Иммобилизация некоторых антибиотиков и гепарина на коллагеновых материалах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПО ИЗЫСКАНИЮ НОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

ИММОБИЛИЗАЦИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИБИОТИКОВ И ГЕПАРИНА НА КОЛЛАГЕНОВЫХ МАТЕРИАЛАХ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

На правах рукописи

ВЕЛИЧКО Татьяна Ивановна

Москва - 1991

. Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Г.С. Катруха

кандидат химических наук, ассистент Н.В. Федосеева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор H.H. Ломакина доктор химических наук Л.И. Валуев

Ведущая организация: Институт биологической и медицинской химии АМН СССР

Зашита состоится ' к 1991 г. в У У час на

заседании Специализированного совета Д.001.05.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков АМН СССР по адресу: 119867, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться с библиотеке ВНИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР.

Автореферат разослан *_ { ' <7£<^SMi991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Т.А. Успенская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В последние года интенсивно развивается новое научное направление - химия медико-биологических полимеров, основным предметом изучения которой является создание полимерных препаратов , предназначенных для контакта с тканями живого организма. Эта проблема имеет весьма актуальное значение в практической медицине, в частности, в оперативной восстановительной хирургии, где широко используются препарата синтетических полимеров. Однако, даже относительно инертные синтетические полимеры, оставаясь постоянным инородным телом в организме, поддерживает* воспалительную реакцию, меняют свои физические свойства и т.д. Поэтому в литературе и на практике все большее внимание уделяется перспективе использования в качестве носителей природных материалов, которые могут выполнять функцию временного направляющего каркаса, и постепенно замещаться собственными тканями организма. Из многочисленных природных полимеров в этом отношении наиболее перспективным оказался коллаген - основной фибриллярный белок соединительной ткани. Благодаря особенностям структуры коллагена на его основе можно получать молекулярные комплексы с лекарственными веществами, а наличие большого количества функциональных групп позволяет проводить направленную химическую модификацию коллагеновых материалов, что может быть использовано для иммобилизации биологически активных веществ. Получаемые в этом случае конызгаты могут, например, сочетать в себе антимикробное или антикоагулянтное действие лекарственного вещества со способностью к регенерации собственных тканей организма за счет коллагена.

В связи с этим весьма актуальным является получение новых препаратов с пролонгирующим действием, с минимальной токсичностью и высокой стабильностью на основе коллагеновых материалов.

Настоящая работа является частью комплексных исследований и выполнялась в рамках научно-технического содружества с I МШ ил. И.М.Сеченова.

Делыз работы является разработка методологии иммобилизации некоторых антибиотиков-оснований и гепарина на специфических отечественных коллагеновых материалах для получения на ее основе нового типа биологически активных конъюгатов с антимикробными и.ан-тикоагулянтными свойствами.

Достижение этой цели потребовало решения следующих основных задач:

1. Экспериментально изучить различные метода ковалентного связывания антибиотиков-оснований с растворимым коллагеном.

2. Экспериментально изучить различные методы ковалентного связывания некоторых антибиотиков и гепарина с нерастворимыми коллаге-новыми материалами.

3. Разработать методы количественного определения иммобилизованных антибиотиков и гепарина на коллагеновых материалах.

4. Наработать препаративные количества конъюгатов типа коллаген-антибиотик и коллаген-гепарин и изучить их физико-химические и биологические свойства.

5. Использовать разработанные методы иммобилизации биологически активных веществ для получения сосудистого трансплантата с антимикробной и антикоагулянтной активностью.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработаны методы химической иммобилизации антибиотиков-оснований и гепарина на коллагеновых, материалах, что позволило получить в препаративных количествах и охарактеризовать около 45.препаратов антибиотиков и гепарина, ковалентно связанных с коллагеном.

Получены конъюгатн типа коллаген-антибиотик, которые проявляют специфическую антимикробную активность In vitro, сравнимую с активностью антибиотиков-стандартов. Показано, что конъюгат колла-ген-мономицин (УШ), полученный с помощью глутарового альдегида, обладает пролонгированным действием в опытах in vivo.

Получены образцы конъюгатов типа коллаген-гепарин,которые проявляют антикоагулянтную активность в опытах in vitro. Показано, что конъюгат типа коллаген-гепарин (ХХХШб), полученный карбоди-имидным методом проявляет наибольшую противосвертывалцую активность в опытах in vitro и обладает пролонгированным действием в опытах in vivo. На основании разработанных методов получен артериальный ксенобиопротез, обладающий как антимикробной так и антико-агулянтной активностью.

Разработан метод количественного определения антибиотиков-оснований на нерастворимых коллагеновых материалах.

Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего изучения полученных конъюгатов in vivo и отбора наиболее перспективных препаратов для предалиничес-ких испытаний и т.д. Полученные конъюгатн могут быть использованы для изучения закономерностей взаимосвязи между структурой иммобилизованных препаратов в ряду антибиотиков-оснований.

Апробация работа. Основные результата работа докладывались на

УП конференции молодых ученых: "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1981). На УП Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Минск, 1985). На Всесоюзной конференции "Перспективы создания лекарственных средств с использованием биотехнологии" (Москва, 1985), на заседании секции Биохимического общества (Москва, 1990).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в котором обобщены сведения о коллагене как носителе биологически активных веществ, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков, 55 таблиц, 18 схем и список цитируемой литературы (139 ссылок).

ОСНОВНОЕ С0ДЕР1АНИЕ РАБОТЫ

Иммобилизацию антибиотиков-оснований и гепарина проводили на специфических отечественных коллагеновых материалах: I) коллаген сухой фармацевтический, в растворимой форме (РК), ВФС 42-1468-84,

2) пленка коллагеновая (КП), ВФС 42-725-78, и 3) коллаген-эластические артериальные ксенотрансплантаты (АКС), ТУ-42-2-586-90.

I. Получение коньигатов типа коллаген-антибиотик

Для получения биологически активных конъвгатов типа коллаген-антибиотик нами были изучены методы ковалентного связывания, используемые в химии пептидов и белков: I) с применением бифункционального реагента - глутарового альдегида, образующего альдимин-ные связи с Ш2-группами коллагена и антибиотика; 2) азидный и

3) карбодиимидный методы основаны на активации карбоксильных групп коллагена с последущим образованием пептидной связи меаду карбоксильными грушами коллагена и аминогруппами антибиотиков-оснований.

