Синтез и изучение антикоагулянтной активности олигосахаридов, родственных разветвленным фрагментам фукоидана из водоросли Chordaria flagelliformis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО РАН

ВИННИЦКИЙ ДМИТРИЙ ЗИНОВЬЕВИЧ 1х у

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ АКТИВНОСТИ ОЛИГОСАХАРИДОВ, РОДСТВЕННЫХ РАЗВЕТВЛЕННЫМ ФРАГМЕНТАМ ФУКОИДАНА ИЗ ВОДОРОСЛИ СИОКОАМА РЬАСЕШРОШШ

На правах рукописи

02.00.03 - органическая химия

02.00.10 - биооргапическая химия

1 * ОКТ 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА-2015

005563312

005563312

Работа выполнена в лаборатории химии гликоконъюгатов (.№52) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии имени Н. Д. Зелинского Российской академии наук (ИОХ РАН)

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Устюжанина Надежна Евгеньевна

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории химии гликоконъюгатов №52 ИОХ РАН

Крылов Вадим Борисович кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории химии гликоконъюгатов №52 ИОХ РАН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Михайлов Сергей Николаевич

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией дизайна и синтеза биологически активных соединений Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардга РАН

Тевяшова Айна Николаевна

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории химической трансформации антибиотиков Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г. Ф. Гаузе РАМН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Химический факультет Московского

государственного университета им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 17 ноября 2015 года в II часов 00 минут на заседании Диссертационного совета Д 002.222.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН по адресу: 119991, Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН и на сайте http://zioc.ru Автореферат разослан 29 сентября 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.222.01 доктор химических наук

Родиновская Л. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Установление взаимосвязи между структурой и свойствами природных соединений является важнейшей задачей современной биоорганической химии. Результаты таких исследований дают ценную информацию для понимания механизмов многих биологических процессов. Кроме того, на основе активных соединений известного строения могут быть разработаны фармацевтические препараты для лечения целого ряда заболеваний.

Среди исследуемых в последнее время биополимеров возрастающий интерес вызывают полисахариды фукоиданы, выделяемые из бурых водорослей и некоторых видов беспозвоночных. Наглядной иллюстрацией этого служит рост публикаций по данной тематике: от единичных статей в начале 80-х до более чем 200 статей только за 2014 год (по данными SciFinder CAS). Причина же подобного интереса заключается в широком спектре биологических свойств, проявляемых этими полисахаридами. В частности, было показано, что фукоиданы эффективно ингибируют процессы воспаления, опосредованные L- и Р-селектинами, обладают антикоагулянтным и антиангиогенным действием, блокируют бактериальную адгезию на клетках млекопитающих. Такой уровень биологической активности делает фукоиданы не только чрезвычайно интересными объектами для дальнейших исследований, но и позволяет рассматривать их в качестве основы для создания новых эффективных лекарственных препаратов.

Фукоиданы построены преимущественно из сульфатированных остатков a-L-фукопиранозы. Наиболее часто встречаются два типа главных цепей фукоиданов: одни построены из повторяющихся (1—>3)-связанных фукозных остатков, для других характерно чередование (1—>3)- и (1—»4)-связанных фукозных звеньев. Однако основное влияние на тип физиологической активности, проявляемый тем или иным фукоиданом, оказывают другие, более тонкие детали строения, а именно: степень сульфатирования, положение сульфатных групп, наличие разветвлений (остатков фукозы, глюкозы, галактозы, глюкуроновой кислоты, маннозы), молекулярный вес. Указанные детали структуры определяются биологическим источником и условиями его роста, а также зависят от времени сбора и методов выделения полисахаридов. Для выявления фармакофорных группировок фукоиданов наиболее перспективным является подход, включающий в себя направленный синтез и исследование биологической активности олигосахаридов, родственных различным участкам цепей этих полисахаридов.

Целью работы является синтез и изучение антикоагулянтной активности олигосахаридов, родственных разветвлённым фрагментам фукоидана из водоросли СИогйаг1а f!ageШformis.

Научная новизна н практическая ценность работы. Впервые осуществлен синтез олигосахаридных производных, отвечающих разветвленным фрагментам фукоидана из водоросли СИоЫаг^а Аа£еШ/огт15, включая несульфатированные, а также избирательно и полностью сульфатированные тетра- и пентасахариды.

Разработан эффективный препаративный метод синтеза фукофуранозил-доноров из Ь-фукозы с использованием недавно открытой пиранозид-фуранозидной перегруппировки.

Для построения 1,2-^ис-гликозидных связей показана эффективность использования гликозил-доноров, содержащих удаленные от аномерного центра соучаствующие ацильные группы. Впервые показано стереоконтролирующее влияние ацильных заместителей при 0-3 в фукофуранозил-донорах на результат реакции гликозилирования.

Исследование антикоагулянтной активности полученных соединений, а также серии природных и химически модифицированных высокосульфатированных фукоиданов показало, что увеличению эффекта способствует высокая степень сульфатирования сахаридов и наличие боковых а-Ь-фукофуранозных заместителей.

Публикация и апробация работы. По результатам диссертации опубликованы 2 статьи и 1 обзор. Отдельные части работы были представлены на 1-ой Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Казань, 2012 г.), 17-ом Европейском углеводном симпозиуме «ЕигоСагЬ2013» (Израиль, Тель-Авив, 2013 г.), 27-ом Международном углеводном симпозиуме «ЮЭ 2014» (Индия, Бангалор, 2014 г.), Международной конференции «Молекулярная сложность в органической химии МСМС-2014» (Москва, 2014 г.).

