Выделение и структурная характеристика белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКА} ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКО ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю./

На правах рукописи

Финкина Екатерина Ивановна

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВО-НЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 шр 2011

Москва - 2011

4840976

Работа выполнена в Учебно-научном центре Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

кандидат химических наук Овчинникова Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Габибов Александр Габибович

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Кочетков Сергей Николаевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук.

диссертационного с«^.*. „ при Учреждении Российской академии

наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7 Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан г.

Защита состоится

2011 г. в 7Ц часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Повсеместное присутствие патогенных микроорганизмов является одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, и способность противостоять их воздействию является ключевым моментом в жизни биологического вида. В ходе эволюции растения и животные выработали ряд эффективных защитных механизмов. Важнейшим компонентом защитной системы высших животных является адаптивный иммунный ответ, который характеризуется специфическим распознаванием микроорганизма и наличием иммунной памяти. Для растений описаны такие характерные только для них защитные стратегии как гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, обеспечение локальной и системной резистентности, в том числе путем синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или сокращенно PRP), и вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием.

Среди всех имеющихся в арсенале у растений защитных механизмов особый интерес у исследователей вызывает синтез PRP. Стресс-индуцируемые белки растений подразделяются на 17 классов и синтезируются только в ответ на воздействие неблагоприятных факторов, таких как присутствие фитонатогенов, дефицит влаги, механическое повреждение, изменение температуры или обработка химическими агентами. Общим для PRP является относительно низкая молекулярная масса, устойчивость к воздействию протеаз и сред с низкими значениями рН, наличие сигнальной последовательности в структуре предшественника, преимущественно внеклеточная локализация и антимикробная активность. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое число PRP из различных растений. Однако механизмы антимикробного действия большинства растительных антибиотиков до конца не исследованы и находятся в стадии изучения.

Интерес исследователей к PRP растений обусловлен возможностью их применения в сельскохозяйственной отрасли, которая несет огромные убытки из-за потери урожая культурных растений, поражаемых патогенными микроорганизмами, вирусами и

1

насекомыми-вредителями. Традиционные методы борьбы, основанные на искусственной селекции растений, в последнее время становятся неэффективными вследствие опережающей автоселекции патогенных микроорганизмов. Применение пестицидов и инсектицидов имеет такие негативные последствия как загрязнение окружающей среды, гибель непатогенной микрофлоры, насекомых и птиц, а также появление устойчивых патогенных микроорганизмов и насекомых. В этой ситуации перспективным представляется создание трансгенных растений, имеющих низкую себестоимость и повышенную устойчивость к фитопатогенам.

Второе направление для возможного применения растительных РЯР связано с их способностью наряду с фитопатогенами также эффективно подавлять рост патогенных для человека микроорганизмов. Такие характеристики как высокая специфичность действия и отсутствие токсического воздействия на животные клетки также свидетельствуют в пользу того, что растительные антимикробные белки и пептиды могут стать альтернативной заменой современных антибиотиков, эффективность использования которых постоянно снижается в связи со стремительно распространяющейся резистентностью бактерий и грибов.

Многие РЯР растений имеют аллергенную природу и являются причиной развития аллергических реакций на пыльцу, растительные пищевые продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важным направлением экспериментальной медицины, которое не только способствует пониманию причин и механизмов развития аллергии, но и имеет важное прикладное значение. Широко используемые для проведения аллергодиагностики экстракты растительных тканей представляют собой многокомпонентные смеси, сложность стандартизации которых зачастую является причиной ложно положительных или ложно отрицательных результатов. В то же время, для лечения аллергии используются различные фармакологические препараты, направленные в основном на устранение аллергических симптомов. Природные и рекомбинантные белковые растительные аллергены могут стать основой для создания новых диагностических тест-систем, а

также использоваться для специфической аллерговакцинации, направленной на снижение реактивности организма

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в поиске, выделении и структурно-функциональном исследовании новых белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения. В качестве объекта исследования была выбрана распространенная во многих странах, но малоизученная культура - чечевица обыкновенная Lens culinaris subsp. culinaris [семейство - бобовые (Leguminosae, Fabaceae), род - чечевица (Lens)]. Предметом исследования были разработка методик выделения и очистки, изучение структуры и биологических свойств антимикробных белков и пептидов, содержащихся в проращённых семенах чечевицы обыкновенной.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- поиск новых антимикробных белков и пептидов;

- разработка методик их выделения и очистки;

- определение полных аминокислотных последовательностей и структур кДНК, кодирующих предшественники антимикробных белков и пептидов;

- функциональная характеристика выделенных веществ.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящее время выделены и охарактеризованы PRP представителей различных ботанических семейств. Среди бобовых растений наиболее изученными культурами являются горох и фасоль. В ходе проведенной работы нами были обнаружены белково-пептидные антибиотики, обеспечивающие устойчивость к заболеваниям малоизученной бобовой культуры - чечевицы обыкновенной. Из проращённых семян чечевицы нами были выделены представители двух классов PRP, а именно: новый растительный дефенсин (PRP-12), подавляющий рост фитопатогенных грибов, и восемь новых липид-транспортирующих белков (Lipid Transfer Proteins или сокращенно LTP) (PRP-14), обладающих антимикробной активностью и проявляющих свойства аллергенов.

3

Полученные сведения обогащают наше преставление о врожденном иммунитете растений и могут стать основой для дальнейших структурно-функциональных исследований PRP белков и молекулярных механизмов их действия, а также для более детального изучения их антимикробных и аллергенных свойств с целью практического применения в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.

Апробация работы и публикации.

Результаты исследования были представлены на VII и VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004, 2006); на IV и V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009); Международной научно-практической конференции "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, 2008); XVI-XX1I зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003-2010); 111 Российском симпозиуме "Белки и пептиды (Москва, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 20072012 годы", конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2008), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009). По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на■¿гЮ страницах; содержит рисунков и ¿0_ таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка, включающего

наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение и фракционирование исходного препарата из проращённых семян

чечевицы обыкновенной Lens culinaris.

Растения содержат большое количество различных PRP, активация синтеза которых происходит под воздействием неблагоприятных абиотических и биотических факторов окружающей среды. Аналогичный эффект наблюдается при прорастании семени, когда нарушается целостность кожуры, являющейся эффективным физическим барьером, и молодой проросток оказывается в среде, густо населенной микроорганизмами. В настоящей работе нами был проведен поиск новых защитных белков и пептидов в проращённых семенах чечевицы.

Исходным препаратом для фракционирования служил суммарный белковый осадок, который был получен в результате гомогенизации проращённых в течение трех дней семян, экстракции буферным раствором (10 мМ Na2HP04, 15 мМ NaH2P04, 100 мМ КС1, 2 мМ ЭДТА), содержащим поливинилполипирролидон и смесь ингибиторов протеаз, и высаливания белков 75% сульфатом аммония. В качестве первой стадии разделения белков была проведена гель-фильтрация на колонке с Сефадексом G-75, уравновешенной 200 мМ ацетатом аммония с 2 М мочевиной, рН 7,0 (рис. 1). Далее, фракции, содержащие белки с Mr 3-6 и 7-10 кДа, объединяли и подвергали диализу с последующим разделением сначала на катионообменной колонке Mono S HR 5/5, а затем на обращенно-фазовой колонке Luna C¡8.

