Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов

Столбушкина, Полина Петровна

Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Столбушкина, Полина Петровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2003 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.06 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов»

Автореферат диссертации на тему "Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов"

На правах рукописи

СТОЛБУШКИНА ПОЛИНА ПЕТРОВНА /

ПОЛУЧЕНИЕ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ АМИНОПОЛИСАХАРИДОВ

Специальность 02.00.06. - Высокомолекулярные соединения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2003 г. г*-

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета имени А.Н. Косыгина

Научные руководители: доктор химических наук Вихорева Галина Александровна

кандидат химических наук Банникова Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук Бабиевский Кирилл Константинович

кандидат химических наук Марквичева Елена Арнольдовна

Ведущая организация: Институт синтетических полимерных материалов имени Н.С. Ениколопова РАН

Защита состоится"_"_2003 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 212.139.01 в Московском государственном текстильном университете имени А.Н. Косыгина по адресу: 119 991, г. Москва, М. Калужская ул., д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного текстильного университета имени А.Н. Косыгина.

Автореферат разослан"_"_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Зубкова Н.С.

О-ОО^-Д з

I 6с>О С ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биополимеры - хитин, хитозан, а также некоторые их эфиры и соли широко применяются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности. Это связано с биологической активностью данных полимеров, их биосовместимостью и биоразрушаемостью, иммуномодулирующим, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, гемостатическим действием и низкой токсичностью. Особый интерес представляют сульфатированные производные хитозана (СХ) как наиболее близкие структурные аналоги природного антикоагулянта крови гепарина (Г), дефицит и высокая стоимость которого стимулирует поиск и синтез его заменителей.

В последнее время большое внимание уделяется исследованию и созданию лекарственных форм на основе низкомолекулярных гепаринов (молекулярная масса 3-6 кД) и других мукополисахаридов, поскольку такие препараты обладают лучшими фармакокинетическими свойствами и меньшей токсичностью. Ферментативный гидролиз - это мягкий и эффективный способ снижения молекулярной массы полимеров. Для гидролиза гепарина обычно используют гепарина-зы, но высокая стоимость и отсутствие гепариназ на отечественном рынке обусловливают необходимость поиска других более доступных ферментов, пригодных для получения низкомолекулярных гепарина и гепариноидов. Такими ферментами могут быть папаин и лизоцим, а также ферментные препараты целлови-ридин и Эи^ерЬтусез kurssanovii, которые с успехом используются для снижения -молекулярной массы хитина и хитозана. Принципиальная возможность ферментативного гидролиза сульфата хитозана и гепарина указанными ферментами обусловлена отсутствием у них узкой субстратной специфичности.

В разработке проблемы создания низкомолекулярных форм гепарина ведущее положение занимают американские (Я. УпЬагсК, II. ОеваО, итальянские (В. Саэи, в. Тот), французские (А. Ргуйтап) и японские (¿. Нтапо) ученые. Российскими учеными В. Макаровым (ГНЦ РАМН), А. Гамзазаде (ИНЭОС РАН) внесен существенный вклад в исследования, направленные на создание эффективных заменителей гепарина. Данная диссертация является продолжением проведенных ранее на кафедре ТХВ МГТУ совместно с ГНЦ исследований и первой из работ, посвященной получению низкомолекулярных форм сульфата хитозана.

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры технологии химических волокон МГТУ и лаборатории Центра "Биоинженерия" РАН при финансовой поддержке РФФИ (код проекта 02-0449850), ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения" и грантом молодых ученых МГТУ.

Целью работы являлось исследование возможности получения низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина, а также изучение строения и биологических свойств полученных препаратов. Для достижения поставленной цели было необходимо:

-изучить возможность получения низкомолекулярных сульфатов хитозана и гепарина с использованием метода ферментативного гидролиза неспецифическими доступными ферментами и ферментными препаратами;

-осуществить выбор наиболее эффективного ферментного препарата и оптимальных условий его действия в нативном и иммобилизованном состоянии; *

рос. национальная i библиотека I

-провести сульфатирование низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами;

-охарактеризовать биологическую активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина, полученных различными методами.

Научная новизна работы

Установлены закономерности ферментативного гидролиза сульфатирован-ных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина неспецифическим фермет-ным комплексом (ФК) из Streptomyces kurssanovii, в том числе в иммобилизованном состоянии, главными из которых являются следующие:

- ферментативный гидролиз полисахаридов наиболее эффективным ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii протекает преимущественно по эндомеханизму;

- сульфат хитозана как более специфический субстрат, содержащий ионо генные группы основного и кислотного типа, гидролизуется с большей скоростью, чем гепарин, содержащий лишь кислотные группы;

• иммобилизованный ферментный комплекс по эффективности не уступает кативному, что может быть связано с фиксацией на носителе в предложенных условиях наиболее активных компонентов ферментного комплекса и минимальным изменением «информации активного центра.

При исследовании сульфатирования низкомолекулярных хитозанов показано, что низкомолекулярный хитозан, полученный ферментативным гидролизом, протекающим, главным образом, в аморфных областях, обладает наиболее упорядоченной надмолекулярной структурой и наименьшей реакционной способностью. :

Впервые показана общая для гепарина и сульфата хитозана закономерность преимущественного проявления анти Ха активности с понижением молекулярной массы препаратов.

•Практическая значимость работы

Предложены условия и разработан лабораторный регламент получения низкомолекулярных препаратов гепарина с молекулярной массой 3-6 кД с использованием доступного и дешевого ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii. Полученные препараты проявляют выраженную анти Ха активность, и имеют соотношение анти Ха и антитромбиновой активности на уровне коммерческих образцов низкомолекулярного гепарина. Наработаны образцы низкомолекулярного гепарина и сульфата хитозана, необходимые для проведения исследований в тестах in vivo, в том числе в композициях и в виде микрокапсулированных форм.

Апробация результатов работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Шестой (Москва 2001) и Седьмой (Санкт-Петербург-Репино 2003) Международных конференциях Российского Хитинового общества "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана", ка Седьмом съезде Польского Хитинового общества (Польша 2001), ка Третьем Международном симпозиуме "Энэимология хитина" (Италия 2001), на внутривузовской конференции (Москва 2001) и научной конференции профессор-ско-преподовательского состава, научных сотрудников и аспирантов МГТУ (Москва 2002),на Международном конгрессе 'Тромбоз" (Болонья 2002) и др. По теме диссертации имеются 13 публикаций и подана заявка на патент.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена

на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 22 рисунка, библиографию из 145 наименований.

Содержание работы

Во введении приведено обоснование актуальности выбранной темы, сформулированы цели и задачи исследований, научная новизна и практическая значимость работы. В литературном обзоре проведен анализ литературы по современному состоянию проблемы получения низкомолекулярных биологически активных препаратов гепарина и гепариноидов методами химической и ферментативной деполимеризации. В методическом разделе описаны методы модификации и анализа полученных низкомолекулярных производных полисахаридов - вискозиметрия, гельпроникающая хроматография, ультрафильтрация, элементный анализ, ИК- и 13С ЯМР-спектроскопия. В экспериментальном разделе изложены результаты исследования закономерностей ферментативного гидролиза сульфатов хиго-зана и гепарина и сульфатирования низкомолекулярных хитозанов, а также данные о строении и биологической активности полученных производных низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ферментативный гидролиз сульфата хитозана и гепарина

Характеристики использованных в работе в качестве исходных образцов гепарина и сульфатов хитозана приведены в табл. 1.

Таблица 1

Обозначение Производитель [Шдл/г ММ, кД в, %

СХ-1 МГТУ, опытное 0,35 100,0 13,5

СХ-2 производство 0,28 75,0 14,8

СХ-3 ОАО "Акрихин" 0,43 130,0 15,5

Г-1 (из легких) Москва МЭЗ 0,11 7,5 10,8

Г-2 (из мукозы) Импорт из КНР 0,11 7,5 10,5

Скрининговые исследования ферментативного гидролиза СХ с использованием ряда ферментных препаратов показали, что наиболее значительные изменения в молекулярно-массовом распределении сульфата хитозана могут быть получены при его гидролизе ферментным комплексом из 5. киязапоуН (рис.1). При гидролизе этим ферментным комплексом средневязкостная молекулярная масса сульфата хитозана снизилась на 80-95 %, а выход гидролизованного сульфата хитозана составил 80-90 %.

