Клонирование, анализ и экспрессия в гетерологичной системе генов интерлейкина-2 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

институт биоорглническоя химии им. акад. и. и. еиетшм и

Ю. А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Ашшеева Надежда Николаевна

КЛОНИРОВАНИЕ, АНАЛИЗ И ЭКСПРЕССИЯ В ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ СИСТЕМЕ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-Й

02.00.10 Епоорганичестсая хиьмя, химия природных и физиологически активных веществ

/

Авторэфзрат диссертации на соискание ученой степени ' кандидата химических наук

1Ьсква-1993

Работа выполнена в Институте бпооргшшческой злами п;.(. акал- И. 11 Шемякина и Ю. А. Овчинникова

ручная рукоЕодигедь: чхе н -- ко р ре сноп де нт РАН,

доктор химических наук Е. Д. Свердлов

Официальные оппоненты: доктор 0];ологкч9С1шх наук А. а Инее с

кандидат химических наук ЕГ. Коробко

Ведущая организация: ВНИИ генетики и соззкцни

прог-ашленнах иифоорганиашв

Завдста диссертации состоится "¿"¿¿¿>/¿6 1993 г. в /¿^ часов ка заседании Специализированного совета Д С02.35.01 при Институте биоорганической химии vat шгад. 11II Шэшгаша и Mi А. Овчинникова РАН по адресу: 11787J ГСП-7. г. Иэата, В-437, ул. МиклухоЧ^слая, д. 16/10.

С диссертацией иокно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии их», акад. LL11 Сйшгаша и КХ А- Овчинникова РАН

Автореферат разослан.'^7" 1993 г.

- 1 -

Актуальность проблемы.

Йнтерлейкин-2 (IL-2) - антиген-неспецифический лимфокин, синтезируемый и секретируешй зрелыми Т-лимфоцитами после стимуляции аллоантигенаш или митогенаш. IL-2 разнообразно воздействует на клетки преимущественно гематопоэтиуеского ряда, однако его основная функция заключается в регуляции пролиферации и диффзренцировки Т-лимфоцнтов, "что, в конечном счете,, приводит к развитию и усилению иммунного отвеял.'

IL-2 является перспективным терапевтическим средством для лечения некоторых онкологических и иммунологических заболеваний. Из-за низкого уровня биосинтеза iл vivo клиническое применение'!! структурно-функциональные исследовг. ;ия IL-2 стали широко развиваться только после клонирования кДНК и получения рекомбияантного IL-2 (rIL-2). Первоначально для синтеза rIL-2 использовались прокариотические системы. Тем не менее, в прокариотах rIL-2 не подвергается необходим гс посттрансляционн. а модификациям, поэтому для получения IL-2 все чащэ используются эукариотические. системы. Полученный таким способом белок по биологическим свойствам максимально приближается к природному.

В зукариотических системах, в отличие от прокариоти-ческих, возможна экспрессия не только кДНК гена IL-2, но и его хромосомной копии. Транскрипция хромомсомного гена IL-2 в Т-клетках'жестко контролируется с помощью регуляторных элементов, находящихся в его фланкирующих областях и, возможно, инт-ронах. Трудно предсказать, каким образом эти. элементы будут влиять на , экспресс™ хромосомного гена в гетерологичной (не Т-клеточной) системе. Пэзтому клонирование гена IL-2, анализ °го структурных элементов и изучение экспрессии в эукариоти-ческой Системе являются необходимым этапом для создания штаммов-продуцентов IL-2 и изучения механизма функционирования этого гена

Цель работы. •

Настоящая.работа является частью реализуемой в Институте биоорганической химии им. акад. tí. Ц Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН комплексной программы по молекулярному клонированию и экспрессии генов лимфокинов.

В задачу настоящей работы входило клонирование, структурная характеристика хромосомных генов IL-2 быка н человека и

- г -

экспрессия в клеточной системе млекопитающих хромосомного гена IL-2 человека.

Научнря новизна и практическая ценность работы.

В результате проведенных исследований впервые клонирован хромосомный ген IL-2 быка, построена его рестриктпая карта и определена первичная структура 5*-фланкирующей области. Проведен сравнительный структурный анализ этой области для генов человека, мыши и быка, позволивший локализовать потенциальные регуляторные участки хромосомного гена IL-2 быка.

Клонирован хромосомный ген IL-2 человека. Дш экспрессии в клетках млекопитающих на основе ретровирусного вектора созданы конструкции, содержащие ген IL-2 человека с различными по длине фланкирующими областями. Показано влияние этих областей на экспрессию гена IL-2 в миеломной клеточной линии. Получен клеточный клон, конститутивно продуцирующий до 200 ед. биологически активного рекомбинантного IL-2 на 1 мл среды. Сконструированные рекомбинантные плазмиды могут быть испольво* ваны для экспрессии гена 1L-2 человека в трансгенных животных.