2. Выделение и структурно-функциональная характеристика нового дефенсииа

Lc-def.

Новый дефенсин чечевицы, названный Lc-def, был обнаружен и выделен в результате двухстадийного разделения объединенных фракций, полученных после гель-фильтрации и содержащих белки с Mr 3-6 кДа. Ионообменную хроматографию проводили на колонке Mono S в линейном градиенте концентрации ацетата аммония, рН 6,0 при умеренном давлении (рис. 2а). Масс-слектрометрический анализ полученных фракций выявил присутствие белка с m/z [М+Н]+ 5441,1 в пике 2. Дальнейшая его

5

Л"* фракции

А2»0 |1 I 2 I 3 I 4 | 5 I 6 i 7 I 8 I 91 1D| III I2II3Í14I 0,25-

Ст 5

10 И 12 13 14

252 294 336

Объем элюента, мл

Рис. 1. а - Разделение белков на колонке с Сефадексом 0-75. 6 - пептидный ПААГ-электрофорез фракций 1-14 после гель-фильтрации; Ст - смесь белков-стандартов молекулярных масс.

Рис. 2. а - Катионообмеипая хроматография на колонке Mono S объединенных фракций 1214, полученных после гель-фильтрации и содёржащих белки с Mr 3-6 кДа. Фракция 2 содержит белок с Mr 5,4 кДа. б - ВЭЖХ на колонке Luna Си фракции 2, полученной после хроматографии на колонке Mono S. Время выхода с колонки белка с Mr 5,4 кДа соответствует пику 2.

очистка осуществлялась с помощью ВЭЖХ на колонке Luna С1(| в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в присутствии 0,1% ТФУ (рис. 26). Частичная N-концевая аминокислотная последовательность выделенного белка (KTXENLSDSFKGPXIPDGN-), установленная методом автоматического микросеквенирования по Эдману, имела значительное сходство с соответствующими последовательностями дефенсинов бобовых растений. Выделенный дефенсин-подобный белок, названный Lc-def. содержал 8 остатков цистеина, образующих четыре дисульфидные связи, что характерно для растительных дефенсинов. Число цистеиновых остатков и дисульфидных мостиков определяли, используя реакцию алкилирования белка 4-винилпиридином без предварительного восстановления дититреитолом и после него.

Для того, чтобы определить полную аминокислотную последовательность Lc-def, нами была выделена суммарная РНК, проведены обратная транскрипция и амплификация 3'- и 5'-концевых фрагментов к ДНК, которая проводилась в три этапа На первом этапе была проведена ПЦР с двумя вырожденными ген-специфическими праймерами, комплементарными консервативным участкам нуклеотидной последовательности дефенсинов бобовых растений. На втором этапе амплификацию проводили с ген-специфическим праймером, комплементарным фрагменту сигнального пептида предшественника Lc-def. На третьем этапе использовалась система вложенных праймеров, комплементарных З'-нетранслируемой области кДНК. Структура полноразмерной кДНК предшественника дефепсина была установлена путем сопоставления результатов секвенирования 3'- и 5-концевых фрагментов и зарегистрирована в банке данных по нуклеотидным последовательностям GenBank под номером EF194158 (рис. За).

Установленная нами нуклеотидная последовательность включает в себя открытую рамку считывания длиной 222 п.о., кодирующую последовательность 74 аминокислотных остатков предшественника дефенсина. Анализ аминокислотной последовательности, транслированной с кодирующей нуклеотидной последовательности, с помощью алгоритма SignalP v.3.0 (htlp://\vww.cbs.dtu.dk/services/SignalP), показал высокую вероятность наличия

7

ME KK TVAALSFLFIVL 1 catatcactacttaagci atggetjafijaaasragisgc jrgoergtcdtc icttnaloghr^

праймер 5

F V A QE I AVTEA К T С E N L S D S F.......К

68 ttjHgceLaaijaaatagcfiijtg н.'иjttq(.a

133

132

праймер 7

G PCI PDGNCNKHC К FKEHLLS

ggaccatgcatcccagatggtaactgtaacaagcattgcaaggaaaaagagcacttacttagtg

GRCRDDFRCWCTRNC

196

197

gcaggtgcagggatgattttcgctgctggtgcactagaaactgt

aaatctcctttctccaacacgca 263

праймер 6 праймер 9

264 acgacattatatatatgaataaatagatatattccttgctagtagccaggactgcatctgtatgctata 332

праймер 8

333 ctgcttcgttgtgaattatgtgtgtaatcaatatcgt

369

VC-34)

■ УЦ-25)

УЦ23-34)

.4111(37-45) Xll(3S-47)

X135-4B) Х1У(4|-45)ХУ(4(,-47)

1(1-11)

УПЦ28-34)

X 1(35-45)

11(2-11) 1Х(28-4(|)

Рис. 3. а - Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Ьс-с1еГ и соответствующая ей аминокислотная последовательность предефенсина. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (показан светло-серым цветом) и зрелый белок (показан черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК. б - Триптические фрагменты восстановленного Ьс-с1е^ Серым цветом выделены аминокислотные остатки, по которым происходило расщепление.

Lens culi naris, Lc-def

Pisum sativum, Psd2

Phaseolus vulgaris

Phaseolus limensis, limenin

Trigonella foenvm-graecvm, Tfgdl

Pachyrrhízus erosus, SPE10

Vigila radlata

Vi.gna radlata, VrD2

Cicer arietinum

Medicago sátira, Msdefl

10 20 30 40 %И

..*......1...*.....*...*.....I....*.... I*.*...*

KTC^NI^DSFKGPCI PDGNOíKHCKEKÉHLI^GRCRDDFBCWCÍRNC 100

KTCENIiSGTFKGPCI PDGNQíKHCRNNEHLLSGRCRDDFRCWCTNRC 85

KTCSNMDTFROTCFATSNmDiiCKNKEHLLSGRCBBPFBCWCfRNC 79

KTSNI^TYKÍ^FTTG<OTDHCK№a;HLI^RCBDbFk^CTRNC 79

-TCÍNI^TFROTCFGNSN^F#CKTKHHLLSGRCRDDF№WCTKRC 77

KTCENMTFRGPCFTDGSCDDttCKNKÉHLIKiGRCíaiDFKCWCIRNC 77

KTI^NLVDlTRSPCFTTGSCDDaCKlWEHLI^GRCKDDVKCWCTRNe 75

KTCEMI^TYMa>CFTTGSCDDaCKNKSHLRSGRCf!DDFRCTCTRNC 72

-RCÉNÍADTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLVSGRCW3DFRCWCTKNC 70

RTC^NÍADKYRGPCF- -SGOTTHCTTKENAVSGRCMÍDFTICWCS'KRC 64

i___i_i__i_:_ i i i_i

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей Ьс-беГ и других дефенсинов бобовых растений: %И - процент идентичных аминокислотных остатков. Серым цветом выделены консервативные аминокислотные остатки: звездочками отмечены остатки цистеина, расположенные консервативно. Характерная для дефенсинов бобовых растений аранжировка дисульфидных связей представлена в нижней части рисунка.

