Исследование новых растительных липид-транспортирующих белков

Мельникова, Дарья Николаевна

Исследование новых растительных липид-транспортирующих белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Мельникова, Дарья Николаевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Исследование новых растительных липид-транспортирующих белков»

Автореферат диссертации на тему "Исследование новых растительных липид-транспортирующих белков"

На правах рукописи Л?

Мельникова Дарья Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ НОВЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИХ БЕЛКОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ДЕК 2013

005543080

Москва-2013

005543080

Работа выполнена в Учебно-научном центре Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор химических наук Овчинникова Татьяна Владимировна Официальные оппопенты:

Кочетков Сергей Николаевич, доктор химических наук, член-корреспондент РАН, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта Российской академии наук.

Градова Нина Борисовна, доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И.Менделеева».

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук.

Защита состоится 23 декабря 2013 г. в _ х)в на заседании

Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Федеральном, государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

Автореферат разослан ю ноября 2013 г. Ученый секретарь

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Растительные липиды и их производные являются мультифункциональными соединениями и принимают участие в биогенезе мембран, дифференцировке клеток, межклеточной и внутриклеточной сигнализации, создании водоотталкивающих и термоизоляционных покровов, защищающих растение от механического повреждения, воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды и проникновения патогенной микрофлоры, а также выполняют запасающую и энергетическую функции. Важную роль в метаболизме липидов у растений и животных играют белки, связывающие липидные молекулы и обеспечивающие их внутри- и внеклеточный транспорт. В растениях обнаружено несколько классов белков, выполняющих разнообразные функции, но обладающих общим свойством -способностью связывать и переносить липиды и их производные. Один из наиболее функционально значимых классов подобных белков составляют липид-транспортирующие белки (Lipid Transfer Proteins или сокращенно LTP).

LTP - небольшие катионные белки, обладающие способностью обратимо связывать и переносить гидрофобные молекулы in vitro. LTP растений относительно стабильны, хорошо растворимы в воде, устойчивы к тепловой и химической денатурации, а также к действию протеолитических ферментов. Данные белки участвуют во многих биологических процессах в растениях, таких как биосинтез кутина, эмбриогенез, адаптация растений к действию стрессогенных факторов окружающей среды. Предполагается, что LTP, подавляющие рост фитопатогенных бактерий и грибов, являются важным элементом защитной системы растений.

ИзучеЕше LTP растений представляет большой интерес в связи с возможностью их практического применения в сельскохозяйственной отрасли для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями. Использование методов ротационного земледелия и

традиционной селекции, направленных на получение устойчивых культур, а также применение химических средств защиты растений не всегда оказывается эффективным и не соответствует требованиям экологической безопасности. Одним из перспективных направлений повышения урожайности сельскохозяйственных культур представляется создание трансгенных растений, обладающих устойчивостью к фитопатогенным микроорганизмам и действию разнообразных стрессогенных факторов окружающей среды.

Важной задачей современной фармацевтической биотехнологии является создание новых лекарственных средств, которые должны прийти на смену традиционно используемым лекарственным препаратам, часто характеризующимся немедленным и неконтролируемым высвобождением действующего вещества. Способность растительных LTP связывать и переносить липидные молекулы делает возможным их применение в качестве лиганд-связывающих белков для создания систем доставки лекарственных средств.

Некоторые представители класса LTP являются аллергенами, ответственными за.развитие аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важной фундаментальной задачей экспериментальной медицины, решение которой, с одной стороны, обогащает наше представление о причинах и механизмах развития аллергии, с другой стороны, имеет важное прикладное значение. Природные и рекомбинантные растительные аллергены, а также их гипоаллергенные аналоги могут стать основой для создания современных диагностических тест-систем и аллерговакцин, предназначенных для профилактики и лечения аллергических заболеваний.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в поиске, выделении и структурно-функциональном исследовании новых липид-транспортирующих белков

растительного происхождения. В качестве объектов исследования были выбраны распространенные во многих странах, но малоизученные культуры -укроп огородный Anethum graveolens L. [класс - двудольные (Dicotylédones), порядок - зонтикоцветные (Apiales), семейство - зонтичные (Umbelliferae) или сельдереевые (Apiaceae), род - укроп (Anethum L.)] и чечевица обыкновенная Lens culinaris subsp. culînaris [класс - двудольные (Dicotylédones), порядок -бобовоцветные (Fabales), семейство — бобовые (Fabaceae) или мотыльковые (Leguminosae), род - чечевица (Lens)]. Исследования были направлены на поиск, выделение и очистку, изучение структуры и биологической активности растительных липид-транспортирующих белков, а также на разработку биотехнологических способов получения рекомбинантных LTP и их меченных стабильными изотопами аналогов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- поиск новых липид-транспортирующих белков;

- разработка методик их выделения и очистки;

- определение полных аминокислотных последовательностей и структур кДНК, кодирующих предшественники новых LTP;

создание систем для гетерологичной экспрессии липид-транспортирующих белков;

- получение рекомбинантных LTP и их меченных стабильными изотопами аналогов;

- структурно-функциональная характеристика выделенных белков.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В ходе проведенной работы выделен новый липид-транспортирующий белок Ag-LTP из листьев и стеблей укропа огородного Anethum graveolens L. Разработаны биотехнологические способы получения рекомбинантных Ag-LTP из укропа огородного Anethum graveolens L. и Lc-LTP2 из чечевицы

обыкновенной Lens culinaris. Проведено сравнительное исследование антимикробной активности Ag-LTP и Lc-LTP2, а также способности этих липид-транспортирующих белков связывать различные липидные молекулы. Получен рекомбинантный аналог Lc-LTP2, тотально меченный стабильным изотопом 15N, необходимый для установления пространственной структуры липид-транспортирующего белка чечевицы.

Полученные результаты обогащают наше представление о разнообразии растительных липид-транспортирующих белков и могут стать основой для дальнейшего детального изучения молекулярных механизмов их антимикробного действия и образования комплексов с липидными молекулами с целью практического применения в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Связь работы с научными программами.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы (соглашение № 8043 от 20.07.2012 г.), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 12-04-01224 и № 13-0800956) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа У.М.Н.И.К.-2012).

Апробация работы и публикации.

Результаты исследования были представлены на 38-ом конгрессе ФЕБО (Санкт-Петербург, 2013), V, VI и VII Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011, 2013); XXI-XXV зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 20092013); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения

академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009); Международной научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), Осеннем финале программы «У.М.Н.И.К.» РАН (Москва, 2012). По теме диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 124 страницах; содержит 18 рисунков и 8 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка, включающего 295 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выделение и структурная характеристика нового липнд-транспортирующего белка Ай-ЬТР из укропа АпеЛит graveolens.