Объем работы.

Диссертационная работы изложена на /страницах машинописного текста и состоит из введенйя, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЕ 1. МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ХРОМОСОМНОГО ГШ 1L-2 БЫКА.

1.1. Создание библиотеки генов тимуса быка.

Для создания банка генов использовали фаговый вектор EMBL3. Работу по созданию библиотеки генов проводили совместно с Р. JL Алликметсоы. ДНК выделяли из тимуса индивидуального животного. Средний размер полученных фрагментов ДНК составлял около 100 т. п. о. Выделенную ДНК частично гидролизовали рест-риктазой Sau3AI. Условия расщепления подбирали таким образом, чтобы длина основной пассы фрагментов находилась в пределах . 10-20 т. п. о. врагмэнты ДНК нужного размера получали из рест-риктной смеси центрифугированием в градиенте плотности сахаро-

вы.

Выделенные фрагменты дотировали с ДНК бактериофага EMBL3, предварительно гидролизованной рестриктазой BamHI. Образовавшиеся кошсатамеры упшсовывали In vitro в экстрактах, содержащих все необходимые компоненты для сборки частиц бактериофага (1сроые ДНК). Эффективность упаковют составляла 5x1060.о.е. на 1 шсг ДНК вставки. Неспецифический фон при высеве чистой упа-ковочгой смеси Оьш равен 1-5% от этой величины.

Клонотеку высевали на чалки Петри диаметром 9 см с плотностью 5x10^ б. о. е. на чашку. В качестве хозяина использовали клетки штамма DP50. Чашки инкубировали при 37°С 12-16 часов до появления фаговых бляшек. Полученная библиотека : энов содержала около 1,5x10е независимых рекомбинантных клона

После С1фининга кланотеки фаги элгаировали и хранили при 4° С с добавлением хлороформа

1.2. Поиск клоков, содержащих последовательность гена IL-2 быка.

Для клонирования гена IL-2 быка использовали две независимые библиотеки генов быка Первой скргаировали клонотеку, любезно предоставленную Городецким С. И. (Институт общей генетики mi Ей. Вавилова РАН). Клонотека была подучена из ДНК молочной авлезы в фаговом векторе EMBL4.

Скрининг библиотек проводили гибридизацией in situ бляшек бактериофага с радиоактивно меченной пробой, причем однократно анализировали не менее 1,5x10 рекомбинантных шона Для синтеза радиоактивной пробы использовали одкоцепочэчную форму ре-гоыбинантного фага ШЗпрЭ, содержащего EeoRI-Sal I фрагмент кДШ IL-2 человека длиной около 500 п.о. (фаг любезно предоставлен Греноы Э. Я. , Институт органического синтеза Академии наук Латвии, Рига). Фаговую ДНК отжигали с избыпшм праймера для секвенирования, после чего синтезировали вторую цепь ДНК фрагментом Кленоза ДНК-полимерааы I в присутствии одного печеного нуклеозидтрифосфата Условия реакции подбирали такиы об-разои, чтобы длина вновь образованной цепи не превышала раэые-ра клонированной кДНК IL-2. Цепи разделяли электрофорезом в полнакрилайндном геле в денатурирующих условиях. Удельная ра-

а

диоактивность элшро?анной меченной цепи достигала 1x10

имп/мин на 1 мкг ДНК.

Использование одноцепочечного зонда исключает самогибридизацию радиоактивных цепей в растворе, что приводит к повышению чувствительности гибридизации. Это особенно важно в данном случае, поскольку использовался зонд с неполной гомологией (гомология между нуклеотидными последовательностями кодирующих областей IL-2 быка и человека составляет около 80%).

Первичным скринингом банка было выявлено пять гибридизую-щихся клонов, из которых затем выделили ДНК ДНК каждого клона расщепляли рестриктазами EcoRI и HindIII. Полученные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нит-роцеллюлозные фильтры и гибридизовали с радиоактивно меченными олигонуклеотидами. В работе использовали два олигонуклеотидных зонда N1 и С1 (табл. 1), комплементарных соответственно 5'- и 3'-областям кДНК IL-2 быка. Оказалось, что ни один из выделенных клонов не содержит последовательности, кодирующей N-конце-вую область гена IL-2. '

Для поиска недостающей части гена использовали полученную наш тимусную геномную библиотеку. Гибридизационный анализ этой библиотеки проводили до ее амплификации. Это повышает вероятность нахождения N-концевого фрагмента гена IL-2, который может теряться в процессе амплификации клонотеки.

