Оптимизация метода химического легирования при сборке протяженных ДНК. Синтез гена тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОГДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЭНАШЯ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛИШ ГОСУДАГСТВПНШЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Не правах рукописи УДК 577Л 13.4

МЕРЕНКОВА Ирина Николяввнв

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ХИМИЧЕСКОГО ЛИГИРОВАНИЯ ПРИ СРОПСЕ ПРОТЯЖЕННЫХ ДНК. СИНТЕЗ ГЕНА

02.00.10 - Биооргашпесквя химия, химия природных и физиологически активных веяэств

Автореферат диссертации на соискянне 7ченой степени кандидата химических наш

Москва - 1992

1-аоотв ышолшиа на кафидри химии природных лиилч&скога факультета Ш'У им. и.В.Ломоносова

со0дшшщ1й

Иаучшю руководители:

¡•Ч-ициалыше оппоненты:

доктор химических наук, Профессор ШАБАРОВА З.А,

кандидат химических, наук, старший научный сотрудник СОКОЛОВА Н.И.

доктор химических наук, ШИБАЕВ Ь.Н.

кандидат физико-математических наук, СКУШ'ОЬСЖШЗ И.я.

Ьо«ущЫ органнуиция: ЕНШЦ'енетика корпорации "Фарминдустрия"

Зощпа состоится Я^сГСриР 1992 г. ь часов

иа заседании Специализированного Совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете'им. к.В.Ломоносова по адресу: II»399. Москва. ГСИ-3. В-234, Ленинские горы, МГУ,. Лабораторный корпус "А". аудитория

С диссертацией мохно ознакомиться в оийлиотеко Химического факультета МГУ,

Автореферат разослан с&ссРсРф^ р.

Учашй секретарь Специализированного совета. '

кандидат химических наук . ^^ : ^•Г.Ошриова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. В связи с интенсивным развитием генетической инженерии я биотехнологии возрастает практическое использование синтетических ДНК в качестве искусственных генов биологически активных пептидов и белков, регуляторных участков геноме, зондов и т.д.

Одним из перспективных методов получения протяженных ДНК дуплексов, а также дуплексов с различными точечными модификация»! является метод химического лигирования (ХЛ), который заключается в сборке двуспиральных ДНК путем конденсации олигонуклеотидных блоков на комплементарной матрице под действием химических реагентов. Значительное снижение требований к структуре субстратов при ХЛ (по сравнению с ферментативным лигированием) открывает возможность введения широкого круга модификаций (неприродные меж-нуклеотадные связи, точечные модификации оснований и углеводофос-фетного остова) в ДНК-дуплексы в процессе их сборки в водных растворах. Оде одним преимуществом метода ХЛ при использовании в качестве ковденсирутоего агента бромистого циана (BrCN) является высокая скорость реакции (время реакции - 1 минута).

Для различного рода исследований в области физико-химической биологии все чаще требуются значительные количества ДНК. При получении препаративных количеств ДНК преимущество химического способа лигирования над ферментативным становится очевидным, так как стоимость химических роагентов (напр., карбодиимида или BrCN) на 3 порядка ниже по сравнению с Т4-ДНК-лигазой.

В связи с этим представлялось целесообразным' оценить возможности метода ХЛ для получения протяженного ДНК-дуплекса (гена) и изучить биологическую активность такого гена In nitro и Ift vivo.

Цель работы. Работа посвящена использованию метода BrCN-индуцируемого химического лигирования для получения функционально-значимого протяженного ДНК-дуплекса: разработке стратегии сборки, определению факторов, влияющих на ее эф1»зктивность, изучению биологи1«ской активности полученного гена In nitro и In Di vo.

Научная новизна'и практическая ценность работы. Впервые провалена полностью неэнзиматическая сборка функционально-значимого фрагмента ДНК. Показано, что в процессе сборки по происходит мутаций нуклеотидного материала. Биологическая активность синтезированного исключительно химическими методами гена In vitro п In

Иио демонстрирует возможность использования метода ХЛ при сборке генов.

