.-strahedron Lett., 1982, v. 23, N 9,. p.961-964.

10;Efimov V.A., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva O.C. New effeotive athod for the syntheeis of oligonucleotides via phosphotriester itermediates. - Huol.Aoide Res.,1982, v.10, N21, p.6675-6694. 11 .Овчинников Ю.А., Ефимов В.А., Чахмахчева О.Г. Хкмико-фсрмента-ганый'синтез и клонирование гена проинсулина человека.- Докл. АН ЮР, 1983, т.270, N 3, с.743-747.

12.Efimov V.A., Buryakova A.A., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva ,Q., Ovohinnikov Yu.A. Rapid . Synthesis of long-ohain joxyribooligonuoleotides by the N-methylimidazolide phosphotriester sthod. - Nuol.Acids Res., 1983,v. 11, 11.23, p.8369-8387.

13. Ефимов В.А.., Бурякова A.A., Ревердатто С.В., Чахмахчева О.Г. )именение N-метилимидазолидного фосфотриефирного метода для получе-гЯ олигонуклеотидов, полезных при изучешш рекомбинантных ДНК.- Бя->рган. химия, 1983, Т.9, N 10, 0.1367-1381.

14 OvchinnikoV Yu.A., Efimov V.A., Ivanova I.П., Reverdatto S.V., :iba N. P. .Chakhmakhcheva O.G.- Synthesis of DNA coding for human *oinsulin. - Gene, .1984, v.31, N 1-2, p.65-78. .

15.Efimov V.A., Chakhmakhcheva O.G., Ovchirinikov Yu.A. Improved pid phosphotriester synthesie of oligcdeoxyTibonuceiotides using ygennuoleophilio oatalysis. - Nuol.Acids Res., 1985,v.13, N 10, 3651-3666. .

16,Efimoy V.Ä., .Chakhmakhcheva O.G. Rapid synthesis of igonuoleotides by the phosphotriester. method.- Biochimie, 1985. 67, N . p.791.-795. ' .

17.Ефимов В.А., Чахмахчева О.Г... Применение кислород-нуклеофилышх гализаторов для быстрого синтеза олигодезоксирибонуклеотидов фос-триэфирным- методом. -' Биоорган.химия, '1985, т.11, N 8, о.1087-1096.

18,Ефимов В.А., Чахмахчеза О.Г., Бурякова A.A.» Мирских О.В., Ревер-гто С.В., Овчинников. 10.А. Общий подход к конструированию сиятете-:-ких ДНК. .- Биооргэн.химия,-1985,: т. 11, N11, о.1533-1.546. ig.Efimov V.A., "; Chakhmakhcheva O.G. Rapid chemical synthesis of Lgodeoxyribonucleotides by the improved phosphotriester method, jleosides and Nucleotides, 1985, v.4, N 1-2, p.265.

20.Efimov Y.A., Buryakova A.A., Dubey I.Y., Polushin N.N., Chakhmakhoheva O.G., Ovchinnikov Yu.A. Application of new aatalytio phosphate protecting groups for the highly eifioient phoephotrieuter oligonucleotide synthesis. Nuol.Aoids Res., 1986, v.14, N 16, p.6525-6540.

21.Chakhmakhoheva O.G., Efimov' V.A., MirskikJi O.V., Reverdatto S.V., Buryakova A.A., Ovchinnikov Yu.A. New approach to the construction of synthetic double-stranded DHA. - Chemica Scripta, 1986, v.26, N 3, p.31-35. • '

22.Efimov V.A., Chakhmakhoheva O.G. Use of oxygen-nuoleophilio oatalysts for the phoephotrieater- oligonucleotide ¡synthesis,- Chemica Sorlpta, 1986, v.26, H 3, p. 55-58. \

23.Efimov V.A., Chakhmakhcheva O.G., Ovchirmokov Yu.A. Synthetic DNA fragments ac useful tools in genetic and protein engineering.- In: Biotechnology and Oenetio Engineering Reviews. Ed. Ruasel G.E.. Poriteland, Newoautlc upon Tyne: Intercept, 1986, v.4,p.79-116.