характерного для растительных дефенсинов сигнального пептида, отщепляемого по связи Ala27-Lys28 и состоящего из 27 аминокислотных остатков. Соответствие транслированной последовательности кДНК аминокислотной последовательности выделенного Lc-def было подтверждено путем проведения триптического гидролиза восстановленного белка. Рассчитанные с помощью программы Protean (DNASTAR) молекулярные массы триптических фрагментов дефенсина соответствовали массам фрагментов выделенного Lc-def, определенных методом времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ (матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации) (рис. 36).

В результате нами была установлена полная аминокислотная последовательность нового дефенсина Lc-def, которая была зарегистрирована в банке данных по аминокислотным последовательностям UNIPROT под номером Р85530, а также структу ра его предшественника Зрелый Lc-def состоит из 47 аминокислотных остатков и имеет расчетную молекулярную массу 5440,21 Да (EditSeq, DNASTAR), совпадение которой с экспериментальным значением m/z молекулярного иона свидетельствует об отсутствии посттрансляционных модификаций у дефенсина чечевицы.

В литературных источниках приводится классификация растительных дефенсинов, подразделяющая их на четыре группы на основе особенностей структурной организации и функциональной активности этих белков. Все четыре группы характеризуются н&чичием консервативных аминокислотных остатков, которые, как предполагают, необходимы для проявления соответствующего спектра антимикробной активности. Однако классификация некоторых дефенсинов растений вызывает затруднения, поскольку их структурные и функциональные характеристики не вписываются ни в одну из ранее упомянутых четырех групп. Поиск в базах данных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) показал, что структура выделенного нами полноразмерного дефенсина чечевицы Lc-def имеет наибольшее сходство с неклассифицированными дефенсинами из семян бобовых растений (рис. 4). Дефенсины данного ботанического семейства обладают выраженной противогрибковой активностью и обеспечивают защиту трансгенных растений от

9

фитопатогенных грибов; в более высоких концентрациях они также подавляют рост бактерий. Помимо этого, данные белки ингибируют обратную транскриптазу ВИЧ-1, обладают митогенной активностью в отношении мышиных спленоцитов и антилролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток. Высокая степень гомологии и сходная функциональная активность дефенсинов бобовых растений дают основание выделить их в новую, пятую структурную группу, к которой и принадлежит выделенный нами Ьс-скГ

Таблица 1. Противогрибковое действие Lc-def.

Фнтопатогенные грибы IC50. мкМ/л

Aspergillus niger VKM F-2259 28,7

Aspergillus versicolor VKM F-l ] I4 18,5

Botrytis cinerea VKM F-3700 9,25

Fusarium culmorum VKM F-844 18,5-37

Fusarium oxysporum TCXA-4 >37

Neurospora crassa VKM F-l84 9,25-18,5

А 620 0,7

0,60,50,40,3 ■ 0,20,1 -О

■ контроль

□ 4,65 мкМ

□ 9,25 мкМ

□ 18,5 мкМ

□ 37 мкМ

Жк^

I

12

24 36

Время, ч

48

Рис. 5. Влияние Lc-def на рост Neurospora crassa.

Антимикробная активность Lc-def определялась методом серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде с культурой спор. Противогрибковая активность природного дефенсина была исследована в отношении двух фитопатогенных грибов из отдела аскомицетов Aspergillus niger VKM F-2259 и Alternaría altérnala VKM F-3047. Противогрибковая активность рекомбинантного аналога Lc-def, полученного в УНЦ ИБХ РАН в результате гетерологической экспрессии Lc-def в клетках £. coli BL-21 (DE3) в составе гибридного белка с модифицированным тиоредоксином А и октагистидиновой последовательностью, была исследована в отношении еще семи фитопатогенных грибов (Aspergillus versicolor VKM

F-1114, Fusarium solani VKM F-142, Fusarium culmorum VKM F-844, Fusarium oxysporum TCXA-4, Neurospora crassa VKM F-184, Botrytis cinerea VKM F-3700, Ascochytapisi VKM F-J173). Результаты тестирования показали, что дефенсин чечевицы характеризуется специфичностью действия и ингибирует рост шести использованных тест-культур (табл. 1). Наиболее чувствительными к Lc-def являются возбудители фузариоза и серой гнили бобовых и злаковых растений F. culmorum и В. cinerea, соответственно, а также N. crassa, 100% ингибирование роста которого наблюдается в присутствии Lc-def в коцентрации 37 мкм/л (рис. 5). В тоже время, дефенсин чечевицы не влияет на прорастание спор и рост таких фитопатогенов, как F. solani, A. allernata и A. pisi в максимальной использованной концентрации 37 мкм/л.

Характерную для растительных дефенсинов специфичность противогрибкового действия связывают с возможным механизмом их действия. В отличие от большинства катионных АМП дефенсины растений вызывают нарушение проницаемости клеточной мембраны фитопатогенных грибов не в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными компонентами мембраны, а в результате взаимодействия с высокоаффинными сайтами связывания на плазматической мембране грибной клетки. Идентифицированные для некоторых растительных дефенсинов сайты связывания представляют собой специфичные для разных видов фитопатогенных грибов кислые и нейтральные гликосфинголипиды. Следствием связывания растительного дефенсина со специфическим рецептором может являться либо встраивание его в мембрану фитопатогена с образованием ион-проницаемой поры, либо активация трансдуцирующих соединений, влияющих на активность ионных каналов или транспортеров. Является ли ингибирование грибкового роста прямым следствием изменения проницаемости мембраны фитопатогена или результатом взаимодействия растительных дефенсинов с внутриклеточной мишенью, пока остается неясным.

Помимо антимикробной активности в литературе была описала способность растительных дефенсинов специфически ингибировать активность протеолитических ферментов. Два негомологичных дефенсина из семян кассии трубчатой (Cassia fistula) и вигны початковой (Vigna unguiculata) ингибируют активность трипсина, но не влияют на

11

протеолитические свойства химотрипсина. Авторами было высказано предположение о механизме ингибирования, в основе которого лежит взаимодействие Lys25 дефенсина кассии или Lys 11 тионина Ср-1 вигны с трипсином. Учитывая, что выделенный нами дефенсин чечевицы Lc-def содержит оба значимых, по мнению авторов гипотезы, остатков Lys, нами было проведено исследование влияния Lc-def на активность трипсина и химотрипсина с использованием в качестве субстратов L-BAPNA (п-питроанилид-а-М-бензоил-ОХ-аргинина) и ct-казеина, соответственно. Было показано, что Lc-def не влияет на активность упомянутых протеолитических ферментов. Таким образом, нами установлено, что присутствие в структуре растительных дефенсинов аминокислотных остатков Lys] 1 и Lys25 не является достаточным условием для проявления способности ингибировать активность трипсина.