Показано, что одним из основных факторов, определяших эффективность образовании новой межнуклеотидной связи, является природа иуклаотидов в участке "сшивания". Обнаружена корреляция между эффективностью ХЛ в зависимости от природы нуклеотидов в участке "сшивания" и локальными сиквенс-зависимыми изменениями параметров ДНК (литературные дашше). НаиОолее ярко эта корреляция проявляется в дуплексах, где акцептором 3'-фосфата является 5'-гидроксильная группа. Выявлена общая для ВгСН и водорастворимого карбодиимида зависимость эффективности ХЛ от структуры реакционного у?ла. Предложены практические рекомендации наиболее рационального планирования разбивки целевой последовательности на фрагменты для проведения эффективного ХЛ.

Методом ХЛ с выходами 2-69* получен широкий набор ДШ-дуилексов, содержащих некомшшментарные пары оснований и пирофос-фатные межнуклеотидные связи.

Публикации и апробация работы. Но материалам диссертации опубликовано 10 работ. Результаты исследования докладывались на конференции молодых ученых химического факультета МГУ (г. Москва,

1989), VII Всесоюзном симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (г. Рига, 1989), VII Международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (г. Бехин. Чехословакия, 1990). I Всесоюзной конференции "Геном человека" (Москва,

1990), Международной конференции по ¡ушии нуклеиновых кислот (Япония, 1990), Международном симпозиуме "Синтетические олигонук-леотиды: проблемы и перспективы практического применения" (г. Москва, 1991), II Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии (г. Самарканд, 1991).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на стра-шцах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы (ссылок), содержит ЯГ рисунков и 7 таблиц.

содшшме работы

Метод химического лигирования с использованием в качестве конденсирующих агентов водорастворимого карбодиимида и бромистого циана исследовался ранее в основном на модельных системах. Открытым 'оставался вопрос о принципиальной возможности использования

этого метода для получения "смысловнх" протяжетт ДИК-дуплексов, в такие изучение факторов, влияющих на эффективность ХЛ. Основное внимание било уделено работе с BrCN, т.к. зтот високочктившЯ реагент бил предложен недавно, а его использование при получении подобии структур несомненно делает ХЛ универсалышм и перспективным методом.

Полностью неэнзииапгческая сборке гена.

Обычно протяжешше ДНК-дуплексы получают ферментативным легированием 5' -фосфорилирояанных олиголезоксирибонуклеотндов п Комплементарных комплексах.

В настоящей работе исследовалась возможность получения Про-тяженяого ДНК-дуплекса С183 п.о.) исключительно химическими методами: твердофазным стотезом олигодезоксирибонумеотидннх Фрагмон-Тов и последующим лигировятгаем этих фрагментов в составе компле -ментарного комплекса под действием BrCN для дальнейшего изучения его активности In vitro и In viva.

Несмотря на небольшой, по совремешшм масштабам, размер ДШ-дуплекса. структура которого представлена на рисунке 1, он является полнонетгам геном - в его состав входят сильный промотор (аналог промотора операторные участки 0f(1 и 0^2, участок

инициации трансляции (протяженная последовательность Шайн-Даль-гарно (9 п.о.), инициирующий ATO и терминирующий TAG колонн), а также р-независимый терминатор транскрипции (аналог tft)). При транскрипции этого гена должна получаться 130-звеття мГИК, кодирующая пептид из 16 аминокислот. Komm ДНК-дуплекса предусматривают возможность его клонирования по сайтам рестрикции IIIndi ÍI и Xbal. Кроме того, в первичную структуру модельного гена бил вшге-чен ряд упикалышх сайтов рестрикции (BamHI, Kpnl, Clai. Eco47III, BglII, EcoRI, EcoRIT и т.д.), что позволит в дальнейшим легко вводить мутации путем замены в клонированном гене участков длиной «20 Ii.п., а также использовать вектор, содержащий синтетическую вставку, для клотфования и экспрессии других mrm.

В работо было использовано два варианта разбивки, различавши* ся длиной олигомеров, из которых впоследствии била собрана целовал последовательность.

