Структура и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Вищук Олеся Сергеевна

Структура и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 МАЙ 2012

005043841

Владивосток - 2012

005043841

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель: д.х.н., профессор

Звягинцева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: Соловьева Тамара Федоровна

д.х.н., профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, заведующая лабораторией ЛМОАБИ

Сорокина Ирина Васильевна д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН, снс

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 28 мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан " 27 " апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О.В.

Актуальность проблемы. Бурые водоросли морей Дальнего Востока России являются богатым, легко возобновляемым источником уникальных по структуре и свойствам полисахаридов (ламинаранов, альгиновых кислот и фукоиданов). В последние годы объектом интенсивного исследования стали сульфатированные полисахариды бурых водорослей - фукоиданы. Они представляют собой обширный класс биополимеров, содержание и структура которых варьирует в зависимости от вида водоросли, мест ее произрастания, сезона сбора и многих других факторов. Постоянно растущий интерес к этим полисахаридам объясняется их разнообразной биологической активностью, которая может быть использована при создании медицинских препаратов нового поколения.

В последние годы наблюдается стремительный рост числа публикаций, посвященных исследованию противоопухолевой активности фукоиданов. Показано, что данная активность фукоиданов возрастает с увеличением степени сульфатирования, однако информация о влиянии на противоопухолевую активность других структурных характеристик фукоиданов: положения сульфатных групп в моносахаридных остатках, vix молекулярной массы, типа О-гликозидной связи между остатками фукозы и/или других моносахаридов в главной цепи, а также наличие неуглеводных заместителей, отсутствует.

Актуальным является выделение фукоиданов со стандартными структурными характеристиками и установление молекулярного механизма их противоопухолевого действия. Исследование фукоиданов, принадлежащих к разным структурным группам, позволит выявить закономерности проявления противоопухолевой активности в зависимости от их структурных особенностей.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН и при поддержке грантов РФФИ (проект № 09-04-00761-а) и ДВО РАН (проекты № 10-III-B-05-084, № 11-III-B-05-075).

Цель и задачи работы. Целью данной диссертационной работы является установление структуры фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России Saccharína cichoríoides, Saccharina japónica, Fucus evanescens и Undaria pinnatifida и характеристика взаимосвязи структуры фукоиданов и их действия на различные типы раковых клеток человека.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) выделить и фракционировать фукоиданы из бурых водорослей морей Дальнего Востока России S. cichoríoides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida\ 2) установить структуру фукоиданов; 3) исследовать противоопухолевую активность фукоиданов и молекулярный механизм их действия; 4) определить характер взаимосвязи структуры фукоиданов из бурых водорослей и их противоопухолевой активности.

в

Научная новизна работы. Из дальневосточных бурых водорослей S. cichoríoides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida были выделены и охарактеризованы новые фукоиданы, различающиеся между собой по моносахаридному составу, типу связей, степени сульфатирования и ацетилирования. Впервые показано, что сульфатированные полисахариды, синтезируемые этими видами водорослей, относятся к разным структурным типам фукоиданов.

Проведены исследования биологической активности фукоиданов in vitro. Изучено цитотоксическое действие фукоиданов на различные типы раковых клеток человека, их способность ингибировать неопластическую трансформацию нормальных эпидермальных клеток мыши JB6 CI41, вызванную действием эпидермального фактора роста (EGF), и самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток человека. Впервые установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурными характеристиками. Показано участие фукоидана в ингибировании EGF-индуцированной активации белков митоген-активируемого протеинкиназного каскада (МАРК каскада) в JB6 CI41 клетках. Исследована способность фукоидана увеличивать антипролиферативную активность ресвератрола и усиливать апоптоз раковых клеток кишечника человека. Впервые показано, что молекулярный механизм данного действия связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз.

Практическая значимость работы. Охарактеризованы фукоиданы из широко распространенных и легко культивируемых дальневосточных видов бурых водорослей S. cichoríoides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida. Полученные данные подтверждают структурное многообразие фукоиданов. Показана перспективность использования исследованных фукоиданов для разработки средств профилактики и лечения онкологических заболеваний. Показана возможность применения фукоидана из F. evanescens для защиты кожи от действия УФ-облучения, а фукоидана из S. cichoríoides для усиления противоопухолевого действия ресвератрола, что может позволить снизить дозы токсичных противоопухолевых препаратов при разработке схем лечения онкологических пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фукоиданы из бурых водорослей S. cichoríoides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida относятся к разным структурным типам.

2. Фукоиданы не проявляют цитотоксической активности к эпидермальным клеткам мыши JB6 С141 и ингибируют их EGF-индуцированную неопластическую трансформацию посредством подавления активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), белков МАРК каскада и АР-1 комплекса.

3. Фукоиданы эффективно ингибируют самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника, молочной железы и меланомы человека. Фукоиданы

различной структуры проявляют специфичность действия по отношению к определенному типу раковых клеток.

4. Высокосульфатированный a-L-фукан из S. cichorioides увеличивает антипролиферативную активность ресвератрола и усиливает апоптоз раковых клеток кишечника человека, вызывая активацию инициаторных и эффекторных каспаз при совместном действии ресвератрола и фукоидана.

5. Существует взаимосвязь структуры фукоиданов и их противоопухолевого действия. Наличие I—»З-связанных сульфатированных остатков a-L-фукозы необходимо для ингибирования EGF-индуцированной неопластической трансформации нормальных клеток мыши и роста колоний раковых клеток кишечника человека; сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1—>3- и 1—»4-связанных остатков a-L-фукозы ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 1—>3- и/или 1-»4-0-гликозидными связями.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на 3rd Annual Korea-Russian Bio Joint Forum «The Natural Products Industrialization and Application», Gangneung, 2011; на научно-практической конференции «Биологически активные вещества: Фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Украина, 2011; на Международном симпозиуме «Bioprosp», Норвегия, 2011; на 9lh International Marine Biotechnology Conference (IMBC 2010), Китай, 2010; на 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Новосибирск, 2010; на XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2009.

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ и 10 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН 28 марта 2012 г.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературы по теме исследования, проведено планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Результаты и их обсуждение», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Список литературы», включающий 197 наименований, и приложения, где приведены спектры ИК-, 13С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Диссертация изложена на 124 страницах. Результаты представлены в 10 таблицах и иллюстрированы 26 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. Звягинцевой Т.Н. Автор благодарит к.х.н. Ермакову С.П. и Шевченко Н.М. за консультации и помощь в работе, к.х.н. Исакова В.В. за получение ЯМР спектров, к.ф,-м.н. Глазунова В.П. за получение ИК спектров и всех сотрудников ЛХФ ТИБОХ ДВО РАН.

Сокращения и условные обозначения. L - фракция ламинарана, РМ - фракция полиманнурованной кислоты, F - фракция фукоидана, EGF - эпидермальный фактор роста, EGFR - рецептор эпидермального фактора роста, ERK - киназа, регулирующая внеклеточные сигналы, JNK - Jun N-концевая киназа, МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы, MMPs - матриксные металлопротеиназы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Главное внимание в настоящем исследовании уделено установлению структуры фукоиданов из 4 видов бурых водорослей морей Дальнего Востока России, исследованию их способности препятствовать возникновению и развитию рака и изучению взаимосвязи структуры фукоиданов и их противоопухолевой активности. 1. Выделение и фракционирование фукоиданов из бурых водорослей

Выделение полисахаридов из бурых водорослей S. cichoríoides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida проводили по модифицированной схеме комплексной переработки водорослей, разработанной в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН , (Рис. 1).

Рисунок 1 -

Схема выделения полисахаридов из бурых водорослей S. cichoríoides, S. japónica, F. evanescens, U. pinnatifida. L - фракции ламинарана РМ - фракция полиманнуронанё F - фракции фукоидана

В результате экстракции водорослей S. cichorioides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida (0,1 N HCl, 60°C), были получены фракции водорастворимых полисахаридов ScE, SjE, FeE и UpE, наибольшее содержание которых было в F. evanescens (5,3 %), наименьшее - в U. pinnatifida (2,8 %). Для отделения фукоиданов от полиманнуроновых кислот и ламинаранов, использовали анионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе.