Новый липид-трансиортирующий белок, названный Ag-LTP, был обнаружен и выделен из листьев и стеблей укропа огородного АпеЛит graveolens. Исходный препарат был получен в результате гомогенизации зеленых частей укропа в жидком азоте и экстракции буферным раствором (10 мМ Ка2НР04, 1,8 мМ КН2Р04, 3 мМ КС1, 140 мМ ЫаС1, 5 мМ ЭДТА), содержащим коктейль ингибиторов протеаз. Осветленный методом центрифугирования экстракт подвергали диализу против ацетатного буферного раствора (5 мМ СН3СООИа, 5 мМ СН3СООН, рН 5,3). На первом этапе разделения белков проводили ионообменную хроматографию на колонке ШТгар 8РРР, используя для элюции линейный градиент концентрации хлорида натрия 0-500 мМ при скорости потока 1 мл/мин.

30 35 40 45 Время, мин

Ä21« 1 Í г. 70

1,5 60

1,0 ДО

i т i2 30

0,5 ! Ц 20

J Ч

20 25 30

Время, мин

Рис. 1. ОФ-ВЭЖХ на колонках Диасфер-300-Cis (а) (LTP присутствует в пике 1') и LunaCjg (б) (LTP присутствует в пике 2),

В результате проведенной хроматографии было получено несколько фракций, которые были проанализированы методом SDS-электрофореза в ПААГ. На основании литературных данных о молекулярной массе представителей подкласса LTP1 для дальнейшей работы была выбрана фракция, содержащая белки с Mr 9-10 кДа. Разделение белков из этой фракции осуществлялось с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) на колонке Диасфер-300-С,8 в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 65% за 48 мин в присутствии 0,1% ТФУ (рис. 1а). Масс-спектрометрический анализ полученных фракций выявил присутствие белка с молекулярной массой 9525,5 Да во фракции 1'. Дальнейшая очистка этого белка была проведена с помощью ОФ-ВЭЖХ на колонке Luna С,а с использованием градиента концентрации ацетонитрила от 5 до 30% за 10 мин и далее от 30 до 62% за 40 мин в присутствии 0,1% ТФУ (рис. 16). Масс-спектрометрический анализ полученных фракций выявил присутствие искомого белка во фракции 2.

N-концевая аминокислотная последовательность выделенного белка Ag-LTP (LTXGQVTGALAPXLGYLRTAG-), установленная методом

автоматического микросеквенирования по Эдману, имела значительное сходство с соотвегсгвующими последовательностями растительных липид-транспортирующих белков подкласса LTP1. Для установления полной аминокислотной последовательности Ag-LTP была выделена суммарная РНК, проведены обратная транскрипция и быстрая амплификация 3'- и 5'-концевых фрагментов кДНК (RACE). Амплификацию осуществляли методом полугнездовой ПЦР со ступенчатым понижением температуры на стадии отжига праймеров в первом раунде реакции. Структуры вырожденных ген-специфичных нраймеров для З'-RACE были выбраны на основании данных по гомологии нуклеотидных последовательностей, кодирующих зрелую часть LTP из других растений. В качестве ген-специфичных праймеров для 5'-RACE использовали праймеры, комплементарные З'-нетранслируемой области кДНК. Продукты ПЦР были клонированы и просеквенированы. Путем сопоставления результатов секвенирования 3'- и 5'-концевых фрагментов была установлена структура полноразмерной кДНК (код доступа в GenBank: JF823967), кодирующей предшественник Ag-LTP из 122 аминокислотных остатков и содержащей открытую рамку считывания длиной 366 п.о. (рис. 2а). Анализ транслированной аминокислотной последовательности с помощью алгоритма SignalPv.3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/scrviccs/SianalP/) показал высокую вероятность наличия характерного для растительных LTP сигнального пептида из 29 аминокислотных остатков. Соответствие транслированной последовательности кДНК аминокислотной последовательности выделенного Ag-LTP было подтверждено путем проведения триптического гидролиза восстановленного белка. Рассчитанные с помощью программы PeplideMass (http://web.expasv.org/peptide mass/) молекулярные массы 8 триптических фрагментов Ag-LTP соответствовали массам фрагментов выделенного белка, определенных методом времяпролстной масс-спектрометрии МАДДИ (рис. 3).

МОУ $ ЙАСР'

1 АСбСбббАСТСА АСССААА6Т6ТА АТАСТТСТСТАС СТАТССІАТАЙА АбАТТАбТТТАТ АТТТАбАбТТАА Р^ЩШШЯШШШШ

V У М V У У У М У V А А Т Р N V К 1 А Е А 1 Т С б 0 V Т С А 1 А

97 ЖіШ^І^ СТССССАбСТбА СС66АбССТТ(Йб|

■а р с і а у і й т а о $ у рур і тсс N а у в а і N ы а а к т т

193 СТСССТЙССТСС ШАССЇААШ ССССбСбИССб ТТССАОТТССТС ТААСАТСТТССА АТСОТСТСАССС СССПААТААСБ САССАСС6АССА|

•Т 1 0 Я Я Т А С N СІК 0 Т А N А 1 А 0 1 НІН А А А б 1 Р А К С-

289 СААТАСАСАСКС ССАССбСТТССА АСТСССТСАААС ААЛСТбССААТб ССАТСССССАТС ТТААТТТШТС СТССТССТСССС ТСССТССТАААТ|

М1(3№СЕ)

САУН 1 РУК 1 5Р8 I ВСЯ й УУ

385 | СТСОТСТСААСА ПССТТАСАААА ТСАСССССІССА СССАСІ6СААСА ВССТТбТбЯЕЕ!:' ' л">; і Г:/У - .1

481 АТЄТАТТТСТІА (5СТАСТА6ТССА ДТАТТААООСЇО СТТА0ААІМТ8 АТОСАТбббАТС ТАвСТТВАТСІО ТИЄАТСТАТН С&ВТИСТАБТТ

577 АБТААТбТАСТС САТААТСІССТІ ТБТААТБИССА ТОТТСССТТТБТ ААОТбАТШВА 6СТ6САСТ6ССС БбТТТААБСАСН ШАШААААА "№"ІШ)-

673 АААААААААААА ААААААА

Рис. 2. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Ag-LTP, и соответствующая ей аминокислотная последовательность пребелка. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (показан серым цветом) и зрелый белок (показан черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК.

В результате была установлена полная аминокислотная последовательность нового липид-транспортирующего белка Ag-LTP и структура его предшественника. Зрелый Ag-LTP состоит из 93 аминокислотных остатков, включая 8 консервативно расположенных остатков цистеина, формирующих четыре дисульфидные связи, и имеет расчетную молекулярную массу 9524,6 Да. Совпадение расчетной молекулярной массы с экспериментальным значением m/z молекулярного иона свидетельствует о стабилизации структуры выделенного белка четырьмя дисульфидными связями и об отсутствии иных посттрансляционных модификаций у нового липид-транспортирующего белка укропа.

VIII (83-93)

111(35-41) IV (42-47)

<-X->

VI (55-74)

ОТ<ЗСРтЗА1АРСШУ1ЖА<3!ДЛЛЛ>И^

^_«ИИ«_

.00 760

1SOO 1'50 2000 2250

Рис. 3. а - Тринтические фрагменты восстановленного Лg-LTP (серым цветом выделены сайты расщепления); б - масс-спекгромеч рнческий анализ триптического

гид рол изата .\g-LTF.