24.Efimov V.A., Chakhrnakhchc va O.G., Ovohinnokov Yu.A. Vei'satile methodology for the construotuion of artificial genes. -Nucleosides and Nucleotides, 1907, v.6, N 1-2, p.321-325.

25.Efimov V.A., Buryakova A.A., Polushin N.N., Dubey I.Y.,Chakhmakhoheva O.G . , Ovchinrikov Yu.A. Phosphotriester synthesis of oligonucleotides with the use of N- and O-nuoleophilio intramolecular aatalysis. - Nucleosides and Nucleotides, 1987, v.6, N 1-2,p.279-282.

26.Efimov V.A., Chakhmakhcheva O.G., Reverdatto S.V. Nuolaophilio oatalysiB in oligonucleotide synthesis. -:in: Biophosphates and their analogues - synthesis, structure, methabolism and activity. Eds. Bruzik K.S. and Steo W.J., Amuterdam: ElBevier, 1987,p.23-36.

27.Efi:nov V. A., Chakhmakhoheva. O.C., Buryakova A.A. Modern phosphotriester synthesis of long oligonucleotides and their use in genetic engineering. - Nuol.Aoids Sym.Ser. No.18, 1987, p.217-220.

28.Efimov V.A., Chakhmakhoheva O.G., Poluchin N.N., Dubey I.Y. Nuoleophilio catalyeis in the oligonucleotide synthesis.- NuoliAcids Symp.Ser. No.18, 1987, p.213-216. -

29.Efimov V.A., Buryakova A.A., Chakhmakhoheva O.G, Synthesis and modification of zein genes. - Protein Engin., 1987, v,1, N 3, p.252.

. 3.G.Ефимов В.А., Бурякова А.А., Пашкова И.Н., Чахмахчева О,Г. Синтез и клонирование искусственных генов зеинов.-Биоорган.химия,1988,тИ4, N 11, 0.1538-1544.

31.Ефимов В.А,, Мирских О.В., Бурякова А.А., Пашкова И.Н., Полушин Н.Н., Чахмахчева О.Г. Конструирование промоторпроСных векторов на оо-новъ модифицированного гена fe-галактозидазы Esoheriohia ooll. - Биоорган. химия, 1989, т.15. Н 1, о.90-103. . , :

32. Ефимов В. А., Бурнкива Л. А.. Полушин Н. Н., Пашкова И. Н., Дмитракова Е. В., Чахмахчева О. Г. Синтез и экспрессия искусственного гена IgG-связывающего фрагмента белка A Staphylococcus aureus. — Биоорган. химия, 1989, т. 15, № 4, с. 499—507.

33. Ефимов В. А., Дубей И. Я. Модификация Н-фосфонатного метода синтеза олигонуклеотидов на полимерных носителях. — Биоорган, химия, 1989, т. 15, № 11, с. 1485—1489.

Результаты диссертационной работы были представлены на 3-ем и 7-ом симпозиумах по молекулярной биологии ФРГ—СССР (Мюнхен, 1979 и Гейдельберг, 1987); международном симпозиуме по химическому синтезу нуклеиновых кислот (Эгесторф, 1980); XVI конференции ФЕБО (Москва, 1984); VI и VII Международном круглом столе: нуклеозиды, нуклеотиды и их биологические применения (Гранд-Мотт, 1984 и Констанн, 1986): Всесоюзной конференции «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1984); Международном симпозиуме «Олигонуклеотиды и молекулярная генетика» (Оссуа, 1985); Международной конференции «Синтетические олигонуклеотиды в молекулярной биологии» (Уппсала, 1985); Международном симпозиуме по белковой инженерии (Гронинген, 1986); симпозиуме «Белковая инженерия'87» (Оксфорд, 1987); 4-ой международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных натуральных продуктов (Будапешт, 1987); 7-ом международном симпозиуме по химии компонентов нуклег.н,;вых кислот (Бехин, 1987); 14-ом международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988); 8-ом международном биотехнологическом симпозиуме (Париж, 1988).

T-1137U. Подп. в печать 7.07.89 г. Формат 60Х84А«. Зак. 585. Тир. 120.

Москва. Типография ВАСХНИЛ

/С^г^с^ CPfoo Sf.0Z.3e.