Другие ферменты - папаин, лизоцим и целповиридин - практически не изменяют профиль элюции полученных гидролизатов. Поэтому для дальнейшего более детального изучения закономерностей протекания ферментативного гидролиза сульфатированных аминополисахаридов был выбран ферментный комплекс из & кигввапож

Известно, что каталитическая активность ферментов очень чувствительна к воздействию различных факторов, и максимальную активность они проявляют в определенном температурном интервале и в: среде с определенным рН. В работе установлено, что для ферментного комплекса из 3. кигззапот, проявляющего активность в широком диапазоне рН (4,0+8,0) и температуры (25+50°С), при гидролизе сульфата хитозана наиболее оптимальными являются рН 5-6 и температура 37 бС (рис.2).

Рис. 1. Профили злюции исходного СХ (1) и его гидролизатов (2-4), полученных с использованием ФК из 5. китапом/

' ' „ V о,25ММ».С1,мл

Условия гидролиза: 37 С, 24 ч, рН 6,0 массовое соотношение СХФК = 1000:1 (2);500:1 (3); 260:1 (4), концентрация СХ 1,0 %

Изучение влияния концентрации исходного раствора сульфата хитозана в диапазоне от 2,0 до 0,5 % на протекание процесса гидролиза позволило в качестве оптимальной выбрать концентрацию 1,0 %, поскольку использование более разбавленных растворов полимера не приводит к дополнительному снижению характеристической вязкости гидролизатов.

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости растворов СХ-1 от рН среды (1) и температуры гидролиза (2)

т.'с

рн

Условия гидролиза: продолжительность 24 ч, массовое соотношение СХ:ФК = 100:1, концентрация СХ 1,0%,температура 37 °С (1), рН 6 (2)

Результаты хроматографического разделения гидролизатов, полученных при различных соотношениях СХ и ФК (рис. 1, табл. 2), наглядно свидетельствуют о зависимости молекулярной массы продуктов гидролиза сульфата хитозана от количества в реакционный смеси ферментного комплекса. С увеличением содержания ферментного комплекса в реакционной среде максимумы поглощения на

кривых злюции гидролизатсв смещаются в сторону больших величин объема элюата, что говорит об образовании более низкомолекулярных продуктов.

Таблица 2

Влияние массового соотношения СХ:белок ФК

СХ:белок ФК, г/г [т]],ДЛ/Г ММ, кД Содержание серы, %

Исходный СХ-2 0,25 75 14,8

1000:1 0,21 51 8,4

500:1 0,15 34 9,5

250:1 0,09 17 6,3

Как видно из данных табл. 2, ферментативный гидролиз сульфата хитозана приводит к получению продуктов с меньшим содержанием серы. Снижение серы в сульфатах хитозана, очевидно, связано с протеканием побочного процесса отщепления серосодержащих заместителей, а также потерей наиболее высокозаме-щенных фракций полимера.

Исследование влияния продолжительности гидролиза показало, что наиболее резкое уменьшение характеристической вязкости и молекулярной массы сульфата хитозана происходит в течение первых 2-4 ч, хотя молекулярная масса продолжает падать вплоть до 24 часов гидролиза (рис.3). Такой вид кривых характерен для ферментов, действующих по эндомеханизму, при котором размер макромолекулы уменьшается в кратное количество раз.

Рис.3. Изменение ММ СХ-1 (1), СХ-2(2) и СХ-З(З) в ходе ферментативного гидролиза 5. /о/гезалом/

Время, ч

Условия гидролиза, температура 37°С, массовое соотношение СХ:ФК= 500:1, концентрация СХ 1,0%, рН 6

Разделение гидролизатов сульфата хитозана с целью наработки фракций с меньшей ММ и более узким молекулярно-массовым распределением, необходимых для определения антикоагулянтной активности, проводили на колонке с ак-рилекс Р-2. В табл. 3 приведены данные о выходе фракций, из которых видно, что таким способом могут быть получены образцы сульфатов хитозана со средневяз-костной молекулярной массой <1,5 кД.

Таким образом, подобранные условия проведения ферментативного гидро^

лиза сульфата хитозана обеспечивают существенное снижение его молекулярной массы, при этом варьирование продолжительности гидролиза и фермент-субстратного соотношения позволяют получать сульфаты хитозана с заданной молекулярной массой вплоть до 5 кД, а последующее фракционирование - с еще меньшей - вплоть до 1,5 кД.

Таблица 3

Фракция ММ.кД Выход фракций при гидролизе (%)

СХ-1 СХ-2 СХ-3

1 5,3 36 38 46

2 3,7 30 37 14

3 2,5 13 4 5

4 1,6 6 3 3

Исходя из аналогии структур гепарина и сульфата хитозана, ферментативный гидролиз гепарина ферментным комплексом из & /сиге$апоуй проводили в условиях, ранее подобранных для сульфата хитозана, при рН 6,0 и температуре 37°С. Динамическая вязкость гидролизата гепарина наиболее заметно уменьшалась в течение первых 2-3 ч гидролиза. Данные об изменении характеристической вязкости и молекулярной массы полисахаридов, приведенные в табл. 4, также показывают, что преимущественно молекулярная масса гепарина снижается в первые 3 часа, а в следующие несколько часов ММ полисахарида практически не изменяется и лишь за 24 ч молекулярную массу удается снизить в два раза.

Таблица 4

Влияние продолжительности ферментативного гидролиза

Время гидролиза, ч [П1. ДЛ/г ММ.кД Снижение ММ**, %

Г-1 СХ-2 Г-1 СХ-2 Г-1 СХ-2

0 0,110 0,280 7,5 75,0 0 0

3 0,085 0,115 5,7 23,4 24 69

5 0,085 0,100 5,7 19,5 24 74

, 7 0,085 0,090 5,7 17,0 24 77

24 0,050 0,075 3,4 13,4 55 82

соотношение 500:1; концентрация полимера 1,0%.

" Снижение ММ = (ММо-ММ,): ММ0*100

Поскольку в случае гидролиза сульфата хитозана характеристическая вязкость и ММ снижаются значительно более резко, можно сделать вывод о том, что гепарин более устойчив к воздействию ферментного комплекса, чем сульфат хитозана.

Факт протекания ферментативного гидролиза гепарина подтвержден также данными хроматографического разделения гидролизатов гепарина на колонке с акрилекс Р-2, в частности, смещением максимума поглощения в сторону более низкомолекулярных продуктов (рис. 4).

Рис.4. Профили элюции исходного гепарина (1) и его гидролизатов (2,3)

с 0,3 -| с20в

0.2 Н

0,1

-1—I—"1—г-

100

118

146

130

V 0,26 М МаС1, мл

Условия гидролиза: температура 37 °С, продолжительность 24 ч, рН 6,0, массовое соотношение Г:ФП= 500:1 (2) и 250:1 (3), концентрация гепарина 1,0 %

Как и следовало ожидать, гидролизованный гепарин при почти вдвое меньшей молекулярной массе характеризуется более узким молекулярно массовым распределением, при этом содержание фракций с ММ<2,5 кД, составляет50 %, а с ММ <5 кД порядка 90 %. Из данных табл. 5, видно, что в результате побочного процесса десульфатирования происходит снижение содержания серы и в гидро-лизованном гепарине.

Таблица 5

Характеристика фракций гидролизата гепарина

Образец

Гисх

НМГх

Га

Гв

Гс

Гд

Ждл/г.

0,150 0,065 0,075 0,055 0,037 0,025

ММ, кД

10,3 4,4. 5,1 3,7

2.5

1.6

Б/Уо

10,8

7,1 5,7 8,6 4,6

Выход,%

10 40 20 30

Сравнение эффективности ферментативного гидролиза гепарина и сульфата хитозана показало, что при ферментативном гидролизе гепарина за 5 ч потеря вязкости составляет 6-10 %, а для СХ - 45-50 %. Вероятно, это объясняется большей доступностью сульфата хитозана как субстрата для данного ферментного комплекса. Тем не менее, предлрженные условия проведения ферментативного гидролиза позволяют получать образцы низкомолекулярного гепарина с молекулярной массой до 3,4 кД, а в сочетании с дополнительным фракционированием и более низкомолекулярные фракции (ММз 2,5 кД) с хорошим (на уровне 50 %) выходом.