Первнй подход заключается в симметричной рпзбщ.ке ДНК дуплекса на короткие фрагмент» (13-2Í3 нт.), причем рз:ф1ши л н.-и лротиппоЛ цепи рясполошш примерно по серп дине по отнпючния комплементарному олигонуклеотиду (pnc.t, Фрагменты 1-1»н. <Vw>

- ч •

ь

з -

а,63) , Ь(4й) с(£2) _с!(47) '^(35) ~55аГ Ы53)

Б

с

* сатЛил.!^ шпалах

....................•С^ССЛТХЛТА^ССАТХЛГГАТ|ЬСТАГПЬССД

— ~ . , • *

1^0:10. А£,ил.$ А К-иТСЛЬТАчА^СА I

1 П. I А.1

т

ГГ.А7Т1

- г-1;-1-з-,-«

АГА1-А11.ТТА(,Аи;ТСйААА1гСАили1*АПСААА(4сГа:ТтииАиС1.ТТГГТТГГГ - я - > ^ Н

М15п>рП

рТ / А -

|НМ1И

аМепсг^АТР

зхЬаТ

4К|ет^,<1стр с|атр Зтгр

хи она кдазе

(Нн,с101 а 5пЮ I

МИтрИ-в , I 1НЫШ I 43та|

-*• рТ7-4-8

Схема коирки гены с иснользоъаниом Ьх-СН и клонировании син тетичасжоги дуплькса в М13 и рТ7-4. Одновременное лигирова-ииа обоих цопой дуплокса (А) и лмгирииание верхней (В) и шшшй (0) цепей но отдельности. Точкой показаны концевие

ОО

5'■фосфитина [ф^шш. авиздочкой - 15'- ,Р)фосфат. Цифрами ойозначони короткиь фрагмйнти: стрелка указиваьт начало фрагмента. Латинскими буквами обозначены протяжатша фрагменты: в скобки* указана длина соотватствущего ошгомера.

-г-

дезоксирибонуклеотютше фрагменты 1-18 содержали 3'-концерне фю фатные группы, т.к. выходы при химическом лигиропании яначителыю выше, если акцептором фосфата является 5'-гидроксильная группа. При химическом лигировзнии фрагментов верхней й нижней цепей генп по отдельности в качестве матрицы использовались нефог^орилиро-ванные фрагменты комплементарной цепи. Такая стратегия Гн.:'я гчю рана для того, чтобы легче было следить за ходом реакции химичес кого лигирования и упростить выделение продукта. .

Эквимолярные смеси олигонуклеотидов в 0,25 М морфолиноэтан-сульфонатном буфере (рН 7.6) нагревали ло 97°С, а зятем медленно охлаждали до 0°С, после чего добавляли ВгСМ. Мороз 1 мин нуклео-тидный материал осаждали этанолом.

Однако ВгСЯ-индуцируемое химическое лигировпнис в птом случае не привело к получению Н0лово1'о продукта. Но опыту многих исследователей максимальное число олигонуклеотидов в смеси лигирования, при котором продукт-еще можно надежно выделить, составляет 10-16 фрагментов. В нашем случае комплекс образовывался из 10 олигонуклеотидов. Резкое снижение эффективности ХЛ хотя он на одной из стадий является критичным для получения нолевого продукта. Использование же многостадийной сборки, т.е. последовательное наращивание цепи, не имеет премущсства перед одностадийной, т.к. выделение промежуточных продуктов лигирования, напримор, электрофорезом в ПААГ, связано с значителышми потерям! нуклеотидного материала. Кроме этого но эффективность химического лигироптшл отрицательно влияет возможность неправильной гибридизации олиго-дазоксирибонуклеотидннх фрагментов с образованием альтернатирпнх структур. Анализ последовательности гена с помощью программ М1сгодеп1е (ВесКтяп, Австрия) показал, что образование подобных "паразитных" структур весьма вероятно. Косвенным подтверждением Этого факта является чрезвычайно низкая эффективность (< 6%) ферментативного лигирования при сборке 184-звенного полидезоксирибо нукпротидв - нижней цепи целевого ДНК-дуплекса.