Личный вклад соискателя. Соискатель участвовал в постановке задач, решаемых в рамках диссертационной работы, самостоятельно проводил все описанные эксперименты, а также анализ и интерпретацию данных физико-химических методов исследования полученных веществ (ЯМР-спектры, масс-спектры). Все статьи, опубликованные по материалам работы, подготовлены автором лично или при его непосредственном участии.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного природным соединениям бактериального и растительного происхождения, содержащим остатки а-Б-глюкуроновой кислоты,

обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Общий объем диссертации составляет 170 страниц, библиографический список включает 301 наименование.

Автор выражает глубокую благодарность член.-корр. РАН Н.Э. Нифаптьеву за плодотворное обсуждение работы, к.х.н. A.C. Дмитренку и к.х.н. P.A. Новикову за регистрацию спектров ЯМР, к.х.н. А.О. Чижову за регистрацию масс-спектров, к.х.н. А.Г. Гербсту за выполнение расчетов энергий стабилизации карбокатионов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Целевые соединения. Структура фукоидана из водоросли С. АсщеИфтиз представляется наиболее сложной из тех, что были установлены к настоящему времени. Основная цепь этого полисахарида построена из частично сульфатированных (1—>3)-связанных остатков а-Ь-фукопиранозы. При О-2 некоторых звеньев основной цепи присутствуют как незамещенные остатки и-О-глюкуроновой кислоты, так и более сложные фрагменты, состоящие из остатков и-О-глюкуроновой кислоты, несущей при 0-4 сульфатированный остаток а-Ь-фукофуранозы (Рисунок 1). Указанный фукоидан обладает значимой антикоагулянтной активностью, блокирует ангиогенез и оказывает иммуностимулирующее действие.

ОРг

I?

ROI RO Me2f2ZoR

RO ' Me-7^3

VO-T-COONa -V^-OR

"Ч V-

OPr OR1

OR

Hl Me",

RO

OR 1 R = H OR 2 R = SO,Na

и

Me' ROI

ROj Me-T~OJn

[OR RO RO

ОРг OR

MS| RÖJ

MeS£Z1o

RO°

Me-7ÜP

ROj' HokE' Me-Z^Z.0H OH

RO°

COOMa Me' OH

r2o

.So

l2Oj R'obl!? £Zor' ПИ'

r2o|

OR

COOMa OR1

OR' OR'

5 R1 = R2 = H

6 R1 = R1 = SOjNa

7 R1 = H, R2 = S03Na

ГО-ЛГ-С(

COONa OR

OR °h4

Me4 ,OH

Me' R20|

О

OPr OR1

OR

3 R = H

4 R = S03Na

Me'

Me-p2Zo r2O? R-oks^xsg'

£Zor1

R = H/S03Na OR

-OR' OR

,|ÖR2 Me 4OR1

Y О

8 R1 = R2 = H l^R1^

9 R1 = R3 = S03Na

10 R'= H, R2 = S03Na OR2

Рис. 1. Фрагмент фукоидана из водоросли C.flagelliformis и целевые олигосахариды 1-10.

Для выяснения влияния отдельных структурных элементов этого фукоидана на величину биологического эффекта нами был проведен синтез и исследование антикоагулянтной активности 10 родственных олигосахаридов. В качестве объектов синтеза были выбраны несульфатированные 1, 3, 5, 8, избирательно сульфатированные 7, 10 и полностью сульфатированные 2, 4, 6, 9 тетра- и пентасахариды (Рисунок 1), построенные из остатков а-Ь-фукопиранозы, а-О-глюкуроновой кислоты и а-Ь-фукофуранозы. Целевые соединения соответствуют разветвленным участкам природного фукоидана.

2. Ретросинтетический анализ целевых соединений. На первом этапе работы нами был проведен ретросинтетический анализ целевых олигосахаридов, в результате чего были выделены две синтетические группы соединений, исходя из общности путей их получения. В первую группу вошли тетрасахариды 1-4, которые планировалось получать методом блочного синтеза по схемам [2+2] (Рисунок 2). В случае тетрасахаридов 1, 2 в качестве дисахаридных блоков были выбраны гликозил-донор 11 и гликозил-акцептор 12, а сборку углеводного скелета тетрасахаридов 3, 4 планировалось провести с использованием дисахаридов 13 и 14. При этом (1—>3)-связанный дисахаридный донор 11 мог быть получен из дифукозидного акцептора 13, а (1—>2)-связанный дисахаридный донор 14 планировалось получать из гликозил-акцептора 12.

ОРг

еж

Рисунок 2. Ретросинтетический анализ целевых тетрасахаридов 1-4.

Таким образом, число исходных структур было сокращено до двух (соединения 12 и 13), при этом методы их синтеза были ранее отработаны в нашей лаборатории.

Во вторую группу вошли тетрасахариды 5-7 и пентасахариды 8-10 (Рисунок 3). Для получения соединений этой группы планировалось использовать дифукозид 15, содержащий две ортогональные защитные группы: гара-метоксибензильную (МВп) при 0-2' и хлорацетильную (СА) при О-У. Такая расстановка защитных групп позволяет избирательно высвобождать гидроксильные группы и последовательно вводить гликозильные остатки. В случае тетрасахаридов 5-7 планировалось сначала ввести остаток глюкуроновой кислоты с использованием гликозил-донора 16, а затем остаток фукопиранозы с использованием фукозил-донора 17.

В ходе синтеза пентасахаридов 8-10 в качестве глюкуронил-донора планировалось использовать трихлорацетимидат 18, содержащий треот-бутил-диметплсил ильную защитную группу при 0-4. Это позволяет избирательно ввести остаток фукофуранозы с использованием гликозил-донора 19. Введение фукопиранозного заместителя в третье положение центрального фукозного остатка происходит на завершающей стадии сборки углеводного скелета с использованием фукозил-донора 17.