Табл. 1. Олигонуклеотидные зонды, использованные для выделения и клонирования гена IL-2 быка.

Название олигонук- леотида Последовательность Координаты по последовательности КДНК IL-2 быка

N1 TTA0TGCAATGCAAGACA 61-68

С1 TTTGACAAAAGGTAATCCAT 458-478

N2 CCTACTTCAAQCTCTCAGGQSAAC 94-119

N3 CTTCTTTCATTCTCTTCCCCGTAG 108-132

Для получения радиоактивной пробы использовали два синтетических частично комплементарных друг другу олигонуклеотида N2 и N3 (табл.1). Олигонуклеотиды отжигали и достраивали некомплементарные 5'-концу фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии двух меченых нуклеозидтрифосфатов. Удельная радиоактивность полученного таким образом зонда достигала 2x10 имп/мин на 1 мкг ДНК.

В гезульгате первичного скрининга биб^лотеки тимусной ДНК было обнаружено пять гибридизующихся клонов. При вторичном рассеве положительные клоны анализировали с помощью двух зондов: N1 и С1. Четыре клона скринированной библиотеки гибридизова-дись только с зондом N1, и один клон - с дг мя зондами. В дальнейшем исследовали только этот клон, названный 28RbIL2.

. 1.2. рестриктный анализ хромосомного гена IL-2 быка.

Для получения общей информации о структуре геномн. А вставки рекомбинантного фага 28RbIL2 провели физическое картирование ДНК этого фага рестриктазами EcoRI, HindiII, BamHI. Первоначально фаговую ДНК расщепляли каждой рестриктазой из выбранного набора ферментов, а затем различными их комбинациями по две. Размеры получаемых в результате гидролиза фрагментов ДНК сильно варьировали, что затрудняло их качественное разделение в одном агарозном геле. Поэтому, для одновременного выявления всех рестриктных фрагментов и более точного определения их размеров один из электрофорезов провели в градиентном по толщине геле 0,5Х агарозы. Для получения дополнительной информации о взаимном расположении рестриктных фрагментов в ДНЙ-вставке использовали блот-гибридизацию с олигонукдеотидны-ми зондами N1 й 01.

Обработку данных проводили с помощью компьютерной программы рестршшгаго картирования RESMAP, созданной Д. А. Ивановым (Институт Сиоорганической химии им. акад. М. Ц. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Шстроенная таким образом рестриктная карта гена IL-2 быка представлена на рис. 1.

1.3. Определение последовательности нукдеотидов 5'-фланкирующей области гена IL-2 быка.

Последовательности генов IL-2 человека и ыыеи наиболее

в

и

1 kb

Е Е Н

Н

Н

Н

Е Е Н

IL 2

Рис. 1. Схема локуса гена 11-2 быка. Черным прямоугольником выделен ген 1Ь-2 быка, указаны сайты узнавания рестриктаз ВапШ (В), Н1п<И11 (Н), Еоой! (Е).

консервативны в области, расположенной слева от сайта инициации транскрипции и охватывающей около 500 п. о. Высокая степень гомологии предполагает,.что данная область играет важную функциональную роль в регуляции транскрипции гена IL-2, поэтому одной из задач данной работы было определение последовательности нуклеотидов 5'-фланкирующей области гена IL-2 быка.

Для клонирования 5'-концевой области гена IL-2 быка фаг 28RbIL2 расщзпляли рестриктавой Pstl. Фрагмент длиной около 6 т. п. о., гибрндизующийся с эондами N1 и С1, клонировали по Pstl сайту вектора pUC181. ДНК полученной рекомбинантной плазмиды гидролизовали рестриктазой Alul. Рестриктные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозе и гибрвдизовали с радиоактивно меченным зондом N1. фрагмент длиной около 700 п.о., содержаний согласно данным гибридизационного анализа N-концевую часть гена, субклонировали в плазмиде pUC18. Полученный Alul фрагмент гена и его Alul-Xbal субфрагмент переклонировали в фаговые векторы М13пр8 и ШЗгпрЗ. Определение нуклеотидной последовательности этих фрагментов проводили методом Сэнгера.

Секвенированная последовательность (рис.2) длиной 646 п. о. представляет собой 5'-фланкирующую область гена IL-2 быка от положения -533 до +112 относительно предполагаемого начала транскрипции. Транскрибируемой последовательности предшествует промоторный элемент TATA бокс, расположенный на 24 п. о. левее кэп-сайта мРНК.