)

gravee lens L ХХапсшг caxoba Citrus sinensis Citrus jambhlrz Mores nigra lactuca sativa i5piGHI ^raraojaiu Гяпд caJjaarií Brassica rapa T.ilxvot langiflomm

10 20 30 40 50 60

-LTCÍiOVTGAI¿a<:i/m.RTAG£rVFreLTCCH(^GIMIAAl<T^IDRRTACMCLKQTW№ VLTCGQVTGAIAE<^GYIJlí^VNVPVFLTCaIVVIU3IAWAAIWTlJ>KRTi\CCCLKQTAlIA —TCGQVSGSLAPCIGFLRSGG—PIPKPCCMGVRSIJiAAARTTPDRQTACNCi^KQAAGS

—tcgqvssaiapcifxlkagg --pipvpcoigvbsmiaaahttpdfqtajqiclkqaacs

—ITOGQVSSSLAPCIHyliRAGG—— VVPiÄCQIGVRSUOÄÄCTTOIHiQAAQICLKSAFNS

-VTCGQWGAVAPCr¿ÍÍLRKüG- -TPPQPCCTGVPGLHJDVARTTSDRKTrCHCLKSASSS -LTCGQVTGia/KK:ijCTIJUÄG"YPSP-ACCGGVKGIi!SIAircp№l«^

AJSCGAVTSDI»SPCLTTl>TGGP-GPSP-QCCGGVKKUjAAAMTTPDBQAA(3ÍCLKííAAKS AI^CCTVSGYVAPCTGTlACGA-Pi^RACCSGVTSU^ARTTPDfó^CRCLTCAAMA -TTCGQVDS) I.TSCbGYARJíG —GVXE PCíA^iCTVRTT JJNlAKTTPDÍ'Q'rArN'CiiF.S i.VN P

70 80 90

Anethzm gxarv&oleruf L. lADLNXKAAAfiLPAKCGVKX P YKIS PSTDCHRW JF823967 100

Daucnxs carota VTGIJ9bi¡®AAGLPA^GVirrPYKISETTDCaiRVV AÄB96834 86

Citroe einen*±8 Ií^ni^I<HNAiM3jPGAGGVSIPyKISTSTDCSKVR CAH03799 70

Citrus jaoahhi tí XPNLKPNHAVGLPRACGVSIPYKISISTCDCSKV BAH03575 €9

Horas nigra XKGLKIÄIAAGLPGKCGVSVPYKX S F STDCKSVK P85894 €7

Lactuca sativa TTOGVSGireAASLPGKCGVNIJErZK3!SPSTDGNRIQ ABK96812 €7

Apizaa graveolens VreiNYGAnSAbPGKCGXKEPXPISPSTDqSRV» ACV04796 59

ÄAX35807 58

Brassica, iарл FPTIJNAAKAAGLPKACGVOTPIKISICrTNGRSVK ABM69132 58

г.t 7 tttb langifloxrum SIÄUÜUUVAGIPGKGGVHIPYPll^TCXaiKVR AÄD46683 57

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей Ag-LTP и других представителей подкласса LTP1. %И- процент идентичных аминокислотных

остатков.

Поиск в базах данных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показал, что выделенный нами . LTP укропа является четвертым представителем класса липид-транспортирующих белков из растений семейства зонтичных наряду с LTP моркови, сельдерея и кумина, для которых установлена полная аминокислотная последовательность.

Согласно литературным данным, LTP из растений различных ботанических семейств при наличии ряда консервативных аминокислотных остатков не обладают высокой степенью гомологии. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей представителей липид-

транспортирующих белков подкласса LTP1, проведенный с помощью программы MegAlign (DNASTAR), показал, что Ag-LTP укропа имеет наибольшее сходство с LTP, выделенным из другого представителя семейства зонтичных растений - моркови обыкновенной Dauern carota (рис. 4). В то же время, гомология аминокислотных последовательностей Ag-LTP укропа и Lc-

LTP2, выделенного ранее в УНЦ ИБХ РАН из семян бобовой культуры — чечевицы обыкновенной Lens culinaris, составляет всего 58%. В структуре Ag-LTP присутствует целый ряд консервативных аминокислотных остатков (А1а67, Leu53 и Val77), участвующих в формировании характерной для представителей класса растительных LTP гидрофобной впадины, в которой находится сайт связывания липидных молекул. Для структуры Ag-LTP так же, как и для других липид-транспоргирующих белков растений, характерно наличие консервативных остатков Туг81 и Arg47, которые принимают участие во взаимодействии с полярной головкой липида, находящегося внутри гидрофобной впадины белка.

2. Гетерологичная экспрессия и очистка липид-транспортирующих белков

укропа и чечевицы.

На основе вектора рЕТ и штамма E.coli BL21(DE3) были созданы системы для гетерологичной экспрессии Lc-LTP2 чечевицы и Ag-LTP укропа. Созданные конструкции предусматривали получение Lc-LTP2 и Ag-LTP в виде гибридных белков с тиоредоксином А. Выбор данного белка в качестве носителя был обусловлен способностью тиоредоксина обеспечивать экспрессию гибридных белков в нативной форме. Возможность металлохелатной очистки гибридных белков была обеспечена введением в конструкцию N-концевой октагистидиновой последовательности. Для высвобождения целевых пептидов из состава гибридных белков между последовательностями, кодирующими липид-транспортирующие белки и тиоредоксин, был введен остаток метионина, который позволял проводить избирательное расщепление полипептидных цепей бромцианом. Для уменьшения количества побочных продуктов, образующихся в результате реакции расщепления, в последовательности тиоредоксина А была произведена замена внутреннего остатка метионина на остаток лейцина (M37L) (рис.5).

Bylu [13) lac operator

Рис. 5. Физическая карта рскомбинантиой плазмиды pET-TrxL-LTP. Bglll, Xhol -сайты рестрикции; pBU322 Ori - участок инициации репликации плазмиды; Ыа - ген устойчивости к р-лактамным антибиотикам; lacl - ген lac-penpeccopa; Т7 promoter -промотор транскрипции; Т7 terminator - терминатор транскрипции; lac operator - сайт связывания lac-penpeccopa; RBS - сайт связывания рибосомы; His8-TrxL-LTP -последовательность, кодирующая гибридный белок, включающий участок из восьми остатков гистидина (IIis8), модифицированный тиоредоксин A (TrxL) и последовательность лнпид-транспортирующего белка (LTP).

О 510JS20Z5 30 35.W45SOS5

9283 Л£Д1.7 U U-LTP2 15Ж5 1

352 4J6L5 SJ Ag-LTP 1 lasts

Рис. 6. а - Очистка рекомбинантных Lc-LTP2 и Ag-LTP методом ОФ-ВЭЖХ на колонке LunaCie; б - МАЛДИ масс-спектры рекомбинантных Lc-LTP2 и Ag-LTP.