Ферментативный гидролиз полисахаридов с использованием, иммобилизованного ферментного комплекса из & киг&апоуЦ Многократное или длительное использование нативных ферментов очень часто невозможно по причине их инактивации. Кроме того, растворение в реакционной среде нативных ферментов предопределяет необходимость очень тщательной очистки от них получаемых продуктов. Неустойчивость при хранении и при различных, например, тепловых, воздействиях также ограничивает возмог

ность применения ферментов в нативном состоянии. Все эти затруднения можно преодолеть, используя ферментные препараты в иммобилизованном состоянии. Поэтому в данной работе представлялось целесообразным исследовать возможность получения и применения иммобилизованного ферментного комплекса для гидролиза сульфатированных аминополисахаридов.

В качестве матрицы при иммобилизации ФКиз & /шкалом/использовали аминоарильное производное силохрома активированное азотистой кислотой. Иммобилизацию проводили по реакции диазотирования. Количество иммобилизованного белка, по которому при гидролизе рассчитывали субстрат-ферментное соотношение, составило 0,2 мг белка на 1 г сорбента.

Изучение рН-зависимости активности иммобилизованного ферментного комплекса показало, что при гидролизе гепарина и сульфата хитозана рН-оптимум практически совпадает с таковым для нативного ферментного комплекса (рН оптимум 6,0), но в случае гидролиза СХ иммобилизованным ФК интервал рН оптимума расширяется от 6,0 до 7,0, а в случае гепарина - до 7,5. Кроме того, температурный оптимум при гидролизе иммобилизованным ферментным комплексом смещается в область более высоких температур и составляет40-45°С против 37-40°С для нативного ферментного комплекса. Сравнение эффективности гидролиза иммобилизованным и нативным ФК свидетельствуют о том, что иммобилизованный ФК не уступает нативному. Так, при гидролизе сульфата хитозана за 1 ч в оптимальных условиях действия ферментов молекулярная масса СХ снижается в 1,5 раза в обоих случаях, а в случае гепарина - в 0,5 раза.

По данным методов ИК- и13 С ЯМР-спектроскопии исходный гепарин и его гидролизат, полученный с использованием иммобилизованного ферментного комплекса иа 5. ки/ьзапощ имеют идентичное строение.

Рис.5.13С ЯМР спектры растворов исходного гепарина (1) и гидролизата гепарина (2)

Л-SJS I-2A-3

*-». . .1 и-бТ2

ILMHHI .. ......................ijüm'iWU" i'iiniii flHiii

O-l

Ntfciw

У|||||Ц1Й11Ч1"»1*|1ЦИ ieo ' ~ rto

м.д.

Сравнение ЯМР-спектров показало, что химические сдвиги 1,2 и 6 углеродных атомов глюкозаминовых остатков (А-1 ,А-2 и А-6) и 1,2 и 4 углеродных атомов остатков идуроновых кислот (1-1,1-2 и I-4) практически сохранили свое положение, а расщепление сигналов атомов А-3, А-4, А-5, i-3,1-2.I-4 и I-5 в области 72-81 м.д. является следствием микрогетерогенности получаемых низкомолекулярных продуктов.

СульФатирование низкомолекулярных образцов хитозана Наряду с ферментативным гидролизом низкомолекулярный сульфат хитозана может быть получен также методом сульфатирования низкомолекулярных, образцов хитозана. В технологическом процессе получения сульфатов хитозана стадия сульфатирования определяет основные характеристики (степень замещения, молекулярную массу) и, следовательно, свойства (растворимость, биологическую активность) конечного продукта. Ранее на кафедре ТХВ сульфатировани-ем высокомолекулярного хитозана системой диметилформамид- ЭОз при температуре 45-60°С в течение разного времени были получены препараты сульфата хитозана с ММ 25-150 кД, степенью замещения (СЗ) 1,2-1,6 и антикоагулянтной активностью 20-70 Ед/мг. Поскольку, перспективные антикоагулянты должны иметь более низкую ММ, в данной работе изучены возможность и закономерности сульфатирования низкомолекулярных (ММ 10-50 кД) образцов хитозана, полученных разными способами: экструзионным дезацетилированием хитина (ХЭ), ферментативным (ХФ) и кислотным (ХК) гидролизом высокомолекулярного хитозана. В табл. 6 представлены характеристики исходных хитозанов, при этом обозначение образца отражает способ получения и ММ, выраженную в кД.

Таблица 6

Основные характеристики исходных хитозанов_

Обозначение ММ, кД СП . сд Зольность, %

• Х-300 300 1800 0,88 0,2 '

ХФ-50 50 300 0,90 • ■■

ХФ-35 35 210 -У 0,87-

ХФ-33 33 198 0,88

ХФ-30 30 185 *"- 0,90

ХФ-10 10 60 * 0,90

ХЭ-45 45 235 0,91 0,05

ХЭ-30 30 185 0,92 .

ХК-20 20 122 0,91 0,10

ХК-10 10 60 0,80

Образец Х-300 представляет собой коммерческий высокомолекулярный хи-тозан, полученный из панцирей крабов. Образцы хитозанов ХЭ получены на кафедре ТХВ МГТУ совместно с ИСПМ РАН, ХФ - в Центре "Биоинженерия", а ХК предоставлены ЗАО "Эхо".

Активацию низкомолекулярных образцов проводили по аналогии с высокомолекулярным хитозаном инклюдированием в диметилформамиде, а в ряде случаев перед инклюдированием их переосаждали из раствора. Активация способствует набуханию полимера, разрушению межмолекулярных водородных связей и аморфизации его структуры, облегчая доступ реагентов к функциональным группам. Экструзионно полученные образцы хитозана характеризуются большей однородностью частиц по размерам и форме, кроме того они обладают более разрушенной структурой и имеют более высокую реакционную способность в реакции сульфатирования по сравнению с хитозанами ХФ. Как и ожидали, при сульфа-тировании происходит снижение ММ полимеров. При этом более корректным является сопоставление не ММ исходных хитозанов и полученных сульфатов хитозана, а величин их степеней полимеризации (СП), так как при сульфатирования происходит существенное (примерно в 2 раза) повышение молекулярной массы

мономерного звена полимера. Закономерно, что при сульфатировании снижение СП происходит тем в большей степени, чем выше СП исходного хитозана. Так, степень полимеризации высокомолекулярного хитозана Х-300 при сульфатировании снижается более чем в 20 раз, тогда как у сульфатов хитозана, полученных из низкомолекулярных хитозанов, она снижалась лишь в 2-10 раз.

Степень замещения^СХ, полученных из ХЭ находится на уровне 1,3-1,8, а из ХФ - 1,0-1,6 (табл. 7). Тем не менее, самые низкомолекулярные (ММ 8-10 кД) сульфаты хитозана получены нами из наиболее низкомолекулярных исходных хитозанов ХФ-10 и ХК-10. Сульфат хитозана, полученный из ХК-10, при довольно высокой степени сульфатирования обладает самой низкой СП.

Таблица 7

Характеристики сульфатов хитозана _

Исходный хитозан [П]. ДЛ/г ММ, кД Б, % СЗ СП СП*/СПсх

Х-300 0,14 30 16,7 1,85 85 21,2

ХЭ-45 0,12 25 16,8 1,85 70 3,4

ХФ-30 0,12 25 15,7 1,63 75 2,5

ХЭ-30 0,12 25 15,9 1,65 75 2,5

ХФ-10 0,06 10 13,9 1,30 35 1,7

ХК-10 0,05 8 15,7 1,63 24 2,5

Результаты фракционирования образцов СХ, полученных из хитозанов ХЭ, на колонке с сефадекс С-10, представленные в табл. 8, показали, что таким образом можно получать фракции СХ со степенью полимеризации 35-45, но выход их находится на уровне 16-20%.

Таблица 8

Фракционный состав образцов сульфата хитозана_

Образец СХ Сп], ММ, СП Б, % . СЗ Выход,

и фракции дл/г кД %

СХ из ХЭ-45 0,12 25 75 15,9 1,65 -

1 0,16 35 100 16,0 1,70 43

2 0,12 25 75 15,8 1,65 21

3 0,07 15 45 15,7 1,63 16

* СХ из ХЭ-30 0,12 25 75 15,9 1,75 -

1 0,16 35 105 16,2 1,75 39

2 0,14 30 80 16,1 1,70 27

3 0,07 15 35 15,5 1,60 20

Сравнение ЯМР спектров полисахаридов показало практически полную аналогию спектров сульфатированных производных, полученных из различных хитозанов. Строение сульфатов хитозанов было исследовано также методом ИК-спектроскопии, который подтвердил наличие в них сульфатных групп.