Второй подход, в основе которого лежит фрагментация на более протяженные олигонуклеотиды с образованием мини-дуплексов с относительно короткими липкими концами, в значительной степени лишен указанных выше недостатков.

> Каждая из цепей ДНК-дуплекса разбивалась на 4 оллгомора дли ной от 35 до 63 нуклеотпдов (рис.1, фрагменты а-11).

Сборка синтетического гона проводилась в двух вариантах: путем одновременной сборки обеих цепей (рис.1 А) и путем сборки кат

дой цоин но отдельности с использованием в атом случае в качестве матрицы нафоофорилировьиных олигонуклеотидов (рис.1В, С).

Ь качестве конденсирующего реагента использовали BrCN. Реакции проводили в оптимальных условиях. Для сравнения параллельно с brüN-шщуцируемим химическим датированием проводилось ферментативное лигирование дуплексов В и С (рис.1) в течение 12 ч с использованием Т4 ДНК-лигази. Все реакционные смеси анализировали в Ь i 11ААГ, содержащем ? М мочевину. Выход целевого продукта при химическом лигировании пики, чем при ферментативном (рис.2).

Это объясняется тем, что в работе использовались б'-фосфори-лировашше олигонуклеотидц, а не 3 • -фосфорилированные, что было связано с техническими возможностями синтеза. Можно надеяться, что сборка поливы* последовательностей из З'-фосфорилированшх олигонушкютидоь (а в настоящее время уже стало возможным получение таких олигомвров непосредственно в результате твердофазного синтеза на автоматах-синтезаторах) позволит значительно повысить выход продукта.

Сравнивая варианты А и В,С (рис.1) следует отметить, что экспериментально оолье простым является получение протяженных ДНК-дуплексов путем лигирования каждой цепи по отдельности. Это позволяет избегать трудностей, связанных с- выделением дуплекса (путь А по ср. с В, С). Электрофорез в неденатурирущих условиях хотя и иоаволяет выделить продукты лигирования в двутяшвом виде, но помимо значительных ьремшшш затрат, выделенный этим методом ЛПК-дуплекс может содержать неренарировфпше разрывы.

ДНК-дуплвкс U, верхняя и нижняя цепь которого получены методом ХЛ в вариантах В и С (рис.1), был успешно клонирован в фаг Mlümpll. Для получения вектора с соответствующими синтетическому фрагменту липкими концами решшкативную форму ДНК фага расщепляли рестриктазами Hlndlll и Xbal, затем достраивали с помощью ДНК-полимеразы I (фрагмент Ююнова) и ограниченного набора (Ш'Р. Различите последовательности на концах модельного гена были сделаны специально для того, чтобы предотвратить мультипликацию фрагмента при клонировании и самолигирование вектора. Для изучения транск-ршишонной активности синтезированный ген был клонирован в плаз-миду р'ГУ 4. В результате была выделена 130-звенная РНК. Первичная структура полученного гена подтверждена секвенированием по Сэнга-ру, (Работа по клонированию была проведена совместно с сотрудниками лаборатории химии нуклеопротеидов кафедры химии природных соединений Химического (факультета МГУ).

12 345

i

Рис.2 Радиоавтограф (электрофорез В В% Г1ААГ, содержлщем 7М • Мочевину) реакционных смесей, полученных поело ферментативного (2,4) и хими ческого (3,5) лидирования верхней п никней цепей гена соответстветю. t -контроль: гидролиззт Taql-рестриктв-зой плазмиш. pHSB, получон-ной при клонировании в рИС19. Цифры слева указывают длину фрагментов. ХС-ксилешшшюл.