- ? -

м .... T... TG.... 66.......-

• 6 CAffiTCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCTCAGTCATCGTGGAGATAAAAGGTAAAG

. ч ____T... T..............A

....".ТС. A...G...........С........С.................GG.......

-473 CCATCCTGGAACAGAAACCAATATTCTTCGTGTTTAATCAACAAATCTAAAA ATTTATTC .. CGT... A..............CA..........................С......-

...... T____С. С......C8. CG.............G. С----T-— G----A. G. T

-413 TTTTCAACTATTTACTCTTGTTCTTGTCCACCACAACATGGTGCTCCACATGTTCCGCAC ......T.. G..........С......T........T... С. -A. T.........A. TGT

G.........С........CA..........ТТ. С......G..T.......

-353 AGTTTTATGATAAAGAGAAATTTTTCATGAGCCATTTTTGTATCCCCACCCCCTTAAAGA ..........С.........Л.____-....ТТ. С.........................

NFAT-1 NF-IL2A ..............ТТ. TG.......GA.........А.........:..А...... С..

-293 AAGAG6SÄHIAAAAACT GT T Т С AT AC AG AA6GCGT TAGT TGT AT G AAT T AGAÀCT GG ACC ..—................................А... С..........G. AT____

NF-*B AP-1 ____A.........ccca...................................A... -.

-233 TAAGTGTGGGCTAATGTAACCAAGAGGGATTTCACCTAAATCCATTCAGTCAGTTTATGG ....................A.................С...............C.T...

AP-1

.........с........a.....................с.........а.... с...

-173 GGGTTT AAAGAAAT T CCAAAGAGT CAT СAGAAGAGGAAAAAT AAAGGT AAT GCT T TT T GG ..........................................G.........T.....—

NF- IL2A

............C.....T. ..A.....................CG.............AT

-113 cacacaggtagmtctttgaaagtatgtgtmtatgtâaaaSàttttgacacccccatca .. a......a. а........a...................................a.

...........с.....С............С.. С. А.. С. GA... a . G......АС. С.

-63 TATTTTTœAQMTTAAMt^MTTGCTTCrrCTTGTTCTAGAACTTCCT^CrrœTT .................с............А..........А...СТ. С......АСТС.

- 8 - '•

TG.........С........GG......G......AGGC

9 CTTCTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCACA ATG TAC AAG ATA CAA ..T................................... Met Туг Lys Ile Gin

64 CTC TTG TCT TGC ATT GCA СТА ACT CTT GCA CTC GTT GCA AAC GGT Leu Leu Ser Cys He Ala Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Asn Gly

108 GCA CCT Ala Pro

Рис. 2. Последовательность гена IL-2 быка от -533 до +108 и ее сравнение с последовательностями генов IL-2 мыши и человека Точками указаны идентичные нуклеотиды, дефисом - деле-ции. Прямоугольником выделены "ТАТА"-бокс и начало транскрипции. фямой линией указаны связывающие сайты для NFAT -1, АР-1 NF-ЯВ, и NF-IL2A.

Последовательности кДНК IL-2 быка, опубликованные ранее, различаются фрагментом длиной 30 п. о., включающим часть 5" -нетранслируемой ' последовательности и начало кодирующей области (9 п. о.). Приведенная нами структура гена IL-2 в спорной области полностью согласуется с данными Cerreti D.P. et al, 1986.

Расположенная слева от начала транскрипции область длиной 500 п. о. высоко консервативна для генов IL-2 быка, мыши и человека Степень гомологии этой области мелщу генами IL-2 быка и человека составляет 91Z, между генами быка и мыши - 87Z, в то время как для кодирующих областей соответственно 79 и 65Z. Такая высокая консервативность 5'-фланкирующей последовательности свидетельствует о том. что эта область играет существенную роль в ДНК-белковых взаимодействиях, необходимых для регуляции гена IL-2.

Область гена IL-2 человека от -326 до -52 является инду-цибельным энхансерным элементом. В данной области гена обнаружено и локализовано несколько сайтов связывания белков, участвующих в регуляции транскрипции гена IL-2. К таким белкам относятся NF-cB и AP-1-подобные факторы, NFAT-1, NF-IL2A.

Белей АР-1 и NF-£B найдены в клетках различных типов, а их связывающие сайты обнаружены в промоторных областях многих индуцибельных генов. Для генов IL-2 быка, мыши и человека сайты связывания этих факторов (в случае АР-1 их два) полностью консервативны.