Исследование антикоагулянтной активности препаратов сульфата хитозана и гепарина Полученные продукты сульфатирования хитозана различаются по молекулярной массе и содержат набор функциональных групп различной химической

природы - аминогруппы, гидроксильные, сульфатные. Интересным представляется изучение взаимосвязи между строением и биологической, в частности, анти-коагулянтной активностью образцов.

Гепарин и сульфат хитозана являются антикоагулянтами прямого действия и предотвращают активацию свертывания крови как in vivo, так и in vitro. Антикоа-гулянтная активность, проявляемая этими препаратами на разных стадиях процесса гемостаза, может быть охарактеризована в различных тестах с использованием модельных систем и компонентов крови.

Антитромбиновая активность (alla) гепарина обусловлена его способностью ингибировать тромбин путем образования комплекса с ним и с антитромбином, и увеличение ММ гепарина благоприятствует образованию таких комплексов. Кроме того, фракции гепарина с пониженной молекулярной массой на более ранней стадии гемостаза взаимодействуют с фактором Ха, поэтому препараты гепарина проявляют как антитромбиновую активность, так и анти Ха (аХа) активность, которая увеличивается с понижением молекулярной массы. Именно такие изменения механизма действия низкомолекулярных гепаринов обеспечивают улучшенные фармакокинетические характеристики и снижение геморрагического побочного действия.

Изучение антитромбиновой и аХа активностей исходного и гидролизованно-го гепарина и их фракций показало, что как и ожидалось, с уменьшением молекулярной массы образцов наблюдается закономерное увеличение аХа активности и снижение антитромбиновой активности, и у лучших образцов аХа активность превышает антитромбиновую в 2-4 раза, что сопосгавимд^коммерческими препаратами низкомолекулярного гепарина (табл. 9). - v

m Таблица 9

ММ, кД S,% аХа, ед/мг alla, рд/мг aXa:a!la

7,5 (исходный) 10,8 184 0,8

3,1 1,7 8,8 8,7 340 646 ik 153 2,0 4,2

Исследование антитромбиновой и аХа активности гидролизованных образцов сульфата хитозана с молекулярной массой 25-3,7 кД показало, что они обладают преимущественно антитромбиновой активностью. Дальнейшее снижение ММ до 2,5 кД приводит к повышению аХа активности и увеличению соотношения активностей aXa:alla до 1,7. Вместе с тем низкий уровень этой активности (3-5 ед/мг) может быть связан с протеканием при гидролизе побочного процесса де-сульфатирования и недостаточно высокой (менее 1,0) степенью сульфатирования полученных продуктов.

Для высокосульфатированных образцов сульфата хитозана (С31,60-1,63), полученных сульфатированием, с понижением ММ доЮ кД наблюдается увеличение аХа активности до 57-64 ед/мг по сравнению с 2-4 ед/мг для образцов с ММ выше 10 кД, а антитромбиновая активность наоборот понижается с 37-85 до 13-14 ед/мг, что приводит к увеличению соотношения aXa:alla до 4,0-4,9.

Наработанные укрупненные образцы низкомолекулярного гепарина и сульфата хитозана переданы на испытание в тестах in vivo и для получения микрокап-сулированных форм препарата.

ВЫВОДЫ

С целью разработки способа получения низкомолекулярных препаратов гепарина и сульфата хитозана, потенциально обладающих улучшенными фармако-кинетическими характеристиками, проведено исследование закономерностей ферментативного гидролиза полисахаридов доступными неспецифическими ферментными препаратами, а также закономерностей сульфатирования низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами.

1. Впервые показана возможность получения низкомолекулярных препаратов сульфата хитозана двумя способами: ферментативным гидролизом высокомолекулярного полисахарида и сульфатированием низкомолекулярного хитозана. Определены параметры гидролиза (pH и температурный оптимумы) наиболее эффективным ферментным комплексом из S. kurssanovií, в том числе в иммобилизованном состоянии, позволяющие в 4-5 раза снизить молекулярную массу и получить препараты с ММ 5-17 кД. Для получения сульфата хитозана с такой же ММ сульфатированием низкомолекулярного хитозана необходимым является использование аморфизованного исходного хитозана с ММ не более 10 кД.

2. Установлено, что гепарин в меньшей степени подвергается ферментативному гидролизу, однако даже 2-х кратное снижение его молекулярной массы обеспечивает получение с хорошим выходом образцов с ММ З-б кД, что находится на уровне коммерческих препаратов низкомолекулярного гепарина.

3. Показано, что иммобилизация ферментного комплекса из S. kurssanovií приводит к повышению его устойчивости к температурным воздействиям и смещению температурного оптимума действия с 37 до 40-45°С. Иммобилизованный ферментный комплекс практически не уступает нативному в эффективности действия при гидролизе полисахаридов в оптимальных условиях.

4. Исследование строения полученных ферментативным гидролизом низкомолекулярных препаратов гепарина и СХ методами ИК и 13С ЯМР-спектроскопии показало идентичность химического строения гидролизованных и исходных полисахаридов, однако по данным элементного анализа при гидролизе протекает побочный процесс десульфатирования, более выраженный в случае СХ.

5. Исследование антикоагулянтной активности образцов гепарина показало, что с понижением молекулярной массы происходит закономерное увеличение их аХа активности и снижение антитромбиновой активности, и для образцов с ММ меньше 5 кД соотношение аХа: alla, равное 2-4, находится на уровне лучших коммерческих препаратов низкомолекулярного гепарина. Для сульфата хитозана подобная закономерность наблюдается при молекулярной массе ниже 10 кД.

Основное содержание работы отражено в публикациях:

1. Вихорева Г.А., Суханова П.П., Банникова Г.Е. Исследование возможности получения низкомолекулярного сульфата хитозана // Тез. докл. внутривузовской научной конф. М.: МГТУ, 2001.С.64

2. Bannikova G.E., Sukhanova P.P., Vikhoreva G.A., Varlamov V.P. Depolymeri-zation of sulfated chitosan with chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovií II Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives / H. Struszczyk. Polish Chitin Society Lodz: Poland, 2001. Monograph. Vil. P.65-72.

3. Дрозд H.H., Макаров B.A., Варламов В.П., Банникова Г.Е., Гальбрайх Л.С., Вихорева Г.А., Суханова П.П. Антикоагулянтная активность образцов низкомолекулярного сульфата хитозана // Материалы Шестой Международ, конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" М.: ВНИРО, 2001.С.161-

4. Банникова Г.Е., Вихорева Г.А., Суханова П.П., Варламов В.П. Исследование возможности ферментативной деполимеризации сульфата хитозана II Материалы Шестой Международ, конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" М.: ВНИРО, 2001 .С.343-346.

5. Variamov V.P., llyina A.V., Bannikova G.E., Lopatin S.A., Nemtzev S.V., Yu-supova D.V., Melent'evA.I., Sukhanova P.P., Vikhoreva G.A. Enzymatic depolymeriza-tion of chitosan and sulfated chitosan II Chitin Enzymology, Atec, Italy I R.A.A. Myzza-relli. 2001. P.423-429.

6. Drozd N.N., Makarov V.A., Variamov V.P., Bannikova G.E., Sukhanova P.P., Galbraikh L.S. Anticoagulant activity of the low molecular weight chitosan sulphate derivatives //17 Int. Congress on Trombosis. Bolonia, 2002.

7. Банникова Г.Е., Суханова П.П., Вихорева Г.А.; Варламов В.П., Гальбрайх Л .С. Гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurs-sanovii // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №5. С.486-489.

8. Суханова П.П. Оптимизация условий получения низкомолекулярного сульфата хитозана // Сборник научных трудов аспирантов М: МГТУ. 2002. Вып. 5. С.62-66.

9. Столбуижина П.П., Вихорева ГА., Банникова Г.Е., Дрозд H.H., Макаров В.А. Сульфатирование низкомолекулярного хитозана // Материалы Седьмой Международ. конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" М.: ВНИРО, 2003. С. 50-52.