Все дефенсины растений имеют схожую третичную структуру, представленную тремя складчатыми ^-листами и одной а-слиралью фофр конфигурация) и стабилизированную четырьмя дисульфидными связями (Cys'-Cys8, Cys2-Cys5, Cys3-Cys6 и Cys4-Cys7). Дисульфидная связь Cys'-Cys8 образована цистеинами, расположенными соответственно в N- и С-концевых участках структуры, что делает дефенсины растений псевдоциклическими белками. Проведенный триптический гидролиз нативного Lc-def позволил получить информацию об организации дисульфидных связей. Ограниченный протеолиз нативного белка привел к образованию девяти пептидов: N-концевого фрагмента 1, С-концевого фрагмента XI (рис. 36) и семи крупных фрагментов, стабилизированных дисульфидными связями, пять из которых характеризовались разрывом одной (Cys'-Cys8) дисульфидной связи. Процент расщепленного белка в данных условиях был очень низким, что свидетельствовало о стабильности структуры и устойчивости нативного дефенсина чечевицы к действию протеолитического фермента. На основании полученных данных нами было выдвинуто предположение, что в структуре выделенного Lc-def присутствует характерная для растительных дефенсинов связь Cys'-Cys8, которая является наиболее лабильной. Разрыв этой связи, по-видимому, приводит к размыканию псевдоцикла и делает более доступными для трипсина N- и С-концевые участки молекулы Lc-def.

3. Выделение и структурно-функциональная характеристика новых липид-транспортирующих белков Lc-LTP.

Четыре новых LTP чечевицы были выделены в результате последовательного разделения объединенных после гель-фильтрации фракций, содержащих белки с Mr 7-10 кДа, сначала на катионообменной колонке Mono S, а затем на обращенно-фазовой колонке Luna С]8(рис. 6) Элюирование белков в случае ионообменной хроматографии осуществляли линейным градиентом концентрации ацетата аммония, pH 6,0. Белки с молекулярной массой около 9 кДа были обнаружены в основной фракции 3, которую далее разделяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в присутствии 0,1% ТФУ. Масс-спектрометрический анализ полученных после ВЭЖХ фракций выявил присутствие двух молекулярных ионов с m/z [М+Н]+ 9121,9 и 9135, во фракции, соответствующей пику 1, и двух молекулярных ионов с m/z [М+Н]+ 9269,1 и 9283,1 во фракции, соответствующей плечу Г. Последовательности первых 24 аминокислотных остатков, установленные методом N-концевого автоматического микросеквенирования по Эдману, оказались идентичными для всех четырех белков (AISXGAVTSDLSPXLTYLTGGPGP-). N-Концевая аминокислотная последовательность выделенных белков, гомологичная первичной структуре белков подкласса LTP1, была депонирована в базы данных SWISS-PROT и TrEMBL под номером Р84255. В результате проведенной реакции алкилирования белков 4-винилпиридином без предварительного восстановления дититреитолом и после него было показано, что каждый из выделенных LTP чечевицы содержит 8 остатков цистеина, образующих четыре дисульфидных связи.

С-концевые аминокислотные остатки были определены путем расщепления белков смесью карбоксипептидаз А и В. В гидролизате LTP из фракции 1 были идентифицированы С-концевые аминокислоты Lys>Val>Thr>Asn. В гидролизате LTP из фракции Г был обнаружен также типичный для белков подкласса LTP1 остаток фенилаланина: Phe>Lys>Val>Thr>Asn.

а б

Рис. 6. а - Катионообменная хроматография объединенных после гель-фильтрации фракций, содержащих белки с Mr 7-9 кДа, на колонке Mono S, и элекгтрофоретический анализ гомогенности фракции 3. 6 - ВЭЖХ на колонке Luna Сщ фракции 3, полученной после катионнообменной хроматографии; Lc-LTP присутствуют во фракциях I и Г.

На основании того, что разница m/z [М+Н]+ для каждой пары выделенных белков (9269,1/9121,9 и 9283,1/9135,9) составляет 147,2 Да, нами было высказано предположение, что белки с m/z [М+Н]+ 9121,9 и 9135,9 отличаются отсутствием С-концевого остатка Phe от белков с m/z [М+Н]+ 9269,1 и 9283,1, соответственно. Для того, чтобы доказать правильность этого предположения, решено было установить полные первичные структуры LTP чечевицы с помощью молекулярного клонирования и секвенирования кДНК.

Для установления структур кДНК использовали метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE). Структура вырожденных ген-специфических праймеров для амплификации З'-концов кДНК на первом этапе была выбрана, исходя из N-концевой аминокислотной последовательности выделенных LTP. На втором этапе для амплификации 5'-кониов кДНК были использованы ген-специфические праймеры,

комплементарные З'-нетранслируемым областям кДНК (рис. 1а). В результате клонирования и секвенирования 3'- и 5'-концевых фрагментов нами была установлена структура шести полноразмерных кДНК предшественников LTP. Пять нуклеотидных последовательностей [номера GenBank: AY793553 (Lc-LTPl), АУ793554 (Lc-LTP2), AY793555 (Lc-LTP3), AY793558 (Lc-LTP4), AY793557 (Lc-LTP6)] включают в себя открытую рамку считывания длиной 354 п.о., кодирующую белки-предшественники, состоящие из 118 аминокислотных остатков. Шестая последовательность [номер GenBank AY793556 (Lc-LTP5)] содержит открытую рамку считывания длиной 348 п.о., кодирующую укороченный на две аминокислоты (в том числе на С-концевой фенилаланин) белок-предшественник, состоящий из 116 аминокислотных остатков. Анализ аминокислотных последовательностей с помощью алгоритма SignalP v.3.0 показал высокую вероятность наличия сигнального пептида, состоящего из 24-25 аминокислотных остатков и отщепляемого но связям А1а25-А1а26 (в случае Lc-LTPl и LC-LTP3), Gly25-Ala26 (для Lc-LTP2, LC-LTP4 и Lc-LTP6) и Gly24-Ala25 (в случае Lc-LTP5). Три из выделенных LTP чечевицы (Lc-LTP2,4,6) очень близки по своей структуре. Lc-LTP2 и Lc-LTP4 различаются между собой всего двумя аминокислотными остатками: в положении 85 в зрелой части белков (Thr/Ser) и в положении 14 в сигнальном пептиде (Met/Ile). Изоформы LC-LTP4 и Lc-LTP6 отличаются только на один аминокислотный остаток в положении 77 (Asn/Asp). Наименьшее сходство со структурами других липид-транспортирующих белков чечевицы имеет Lc-LTPl (рис. 8). Выделенные нами липид-транспортирующие белки из чечевицы обладают высокой степенью гомологии с LTP из семян нута Cicer arietinunr. 76% идентичных остатков в случае Lc-LTP2 и 77% для Lc-LTP4.

Для того, чтобы соотнести аминокислотные последовательности, транслированные с кодирующих нуклеотидных последовательностей, с таковыми у выделенных LTP. был проведен триптический гидролиз восстановленных и S-пиридилэтилированных белков, который привел к образованию 13 фрагментов (рис. 76).