Последовательность NF-IL2A сайта содержит участок, гомологичный октамерному энхансерному элементу промоторной области иммуноглобулинов (Oct-1). Фактор NF-IL2A, так же как и АР-1, имеет в рассматриваемой области гена IL-2 два сайта связывания. Ближний NF-IL2A сайт консервативен для всех трех последовательностей, в то время как последовательности дальнего сайта различаются по нескольким нуклеотидам.

Связывающий сайт фактора NFAT-1, присутствующего только в активированных Т-клетках, тага® высококонсервативен, хотя гомология и не является полной.

Следует отметить, что все рассмотренные сайты связывай: л регуляторных белков высоко консервативны не только по последовательности, но и по расположению в 5'-фланкирующей области.

Консервативность 5'-фланкирующей области на всем протяжении от -1 до -497, возможно, обусловлена существованием еще неидентифицированных сайтов связывания регуляторных белков.

Левее нуклеотида -497 последовательности '5'-фланкирующих областей ' гена IL-2 человека и быка практически негомологичны. Вероятно, указанный участок последовательности не играет существенной роли в регуляции экспрессии гена IL-2.

2. ЭКСПРЕССИЯ ХРОМОСОМНОГО ГЕНА IL-2 ЧЕЛОВЕКА В ГЕТЕРОЛО ГИЧНОЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ.

2.1. Клонирование хромосомного гена IL-2 человека.

Для поиска клонов, содержащих ген IL-2 человека иепольаова-ли две библиотеки генов человека: клонотеку, полученную из ДНК гепатомной клеточной линии Alexander в фаговом векторе Харон 4А и плацентарную библиотеку, получешую в фаговом векторе EM8L3 Алликмэтсом Р. Л. Скрининг библиотек проводили по стандартной методике с поиоцыэ радиоактивно печенной IL-2 пробы, приготовление которой описано в разделе 1.2. В качестве матрицы для синтеза зонда использовали рекомбинантньй фаг ШЗпрИ,

содержащий С-концевой фрагмент кДНК IL-2 человека, ffiar был предоставлен Греном Э. Я. (Институт органического синтеза Академии наук Латвии, Рига).

Из каждой библиотеки выделили по одному гибридизующеыуся

клону. ДНК индивидуальных клонов , картировали рестриктазами

ли

EcoRI, Hindi II, BamHI, Sali, аназируя полученные фрагменты электрофорезом в агарозном геле и блот-гибридизацией по Сау-верну с радиоактивно меченным IL-2 зондом.

Анализ показал, что клон из плацентарной библиотеки (R14/1IL2) содержит только С-концевой фрагмент гена IL-2, в состав которого входит часть второго и третий интроиа, третий и четвертый экзоны и 3'-фланкирующая область. Кдон из гепатом-ной библиотеки (A21/3IL2) содержит полный ген IL-2 с 5'- и 3' -концевыми областями, и его рестриктная карта. совпадает с данными, опубликованными ранее (рис. 3).

н-

Е Е Е Е.

1-1

н н 1 1 н 1 Н I

LJ- -в—i® 1

1 КЬ

ДЯ1/3112

ЙМ/1JL2

Рис. 3. Схема локуса гена 11,-2 человека, а - вставка ре-комбинантного фагового клона А21/31Ь2, б - ЯИ/Шг. На рисунке выделены экзоны гена И.-2, указаны сайты узнавания рестрик-таз ЕсоЯКЕ) и Н1пс111 К Н).

2. 2. Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии гена IL-2 человека.

Одной из перспективных систем для экспрессии клонированных генов в эукариотических клетках являются векторные системы на основе ретровирусов. Удобными для таких исследований ретрови-русы стали благодаря небольшому геному, наличию мощных транскрипционных энхансеров и стабильной интеграции в геном гаетки-хозяина.

Для экспрессии хромосомного гена IL-2 человека мы использовали ретровирусный вектор pPSneo (рис. 4д), созданный в Институте молекулярной биологии им. ЕА. Энгельгардта РАН (Прасолов и др., 1988).

IL-2 относится к индуцибельным, псанеспецифическим белкам, синтез которых in vivo тонко регулируется. Для достижения высокоэффективной гетерологичной экспрессии многих генов, обладающих специфическими регуляторными последовательностями, ' часто необходимо удалять реальные или потенциальныё регулятор-ные элементы. ...

При конструировании рекомбинантных'плазмид для экспрессии гена IL-2 в эукариотической системе учитывали данные о том, что:

1) неамплифицированные или слабо амплифицированные векторные системы (к катам относятся и ретррвирусные векторы), содержащие ген IL-2, дают низкий уровень экспрессии, близкий к фоновому, причем индукция не влияет на количество продуцируемого белка. Причиной этого молзт быть наличие на 5'-конце гена IL-2 области, отвечающей за индуцибедыгость и ткаиеспецифичность его экспрессии.