10. Дрозд H.H., Макаров В.А., Варламов В.П., Банникова Г.Е., Гальбрайх Л.С., Вихорева ГА., Столбушкина П.П. Исследование антикоагулянтной активности низкомолекулярных образцов сульфата хитозана II Материалы Седьмой Международ. конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" М.: ВНИРО, 2003. С. 169-171.

11. Дрозд H.H., Макаров В.А., Варламов В.П., Банникова Г.Е., Гальбрайх Л.С., Вихорева Г.А., Столбушкина П.П. Антикоагулянтная активность низкомолекулярного гепарина, полученного с помощью ферментативного гидролиза II Материалы Первой Всероссийской конф. "Клиническая гемостазиология и гемореоло-гия в сердечно-сосудистой хирургии" М.: Здоровье человека, 2003. С.99.

12. Дрозд H.H., Макаров В.А., Варламов В.П., Банникова Г.Е., Гальбрайх Л.С., Вихорева Г.А., Столбушкина П.П. Исследование антитромбиновой активности и активности против фактора Ха низкомолекулярных образцов гепарина и сульфата хитозана // Сборник тезисов 2-го съезда Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" М.: Здоровье человека, 2003. С.167.

13. Столбушкина П.П., Киселева Г.В. Разработка способа получения лекарственных средств на основе производных хитозана II Сборник научных трудов, выполненных по итогам конкурса грантов молодых исследователей М.: МГТУ, 2003. С.25-29.

и , .

\4>оо£

ИД №01809 от 17.05.2000

Подписано в печать 21.10.03 Сдано в производство 21.10.03 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 1,0 Уч.-изд.л. 0,75 Заказ 458 Тираж 80

Электронный набор МГТУ, 119991, ул. Малая Калужская, 1

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Столбушкина, Полина Петровна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Химическое строение и биологические свойства полисахаридов и их производных.

1.1.1. Химическое строение и биологические свойства гепарина.

1.1.2. Способы получения и биологические свойства гепариноидов.

1.1.3. Способы получения и биологическая активность производных полисахаридов хитина и хитозана.

1.2. Ферментативный гидролиз полисахаридов.

2. Разработка условий получения низкомолекулярных сульфатиро-ванных аминополисахаридов и исследование их строения и свойств.

2.1. Ферментативный гидролиз сульфата хитозана и гепарина.

2.1.1. Характеристика исходных полисахаридов, ферментных препаратов и методов оценки протекания ферментативного гидролиза.

2.1.2. Результаты скрининговых исследований ферментативного гидролиза сульфата хитозана.

2.1.3. Ферментативный гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii.

2.1.4. Ферментативный гидролиз гепарина ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii.

2.1.5. Ферментативный гидролиз полисахаридов с использованием ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii.

2.2. Сульфатирование низкомолекулярных образцов хитозана.

2.3. Исследование антикоагулянтной активности препаратов сульфата хитозана и гепарина.

3. Методический раздел.

3.1. Исходные материалы и химические реагенты.

3.2. Методы синтеза.

3.3. Методы анализа.

Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов"

Биополимеры - хитин, хитозан, а также некоторые их эфиры и соли широко применяются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности. Это связано с биологической активностью данных полимеров, их биосовместимостью и биоразрушаемостъю, иммуномо-дулирующим, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, гемостатическим действием и низкой токсичностью. Особый интерес представляют сульфатированные производные хитозана (СХ) как наиболее близкие структурные аналоги природного антикоагулянта крови гепарина (Г), дефицит и высокая стоимость которого стимулирует поиск и синтез его заменителей.

Ферментативный гидролиз - это мягкий и эффективный способ снижения молекулярной массы полимеров. Для гидролиза гепарина обычно используют гепариназы, но высокая стоимость и отсутствие гепариназ на отечественном рынке обусловливают необходимость поиска других более доступных ферментов, пригодных для получения низкомолекулярных гепарина и гепари-ноидов. Такими ферментами могут быть папаин и лизоцим, а также ферментные препараты целловиридин и Streptomyces kurssanovii, которые с успехом используются для снижения молекулярной массы хитина и хитозана. Принципиальная возможность ферментативного гидролиза сульфата хитозана и гепарина указанными ферментами обусловлена отсутствием у них узкой субстратной специфичности.

В разработке проблемы создания низкомолекулярных форм гепарина ведущее положение занимают американские (R. Linhardt, U. Desai), итальянские (В. Casu, G. Torn), французские (A. Frydman) и японские (S. Hirano) ученые. Российскими учеными В. Макаровым (ГНЦ РАМН), А. Гамзазаде (ИНЭ-ОС РАН) внесен существенный вклад в исследования, направленные на создание эффективных заменителей гепарина. Данная диссертация является продолжением проведенных ранее на кафедре ТХВ МГТУ совместно с ГНЦ исследований и первой из работ, посвященной получению низкомолекулярных форм сульфата хитозана.

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры технологии химических волокон МГТУ и лаборатории Центра "Биоинженерия" РАН при финансовой поддержке РФФИ (код проекта 02-04-49850), ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения" и грантом молодых ученых МГТУ.

-осуществить выбор наиболее эффективного ферментного препарата и оптимальных условий его действия в нативном и иммобилизованном состоянии;

-провести сульфатирование низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами;

-охарактеризовать биологическую активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина, полученных различными методами. Научная новизна работы

Установлены закономерности ферментативного гидролиза сульфатированных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина неспецифическим ферментным комплексом (ФК) из Streptomyces kurssanovii, в том числе в иммобилизованном состоянии, главными из которых являются следующие:

- сульфат хитозана как более специфический субстрат, содержащий ио-ногенные группы основного и кислотного типа, гидролизуется с большей скоростью, чем гепарин, содержащий лишь кислотные группы;

- иммобилизованный ферментный комплекс по эффективности не уступает нативному, что может быть связано с фиксацией на носителе в предложенных условиях наиболее активных компонентов ферментного комплекса и минимальным изменением конформации активного центра.

Практическая значимость работы

Предложены условия и разработан лабораторный регламент получения низкомолекулярных препаратов гепарина с молекулярной массой 3-6 кД с использованием доступного и дешевого ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii. Полученные препараты проявляют выраженную анти Ха активность, и имеют соотношение анти Ха и антитром биновой активности на уровне коммерческих образцов низкомолекулярного гепарина. Наработаны образцы низкомолекулярного гепарина и сульфата хитозана, необходимые для проведения исследований в тестах in vivo, в том числе в композициях и в виде микрокапсулированных форм.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 22 рисунка, библиографию из 145 наименований.

Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

выводы

С целью разработки способа получения низкомолекулярных препаратов гепарина и сульфата хитозана, потенциально обладающих улучшенными фар-макокинетическими характеристиками, проведено исследование закономерностей ферментативного гидролиза полисахаридов доступными неспецифическими ферментными препаратами, а также закономерностей сульфатирования низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами.

1. Впервые показана возможность получения низкомолекулярных препаратов сульфата хитозана двумя способами: ферментативным гидролизом высокомолекулярного полисахарида и сульфатированием низкомолекулярного хитозана. Определены параметры гидролиза (рН и температурный оптиму-мы) наиболее эффективным ферментным комплексом из S. kurssanovii, в том числе в иммобилизованном состоянии, позволяющие в 4-5 раза снизить молекулярную массу и получить препараты с ММ 5-17 кД. Для получения сульфата хитозана с такой же ММ сульфатированием низкомолекулярного хитозана необходимым является использование аморфизованного исходного хитозана с ММ не более 10 кД.

2. Установлено, что гепарин в меньшей степени подвергается ферментативному гидролизу, однако даже 2-х кратное снижение его молекулярной массы обеспечивает получение с хорошим выходом образцов с ММ 3-6 кД, что находится на уровне коммерческих препаратов низкомолекулярного гепарина,

3. Показано, что иммобилизация ферментного комплекса из S. kurssanovii приводит к повышению его устойчивости к температурным воздействиям и смещению температурного оптимума действия с 37 до 40-45°С. Иммобилизованный ферментный комплекс практически не уступает нативному в эффективности действия при гидролизе полисахаридов в оптимальных условиях.