Клетки каждого из полученных нгтаммов (BL-21(DE3)/pET-His8-TrxL-Lc-LTP2 и В L-21 (DE3)/pET-His8-TrxL-Ag-LTP) культивировали в богатой питательной среде при температуре 30°С, используя изопропил-p-D-тиогалактозид в качестве индуктора. Клеточный осадок подвергали лизису с помощью ультразвука в буферном растворе А (50 мМ трис-НС1, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,8), содержащем ингибитор сериновых протеаз фснилметилсульфонилфторид. Полученный в результате центрифугирования осветленный лизат фракционировали с помощью металлохелатной хроматофафии на колонке с №2'-сефарозой, Элюирование проводили буфером А, содержащим 0,5 М имидазол, после чего полученный элюат подвергали диализу против воды, подкисленной НС1 до рН 4,0. Далее каждый из полученных гибридных белков (His8-TrxL-Lc-LTP2 и H¡s8-TrxL-Ag-LTP) расщепляли бромцианом в кислой среде, после чего продукты реакции разделяли с помощью повторной металлохелатной хроматографии. В качестве следующей стадии очистки рекомбинантных белков использовали ОФ-ВЭЖХ на колонке Reprosil-PurC|8-AQ. Разделение проводили в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 5 до 80% за 60 минут в присутствии 0,1% ТФУ. Финальную очистку рекомбинантных Lc-LTP2 и Ag-LTP проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ на колонке Luna С18, используя градиент концентрации ацетонитрила от 5 до 65% за 45 минут в присутствии 0,1% ТФУ (рис. 6а).

Времена удерживания на колонке рекомбинантных Lc-LTP2 и Ag-LTP в условиях заданного градиента совпадали с таковыми у соответствующих природных белков. Выходы рекомбинантных Lc-LTP2 и Ag-LTP составили не менее 5 и 1,5 мг/л культуры в пересчете на индивидуальные белки, соответственно. Гомогенность полученных образцов и идентичность рекомбинантных Lc-LTP2 и Ag-LTP природным белкам были также подтверждены с использованием методов SDS-электрофореза в ПААГ, времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ (рис. 66), автоматического микросеквенирования по Эдману и КД-сиектроскопии (рис. 7).

)

-иооо

190 юо ¡ш tlO i» I« ISO HiO 2>5 3 3'S 4 45 5

Рям сдхяхе опннла,

Длина валкы, нм 1

Рис. 8.Связывание поликлональных

Рис. 7. Спектры КД Ag-LTP и LC-LTP2. кроличьих IgG с рекомбинантными

Ag-LTP и LC-LTP2.

Спектры кругового дихроизма двух LTP представляли собой кривые, характерные для белков с высоким содержанием а-спиральной структуры и достигающие минимумов при 222 и 208 нм и максимума при 195 нм. Вклад а-спиральной структуры у Lc-LTP2 составлял 43,8%, у Ag-LTP - 50,3%, что соответствует среднему значению для большинства представителей подкласса LTP1 (около 50%). Сходство свойств рекомбинантных Ag-LTP и Lc-LTP2 было подтверждено также с помощью методов иммуиоблоттинга и непрямого иммуноферментного анализа (рис. 8) при использовании поликлональных кроличьих антител к LC-LTP2.

3. Биотехнологический способ получения LC-LTP2, тотально меченного стабильным изотопом 1SN.

Сконструированная плазмида pET-His8-TrxL-Lc-LTP2 была использована для получения липид-транспортирующего белка чечевицы, тотально меченного стабильным изотопом l5N. Штамм Е. coli BL21(DE3) трансформировали данной плазмидой и культивировали при пониженной температуре 25-28°С на бедной питательной среде М9, содержащей 15NH4C1 в качестве единственного источника азота. Индукцию экспрессии гибридного белка осуществляли путем добавления в культуральную жидкость изопропил-ß-

Рис. 9, Пространственная структура Lc-L'I'P2 в водном растворе в ленточном представлении. Показаны консервативные остатки Asp44, Arg45,1'го79 и Туг80.

D-тиогалактозида. Выделение и очистку рекомбинантного '^-меченого Lc-

LTP2 проводили по схеме, описанной для его немеченого аналога. По данным

МАЛДИ масс-спектрометрии молекулярная масса 151Ч-меченого белка (9395,9

Да) на 113 Да превышала молекулярную массу природного липид-

транспортирующего белка чечевицы и соответствовала расчетной массе Lc-

LTP2, тотально меченного стабильным изотопом 1'' N. Гомогенность

полученного образца и идентичность 15Ы-меченого Lc-LTP2 природному

липид-транспоргнрующему белку чечевицы были подтверждены с помощью

методов SDS-электрофореза в ПААГ и КД-спектроскопии. Методом

гетероядерной ЯМР-спектроскопии была подтверждена высокая (-99%) степень

включения изотопной метки в структуру молекулы LC-LTP2. Используя

полученные образцы немеченого и 1SN -меченого рекомбинантных аналогов

LTP чечевицы, в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН

(с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев) была определена

пространственная структура Lc-LTP2 в водном растворе (рис.9). Молекула Lc-

LTP2 содержит четыре а-спирали, сформированные на следующих участках

полипептидной цепи: Cys4-Leul8 (Hl), Pro26-Ala37 (Н2), Thr42-AIa56 (НЗ),

Thr63-Lys73 (Н4). В структуре молекулы наблюдается также длинный С-

концевой участок Gly75-Phe93 без регулярной вторичной структуры. Спираль

Hl образует небольшой излом в районе остатка Рго13, при этом спирали Н1-НЗ расположены параллельно и формируют a-спиральную связку, а спираль Н4 и С-концевой участок расположены перпендикулярно связке Н1-НЗ, таким образом формируя полость внутри молекулы белка. На поверхности полости расположены боковые цепи гидрофобных аминокислотных остатков, которые предположительно могут участвовать в связывании молекулы липида. Структура белка стабилизирована четырьмя дисульфидными связями (Cys4-Cys51, Cysl4-Cys28, Cys29-Cys74, Cys49-Cys88) и 32 водородными связями. Внешняя поверхность Lc-LTP2 образована полярными аминокислотными остатками и не содержит выраженных гидрофобных участков, которые могли бы использоваться для связывания с липидными мембранами. У входа в полость расположены консервативные остатки Asp44, Arg45, Рго79 и Tyr80. Согласно литературным данным, эти остатки могут участвовать во взаимодействии с полярной головкой липида, локализованного внутри гидрофобной полости белка.

4. Характеристика биологической активности Ag-LTP и Lc-LTP2.

Антимикробную активность рекомбинантных аналогов Lc-LTP2 и Ag-LTP исследовали методом двукратных серийных разведений белков в жидкой питательной среде с культурой бактериальных клеток или фитопатогенных грибов (табл. 1). Антибактериальную активность белков определяли в отношении грамположительной бактерии Clavibacter michiganensis VKM Ас-1144 и двух грамотрицателышх бактерий Agrobacterium tumefaciens А281 и Pseudomonas syringae VKMB-1546, являющихся причиной развития у растений кольцевой гнили, корончатых галлов, бурого слизетечения, повреждения плодов и пятнистости листьев. Противогрибковую активность LTP определяли в отношении фитопатогенных грибов Alternaría altérnala VKM F-3047, Aspergillus niger VKM F-2259, Aspergillus versicolor VKM F-1114, Botrytis cinerea VKM F-3700, Fusarium culmorum VKM F-844, Fusarium solani VKM F-142 и Neurospora crassa VKM F-184.