В результате разделения полисахаридов фракции ScE получили сульфатированные полисахариды ScF1 и ScF2. Показано, что водоросль S. cichorioides синтезирует два разных структурных типа фукоиданов, различающихся по (Ломосахаридному составу и степени сульфатирования (рис. 2, табл. 1)

Д ScF2

г

\

NaCI, М 2

1,5

0,5

Рисунок 2 - Анионообменная хроматография (DEAE-целлюлоза) полисахаридов фракции ScE из S. cichorioides

300 400

NaCI/HiO, мл

Таблица 1 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции ЭсЕ из Э. с/'сЛош/Уез

Фракция* Выход" % Mw"* кДа Содержание' , % Моносахаридный состав, мольные %

Углеводов SOjNa" Fue Gal Man Xyl Rha Glc

ScF1 1,0 н.о. 55 21 95,0 0 5,0 0 0 0

ScF2 2,2 540 30 39 100,0 0 0 0 0 0

* - ScF1 - фракция полисахаридов, элюированных 1 М NaCI

ScF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,5 М NaCI

** - процент от веса сухой обезжиренной водоросли

*** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard Р-82» и

голубой декстран «Amersham»

"** - процент от навески полисахарида

н.о. - не определен

В результате разделения фракции FeE получили фракцию FeL и фракции

сульфатированных полисахаридов FeF1 и FeF2 (рис. 3). Анализ моносахаридного

состава показал, что полисахарид FeL содержал глюкозу и минорные количества

мэннозы (табл. 2). Для установления структуры полисахарида FeL использовали метод

13С-ЯМР-спекроскопии. В 13С-ЯМР спектре полисахарида FeL были обнаружены сигналы

101,6 м.д., 74,0 м.д., 84,7 м.д., 68,6 м.д., 77,0 м.д., 61,6 м.д., характерные для 1->3-

связанных остатков p-D-глюкопиранозы. Сигнал с хим. сдвигом 176,5 м.д.

7

соответствовал С6 остатка полиманнуроновой кислоты. Таким образом, полисахарид фракции Ре1_ представлял собой 1—»3-(3-0-глюкан (ламинаран), также в ней содержалось незначительное количество полиманнуроновой кислоты.

Фракция РеП имела гетерогенную моносахаридную композицию, тогда как фракция РеР2 представляла собой сульфатированный фукан, содержащий минорные количества

Таблица 2 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции FeE из F. evanescens

Фракция* Выход" % Mw*" кДа Содержание , % Моносахаридный состав, мольные %

Углеводов S03Na" Fuc Gal Man Xyl Rha Glc

FeL 1,0 н.о. 72 н.о. 0 0 3,0 0 0 97,0

FeF1 1,4 н.о. 58 15 79,0 0 15,0 4,0 2,0 0

FeF2 3,2 430 55 27 94,0 3,0 1,0 2,0 0 0

* - FeL - фракция полисахаридов, элюированных 0,04 М NaCI

FeF1- фракция полисахаридов, элюированных 0,95 М NaCI FeF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,5 М NaCI **- процент от веса сухой обезжиренной водоросли

*** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard Р-82»

и голубой декстран «Amersham»

**** - процент от навески полисахарида

н.о. - не определен

В результате разделения фракции SjE получили полисахариды SjL, SjF1 и SjF1 (рис. 4, табл. 3). Фракция SjL содержала большое количество глюкозы после гидролиза полисахарида В 13С-ЯМР спектре полисахарида SjL присутствовали сигналы с химическими сдвигами 101,3 м.д., 73,6 м.д., 85,2 м.д., 68,8 м.д., 77,3 м.д., 61,4 м.д., характерные для 1—>3-связанных остатков P-D-глюкопиранозы и имелись дополнительные сигналы с химическими сдвигами 104,1 М.д., 74,0 м.д, 76,2 м.д., 69,8 м.д., 75,3 м.д., 69,4 м.д., свидетельствующие о присутствие 1—>6-связанных остатков (В-D-глюкопиранозы. Следовательно, полисахарид SjL являлся 1—>3;1—>6-Р-0-глюканом. Полисахарид SJF1 являлся сульфатированным полисахаридом с гетерогенным

составом: помимо большого количества фукозы, галактозы и маннозы, он содержал минорные количества других моносахаридов. Фракция в]Р2 отличалась высоким содержанием фукозы, галактозы и незначительным содержанием ксилозы и рамнозы. Данный сульфатированный полисахарид являлся галактофуканом (табл. 3).

А4.

SJF !

/

L

SJF1 I* А

, /

\

-Sj, / %

/

1,5

0,5

Рисунок 4 - Анионообменная Хроматография полисахаридов фракции SjE из S. japónica

NaC!/H20, мл

Таблица 3 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции SjE из S. japónica

Фракция* Выход", % Mw"* кДа Содержание , % Моносахаридный состав, мольные %

Углеводов SOjNa" Fue Gal Man Xyt Rha Glc

SjL 0,4 н.о. 58 н.о. 3,0 4,0 4,5 0,5 1,0 87,0

SjF1 0,8 н.о. 76 10 53,0 29,0 15,0 1,3 1.7 0

SjF2 3,0 310 56 23 60,0 35,0 0 2,0 3,0 0

* - SjL - фракция полисахаридов, элюированных 0,04 М NaCI SjF1- фракция полисахаридов, элюированных 0,9 М NaCI SjF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,4 М NaCI **- процент от веса сухой обезжиренной водоросли

*** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard Р-82»

и голубой декстран «Amersham»

**** - процент от навески полисахарида

н.о. - не определен

В результате разделения фракции UpE получили полисахариды UpPM, UpF1 и UpF2, представляющие собой полиманнуроновую кислоту, сульфатированный полисахарид с гетерогенным составом и сульфатированный галактофукан, соответственно (рис. 5, табл. 4).

А490

Up 2 /

U pPM IF1

-fC к f

Д '4 1

NaCI, М 2

1,5

0,5

Рисунок 5 - Анионообменная хроматография полисахаридов фракции UpE из U. pinnatifida

200 300 400 500

NaCI/HjO, мл

gsoo

Таблица 4 - Характеристики полисахаридов, полученных при анионообменной хроматографии фракции UpE из U. pinnatifída

Фракция* Выход", % Mw"" Kfla Содержание"", % Моносахаридный состав, мольные %

Углеводов S03Na- Fue Gal Man Xyl Rha Glc

UpPM 0,5 н.о. 65 н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

UpF1 1,1 н.о. 56 14 59,0 30,0 8,0 2,0 0 1,0

UpF2 1,8 760 54 29 51,0 48,0 1,0 0 0 0

* - UpPM - фракция полисахаридов, элюированных 0,25 М NaCI UpF1- фракция полисахаридов, элюированных 0,9 М NaCI UpF2 - фракция полисахаридов, элюированных 1,4 М NaCI

**- процент от веса сухой обезжиренной водоросли

*** - Mw, установленные методом ВЭЖХ. Стандарты: пуллуланы «Shodex Standard Р-82»

и голубой декстран «Amersham»

**** - процент от навески полисахарида

н.о. - не определен

Таким образом, анализ полученных данных позволил отнести исследуемые полисахариды к ламинаранам, полиманнуроновым кислотам, фуканам и галактофуканам. Показано, что отдельный вид бурой водоросли может синтезировать различные структурные типы фукоиданов. Водоросли, принадлежащие к одному семейству Laminariaceae, также синтезируют различные структурные типы фукоиданов. Так, фукоидан из бурой водоросли S. cichorioides является a-L-фуканом, а основной тип фукоидана из бурой водоросли S. japónica - галактофукан. Было подтверждено, что фукоиданы являются видослецифичными полисахаридами бурых водорослей. 2. Установление структуры выделенных фукоиданов

Для установления структуры были выбраны наименее гетерогенные по моносахаридному составу фракции ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2, которые имели максимальный выход. Показано, что исследуемые полисахариды различались между собой по степени сульфатирования: наиболее сульфатированйым был фукоидан из S. cichorioides (ScF2), содержащий 39 % сульфатов; наименее - из S. japónica (SjF2) - 23 % сульфатных групп (табл. 1, 2, 3, 4).