Мб'

я2о

6 Я1 ■ И1 - ЭО^а 7|?1 = Н,

ОРг 014'

Ме'

г1

Г' \

22 оя1 г,И1

ю н2о]

СООЫа О

оя2

о«1

Мвч „ОЯ

Я20

8 II1 - Я2 » Н

9 И« • |*2 > Б03Ма

10 Я'-Н, 1*2»50^а

ОАН

ВгО|

Ме

-ОМВп

| ОСА

ВгО 15

НЫ

ЫН

с3с- _ ^^О^С,

>0, ВпО

о^ 16 ОВп

[оса

17

ОАП овп

[о С1,С.,МН

СООМэ ОВп

САО

ВгО

ВгО| "•^^¿ОМВП ОСА

15 N4

оЧ

[оса

САО

О

ВпО

)-»—-Т^—I 18 ""

ч РВп

соомв отвомэ

18 ОВп

Ме лОВп

, , .МН 0-< 0В2 ЧСС1,

Рисунок 3. Ретросинтетический анализ целевых сахаридов 5-10.

Важно отметить, что все моносахаридные остатки в олигосахаридах 1-10 соединены 1,2-г(ыс-(а)-гликозидными связями, поэтому для их сборки необходимо было использовать блоки, содержащие несоучаствующие защитные группы при 0-2. Кроме того, для стереоизбирательного построения а-гликозидных связей планировалось использовать эффект соучастия ацильных заместителей, удаленных от аномерного центра гликозил-донора. На Рисунке 4 представлены примеры нестабилизированного (I) и стабилизированных (II и III) гликозил-катионов. Видно, что нуклеофильная атака катионов II и III возможна только с а-стороны. Для каждого конкретного гликозил-катнона методом молекулярной механики (ММ+) выполнен расчет величины энергии стабилизации (Естаб ), которая представляет собой разность энергий нестабилизированного и стабилизированного катионов (все расчеты проведены к.х.н. А.Г. Гербстом).

BnO ^

loR1 ^'В R20

Me

BnO f \ а

о 7—" '

OR1 „

R' II

BnO R"

Рисунок 4. Нестабилизированный (I) и стабилизированные (II и III) гликозил-катионы.

3. Синтез целевых тетрасахаридов 1-4. Дисахаридные предшественники 12 и 13 были синтезированы по отработанным ранее схемам исходя из аллил-а-Ь-фукопиранозида. Далее для получения гликозил-донора 11 проводили ацетилирование дисахарида 13 с образованием дифукозида 20, в котором затем была удалена аллильная группа с аномерного центра действием РсЮЬ в метаноле, после чего образовавшийся полуацеталь переводили в соответствующий трихлорацетимидат 11 обработкой ССЬСЫ в присутствии СэгСОз (Схема 1).

13

Схема 1

Гликозилирование дисахаридного акцептора 12 донором 11 в присутствии ТМБО'П' привело к образованию тетрасахарида 21 с выходом 82% (Схема 2).а-Конфигурацпя образованной тликозидной связи была подтверждена характеристичной величиной константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) J\-г = 3.6 Гц в 'Н-ЯМР спектре. Необходимо отметить, что в результате реакции не было зафиксировано следов р-изомерного продукта. Стереохимический результат реакции объясняется стабилизацией гликозил-катиона за счет анхимерного содействия бензоильного заместителя при 0-4. Аналогичные эффекты были отмечены ранее для моно- и дисахаридных фукозил-доиоров, использованных в ходе синтеза гомофукозидов. Величина Естаб для катиона типа II (см. Рисунок 2) составила 5,8 ккал/моль.

Схема 2. (¡): 1. Н2, Ра/С, 2. 0.2 М №ОН, МеОН; (и): Ру 50з, НБОзС!, ЭМЕ.

Гидрогенолиз полученного тетрасахарида 21 с последующим омылением приводили к целевому тетрасахариду 1 с выходом 87% (Схема 2). Для получения полностью сульфатированного производного 2 были использованы условия реакции кислотно-промотируемого сульфатирования, разработанной в нашей лаборатории ранее. В результате действия комплекса Ру503 в присутствии Ш03С1 тетрасахарид 1 был переведен в соединение 2 с выходом 79%.

Для получения гликозил-донора 14 проводили бензоилирование синтезированного ранее дисахарида 12 с образованием дифукозида 22, в котором затем была удалена аллильная группа действием РсЮг в метаноле, после чего полученный полуацеталь переводили в соответствующий трихлорацетимидат 14 (Схема 3).

ОА11

ВгО

21, 82%

S?A" BzCI, Py ?A" 1. PdCI2> MeOH | o4CC'3

22-0 - Me^2Zo 2. CCI3CN, CS2CO3 ш-Т22Хо NH

A=0 Bn0 ksSCMMe АоОГ0^п0ко^СООМе Acli0UcO«e

^ОвГ OBn BnO-\_-^_0Bn

OBn

12 22,80% 14, 75%

Схема 3.

OBn

Сочетанием дисахаридов 13 и 14 в присутствии TMSOTfбыл получен тетрасахарид 23 с выходом 75% (Схема 4). Как и в случае синтеза тетрасахарида 21, в ходе реакции образовывался только необходимый а-изомер. Величины энергии стабилизации для катионов типов II и III составили 11,2 ккал/моль и 4,8 ккап/моль, соответственно. Гидрогенолиз тетрасахарида 23 с последующим омылением приводили к целевому тетрасахариду 3 с выходом 86%. Сульфатированием соединения 3 в присутствии хлорсульфоновой кислоты был получен полностью сульфатированный продукт 4 с выходом 82%.