М А I? йМ К L А С V V V I

С М V VI А РМА Е С А I Э С О АУТЭР ЬЭРСЬТУиТ 91 Ь^дию^аМаИсспссШаослаааппМ^^^ 180

181

270

NCLKSAAGSITKLNTNNAAALPGKCGVN 1Р

271

УК15ТТТМСМТУКР

асаада«сад!ассассассаас1д1аа1асадЦаадЦ

451 аа№ас1ад1дсддссдсс1дсадд1сдас б

_II (1-34)_ _ VI (35-53)

1ааада1да1дидсддиссааддс1аиада1ддаа1шс1сад1 450

480

праймер 15

X (54-73)

XIII (74-92)

№5

I (1-33)

111(35-45) V (46-53) VIII (54-61) IX (62-73) XI (74-81) XII (82-92)

IV (34-45)

VII (34-53)

Рис. 7. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Ьс-ЬТР2, и соответствующая ей аминокислотная последовательность пребелка. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (показан светло-серым цветом) и зрелый белок (показан черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК. б - Триптические фрагменты восстановленных Ьс-ЬТР2,4,6. Серым цветом выделены аминокислотные остатки, по которым происходило расщепление.

1 10 20 30 40 50 60

Рис. 8. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников Lc-LTPl-8. Светло-серым цветом выделены сигнальные пептиды, черным - зрелые белки, аминокислотные замены показаны белым цветом.

Рассчитанные с помощью программы Protean (DNASTAR) молекулярные массы триптических фрагментов Lc-LTP2,4,6 соответствовапи массам фрагментов выделенных LTP. определенных методом времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ. Принимая во внимание то, что разница между молекулярными массами Lc-LTP4 и Lc-LTP6 составляет всего 1,0 Да, было выполнено микросеквенирование фрагмента XI CGV(A'.Z))]PYK при помощи тандемной времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ. которое позволило нам идентифицировать остаток Asn77. В результате нами было установлено, что выделенные LTP чечевицы с m/z молекулярных ионов [М+Н] 9269.1 и 9283.1 соответствуют зрелым белкам Lc-LTP4 и Lc-LTP2 (расчетные молекулярные массы 9268.7 Да и 9282,7 Да. соответственно; EditSeq, DNASTAR). Выделенные белки с m/z молекулярных ионов [М+Н]+ 9121.9 и 9135,9, названные LC-LTP8 и Lc-LTP7. являются укороченными изоформами Lc-LTP4 и Lc-LTP2 без С-концевого Phe (расчетные молекулярные массы 9121,5 Да и 9135,5 Да соответственно: EditSeq. DNASTAR. рис. 8). Так как в процессе выделения белков использовался коктейль ингибиторов протеаз. присутствие укороченных изоформ Lc-LTP7.8. возможно, является

результатом экспрессии соответствующих генов или ферментативного отщепления С-концевого остатка непосредственно в растительных клетках.

Таблица 2. Антимикробное действие LC-LTP2/4.

Тест-микроорганизмы

1С5о, мкМ/л

Грамотрицательные бактерии

Agrobaclerivm tumefaciens А2&1 27-40,5

Фитопатогенные грибы

Aspergillus niger VKM F-2259 17,5

Botrytis cinerea VKM F-3700 10,85-21.7

Fusarium culmorum VKM F-844 >21,7

Neurospora crassa VKM F-l 84 >21,7

Phylophthora infestans de Bary >18,3

УДАЧА 2

А 620 0,8 0,7 -0,6 0,5 -0,4 -0,3 0,2 0,1 -0

■ контроль ЕЭ 13,5 мкМ

□ 27 мкМ В 40,5 мкМ

□ 54 мкМ

12

18 24 Время, ч

Рис. 9. Влияние Lc-L.TP2/4 на рост Agrobaclerivm tumefaciens.

30

Литературные источники свидетельствуют, что присутствие нескольких изоформ белков в одном растении типично для класса LTP. Представители данного класса обладают антимикробной активностью и способностью связывать и переносить липиды. являются многофункциональными белками и, предположительно, принимают участие в таких биологических процессах в растениях, как синтез кутина, эмбриогенез, адаптация к стрессу (холод, засуха, засоление почвы и т.д.), защита растений от фитопатогенов. Различные изоформы LTP. как полагают, выполняют различные функции в растениях, и уровень их экспрессии зависит от условий окружающей среды. В подтверждение присутствия в семенах чечевицы множественных изоформ LTP нами были обнаружены мРНК шести белков Lc-LTPl-б. которые, по-видимому, синтезируются на разных стадиях развития растения. Синтез изоформ Lc-LTP2.4.7.8 выделенных нами из проращённых в течение трех дней семян чечевицы, происходит на ранней стадии развития проростков и. возможно, обусловлен участием этих белков в борьбе с

инфекциями и мобилизации липидов при переходе эмбриональных клеток из фазы покоя в фазу активного метаболизма при прорастании семян.

Защитная функция выделенных LTP была подтверждена наличием антимикробной активности, которую определяли, как и в случае дефенсина. методом серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде. Антимикробная активность природных LTP чечевицы была исследована в отношении двух фитопатогенных грибов - Aspergillus niger VKM F-2259 и Alternaría altérnala VKM F-3047. а также в отношении грамотрицательной бактерии Agrobacterium tumefaciens А281. Исследование влияния природных LTP чечевицы на рост оомицета Phytophthora Infeslans (Mont.) de Вагу УДАЧА 2, возбудителя фитофтороза. было проведено в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. Противогрибковая активность рекомбинантного аналога Lc-LTP2, полученного в УНЦ ИБХ РАН в результате его гетерологической экспрессии в клетках £. coli BL-2I (DE3) в составе гибридного белка с модифицированным тиоредоксином А и октагистидиновой последовательностью, была также исследована в отношении еще семи фитопатогенных грибов (Aspergillus versicolor VKM F-1114, Fusarium solani VKM F-142, Fusarium culmorum VKM F-844, Fusarium oxysporum TCXA-4, Neurospora crassa VKM F-184. Botrytis cinerea VKM F-3700, Ascochyta pisi VKM F-1173). Результаты тестирования показали, что LTP чечевицы обладают как антибактериальной, так и противогрибковой активностью и ингибируют рост шести использованных тест-культур (табл. 2). Наиболее чувствительными к LTP чечевицы являются возбудители аспергиллезной и серой гнили растений A. niger и В. cinerea. соответственно, а также почвенная бактерия A. tumefaciens. вызывающая опухоли у растений (рис. 9). В тоже время, LTP чечевицы не влияют на прорастание спор и рост таких фитопатогенов. как A. versicolor. А. alternara. A. pisi, F. oxysporum и F. solani в максимальной использованной концентрации 21.7 мкм/л.