Молекулярная масса фукоиданов бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), Я evanescens (FeF2), S. japónica (SjF2) и U. pinnatifída (UpF2) была определена методом ВЭЖХ на последовательно соединенных колонках Shodex Asahipak GS-520 HQ и GS-620 HQ, и составила 540, 430, 310 и 760 кДа, соответственно (табл. 1, 2, 3, 4). В качестве стандартов использовали пуллуланы Shodex Standard Р-82 («Showa Denko», Япония) с молекулярными массами от 180 до 667000 Да и голубой декстран («Amersham», Швеция).

Положение сульфатных групп в фукоиданах устанавливали с помощью метода ИК-спектроскопии. Показано, что сульфатные группы в фукоидане ScF2 из S. cichorioides находились преимущественно в аксиальном положении при С4 (интенсивная полоса поглощения 851 см"1) и меньшее их число - в экваториальном положении при С2 (полоса поглощения 830 см"1) остатков фукозы. В фукоидане FeF2 из бурой водоросли F. evanescens, напротив, преобладающим положением сульфатных групп являлось экваториальное при С2 (полоса поглощения 823 см"1) остатков фукозы. В галактофукане SjF2 из S. japónica сульфатные группы находились преимущественно в экваториальном положении при С2 (полоса поглощения 823 см"1), небольшое количество сульфатов находилось в аксиальном положении при С4 остатков фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 836 см'1). В галактофукане UpF2 из U. pinnatifida сульфатные группы находились, в основном, в экваториальном положении при С2 фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 829 см"1), а также в аксиальном положении при С4 фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 849 см"1).

Структурные особенности фукоиданов бурых водорослей были проанализированы методом 13С-ЯМР спектроскопии. В 13С-ЯМР спектре фукоидана ScF2 из бурой водоросли S. cichorioides были интерпретированы сигналы углеродных атомов СН3-групп фукопиранозы (около 16,3-16,5 м.д.) и С1 (99,5-100 м.д.); а область сигналов С2 -С5 остатков фукозы бЫла плохо разрешена. После сольволитического десульфатирования фукоидана ScF2 степень сульфатирования снизилась на 30 % (десульфатированный полисахарид содержал 9 % сульфатных групп). В области резонанса аномерных атомов углерода присутствовали сигналы с химическими сдвигами 96,6 м.д., 67,9 м.д., 76,3 м.д., 69,7 м.д., 67,8 м.д.,16,3-16,5 м.д., характерные для 1—>3-связанных остатков a-L-фукопиранозы. Наиболее интенсивные сигналы в двумерных COSY, TOCSY и NOESY спектрах были идентифицированы как принадлежащие остаткам a-L-фукопиранозы. Для более детального структурного анализа фукоидана ScF2 был применен метод масс-слектрометрии, который позволяет устанавливать тип гликозидных связей в олигомерах полисахаридов, положение сульфатных групп и минорных элементов. В условиях автогидролиза, впервые примененного нами для деградации фукоидана ScF2, были получены сульфатированные фукоолигосахариды с максимальной степенью полимеризации (п) до 7. Результаты анализа сульфатированной a-L-фукозы и фукоолигосахаридов с п = 2-3 Показали, что фрагменты полисахарида содержали 2- и 4-сульфатированные 1->3-связанные остатки a-L-фукопиранозы в качестве преобладающей структурной единицы. Согласно литературным данным, фукоиданы из бурой водоросли S. cichorioides в качестве главного моносахаридного компонента содержат фукозу, содержание других моносахаридов незначительно. В нашем случае мы выделили

высокосульфатированный фукоидан со структурой аналогичной структуруре фукоидана, описанной в работе (Zvyagintseva Т. and et.al, 2003).

В 13С-ЯМР спектре фукоидана FeF2 из бурой водоросли F. evanescens наблюдали характерные сигналы для СН3-групп (около 16,6 м.д.) и С1 остатка a-L-фукопиранозы (99,9 - 101,3 м.д.), а также сигналы, указывающие на присутствие ацетильных групп (21,7 м.д., СН3; 175,9 м.д., С=0) в полисахариде. С помощью масс-спектрометрии установлено, что фукоидан FeF2 построен из остатков фукозы, связанных 1—>4-0-гликозидными связями. Поскольку в фукоидане FeF2 сульфатирование при СЗ остатка a-L-фукопиранозы не было обнаружено, был сделан вывод о присутствии некоторого количества 1—»3-связанных остатков a-L-фукопиранозы. Полученные данные находятся в соответствии с результатами предыдущих исследований (Bilan M. and et.al, 2002).

В 13С-ЯМР спектре галактофукана SjF2 имелись сигналы С1 (103,7 м.д.), характерные для p-D-галактопиранозы и менее интенсивный сигнал при С6 (62,0 м.д.), указывающий на присутствие свободной СН2ОН группы в остатке D-галактопиранозы, а также сигналы (21,7 м.д., СН3; 175,9 м.д., С=0), характерные для ацетильных групп в полисахариде. Интенсивный сигнал в области 69,7 - 70,2 м.д., соответствовал С6 остатков галактозы, связанных 1—»6-О-гликозидными связями. Аномерные сигналы С1 (99,5 - 101,7 м.д.) и С6 (16,5 м.д.), область сигналов С2 - С5 (65,0 - 83,0 м.д.) свидетельствовали о наличии 1—»З-О-гликозидной связи между остатками a-L-фукопиранозы.

В спектре галактофукана UpF2 из U. pinnatifida были обнаружены сигналы с химическими сдвигами 103,6 - 104,8 м.д. и интенсивный сигнал с химическим сдвигом 62,0 м.д., характерные для С1 атомов остатков P-D-галактопиранозы и С6 свободной СН2ОН группы в остатке D-галактопиранозы, соответственно.

è

)

-OSO,-

".сTiloso; Б »"ffdos W В Г? „ОН,сррй-о

•OjS( OjSO I

n'C7~Z--¿-OSO,' H,L, __uosoi 'Q jSO 1

■OjSÔ j A[¿ Г HOH.C/^l^jloSOy

0

Hj<

•OjSÔ I

»•epfloso,-

AcO I

Saccharine japónica

Г

V J

Рисунок 6 - Фрагменты структуры фукоиданов из бурых водорослей S. cichorioides (А), F. evanescens (Б) U. pinnatifida (В) », (п -1 - з) S. japónica (О

Согласно литературным данным галактофукан из U. pinnatifida имеет блочное строение: блоки построены из остатков фукозы и галактозы [Skriptsova A. and et.al, 2010]. Аномерные сигналы С1 (97,0 - 102,7 м.д.), С6 (16,4 - 16,9 м.д.) и интенсивный сигнал С2 (67,7 м.д.) указывали на присутствие 1—»3- и 1—>4-связанных остатков a-L-фукопиранозы и p-D-галактопиранозы. Сигналы с химическими сдвигами 21,7 м.д. и 175,9 м.д. указывали на присутствие ацетильных групп в полисахариде.

Установлено, что выделенные фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 относятся к разным структурным группам. Фукоидан ScF2 из S. cichorioides содержал главную цепь из 1-»3-связанных остатков a-L-фукопиранозы, сульфатированной по С2 и С4 остатков фукозы (I группа) (рис. 6 А). Фукоидан FeF2 из бурой водоросли F. evanescens состоял из 1—>3- и 1—>4-связанных остатков a-L-фукопиранозы, частично ацетилированных и сульфатированых преимущественно по положению С2, и менее по С4 (II группа) (рис. 6 Б). Сопоставление полученных данных с литературными позволило предположить, что фукоидан из бурой водоросли S. japónica является галактофуканом, построенным из 1—>3-связанных остатков a-L-фукопиранозы с ответвлениями от основной цепи в виде 1—»6-связанных остатков p-D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее С4, а также частично ацетилированных по свободным положениям (III группа) (рис. 6 Г).