OAII

13*14 ™S°Tf ■ МеТО^0Вп —!_ ПГ] JUm CHJCIJ, -30 °C (о 1—1 1—1

BzOj 86% 82%

loBz U0^-COOMe AcO BnO-\. \ QBn OBn

23, 75%

Схема 4. 0): 1. Н2, Рс1/С, 2. 0.2 М №ОН, МеОН; (н): Ру 50з, Н503С1, ОМИ.

4. Синтез днеахарндного блока 15 и глюкуронил-доноров 16 и 18. Для синтеза

ключевого дисахаридного блока 15 был использован доступный аллил-а-Ь-фукопиранозид 24. Из этого соединения были получены моносахаридные гликозил-акцепторный 25 (в одну операционную стадию, выход 85%) и гликозил-донорный 27 (3 операционные стадии, общий выход 60%) блоки (Схема 5).

CI3C NH

OAII OAII ?A" X

Bzi°H нОГ°Н Bzi°CA l&T

25,85% 24 26,79% BzU 27,76%

Схема S. (i): 1. PhC(OMe)3, CSA, DMF 2. NaH (60%), BnBr 3. AcOH (80% води.); (ii): 1. PhC(OMe)3, CSA, DMF, 2. NaH (60%), MBnCl, Bu4NI 3. AcOH (80% водн.) 4. CACI, Py; (iii): 1. PdCI2, MeOH, 2. СС13СЫ, Cs2C03.

Гликозилирование моносахаридного акцептора 25 фукозил-донором 27 в присутствии TMSOTf приводило к образованию необходимого а-изомера 28 с выходом 95% (Схема 6), что подтверждалось величиной соответствующей КССВ Ji.j (3,6 Гц). Как и в случае описанных выше реакций гликозилирования, стереохимический результат данной реакции обусловлен анхимерным содействием ацильных групп при 0-3 и 0-4 в гликозил-доноре 27. Величины энергии стабилизации для катионов типов II и III составили 4,3 ккал/моль и 12,4 ккал/моль, соответственно.

OAII

TMSOTf 27 + 25 --

CH2CI2, -30 °с

Bz0 15,95%

Схема 6.

Исходным соединением для получения бензилированных глюкуронил-доноров 16 и 18 был доступный пентаацетат p-D-глюкозы 28. Действием аллилового спирта в присутствии эфирата трехфтористого бора с последующим дезацилированием действием метилата натрия в метаноле с выходом 75% был получен тетраол 29. Далее первичная гидроксильная группа была защищена тритильной группой, после чего следовали стадии исчерпывающего бензилирования и детритилирования с образованием моногидроксильного производного 30 с выходом 78%. Окисление гидроксильной группы в соединении 30 было проведено с использованием мягкой окислительной системы: 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксил (TEMPO) - бис(ацетокси)йодбензол (ВАШ). Последующее метилирование полученной глюкуроновой кислоты действием метилйодида в присутствии карбоната калия приводило к метилглюкурониду 31с выходом 89% на 2

стадии. Деаплилирование и перевод полученного полуацеталя в трихлорацетимидат приводили к глюкуронил-донору 16 с выходом 78% (схема 7).

АсО-^°0 С 1. А110Н, ВР3 ЕДО СН2ОН , ^ С^ОН

АС0^с°АС 2. МеОЫа, МеОН Н^^ОАП впО^^ОАН

28 29,75% 30,78%

¡1

СООМе СООМе

BnO—v-V-0 '" BnO—tV-0

ОВп П ОВп

NH

16, 78% 31, 89%

Схема 7. (i): 1. TrCl, Ру, DCM 2. NaH (60%), BnBr, DMF 3. TFA (90% вода.), DCM; (ii): 1. BAIB, TEMPO, DCM/H20, 2. Mel, K2C03, DMF; (iii): 1. PdCl2, MeOH, 2. CC13CN, Cs2C03.

Для получения глюкуронил-донора 18 тетраол 29 был сначала переведен в 4,6-бензилиденовое протводное, бензилирование которого с последующим удалением бензилиденовой защиты в условиях кислотного гидролиза дало диол 32 с выходом 73% (Схема 8). Региоизбирательное окисление первичной гидроксильной группы в соединении 32 было выполнено с использованием системы ТЕМРО-ВА1В. После метилирования карбоксильной группы был выделен метилглюкуронид 33 с выходом 84% на 2 стадии. Далее свободная гидроксильная группа при С-4 была защищена т/>ет-бутил-диметилсилильной группой (ТВОМБ), что приводило к моносахариду 34, из которого по отработанной схеме был получен глюкуронил-донор 18 с выходом 72%.

СН2ОН СООМе ...„

I НО-г-Л-О и HO-vV-O TBDMSCI СООМе

ОВп ОВп Имидаэол

32, 73% 33, 84% 34, Э4%

III /

СООМе С13С

ВпО-^——О NH ОВп 18, 72%

Схема 8. (i): l.PhCH(OMe)2, CSA, DMF, 2. NaH (60%), BnBr, 3. TFA (90% водн.); (ii): 1. BAIB, TEMPO, DCM/H20, 2. Mel, K2C03, DMF; (iii): 1. PdCl2, MeOH, 2. CCI3CN, Cs2C03.

5. Синтез целевых тетрасахаридов 5-7. Для получения дисахаридного гликозил-акцептора 35 в соединении 15 была удалена идра-метоксибензильная группа в условиях кислотного гидролиза (Схема 9). Сочетание дисахарида 35 и глюкуронил-донора 16 приводило к смеси изомерных трисахаридов 36 с выходом 78%. Соотношение а:р изомеров в смеси составило 5:1, что было установлено по соотношению величин интегральных интенсивностей сигналов Н-1 остатков глюкуроновой кислоты (сигналы Н-1а01сА J^.l = 3,9 Нг, Н-1рС]сА = 7,6 Нг).