1.1 Применение глутарового альдегида

Для иммобилизации нами были выбраны высокоактивные антибиотики-основания, антимикробная активность которых, как известно, зависит, в основном, от наличия свободных аминогрупп. Предварительные опыты по изучению реакции глутарового альдегида как.с коллагеном, так и с антибиотиками показали, что иммобилизации необходимо 1-2

начинать с обработки глутаровым альдегидом коллагена, поскольку его модификация не влияет на активность получаемого конъюгата. Чтобы избегать побочных реакций при модификации коллагена глутаровым альдегидом, избыток реагента необходимо было удалять из реакционной смеси методом диализа против дистиллированной воды. Затем, как показано на схеме I, в реакцию вводили соответствующий антибиотик.

Схема I.

Коллаген-н^

I |Глутаровый альдегид Коллаген-ы=сн- (сна)э-сно

I I) Диализ 2) Антибиотик

Коллаген—Антибиотик

(Коньюгат)

При этом осуществляли контроль за рядом факторов: значением рН, количеством вводимого в реакции антибиотика и продолжительностью реакции. Предварительно Шло показано, что для полимиксина Ы и аминогликозидов - ыономицина, кянямицина А и гентамицина оптимальным значением рН реакции с глутаровым альдегида* является рН 8,3, a для ристомицйна А - 7,4, время реакции 18-20 часов, при!8-20°С. Важным фактором также является количество добавляемого антибиотика к модифицированному коллагену, содержащему свободные альдегидные группы глутарового альдегида, так как недостаток антибиотика может приводить к его многоточечному связыванию с коллагеном по нескольким аминогруппам, что без сомнения, вызовет потерю его антимикробной активности. Чтобы избежать нежелательного направления реакции, мы вводили расчетное количество антибиотика, при котором в нем реагирует, в основном, только одна аминогруппа, а именно: 10-кратный избыток антибиотика. Удаление избытка антибиотика из реакционной смеси по окончании реакции проводили диализом и контролировали методом электрофореза на бумаге. В таких условиях были получены конъюгата полимиксина II (I). ристоыицива А (17), мсшомицина (ути), канаыицина А (П) и гентамицина (XY), сы.табл.1.

Для определения количества присоединенного к коллагену антибиотика мы использовали три метода: (I) аминокислотные анализ про-

дуктов кислотного гидролиза коньюгатов в результате которого определяется количество присоединенного а) полимиксина М - по появлению на хроматограмме и приросту а, 7-диаминомасляноЙ кислоты (ДАМК), б) ристомицина А - по количеству наиболее устойчивой при кислотном гидролизе ристомишшовой кислоты, в) антибиотиков аминогликозидов - мономищша и канамицина - по содержанию в гидролизате глюкозами-на; (2) в случае гентамицина, иммобилизованного с помощью глутарового альдегида на растворимом коллагене, количество антибиотика определяли биологическим методом, а (3) при иммобилизации гентамицина на нерастворимых коллагеновых материалах (пленки, сосуды) - с помощью нового разработанного нами метода..основанного на определении количества свободных аминогрупп кояьюгата с помощью 2,4,6-гринигробе нзолсульфокисло га (ТННС).

1.2 Применение водорастворимого карбодаиыида

Для химического связывания коллагена непосредственно с антибиотиками, т.е. без применения какого-либо бифункционального реагента ("нотой"), нами был исследован карбодиимидный метод, являющийся весьма удобным в тех случаях, когда белок содержит сравнительно небольшое количество свободных аминогрупп по сравнению с числом карбоксильных групп. Именно такое соотношение -ш^/сооя--групп мы наблюдаем в молекуле коллагена (25:253).

Поскольку присоединяемые антибиотики являются основаниями, содержат свободные аминогруппы и хорошо растворимы в воде, для получения коньюгатов типа коллаген-антибиотик целесообразно применять водорастворимые карбодиимиды. так как это позволяет получать прочную связь между коллагеном и антибиотиком. С этой целью в работа был использован водорастворимый карбодиимцд - 1-циклогексил--3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид мето-4-толуолсульфонат (ЩЕК), см. схему 2.

Активацию карбоксильных групп растворимого коллагена с помощью ЩЭК проводили по методике Хо и Кошланда (1967г). Чтобы избежать нежелательных побочных реакций и, в частности, образования производных ацилмочевины, значения рН реакционной смеси поддерживали в течение периода добавления раствора антибиотика на уровне 4,7 с помощью 0,01н НС1. Реакция заканчивалась в течение 6-8 часов. Таким путем были получены конъюгаты коллагена с антибиотиками полимиксином Ы (XI), ристомицином А (У), мономицином (IX) и-кана-мицином А (П1), см. табл.1.

1-3

Иммобилизация антибиотиков на коллагене карбодаимиДным методом I. Для растворимого коллагена

г-, 1) ШЭК . г-, [к|-соон-- |Kj-co-NH-.

2) Антибиотик.рН 4,65; Зч; 20°С

-Антибиотик

КП

II. Для нерастворимой коллагеновой пленки

NaOH (или HCl) ,—, 1) ЦИЭК (pH 4,7; 8ч; 20°С)

jraj-cooH

37°, 2ч .2) H^N-Антибиотик, pH 7,4; 5сут; 4°С

[Ц-СО-Ш-.

-Антибиотик

При иммобилизации антибиотиков с помощью ШЭК на нерастворимых коллагеновых материалах (пленках в сосудистых биопротезах) за основу был принят метод, предложенный французскими исследователями для иммобилизации ферментов (1976г.). В этом методе предусматривается предварительная обработка образцов коллагеновых материалов двумя способами, а именно: пленку коллагена или биопротез выдерживают щи 37°С в растворе (I) 0,1н HCl, либо (2) 0,1н NaOH. Вероятно, в результате такой обработки увеличивается количество доступных реакционноспособных карбоксильных групп белка за счет либо частичного нарушения микроструктуры фибрилл поверхностного слоя пленки, либо гидролиза амидннх групп дшсарбоновых кислот до свободных карбоксильных групп, которые затем могут быть активированы с помощью ШЭК. Так были получены нами коныагаты коллагена с антибиотиками полимиксином В (III), ристомицином А (Yi, Yla, YI6), геитамицином (XVIII) и кавамициноы А (XIX), см. табл. I.