Фукоидан из U. pinnatifida также представлял собой галактофукан, главная цепь которого состояла из 1->3- и 1—►4-связанных остатков a-L-фукопиранозы и p-D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и реже С4 и частично ацетилированных по свободным положениям (III группа) (рис. 6 В). Кроме того, в фукоидане из S. japónica СН2ОН группа остатков галактозы была замещена, а в галактофукане из U. pinnatifida оставалась практически свободной.

3. Противоопухолевая активность фукоиданов из бурых водорослей морей Дальнего Востока России

3.1 Цитотоксическая активность фукоиданов

Фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 не проявляли цитотоксической активности по отношению к нормальным эпидермальным клеткам мыши JB6 CI41 в концентрациях до 400 мкг/мл. Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотоксичности фукоиданов по отношению к клеткам рака кишечника НТ-29, DLD-1 и меланомы человека SK-MEL-28 и SK-MEL-5. Наблюдался незначительный цитотоксический эффект исследуемых фукоиданов по отношению к линиям клеток рака кишечника НСТ 116, рака молочной железы T-47D и к клеткам меланомы человека RPMI-7951. Все выделенные фукоиданы (до 400 мкг/мл) не вызывали гибели 50% исследованных клеток в течение 24

4, то есть являлись нетоксичным, либо проявляли слабо выраженную токсичность. Цитотоксическая активность фукоиданов, различающихся по строению главной цепи,

моносахаридному составу, положению сульфатов и степени сульфатирования по отношению к различным типам клеток проанализирована впервые.

3.2 Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток

Показано, что фукоиданы из бурых водорослей незначительно влияли на пролиферацию раковых клеток кишечника человека НСТ 116 (рис. 7 А), НТ-29 и йШИ (данные не показаны) в концентрации до 200 мкг/мл.

Фукоидан ЭсР2 ингибировал пролиферацию раковых клеток молочной железы Т-47Й (рис. 7 Б) и меланомы человека ЗК-МЕ1_-28, ЭК-МЕЬб и ЯРМ1-7951 (рис. 7 В, Г, Д) на 10 % - 15 % по сравнению с контролем. Степень ингибирования роста клеток молочной железы и меланомы человека галактофуканом Э]Р2 составила менее 30 % (рис. 7 Б, В, Г, Д).

Фукоидан FeF2 обладал более выраженным действием: ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека ЗК-МЕ1_-28, БК-МЕ1_-5 и [ЧРМ1-7951 на 38 %, 43 % и 46 %, соответственно (рис. 7 В, Г, Д), тогда как степень ингибирования роста раковых клеток молочной железы Т-470 не превышала 15 % по сравнению с контрольными клетками (рис. 7 Б). Напротив, галактофукан 11рР2 из и. р'тпаИМа проявлял высокую антипролиферативную активность по отношению к клеткам Т-470 (степень ингибирования составила 60 %) и был менее активен по отношению к ЭК-МЕЬ 28, ЗК-МЕ1_-5 и РРМ1-7951 клеткам (степень ингибирования - 34 %, 34 % и 35 %, соответственно).

А Б

T-47D

—

Время обработки, ч

Рисунок 7 - Выживаемость НСТ 116 (A), T-47D (Б), SK-MEL-28 (В), SK-MEL-5 (Г) и RPMI-7951 (Д) клеток, обработанных фукоиданами из бурых водорослей S. cichoríoides (ScF2), S. japónica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2)

Показано, что все исследованные фукоиданы практически не ингибировали рост раковых клеток кишечника человека, но были более эффективны по отношению к опухолевым клеткам молочной железы и меланомы человека, то есть проявляли специфичность действия. Наибольшим влиянием на пролиферацию клеток T-47D обладал галактофукан из U. pinnatifida, тогда как галактофукан из S. japónica незначительно ингибировал рост данных клеток; на пролиферацию клеток меланомы человека эффективно действовал 1-+3;1 —>4-а-1--фукан из F. evanescens, а 1—>3-a-L-фукан из S. cichorioides не влиял на данный процесс. Необходимо отметить, что влияние фукоиданов на пролиферацию каждого типа клеток связано с индивидуальными структурными характеристиками фукоиданов.

3.3 Действие фукоиданов бурых водорослей на неопластическую трансформацию клеток, вызванную действием эпидермального фактора роста

Согласно литературным данным, процессы неопластической трансформации клеток в мягком агаре in vitro можно коррелировать с процессами возникновения злокачественных новообразований in vivo (Combes R. et.al., 1999). Эпидермальные клетки мыши JB6 CI41 (без обработки эпидермальным фактором роста (EGF), контроль) не образовывали колонии в мягком агаре, тогда как под действием EGF (1 нг/мл) происходила их трансформация и, как следствие, образование колоний (2000 колоний/8000 клеток). Установлено, что исследуемые фукоиданы в концентрации 50 мкг/мл ингибировали неопластическую трансформацию JB6 CI41 клеток, индуцированную EGF. Фукоидан ScF2 из S. cichorioides ингибировал трансформацию клеток на 65 % по сравнению с контролем, а обработка клеток фукоиданами SjF2, FeF2 и UpF2 из S. japónica, U. pinnatifida и F. evanescens приводила к снижению количества трансформированных клеток на 39 %, 55 % и 35 %, соответственно (рис. 8).

500 -

т о

EGF, 1 нг/мл Фукодан, 50 мкг/мл

-ti

Г*1

+ + + +

+ + + +

ScF2 SjF2 FeF2 UpF2

Рисунок 8 - Действие фукоиданов из бурых водорослей S, cichorioides (ScF2), S. japónica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) на EGF-индуцированную неопластическую трансформацию эпидермальных клеток мыши JB6 CI41

3.3.1. Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана из S. cichorioides

Для изучения молекулярного механизма действия был выбран фукоидан ScF2 из бурой водоросли S. cichorioides, поскольку он ингибировал EGF - индуцированную неопластическую трансформацию JB6 CI41 клеток в наибольшей степени по сравнению с фукоиданами из S. japónica, F.evanescens и U. pinnatifida (рис. 8).

С помощью метода вестери-блоттинг показано, что фукоидан в концентрации 10 мкг/мл эффективно ингибировал фосфорилирование рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и белка МЕК 1/2, индуцированное EGF, а в концентрации 100 мкг/мл практически полностью блокировал их фосфорилирование (рис. 9). Важно отметить, что обработка клеток фукоиданом в сочетании с EGF не приводила к изменению экспрессии белков EGFR и МЕК 1/2.

EGF, 1 in 7мл ScF2. мкг/мл

-^¡¡ПЙГ

р- ECFR EGFR

р-МЕК 1/2 МЕК 1/2

P-JNK 1/2 JNK 1/2

-Jun (Ser 63) -jun (Ser 63)

=S=r= г

—— —' ---- = ==.

--_-...._. Л. 40* |(Ь ......

........-■■"■■- '........■...... --- '--- ™•

р-ЕКК 1/2 ERKI/2

p- р9<Г р9(Г

Рисунок 9 - Действие фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на EGF-индуцированную активацию EGFR, МЕК 1/2, ERKs, и JNKs

Фукоидан 5сР2 также эффективно ингибировал фосфорилирование протеинкиназ ЕКК 1/2 и ЛЫК 1/2, вызванное действием ЕОР, а также следующих за ними в МАРК каскаде р-90"а< и с-]ип. Экспрессия анализируемых белков оставалась постоянной (рис. 9).

Известно, что повышение уровня экспрессии онкобелков с^ип, ЫЪб и АР-1 комплекса играет решающую роль в процессах трансформации нормальных клеток в опухолевые. Установлено, что фукоидан в концентрации 10 мкг/мл подавлял активность онкобелков с-Кээ, с-]'ип и АР-1 комплекса, активированные ЕйЕ, на 40 %, 43 % и 65 %, соответственно (рис. 10).