OA1I OAII

Ме

15

16, ii «даХоВп

I? -:-► „1? а:6 5:1

А-О-^ч СООМе O-v-T V ОВп ОВп

36, 78%

Схема 9. (i): TFA (90% водн.), DCM; (ii): TMSOTf, DCM, -30 °С.

Преимущественное образование а-изомера в ходе реакции глюкуронилирования объяснялось стабилизацией гликозил-катиона карбометоксильной группой (Рисунок 5). Величина энергии стабилизации катиона составила 6,5 ккал/моль.

ВпО-ВпО

QOOMe ß

ВпО

^—^ с

МеОч

BnO^Vj-O^

ВпО' \ ВпО

КУ '

Рисунок 5.

Удалением хлорацетильной группы в 36 был получен а-изомериый трисахарид 37, содержащий свободную гидроксильную группу при С-3' (Схема 10). Из аплил-фукозида 24 в 2 операционные стадии был получен фукозил-донор 17. Сочетание трисахарида 37 и моносахарида 17 приводило исключительно к а-связанному тетрасахариду 39 с выходом 91% (КССВ Ji-2 = 3,7 Гц). Стереохимический результат данной реакции обусловлен анхимерным содействием ацильных групп при 0-3 и 0-4 в гликозил-доноре 17. Величины энергии стабилизации для катионов типов II и III составили 6,2 ккал/моль и 11,1 ккал/моль, соответственно.

0А11

N4 СС|3

ГоСА САО 17,68%

ОАН

Ме^2^0Вп П I ОСА "

САО 38, 72%

ВгО]

37, 80%

ВпО ОВп

.'с-оТ'СООМб 1 >■ V ОВп ОВп

39, 91%

81% 80%

Схема 10. 0): ЗС(ЫН2)2, 2,4,6-коллидин, МеОН, (и): 1. РЬСН(ОМе)2, СБА, ОМР, 2. ЫаН (60%), ВпВг, 3. ТИА (90% водн.), 4. САС1, Ру; (ш): 1. Р(1С12, МеОН, 2. ССЬСИ, Сз2С03; (¡у): ТМБОТ^ ОСМ, -30 °С; (у): 1. Н2, Рс1/С, 2. 0.2 МЫаОН, МеОН; (VI): 1. 0.2 МЫаОН, ТОТ, МеОН, 2. Ру 503, ОМИ, 3. Н2, Ра/С; (ун): Ру-БОз, ИМИ.

Из соединения 39 были получены целевые тетрасахариды 5-7. Удаление всех ацильных групп в 39, сульфатирование свободных гидроксильных групп в полученном продукте и последующий гидрогенолиз приводили к избирательно сульфатированному тетрасахариду 7 с выходом 81%. Удалением всех защитных групп в 39 был получен несульфатированный тетрасахарид 5 с выходом 91%. Однако введение данного тетрасахарида в реакцию кислотно-промотируемого сульфатирования, в отличие от тетрасахаридов 1, 3, сопровождалось изомеризацией восстанавливающего фукопиранозидного остатка в фукофуранозидный. В результате нами была выделена смесь, состоящая из целевого тетрасахарида 6 и изомерного ему продукта 6Г (Рисунок 6).

ОРг

Ме

Б01

го—гсо

ОБ ОЭ

о'э

30 6 Б = вО^а

Ме лОЭ

ОРг

БО>

Ме

зок°^£^Ма

ОБ ОБ

ОЭ

6Г Э = БО^Ыа

Рисунок 6.

Мониторинг указанной реакции с использованием методов ЯМР спектроскопии показал, что изомеризация начинает протекать еще на стадии частично сульфатированного продукта. Для ингибирования изомеризации нами была проведена реакция сульфатирования без кислоты, но она привела лишь к смеси частично сульфатированных продуктов. Анализ ЯМР-спектров продуктов показал, что несульфатированными остаются стерически затрудненные гидроксильные группы при О-4 центрального и восстанавливающего остатков фукозы. Поэтому нами была предпринята попытка досульфатирования частично сульфатированного тетрасахарида 7. Действительно, обработка тетрасахарида 7 комплексом Ру-БОз в отсутствие кислоты приводила к целевому сполна сульфатированному продукту 6 с выходом 80% (Схема 10).

6. Получение фукофуранозных синтетических блоков. Целевые пентасахариды 8-10 содержат а-Ь-фукофуранозный остаток при 0-4 глюкуроновой кислоты. В связи с этим, для их синтеза необходимо было разработать эффективный метод получения фукофуранозного блока. Следует отметить, что для фукозы термодинамически более выгодной является пиранозная форма, а перевод ее в фуранозную форму представляется нетривиальной задачей.

Ранее в данной работе нами наблюдалась изомеризация фукопиранозы в фукофуранозу при кислотно-промотируемом сульфатировании тетрасахарида 5. Подобные побочные реакции в присутствии кислот наблюдались в нашей лаборатории и ранее при изучении реакций сульфатирования других олигосахаридов (см. пример на Схеме 11). С учетом полученных результатов, было решено разработать препаративный метод синтеза фукофуранозидных производных, основанный на реакции кислотно-промотируемого сульфатирования.

перегруппировки была изучена на примере доступного аллил-а-Ь-фукопиранозида 24.

Ме ,0503Ыа

Схема 11.

Первоначально возможность проведения пиранозид-фуранозидной

Однако кислотно-промотируемое сульфатирование 24 в присутствии хлорсульфоновой кислоты приводило только к полностью сульфатированному фукопиранозиду 42 (Схема 12). Повышение температуры до 50 °С и увеличение времени реакции с 1 до 3 суток также не позволили получить желаемый фуранозидный продукт.