2) присутствие .ТАТТ-повтора, расположенного в З'-нет-ранслируемой области гена IL-2, понижает стабильность мРНК IL-2 и, следовательно, количество продуцируемого Селка.

Поэтому на основе вектора pPSneo нами была создана серия констругащй, содержащих ген IL-2 с различными по длине 5'- и 3' -фланкирующими областями.

Фланкирующие последовательности гена IL-2 удаляли с помощью рестриктаз Stul, Dral и Mnll. Клонирование необходимых

фрагментов гена проводили в несколько этапов, поскольку эти рестриктазы имеют несколько участков расщепления в исходном фрагменте гена Схема конструирования рекомбинантных плазмид представлена на рис. 4.

рРБпео

ВатМ

-»

ЕсоК1

,. 1 ВатН1'

рРБОЕ 11.-2 ВотН1,В*Л(дос«») " рр$ЕЦ-2

ВдШ -Нра1 БоИ

рис 18

*.рРГОИ-2

pDNJL-2

Mull

Hinfl

pDNIL-2

Htmi.aai

PEIL-2

Hpai,ClaI (S9p.)

Psl!.Hin»l

Pstlflal

pBluescript

BomHl . Clal. I pBMHCIL-2

ВатМ.фрКтнс&а, Clal (нфр.)

EcoRl

pDSlL-2

Kpnl, EccRI(M.9f)

KpnI.EcoRIIff.q-p-)

Kpnl.' Sail

>pPSMSIL-2

Рис. 4. Схема конструирования рекомбинантных плаамид (а - рРБЕНг и рРЗЕ1Ц2, б - рРЗБШЗ, в - рге031Ь2, г -рРЗКБ1Ь2). Заштрихованным прямоугольником обозначена 5'-фланки-ругацая область гена 11-2, светлым - 3'-фланкирующая область, темным - кодирующая часть гена

- 14 - '

Практически все фрагменты ДНК, необходимые для лигирования, выделяли из смеси рестриктных фрагментов с помощью электрофореза в 0.8Х легкоплавкой агарозе с последующим замораживанием- оттаиванием вырезанных полос геля. Клоны, содержащие необходимые фрагменты гена IL-2 человека, чаще всего идентифицировали гибридизацией с радиоактивно меченными синтетическими олигонуклеотидами из N- и С-концевой области гена (соответственно d(ACACAGCTACAACTGGAGCAT) и d(ATTTTTCTTTTATAGGGATCT)). Для дальнейшей работы рекомбинантные ретровирусныэ плазмиды амплифицировали в клетках £ coli и векторную ДНК очищали " ■ градиенте CsCl.

Таким образом нам удалось получить 5 конструкций с геном IL-2 (рис. Б).

Плазмиды pPS0EIL2 и pPSEIL2 содержали ген IL-2 с протяженными фланкирующими областями и отличались ориентацией гена относительно ретровирусного LTR.

Плазмида pPSDIL2 включала в себя ген IL-2, укороченный с 5'-конца до положения -164 (относительно начала транскрипции), т. е. была удалена часть знхансера гена IL-2.

Плазмида pPSDSIL2 содержала геи IL-2 с укороченными б'- и 3'-концевыми областями от положош® -164 (относительно начала транскрипции) до положении 5031, то есть от Dral до StuI сайтов. В состав удаленной 3'-фланкирующей области входили сайт полиаденилирования и ТАТТ-повторы.

Плазмида pPSKEIL2 содержала фрагмент гена IL-2 от Ш11 сайта в положении 276 до StuI сайта в положении 5031, т.е. Б'-и З'-нетранслируемые области гена были удалены.

2;3. Экспрессия гена IL-2 человека в шеломной клеточной линии.

Влияние фланкирующих последовательностей гена IL-2 на эксперссию маркерных генов в Т-клеточной системе достаточно хорошо исследовано. Тем не менее, вопрос о том, каким образом фланкирующие последовательности будут влиять на экспрессию гена IL-2 в гетерологичной (не Т-клеточной) системе остается открытым.

Е В Е ■-—на-ю- PPSEIL2

а

Е Е Е КИ-и--—в-|ш-- PPS0EIL2

DE Е

5 L-EJ8—1—Ш-ai? PPSDIL2

о в е.