о

PGL3

EGF (1 нг/мл) ScF2 (мкг/мл)

Л

Ис-fos a c-¡un DAP-1

Mkk

Рисунок 10 - Действие фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на активацию онкобелков c-fos, c-jun и АР-1 комплекса

Полученные результаты представляют несомненный интерес, поскольку фукоиданы бурых водорослей, ингибирующие активацию EGFR, МАРК и АР-1 комплекса, являются перспективными средствами для предотвращения клеточной трансформации и, как следствие, возникновение рака.

3.4 Действие фукоиданов бурых водорослей на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток

Исследование действия фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 (50 мкг/мл) из бурых водорослей S. cichorioides, S. japónica, F. evanescens и U. pinnatifida на самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека показало, что они ингибировали данный процесс в различной степени. Фукоидан ScF2 из S. cichorioides оказался наиболее эффективным при обработке опухолевых клеток кишечника человека. Он ингибировал формирование и рост колоний НОТ 116, НТ 29 и DLD-1 клеток на 29 %, 44 % и 76 %, соответственно (рис. 11 А, Б, В). Наиболее выраженное противоопухолевое действие для фукоидана SpF2 обнаружено на модели DLD-1 клеток: он снижал не только количество колоний опухолевых клеток, но и значительно уменьшал их размеры (рис. 11 Г).

3000

2500

2 ООО

о b 1500

i 1000

■р

'-О 500

ъ

-fl

г£~]

г¥п

1500 1000 500

i

л

г£п

Рисунок 11 - Действие фукоиданов из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), S. japónica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) на формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека НСТ 116 (А), НТ-29 (Б) и bLD-1 (В, Г)

FcF2, 50 мкг/мл UpFl, 50 мкг/мл

Галактофуканы UpF2 и SjF2 из бурых водорослей U. pinnatifida и S. japónica оказались наиболее эффективными на модели раковых клеток молочной железы (рис. 12 Г). Галактофуканы UpF2 и SjF2 ингибировали формирование и рост колоний T-47D клеток на 75 % и 64 %, соответственно, тогда как фукоиданы ScF2 и FeF2 ингибировали данный процесс на 18 % и 30 %, соответственно.

I

4000

т

3000

i

л

S

i

1

А

¿f

Рисунок 12 - Действие фукоиданов из S. cichorioides (ScF2), F. evanescens (FeF2), S. japónica (SjF2), U. pinnatifida (UpF2) na формирование и рост колоний клеток меланомы SK-MEL-28 (A), SK-MEL-5 (Б), RPMI-7951 (В) и опухолевых клеток молочной железы человека T-47D (Г)

Фукоидан РеР2 из Р. ечапевсепв обладал наиболее сильным ингибирующим действием на клетках меланомы человека, он угнетал рост колоний ЗК-МЕ1_-28, ЭК-МЕ1.-5 и ИРМ1 -7951 на 66 %, 54 % и 51 %, соответственно (рис. 12 А, Б, В).

3.4.1 Действие фукоидана из бурой водоросли Р. evanescens на УФ-индуцированную активацию магприксных металлопротеиназ

Известно, что одним из факторов возникновения меланомы у человека является чрезмерное ультрафиолетовое облучение (УФ-облучение) кожи. Установлено, что экспрессия матриксной металлопротеиназы - 1 (ММР-1) - играет важную роль в процессе метастазирования меланомы, опухолей легких и молочной железы человека.

Фукоидан РеР2 из Р. evanescens проявлял наиболее выраженное ингибирующее действие на пролиферацию и формирование колоний клеток меланомы человека (рис. 7, 12), поэтому мы исследовали его способность подавлять экспрессию ММР-1, вызываемую УФ-облучением.

Фукоидан РеР2 (10 мкг/мл и 100 мкг/мл) ингибировал активацию ММР-1, индуцированную УФ-облучением (15 мДж/см2) на 40 % и 48 %, соответственно (рис. 13 А). Действие фукоидана на уровень экспрессии гена, кодирующего ММР-1, было исследовано с помощью ПЦР анализа. Фукоидан (10 и 100 мкг/мп) эффективно ингибировал экспрессию этого гена (степень ингибирования составила 27 % и 59 %, соответственно) (рис. 13 Б).

Под действием УФ-облучения происходило фосфорилирование протеинкиназ ЕЯК 1/2, Л\1К 1/2, р38, тогда как обработка клеток фукоиданом (100 мкг/мл) приводила к значительному снижению активности данных белков (рис. 13 В).

1 3 1 а

л 100 «о

и

, 0 --ЛИ—Г'

60 °/о 52 ЧЪ

гЬ

4- и\гв (15 мДж/см1) ¿00 ГсГ2 (мкг/мл)

1

А

1

А

+ 100

ич-вазл^/смМ

1гУ2 (МКГ/МЛ)

Рисунок 13 - Действие фукоидана из Р. еуалеэселз (РеР2) на УФ-индуцированную активацию ММР-1 (А), экспрессию мРНК (Б) и фосфорилирование МАРК (В)

Впервые показано, что фукоидан из Р. ечапезсепз способен предотвращать УФ-индуцированную экспрессию ММР-1 на транскрипционном и трансляционном уровнях, изменяя активность клеточных белков МАРК сигнального каскада. Как результат, фукоидан из бурой водоросли Р. еуапезсепв может быть потенциальным терапевтическим средством для предотвращения возникновения меланомы кожи под действием УФ-облучения и использоваться как активная составляющая в лечебной и лечебно-профилактической косметике.

3.5 Проапоптопическое действие фукоидана из бурой водороспи 5. с/с/?ош/о'е5

Перспективным направлением лечения злокачественных опухолей является поиск и разработка нетоксичных противоопухолевых препаратов на основе субстанций природного происхождения, способных индуцировать апоптоз опухолей на разных стадиях их развития. Известно, что антипролиферативное действие веществ часто связано с реализацией программы апоптоза опухолевых клеток. Поскольку фукоидан ЭсР2 из й. с/с/юг/о/с/ея не обладал цитотоксической активностью (до 400 мкг/мл) и не влиял на пролиферацию раковых клеток кишечника человека НСТ 116 (рис. 7 А), мы исследовали его способность увеличивать противоопухолевую активность ресвератрола и усиливать апоптоз НСТ 116 клеток, индуцированный данным препаратом. Использование ресвератрола в качестве противоопухолевого агента во многом сдерживается его высокой токсичностью по отношению, как к опухолевым, так и нормальным клеткам. Следовательно, изучение возможного синергического противоопухолевого действия ресвератрола (в нетоксичных концентрациях) и

19

фукоидана ЭсР2 представляет большой интерес для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований.

При исследовании цитотоксической активности ресвератрола бмла определена его концентрация, при которой погибало 50 % раковых клеток кишечника НСТ 116 (1С50 = 55 мкМ). Показано, что ресвератрол в нетоксических дозах (40 мкМ) подавлял пролиферацию НСТ 116 клеток на 34 %, 40 % и 71 % после инкубации клеток с веществом в течение 24, 48 и 72 ч, соответственно (рис. 14 А). Действие ресвератрола (24 ч) усиливалось при добавлении фукоидана ЭсР2 (100, 200 и 300 мкг/мл) на 13 %, 18 % и 22 %, соответственно (рис. 14 Б). Таким образом, в данном случае имел место синергизм действия при совместном введении двух веществ.

53%

ril

-П

зг% rin

27% h

24 48

Время обработки, ч

+ Res, 40 мкМ 300 ScF2, мкг/мл

Рисунок 14 - Действие ресвератрола (Res) (А) и совместное действие ресвератрола (Res) и фукоидана (ScF2) из S. cichorioides (Б) на пролиферацию опухолевых клеток кишечника человека HCT 116

Установлен молекулярный механизм реализации апоптоза опухолевых клеток HCT 116 при совместной обработки ресвератролом и фукоиданом. Показано, что добавленные отдельно ресвератрол (40 мкМ) и фукоидан ScF2 (300 мкг/мл) не индуцировали активацию каспаз в HCT 116 клетках, тогда как при совместном их введении наблюдается синергический эффект (рис. 15).