1.3 Применение азидного метода

Второй способ активации СООН-групп коллагена (в виде пленки), использованный нами в работе, основывался на азидном методе, »¡мобилизацию антибиотиков на коллагеновой пленке проводили по

схеме:

Н-соон

сн,он/0.2 н не» |—I _ ♦

|КП| соосн,

20°С, 7 сут. 1—1 20°с. 12-15 час.

,—■ 0.5м ныю^/о.эи нс1 ,—, "а"-® или н,ы-ф

КПксо-+#ь«на-- КПн-сон, —---

1—I 0°С. 7КИН • 1-1 О С, рН 8.8, 7 сут.

—-:-► |кп]-со-мн-0 или [кп}-со-*н-(г)

@ - антибиотик, ф - гепарин.

Особенности азидного метода, хорошо разработанного в-пептидной химии, требуют соблюдения строго определенных условий проведения реакции активации карбоксильных групп (температуры, рН, типа растворителя и др.). Каждая стадия синтеза конъюгата завершалась тщательной отмывкой модифицированной коллагеновой пленки от избытка реагента. Последний этап получения азида - реакция с' КаН02, а так-хе реакцию образования пептидной связи с н^-группой антибиотика, проводили на холоду (0°С-4°С). Полученные коньюгаты тщательно промывала буфером трис/НС1, рН 8,8, затем дистиллированной водой.Пол-ноту удаления возможных продуктов сорбции антибиотиков на пленке контролировали методом электрофореза на бумаге, анализируя промывные воды . Таким образом были получены коньюгаты коллагена с рис-томицином А ста:), мономицином (X), канамипином А (ХГУ) и гентами-цином (ХШ. см. табл. I.

Подводя итоги исследованиям по разработке методов иммобилизации антибиотиков-оснований на коллагеновых материалах, которые суммированы в таблице I, можно сделать следующие выводы:

I .• Все три метода ^мобилизации позволяют получить сравнимые результата для соответствующего антибиотика как при работе с растворами коллагена,так и с его нерастворимой формой (пленкой).

2. Для иммобилизации антибиотиков на растворимом коллагене оптимальным является метод с использованием глутарового альдегида.

3. При работе с коллагеновыми пленками, активированными слабыми растворами кислоты или щелочи - высокая степень иммобилизации антибиотика ристомицина А получена с помощью карбодиимидного* метода.

ь-4

Таблица I

Сравнительные результаты иммобилизации антибиотиков на коллагеновых материалах различными методами

\ Метод ирисов— Л* \ дине— коа»ю-\ ни* гатов \ Количество иммобилизованного антибиотика, ноль/ноль коллагена

Антибиотики через глу- таровый альдегид карбодн-миидный азидный

Полиииксин В Полишпссин M Полиииксин И III I II 12 (РК) 5 (КП) 11 (РК) -

Ристоиицин А V IV Vía VIb . 42 (РК) б (РК) 38 (КП после обработки НС1) 43 (КП после -обработки ЫаШ)

VI - б (КП без обработки) —

Моноиицин Vil IX X 31 (РК) 24 (РК) 39 (КП)

К&наиицин. А XI XII XIII XIV 27 (РК) 3 (КП) 12 (РК) 28 (КП)

Гентаиифсн XV XVI 11 (РК) - 16 (КП)

КП- коллагеновая пленка, РК - растворимый коллаген.

4. Хорошие результаты дает азидаый метод при работе с необработанной коллагеновой пленкой, особенно в случае антибиотика-аминогликозида мономицина.

В заключение следует сказать, что для иммобилизации антибиотиков на коллагеновой пленке целесообразно применять азидный метод, а при работе с растворимым коллагеном - метод с использованием глутарового альдегида. Необходимо также отметить, что карбоди-имидный метод может Сыть применен как при работе с коллагеновыми пленками, так и при иммобилизации антибиотиков на растворимом коллагене.

1.4 Изучение антимикробной активности полученных коныхгатов типа коллаген-антибиотик

Некоторые из конъюгатов типа коллаген-антибиотик, полученные с помощью описанных методов, были испытаны на антимикробную активность (табл.2).

Из данных таблицы видно, что для всех испытанных конъюгатов типа коллаген-антибиотик специфическая антимикробная активность антибиотиков не утрачена и сравнима с активностью стандартных дисков соответствующих антибиотиков, т.е. мягкая химическая (ковален-тная) иммобилизация на коллагеновых материалах, существенно не влияет на их биологическое действие. Исключением являются только конъюгаты ристомицина А и канамицина А, полученные карбодиимидным методом.

Таблица 2.

Антимикробная активность конъюгатов типа коллаген-антибиотик, полученных разными методами иммобилизации

>

1 • 5

Метод Ш ИшкхЗадизовай- Тип Зоны подавления роста микроорганизмов в ш

иымскЗили за щи Коыъсгатов ный антшЭиотак коллагена £.со& тирюл м.. йиищ 4Ь. аи.иил г оэ Б о-с. т^и^гл

Через глутаров.альдег. Ка рй одшмидный I XX Подимиксия и Патшссия К РК РК 18-20 18-20 15-17 14-16 20-21 20-2Х '

Стандартный диск 19-20 18-20 21-24

Через глутаровшк альд. Карйодшпшднка и У Рестоыхцин А • РК РК 20,7 0 21,0 25,0

Карбодилмндный 716 ---- кп 22,С

Азидный П1 -- кп 26,8

Стандартный днск 19,0 21,5 21-23

Через глутаровый альд. Карводиивддвый . УШ и Мономидая РК РК 20-21 31 29 22-24

Стандартный даек 21-24 19-23 18-21 22

Через глутарошЗ альд. КарОодшогадннЗ И И1 Канашщвя к РК кп 18 0 22 0 23 6,0

АзиДннй.. НУ -■- • кп 20,3

Стандартный даек 20 19 21 22,0

Через глутароЕыа альд. ДГ Гентамддгн Стандартный диск РК 21 19-20 21 18-20 20 22 24 2*

1-5

Иммобилизация антибиотиков на нерастворимых коллагеновых пленках приводит к конъюгатам, не уступающим по активности препаратам, полученным из растворов коллагена.

Кроме исследований In vitro, коныогат типа коллаген-мономицин(УШ), полученный с помощью глутарового альдегида, исследовали в форме лиофильно высушенных губок In vivo на крысах. Для этого губки размером 2x2 см2 имплантировались в подкожно-жировую клетчатку спины крыс. Активность антибиотика определяли в крови и ткани. Результата представлены на рис.1.

Как видно из рисунка I, мономицин обнаруживается в крови и ткани в первые сутки после имплантирования коньюгата и достигает максимального уровня на третьи сутки. В последующие дни уровень мономи-цина падает как в крови, так и в ткани. Однако на 7-е сутки заметен незначительный подъем концентрации антибиотика и так вплоть . до 21-х суток. С этого момента и по 30-е сутки происходит новое нарастание количества антибиотика в крови и ткани. Этот факт, веро-21 ери ятно, можно объяснить деградацией самого коллагена и постепенным , ' освобождением ковалентно связан-

Рис.1 . Динамика выхода иоионнци-

на в кровь м ткана животных soc- HOTO ШТИбИОТИКа, ЧТО ПОКаЗЫВавТ лв инилантацмн хонъвгата VIII. ВОЗМОЖНОСТЬ ПОЛУЧвНИЯ ПрвПараТОВ

с пролонгированным действием. Таким образом, анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что все три химических метода ковалентного связывания антибиотиков-оснований с коллагеном приводят к конъюгатам, обладающим антибактериальной активностью, сравнимой с активностью стандартных дисков соответствующих антибиотиков.

2. Получение коньпгатов там колянге н-гепарин

Для получения конъюгатов типа коллаген-гепарин, мы учитывали, что в молекуле гепарина содержатся свободные карбоксильные, гидро-ксильные г легко десульфа тируемые аминогруппы, которые можно использовать для ©мобилизации гепарина на поверхности коллагена.

- п -

Исходя из этого, мы исследовали пять различных способов ковалент-ной иммобилизации гепарина на коллагеновых материалах, которые представлены на схемах 4-5. Эти методы можно подразделить на две группы: (I) методы активации карбоксильных групп коллагена или гепарина (карбодиимидный и азидный) и (2) методы, основанные на модификации аминогрупп белка с помощью промежуточного звена - бифункционального реагента - глутарового альдегида или трихлор-симм-триазина (цианурхлорида).

Первоначально для иммобилизации был взят гепарин фирмы "Спо-фа". Связывание осуществляли карбодиимидным и азидным способами, а также путем образования азометиновых связей с помощью глутарового альдегида. Ни один из этих методов не дал положительных результатов, что можно объяснить наличием в образце гепарина фирмы "Спофа" большого количества хондроитинсульфатов и отсутствием в его молекуле свободных аминогрупп.

2.1. Применение кярбодиимидного метода

Согласно литературным данным в гепарине содержится около 10% свободных аминогрупп. Однако, в зависимости от источника и метода выделения препарата, часть этих групп может быть блокирована, и для их освобождения нами была проведена частичная десульфатация гепарина. Иммобилизацию модифицированного таким образом гепарина на коллагеновой пленке осуществляли карбодиимидным способом. Аминокислотный анализ полученных конъюгатов (ХХХПа и ХХХПб) показал, что в зависимости от метода предварительной обработки коллагеновой пленки, на ее поверхности связывается от 9 до 13 мг десульфатиро-ванного гепарина с 1г коллагена (табл.3.).

Опыты по иммобилизации гепарина отечественного производства (активность 140 Ед/мг) карбодиимидным методом (конъюгаты ХХУ. ХХУ1, ХХХШа и ХХХШО, XXXIУа и XXXIУб) дали лучше результаты, что вероятно, объясняется наличием в нем достаточного для иммобилизации количества свободных аминогрупп. В этом случае не наблюдалось столь резкого различия в степени иммобилизации для десульфатиро-ванного и нативного гепарина (табл.3 ).

' Для увеличения количества • реакционноспособных аминогрупп в гепарине и коллагене нами были выбраны два различных метода. В первом случав мы синтезировали п-аминофенилэтилгепарин (ПАССЭГ) с последующей иммобилизацией его на коллагеновой пленке, как показано на. схеме 4.

1-6

КП

КП

Гепарин

ЦМЭК

1-соон-И-СО-ш-(г)

\ ПАФЭГ v — ^

У

Как видно из таблицы 3, модификация гепарина путем введения дополнительных аминогрупп существенно увеличивает степень его иммобилизации на коллагене. Таким путем были получены конъюгаты ХХУП и ХХХУ, причем в случае активации коллагена и предварительной обработки его 0,1н ИаОН удалось связать с 1г коллагена до 86 мг п-аминофенилэтиЛгепарина.

Таблица 3.

Содержание гепарина в коньюгатах, полученных карбодиимидным методом

Количество гепарива, иииобилизоваиного на коллагенов oí пленке, «г/г коллагена

Образцы Активация Активация коллагена Без обра-

гепарина гепарина Предварительная обработка ботки

0,1 i BClj 0,1 в »«он ¡впихлоргидринои и ! i ашгаакои

j j сукцинилироваиие

НвТИЗШ! гепарин (ЧССР) 0(Ш1)" 0(1Щ) слеш 0(1X11») (ХШб)

Аесульфатированный гепарин (ЧССР) 2,5(ШП) 9,6(ШПа) 13,4(ХШб)

Нативны» гепарин (СССР) 8,6(1X7) 7,2(ХХХХ) 18,9(ШВа)27,г(ШЛб) *7,1(ШЛ) 13,5(1X111) £,Í(XL)

Десудьфатиро-ванный гепарин (СССР) да

П-амииофе излети лге sapas 56,Э(ЮТ) 85,6(ХХХ7)

* ( ) - покера конъюгатов.

Во втором случае была' проведена двухстадийная модификация коллагена: вначале эпихлоргидрином, а затем аммиаком (схема 5), что .позволяет ввести в коллаген дополнительные аминогруппы и тем самым увеличить количество иммобилизованного гепарина после использования соответствующего метода конденсации. Вполне вероятно, что после такой обработки создается "мостик" между коллагеном и гепарином, снимающий стерические ограничения для реакции конденсации, через который может быть ковалентно присоединен гепарин. Такой подвижный "мостик", как предполагается, позволяет гепарину более полно проявлять свои антикоагулянтные свойства, так как его

функциональные группы удалены от белковой подложки и способны взаимодействовать с белками плазмы крови. Аминокислотный анализ модифицированного таким образом коллагена показал, что в реакцию с эпихлоргидрином вступают боковые функциональные группы остатков трифункциональных аминокислот коллагена - гидроксипролина, серина, тирозина, лизина, гистидина и аргинина, содержание которых в полном кислотном гидролизате заметно уменьшается. Описанная двухста-дийная модификация коллагеновой пленки позволяет иммобилизовать гепарин карбодиимидным методом (схема 5, реакция" А, конъюгат ХХХУ1, табл.3), через сукциншшрование (схема 5, реакция В, конъю-гаты XXXIX и XI, табл.3), а также методом восстановительного ами-нирования в присутствии натрийборциангидрида (схема 5, реакция Б).

„ , Схема 5.

Иммобилизация гепарина на коллагенновых пленках, модифицированных эпихлоргидрином и аммиаком

И—011 ♦ С1 - сп? - ся -сн, --- ГШ-о - сн, - сн - ся,

(ни,) ' V —<*Н)_

[Й}- О - СЯ, - СИ - СЯ. -»я, (.И) |„

Щ^иг-ст-сн^,^-©

Q <1,И) ОН -О И

\А СН.0Н

он

В случае реакции А - карбоксильные группы гепарина активировались водорастворимым карбодиимидом - ЦМЭК. Для этого" вводили 3-кратный избыток реагента, поддерживая рН раствора 4,75. Из данных аминокислотного анализа полученных образцов видно,что к 1г коллагена присоединилось 47 ыг гепарина (табл.3, конъюгат ХХХУ16). Для контроля аналогично проводили реакцию и с исходной (немодифщиро-ванной пленкой). Однако, в этом случае к 1г коллагена присоединилось всего 7,2 мг гепарина (конъюгат ХХХШ, табл.3), т.е. почти в 7 раз меньше, чем к модифицированному по схеме 5(А) коллагену. Следовательно, активация гепарина и коллагена является необходимым процессом.

В случае реакции В - сукциншшрование модифицированных колла-

геновых пленок осуществляли инкубацией коллагеновых пленок с янтарным ангидридом в течение четырех суток при комнатной температуре с последующей обработкой носителя раствором гепарина в присутствии ЦМЭК как конденсирующего агента. Исходя из данных аминокислотного анализа модифицированных таким образом коллагеновых пленок было установлено, что к 1г коллагена присоединяется 13 мг гепарина (табл.3). В качестве контрольного образца использовали сукцинили-рованные исходные немодифицированные коллагеновые пленки, к которым присоединяли гепарин тем жэ карбодиимидным методом.Расчет показал, что к I г коллагена в этом случае присоединилось около 7 мг гепарина.

Анализ данных таблицы 3 показывает, что карбодиимидный метод оказывается более эффективным, если вводить дополнительное количество аминогрупп либо в гепарин (ПАФЭГ, конъюгаты ХХУП и ХХХУ), либо в коллаген путем его обработки эпихлоргидрином и аммиаком (конъюгат ХХХУ16). Менее эффективными оказались способы активации коллагена слабыми растворами кислоты или щелочи и сукцинилирования коллагена. Из таблицы также следует, что существует прямая зависимость мевду количеством свободных аминогрупп в исходном гепарине и количеством иммобилизованного гепарина, что указывает на образование конъюгатов, в основном, за счет активации карбоксильных групп коллагена, а не гепарина.

2. 2. Применение метода восстановительного ашнирования

Метод восстановительного аминирования (схема 5, реакция Б) заключается в обработке коллагеновых пленок (как немодифщирован-ных, так и модифицированных эпихлоргидрином и аммиаком) раствором гепарина в присутствие натрийборциангидрида. Анализ полученных образцов показал, что к модифицированной пленке гепарин присоединялся в количестве 17 мг/г (конъюгат ХШП), а к немодафицированной (конъюгат ХХХУШ) - всего 1,5 мг/г коллагена, т.е. модификация пленки эпихлоргидрином и аммиаком увеличивает количество иммобилизованного гепарина, что можно объяснить увеличением количества свободных т^групп и их большей пространственной доступностью для объемных реагентов.

2,3. Применение азндаото метода

Коллагеновые пленки подвергали ацил-азидной активации 3-х стадийным синтезом как и в случае получения конъюгатов типа колла-

ген-антибиотик (см.схему 3). Иммобилизацию гепарина на коллагене осуществляли путем выдерживания полученного азида белка с гепарином в буфере трис/НС1 в течение длительного времени. Образцы полученных конъюгатов гидролизовали в стандартных условиях и определяли содержание глюкозамина в гидролизатах. На основании этих данных рассчитывали количество гепарина, иммобилизованного на коллагене, см. табл. 4..

Таблица 4.

Количественное содержание гепарина в конъюгатах, полученных азидным методом.

Образцы гепарина ** конъюгатов Количество гепарина, иммобилизованного на коллагеновой пленке, мг/г

Нативный гепарин (ЧССР) XX 0

Нативный гепарин (СССР) XXI 18,6

Десульфатированный гепарин ХХП 20,9

П-аминофенилэтилгепарин ХХШ 59,6

Из таблицы следует, что азидаый метод, как и активация коллагена с помощью карбодиимидного метода, дает достаточно хороший выход целевого коньюгата. И в атом случае введение новых аминогрупп в молекулу гепарина повышает количество иммобилизованного гепарина на коллагене (конъюгат ХХШ).