ОА11 ОАИ Ме ОЭ ^

НО 24 БО 42 оэ

3=303Ыа в^ОзИа

Схема 12. (¡): РуБОз, Н803С1, ЭМР

Неудачный результат, полученный при попытке проведения перегруппировки аллил-а-Ь-фукопиранозида, вынудил нас рассмотреть возможность синтеза фукофуранозидов исходя из аллил-Р-Ь-фукопиранозида 47. Было реализовано два пути получения аллил-Р-Ь-фукопиранозида 47 из Ь-фукозы 48 (Схема 13). Первый путь включал 4 последовательных стадии, а общий выход превращения, исходя из Ь-фукозы, составил 21%. Второй путь включал 5 стадий, его общий выход составил 25%. Помимо аллил-Р-Ь-фукопиранозида 47, было синтезировано его производное 52, содержащее бензоильную группу при 0-3.

Схема 13. (¡): 1. Ас20, Ру, 2. НВг/АсОН, Ас20; (н): 1. АИОН, ТГОАв, 2. МеОЫа, МеОН; (ш): 1. Морфолин, ацетон, 2. СС13СЫ, Сз2С03; (¡V): 1. АИОН, ТМБОТГ, 2. МеОЫа, МеОН.

Полученные аллил-Р-Ь-фукопиранозиды 47 и 52 были введены в реакцию кислотно-промотируемого сульфатирования. По прошествии 24 часов исходные пиранозиды практически нацело перегруппировывались в соответствующие

фукофуранознды 53 и 54, конверсия по данным ЯМР превышала 90% (Схема 14). Таким образом, нами впервые была показана возможность проведения перегруппировки Fucp—>Fuc/ на препаративных количествах вещества. Кроме того, мы выявили факт зависимости между конфигурацией аномерного центра углевода и возможностью перегруппировки в условиях кислотно-промотируемого сульфатирования, что является важным наблюдением для дальнейшего шучения механизма данной реакции.

Me 4OS Me „OS

-¡caza" _!_ ф.

Г~ V*0«ll „¿»' Si V'OA.

НО 47 os OBz

53 S=S03Na, 95% 54 S=S03Na, 98%

Схема 14. (i): Py-S03, HS03C1, DMF, 24 ч.

Для успешного применения данной реакции в препаративном синтезе фукофуранозидных блоков необходимо было разработать эффективный метод десульфатирования. Нами был использован метод сольволитического десульфатирования, заключающийся в обработке сульфатированного производного слабой кислотой в диоксане или диметилсульфоксиде при нагревании. Было показано, что выдерживание реакционной смеси в течение 30 минут при 50 °С в смеси растворителей диоксан:ДМФА (5:1) в присутствии ионообменной смолы 1К-120 (Н+) приводит к удалению всех сульфатных групп и образованию требуемого моносахарида 55 с выходом 82% (Схема 15). Таким образом, впервые было показано, что последовательное проведение реакций кислотно-промотируемого сульфатирования и десульфатирования в указанных условиях позволяет получать фукофуранозные блоки в высокими выходами из соответствующих фукопиранозных предшественников.

Ме

DR

Ме

IR-120 Н*

-„ 0А" diox.: DMF 5:1, 50 "С OR

53 R - S03Na

ПН

OAII

ОН 55, 82%

Схема 15.

Описанные выше два метода получения аллил-Р-Ь-фукопиранозида 47 (Схема 13) довольно трудоемки, требуют проведения нескольких стадий и характеризуются

недостаточно высоким общим выходом целевого продукта. Для упрощения синтетической схемы нами была использована одностадийная процедура прямого аллилирования фукозы 48 в водном растворе под действием аллилбромида в присутствии гидроксида натрия (Схема 16). Продуктом такой реакции является смесь а- и р-аллилфукопиранозидов 58 в соотношении 1:5. Данная смесь не разделяется методами колоночной хроматографии и ВЭЖХ. Смесь изомеров 58 была введена в реакцию селективного З-О-бензоилирования, что позволило нам получить производное 59 с выходом 97%. Соединения 58 и 59 были введены в пиранозид-фуранозидную перегруппировку. В обоих случаях была получена смесь а-изомерного пиранозида и р-изомерного фуранозида, которые легко разделялись методом колоночной хроматографии. В результате из смесей нами были выделены чистые аллил-р-фукопиранозид 55 и аплил-З-О-бензоил-р-фукопиранозид 60, которые затем были введены в реакцию бензилирования в присутствии оксида серебра. После этого в обоих соединениях были удалены аллильные защитные группы, а затем полученные полуацетали переводили в трихлорацетоимидаты 19 и 61 (Схема 16).

ОА11 Мвч *он Ме чОВп

но^ Н2° и!--- Г0А" ¡¿Ч*

I 55,66% 61,39%

I

I чОВп

' -ОАИ „ Ме чОН V _

тг6- ^г

Н0 59,97% ¿¡Г °Г48/ССЗ

60,66% 19,48/4

Схема 16. (0: ВгС1, (/-РгЬЫЕ^ 2-АРВ; (и): 1. РувОз, Н503С1, ЮМР, 2. ЫаНС03, 3. ИМ20

(Н+), ОМР-Диоксан; (Ш): 1. ВпВг, Ag20, 2. Р(1С12, МеОН, 3. ССЬСИ, Сз2С03.

На следующем этапе мы приступили к изучению реакции фукофуранозилирования, причем в качестве модельного акцептора мы использовали глюкуронат 33, полученный нами ранее, а в качестве доноров трихлорацетимидаты 19, 61 (Схема 17). При сочетании трибензилированного донора 61 и акцептора 33 в результате реакции образовывалась смесь изомеров в соотношении а:Р 1:2. В случае же использования донора 19, содержащего соучаствующую бензоильную группу при 0-3, результат реакции менялся кардинальным образом: соотношение а:Р составило 6:1.