Res, 40 мкМ -ScF2, мкг/мл_

Caspase 9 Caspase 7

Рисунок 15 - Совместное действие ресвератрола (Res) и фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на активацию

| Cleaved Caspar 7 каспазы g ^ 3 и расщепление

] Caspase3 каспаз 7 и 3

J Cleaved Caspase 3 b-aetin

Показано, что происходила активация каспазы 9, и, как следствие, активация каспаз 3 и 7. Стоит отметить, что активация каспаз усиливалась с увеличением

20

концентрации фукоидана ScF2 (рис. 15). Наибольшее расщепление каспаз 7 и 3 (cleaved caspase 7, 3) наблюдалась в клетках, обработанных ресвератролом (40 мкМ) и ScF2 (300 мкг/мл).

Данные, свидетельствующие о способности фукоидана из S. cichorioides (ScF2) усиливать апоптоз НСТ 116 клеток, индуцированный ресвератролом, были подтверждены методом проточной цитофлюориметрии с окрашиванием аннексином-V/PI (рис. 16).

Рисунок 16 - Совместное действие ресвератрола и фукоидана из S. cichorioides (ScF2) на индукцию апоптоза опухолевых клеток кишечника человека НСТ 116

При обработке НСТ 116 клеток ресвератролом (40 мкМ) и фукоиданом ScF2 (100, 200, 300 мкг/мл) наблюдалось существенное повышение числа апоптотических клеток (до 52%), тогда как в контрольных образцах количество апоптопических клеток не превышало 20 %.

Таким образом, фукоидан ScF2 из S. cichorioides самостоятельно не влиял на пролиферацию опухолевых клеток кишечника человека, но усиливал их апоптоз, индуцированный ресвератролом, что может привести к снижению действующей дозы ресвератрола и соответственно снизить его побочные действия на организм человека.

Сравнительный анализ противоопухолевой активности фукоиданов из дальневосточных бурых водорослей, имеющих разную структуру, позволил определить структурные элементы фукоиданов, необходимые для проявления данной активности на разных моделях раковых клеток. Предположительно, наличие 1—»3-связанных сульфатированных остатков a-L-фукозы необходимо для ингибирования EGF-индуцированной неопластической трансформации нормальных клеток мыши и роста

Ресверагрол, 0 мкМ Фукоидан, 0 мкг/мл

i

I»' 101 10г 10 I04

FL1-H

есвератрол, 40 мкМ 'укоидан, 200 мкг/мл

Ресвератрол, 40 мкМ Фукоидан, 0 мкг/мл

Ресвератрол, 40 мкМ Фукоидан, 100 мкг/мл

колоний раковых клеток кишечника человека; сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1—>3- и 1—»4-связанных остатков a-L-фукозы ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 1—»3- и/или 1—>4-0-гликозидными связями.

Выводы

1. Установлено, что фукоиданы из бурых водорослей Saccharine cichorioides, S. japónica, Fucus evanescens и Undaria pinnatifida различаются между собой по моносахаридному составу, степени сульфатирования и ацетилирования. Фукоидан из S. cichorioides представляет собой высокосульфатированный 1-»3-а-L-фукан; фукоидан из F. evanescens состоит из 1-»3- и 1-»4-связанных остатков a-L-фукозы, сульфатированных по С2 и менее по С4, и ацетилированных по свободным положениям.

2. Галактофуканы из S. japónica и U. pinnatifida построены из 1-»3-связанных и 1—>3-и 1—»4-связанных остатков a-L-фукозы и p-D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее С4, соответственно, а также частично ацетилированных по свободным положениям.

3. Показано, что фукоиданы не токсичны по отношению к эпидермальным клеткам мыши JB6 CI41 и ингибируют их EGF-индуцированную неопластическую трансформацию.

4. Определено, что фукоидан из S. cichorioides блокирует EGF-индуцированную трансформацию JB6 CI41 клеток посредством ингибирования активации EGFR, протеинкиназ МАРК каскада и АР-1 комплекса.

5. Показано, что фукоиданы незначительно влияют на пролиферацию раковых клеток человека, но эффективно ингибируют самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника, молочной железы и меланомы человека. Установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурными характеристиками.

6. Фукоидан из F. evanescens подавляет УФ-индуцированную экспрессию ММР-1, мРНК и МАРК в клетках меланомы человека.

7. Показано, что высокосульфатированный a-L-фукан из S. cichorioides усиливает антипролиферативное действие ресвератрола и апоптоз раковых клеток кишечника человека, индуцированный ресвератролом. Показано, что молекулярный механизм реализации апоптоза связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз при совместном действии ресвератрола и фукоидана.

8. Установлена взаимосвязь структурных элементов фукоиданов и их противоопухолевого действия. Показано, что наличие 1—>3-связанных сульфатированных остатков a-L-фукозЫ необходимо для ингибирования EGF-индуцированной трансформации нормальных клеток и роста колоний раковых клеток кишечника человека; сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1—»3- и 1 —»4-связанных остатков a-L-фукозЫ ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 1—>3- и/или 1-»4-0-гликозидными связями.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Vishchuk О., Tarbeeva D., Ermakova S., Zvyagintseva Т. Structural characteristics and biological activity of fucoidans from brown algae Alaria sp. and Saccharina japónica of different reproductive status // Chem. Biodiversity. - 2012. - Vol. 9. - P. 817 - 828

2. Anastyuk S., Shevchenko N., Ermakova S., Vishchuk O., Nazarenko E., Dmitrenok P., Zvyagintseva T. Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens and its low molecular fragments, structurally characterized by tandem mass-spectrometry II Carbohydr. Polymers. - 2012. - Vol. 87, N 1. - P. 186-194.

3. Vishchuk O., Ermakova S., Zvyagintseva T. Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japónica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics and antitumor activity II Carbohydr. Res. - 2011. - Vol. 345, N 17. - P. 2769-2776

4. Ku M„ Jung J., Lee M., Cho В., Lee S., Lee H., Vischuk O., Zvyagintseva Т., Ermakova S., Lee Y. Effect of Fucus evanescens fucoidan on expression of matrix metalloproteinase-1 promoter, mRNA, protein and signal pathway II J. Life Science. -2010.-Vol. 20. - P. 1603-1610.

5. Вищук O.C., Ермакова С.П., Фам Д.Т., Шевченко Н.М., Ли Б.М., Звягинцева Т.Н. Противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 3. - С. 92-96.

6. Sokolova R., Vishchuk О., Ermakova S., Zvyagintseva Т. Brpwn algae as source of sulphated polysaccharides with anticancer activity // Тез. докл. The 3"1 Annual Korea-Russian Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application. Gangneung. - 2011. - P. 333.

7. Vishchuk O. Brown algae are perspective source of biological active polysaccharides // Тез. докл. Междисциплинарной конференции «Биологически активные вещества:

фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Украина. -2011.-С. 250.

8. Vishchuk О., Ermakova S., Zvyagintseva Т. Sulphated polysaccharides of brown seaweeds: perspectives of production of medicine with antitumor effect // Тез. докл. International symposium «Bioprosp 2011». Norway. - 2011. - P. 63.

9. Vishchuk 0., Ermakova S., Zvyagintseva T. Brown algae is source of bioactive polysaccharides with anti-tumor effect // Тез. докл. 9"1 International Marine Biotechnology Conference (IMBC 2010). Qingdao. China. - 2010. - P. 413.

10. Vishchuk O., Ermakova S., Pham Т., Ly В., Zvyagintseva T. The supplement with antitumor effect, based on polysaccharides from brown algae // Тез. докл. 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology». Новосибирск. - 2009. - P. 152.

11. Ермакова С.П., Вищук O.C., Кусайкин М.И., Ли Н.Е., Чой Х.С., Чой Х.К., Звягинцева Т.Н. Противоопухолевая активность фукоиданов из бурой водоросли L. cichorioides // Тез. докл. Ill Международной научной конференции ТИНРО. Владивосток. - 2008. - С. 311.

Соискатель

Вищук О.С.

Вищук Олеся Сергеевна

Структура и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 26.04.2012 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,45 Уч-изд. 1,34 Тираж 100 экз. Заказ 307 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

61 12-2/52 8

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Вищук Олеся Сергеевна

Структура и противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н. Звягинцева Татьяна Николаевна

ВЛАДИВОСТОК - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

¡.ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.........................................................................................6

2.1. Фукоиданы бурых водорослей. Общие сведения...............................................7

2.2. Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей.........................9

2.2.1. Фукоиданы, построенные из 1—^3-связанных остатков сульфатированной а- Ь-фукопиранозы...................................................................................................10

2.2.2. Фукоиданы, построенные из 1—>3- и 1—>4-связанных остатков сульфатированной а-Ь-фукопиранозы...................................................................15

2.2.3. Фукоиданы, построенные из 1—>3 и/или 1—И-связанных остатков сульфатированной а-Ь-фукопиранозы и р-О-галактопиранозы..........................18

2.2.4. Фукоиданы сложного состава.......................................................................21

2.3. Биологическая активность фукоиданов бурых водорослей............................23

2.3.1. Антикоагулянтная и антитромбическая активности...................................23

2.3.2. Антивирусная активность..............................................................................26

2.3.3. Противоопухолевая активность....................................................................29

2.3.3.1. Антипролиферативная активность..........................................................30

2.3.3.2. Антиметастатическая активность............................................................36

2.3.4. Апоптоз............................................................................................................41

2.3.4.1. Определение понятия «апоптоз». Отличительные признаки апоптоза42

2.3.4.2. Сигнальные пути при апоптозе................................................................42

2.3.4.3. Митоген-активируемые протеинкиназные каскады..............................45

2.3.4.4. Фукоиданы бурых водорослей - индукторы апоптоза раковых клеток47

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................53

3.1. Выделение фукоиданов из бурых водорослей и установление их структуры53

3.1.1. Выделение и фракционирование фукоиданов из бурых водорослей........53

3.1.2. Установление структуры фукоиданов..........................................................63

3.2. Исследование противоопухолевой активности фукоиданов из бурых водорослей...................................................................................................................72

3.2.1. Цитотоксическая активность фукоиданов...................................................72

3.2.2. Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток...................74

3.2.3. Действие фукоиданов на неопластическую трансформацию клеток, вызванную действием ЕвР......................................................................................76

3.2.3.1. Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана из бурой водоросли & сгскопогс^ея............................................................................78

3.2.4. Действие фукоиданов на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток....................................................................................................82

3.2.4.1. Действие фукоидана из бурой водоросли Е. еуапезсепя на активацию матриксных металлопротеиназ.............................................................................85

3.2.5. Проапоптопическое действие фукоидана из бурой водоросли & Ыскогтёез.............................................................................................................87

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.........................................................................93

4.1. Материалы............................................................................................................93

4.2. Оборудование.......................................................................................................95

4.3. Методы..................................................................................................................96

5. ВЫВОДЫ.................................................................................................................104

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия ДТТ (DTT) - дитиотриэтол

ДЭАЭ-целлюлоза (DEAE-cellulose) - диэтиламиноэтил-целлюлоза ПСА (APS) - персульфат аммония ТФУ (TFA) - трифторуксусная кислота

УФ-облучение (UVB) - ультрафиолетовое облучение, Аг=280-320нм ВМЕ (Basal Medium Eagle) - питательная среда для культур клеток c-Jun - белок из семейства транскрипционного фактора Jim

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) - питательная среда для культур клеток EGF (Epidermal Growth Factor) - эпидермальный фактор роста EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) - рецептор эпидермального фактора роста ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) - киназа, регулирующая внеклеточные сигналы

FBS (Fetal Bovine Serum) - эмбриональный бычий альбумин Fuc - фукоза Gal - галактоза Glc - глюкоза

JNK (Jun N-terminal kinase) - Jun N-концевая киназа Man - манноза

МАРК - митоген-активированая протеинкиназа

MEM (Minimum Essential Medium Eagle) - питательная среда для культур клеток

MMPs - матриксные металлопротеиназы

р-38 МАРК - митоген-активированая протеинкиназа р-3 8

RPMI (Roswell Park Memorial Institute) - питательная среда для культур клеток

Rha - рамноза

Ua - уроновая кислота

Ху1 - ксилоза

1. ВВЕДЕНИЕ

Бурые водоросли морей Дальнего Востока России являются богатым, легко возобновляемым источником уникальных по структуре и свойствам полисахаридов (ламинаранов, альгиновых кислот и фукоиданов). В последние годы объектом интенсивного исследования стали сульфатированные полисахариды бурых водорослей - фукоиданы. Они представляют собой обширный класс биополимеров, содержание и структура которых варьирует в зависимости от вида водоросли, мест ее произрастания, сезона сбора и многих других факторов. Постоянно растущий интерес к этим полисахаридам объясняется их разнообразной биологической активностью, которая может быть использована при создании медицинских препаратов нового поколения.

В последние годы наблюдается стремительный рост числа публикаций, посвященных исследованию противоопухолевой активности фукоиданов. Показано, что данная активность фукоиданов возрастает с увеличением степени сульфатирования, однако информация о влиянии на противоопухолевую активность других структурных характеристик: положения сульфатных групп в моносахаридных остатках фукоиданов, их молекулярной массы, типа О-гликозидной связи между остатками фукозы и/или других моносахаридов в главной цепи, а также наличие неуглеводных заместителей, отсутствует.

Актуальным является выделение фукоиданов со стандартными структурными характеристиками и установление молекулярного механизма их противоопухолевого действия. Исследование фукоиданов, принадлежащих к разным структурным типам, позволит выявить закономерности проявления противоопухолевой активности соединений в зависимости от их структурных особенностей.

Целью данной диссертационной работы является установление структуры фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России Saccharina cichorioides, Saccharina japónica, Fucus evanescens и Undaria pinnatifida и характеристика взаимосвязи структуры фукоиданов и их действия на различные типы раковых клеток человека.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Бурые водоросли (РЬасорЬу1а), тип споровых растений, включающий 240 родов (более 1500 видов), из которых 3 — пресноводные, остальные — морские. Эти макроводоросли особенно широко распространены в холодных частях Атлантического и Тихого океанов, где преобладают виды, относящиеся к семействам Рисасеае и Ьапнпаппасеае. В теплых водах наиболее распространены бурые водоросли семейства 8аг§а88асеае. Слоевища бурых водорослей имеют цвет от оливково-зелёного до темно-бурого из-за присутствия в хроматофорах особого бурого пигмента фукоксантина, маскирующего другие пигменты (хлорофилл, хлорофилл с, ксантофилл и бета-каротин). Бурые водоросли разнообразны по форме и размерам (от микроскопических разветвленных нитей до 40 метровых растений).

Полисахариды являются главными компонентами биомассы водорослей и выполняют ряд важнейших биологических функций: служат энергетическим резервом, участвуют в построении клеточных стенок, образуют наружные капсулы и межклеточный матрикс, препятствуют дегидратации, создают барьер для проникновения в клетки солей из морской воды или, напротив, обеспечивают избирательное поглощение катионов, необходимых для построения минерального скелета.

Полисахариды имеют различную структуру и интригующий спектр биологической активности. Наиболее характерными полисахаридами бурых водорослей являются альгиновые кислоты и их соли, ламинараны (1—>3- или 1 —>3; 1 —>6-р-0-глюканы) и фукоиданы (сульфатированные а-Ь-фуканы или гетерополисахариды). В настоящее время наибольший интерес вызывают фукоиданы, которые перспективны для создания на их основе биологически активных добавок и лекарств, несмотря на трудности с установлением их структуры.

2.1. Фукоиданы бурых водорослей. Общие сведения

Фукоиданы - сульфатированные полисахариды, непременным и часто главным компонентом которых являются остатки a-L-фукозы, этерифицированные серной кислотой. Однако в настоящее время обнаружены фукоиданы, в которых содержание D-галактозы и L-фукозы практически одинаково.

Впервые фукозосодержащий полисахарид был выделен Н. Killing в 1913 г. из бурой водоросли и назван фукоидином [1]. Подобные полисахариды не встречаются в других отделах водорослей и в наземных растениях, однако родственные биополимеры найдены в морских беспозвоночных (морских ежах и голотуриях), принадлежащих к типу иглокожих [2]. Поскольку полисахариды животного происхождения содержат только фукозу (содержание других моносахаридов менее 5 %) и сульфат, в соответствии с IUP АС принятой номенклатурой углеводов, A. Ribeiro и A. Alves применили термин фукансульфаты к полисахаридам, выделенным из морских беспозвоночных [3].

В состав сульфатированных полисахаридов, выделенных из бурых водорослей, часто входят такие моносахариды как галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Xyl), рамноза (Rha), уроновые кислоты (Ua), а также ацетильные группы. Е. Percival и A. Ross предложили считать полисахарид из водорослей, обогащенный L-фукозой, фуканом [4]. Позже в 1959 г. в соответствии с номенклатурой полисахаридов подобный препарат, полученный N. McNeely, был назван фукоиданом [5].

Гистохимически фукоиданы определяются как основной компонент внеклеточного матрикса (ВКМ) концептакул водоросли [6]. Концентрация этих полисахаридов в ВКМ концептакул в несколько десятков раз выше, чем в межклетниках сердцевины [7]. Для определения локализации фукоидана было предложено использовать иммуноцитохимический метод окрашивания, с помощью которого удалось обнаружить, что фукоидан локализован в области клеточной стенки. Он был обнаружен не только в области эпидермальных клеток, но и во внутреннем кортикальном слое. Было показано, что в водоросли Saccharina japónica (предыдущее название Laminaria japónica) фукоидан находится на расстоянии 50 - 150 мкм от поверхности [8]. Предполагается, что фукоиданы,

благодаря их гигроскопичности, помогают в высвобождении репродуктивных клеток. Они предохраняют растения, произрастающие на литорали, от высыхания и обеспечивают стабильность клеточных стенок [9]. Предположительно, благодаря своим антиоксидантным свойствам, фукоиданы могут защищать растения от оксидативного стресса, вызванного флуктуациями температуры, света и солености в естественных условиях [10, 11]. Предполагается также экранирующая функция фукоиданов против высоких интенсивностей света и ультрафиолетового облучения (УФ-облучения) [12].

Содержание фукоиданов в бурых водорослях колеблется в довольно широких пределах: от 0,4 до 20,4 % и зависит от вида водоросли и сезона ее сбора. Самое высокое содержание фукоидана (20,4 %) было обнаружено Усовым А.И. с соавторами в Saundersella simplex, принадлежащей к порядку Dicyosiphonales [13]. Достаточно высокое содержание фукоиданов наблюдается в водорослях порядка Fucales: от 13,4 % до 16,5 % - у Fucus vesiculosus и от 10,0 % до 11,5 % - у Ascophyllum nodosum [14]. В дальневосточных представителях порядка Laminarinales содержание фукоиданов меньше: от 0,6 % до 6,5 %, а водорослях порядка Fucales - от 1,5 % и до 7,9 % [15, 16]. Различие в содержании фукоиданов для одного вида водоросли может определяться сезонными изменениями таких абиотических факторов как температура, концентрация элементов минерального питания, освещенность [17], и зависит от репродуктивного статуса водоросли [16]. Один и тот же вид водоросли может содержать несколько структурных типов фукоиданов [18].

Кроме того, водоросли одного вида, произрастающие в разных условиях, содержат фукоиданы, отличающиеся не только по моносахаридному составу, но и по степени сульфатирования. Известно, что фукоиданы из Saccharina latissima (предыдущее название Laminaria saccharina), произрастающей в Баренцевом море, более сульфатированы и состоят из остатков фукозы и глюкуроновой кислоты, тогда как полисахариды водоросли беломорской популяции менее сульфатированны и наряду с фукозой и глюкуроновой кислотой содержат глюкозу [19].

Биологическая активность этих полисахаридов в отличие от их структуры изучается чрезвычайно интенсивно. В силу недостатка информации о структуре биологически активных фракций фукоиданов сведения о связи структура/функция для этих полисахаридов практически отсутствуют.

2.2. Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей

С того момента, как Killing впервые выделил фукоидан (1913 г.), структура этих полисахаридов из различных бурых водорослей является объектом изучения многих естествоиспытателей. Структурные исследования фукоиданов, как правило, позволяют установить строение лишь отдельных фрагментов молекул. Это объясняется, с одной стороны, тем, что водоросли часто содержат сложные смеси различных по химической структуре сульфатированных полисахаридов. С другой стороны, это связано с особенностями структуры молекул фукоиданов, такими, как высокая степень сульфатирования, разветвленность, но главные трудности возникают из-за нерегулярного распределения отдельных структурных элементов вдоль цепи полимера.

В настоящее время установлены структуры фукоиданов, основным компонентом которых является L-фукоза. Показано, что фукоидан из бурой водоросли Saccharina cichorioides (предыдущее название Laminaria cichorioides) построен из остатков a-L-фукопиранозы, соединенных 1—в-О-гликозидной связью, сульфатированных по положениям С2 и С4 [20, 21]. Однако, фукоиданы, выделенные из видов, относящихся к разным порядкам бурых водорослей, могут различаться структурой главной цепи. Так фукоидан из Fucus vesiculosus содержит в своей полимерной цепи остатки a-L-фукопиранозы, соединенные 1—»3- и 1—>4-0-гликозидными связями, а также сульфатные и ацетильные группы [22]. Большинство известных фукоиданов, например фукоиданы из Undaria pinnatifida [23, 24] и Saccharina japónica [25], имеют еще более сложное строение, т.к. наряду с фукозой, они содержат в заметных количествах галактозу (Gal), маннозу (Man), ксилозу (Xyl), уроновые кислоты (Ua). Кроме того, они лишены элементов регулярности за счет разветвлений главной цепи и произвольного расположения неуглеводных заместителей.

В связи с этим, в настоящее время по типу связи а-Ь-фукопиранозы в полисахариде и содержанию моносахаридов, фукоиданы разделяют на три группы [26]:

1. Фукоиданы, построенные преимущественно из 1—>3-связанных остатков сульфатированной а-Ь-фукопиранозы. В эту группу входят полисахариды, выделенные из представителей порядка Ьапппапакэ (семейства Ьаттапасеае и СЬогёасеае). Они построены из 1—>3-связанных а-Ь-фукопиранозных остатков, сульфатированных по положениям С2 и/или С4 и содержат ответвления от основной цепи в виде остатков фу козы (рис. 2.1).

2. Фукоиданы, содержащие в своей полимерной цепи 1—>3- и 1^4-связанные остатки сульфатированной а-Ь-фукопиранозы. Например, фукоиданы из бурых водорослей порядка Ьисакэ (семейство Ьисасеае), построенные из чередующихся 1—>3- и 1 —>4-связанных а-Ь-фукопиранозных остатков, сульфатированных преимущественно по положению С2, с ответвлениями от основной цепи в виде остатков фукозы (рис. 2.2).

3. Фукоиданы, построенные из остатков а-Ь-фукопиранозы и РЛ)-галактопиранозы, связанных 1—>3- и/или 1—>4-0-гликозидными связями. Примером могут служить фукоиданы из бурых водорослей порядка Ьаштапа1ез (семейство А1аиасеае и некоторые представители семейства Ьаттаппасеае) и Риса1ез (семейство Ва^азэасеае) (рис. 2.3).

2.2.1. Фукоиданы, построенные из 1—>3-связанных остатков сульфатированной а-Ь-фукопиранозы

Фукоидан, содержащий практически только фукозу и сульфатные группы, был выделен из бурой водоросли БасскаНпа ыскогШйез. В результате химических модификаций (десульфатирование, метилирование), а также методом ЯМР -спектроскопии установлено, что фукоидан из 5". сшкогшёез представляет собой 1—>3-а-Ь-фукан, сульфатные группы которого находятся в положении 2 и 4 (рис. 2.1 А) [20, 21]. Сравнение с фукоиданами из других видов бурых водорослей семейства Ьаттаппасеае, показало, что бурая водоросль cichorioid.es

синтезирует самый высоко сульфатированный ф