2.4. Применение траазинового метода

Цианурхлорид является трифункциональным реагентом, который позволяет связать две биологические молекулы через их свободные аминогруппы. Поскольку в нашем случае коллаген и гепарин содержат свободные аминогруппы, то для получения конъюгатов типа коллаген-гепарин первоначально мы проводили сравнительное изучение реакции цианурхлорида как с индивидуальным гепарином, так и с коллагеном (схема 6). После присоединения цианурхлорида к биополимеру, второй атом хлора замещали на остаток анилина в растворе джжсана. Третий атом хлора использовали для получения соответствующего кснъюгата, причем конденсацию проводили в фосфатном буфере рН 6,8 в течение 5-7 дней на холоду.

N /—у

-у^ •^ (0>мн2

Ш—ЫН2 даоксал; дмокеан. 3 ч

I—1 инг—(г)„ /<=г-®

^ и1

О Н диокеан; 50кС. I/2ч" }/ диоксш, 1ч

/К1 Г,Н2 - Щ ^

Вывод о перспективности получения целевых конъюгатов с использованием триазинового метода (см.табл.5) был сделан на основании данных их аминокислотного анализа .

Таблица 5.

Количественное содержание гепарина в конъюгатах, полученных триазиновым методом

Образцы гепарина Первичная активация *» конъюгатов Количество гепарина, иммобилизованного йа коллагеновой пленке ,• мг/г

Нативный гепарин гепарин ХХУШ 5,9

(СССР)

и « коллаген XXIX 4,8

п-Аминофенил- коллаген XXX 13,6

этилгепарин

- 17 -

Показано, что этим методом с 1г носителя удается связать от 5 до 14 мг нативного или модифицированного гепарина (ПАФЭГ). В последнем случае (коньюгат XXX). заметно увеличение количества иммобилизованного гепарина. Следовательно, как и при использовании кар-бодиимидного метода, увеличение количества аминогрупп в гепарине в результате его модификации (ПАФЭГ) также приводит к повышению выхода целевого коньюгата.

Таким образом, сравнительное изучение различных методов химической иммобилизации гепарина на коллагеновых пленках показывает, что наиболее эффективным является карбодиимидный метод. Количество иммобилизованного гепарина существенно зависит от введения дополнительных свободных аминогрупп как в исходном гепарине, так и в коллагене.

2.5. Биологические испытания конъюгатов типа коллаген-гепарин, • полученных различными методами иммобилизации

Исследование антитромбогеншх свойств материалов с иммобилизованным на них гепарином было проведено совместно с отделом по изучению и применению коллагена в медицине ЦНИО НИЧ 1 ММИ им. И.М.Сеченова путем определения времени свертывания крови.

Было исследовано 6 различных конъюгатов, полученных нами с помощью карбодиимидного и азидного методов. Для контроля определяли время свертывания крови' на чистой коллагеновой пленке и на стекле. В ходе исследования было обнаружено, что на всех испытанных образцах конъюгатов время свертывания крови по сравнению с контролем увеличилось (см.табл.6).

ИЗ таблицы следует, что коньюгат ХХЭДб, полученный карбоди-имидным методом из нативного гепарина и коллагеновой пленки, обработанной 0,1н НаОН обладает наибольшей антикоагулянтной активностью — время свертывания крови превышает 10 минут, что более чем в 10 раз выше, чем у контроля. Наименьшей противосвертывавдей активностью обладал коньюгат - ХШУб, полученный иммобилизацией десульфатированного гепарина на коллагеновой пленке карбодиимшшм методом, что подтверждает предположение о возможной потере гепарином биологической активности при его десульфатации. С другой стороны интересно отаетить, что введение в молекулу гепарина п-амино-фенилэтиламина и иммобилизация таким образе»! модифицированного гепарина на коллагеновой пленке как азидным, так и карбодшаидным методами (конъюгаты ХХШ и ХХУП) не приводит к потере ими антико-

агулянтных свойств.

Другим методом оценки антитромбогенных свойств полученных конъюгатов in vitro является тромбоэластография, отражающая весь процесс гемокоагуляции. Этот метод показал, что плазма после инкубации в ней чистой исходной коллагеновой пленки дает тромбоэласто-грамму идентичную тромбоаластограмме нативной плазмы. В тоже время тромбоэластограммы с образцами плазмы после инкубации в них коныь гатов записать не удалось, что свидетельствует о резком снижении свертываемости крови, а именно - резком замедлении образования фибринового сгустка.

Следовательно и метод тромбоэластографш свидетельствует о высокой антикоагулянтной активности полученных коньюгатов в использованном режиме инкубации в свежей плазме крови.

Таблица 6.

Время свертывания крови на коллагеновых пленках с иммобилизованным гепарином.

Л* коньюгатов Метод иммобилизации Время коагуляции, мин;

Стекло - 0,8 ± 0,5 ■.

КП — 1.3 ± 0,1

XXI азилннЯ 3,5 ± 0,6

ххш азидный 8,1 ± 0,8

ХХХШб карбодиимидннй 12,0 ± 1,9

ХХХУ карбодиимидный 7,9 ± 1.2

ХХХ1У6 карбодиимидный 2,3 ± 0,6

ХХУП карбодиимидннй 4,7 ± 0,7

Для оценки свойств антитромбогенности в условиях ln vivo, образец коньвгата ХХХШб имплантировали в подкожно-жировую клетчатку спины кроликов и периодически проводили тромбоэластографическиа исследования. Полученные данные свидетельствуют (см.рис.2), что через час после имплантации гепарин в системе отсутствовал, но общая тенденция сводилась к реакции на оперативное вмешательство и выражалась в небольшой активизации свертывающей системы крови. К 6-ти часам отмечался значительный выброс гепарина в кровь, что можно объяснить нарушением микроструктуры поверхности коллагеновой пленки и освобождением гепарина. К концу первых суток отмечалось

снижение уровня гепарина практически х исходным цифрам, что мы объясняем утилизацией выброшенного в кровь гепарина. С 3-х до 8-ми

суток вновь отмечается польем уровня гепарина в крови, что, по всей видимости, связано с освобождением в кровоток адсорбированного полимеризованного гепарина, образовавшегося путем конденсации концевых альдегидных групп одних молекул с аминными группами других. Затем на 14 - 21 сутки опыта наблюдается, резкий выброс гепарина в кровь, что можно объяснить активным лизисом конъюга--та. К 28 суткам отмечается паде-

28 кг,

_'ние уровня гепарина в крови; как

р*с. 2. лмяяжыхл уровня г«.Ри- правило, не доходящее до исходных на в крови при имплантировании Значений КОНТРОЛЬНОЙ ТромбОЭЛЭС-хонъюгата хххшб в опытах ш vivo тограмш крови кролика перед операцией. Таким образом, полученный нами конъггат и в опытах ln vivo проявляет пролонгированное проти-восвертывакщее действие.