61: R=Bn 19: R=Bz

MeOOC + HBnO

CCI]

________TMSOTf

OBn -30 °C

33

OAII

62: R=Bn a:p=1:2 63: R-Bz a:p=6:1

Схема 17.

Соотношение изомеров в данном эксперименте определялось с помощью 'Н-ЯМР спектроскопии по соотношению интегралов интенсивности пиков аномерных протонов фукофуранозного кольца НА Fue. Для a-изомера это дуплет с константой спин-спинового взаимодействия J\.i~4 Гц (8 5.20-5.35 м.д.), а для p-изомера это синглет (5 5.50-5.60 м.д.).

Принципиальная разница в стереоизбирательности реакций гликозилирования донорами 19 и 61 объяснялась удаленным соучастием бензоильной группы из третьего положении (Рисунок 8). В фукофуранозе, так же как и в фукопиранозе, ацильная защитная группа при 0-3 может стабилизировать карбокатион, образующийся в процессе реакции гликозилирования. Рассчитанная величина энергии стабилизации составила 5,4 ккал/моль. Таким образом, была впервые показана возможность удаленного соучастия ацильного заместителя в структуре фукофуранозного донора.

7. Синтез пентасахарндов 8-10. Полученный ранее при сборке целевых тетрасахаридов 5-7 акцептор 35 был введен в реакцию гликозилирования с глюкуронильным донором 18, содержащим ортогональную защитную группу (ТВОМЭ). В результате этой реакции с выходом 87% образовывалась смесь изомерных трисахаридов 64 в соотношении а:р=4:1, которое было установлено по соотношению интегральных ингенсивностей сигналов Н-1 остатков глюкуроновой кислоты (сигналы Н-1а0,сА J\¿ = 3,9 Нг, Н-1г,01сАЛ2 = 8,7 Нг) (Схема 18).

ОАН

Ме

ОН

ВгО

СООМе С13С ТВОМЭО—А-0 I

ВпО-Л—тАлллО

ОВп

18

ТМЭОТГ

ОАП

ВгО I

Ме-

СН2С12, -30 °С |ОСА

ВгО ч- -

35

<х:Р-4:1 64, 87%

СООМе ОТВОМЭ ОВп

Схема 18.

Преимущественное образование а-изомера в ходе реакции глюкуроншшрования, как и в случае донора 16, объяснялось стабилизацией гликозил-катиона карбометоксильной группой (Рисунок 9). Величина энергии стабилизации в данном случае составила 6,2 ккал/моль.

СООМе 0 ТВОМЭО—с-^—О ** ВпО-*—+ ВпО

ВпО

Рисунок 9.

В полученном трисахариде 64 действием плавиковой кислоты была селективно удалена ТВОМБ защитная группа с образованием трисахаридного акцептора 65 с выходом 77% (схема 19). Полученный трисахарид 65 был введен в реакцию гликозилирования с фукофуранозным донорм 19. В результате этой реакции образовалась смесь а- и р-изомеров, причем стереоселективность в данном случае оказалась выше, чем при гликозилировании модельного акцептора 33, и достигла соотношения 10:1 в пользу а-изомера. С помощью колоночной хроматографии а-продукт 66 был выделен в чистом виде с выходом 89% (КССВ У|.2 = 4,2 Гц). Затем в полученном тетрасахариде 66 была удалена хлорацетильная защитная группа, что приводило к акцептору 67 с выходом 80% (Схема 19).

64

г, ~ Ч ч-СООМе СН,С12, -30 °С ОВп

65, 77%

ОА11 ОВп

Ме-7^0

| оп

ВгО ВпО

{И

О

о

Р-изомер

СООМе

ОВп Ме. .ОВп

66: 1*=СА, 89%

80%

..г 66: К=С, ^ 67: (*=Н,

ОВг

Схема 19. (¡): НР (40% водн.), СН3СЫ; (и): БС(МН2)2, 2,4,6-коллидин, МеОН.

На последнем этапе сборки пентасахаридного скелета акцептор 67 был введен в реакцию гликозилироваиия с донором 17 (Схема 20). В результате данной реакции нами был получен исключительно а-связанный пентасахарид 68 с выходом 86% (КССВ .2 = 3,9 Гц). Как и в случае описанных выше реакций гликозилироваиия, стереохимический результат данной реакции обусловлен анхимерным содействием ацильных групп при 0-3 и 0-4 в гликозил-доноре 17.

Схема 20. (¡): ТЫБСт; ОСМ, -30 °С; (и): 1. Н2, Рс1/С, 2. 0.2 М ЫаОН, МеОН; (ш): 1. 0.2 М ЬЮН, ВщЫОН, ТНР, 2. Ру803, ИМР, 3. Н2, Ра/С; (¡у): Ру БОз, ЭМИ.

Из соединения 68 были получены целевые пентасахариды 8-10 (схема 20). Удаление всех ацильных групп в 68, сульфатирование свободных гидроксильных групп в полученном продуете и последующий гидрогенолиз приводили к избирательно

сульфатированному пентасахариду 10 с выходом 76%. Удалением всех защитных групп в 68 был получен несульфатированный пентасахарид 8 с выходом 82%. Введение данного пентасахарида в реакцию кислотно-промотируемого сульфатирования, как и в случае тетрасахарида 5, привело к смеси целевого продукта и продукта изомеризации восстанавливающего остатка фукопиранозной цепи. Поэтому по аналогии с тетрасахаридом 5 было проведено досульфатирование селективно сульфатированного пентасахарида 10 действием Ру ЗОз в ДМФА в отсутствие кислоты, что привело к образованию целевого пентасахарид 9 с выходом 84%.