5. Исследование антикоагулянтной активности образцов гепарина показало, что с понижением молекулярной массы происходит закономерное увеличение их аХа активности и снижение антитромбиновой активности, и для образцов с ММ меньше 5 кД соотношение аХа: alia, равное 2-4, находится на уровне лучших коммерческих препаратов низкомолекулярного гепарина. Для сульфата хитозана подобная закономерность наблюдается при молекулярной массе ниже 10 кД,

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Столбушкина, Полина Петровна, Москва

1. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина // Прикладная биохимия и микробиология.-1984.-Т.20, вып.2.-С.147-160.

2. Стейси М., Баркер С. Углеводы живых тканей. Пер. с англ.- М: Мир. 1965.324 с.

3. Химия биологически активных природных соединений (углевод-белковые комплексы, хромопротеиды, липиды, липопротеиды, обмен веществ ) / Под ред. Преображенского Н.А., Евстигнеевой Р.П.-М: Химия. 1976.424 с.

4. Meyer К.Н., Schwartz D.E. 214. Les substatuants des groupes amino de heparine // Helv.Chem.Acta.-1950.-V.33.-P.1651-1662.

5. Lindahl U., Hook M., Backtrom G. Structure and biosynthsis of heparin-like polysaccharides // Fed. Proc.-1977.-V.36.-P.19-23.

6. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Козин-ца Г.И, Макарова В.А. М.: Триада-Х. 1997.480 с.

7. Макаров В.А., Дрозд Н.Н., Малыхина JI.C. Роль полисульфата хитозана в развитии антикоагулянтной терапии // Мат. пятой конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-1999,-С.160-162.

8. Кожевникова И.В., Волковинская Л.П., Соколова Л.В., Норейка P.M. Способы получения гепарина // Обзорная информация ЦБНТИ Минмед-пром. сер. Химико-фармацевтическая промышленность.-1977.-№11.-С.28.

9. Cifonelli Y.A. Heparin structure, function and clinical implications. New York - London : Plenum Press, 1975.

10. Коршак A.B., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука. 1984.260 с.

11. Foster А.В., Haggard A.I. The chemistry of heparin // Adv. in Carbohydr. Chem.-1955.-V.10.-P.335-368.

12. Cifonelli J.A. The relationship of molecular weight and sulfate content and distribution to anticoagulant activity of heparin preparation // Carbohydr.Res.-1985.-V.37.-N.1.-P.145-154.

13. Graham D.T., Pomeroy A.R. Relative activites of heparin fractions obtained by gel chromatography // Thromb. and Haemost.-1980.-V.42.-P. 1598-1603.

14. Бычков C.M. Новые данные о гепарине // Вопросы мед. химии.-1981.-№2.-С.725-735.

15. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Получение гепарина из животной ткани методом ультрафильтрации // Мясная индустрия.-2000.-№7.-С.29-31.

16. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Получение гепарина и хондроитинсуль-фата из животной ткани ионообменным методом // Прикладная биохимия и микробиология.-1998.-Т.34.-№6.-С.692-697.

17. Кудряшов Б.А., Аммосова Я.М., Ляпина J1.A., Осипова Н.Н. Гепарин из таволги вязколистной, его свойства // Изв. АН СССР. Серия биологиче-ская.-1991.-№6.-С.939-943.

18. Макаров В.А., Кондратьева Т.Б. Применение гепаринов в клинической практике // Русский медицинский журнал.-1998,- Т.6.-№3.-С. 1-4.

19. Kelton J.G. Heparin-induced thrombocytopenia // Haemostasis. -1986,-V.16.-P.173-186.

20. Matzsch Т., Bergqvist D., Hender U., Nilsson В., Ostergaard P. Heparin-induced osteoporosis in rats // Thrombosis and Haemostasis.-1986.-V.56.-N.3.-P.293-294.

21. Frydman A. Low-molecular-weight heparins: an overview of their pharmacodynamics, pharmacokinetics and metabolism in humans // Haemostasis.-1996.-V.26.-N.2.-P.24-38.

22. Linhardt R.J., Gunay N.S. Production and chemical processing of low molecular weight heparins// Semin. Thromb. Hemost.-1999.-V.25.-N.3.-P.5-16.

23. Jeske W., Fareed J. In vitro studies on the biochemistry and pharmacology of low molecular heparins // Semin. Thromb. Hemost.-1999.-V.25.-N.3.-P.27-33.

24. Fareed J., Hoppensteadt D., Jeske W., Clarizio R., Walenga J.M. Low molecular weight heparins: are they different? // Can. J. Cardiology.-1998.-V.14.-N.2.-P.28-34.

25. Choo J., Kereiakes D. Low molecular weight heparin therapy for percutaneous coronary intervention: a practice in evolution // J.Thromb.Thrombolysis.-2001.-V.ll.-N.3.-P.235-246.

26. Verhaeghe R. The use of low-molecular-weight heparins in cardiovascular disease // Acta Cardiol.-1998.-V.53.-P. 15-21.

27. Nunnelee J.D. Low-molecular-weight heparin // J. Vase. Nurs.- 1997.-V.15,-P.94-96.

28. Hirsh J. Heparin and low-molecular weight heparins // Coron Artery Dis.-1992.-N.3.-P.990-1002.

29. Wang Q.L., Shang X.Y., Zhang S.L., Ji J.В., Cheng Y.N., Meng Y.J. Effect of inhaled low molecular weight heparin on airway allergic inflammation in aerosol-ovalbumin-sensitized guinea pigs // Jpn. J. Pharmacol.-2000.-V.82.-N.4.-P.326-330.

30. Linhardt R.J., Loganathan D.,A1-Hakim A., Wang H-M., Walenga J.M., Hoppensteadt D., Fareed J. Oligosaccharide mapping of low molecular weight heparins:structure and activity differences // J. Med. Chem.-1990.-V.33.-N.6.-P. 1639-1645.

31. Volpi N. Characterization of heparins with different relative molecular masses by various analytical techniques // J. Chromatogr.-1993.-V.622.-N.l,-P.13-20.

32. Nagasawa K., Uchiyama H., Sato N., Hatano A. Chemical change involved in the oxidative-reductive depolymerization of heparin // Carbohydr. Res.-1992-V.236.-N.15.-P. 165-180.

33. Lahiri В., Lai P.S., Pousada M., Stanton D., Danishefsky I. Depolymerization of heparin by complexed ferrous ions // Arch. Biochem. Bio-phys.-1992.-V.293.-N.14.-P.54-60.

34. Дутремпюиш К.Р., Содюпрей Ф., Дебиофарм С.А. Антитромботиче-ские негеморрагические композиции на основе гепарина, способ их получения и терапевтические дозы. Пат.№97104917/14.Россия.27.06.2000г.

35. Jeske W., Iqbal О., Gonella S., Boveri G., Torn G., De Ambrosi L., Fareed J. Pharmacologic profile of low-molecular-weight heparin depolymerized by gamma-irradiation//Semin. Tromb. Hemost.-1995.-V.21.-N.2.-P.201-211.

36. Bisio A., Ambrosi L., Gonella S., Gonella M., Guglieri S., Maggi G., Torn G. Preserving the original heparin structure of a novel low-molecular-weight heparin by gamma-irradiation // Arzneimittelforschung.-2001.-V.51.-N.10.-P.806-813.

37. Шоай С.А. Очищенная гепариновая фракция, способ ее получения и содержащая ее фармацевтическая композиция. Пат.№2133253.Россия. 1999 г.

38. Naggi A., Torri G., Casu В. "Supersulfated" heparin fragments, a new type of low-molecular weight heparin // Biochemical Pharmocological.-1987.-V.36.-N 12.-P.1895-1900.

39. Hoppensteadt D., Walenga J.M., Fareed J. Low molecular weight heparins. An objective overview // Drugs Aging.-1992.-V.2.-N.5.-P.406-422.

40. Nightingale S.L. From the Food and Drug Administration. // JAMA.-1993.-V.270.-N.22.-P. 1672-1674.

41. White R.H., Ginsberg J.S. Low-molecular-weight herarins: are they all the same? // British J. Haematology.-2003.-V.121.-P.12-20.

42. Morris T.A., Marsc J.J., Konopka R., Pedersen C.A., Chiles P.G. Antithrombotic efficacies of Enoxaparin, Dalteparin, and Unfractionated Heparin in venous thrombo-embolism // Thromb. Res.-2000.-V.100.-P.185-194.

43. Ostergaard P.B., Nilsson В., Bergqvist D., Hedner U., Pedersen P.C. The effect of low molecular weight heparin on experimental thrombosis and

44. Casu В., Torn G. Structural characterization of low-molecular weight heparins. // Semin. Thromb. Hemost.-1999.-V.25.-N.3.-P.17-25.