Результаты исследования показали, что Lc-LTP2 чечевицы проявляет антимикробную активность в отношении почти всех использованных фитопатогенных микроорганизмов. Ag-LTP укропа ингибирует прорастание спор и замедляет рост фитопатогенных грибов (рис. 10), но не обладает антибактериальной активностью в максимальной используемой концентрации 40 мкМ/л. LTP укропа и чечевицы не вызывают морфологических изменений гиф грибов. Наиболее чувствительной культурой к обоим липид-транспортирующим белкам является возбудитель черной гнили растений Aspergillus niger.

Известно, что наличие и уровень антимикробной активности у LTP из различных растений сильно варьирует. Предположительно, это связано с выполнением липид-траиспортирующими белками различных функций в растениях. Б данной работе было показано, что Ag-LTP укропа и Lc-LTP2 чечевицы обладают умеренно выраженной антимикробной активностью и ингибируют рост фитопатогенов в достаточно высоких концентрациях. На основании этого было выдвинуто предположение, что Таблица 1. Антимикробная активность LC-LTP2 и Ag-LTP. _______ контроль

Фитопатогенные микроорганизмы ICso, мкМ/л

Lc-LTP2 Ag-LTP

Бактерии

Agrobacíerium tumefaciens 20-40 на

Clavibacter michiganensis >40 на

Pseudomonas syringae >40 на

Грибы

Alternaria altérnala >40 но

Aspergillus niger 10-20 10-20

Aspergillus versicolor на но

Botrytis cinerea 10-20 но

Fusarium culmorum на но

Fusarium solani >40 но

Neurospora crassa 20-40 >40

+20 мкМ Ag-LTP

но - не определяли на - не активен

Рис. 10. Влияние Ag-LTP на рост Aspergillus ttiger.

основной функцией исследуемых представителей растительных LTP является не защита растения от фитопатогенных микроорганизмов, а участие в процессах, связанных с переносом липидных молекул.

Ранее в экспериментах in vitro с различными LTP растений было показано, что данные белки обладают способностью связывать и переносить различные липиды, включая жирные кислоты (ЖК) с длиной цепи С10-С18, ацильные производные кофермента А, фосфо- и галактолипиды. Эта способность обусловлена наличием в структуре LTP гидрофобной полости, внутри которой могут располагаться одна или две липидные молекулы определенного размера.

Для Lc-LTP2 и Ag-LTP способность связывать ЖК была показана с помощью метода флуоресцентной спектроскопии. На первом этапе работы было исследовано влияние присутствия ЖК в растворе на интенсивность собственной флуоресценции белка. Известно, что в структуре растительных LTP присутствуют два консервативных остатка тирозина, расположенных в N-и С-концевых участках структуры. Последний из них обращен внутрь гидрофобного кармана и располагается в центре связывания липидных молекул. При связывании липидной молекулы интенсивность флуоресценции С-концевого тирозина значительно увеличивается благодаря изменению микроокружения этого флуорофора.

Флуоресценция исследуемых белков возбуждалась светом с длиной волны 275 нм и регистрировалась в диапазоне 285-400 нм. В качестве лиганда была использована стеариновая кислота, связывание с которой было показано для ряда представителей подкласса LTP1. При титровании растворов Lc-LTP2 и Ag-LTP стеариновой кислотой наблюдался рост интенсивности флуоресценции обоих белков, который свидетельствовал о конформационных изменениях в их структурах, связанных с размещением липидных молекул внутри гидрофобных карманов Lc-LTP2 и Ag-LTP (рис. 11).

Для определения количества сайтов связывания (п) и расчета констант диссоциации комплексов белков с ЖК (Kd) использовали математическое моделирование. В литературных источниках для LTP растений описана модель некооиеративного связывания лигандов. На основании данной модели связывания были рассчитаны теоретические кривые титрования белка, описываемые уравнением:

/г . к,

I +—+ п

|а-

^=0

где п - число сайтов связывания, Kd - константа диссоциации комплекса, Ri -мольное соотношение липид/белок, Р0 - общая концентрация белка, а — доля связанного белка, рассчитанная из соотношения интенсивностей флуоресценции (F-F0/Fmax-F0), где Fmax и F0 - интенсивности флуоресценции связанного и свободного белка, соответственно (Douliez J.-P. et al. // Biochimica et Biophysica Acta. - 2000. - V.1467. - P.65-72). Обсчет экспериментальных данных с использованием программы Grace показал, что оба белка связывают по одной молекуле липида, причём LC-LTP2 образует более прочный комплекс со стеариновой кислотой (табл. 2).

На втором этапе работы исследовали влияние присутствия в растворе ЖК

Таблица 2. Константа диссоциации (К(1) и число сайтов связывании (п) со стеариновой кислотой.

Белок Kd, мкМ п

Lc-LTP2 0,7 1,1

Ag-LTP 1,6 1,0

Рис. 11. Изменение интенсивности флуоресценции белков при различном мольном соотношении стеариновой кислоты и LTP.

Рис. 12. Влияние присутствия ЖК на образование комплексов LTP с ТНС.

(на связывание липид-транспортирующих белков укропа и чечевицы с флуоресцентным зондом - 2-п-толуидинилнафталин-6-сульфоновой кислотой ТНС), флуоресценция которой сильно возрастает при размещении ее внутри гидрофобной полости LTP.

Флуоресценция ТНС возбуждалась при 320 нм и регистрировалась в диапазоне 330-450 нм. При добавлении к раствору ТНС липид-транспортирующих белков укропа и чечевицы наблюдалось значительное увеличение интенсивности ее флуоресценции за счет образования комплексов с данными LTP. В то же время, при добавлении Ag-LTP и Lc-LTP2 к смеси ТНС и ЖК такого роста интенсивности флуоресценции не наблюдалось, причиной чего предположительно является конкурентное связывание ТНС и ЖК с исследуемыми липид-транспортирующими белками. В экспериментах по изучению связывания были использованы насыщенные ЖК с длиной цепи от

С12 до С19, ненасыщенные ЖК с длиной цени С16 и С18 и с различным числом двойных связей, а также жасмоновая кислота - растительный гормон, участвующий в регуляции роста растения, формирования клубней и луковиц, опадания листьев, а также в защите растения от стрессогенных факторов окружающей среды и заживлении повреждений. Было показано, что Ag-LTP и Lc-LTP2 с разной эффективностью связывают все исследованные ЖК, а также жасмоновую кислоту (рис. 12). Было установлено, что более вытянутые насыщенные ЖК с меньшей эффективностью связываются с Lc-LTP2, в то время как ненасыщенные пальмитолсиновая (С16:1 (с9)), линолевая (С18:2 (с9,12)) и линоленовая (С18:3 (с9,12,15)) кислоты эффективно конкурируют с ТНС за сайт связывания липид-транспортирующего белка чечевицы. В то же время, было отмечено, что все исследованные ЖК практически с одинаковой эффективностью связываются с липид-транспортирующим белком укропа. Возможной причиной такой разницы в связывающей способности Ag-LTP и Lc-LTP2 могут являться отличия в размере и форме гидрофобной впадины этих двух представителей класса LTP.