6 4I3-I—-ri PPSDSIL2

' м • Е SI

г . fe-s—o-a--$ PPSMSIL2

. Piîc. 5. Схематичесгое изображение рекомбинантных ретрови-русных плазмид, содержащих геи IL-2 человека Структура вектора pPSneo (д) изображена согласпо работе Прасолова Е С. и др., 1988. Заштрихованным прямоугольником изображена 5' -пет-рапсллруемэя область гена, темпын - кодирующая часть гена, светлым - З'-нетраислируемая область. Указаны участки узнавания рестршстаз EcoRI(E), Dral(D), StuI(S), !/л11(М).

Для экспрессии .гена IL-2 в составе полученных рекоыби- -нантных ретровирусных плаамид мы использовали миеломную В-клеточную линию X53Ag8-653. Плазмидную ДНК трансфицировали в клетки методом элекгропорации. Для повышения эффективности трансфекции плазмидную ДНК предварительно линеаризовали рест-риктазой Pvul. Через 48 часов после трансфекции производили замену среды на селективную, содержащую антибиотик >418. Культуральную среду меняли.каждые 3 дня в течение 2-3 недель, после чего селективное давление снимали.

Биологическую активность IL-2 в культуральной жидкости . выросших клонов определили с помощью стандартного, теста, основанного на пролиферации IL-2-вависишх клеточных линий CTLL или НТ-2. Для количественной оценки сравнивали тестируемые образцы IL-2 с международным стандартом (BRMP Reference • Reagent). В качестве отрицательного контроля использовали культуральные жидкости исходной клеточной линии и клеток, трансформированных ретровирусным вектором pPSneo.

Для каждой из плазмид получили от 5 до 15 первичных клонов. Биологически активный IL-2 был обнаружен толы to в культу-ралъных жидкостях клеток, трансфицированных плазыидаш PPSDIL2, pPSDSIU И PPS1.SIL2 (табл. 2).

Клетки, трансфииироЕанные плазмидами pPSEIL2 и PPS0EIL2, не секретировали IL-2 даже после стимуляции конканавалином А или фитогемагглкпинином. Клетки, котрансфицированные плазмидами pEIL2 и pPVneo, в состав которых входят соответственно ген IL-2 с фланкирующими областями и ген Neo, также не секретировали IL-2.

Вероятно, что конститутивная экспрессия хромосомного гена LL-2, входящего в состав этих пльъмид, блокируется на .-ровне транскрипции с помощью регуляторных элементов 5'-концевой области гена. Индуцированная экспрессия не наблюдается из-за отсутствия в В-клеточной системе необходимых факторов регуляции транскрипции, имеющихся в Т-клетках.

Шсле удаления фланкирующих областей (рР£>Ш1Ь2), когда ген IL-2 находился под контролем только ретровирусных регуля-• торных элементов, наблюдалась конститутивная экспрессия IL-2.

При сохранении части 5*-фланкирующей области гена (от -164 до ATG кодона), включающей в себя промотор гена 1L-2 и

■ - 17 -

Табл. 2. Продукция биологически активного 1Ь-2 клонами, полученные; после трансфекции рекомбинантных плазмид в клеточ-нук) линию Х63Л^8-653.

рРБ01Ь2 рРЗББШг рРЭМ51Ь2

Клон биол. акт., Клон биол. акт., Клон биол. акт. ,

ед/мл ед/мл ед/мл

2.1В4 42 3.103 10 4.1В5 2

2.1С2 2 3.104 2 4.105 8

'2.1СЗ 2 3.1С5 2 4.1С2 15

2.1С4 5 3. 2В4 10 4.2С4 15

2.1С5 25 3.203 30 4.3ВЭ 10

З.ЗСЗ 200 4.3В4 8

3. 304 4

3.4Б4 4

*В качестве контроля использовалась культуральная среда исходной клеточной линии и клона, полученного после трансформации этой линии ретровирусным вектором рРБпео. Приведены данные для клонов, секретирующих более 1 ед. 11-2 на 1 мл; при этом уровень фона не превышал 0,1 ед/мл.

часть индуцибельного энхансерного элемента, экспрессия тага® была конститутивной.

Уровень экспрессии (рРБ01Ь2 и рРБ031Ь2) не зависел от наличия или отсутствия 3*- фланкирующей области, хотя делеция этой области в последовательности кДНК 11.-2 из-за повышения стабильности мРНК ведет к значительному (на 1-2 порядка) увеличению количества секретируемого продукта Не исключена возможность того, что некоторые элементы 3'-фланкирующей последовательности участвуют р процессах регуляции экспрессии 11.-2 на уровне транскрипции. Подтверждением этого предположения являются данные о вероятном участии АТ-богатого мотива З'-нет-ранслируемой области в изменении структуры хроматина

Уровень конститутивной экспрессии 11-2 в полученных клеточных клонах не зависел от стимуляции митогенами.