45. Rasine E. Differentiation of low-molecular weight heparins // Pharmacother-apy.-2001.-V.21.-P.62-70.

46. Daud A.N., Ahsan A, Iqbal O., Walenga J.M., Silver P.J., Ahmad S., Fareed J. Synthetic heparin pentasaccharide depolymerization by heparinase 1 molecular and biological implications // Clin. Appl. Thromb. Hemost.-2001.-V.7.-N.1.-P.58-64.

47. Mattsson C., Palm M., Soderberg K., Holmer E. Antitrombotic effects of heparin oligosaccharides // Ann.N.Y.Acad.Sci.-1989.-V.556.-P.323-332.

48. Petitou M., Herault J.P., Bernat A., Driguez P.A., Duchaussoy P. Synthesis of thrombin-inhibiting heparin mimetics without side effects // Nature.-1999.-Y.398.-P.417-422.

49. Buchanan M.R., Blister S.J., Ofosu F. Prevention and treatment of thrombosis: novel strategies arising from our understanding the healthy endothelium // Wien. Klin. Wochenschr.-1993.-V.105.-N.l 1 .-P.309-313.

50. Buchanan M. R., Liao P., Smith L. J., Ofusu F. A. Prevention of thrombus formation and growth by antithrombin III and heparin cofactor II-dependent thrombin inhibitors: importance of heparin cofactor II // Thromb. Res.-1994.-V.74.-N.5.-P.463-475.

51. Назаров И.В., Шевченко H.M., Ковалев Б.М., Хотимченко Ю.С. Имму-номоделирующие свойства полисахаридов из красных водорослей: влияние на систему комплемента // Биология моря.-1998.-Т.24.-№1.-С.50-53.

52. Усов А.И., Смирнова Г.П., Билан М.И., Шашков А.С. Полисахариды водорослей. Бурая водоросль Laminaria saccharina как источник фукоидана // Биоорган, химия.-1998.-Т.24.-С.437-445.

53. Nishino Т., Nagumo Т. The sulfate-content dependence of the anticoagulant activity of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome // Carbohydr. Res.-1991.-V.214.-P. 193-197.

54. Наджи А., Торри Д. Полусинтетические сульфаминогепаросансульфа-ты, имеющие высокую антиметастатическую активность и пониженный геморрагический риск. Патент №2176915 Россия.

55. Casu В., Grazioli G., Razi N., Guerrini M., Naggi A. Heparin-like compounds prepared by chemical modification of capsular polysaccharide from Escherichia coli K5 // Carbohydr. Res.-1994.-V.263.-N.2.-P.271-284.

56. Razi N., Feyzi E., Bjork I., Naggi A., Casu В., Lindahl U. Structural and functional properties of heparin analogues obtained by chemical sulphation of Escherichia coli K5 capsular polysaccharide // Biochem. J.-1995.-V.15.-P.465-472.

57. Geresh Sh., Mamontov A., Weinstein J. Sulfation of extracellular polysaccharides of red microalgae: preparation, characterization and properties //J. Biochem. Biophys. Methods.-2002.-V.50.-P.179-187.

58. Плиско E.A., Нудьга JI.А. Хитин и его химические превращения // Успехи химии,- 1984.-Т.46, №8.-С. 1470-1487.

59. Марьин А.П., Феофилова Е.П., Генин Я.В. Влияние кристалличности на сорбционные и термические свойства хитина и хитозана // Высокомолекулярные соединения. Сер.Б.-1982,- Т.24.-№9.-С.658-662.

60. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина // Прикладная биохимия и микробиология.-1984.-Т.20, вып.2.-С.147-160.

61. Зеленецкий С.Н. О пластифицирующем действии воды при получении хитозана из хитина непрерывным способом в двухшнековом экструдере // Пластические массы.-1998.-№1 .-С.29-33.

62. Гафуров Ю.Ф., Мамонтова В.А., Рассказов В.А. Средство наружного применения препаратов "Полимед", "Автохит", "Гидрохит" // Мат. шестой Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-2001 .-С. 150-152.

63. Быкова В.М., Кривошеина Л.Н. Хитин, хитозан биополимеры XXI века // Пища, вкус, аромат.-2000.-№1 .-С.4-7.

64. Новик А.А., Цыган В.Н., Жоголев К.Д., Никитин В.Ю. Применение препаратов на основе хитина и хитозана в медицине // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов.-М:ВИНИТИ.-2000.-№8.-С.90-106.

65. Дубинская A.M., Добротворская А.Е. Применение хитина и его производных в медицине // Хим-фарм. журнал.-1989.-Т.23.-№5.-С.623-628.

66. Kweon D.-K., Song S.-B., Park Y.-Y. Preparation of water-soluble chito-san/heparin complex and its application as wound healing accelerator // Bioma-terials.-2003.-V.24.-P. 1595 -1601.

67. Марквичева E.A. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под редакцией К.Г. Скрябиа, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.-М: Наука, 2002.-365 с.

68. Червинец В.М., Комаров Б.А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Пат.№2145975. Россия. 2000 г.

69. Niscimura К., Niscimura S., Nisei N. Immunological activity of chitin and its derivaties // Vaccine.-1984.-V.2.-N.l.-P.93-99.

70. Немцев C.B., Ильина A.B., Шинкарев C.M., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Био-технология.-2001.- № 6.-С. 37-42.

71. Бегунов И.И., Калугин Н.Ф., Догаленко В.Н., Стрелков Е.В. Нарцисс-альтернативахимическим протравителям // Мат. шестой Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-2001 .-С.16-11.

72. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г. и др. Производные хитина и хитозана как элиситоры фитофторустойчивости картофеля // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-№4.-С.433-438.

73. Таирова А.Р. Состояние минерального обмена в организме коров на фоне применения хитозана // Мат. шестой Международной конф. "Новые

74. Косяков В.Н., Яковлев Н.Г., Велешко И.Е. Хитин-хитосодержащие материалы для дезактивации жидких радиоактивных отходов // Мат. 6-ей Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хито-зана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-2001.-С.287-290.

75. Горбачева И.Н. Разработка способа получения водорастворимых сульфатов хитина и хитозана и исследование их свойств Дис.к.х.н.-М.: Текстильный Институт .-1990.С.236.

76. Hirano S., Nanako Y., Tobetto К. Effect of sulfated derivatives of chitosan on some blood // Carbohydr. Res.-1985.-V.137.-P.205-215.

77. Норейка P.M., Колодзейскис B.C., Дуденас Г.Э. Исследования фракционного состава сульфата хитозана // Тез. докл.конф. "Актуальные вопросы разработки, изучения и производства лекарственных средств" Каунас,-1985.-С.113-116.

78. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана // Прикладная биохимия и микробиология.-2002 -Т.38.-№1.-С.5-13.

79. Корнилаева Г.В., Макарова Т.В., Гамзазаде А.И., Скляр A.M. Сульфа-тированные производные как ингибиторы ВИЧ-инфекции // Иммуноло-гия.-1995.-№5.-С. 13-16.

80. Nishimura S., Kai Н., Yoshida Т. Regiocelective syntheses of sulfated polysaccharides: specific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates // Carbohydr. Res.-1998.-V.306.-N.3.-P.427-433.

81. Соловьева M.A., Горбачева И.Н., Вихорева Г.А., Гальбрайх JI.C., Ры-женков В.Е. Влияние сульфата хитозана на активность липопротеинлипазы // Вопросы медицинской химии.-1994.-Т.40.-№2.-С.37-39.

82. Gamzazade A.I., Nasibov S.M., Rogozhin S.V. Study of lipoprotein sorption by some sulfoderivatives of chitosan // Carbohydr. Polymer.-1997.-V.31.-P.l-4.

83. Chen C.S., Liau W.Y., Tsai G.J. Antibacterial effects of N-sulfonated and N-sulfobenzoyl chitosan and application to oyster preservation // J. Food Prot.-1998.-V.69.-N.9.-P.1124-1128.

84. Wolfrom M.L. Sulfated aminopolysasccharides. Patent N. 283 2766. USA 1958.

85. Гальбрайх Jl.С., Ениколопов Н.С., Горбачева И.Н., Вихорева Г.А., Зе-ленецкий С.Н. Способ получения биологически активного сернокислого эфира хитозана // Авторское свидетельство № 2034851.