В литературных источниках описан целый ряд предположений о возможных функциях LTP в растениях, многие из которых обусловлены способностью данных белков связывать и переносить разнообразные липидные молекулы. В частности, описано возможное участие LTP растений в биосинтезе защитного кутинового слоя, основными компонентами которого являются производные пальмитиновой и стеариновой кислот с различным числом двойных связей и гидроксильных групп. Также показано, что данные белки могут являться компонентами различных сигнальных путей в растении с участием жасмоновой кислоты. Исследованные в данной работе LTP чечевицы и укропа связывают широкий спектр ЖК и, предположительно, могут выступать в роли переносчиков сигнальных и строительных липидных молекул и тем самым участвовать в модуляции роста и активации защитных механизмов растений.

выводы

1. В зеленых частях укропа огородного Anethum graveolens L. обнаружен новый липид-транспортирующий белок, названный Ag-LTP. Разработана методика его выделения и очистки. Определена полная аминокислотная последовательность выделенного Ag-LTP.

2. Установлена структура полноразмерной кДНК, кодирующей белок-предшественник липид-транспортирующего белка Ag-LTP из укропа огородного Anethum graveolens L., и соответствующая ей полная аминокислотная последовательность предшественника этого белка.

3. Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии Ag-LTP укропа и Lc-LTP2 чечевицы в клетках Е. coli в составе гибридных белков. Получены штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать эти белки с выходом 1,5 и 5 мг/л культуры, соответственно.

4. Разработаны методики выделения белков Ag-LTP укропа и Lc-LTP2 чечевицы. Показано, что рекомбинантные белки полностью идентичны природным LTP по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и спектрам кругового дихроизма.

5. Разработан биотехнологический способ получения рекомбинантного аналога Lc-LTP2, тотально меченного стабильным изотопом I5N.

6. Проведено исследование функциональной активности выделенных липид-транспортирующих белков. Показано, что Ag-LTP укропа и LC-LTP2 чечевицы обладают умеренной антимикробной активностью в отношении фитопатогенных микроорганизмов.

7. Установлено, что Ag-LTP укропа и LC-LTP2 чечевицы связывают насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, а также природный регулятор роста растений - жасмоновую кислоту.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Gizatullina A.K.., Finkina E.I., Mineev K.S., Melnikova D.N., Bogdanov I.V., Telezhinskaya I.N., Balandin S.V., Shcnkarev Z.O., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V.Recombinant production and solution structure of lipid transfer protein from Lentil Lens culinaris. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2013. -V.439. - №.4. - P. 427-432.

2. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова T.B. Новый липид-транспортирующий белок из укропа огородного Anethum graveolens. II Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2013. - Т.9. - №3. - С. 5-14.

3. Finkina E.I., Melnikova D.N., Bogdanov I.V., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V. Study of molecular and immunological features of novel plant lipid transfer proteins // FEBS Journal. - 2013. - V.280. - S.I. - P. 133. Abstracts of the 38th FEBS Congress, Saint Petersburg, Russia, July 6-11,2013.

4. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова T.B. Получение рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы обыкновенной Lens culinaris// Тезисы докладов и стендовых сообщений XXI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - М., 2009. - С. 66.

5. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Изучение нового липид-транспортирующего белка чечевицы обыкновенной Lens culinaris// Тезисы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2009. - С. 338— 339.

6. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Гетерологическая экспрессия липид-транспортирующего белка чечевицы в клетках Е. coli // Тезисы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. - М., 2009.-С. 137.

7. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Болдырев И.А., Стукачева Е.А., Водовозова E.JI., Овчинникова Т.В. Изучение связывания липид-транспортирующего белка чечевицы с липидами // Тезисы VI Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития",- М., 2011. - С. 248.

8. Павлова Л.Е., Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Рыбалко А.Е., Овчинникова Т.В. Новый липид-транспортирующий белок из плодов Citrus natsudaidai II Тезисы VI Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".-М., 2011. - С. 15.

9. Гизатуллина А.К., Богданов И.В., Минеев К.С., Шенкарёв З.О., Мельникова Д.Н.,Финкина Е.И., Баландин C.B., Арсеньев A.C., Овчинникова Т.В. Получение и исследование пространственной структуры рекомбинантных липид-траспортирующих белков чечевицы // Тезисы научной конференции по

биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова».- М., 2011. - С. 249.

10. Болдырев И.А., Алексеева A.C., Водовозова ЕЛ., Мельникова Д.Н., Молотковский Ю.Г.. Липид-белковые взаимодействия и флуоресцентная спектроскопия 7/ Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - М., 2012. - С. 13.

11. Гизатуллина А.К., Богданов И.В., Минеев К.С., Шенкарёв З.О., Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Арсеньев A.C., Овчинникова Т.В. Получение и исследование пространственной структуры рекомбинантных липид-траспортирующих белков чечевицы // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - М., 2012. — С. 34.

12. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Новый липид-транспортирующий белок из укропа Anethum graveolens // Тезисы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии».- М., 2012. - С. 53-54.

13. Мельникова Д.Н. Перспективы использования липид-транспортирующих белков растений при создании биосенсоров и систем направленной доставки лекарственных средств // Тезисы осеннего финала программы «У.М.Н.И.К.» РАН. - М., 2012. - С. 21-23.

14. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Исследование новых липид-транспортирующих белков растений // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». -М., 2013.-С.7.

15. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Получение и структурно-функциональная характеристика нового липид-транспортирующего белка из укропа Anethum graveolens II Материалы VII Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". — М., 2013. - С. 426-427.

16. Финкина Е.И., .Панина П.А., Богданов И.В., Мельникова Д.Н., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Биотехнологическое получение рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы и его меченных стабильными изотопами аналогов // Материалы VII Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М., 2013. - С. 382-383.