- 18 - •

Таким образом, экспрессия хромосомного гена IL-2 в гетеро-логичной системе при использовании неамплифицированных векторных систем дает низкий уровень конститутивной экспрессии. Эти данные согласуются с ранее опубликованными. Однако в нашей системе уровень экспрессии не изменяется при удалении 3'-регуляторных участков гена ÍL-2.

Аыплифицированный хромосомный ген IL-2 эффективно экспрессируется в гетерологичной (не Т-клеточной) системе под своим собственным промотором. Неясно, является ли конститутивная секреция IL-2 в этом случае результатом перегруппировки некоторой части последовательностей гена во время амплификации, или сама амплификация приводит к нарушению механизма регуляции экспрессии гена IL-2. С этой точки зрения было бы интересно использовать полученные в данной работе конструкции с геном IL-2 для экспрессии в векторной системе с высокой копий-ностыа

Конструкции pPSDIL2, pPSDSIL2 и pPSívSIL2 также могут быть использованы для экспрессии IL-2 в трансгенных животных.

Для получения индивидуальных линий клеток первичные клопы 3.1ВЗ, 4. 2С2, 4.2С4 и 4. ЗВЗ, продуцирующие биологически-активный IL-2, дважды клонировали методом лимитирующих разведений. Полученные таким образом клеточные линии сохраняли способность продуцировать IL-2 в течение 4 месяцев. Для клеточной линии VIlIaE6/E7, полученной из первичного ююна 4. ЗВЗ, исследовали зависимость количества секретируемого IL-2 от времени культивирования клеток. Как следует из рис. 6, на седьмой день выращивания' этой линии кульгуральная среда содержит около 200 ед. на мл рекомбинантного IL-2.

Сходный уровень секреции ».аблвдался у фибробл- зтов, трансфицироврчных ретровирусным вектором pPSnao, содержащим кДНК IL-2 (Bubenik J. et al, 1988). Т-клеточная линия Jurkat, которая ранее широко использовалась для выделения природного 1L-2 также продуцирует аналогичные количества белка после стимуляции митогенами. Преимущество полученной нами линии, продуцирующей IL-2, заключается в отсутствии стимулирующих агентов и возможности культивирования в бессывороточных условиях. Это позволяет использовать д иную клеточную линию как источник IL.-2 для культурадьних работ.

биолокт. Л.-2(рд /мл)

2 4 'б. бремя-(сутки)

Рпо. б. Зависимость уровня продукции 11-2 от времени культивирования клеток ¡слона УШаЕб/Е7. Клетки (2х1С$ помещали в 1 ил свежа среди (в 24-луночном платгэте) и инкубировали в течение определенного периода времени, после чего определяли . биологическую активность 1Ь-2 в культуральиоЯ гидиости.

- 20 -ВЫВОДЫ.

1. Впервые выделен и клонирован ген 11,-2 быка. Проведено рестриктное картирование локуса гена 1Ь-2 быка. Определена й проанализирована первичная структура Б'-концевой области гена 1Ь-2 быка

2. Вьщелен, клонирован и охарактеризован хромосомный геи 1Ь-2 человека с фланкирующими последовательностями.

3. Создана серия зкспрессирующнх конструкций, содержащих ген И-2 человека с различными по длине фланкирующими областные

•Показано влияние этих областей на экспрессию гена 1Ь-2 в гете-рологичной клеточной системе. Получена клеточная линия, стабильно продуцирующая около 200 ед. рекоыбинантного 11.-2 на 1 их среды.

Основные результаты диссертации опубликованы £ елвдущях работах:

1. Виноградова Т.а , Аникеева ЕЕ Геномные варианты человеческих ^-интерферона и интерлейкина-2 и ген интерлейкина-2 быка. - Тезисы симпозиума "Структура, биосинтез и функция молекулярных элементов иммунной системы", 1987 г., с. 78.

2. Аникеева Е Е , Виноградова Т. Е , Дементьева Е. С., Ибрагимов А. Р. Влияние' фланкирующих областей на экспрессию хромосомного гена интерлейкина-2 человека в мышиной ыиедоыной клеточной линии. - Биоорг. химия, 1991, Т. 17, N 9, с. 1223-1828.

. Последовательность куклеоткдов . о'-фланкирующей области гена интерлейкинр 2 быка зарегистрирована в банке данных ЕМВ1_ Регистрационный номер Ъ-£Лб£<

¡Годилсаио в печать 13.04.33 г. Зак. 741. гзрмат б 1х 51/16. Тир. НО.

Мог-ква. Т' -.ография Р»СХН