86. Горбачева И.Н., Скорикова Е.Е., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С., Баби-евский К.К. Строение и свойства сульфата хитозана // Высокомолекулярные соединения. Сер. А.-1998.-Т,33.-№9.-С.1899-1903.

87. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D., Kongtawelert P. Anticoagulant activity of sulfated chitosan // Carbohydr. Res.-2002.-V.337.-P. 1233-1236.

88. Гамзазаде А.И., Скляр A.M. Способ получения сульфатированного хитозана. Пат.№2048474. Россия. 1995 г.

89. Lin C.W., Lin J.C. Surface characterization and platelet compatibilityevalua-tion of surfase-sulfonated chitosan membrane // J. Biomater. Sci. Polym. Ed.-2001.-V.12.-N.5.-P.543-557.

90. Holme K.R, Perlin A.S. Chitosan N-sulfate. A water-soluble polyelectro-lyte // Carbohydr. Res.-1997.-V.302.-P.7-12.

91. Будовская К.Э. Изучение взаимосвязи строения и свойств производных хитозана с иногенными группами различных типов: Дис.к.х.н.-М.: МГТУ. -2000.-С. 147.

92. Baumann Н. The role of regioselectively sulfated and polysaccharide of biomaterials for reducing platelet and plasma protein adhesion // Semin. Thromb. Hemost -2001 .-V.27.-N.5.-P.445-463.

93. Грачёва И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. -М: Элевар.2000.335 с.

94. Koga D., Mitsutomi М., Kono М., Matsumiya М. Biochemistry of chitinases // Exs.-1999.-V.87.-P.l 11-123.

95. Yoon H.G., Kim H.Y., Kim H.K., Hong B.S., Shin D.H., Cho H.Y. Thermostable chitosanase from Bacillus sp. strain CK4: its purification, characterization, and reaction patterns // Biosci. Biotechnol. Biochem.-2001.-V.65. -P.802-809.

96. Stoyachenko I.A., Varlamov V.P., Davankov V.A. Chitinases of Streptomyces kurssanovi purification and some properties // Carbohydr. Poly-mer.-1994.-V.24.-P.47-54.

97. Стояченко И.А. Выделение, очистка хитиназ Streptomyces Kurssanovii и ферментативное расщепление хитина и хитозана. Дисс.к.х.н.-М.: Институт биохимии.-1992.-С.169.

98. Ильина А.В., Татаринова Н.Ю., Тихонов В.Е., Варламов В.П. Внеклеточные протеаза и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-№ 2.-С.184-188.

99. Tikhonov V.E., Yamskov 1.А., Varlamov V.P., Ilyina A.V., Davankov V.A. Chitinolytic digestibility of cross-linked chitosan gels by an enzyme complex from Streptomyces Kurssanovii // Biotechnol. Appl. Biochem-1993.-V.17.-P.251-256.

100. Ilyina A.V., Tikhonov V.E., Albulov A.I. Enzymic preparation of asid-free-water-soluble chitosan // Process Biochemistry .-2000.-V.35.-P.563-568.

101. Muzzarelli RAA Depolymerization of chitins and chitosans with hemicellulase, lysosyme, papain and lipases. In Chitin Handbook / R.A.A. Muzzarelli and M.G. Peter. European Chitin Society, Atec, Grottammare, Italy. 1997. P.153-163.

102. Aiba S. Lysozymic hydrolysis of partially N-acetylated chitosans // Int. J. Biol. Macromol.-1992.-V.14.-P.225-228.

103. Muzzarelli R.A.A. Depolymerization of methilpyrrolidinonechitosan by lysozym // Carbohydrate Polymers.-1992.-V.l9.-N.l .-P.29-34.

104. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г20Х // Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т.38.-№ 2.-С.132-135.

105. Lusta К.A., Chung I.K., Sul I.W., Park H.S., Scin D.L. Immobilization of fungus Aspergillus sp. by a novel cryogel technique for production of extracellular hydrolytic enzymes // Proc. Biochem.-2002.-V.35.-P.l 177-1182.

106. Sutherland I.W. Polysaccharide lyases // FEMS Microbiology Reviews.-1995.-V.16.-P.323-347.

107. Jandik K.A., Gu K., Linhardt R.J. Action pattern of polysaccharide lyases on glycosaminoglycans // Glycobiology.-1994.-V.4.-N.3.-P.289-296.

108. Matzsch Т., Berggvist D., Hedner U., Ostergaard P. Effects of an enzymatically depolymerized heparin as compared with conventional heparin in healthy volunteers // Tromb. Haemost.-1987.- V. 57.-P.97-101.

109. Linhardt R.J.,Grant A., Cooney C.L., Langer R. Differential anticoagulant activity of heparin fragments prepared using microbial heparinase // J. Biol, Chem. 1982.-V.257.-P.7310-7313.

110. Godavarti R., Sasisekharan R. A Comparative Analysis of the Primary Sequences and Characteristics of Heparinases I, II, and III from Flavobacterium heparinium II Biochemical and biophysical research communications.-1996,-V.229.-P.770-777.

111. Rhomberg A.J., Shriver Z., Biemann K., Sasisekharan R. Mass spectrometry evidence for the enzymatic mechanism of the depolymerization of heparino-like glycosaminoglycans by heparinase II // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998.-V.95.-P. 12232-12237.

112. Toida Т., Hileman R., Smith A., Vlahova P.,Linhardt R. Enzymatic preparation of heparin oligosaccharides containing antithrombin III binding sites // J. Biological chemistry.-1996.-V.271 .-N.50.-P.32040-32047.

113. Rice K.G., Linhardt R.J. Study of structurally defined oligosaccharide substrates of heparin and heparan monosulfate lyases // Carbohydr. Res.-1989,-V.190.-P.219-233.

114. Perlin A., Gallo C., Jandik K.A., Han X.J., Linhardt R.J. Preparation and structural characterization of large heparin-derived oligosaccharides // Glycobi-ology.-1995.-V.5.-N.l.-P.83-95.

115. Zimmermann J., Lewis N., Heft R. Metod for the enzymatic neutralization of heparin. Pat. №5262325. USA. 1993.

116. Lasker S.E., Stivala S.S. Physicochemical studies of fractionated bovine heparin // Archives of biochemistry and biophysics.-1966.-V.l 15.-P.360-372.

117. Farndale R.W., Buttle D.J., Barrett A.J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glucosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue //Biochim. Biophis. Acta.-1986.-V.883.-N.2.-P.173-177.11

118. Desai U.R., Linhardt R.J. Molecular weight of heparin using С Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy // Reprinted from J. of Pharmaceutical Sci-ences.-1995.-V.84.-N.2.-P.212-215.

119. Акопова Т.А. Химические превращения хитина и хитозана в твердом состоянии при механическом воздействии. Дис.к.х.н. М.: МГТУ.-2001 120 С.

120. Thurnberg L., Backstrom G., Lindahl L.J. Further characterization of the antithrombin-binding sequence of heparin // Carbohydr. Res.-1982.-V. 100.-P. 393-410.

121. Walenga J.M., Petitou M., Lormeau J.C., Samama M., Fareed J. Antithrombotic activity of a synthetic heparin pentasaccharide in a rabbit stasis thrombosis model using different thrombogenic challengers // Thromb. Res.-1987.-V.46.-P. 187-198.

122. Thomas D.P., Merton R.E., Gray E., Barrowdiffe T.W. The relative antithrombotic effectiveness of heparin, a low molecular weight heparin, and a pentasaccharide fragment in an animal model // Thrombosis and Haemostasis.-1981.-V.61.-P.204-207.

123. Папков С.П. Физико-химические основы переработки полимеров.-М.: Химия. 1971.372 с.

124. Miller G.L. Use of dinitrosalicylis asid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem.-1959.-V.31 .-P.426-428.

125. Spector T. Refinement of the Comassie Blue method of protein quantitation //Anal. Biochem.-1978.-V.86.-P. 141-146.

126. Plelcher C.H., Cunningham M., Nelsestuen G.L. Kinetic analysis of various fractions and heparin substitutes in the thrombin inhibition reaction // Bio-chimica et Biophysica Acta.-1985.-V.838.P.106-l 13.

127. Баркаган 3.C., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М: Ньюдиамед. 2001. 296 с.