Подписано в печать:

18.11.2013

Заказ № 9157 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Мельникова, Дарья Николаевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201453244

Мельникова Дарья Николаевна

Исследование новых растительных липид-транспортирующих белков

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -доктор химических наук Т.В. Овчинникова

Москва-2013

Оглавление

1. Введение 4

2. Многообразие и функции растительных белков, связывающих и переносящих липиды (обзор литературы) 7

2.1. Липиды и их функции в клетке 7

2.1.1. Растительные липиды, их синтез и локализация 7

2.1.2. Функции липидов в растительной клетке 11

2.1.3. Изменение липидного состава в течение жизненного цикла растений 15

2.1.4. Транспорт липидов 17

2.2. Белки, связывающие и переносящие липиды 18

2.2.1. Общая характеристика 18

2.2.2. Пуроиндолины 18

2.2.3. Стерин-переносящие белки 21

2.2.4. Гликолипид-переносящие белки 25

2.2.5. Ацил-КоА-связывающие белки 26

2.2.6. Гомологи Bet v 1 35

2.2.7. Липид-транспортирующие белки 38

2.3. Возможности практического применения растительных белков, связывающих и переносящих липиды 48

3. Материалы и методы 52

3.1. Оборудование 52

3.2. Реактивы и расходные материалы 53

3.3. Методы 57

3.3.1. Выделение LTP из укропа 57

3.3.2. SDS-электрофорез 58

3.3.3. Электроблоттинг 58

3.3.4. Масс-спектрометрический анализ 59

3.3.5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 59

3.3.6. Триптический гидролиз 59

3.3.7. Выделение суммарной РНК 60

3.3.8. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE) 60

3.3.9. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР 62

3.3.10. Гетерологичная экспрессия LTP 63

3.3.11. Выделение и очистка гибридных белков 65

3.3.12. Выделение и очистка рекомбинантных LTP 66

3.3.13. Спектроскопия кругового дихроизма 67

3.3.14. Иммуноблоттинг 67

3.3.15. Непрямой иммуноферментный анализ 67

3.3.16. Определение антимикробной активности 68

3.3.17. Флуоресцентная спектроскопия 69

4. Результаты и обсуждение 72

4.1. Выделение и структурная характеристика нового липид-транспортирующего белка Ag-LTP 72

4.2. Гетерологичная экспрессия и очистка липид-транспортирующих белков 81

4.3. Биотехнологический способ получения Lc-LTP2, тотально меченного стабильным изотопом 15N 87

4.4. Характеристика биологической активности Ag-LTP и Lc-LTP2 91

5. Выводы 98

6. Благодарности 99

7. Библиографический список 100

8. Список сокращений

123

1. Введение

Изучение LTP растений представляет большой интерес в связи с возможностью их практического применения в сельскохозяйственной отрасли для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми-вредителями. Использование методов ротационного земледелия и традиционной селекции, направленных на получение устойчивых культур, а также применение

химических средств защиты растений не всегда оказывается эффективным и не соответствует требованиям экологической безопасности. Одним из перспективных направлений повышения урожайности сельскохозяйственных культур представляется создание трансгенных растений, обладающих устойчивостью к фитопатогенным микроорганизмам и действию разнообразных стрессогенных факторов окружающей среды.

Некоторые представители класса LTP являются аллергенами, ответственными за развитие аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важной фундаментальной задачей экспериментальной медицины, решение которой, с одной стороны, обогащает наше представление о причинах и механизмах развития аллергии, с другой стороны, имеет важное прикладное значение. Природные и рекомбинантные растительные аллергены, а также их гипоаллергенные аналоги могут стать основой для создания современных диагностических тест-систем и аллерговакцин, предназначенных для профилактики и лечения аллергических заболеваний.

Целью работы явились поиск, выделение и структурно-функциональное исследование новых липид-транспортирующих белков растительного происхождения. В качестве объектов исследования были выбраны распространенные во многих странах, но малоизученные культуры - укроп огородный Anethum graveolens L. [класс - двудольные (Dicotylédones), порядок -зонтикоцветные (Apiales), семейство - зонтичные (Umbelliferae) или сельдереевые (Apiaceae), род - укроп {Anethum L.)] и чечевица обыкновенная

Lens culinaris subsp. culinaris [класс - двудольные (Dicotylédones), порядок -бобовоцветные (Fabales), семейство - бобовые (Fabaceae) или мотыльковые (Leguminosae), род - чечевица (Lens)]. В задачи работы входили поиск новых липид-транспортирующих белков, разработка методик их выделения и очистки, определение полных аминокислотных последовательностей и структур кДНК, кодирующих предшественники новых LTP, создание систем для гетерологичной экспрессии липид-транспортирующих белков, получение рекомбинантных LTP и их меченных стабильными изотопами аналогов, а также структурно-функциональная характеристика выделенных белков.

2. Многообразие и функции растительных белков, связывающих и переносящих липиды (обзор литературы)

2.1. Липиды и их функции в клетке

Липиды, наравне с углеводами, белками и нуклеиновыми кислотами, являются основными компонентами прокариотических и эукариотических клеток. Наибольшее количество липидов и их производных синтезируется в клетках растений, которые являются основным источником незаменимых жирных кислот для животных, человека и бактерий. Известно, что около 5% генома эукариот составляют гены, принимающие участие в липидном обмене [96; 266].

Локализация и пути метаболизма липидов сильно различаются у растений, животных и бактерий, что обусловлено в первую очередь особенностями строения клеток этих организмов.

2.1.1. Растительные липиды, их синтез и локализация

Клетки различных эукариотических организмов имеют схожее строение. В состав различных мембран эукариотических клеток входят повсеместно присутствующие липиды, одним из которых является фосфатидилхолин (ФХ). Однако, клетки растений имеют ряд отличительных особенностей, в том числе относящихся к структуре и локализации липидов.

К особенностям строения растительных клеток относится наличие центральной вакуоли, клеточной стенки, которая у высших растений состоит приблизительно на 10% из белков и на 90% из полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлозы и пектина), и нескольких типов пластид (лейкопластов, хлоропластов и хромопластов) [1]. Синтез определенного набора липидов происходит в разных частях клетки и является одной из причин уникальности липидного состава мембран органелл [189; 233] (табл. 1).

В растительной клетке липиды синтезируются в цитозоле, эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), пластидах и митохондриях, откуда

транспортируются в другие компартменты клетки. ЭР растительной клетки представляет собой сложную систему взаимосвязанных канальцев и цистерн, окруженных мембраной [248]. Площадь мембран ЭР составляет более половины общей площади всех мембран клетки. ЭР является основным местом формирования липидных телец и синтеза большинства фосфолипидов (ФЛ) и триацилглицеринов (ТАГ) [224]. В ЭР происходят образование двойных связей ненасыщенных жирных кислот (десатурация) и другие изменения жирных кислот (ЖК), которые далее включаются в состав ФЛ и ТАГ.

ЖК растений и большинства других организмов в основном имеют длину цепи от 16 до 18 атомов углерода. Ацильные остатки всего пяти ЖК с различной степенью насыщенности (18:1, 18:2, 18:3, 16:0 и в некоторых видах 16:3) входят в состав 90% глицеролипидов мембран. В то же время, в состав растительных масел входят самые разнообразные жирные кислоты. В общей сложности в составе ТАГ семян насчитывается более 300 видов различных ЖК [39]. Такое разнообразие обеспечивается различиями в длине ацильной цепи ЖК (от 8 до более чем 22 атомов углерода), положении и числе двойных связей, наличием в структуре молекул гидроксильной, эпоксидной и других функциональных групп [26; 36; 138; 264]. Биосинтез ЖК является важнейшим процессом метаболизма, ингибирование которого приводит к гибели клеток [245; 272].