3. Получение сосудистых биопротезов с антнняхробташ и антикоагулянтными свойствами

Проведенные нами исследования показывают, что разработаны эффективные способы иммобилизации антибиотиков и гепарина на колла-геновых материалах с получением конъюгатов, обладающих высокой биологической активностью. Это позволило нам приступить к модификации артериальных сосудистых ксенотрансплантатов для 'придания им одновременно антибактериальных и антикоагулянтных свойств. В работе мы использовали специально обработанные артериальные ксено-трансплантаты (АКС), основу которых составляют коллаген и эластин. Предварительно нами было определено содержание свободных е-аминных групп лизина в биопротезах, находящихся на различных стадиях обработки глутаровым альдегидом,которая необходима для стерилизации и придания биопротезу определенных механических свойств. В результате анализа было установлено, что после третьей стадии обработки биопротеза 0,5* глутаровым альдегидом достигается постоянный уровень свободных e-аминогрупп остатков лизина (50 нмоль/мг), который

незначительно изменяется: при последующем хранении биопротеза в 0,5% растворе глутарового альдегида.

Для придания сосудистым биопротезам антимикробных свойств нами были получены конъюгаты типа коллаген-антибиотик. Наиболее эффективными для иммобилизации антибиотиков-аминогликозидов - гента-мицина и канамицина А являются карбодиимидный метод и метод с использованием глутарового альдегида. С помощью ЦМЭК были получены конъюгаты ХУШ (АКС-гентамицин) и XIX (АКС-канамицин А), а при помощи глутарового альдегида - конъюгат ХУЛ с имобилизованным гента-мицином.

Количественное определение иммобилизованных на коллагеновых биопротезах антибиотиков проводили с помощью ТНБС-метода, специально разработанного нами для нерастворимых коллагеновых материалов. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7..

Количественное содержание антибиотика, иммобилизованного на биопротезах

Образец ** конъюгатов Метод иммобилизации Количество иммобилизованного антибиотика мкг/смя поверхности сосуда

АКС + Гн ХУЛ через глутаровый альдегид 19

АКС + Гн ХУШ карбодиимидный 20

АКС + Кн XIX карбодиимидный 20

Гн - гентамицин, Кн - канамицин А .

Из таблицы следует, что оба метода иммобилизации как для гентамицина, так и для канамицина А дают сопоставимые результаты -на I см2 поверхности ксенотрансплантата присоединяется до 20 мкг антибиотика. Такое содержание иммобилизованного антибиотика придает носителю (АКС) достаточно высокие антимикробные свойства в опытах In vitro в отношении ряда тест-микробов (табл.8).

Для придания сосудистым ксенотрансплантатам антитромбогенных свойств нами была проведена иммобилизация гепарина на внутренней поверхности биопротеза. С этой целью использовали два метода иммобилизации- карбодиимидный и метод с применением глутарового альдегида.

Таблица 8.

Антимикробная активность биопротезов (размер 1x1 см2) с иммобилизованными антибиотиками

Зоны подавления, мм

ХЛ конъюгатов Метод иммобилизации

Б4.аигеиз Е.оо11 Рз.аеги-в1лова

ХУЛ через, глутаровый альдегид 40 35 48

ХУШ карбодиимидный 20 20 12

XIX карбодиимидный 15 20 10

Стандартный диск 20 19 19

Иммобилизацию с помощью глутарового альдегида осуществляли по схеме:

Схема 7.

АКС

1) + Гепарин рй 3,2

2) + ГА (конечная кона- 0,025 Ы ) рН 3,2

3) + ГА (конечная конц. 0,025 И ) рН 7,4

КОНЬЕГАГЫ

Такая трехстадийная иммобилизация гепарина при различных значениях рН, позволяет увеличить количество иммобилизованного гепарина на внутренней поверхности биопротеза. В таблице 9 предстрлз-нн результаты по иммобилизации гепарина на биопротезах, претерпевших различные стадии обработки-глутаровым альдегидом: конызгат хт.т -это биопротез после ферментативной и солевой обработки; конызгат тт.тт - биопротез после трехстадийной обработки глутаровым альдегидом; коньюгаты тт.тт т и ХЫУ- после вести стадийной обработки глута-роЕым альдегидом. Из таблицы следует, что количество иммобилизованного гепарина практически не зависит от степени предварительной обработки биспротеза глутаровым альдегиде«.

Таблица 9.

Количество гепарина, иммобилизованного на биопротезах

** конъюгатов ХЫ ХЫ1 хин ХЫУ

Гепарин, мг/г 16 II II 13,5

Связывание гепарина с коллагеном биопротеза подтверждено также данными гистологического анализа полученных коныогатов.

Для оценки антикоагулянтной активности иммобилизованного гепарина в коныогатах хы - хыг были использованы методы тромбо-эластографш и определения толерантности плазмы к протамин-сульфату. Полученные данные свидетельствуют об активном влиянии связанного с носителем гепарина, что проявляется в замедлении свертываемости крови, - такая реакция наблюдалась у исследуемых коныогатов вплоть до 28 суток.

Другой подход для получения биопротезов с антитромбогенными свойствами заключался в использовании в качестве конденсирующего агента - 1ЩЭК. Иммобилизацию проводили, как и в случае получения конъюгатов типа коллаген—: гепарин", по схеме 4. Таким путем были получены конъюгаты ХЬУ1 и хьуи с биопротезами, прошедшими шес-тистадийную обработку глутаровым альдегидом. И в этом случае факт связывания гепарина с внутренней эластической мембраной внутренней стенки сосуда был подтвержден результатами гистологического анализа. Данные биологических испытаний по определению времени свертывания крови представлены в таблице 10.