Установлено, что представители класса LTP так же, как и многие другие PRP. являются растительными аллергенами, участвующими в развитии аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Чечевица является основным

19

ES1 ES2 ES3 NL4 NL5 NL6 NL7

кДа

I

¡ps щ h' \ \ ' ж н

ЯВ IK

7

в Ий

I- 17 - 14

I- 6

• 3

бобовым растением, вызывающим аллергические реакции у детей, живущих в странах Средиземноморского бассейна и в Индии. Ранее в семенах чечевицы были обнаружены всего два аллергена: субъединица у-вицилина Len с 1 (47 кДа) и специфический для семян «а» ни& биотинилированный белок Len с 2 (66 кДа).

ММ te

ЦР ЦР * - ИЦ ^ Совместно с отделом экспериментальной

: U иммунологии Академического медицинского

центра г. Амстердама (Нидерланды) нами было проведено исследование взаимодействия природных LTP чечевицы и рекомбинантного аналога Lc-LTP2 с IgE из сывороток пациентов с пищевой аллергией. Результаты иммуноблоттинга (рис. 10) и иммуноферментного анализа с использованием тест-системы ImmunoCap показали, что в сыворотках пациентов с пищевой аллергией на чечевицу, горох, орехи, фрукты и другие продукты присутствуют IgE, специфичные к LTP чечевицы. Анализ полученных данных позволил прийти к выводу о том, что LTP чечевицы являются перекрестными аллергенами и имеют наибольшее сходство с Ara h 9 из арахиса LTP чечевицы были внесены нами в базу данных по аллергенам (www.allergen.org) Международного союза иммунологических обществ (1U1S) под аббревиатурой Len с 3. Таким образом, чечевица является третьим после арахиса и стручковой фасоли бобовым растением, из которого были выделены LTP. охарактеризованные как новые аллергены.

Рис.10. Иммуноблотгиш Ьс-ЬТР2/4 с сыворотками пациентов с пищевой аллергией из Испании (ЕБ) и Нидерландов (ЫЕ). Детектирование специфичных проводили

авторадиографией, используя |ь1-меченные овечьи антитела.

выводы

1. В семенах чечевицы Lens culinaris обнаружено 9 новых PRP, выполняющих защитную функцию в растениях, а именно: новый растительный дефенсин Lc-def и подсемейство из 8 новых липид-транспортирующих белков Lc-LTPl-8. Разработаны методики выделения растительного дефенсина Lc-def и четырех липид-транспортирующих белков из проращённых семян чечевицы Lens culinaris. Определены полные аминокислотные последовательности выделенных PRP.

2. Установлены структуры полноразмерных кДНК, кодирующих белки-предшественники дефенсина Lc-def и шести изоформ липид-транспортирующих белков из семян чечевицы Lens culinaris, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности предшественников этих белков.

3. Проведено исследование функциональной активности выделенных PRP. Показано, что дефенсин чечевицы Lc-def обладает противогрибковой активностью и характеризуется специфичностью действия в отношении ряда фитопатогенных грибов. Показано, что липид-транспортирующие белки чечевицы обладают антибактериальной активностью и ингибируют рост фитопатогенных грибов.

4. Установлено, что липид-транспортирующий белок чечевицы Lc-LTP2 является новым пищевым аллергеном. Lc-LTP2 внесен в международную базу данных по аллергенам как Len с 3.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Финкина Е.И., Баландин C.B., Серебрякова М.В., Потапенко H.A., Тагаев A.A., Овчинникова Т.В. Выделение и первичная структура новых липид-транспортирующих белков из проращённых семян чечевицы (Lens culinaris) II Биохимия. - 2007. - Т.72. - №4. - С.533-543.

2. Finkina E.I., Shramova Е.1., Tagaev A.A., Ovchinnikova T.V. A novel defensin from the lentil Lens culinaris seeds // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2008. - Vol.371(4). - P.860-865.

3. Овчинникова T.B., Финкина Е.И., Баландин C.B. Плазмидный вектор pE-Lc-LTP, штамм бактерии Escherichia coli для экспрессии липид-транспортирующих белков чечевицы Lens culinaris и способ получения указанных белков // Заявка на патент РФ №2009129838 (041521) от 04.08.2009.

4. Баландин C.B., Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-Trx-Lc-def. штамм Escherichia coli для экспрессии антимикробного пептида дефенсина чечевицы Lens culinaris и способ получения указанного пептида. Заявка на патент № 2010154169 от 30.12.2010г.

5. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Выделение белково-пептидных антибиотиков из семян чечевицы Ervum lens II Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - M., 2004., С. 43.

6. Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Структура мРНК, кодирующих новые липид-транспортирующие белки из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris II Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова - M., 2004. - С. 45.

7. Финкина Е.И., Серебрякова М.В., Потапенко H.A., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Аминокислотные последовательности новых липид-транспортирующих белков из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris II Тезисы докладов и стендовых сообщений XVJI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2005., С. 51.

8. Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Новый дефенсиноподобный белок из семян чечевицы Lens culinaris II Тезисы докладов и стендовых сообщений XVII] зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - M., 2006., С.53.

9. Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Новый дефенсин из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова. - M., 2006., С. 70.

10. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Новый дефенсин из семян чечевицы Lens culinaris H Тезисы стендовых сообщений 111 российского симпозиума "Белки и пептиды". - Пушино, 2007., С. 20.

11. Т.В. Овчинникова, C.B. Баландин, A.A. Василевский, Ц.А. Егоров, С.А. Козлов, К.А. Плужников, Е.А. Рогожин, A.A. Тагаев, Е.И. Филясова, Е.И. Финкина, З.О. Шенкарев, Е.В. Гришин. Антимикробные пептиды природного происхождения: поиск, структурный анализ, биологические свойства, методы получения и применение для конструирования лекарственных средств нового поколения // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы". - M., 2007., С. 45.

12. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Выделение и первичная структура нового дефенсина из проращённых семян чечевицы Lens culinaris II Тезисы Четвертого Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М., 2007., С. 308.

13. Т.В.Овчинникова, C.B. Баландин, A.A. Тагаев, Е.И. Финкина, З.О. Шенкарев, З.А. Якименко. Создание лекарственных средств нового поколения на основе природных антимикробных пептидов. Тезисы докладов на конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки -медицине», Москва, 2008, с. 158-159.

14. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. PR-белки из семян чечевицы Lens culinaris II Тезисы докладов и стендовых сообщений XX зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2008., С. 23.

15. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Структурно-функциональная характеристика PR-белков из проращённых семян чечевицы Lens culinaris И Тезисы Международной научно-практической конференции "Биотехнология. Вода и пищевые продукты". - М., 2008., С. 227.

16. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Получение рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы обыкновенной Lens culinaris II Тезисы докладов и стендовых сообщений XXI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". -М., 2009., С.66.

17. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Изучение нового липид-транепортирующего белка чечевицы Lens culinaris // Тезисы Пятого Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития",- М., 2009., С.338.

18. Алексеева Е.А., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Исследование нового дефенсина из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы Пятого Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".- М., 2009., С.294.

19. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Гетерологическая экспрессия липид-транспортирующего белка чечевицы в клетках Е. coli // Тезисы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. - М., 2009., С. 137.

20. Алексеева Е.А., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Получение рекомбинантного дефенсина чечевицы Lens culinaris II Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2010., С.90.

Напечатано с готового оригинала-макета ООО «Документ сервис «ФДС»»

ИНН 772801001 Подписано к печати 25.02.2011 г.

Тираж 100 экз. Заказ 463. Тел. 935-00-89. Тел./факс 432-99-96 119421, г. Москва, Ленинский проспект, д. 99.

61 11-2/382

УЧРЕЖДЕНИЕ [ЩМИИ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

Финкина Екатерина Ивановна

Выделение и структурная характеристика белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -кандидат химических наук Т.В. Овчинникова

Москва-2011

Оглавление

1. Введение..........................................................................................................................................4

2. Белково-пептидные антибиотики как компоненты врожденного иммунитета растений (обзор литературы).............................................................................................................................7

2.1. Механизмы распознавания фитопатогена............................................................................9

2.1.1. РАМР-активируемый иммунитет растений.................................................................10

2.1.2. Активируемый эффекторами иммунитет растений.....................................................15

2.1.3 Передача сигнала.............................................................................................................18

2.2. Основные защитные стратегии растений............................................................................23

2.3. Белково-пептидные антибиотики растений....................................................................26

2.3.1. Общая характеристика...................................................................................................26

2.3.2. Возможные механизмы антимикробного действия.....................................................34

2.3.3. Растительные PRP...........................................................................................................40

2.3.4. Другие антимикробные белки.......................................................................................72

2.3.5. Растительные АМП.........................................................................................................77

2.4. Стратегии возможного применения растительных белково-пептидных антибиотиков 82

3. Материалы и методы...................................................................................................................88

3.1. Оборудование........................................................................................................................88

3.2. Реактивы и расходные материалы.......................................................................................89

3.3. Методы...................................................................................................................................93

3.3.1. Выделение PRP из семян чечевицы..............................................................................93

3.3.2. SDS-электрофорез...........................................................................................................95

3.3.3. Электроблоттинг.............................................................................................................97

3.3.4. Масс-спектрометрический анализ.................................................................................97

3.3.5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности..............................98

3.3.6. Определение С-концевых аминокислотных остатков.................................................98

3.3.7. Восстановление и алкилирование.................................................................................99

3.3.8. Триптический гидролиз................................................................................................100

3.3.9. Выделение суммарной РНК........................................................................................100

3.3.10. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE).........................101

3.3.11. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР...................................................103

3.3.12. Определение антимикробной активности................................................................104

3.3.13. Исследование влияния выделенных белков на активность протеолитических ферментов................................................................................................................................106

3.3.14. Исследование взаимодействия LTP чечевицы с IgE...............................................107

4. Результаты и обсуждение..........................................................................................................108

4.1. Получение и фракционирование исходного препарата из проращенных семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris....................................................................................109

4.2. Выделение и структурно-функциональная характеристика нового дефенсина Lc-def ......................................................................................................................................................112

4.3. Выделение и структурно-функциональная характеристика ингибиторов протеаз.....128

4.4. Выделение и структурно-функциональная характеристика новых липид-транспортирующих бежов Lc-LTP..........................................................................................130

5. Выводы........................................................................................................................................145

6. Благодарности.............................................................................................................................146

7. Библиографический список.......................................................................................................147

8. Список сокращений...................................................................................................................169

1. Введение

Повсеместное присутствие патогенных микроорганизмов является одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, и способность противостоять их воздействию является ключевым моментом в жизни биологического вида. В ходе эволюции растения и животные выработали ряд эффективных защитных механизмов. Важнейшим компонентом защитной системы высших животных является адаптивный иммунный ответ, который характеризуется специфическим распознаванием микроорганизма и наличием иммунной памяти. Для растений описаны такие характерные только для них защитные стратегии как гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, обеспечение локальной и системной резистентности, в том числе путем синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или PRP), и вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием.

Среди всех имеющихся в арсенале растений защитных механизмов особый интерес у исследователей вызывает синтез PRP. В настоящее время выделены и охарактеризованы PRP представителей различных ботанических семейств. Эти стресс-индуцируемые белки растений подразделяются на 17 классов и синтезируются только в ответ на воздействие неблагоприятных факторов, таких как присутствие фитопатогенов, дефицит влаги, механическое повреждение, изменение температуры или обработка химическими агентами. Общим для PRP является относительно низкая молекулярная масса, устойчивость к воздействию протеаз и сред с низкими значениями рН, наличие сигнальной последовательности в структуре предшественника, преимущественно внеклеточная локализация и антимикробная активность. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое число PRP из различных растений. Однако механизмы антимикробного действия большинства растительных антибиотиков до конца не исследованы и находятся в стадии изучения.

Интерес исследователей к РИР растений обусловлен возможностью их применения в сельскохозяйственной отрасли, которая несет огромные убытки из-за потери урожая культурных растений, поражаемых патогенными микроорганизмами, вирусами и насекомыми-вредителями. Традиционные методы борьбы, основанные на искусственной селекции растений, в последнее время становятся неэффективными вследствие опережающей автоселекции патогенных микроорганизмов. Применение пестицидов и инсектицидов имеет такие негативные последствия, как загрязнение окружающей среды, гибель непатогенной микрофлоры, насекомых и птиц, а также появление устойчивых патогенных микроорганизмов и насекомых. В этой ситуации перспективным представляется создание трансгенных растений, имеющих низкую себестоимость и повышенную устойчивость к фитопатогенам.

Второе направление для возможного применения растительных РЯР связано с их способностью наряду с фитопатогенами эффективно подавлять рост патогенных для человека микроорганизмов. Такие характеристики, как высокая специфичность действия и отсутствие токсического воздействия на животные клетки, также свидетельствуют в пользу того, что растительные антимикробные белки и пептиды могут стать альтернативой современных антибиотиков, эффективность использования которых постоянно снижается в связи со стремительно растущей резистентностью бактерий и грибов.

Многие РЫР растений имеют аллергенную природу и являются причиной развития аллергических реакций на пыльцу, растительные пищевые продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важным направлением экспериментальной медицины, которое не только способствует пониманию причин и механизмов развития аллергии, но и имеет важное прикладное значение. Широко используемые для проведения аллергодиагностики экстракты растительных тканей представляют собой многокомпонентные смеси, что осложняет их стандартизацию и зачастую является причиной ложно положительных или ложно отрицательных

результатов. В то же время, для лечения аллергии используются различные фармацевтические препараты, направленные в основном на устранение аллергических симптомов. Природные и рекомбинантные белковые растительные аллергены могут стать основой для создания новых диагностических тест-систем, а также использоваться для специфической аллерговакцинации, направленной на снижение чувстсвительности организма к аллергенам.