Таким образом, исследования показали, что метод ХЛ позволяет проводить полностью неэнзиматическую сборку биологически активных структур. При планировании синтеза олигонуклеотидов разбивка функционально-значимого ДНК-дуплекса иа фрагменты, образующие мшш-дуплексы с относительно короткими липкими концами, имеет несомненные преимущества перед разбивкой на короткие фрагмент: для проведения эффективного одностадийного химического лигирова-ния следует также учитывать влияние элементов вторичной структуры. Лигирование каллой из цепей ДНК-дуплекса по отдельности позволяет экспериментально упростить процедуру шделения, определить истинный выход продуктов лигирования и обеспечить эквимоляр-йость цепей при дальнейшей гибридизаций.

Иэучыиаб зависимости ъффектшвоста химического литерования от природы нуклеотадов, иежду которыш образуется новая иижнушшотидиая связь.

ранее было замечено, что эффективность ХЯ зависит от структур узла "сшивании". Неудача ХЛ при сборке гена из коротки!

' Фрагментов, а также невысокий выход целевого продукта при ХЛ протяженных Фрагментов заставил нас еще раз обратить внимание на эту проблему.

Набор различных фрагментов ДНК-дуплекса (рис.), фрагменты 1--1В и а-Ы сделал возможным изучение эф1ективности ХЛ для 14 из 16 возможных комбинаций нуклеотидных пар в месте образования новой фосфодиефирной связи двойной спирали ДНК. Исследование проводилось на серии трехкомпонентних комплексов I -XV, состоящих из двух олш'онуклаотидов и комплементарной им матрицы (табл.1). Следует отметить, что нуклеотшвшв последовательности, фланкирующие участок легирования, били различны. Эксперименты проводились параллельно как о (-втил-ЗО'-диметилйииногфопилжарбодииивдоы (КДИ), так и с использованием ВгСЫ. Во всех изучешшх дуплексах в реакционных центрах были сближены 3'-фосфатная гру1та одного оли-10мера и 5'-гидроксильная группа другого. Ряд контактов был проверен повторно с использованием более протяженных матриц (рис.1, Фрагменты а-Ц).

Результаты ХЛ, индуцимруемого ВтСИ (1 мин) и КДИ (за 46, % и 144 часа) в комплексах 1-ХУ приведен^ в табл. 1. Из приведенных данных видно, что выходи продуктов реакции колеблются от 10 до Причем конденсация под действием ВгСН протекает аффоктиънее, чем под действием Выходы продуктов ВгСН- и КДИ индуцируемого ХЛ практически близки во всех изучешшх системах. Однако, следует учитывать различна в скоростях ХЛ: значительно более короткое время Ы-СН-индуцируемой конденсации - 1 минута - по сравнению с несколькими сутками в случае КДИ-индуцируемой. Как видно из приведенных в таблице данных, при использовании КДИ в качестве конденсирующего агента максимальный выход продукта достигается.через 6 суток, однако со временем возрастает и вероятность модификации гетероциклических оснований, что делает использование КДИ нецелесообразным при сборке функционально-значимых ДНИ.

Тяблина 1

Химическое лягирозание в трэхкоыпокентных комплексах

Состав комплексов Нуклеотилные остатки в нике Выхол продукта, %

Номер ВгСМ !(ДИ

1 мин 48 Ч 90 Ч .111.1

(I) (1 + 2р*) / в 07 80 88 90

(II) (2 + Зр*) / 9 Тр*А 51 50 05 75

(III) (16 + ер*) /а Ср*0 42 19 37 30

(IV) (3 4р*) / 16 Ср*А 33 10 12 19

(IV) (3 * 4р") / 1 СрН 19 13 18 20

(V) (15 + 16р*) / 4 Тр'С 79 69 60 07

(V') (15 + 16р") / Ь Тр40 76 75 78 83

(VI) (4 + 5р*) / 15 ар*т 83 60 72 аз

(VI') (4 + 5р*) / 1 88 75 77 88

(VII) (14 + 15р*) / 5 Ср*А 33 16 20 22

(VII») (14 + 15р*) / Ь Ср*А 46 '61 54 57

да (5 + бр*) / 14 Тр^С 31 29 33 39

(ш*) (5 + бр*) / 8 Тр*в ■ 39 34 43 58

(IX) (13 + 14р*) / 6 Ср^А 25 19 20 39

ЦХ*) (13 + 14р*) / с Ср+А 53 30 39 57

(X) (6 + 7р*) / 13 Ар4 С 47 48 52 69

(X') (б * 7р") / в Ар*С 72 38 41 69

(XI) (12 + 13р*) / 7 Ар*А 62 28 34 52

(XII) (7 + 8р") / 12 Ср*0 58 30 33 38

(XIII) (11 + 12р*> / а Тр+Т 81 .66 72 85

(XIV) (8 * 9р*) / ср*а • 50 13 15 17

; (XV) (10 + 11р*) / 9 СрАТ 89 82 89 94

* - Состав комплексов расшифрован па призере (I):

1 1 2 * „ 5' ССТТААСАСООТОр ССТСТТСАСТАТТТТр 3'

(I + 2р ) / в я 3, АТТСТСССАС—ССАСААСТСАТААЛАТООАОЛССОО 5'

о

р* _ 32р-меченная фосфатная груша па 3'-конце соответствующего олигонукпеотида; комплекса, имепяие одинаковые номера различаются только матричпнми олигонуклеотилами. Стрелкой указало место разрыве.

сраышвая соответствующие пари дуплексов, в которых контактируют одни и те ке нуклеотидные остатки в участка "сшивания", оыдо оонаруиено, что изменение длины матрицы оказывает неоднозначное влияние на выход продукта датирования. Причем в случае ВгСН-индуцируемого .цитирования для большинства изученных систем эта зависимость проявляется в меньшей степени в отличие от КДМ-индуцируемого, где о увеличением длины матрицы наблюдается некоторое увеличение эффективности лигирования. Особый интерес представляют комплексы IV, IV; IX, IX' и X, X'. Отметим, что в комплексах IV, IV' и IX, IX' в узле "сшивания" контактируют одни И те же нуклеотидные остатки (СрН). Однако, в комплексах IV, IV при увеличении длины матрицы наблюдается понижение эффективности ХЛ, в комплексах IX, IX' - увеличение. Возможное объяснение этому может быть следующим. В случае первых двух комплексов матричный олцгонуклеотид I (комплекс IV) может образовывать шпилечную структуру, в результате чего участок, комплементарный олигомерам 3 и 4 в месте "сшивания" оказывается вовлечен во внутримолекулярные взаимодействия, образуя стебель шпильки. Вероятно, этим объясняется резкое уменьшение выхода продукта ВгШ-индуцируемого лигирования нри увеличении длины матрица. В комплексах IX и IX' шпилечную структуру с высокой вероятностью может образовывать олигонуклеотид 13. Однако увеличение длины матрицы способствует образованию более протяженного дуплекса (10 н.п. при использовании в качестве матрицы олигомера 6 и 20 н.п. при использовании -олигомера р) именно с этим олигонуклеотидом, что делает комплекс более стабильным, и, как следствие, приводит к увеличению эффективности ХЛ (дня обоих реагентов). Интересно отметить, что этот же олигомер (13) входит также в состав комплекса X, где' также наблюдается уменьшение выхода продукта ХЛ по сравнению с комплексом X', в котором используется Солее протяженная матрица.

Из приведенных в таблице 1 данных видна определенная корреляция в результатах, полученных при использовании обоих конденсирующих реагентов, несмотря на различия в механизме их действия и скоростях реакций. Подобная закономерность отмечалась и ранее для семейства дуплексов, содержащих различные структурные аномалии в реакционном центре. Можно предположить, что одной из основных причин различной эффективности ХЛ является строение "узла сшивания", обусловленное сиквонс-зависимыми 'возмущениями локальной структуры ДНК. Кроме теоретического интереса, исследование зависимости эффективности ХЛ от структуры "узла сшивания" имеет

большое практическое значение, так как позволит ешь пирьд сипл зом планировать оптимальную разбивку целевых ДНК-душижиои и... фрагменты.

В литературе существует несколько гипотез сшшеис заыи.ии 41 вариабельности структуры В-ДНК: локалыше конфсцжшцт.шил: подстройки, смягчающие энергетически невыгодные столкновения иу риновых оснований противоположных цепей (см. правила Каллаиты I, специфическая геометрия стэкинг-взаимодейстьий разных нуклшл-иц 1Ш1 пар, обуславливающая вариации локальных парами трои спирали п торсионных углов углеводофосфатного остова и т.д.

Основным возражением против нашей интерпретации причин .ншл симости эффективности лигирования от природы вэаимод^йслъуедил нуклеотидов является наличие одноцепочачного разрыва, который мч кет нарушить тонкие структурные подстройки, увеличивая отышии свободы ковалентно не связанных фрагментов улд0йод<4осфатны о о<; това. Однако, недавние исследования с помощью ЯЫ1'-спектроскопии высокого разрешения и рентгеноструктурного анализа Ш1к -содириищт и интактных ДШ-дуплексов показали, что одноцепочечный разрыв практически не вызывает искажения структуры ДНК. Логично прецгы лохить, что эффективность ХЛ, непосредственно связанная с конфор• мацией реагирующих фосфатной и гидроксильной групп, должна коррь лировать с локальными параметрами интактных ДНК, характерными дни того или иного динуклеотидного фрагмента.

На основании анализа литературных данных и результатов ХЛ в дуплексах 1-ХУ (табл.1), мы обнаружили общую тенденцию в измени нии некоторых параметров спирали ДНК и колебаниях ьыхода продукта ХЛ.

'Вполне естественно, что это исследование поставило нас пирсц необходимостью корректного систематического изучения зависимости эффективности р от структуры "узла сшивания".

Ответить на некоторые вопросы можно при использовании доста точно простой модельной системы, позволяющей детально исслидоыш. единичный акт "сшивания" двух олигомеров на комплементарной мат рице. В качестве такой системы была ьыорана серия ДНК-души: к си» с единичным разрывом в одной из целей. В состав дуплексов мотни гекса- и ундекануклеотиды, отличащиеся структурой примыкаиадх к разрыву 3'- или 5'-концевых звеньев, соответственно, и комплеиин тарные им тетрадакануклеотиды-матрицы.

-/л— 6 -—--11---сокрвмйой

5' А-С 0-0-А-Х 1 1~С-А-С-С-А-0~Т-()-А-С обо1печотВ1 Т И-С-С-Т-Х'-Т'-О-Т-О-С-Т-С-А-С

-----(4------(6Х + Т1П/14

Модификации в место одноцепочечного разрыва включали:

1) замены нуклеотидов при неизменном положении фосфатной группы!

2) изменение положения фосфатной грунт - 3'- йлй 5'-ко1Шб-

, ■ В8Я!

3) замены нуклеотидов при образовании пирофо'сфатной свя-

' &и.

В качество конденсирующего агента использовался ВгСМ, ».к. им'шно оп пролсташшбтся наиболее перспективным для сборки протя-юшинх ДНК. ,

Полученные после лигирования дуплексы с заменами нуклеотид-гшх пор и ноприродными мекнуклеотидными связями являются интереб-пыми субстратами для изучения функционирования эндонуклеаз реет-ршидая ЕсоЙП и Н7а1, участок узнавания которых заложен в парвич- ^ нпП структуре олигонуклеотидов.

Реакцию ХЛ под действием ВгСИ проводили в оптимальных условиях. Для получения достоверных результатов ХЛ в вышеприведенных ; системах проводилось по 6-8 раз, разброс значений выходов состав- I лял лэ более 5%. :

Результаты ХЛ под действием ВгСМ представлены на рис. Э.

Рио,Э Ьыход продуктов ХЛ в зависимости от природы НУКЛЙОТЦД-ных эваиьав. между которыми образуется новей связь; направление цапн о'.З'. На оси абсцисс показаны лишь яуклеотвди <ХЮ, непосредственно примыкающие к цвету образования связи. Д| система (6Хр + VIТ) ( 14;

, ; В) система (6Х + рУ11) / »4$

01 система (6Хр + рУ1I) / 14.