Таблица 10.

Время свертывания крови на сосудистых биопротезах, с иммобилизованным гепарином'

Наименование объекта Метод иммобилизации Время коагуляции, мин.

Стекло - ■ 3,1 ± 0,6

Сосудистый биопротез - 2,6 ± 0,1

Коньюгат ХЬ71 карбодиимидный 11,4 ± 1,9

Коньюгат ХЬУ через глутаровый 17,4 1 2,1 альдегид

Коньюгат XXVII карбодимидный 27,4 ± 2,4

Для придания артериальному ксенобиопротезу как антимикробных, так и антикоатулянтных свойств в качестве антимикробного агента был выбран гентамицин, а антикоагулянта - гепарин (конъюгат xlyii). Конденсирующим агентом в обоих случаях служил водорастворимый карбодиимид (ШЭК). Полученный конъюгат xlyii в опытах in vitro показал антибактериальную активность в отношении Bao.pumnilis и достаточно высокую антикоагулянтную активность (табл.10). Результаты гистологического анализа подтверждают присутствие гепарина в стенке сосуда.

Из таблицы 10 следует, что все полученные различными методами конъюгаты типа АКС-гепарин и антибиотик-АКС-гепарин проявляют тенденцию к гипокоагуляции: увеличивается время свертывания крови по сравнению с контролем.

Таким образом, разработанная нами система придания АКС антимикробных и антикоагулянтных свойств показывает хорошие результаты в опытах in vitro и может быть рекомендована для использования на практике в экспериментах in vivo.

ВЫВОДЫ

1. Изучены различные методы ковалентной иммобилизации ряда антибиотиков-оснований на коллагеновых материалах. Показано, что азидный метод эффективен при иммобилизации антибиотиков на колла-геновой пленке, бифункциональный реагент - глутаровый альдегид -целесообразно применять при работе с растворимым коллагеном, в то время как карбодииыидный метод дает положительные результаты как при работе с коллагеновыми пленками, так и с растворами коллагена.

2. Установлено, что полученные конъюгаты коллагеновых матери-' алов с антибиотиками _ (полимиксином М, мономицином, канамицином А, гентамицином и ристомицином А) проявляют специфическую антимикробную активность in vitro , сравнимую с активностью соответствупетх антибиотиков-стандартов. Показано также, что конъюгат коллаген-мономицин, полученный через глутаровый альдегид, обладает пролонгированным действием в опытах in vivo.

3. Проведено сравнительное изучение различных методов иммобилизации гепарина на коллагеновых пленках. Показано, что : а) максимальное присоединение нативного гепарина достигается с помощью азидного метода,а карбодиимидный, триазиновый и метод восстановительного аминирования оказались менее эффективными; б) предварительная обработка коллагеновой пленки слабыми растворами щелочи или кислоты, а также суишнилирование ее после обработки эпихлэр-

гидрином и аммиаком заметно увеличивает количество нативного гепарина, иммобилизованного карбодиимидным методом; в) введение дополнительных аминогрупп в исходный гепарин существенно увеличивает количество иммобилизованного гепарина.

4. Установлено, что все полученные образцы коньюгатов типа коллаген-гепарин проявляют' антикоагулянтную активность в опытах In vitro. Конъюгат типа коллаген-гепарин, полученный карбодиимидным методом проявляет наибольшую противосвертываыцую активность в опытах in vitro и обладает пролонгированным действием в опытах in vivo.

5.Разработаны условия иммобилизации некоторых антибиотиков -аминогликозидов и гепарина на коллагенэластических ксенотранс-плантатах, что позволило получить артериальный ксенобиопротез, обладающий как антимикробной (на внешней стороне биопротеза), так и антикоагулянтной (на внутренней стороне биопротеза) активностью. .

6.Разработан метод количественного определения антибиотиков-оснований, иммобилизованных на нерастворимых коллагеновых материалах.

Список публикаций по теме диссертации

1. Н.В.Седосеева, А.К.Рабинович, Т.И.Величко. Иммобилизация некоторых антибиотиков на коллагене.// В сб."Экспериментально-клинические аспекты применения биологических полимеров в медицине.'' , Москва. 1981. С.46-48.

2. А.К.Рабинович, Т.И.Величко, Н.В.Федосеева. Синтез биологически активных соединений на основе коллагена и некоторых антибиотиков. Тез.докл.УП конференции молодых ученых " Синтез и исследование биологически активных соединений." Рига. 1981. С. 108109.

3. Н.В.Федосеева., Т.И.Величко, А.К.Рабинович, А.А.Елисеев. Кова-лентная иммобилизация антибиотиков полимиксина М и ристомицина А на коллагене.// Тез.докл.Всесоюзной конференции " Перспективы создания лекарственных средств с использованием биотехнологии. " Москва. 1Э85. С.56.

4. Н.В.Федосеева, Т.И.Величко, Н.Н.Аникеева, А.А.Елисеев, Г.С.Катруха, Т.Г.Руденко, Г.Ф.Липская, Р.К.Абоянц. - Коллаген как полупроницаемый носитель для иммобилизации лекарственных

• веществ. // УП Всесоюзный симпозиум " Синтетические полимеры медицинского назначения." Минск. 1985. С.96. •

5. Н.В.Федосеева, Т.И.Величко. Модификация природного белка -коллагена. // В сб. " Рациональное-использование растительных тюсурсов Казахстана." Алма-Ата. 1986. С.284-286.

6. Т.И.Величко, А.Н.Штопенко, Н.В.Федосеева, Г.С.Катруха. Кова-лентная иммобилизация гепарина на коллагеновой пленке. // ХПС. 1987. * 5. С.700-704.

7. Т.И.Величко. Н.Н.Аникеева, Н.В.Федосеева, Г.С.Катруха. Иммобилизация модифицированного гепарина на коллагеновой пленке. // ХПС. 1987. С.771-772.

8. Т.И.Величко, Г.С.Катруха, М.А.Нифонтова. Количественное определение антибиотиков, иммобилизованных на нерастворимых коллагеновых материалах.// ХПС. 1989. С.408-4П.