Целью работы являлся поиск, выделение и структурно-функциональное исследование новых белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения. В качестве объекта исследования была выбрана распространенная во многих странах, но малоизученная культура - чечевица обыкновенная Lens culinaris subsp. culinaris [семейство - бобовые (Leguminosae, Fabaceae), род - чечевица (Lens)]. В задачи работы входили поиск новых антимикробных белков и пептидов, разработка методик их выделения и очистки, определение полных аминокислотных последовательностей и структур кДНК, кодирующих предшественники антимикробных белков и пептидов, а также функциональная характеристика выделенных веществ.

2. Белково-пептидные антибиотики как компоненты врожденного иммунитета растений (обзор литературы)

Патогенные микроорганизмы являются повсеместно присутствующими универсальными факторами, и устойчивость к ним является результатом выработанных в процессе эволюции у растений и животных защитных механизмов. В то же время, существует обратная связь, и любые новые механизмы защиты хозяина приводят к коэволюционной адаптации патогена и возникновению новых способов его проникновения и распространения. Несмотря на существенную разницу в клеточной организации и образе жизни растений, животных и патогенных микроорганизмов, в стратегиях атаки, защиты и контратаки этих эволюционно отдаленных организмов просматриваются сходные элементы [306].

Важнейшим компонентом защитной системы позвоночных животных является адаптивный иммунный ответ, который характеризуется специфическим распознаванием микроорганизма, выработкой антител и наличием иммунологической памяти, позволяющей эффективно подавлять развитие инфекции при повторном проникновении патогена в организм. Более древние истоки имеет общая для позвоночных, беспозвоночных животных и растений система врожденного иммунитета, основанная на распознавании так называемых патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (Pathogen Associated Molecular Patterns или PAMP). Основную сенсорную функцию по распознаванию РАМР у растений и животных выполняют специфические паттерн-распознающие рецепторы (Pattern Recognition Receptors или PRR). Передача сигнала о распознавании РАМР посредством каскада митоген-активируемых протеинкиназ (Mitogen-Activated Protein Kinases или МАРК) приводит к активации биосинтеза антимикробных пептидов (АМП). Сходство системы врожденного иммунитета растений и животных может являться результатом как дивергентной, так и конвергентной эволюции, в ходе которой

и те, и другие подвергались атакам микроорганизмов со схожими факторами вирулентности [22].

Большинство растительных видов устойчиво к потенциальным микробным агрессорам. Механизмы защиты растений от фитопатогенов условно подразделяются на конститутивные (пассивные) и индуцированные (активные). К пассивным механизмам, формирующим первую линию защиты, относят анатомо-морфологические особенности, химический состав тканей, скорость прохождения фаз онтогенеза, характерные для растений физиологические и биохимические системы, способные препятствовать внедрению и развитию патогена. Активные механизмы устойчивости запускаются только в ответ на атаку патогенного микроорганизма и чаще всего связаны с изменениями в спектре экспрессируемых генов. К этим механизмам относятся утолщение клеточной стенки, гиперчувствительный ответ (Hypersensitive Response или HR), образование активных форм кислорода (АФК) и азота, накопление вторичных метаболитов, локальная и системная приобретенные резистентности (Localized Acquired Resistance или LAR и Systemic Acquired Resistance или SAR, соответственно), синтез АМП и других PRP. Следует отметить, что запуск активных механизмов происходит под действием не только биотических, но и абиотических факторов, в качестве которых для растений выступают механическое повреждение, дефицит влаги, изменение температуры и обработка химическими агентами, элиситорами, эндогенными регуляторами роста [8;9].

Основными этапами патогенеза микробной инфекции являются внедрение и проникновение фитопатогена, стабилизация и распространение инфекции за счет подавления иммунной защиты растения, изменения метаболизма в зараженных клетках и тканях и транспорта патогена по растению [2]. Внедрение фитопатогена может происходить через раны и неповрежденную поверхность, в том числе через устьица. В случае проникновения через неповрежденную поверхность фитопатогену для её

прободения необходимо преодолеть конституциональные барьеры, к которым относятся кутикула и ригидная клеточная стенка. Для проникновения через устьица фитопатогенные микроорганизмы формируют специальные инфекционные структуры [132;326].

Особенностью строения растительных клеток является наличие пластид (хлоропластов, хромопластов и лейкопластов), центральной вакуоли и клеточной стенки, которая у высших растений состоит приблизительно на 10% из белков и на 90% из полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлозы и пектина). У многих растений первичная клеточная стенка, состоящая из вышеперечисленных компонентов, утолщается, пропитывается лигнином (продуктом полимеризации ароматических спиртов) и суберином (глицеридом феллоновой и пробковой кислот), образуя тем самым вторичную клеточную стенку. Кутикула покрывает большинство органов растения и состоит из воска и кутина (нерастворимого сополимера диоксипальмитиновой и оксиолеиновой кислот, этерифицированных спиртами) [2].

Патогены секретируют широкий спектр ферментов (целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, кутиназы), разрушающих кутикулу и клеточную стенку растений, и используют продукты деградации в качестве источника питательных веществ. Растения в свою очередь вырабатывают специфические ингибиторы микробных ферментов и обладают способностью распознавать фрагменты собственных клеточных стенок, которые являются индукторами (элиситорами) защитных механизмов врожденного иммунитета [173].

2.1. Механизмы распознавания фитопатогена

Активация защитных механизмов растения происходит под действием не только биогенных, но и абиогенных элиситоров. К абиогенным элиситорам, не принимающим участие в процессе патогенеза, относятся ионы тяжелых металлов, УФ-излучение, ингибиторы различных звеньев метаболизма растений, фенольные соединения, хиноны и антибиотики [2]. Биогенные

элиситоры растений подразделяются на первичные (экзогенные), источником которых являются патогенные микроорганизмы, и вторичные (эндогенные), которые являются растительными продуктами и образуются в процессе патогенеза. Первичные элиситоры в свою очередь разделяются на неспецифические, которые активируют каскад защитных реакций независимо от вида растения и вирулентности патогена, и специфические.

2.1.1. РАМР-активируемый иммунитет растений

Общим свойством врожденного иммунитета растений и животных является способность распознавания неспецифических элиситоров, получивших название патоген- или микроб-ассоциированных молекулярных паттернов (Pathogen/Microbe Associated Molecular Patterns или PAMP/MAMP). В качестве РАМР, активирующих защитные системы растений и животных, выступают консервативные структуры, необходимые для жизнедеятельности большинства патогенных микроорганизмов [35;60;73;81]. По химической природе РАМР подразделяются на полисахариды, которые являются фрагментами клеточных стенок патогенных микроорганизмов и образуются в результате действия соответствующих гидролитических ферментов, а также на секреторные белки, полипептиды и гликопептиды клеточных стенок патогенов, липиды. Хорошо изученными РАМР как для растений, так и для животных являются липополисахаридные фракции грамотрицательных бактерий, пептидогликаны грамотрицательных бактерий, флагеллин эубактерий, бактериальный фактор элонгации EF-Tu (Elongation Factor- Thermo Unstable), глюканы, хитины, маннаны и белки клеточной стенки грибов [226;373].

Основную сенсорную функцию по распознаванию РАМР у растений и животных выполняют специфические так называемые паттерн-распознающие рецепторы (Pattern Recognition Receptors или