Пластиды представляют собой семейство органелл, в матриксе которых имеется собственная геномная система. Недифференцированные растительные клетки содержат мелкие пропластиды, которые в зависимости от вида ткани могут дифференцироваться в хлоропласты, богатые каротиноидами хромопласты и несколько типов бесцветных лейкопластов [211]. Все типы пластид являются двумембранными органеллами. Внутренняя мембрана хлоропластов отделяет строму пластиды, в которой имеется два типа внутренних мембран. Одни из них образуют ламеллы стромы, другие - мембраны тилакоидов. Данные мембраны обогащены более чем на 80-90% галактолипидами и содержат уникальный сульфолипид - сульфохиновозилдиацилглицерин (СХДГ), который содержит модифицированную галактозу (табл. 1). Фосфолипиды присутствуют в них в

меньших количествах, например, ФХ находится исключительно в наружном слое внешней мембраны [79]. Последняя содержит больше дигалактозилдиацилглицерина (ДГДГ), чем моногалактозилдиацилглицерина

Таблица 1. Липидный состав мембран органелл растительной клетки.

Органеллы и мембраны Доминирующие липиды (более 5% от общего количества липидов)

Пластиды Дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ), моногалактозилдиацилглицерин (МГДГ), фосфатидилглицерин (ФГ), сульфохиновозилдиацилглицерин (СХДГ), фосфатидилхолин (ФХ)

Эндоплазматический ретикулум ФХ, фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфотидилинозит (ФИ), ФГ

Аппарат Гольджи ФХ, ФЭ, фосфатидилсерин (ФС)

Липидные тельца Триацилглицерин (ТАГ)

Митохондрии ФХ, ФЭ, дифосфатидилглицерин (ДФГ), кардиолипин, ФИ

Ядро ФХ, ФЭ, ФИ, ФГ

Белковые тельца Фосфатидная кислота (ФК), ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ

Тонопласт ФХ, ФЭ, ФИ, сфинголипиды, стерины и их производные

Глиоксисомы ФХ, ФЭ, ФИ

Пероксисомы ФХ, ФЭ, ФГ, ФИ

Плазматическая мембрана ФЭ, ФХ, ФИ, сфинголипиды, стерины и их производные

(МГДГ). В то же время, МГДГ является основным липидным компонентом внутренней мембраны [139]. Липиды мембран тилакоидов имеют асимметричное распределение: наружный слой мембраны обогащен МГДГ и ФГ, тогда как ДГДГ и СХДГ в основном расположены во внутреннем слое [79; 111]. Такое неравномерное распределение липидов наблюдается у представителей различных ботанических семейств и формируется на ранних стадиях образования тилакоидов [111; 189].

Для пластид описаны процессы биосинтеза галактолипидов (мажорных компонентов их мембран), ФГ и большинства ЖК, в частности, С 18:0 и С 16:1, которые затем экспортируются в другие компартменты клетки при участии ацил-КоА-синтетазы, находящейся на внешней мембране. При этом полиненасыщенные ЖК не могут экспортироваться и накапливаются в пластидах. Согласно преимущественному содержанию полиненасыщенных стеариновой и пальмитиновой кислот в составе МГДГ мембран хлоропластов растения подразделяют на типы «18:3» и «16:3», соответственно [276].

Липидный состав пластид формируется по «прокариотическому» (автономно в пластидах) и/или «эукариотическому» (в ЭР) пути [244]. В «16:3» растениях синтез липидов, локализованных в пластидах, происходит по двум путям одновременно. Например, было показано, что одна половина галактолипидов, выделенных из листьев арабидопсиса Arabidopsis thaliana, синтезировалась в пластидах, тогда как вторая - в ЭР. Следует отметить, что из-за специфики растительной ацилтрансферазы липиды, в состав которых входят 16:3 ЖК, синтезируются исключительно по «прокариотическому» пути. В «18:3» растениях пластиды не способны синтезировать свои собственные липиды, за исключением ФГ и их производных, содержащих необычную транс-3-гексадеценовую кислоту во втором положении. Остальные липиды в этих растениях синтезируются по «эукариотическому» пути в ЭР и, следовательно, не содержат 16:3 жирных кислот [189].

Митохондрии так же, как пластиды, являются двумембранными органеллами. Поверхность внутренней мембраны митохондрий больше внешней и на ее долю приходится более 90% всех митохондриальных липидов [1]. Данные органеллы наряду с ЭР и пластидами участвуют в синтезе липидов, для них хорошо изучены биосинтетические пути образования кардиолипина и ФГ. Но большинство ЖК доставляется в митохондрии из ЭР или пластид. Однако, имеются сведения о митохондриальном синтезе минорных фракций жирных кислот из малоната. Основным продуктом этого биосинтетического пути служит октаноат - предшественник липоевой кислоты, являющейся кофактором таких ферментов, как глициндекарбоксилаза и пируватдегидрогеназа [113].

В клетках прорастающих семян масличных культур образуются одномембранные микротельца - глиоксисомы. Структурными компонентами их мембран являются разнообразные фосфолипиды (табл. 1), которые синтезируются в ЭР, так как у глиоксисом эта способность отсутствует. В ходе недавних исследований было обнаружено, что в клетках семян хлопка липидные тельца наряду с ЭР являются источником фосфолипидов для формирования мембран глиоксисом [53]. Метаболизм липидов в растительных клетках нельзя рассматривать без участия данных органелл, так как они являются местом, где проходят реакции глиоксилатного цикла - метаболического пути превращения ацетил-кофермента А, образующегося при р-окислении ЖК. В животных клетках данный цикл отсутствует, так как в них не образуются изоцитратлиаза и малатлиаза - ключевые ферменты этого превращения. Так как в растениях ЖК не могут переноситься на большие расстояния, только преобразование ацетил-кофермента А в сахарозу, которая транспортируется по сосудистой системе растения, делает ЖК источником углерода для растущих побегов и корней [189; 233].

2.1.2. Функции липидов в растительной клетке

Клетки растений содержат приблизительно 5-10% липидов в пересчете на сухой вес биомассы [4]. На это количество приходится шесть основных групп

Таблица 2. Основные функции и специфические свойства липидов растений.

Функция Липиды Специфические свойства

Защитная Воски, кутин, суберин 1. Характеризуются высокой степенью гидрофобности. 2. Образуют стабильные полимеры. 3. Присутствуют только в растительных клетках.

Структурная 1. Амфипатические липиды: фосфо- и гликолипиды 2. Специфические растительные стерины: ситостерин, стигмастерин, кампастерин. Состав фосфолипидов такой же, как в клетках животных; основной компонент - ФГ.

Запасная Триглицериды, воски 1. Широкая вариабельность ацильных цепей. 2. Являются основой для синтеза новых продуктов.

Биоэффекторы, элиситоры Оксилипины, эйкозаноиды Являются продуктами окисления ЖК липоксигеназой.

Другие функции Изопреноиды: хлорофиллы а и Ь, каротиноиды, токоферолы 1. Основа реакционных центров пигментов и светособирающих комплексов. 2. Защищают от фотоокисления. 3. Являются антиоксидантами.

липидов: ЖК, триглицериды, воски, фосфолипиды, гликолипи