8, Исследование антикоагулянтной активности. Антикоагулянтная активность синтезированных соединений была исследована в тесте по увеличению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Наряду с олигосахаридами были изучены природные фукоиданы из водорослей С1ас1озфНоп окатигапш (СО) и С.

(СЮ (Рисунок 10), их искусственно досульфатированные производные (СОв и СР-в), а также применяемые в настоящее время в клинической практике антикоагулянтные препараты Клексан® (низкомолекулярный гепарин) и Арикстра® (синтетический аналог пенгасахаридной последовательности гепарина). Результаты тестов представлены на Рисунке 11.

О

СО = Н/ЭОз№ СР ¿И

Рисунок 10. Разветвленные участки полисахаридных цепей фукоиданов из водорослей С. окатигапих (СО) и С./1ацеШ/огпйх (СИ).

сгустка в тесте АЧТВ.

Фукоидан из С. окатигапия, несульфатированные и избирательно сульфатированные олигосахариды не проявляли активности, тогда как их полностью сульфатированные аналоги оказывали значимое противосвертывающее действие, сравнимое с эффектом препарата Арикстра®. При этом сполна сулъфатированный пентасахарид 9 практически в два раза превышал показатели для тетрасахарида 6 и оказался даже более активен, чем пентасахарид Арикстра®. Фукоидан из С. flagelliformis проявил уровень активности, сравнимый с низкомолекулярным гепарином (Клексан®), а наиболее активными в данной серии оказались искусственно досульфатированные фукой даны СИ-Э и СО-Б.

На основании полученных данных можно утверждать, что уровень активности, проявляемой фукоиданами и родственными олигосахаридами, растет с увеличением степени сульфатирования сахаридов. Кроме того, на примере олигосахаридов было показано, что присутствие остатка а-Ь-фукофуранозы в боковой цепи значительно увеличивает уровень антикоагулянтной активности.

Выводы

1. Впервые осуществлен синтез четырех незащищенных (1,3,5,8), четырех сполна сульфатированных (2, 4, 6, 8), а также двух избирательно сульфатированных (7, 10) олигосахаридов, соответствующих разветвленным фрагментам фукоидана из водоросли С. _/1а§еШ/огт15.

2. Разработан эффективный препаративный метод синтеза фукофуранозного донора с применением недавно открытой пиранозид-фуранозидной перегруппировки.

3. Впервые изучено влияние заместителей в структуре фукофуранозных доноров на стереохимию реакции гликозилирования и показано стереоконтролирующее влияние ацильного заместителя при О-З.

4. Исследование антикоагулянтной активности полученных соединений, а также серии природных и высокосульфатированных полисахаридов показало, что увеличению эффекта способствует высокая степень сульфатирования сахаридов и наличие боковых сульфатированных а-Ь-фукофуранозных заместителей.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. V. В. Krylov, Z. М. Kaskova, D. Z. Vinnitskiy, N. Е. Ustyuzhanina, A. A. Grachev, А. О. Chizhov, N. Е. Nifantiev. Acid-promoted synthesis of per-O-sulfated fucooligosaccharides related to fucoidan fragments // Carbohydr. Res., 2011, 346, 540550.

2. V. B. Krylov, D. A. Argunov, D. Z. Vinnitskiy, S. A. Verkhnyatskaya, A. G. Gerbst, N. E. Ustyuzhanina, A. S. Dmitrenok, J. Huebner, O. Hoist, H.-C. Siebert, N. E. Nifantiev. Pyranoside-into-Furanoside Rearrangement: New Reaction in Carbohydrate Chemistry and Its Application in Oligosaccharide Synthesis // Chem. Eur. J., 2014, 20, 1651616522.

3. Д. 3. Винницкий, H. E. Устюжанина, H. Э. Нифантьев. Природные соединения бактериального и растительного происхождения, содержащие остатки a-D-глюкуроновой кислоты//Изв. АН. Сер. Хим., 2015, 6, 1273-1301.

4. В. Б. Крылов, Н. Е. Устюжанина, Д. 3. Винницкий, 3. М. Каськова, Н. А. Ушакова, М. Е. Преображенская, Н. Э. Нифантьев. Анионные полисахариды из природных источников как основа для разработки фармацевтических препаратов новых типов // 1-ая Всероссийская конференция "Фундаментальная гликобиология" Казань, 2024 июня, 2012. Тезисы докладов, стр. 45.

5. D. Z. Vinnitskiy, V. В. Krylov, N. Е. Ustyuzhanina, N. Е. Nifantiev. Synthesis of disaccharides related to fucoidan from Chordaria flagelliformis // 17th European Carbohydrate Symposium, Тель-Авив, Израиль, 7-11 июля, 2013. Тезисы докладов, стр. 63.

6. N. Е. Nifantiev, N. Е. Ustyuzhanina, N. A. Ushakova, М. Е. Preobrazhenskaya, М. I. Bilan, V. В. Krylov, D. Z. Vinnitskiy, D. О. Croci, A. Cumashi, N. U. Anisimova, A. S. Shashkov, A. I. Usov, S. Iacobelli, G. A. Rabinovichc, M. V. Kiselevskiy. Seaweeds fucoidans - a platform for new drug discovery // 27th International Carbohydrate Symposium, Бангалор, Индия, 12-17 января, 2014. Тезисы докладов, стр. 48.

7. D. Z. Vinnitsky, N. Е. Ustyuzhanina, V. В. Krylov, N. Е. Nifantiev. Stereoselective synthesis of the pentasaccharides related to the fucoidan from brown seaweed Chordaria flagelliformis // Molecular Complexity in Modern Chemistry, Москва, 13-19 сентября, 2014. Тезисы докладов, стр. 287.

Подписано в печать:

24.09.2015

Заказ № 10892 Тираж - 220 экз. Печать трафаретная. Объем: 1,5 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш„ 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru