Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.

Сильченко, Артем Сергеевич

Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp. тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Сильченко, Артем Сергеевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2014 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.»

Автореферат диссертации на тему "Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp."

На правах рукописи

Сильченко Артем Сергеевич

Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т и морского моллюска Lambis sp.

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 ь !:9<1

?П1 I

Владивосток - 2014

005550090

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Кусайкин Михаил Игоревич

Официальные оппоненты:

Имбс Андрей Борисович

доктор биологических наук, зам. директора по науке, зав. лабораторией сравнительной биохимии Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Ильина Анна Павловна

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологически активных биополимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Ведущая организация:

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «4» июля 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан

«¿3» -X-tClÄ 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение уникальных ферментов морских организмов, расщепляющих полисахариды бурых водорослей, характеристика их каталитических свойств и структуры - актуальная задача современной энзимологаи. Объектами нашего исследования являются фукоиданазы и альгинат-лиазы морских беспозвоночных и бактерий, принимающие участие в катаболизме полианионных полисахаридов морских водорослей. Эти ферменты исследованы недостаточно, поэтому их изучение расширит наши теоретические знания о структурно-функциональных свойствах этих ферментов и позволит направленно использовать их для установления структуры природных полисахаридов.

Субстратами для исследуемых ферментов являются альгиновые кислоты (гетерополисахариды, состоящие из остатков маннуроновых и гулуроновых кислот) и фукоиданы (высокосульфатированные гомо- и гетерополисахариды). Эти полисахариды бурых водорослей относят к так называемым «поливалентным биомодуляторам», так как они обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, радиопротекторной, антиопухолевой, антивирусной, антимикробной, антикоагулянтной, гепатозащитной и другими. Все эти свойства делают возможным использование полисахаридов бурых водорослей в медицине. Однако лекарства на их основе еще не созданы. Это связано с недостатком информации о взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов водорослей и отсутствием простых и воспроизводимых методов стандартизации препаратов. Существуют трудности в установлении структуры этих биополимеров, характеризующихся большим структурным разнообразием, гетерогенностью получаемых фракций, сложным построением молекул. Для стандартизации природных полисахаридов, установления их структуры, увеличения биологической активности и снижения побочных эффектов наиболее перспективным является использование ферментов.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является установление первичной структуры и характеристика каталитических свойств фукоиданаз и альгинат-лиаз морских организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать методы поиска продуцентов фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских организмов; 2) Выбрать продуценты фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских бактерий и беспозвоночных; 3) Разработать схемы выделения индивидуальных фукоиданаз и альгинат-лиаз из выбранных объектов; 4) Изучить каталитические свойства, специфичность и тип действия выделенных ферментов; 5) Установить структуры продуктов ферментативной трансформации фукоиданов и альгиновых кислот; 6) Определить аминокислотные последовательности выделенных ферментов; 7) Получить рекомбинантные аналоги исследуемых ферментов и провести их сравнительное изучение.

Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан простой метод поиска продуцентов фукоиданаз среди микроорганизмов. Впервые выделены: внутриклеточная фукоиданаза из штамма морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т, фукоиданаза и альгинат-лиаза из печени морского моллюска Lambis sp. Определены их основные биохимические свойства, специфичность и тип действия. Установлены структуры основных низкомолекулярных продуктов трансформации фукоидана и полигулуроновой кислоты, полученных под действием выделенных ферментов. Установлены первичные структуры двух фукоиданаз из штамма морской бактерии F. algae КММ 3553Т. Получены две рекомбинантные фукоиданазы F. algae КММ 3553Т и проведено сравнительное исследование их каталитических свойств.

Показаны особенности действия новых ферментов и возможности их дальнейшего применения для исследования структур фукоиданов и альгиновых кислот. Рекомбинантные фукоиданазы могут найти свое применение в биотехнологии, для получения сульфатированных фукоолигосахаридов, которые

имеют перспективы использования их в качестве биологически активных добавок и

лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод обнаружения фукоиданаз в бактериях применим для масштабного поиска продуцентов этих ферментов.

2. Внутриклеточная фукоиданаза (FFA), выделенная из морской бактерии F. algae КММ 3553Т, является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление аг-1—>4-0-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из Fucus evanescens.

3. Геном морской бактерии F. algae КММ 3553Т содержит два гена, кодирующих внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы.

4. Фукоиданазы FFA1 и FFA2 относятся к 107 структурному семейству О-гликозидгидролаз.

5. Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и катализируют расщепление сг-1—>4-0-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

6. Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление сг-1—>4-0-гликозидных связей ме>кду остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

7. Альгинат-лиаза из морского моллюска Lambis sp., является ферментом эндо-типа действия, и имеет редкую для альгинат-лиаз морских беспозвоночных специфичность: катализирует расщепление ог-1—>4-гликозидных связей менаду остатками L-гулуроновой кислоты. Фермент классифицирован как поли-1->4-сг^-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11).

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на:

Первом международном симпозиуме «Marine Enzymes and Polysaccharides», Вьетнам, 2012; конференции молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», Россия, 2013 и пятом Российско-Корейском форуме «The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application», Корея 2013.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из списка ВАК РФ и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций. Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей. Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуздение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 213 источников. Диссертация изложена на 141 странице и содержит 41 рисунок, 24 таблицы и 4 приложения.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю к.б.н. Кусайкину Михаилу Игоревичу за помощь в выполнении диссертационной работы. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН: проф. Т.Н. Звягинцевой, к.х.н. В.В. Сова, к.х.н.

A.M. Захаренко, к.х.н. Р.В. Меньшовой, к.х.н. М.С. Автушенко, д.х.н. С.П. Ермаковой, к.х.н. О.С. Вищук, к.х.н. Н.М. Шевченко, к.х.н. Т.И. Имбс, к.б.н. Ю.В. Дубровской, д.х.н. И.Ю. Бакуниной, н.с. М.И. Киселевой за всестороннюю поддержку и обсуждение полученных результатов в ходе выполнения работы. Автор также благодарен к.х.н.

B.В. Исакову и к.х.н. П.С. Дмитренку за получение и помощь в обработке спектральных данных; к.б.н. В.В. Куриленко и д.б.н. О.И. Недашковской за выполнение некоторых микробиологических экспериментов; к.б.н. С.Н. Ковальчук, проф. Nils Peder Willassen, Ph.D. Bjerga Gro Elin Kjasreng за помощь в проведении отдельных экспериментов в области молекулярной биологии и генной инженерии.

Сокращения и условные обозначения: а.о. - аминокислотный остаток; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДСН - додецилсульфат натрия; ПААГ-электрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле; Р.И. - рефрактометрический индекс; ЯМР-спектроскопия - спектроскопия ядерного магнитного резонанса; Gal - галактоза; FFA1 - внеклеточная фукоиданаза из морской бактерии F. a/gae; FFA2 - внутриклеточная фукоиданаза из морской бактерии F. algae; FFA1-SD - усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA1 без С концевого домена; FFA2-SD - усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA2 без С-концевого домена; FFA1-KD - усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA1 без С-концевого и кадгериноподобных доменов; FFA2-KD - усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA2 без С-концевого и кадгериноподобных доменов; Fucp - фукопираноза; MALDI масс-спектрометрия - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; Xyl - ксилоза.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз

Для обнаружения фукоиданаз в микроорганизмах нами был разработан простой метод определения утилизации фукоидана бактериями, растущими на агаризованной питательной среде.

Штаммы бактерий выращивали на стандартной агаризованной питательной среде с добавлением фукоидана из F. evanescens, затем удаляли клетки бактерий с поверхности агара и проводили его обработку раствором цетавлона. При взаимодействии цетавлона с фукоиданом образуется нерастворимый комплекс, который, выпадая в осадок, окрашивает агар в молочно-белый цвет. Фукоиданазная активность была обнаружена по формированию прозрачных зон (обедненных фукоиданом) в месте посева штаммов-продуцентов фукоиданаз (рис.1 А).

На основании проведенного ранее скрининга в качестве продуцентов фукоиданаз нами были выбраны штаммы бактерий F. algae КММ 3553Т (рис. 1, номер 4) и штамм МФ-2-3 (рис. 1, номер 2), в качестве контролем были использованы штаммы Coheasibacter sp. SF 2-8, Cytophaga sp. ZBS 33F и МФ 4-5, не продуцирующие фукоиданазы (рис. 1, номера 1, 3 и 5). Оптимальная концентрация фукоидана в питательной среде составляла 0,5 %.

Для скрининга и изучения свойств фукоиданаз мы использовали также электрофоретический метод. Результаты, полученные в агаре, были подтверждены присутствием продуктов гидролиза фукоидана, обнаруженных с помощью электрофореза в ПААГ. Этим методом было показано, что штаммы 2 и 4, выращенные на жидкой питательной среде с добавлением фукоидана, утилизировали его в процессе роста клеток (рис. 1 Б). Фукоиданазная активность также была обнаружена в клеточных экстрактах этих штаммов (2 и 4), что подтверждается образованием хорошо видимых на электрофореграмме полос фукоолигосахаридов - продуктов ферментативного гидролиза фукоидана (рис. 1 В). Метод Нельсона, который регистрирует восстанавливающие сахара и используется для определения активности О-гликозидгидролаз, не выявил присутствия фукоиданазной активности в штаммах 2 и 4. По-видимому, эти фукоиданазы расщепляют фукоидан на большие фрагменты, незначительно повышая содержание восстанавливающих Сахаров в реакционной смеси.

Разработанный нами экспресс-метод поиска продуцентов фукоиданаз менее трудоемкий, чем метод Нельсона и электрофоретический метод. Кроме того, возможности метода могут быть расширены. Например, использование фукоиданов различной структуры может дать предварительную информацию о субстратной специфичности фукоиданаз, продуцируемых исследуемыми штаммами.

•F

щ •

1 2 я Л 5

Рисунок 1 - (А)- Агаризованная питательная среда с добавлением фукоидана после обработки 1 % водным раствором цетавлона. Зоны посева штаммов: 1- Coheasibacler sp. SF 2-8;

2- штамм МФ-2-3; 3- Cytophaga sp. ZBS 33F; 4- F. a/gae KMM 3553T; 5- МФ 4-5; (Б) - ПААГ-электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана в жидкой культуральной среде; (В) - ПААГ-зпектрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана экстрактами штаммов бактерий

2 Фукоиданазы морской бактерии F. algae KMM 3553Т

По результатам скрининга среди морских бактерий в качестве продуцента фукоиданазы нами был выбран штамм 3553Т из коллекции морских микроорганизмов КММ, принадлежащей ТИБОХ ДВО РАН. Штамм морской бактерии был идентифицирован как F. algae.

Были выяснены факторы, влияющие на биосинтез фукоиданаз морской бактерии F. algae KMM 3553Т, изучена динамика роста бактерии и утилизация углеводных компонентов питательной среды различного состава. Эффективными индукторами биосинтеза фукоиданаз являлись полисахариды фукоидан и альгиновая кислота, действие которых проявлялось на самых ранних этапах роста бактерий. Для дальнейшей работы бактерии выращивали 24 ч в присутствии фукоидана.

Клеточный экстракт F. algae служил источником для выделения фукоиданазы FFA. В качестве субстрата применяли высокоочищенный фукоидан из бурой водоросли F. evanesœns. Для обнаружения сульфатированных олигосахаридов,

образующихся в результате ферментативного гидролиза фукоидана, нами был использован ПААГ электрофорез. Определение восстанавливающей способности продуктов реакции для этого фермента оказалось безрезультатным.

Фермент был выделен в гомогенном состоянии комбинацией методов

ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. По результатам ДСН-ПААГ электрофореза его молекулярная масса составила 96±1 кДа (рис. 2). Выход фермента (по белку) составил 0,0003 % от исходного содержания растворимых белков в клетке F. algae.

Изучение свойств фукоиданазы проводилось на частично очищенном препарате фермента, не содержащем других О-гликозидгидролаз. FFA проявляла ферментативную активность при рН 6,5-9 (рис. 3 А). Ионы Мд+2, Са*2 и Ва значительно активировали фермент, а присутствие ионов 6

Рисунок 2 - ДСН ПААГ-электрофорез белков из F. algae. (1) - Клеточный экстракт F. algae;

(2) - фракция белков после очистки экстракта на DEAE-MacroPrep;

(3) - маркеры молекулярной массы белков; (4) - фукоиданаза из F. algae

Си*2 и Ъх\2 оказывало выраженное ингибирующее действие на ферментативную активность (рис. 3 Б).

Изучена кинетика гидролиза фукоидана частично очищенной фукоиданазой. Образование сульфатированных олигосахаридов было заметным на электрофореграмме после 12 ч инкубирования реакционной смеси, максимальный выход продуктов ферментативного гидролиза фукоидана наблюдался через 48 ч (рис. 3 В).

А Б В

Рисунок 3 - Электрофореграммы продуктов гидролиза фукоидана фукоиданазой из F. algae: (А) - оптимум рН фукоиданазы; (Б) - Влияние ионов металлов на активность фукоиданазы, Р - реакционная смесь без добавления солей металлов, Кс - фукоидан; (В) - кинетика гидролиза фукоидана фукоиданазой FFA

Показано, что длительное (более 60 мин) выдерживание раствора фермента при температуре 45 °С заметно снижало ферментативную активность FFA, полностью

инактивировался фермент за 40 мин при температуре 55 °С и выше (рис. 4).

Фукоиданаза из морской бактерии F. algae (FFA)

катализировала гидролиз фукоиданов из F. evanescens и F. vesiculosus, состоящих из чередующихся а-1—>3- и а-1—>4-связанных остатков

сульфатированной L-фукозы, но не фукоидана из Saccharine cichorioides, построенного из а-1->3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы (таблица 1).

При исследовании

специфичности фукоиданазы в качестве субстрата был использован фукоидан из F. evanescens, который имеет преимущественно линейную структуру, построенную из повторяющихся 1—>3- и 1->4-связанных остатков a-L-фукопиранозы, сульфатированных по второму положению. Добавочный сульфат занимает в нем 4 положение в 1—>3-связанных остатках cr-L-фукозы. Фукоидан состоял преимущественно из остатков сульфатированной фукозы, молярное соотношение Fuc:Gal:Xyl:0S03' составило 1:0,03:0,01:1,2, соответственно. Для определения

Рисунок 4 - Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана фукоиданазой из F. algae, которая предварительно выдерживалась в течении различного времени (мин) при 45, 55 или 65 °С; Ks - фукоидан

специфичности фукоиданазы к типу расщепляемой им связи необходимо установить изменение соотношения сг-1—>3- и сг-1—>4-гликозидных связей в фукоидане и продуктах его ферментативного гидролиза. Определение соотношения этих типов связи проводили методом ЯМР-спектроскопии. Высокомолекулярные (ВМФ) продукты ферментативного гидролиза отделяли от низкомолекулярных (НМФ) осаждением 75 %-ным водным этанолом. Выход НМФ составил 49 %. Моносахаридные составы НМФ, ВМФ и исходного фукоидана были практически идентичны и включали преимущественно остатки фукозы. 1Н и 13С ЯМР спектры ВМФ фракции также были аналогичны спектрам исходного фукоидана. Спектры Н ЯМР фракции НМФ имели хорошее разрешение, что позволило провести сравнение интегральных интенсивностей сигналов, соответствующих Н6 остатков фукозы. 'Н ЯМР спектр фракции НМФ заметно отличался от спектров исходного фукоидана (рис. 5). Сравнительный анализ интегральных интенсивностей сигналов в области 1,24- 1,32 и 1,38-1,41 м.д., соответствующих Н6 1—>3- и 1 —>4-связанных остатков фукозы, показал, что соотношение 1—»3- и 1—>4-связей в НМФ составило 3:1. Соотношение этих типов связей в исходном фукоидане было практически 1:1. Уменьшение содержания 1-»4-0-гликозидных связей в продуктах гидролиза говорит об их расщеплении. Кроме того, в 'Н спектре низкомолекулярной фракции отсутствовал сигнал Н4, соответствующий остаткам 2,4 дисульфатированной фукозы, что может свидетельствовать в пользу расщепления 1->4-связей внутри фрагмента следующей структуры: H>3-cr-L-Fucp(20S03>1->4-CT-L-Fucp(20S03")-1->].

Таблица 1 - Специфичность фукоиданазы из F. algae

Фукоидан Степень гидролиза***, %

Фукоидан из F. vesiculosus 5,6

Фукоидан из S. cichorioides 0

Фукоидан из F. evanescens 7

F. dAc* 9,4

F. dAcS** 0,8

*F. dAc - дезацетилированное производное фукоидана из F. evanescens\ **F. dAcS - дезацетилированное и десульфатированное производное фукоидана из F. evanescens (Fuc:0S03~ = 1:0,2, моль/моль); *** - Отношение содержания Сахаров в низкомолекулярных продуктах ферментативного педролиза к содержанию Сахаров в реакционной смеси. Содержание Сахаров определяли фенол-сернокислотным методом

Фракционирование низкомолекулярных продуктов проводили на колонке с биогелем Р-6 и последующей хроматографией на колонке с биогелем Р-2. Было получено 4 фракции, только для одной из них (фракция 2) спектры имели достаточное разрешение для надежного отнесения сигналов. Выход низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза относительно общего количества Сахаров в реакционной смеси для фракций 1, 2, 3 и 4 составили 27,6, 8,3, 5,7, и 5,2 % соответственно.

Для очищенной фракции 2 были получены спектры 1Н и 13С, а также двумерные: COSY, TOCSY, НМВС и HSQC ЯМР спектры. Анализ 'Н, "С, COSY и HSQC ЯМР спектров фракции 2 показал наличие четырех различных остатков o-L-фукопиранозы (А, Б, В и Г). ЯМР спектры, полученные методами COSY, TOCSY и НМВС, позволили соотнести сигналы всех остатков фукозы в олигосахариде. Положение сульфатных групп в остатках фукозы было определено по химическому сдвигу сигналов Н2 в слабое поле Дб = 0,7 м.д. Это означает, что все остатки фукозы в олигосахариде сульфатированы по положению С2. В одном из остатков фукозы (В) был идентифицирован сигнал с химическим сдвигом 4,7 м.д., указывающим на замещение гидроксильных групп в остатках фукозы (В) сульфатными группами в положении СЗ.

Кросспик в спектрах НМВС между аномерным протоном (5,32 м.д.) остатка фукозы А и СЗ (73,9 м.д.) остатка Б, а также Н1 (5,34 м.д.) остатка В и СЗ (75,2 м.д.) остатка Г указывают на тот факт, что данные остатки связаны 1—>3-0-гликозидными связями (таблица 2). Отношение интегральных интенсивностей сигналов протонов Н1 остатков А и В составило 1:0,5. Таким образом, можно сделать вывод о том, что фракция 2 - это смесь дисахаридов ог-1--Риср(2050з')-1->3-а-1-Рис(2050з") и

a-L-Fucp(2,30S03")-1->3-CT-L-Fucp(20S03") соответственно (рис. 6).

молярном соотношении

2:1

-О-

, 4, И>\

»ги Н

ш т п

hMa

Ti М U| |

4.0

J .5

2.5

5.5 5,0 4:

Рисунок 5 - 'Н ЯМР спектры фукоидана и продуктов его ферментативного гидролиза фукоиданазой РРА. (А) - Спектр НМФ ферментативнго гидролиза фукоидана; (Б) - увеличенная область спектра НМФ ферментативного гидролиза фукоидана; (В) - спектр фкоидана ; (| ) - сигнал, соответствующий протонам фрагмента структуры: —>3-а,-1-Риср(2,40303")-1-» (Л ) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры: —>4-сг-1--Риср(20 303')-1 —>; (.Щ.) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры: —> 3-сг-1--Риср(20 303")-1 —>

Таблица 2 - Химические сдвиги (м.д.) в ЯМР спектрах фракции продуктов (фракция 2) ферментативного гидролиза фукоидана фукоиданазой РРА

Остатки фукозы 'Н / "С химические сдвиги (м.д.)

Н1 /С1 Н2/С2 НЗ/СЗ Н4/С4 Н5/ С5 Н6 1 С6

A a-L-Fucp(20S03>(1—3) 5,32/95,3 4,45/76,4 4,08/69,9 3,88/73,3 4,22/67,1 1,23/16,0

Б -»3)-cr-L-Fucp(20S03") 5,48/91,7 4,50/74,6 4,02/73,9 4,06/68,6 4,47/67,9 1,22/16,1

В a-L-Fucp(2,30S03")-( 1 —*3) 5,34/96,4 4,56/73,6 4,70/76,2 4,21/71,7 4,53/67,8 1,24/16,3

Г ^3)-cr-L-Fucp(20S03")- 5,50/91,7 4,51/74,6 4.03/75,2 4,08/70,5 4,48/67,8 1,23/16,2

OSOj"

oso3"

Рисунок 6 - Структуры олигосахаридов фракции 2, полученной ферментативным гидролизом фукоидана из F. evanescens фукоиданазой из F. algae

2.1 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз)

Данные об аминокислотных последовательностях фукоиданаз были получены в результате секвенирования нуклеотидной последовательности генома морской бактерии F. algae, выполненного в Норвежском центре структурной биологии города Тромсё. В базах данных NCBI, UniProt, TIGRFam, Pfam, PRIAM, KEGG, COG, и InterPro был проведен поиск гомологов продуктов генов, содержащихся в геноме F. algae. Результаты поиска позволили сделать вывод о наличии в геноме F. algae двух генов, кодирующих фукоиданазы (FFA1 и FFA2). Расчетные молекулярные массы продуктов генов FFA1 и FFA2 составили 111 кДа (1008 а.о.) и 97,9 кДа (890 а.о.) соответственно. Сравнение аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 посредством множественного выравнивания при помощи сервиса Clustal Omega показало 57 % их идентичности. Поиск в базе данных BLASTp (NCBI) выявил высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 с уже известной фукоиданазой FcnA из морской бактерии Mariniflexile fucanivorans (GenBank номер CAI47003.1). Идентичность аминокислотных последовательностей FcnA с FFA1 и FFA2 составила 67 % и 57 % соответственно.

Меньшая идентичность наблюдалась при сравнении аминокислотных последовательностей FFA1 и FFA2 с аминокислотными последовательностями других известных фукоиданаз: из Alteromonas sp. SN-1009 (Fda1 (GenBank AA000508.1) и Fda2 (GenBank AA000509.1)) и из Shewanella violacea DSS12 (SVI_0379 (GenBank BAJ00350.1)). Гипотетическая последовательность последней была установлена при прогнозировании функции генов по гомологии нуклеотидных последовательностей (таблица 3).

Таблица 3 - Степень идентичности известных к настоящему времени аминокислотных последовательностей фукоиданаз ЯРА!, РРА2, РспА, Рйа1, Fda2, Э\/1_0379

№ Фукоиданаза (источник) Степень идентичности, %

FFA1 FFA2 FcnA SVI 03937 Fda1 Fda2

1 FFA1 (F. algae КММ 3553) 100 57,05 56,26 21,05 18,45 19,39

2 FFA2 (F. algae КММ 3553) 57,05 100 66,77 20,30 18,22 20,00

3 FcnA (М. fucanivorans SW-5) 56,26 66,77 100 21,40 19,76 21,00

4 SVI 03937 (S. violacea DSS12) 21,05 20,30 21,40 100 31,65 30,76

5 Fda1 (Alteromonas sp. SN-1009) 18,4 18,22 19,76 31,65 100 71,18

6 Fda2 (Alteromonas sp. SN-1009) 19,39 20,00 21,00 30,76 71,18 100

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей FFA1, FFA2 и других известных фукоиданаз (рис.7), показало наличие общих для этих ферментов консервативных участков, что позволило отнести FFA1 и FFA2 к 107 семейству гликозидгидролаз (CAZy), в которое входят четыре фукоиданазы. В некоторых консервативных участках фукоиданаз обнаружены точечные замены аминокислотных остатков. Характер этих замен в молекулах фукоиданаз условно делит их на две группы, которые соответствуют специфичности ферментов. Например, в одном из консервативных участков фукоиданаз были выявлены точечные замены аминокислот Ala308 и Cys310, содержащихся в молекулах FFA1, FFA2 и FcnA, на аминокислотные остатки Gly308 и Тгр310 в последовательностях Fda1, Fda2 и SV!_03739 (рис. 7). Известно что, фукоиданазы FFA1, FFA2 и FcnA катализируют гидролиз а-1—>4-0-гликозидных связей, в то время как Fda1, Fda2 и, вероятно, SVI_03739 расщепляют ст-1—>3-0-гликозидные связи в молекулах фукоиданов. К сожалению, накопленные на сегодняшний день немногочисленные данные о структуре и каталитических свойствах фукоиданаз не дают возможность предположить функции, выполняемые этими консервативными участками: каталитические, субстрат-связывающие или др.

При помощи сервиса InterProScan обнаружено наличие сигнальной последовательности у FFA1 (Met1-Gln26), которая характерна для внеклеточных белков, в то время как у FFA2 такая последовательность отсутствовала.

Аминокислотные последовательности FFA1 и FFA2 имели в своем составе повторяющиеся кадгериноподобные (К) домены (рис. 8 А и Б). У фукоиданазы FFA1 кадгериноподобный домен К1 включал последовательность Pro428-Gly519, домен К2 - Asn533-Phe626, домен КЗ - Trp636-Glu730. У фукоиданазы FFA2 домен К1 включал последовательность Pro408-Gly509, домен К2 - Gly522-Val616 (SUPERFAMILY номер SSF49313). Похожие повторяющиеся кадгериноподобные домены были обнаружены у FcnA. Функции кадгериноподобных белков разнообразны. Отмечено участие кадгериноподобных белков, ассоциированных с клеточной стенкой бактерий, в адгезии клеток. Стоит отметить, что общими для всех описанных в литературе функций этих доменов является связывание с тем или иным биополимером при помощи ионов кальция (кальций-зависимое связывание).

Лвйвч-Яздг

F.etfr>0_FFA1 M. tucMivorem_FcfiA S v>ofac*4_$Vl_0$&77 A!tvomotm_ sp,_fitfaf

Kaltm.FfAS F.atyXLFPAI «. fuCWiiVCWQ.fblA

M4romco8S„£p_Ftte 1 A/twomonea^SiK_Fds2

F.tf&^FFAI F.ety*_FFA1 M. hicmùvrafts^FcnA S.Wb&C**_SVJJ8897 A#«romQO*s_sp _Fûe 1 Anwomones_sp_Faa2

U. tlX&nhv,-m8_Fcri4

$. vtQl4cea_ sv/_039$r

Afatf&T>On*S_SP _FOs 1 AH»mmon0s_sf>._Föe2

F.atyK>_FFA2 F.tttyf^FFAI U flK9nM>/mS_FC.nA $. vtc!9C«a_SVl_03&3? A/f«fotnoo6s_3/x_F0a1 A№omof&s_ap._Fita2

Рисунок 7 - Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей фукоиданаз из F. algae КММ3553 (FFA1, FFA2), М. fucanivorans SW5 (FcnA), Alteraminas sp.

SN-1009 (Fda1 и Fda2), Shewanella violacea DSS12 (SVI_03739); (*) - точечные замены a.o. в консервативных участках

Известно, что фукоиданы и другие анионные полисахариды в водорослях содержатся именно в виде кальциевых солей. Возможно, что по этому механизму происходит связывание фукоиданазы непосредственно с субстратом или связь самих бактерий, продуцирующих фукоиданазу, с поверхностью клеток водорослей, являющихся объектом их питания. С-Концевые участки FFA1 (Leu940-Arg1007) и FFA2 (Leu822-Arg889) составляли высококонсервативный домен, включающий 68 аминокислотных остатков. Эти участки демонстрировали высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей (от 26 % до 41 %) с С-концевыми доменами различных белков, в основном, гликозидгидролаз и протеиназ, синтезируемых бактериями типа Bacterioidetes, в частности представителями родов Porphyromonas, Cytophaga, Zobellia, Flavobacterium, Microscilla и Rhodothermus (рис. 8).

Таким образом, в аминокислотной последовательности исследуемых нами фукоиданаз (FFA1 и FFA2) присутствуют все домены, ранее найденные в структуре

160 160 170 180 190 ^ ^ 200

|Vg|aSPvÎvSPVHTA|HPL L§RLV\€GDLCPo£kP I N|vv|RASAP|Ppl.CVW.|il Kjp11Ô :LP|tSPNI PSPIHVgIhSL ||sPWEGDT0ANG0P)m|AV|RE$v0|pi LSWLK^L Rift 137 ILPITSPN I FSPTHVaIhP I liSLVyQGOTDANGDPINiVA|RESVDb;PLtSVVLK^LR^A140

FM|SDA-AHGOAVLApSI LTTLMPOST- -PMAD..........K|u|öELA!|pHpHe

230

270

120 §LKTEV|VNSAHL - .SeWElFC.....TPIS..........EFSÖFae-RViKAYioTDPTMaiF t ESlPiHKOGVKm

13в ÖLKAE I IvNSYNL - - §AR I PÊ......E>TQE..........OYIDVSE - WAMEV\|DT|PE AQÄF 1 ASÖDFHEG.

141 IlRTEIIvNSYNL --gARIpf......t>TOA..........OYIdIIa - RSAMEvJoTÎlt6AC>|F » Ы8|т|НЕС •

119 l'ivi aIaatcxîpamÉkhgAayafdgvqd....................anohwssksmtn*$kwvtnk|gsa - •

129 imvVÀil AiaGPGwiKHGAÊNSMDEOps I T......OCKSSKpL VTDLOTQVY|SANMWRVS«DYVLeQ|PST -

1« ilKYVAil ATQGPAw1kHGA6RSMDF00S i VOESOGSACKSSRgVVSDPOTQvYßSANMMRSWOYVtQQ!|P3T - -

178 ddrrpVmfcyabfvlkeyai

192 DGRRKYMFC YA6f||lK£ Y At 196 NGRRKVMFCYAEF|lkEYA< 172 . SDDMYKKAYAEw| I AEYAi 19« .slyrsfelamvnIvetlsl 268 -SLHHSFQLGUVnIyETLSL:

360

370

320

330

340

ÎAAHVN - MGA A^O Y STGO I DTQRVF QAÊ isAON I MECEC^pOP ASOO I DOOR I YQAF AI [SAONVMEDEciioPASEOVNOQR! YQAF At

CAN............I PLLHI

FM............SELL

YK............YNLLPDISAR

400

410

2S3 NGIGDRDSDPFVPYVTPSLF

269 NSVGOREGNPFT---TATYFDl

2T1 NSVGOREGNPFT-- - SATLFOj

229 KGQKV......PLI NNNPGYEj

253 EGOKV......PLVNNP6TLD!

322 LEGDI......F LSNNPEVMEj

iPCLTDEEFVj PCLTDDQFVI jPClTOeOFYI lsvwplskaV

?$GAGNMVEPROPLYTVNFGICEYt*ROT IF GGAGNMVENE-TLYGYMFGVI EVNWODY-É FGGAGNMVVPE-ALYTYNHOlVVFMQTN-|f

ItPLRRSTVSND IN.....LPWVESI €AS$||

PIGSEVSSODKN.....LP«LTSlEATLDj

¡7PIÄRVVSSDDTN.....LPMLTA I EOAPÜ

420

430

(HPYTNDD I DV.N0NVVAH327 SAFL000RTVW0HVV8H338 ÎY A F ROOT RTVW-iÖN'V» V AH341 SY- -VD-OGAGMK$LGHM290 II . .LTGSGD0VGS^GHM316 jl - -FTGTG0DV0ALGHM3&Î

480

490

IN VGL I SKGI I Djg STGI ITRVNNACi

GTPLVlfWLNNASANLipO--РУ - -ALR--0L1LVOA397

IGT PL I RTNLEN9 - PVL "Г |R • -OY- - AVT - - ÖF ELTDA407 ¡GTPLVRTNLENA-PVL§1Q- - PY- - AlN - -äFgLT0T4i0 NVATQD|NSKLA0HA||FMN0VTAKI IS----NGGTR359

-|vVF3EAKGSofLNRALKA^AF|^ALSQOSNOeLGGGG- ARll SEPQVKML ERMSFN I GKQ3Ö7 tG|-lvvFSEAKGT6§LNRVTRAISöALi»ALSHEG. -SVSGGE -AM:|l SAPQAKML ARMQLN f GKQ454

FcnA, что может быть объяснено таксономической близостью организмов продуцентов.

«dhaasnsfe*»

_К1-K2^JO_

»и**-™"™»-»_J^ ап

вяза sssu inss, ebbs

SEefliliiiiTT

J2_

(£&» R& BBS« ESS

InttrPioScart (vci Sivuti««: CAI<7i:C U>Wh lbCi CRCM: J3I JA$WU?302

'«rourogloCH.Iin-iik« ?c

Cadhprin-lii K1 K2 КЗ

Stem ¡а: sum C-umlr с

•CkAlf |1>l'lill BCiNEiU

IIII »я Omlirtii Ih* Еилдоэп MeleasUf Ubotttiyy-

Рисунок 8 - Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз FFA1 (A), FFA2(E) из F. algae КММ 3553Т и FcnA (В) из М. fucanivorans при помощи сервера InterProScan. К1-, К2-, КЗ- кадгериноподобные домены фукоиданаз. С - С-концевые домены фукоиданаз, СИ- сигнальная последовательность фукоиданазы FFA1

2.2 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae КММ 3553Т

Для подтверждения прогнозируемой функции генов FFA1 и FFA2 морской бактерии F. algae были получены рекомбинантные продукты этих генов. С целью определения функции того или иного домена были получены 6 генетических конструкций по три для каждой из фукоиданаз FFA1 и FFA2. В качестве вектора использовалась плазмида pCold-Tev II (разработанная и любезно предоставленная Норвежским центром структурной биологии). Генетические конструкции содержали нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные фукоиданазы FFA1 и FFA2, а также их усеченные производные FFA1-SD и FFA2-SD без С-концевого домена и FFA2-KD и FFA1-KD без повторяющихся последовательностей кадгериноподобных доменов. Все конструкции содержали нуклеотидную последовательность, кодирующую полигистидиновый участок (6*His) и участок для расщепления Tev-протеазой. В качестве систем экспрессии генов FFA1 и FFA2 были использованы коммерческие штаммы Е. coli: BL21 star (DE3)pLysS, Rosetta-gami (DE3)pLysS, BL21 (DE3)GroEL. Практически все рекомбинантные белки: полноразмерные фукоиданазы (FFA1, FFA2) и их усеченные производные (FFA1-SD,

FFA2-SD) экспрессировались в растворимой форме. Исключение составляли усеченные производные FFA1-KD и FFA2-KD, которые экспрессировались как в виде телец включений, так и в растворимой форме. Наилучшим штаммом-продуцентом рекомбинантных фукоиданаз был штамм Е. coli BL21 star (DE3)pLys. Наибольшее содержание целевых рекомбинантных белков для всех исследованных штаммов наблюдалось при температуре культивирования +20° С.

Обе полноразмерные рекомбинантные фукоиданазы и все их усеченные производные катализировали расщепление фукоидана (рис. 9 А). Фукоиданазная активность рекомбинантных ферментов, так же как и нативного, проявлялась только в присутствии некоторых ионов двухвалентных металлов. Это дает основание предположить, что фукоиданазы, синтезируемые морской бактерией F. algae, являются металлозависимыми. Наличие фукоиданазной активности у усеченных производных рекомбинантных фукоиданаз FFA1-SD и FFA2-SD указывает на то, что С-концевой домен, вероятно, не участвует в каталитическом акте. Фукоиданазы FFA1-KD и FFA2-KD также обладали способностью гидролизовать фукоидан, однако в значительно меньшей степени (рис. 9 А). Возможно, подобная модификация белков приводила к уменьшению способности связываться с молекулами субстрата. Аналогичный результат мог быть получен за счет уменьшения устойчивости молекулы, если кадгериноподобные домены играли стабилизирующую роль. Функция, выполняемая кадгериноподобными доменами, входящими в состав структуры фукоиданаз, остается неизвестной.

Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 были очищены до гомогенного состояния. Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на ферментативную активность фукоиданаз FFA1 и FFA2 показало, что наиболее эффективными активаторами для обоих ферментов служили ионы Са2+ и Ва2*, ионы Мд2* активировали фукоиданазы в меньшей степени. Ионы Со2* и Мп2* являлись активаторами фукоиданазы FFA2, но не активировали FFA1. Ионы Zn2+ и Си2\ в отличии от ионов Са2* и Ва2*, не активировали фукоиданазы (рис. 9 Б). Оптимальными для проявления ферментативной активности фукоиданаз были рН 6,5 - 8 для FFA1,6,5-9 для FFA2.

Рисунок 9 - Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоидана из Р. еуалезселБ рекомбинантными фукоиданазами: А - РРА1 (1), (2), РРА1-ЭО (3), РРА2-30 (4), РРА1-КО (5), РРА2-КО (6); Р- продукты гидролиза фукоидана фукоиданазами (1-6); Кс - смесь фукоидана и денатурированных фукоиданаз (1-6); Б - Влияние ионов двухвалентных металлов на активность фукоиданаз РРА1 и РРА2

Специфичность рекомбинантных фукоиданаз была изучена на серии фукоиданов различной структуры (рис. 10). Оба фермента с высокой скоростью гидролизовали фукоидан из Р. еуапевсепв, цепь которого построена из чередующихся а-1 _>3- и а-1-»4-связанных остатков сульфатированной фукозы. Фукоиданы из Э. с/сЛоло/с/ев и ипбапа рюпаШа, содержащие в своем составе о1->3-связанные остатки сульфатированной 1_-фукозы, ферментативному гидролизу не подвергались.

FFA1

:1.4

Ко

Н'Л!

М-Л2

Ь.е Ц.рГ'.е$.с Ц.р Ь'.е V{

Рисунок 10 - Электрофореграмма продуктов гидролиза фукоиданов из Я е\/апе$сепз (Р.е), 5. с/с/юло/йез

(Э.с), и. р1ппа№йа (и.р) рекомбинантными фукоиданазами РРА1 и РРА2; Кс - фукоиданы

С помощью рекомбинантной фукоиданазы РРА2 был гидролизован фукоидан из Я. еуапевсепз и получены сульфатированные фукоолигосахариды. Высокомолекулярные продукты реакции (ВМФ) отделяли от низкомолекулярных (НМФ) осаждением 75% этанолом. Выход НМФ составил 55%. НМФ разделяли ионообменной хроматографией (рис. 11), полученные фракции анализировали при помощи ЯМР-спектроскопии. Выход фракции 1 составил 12,9 % относительно общего содержания Сахаров в реакционной смеси. 20 ЯМР спектры фракции 1 содержали четыре кросспика в аномерной области, соответствующие четырем типам остатков а-фукопиранозы А, Б, В и Г. Три кросспика на спектрах НМВС фракции 1 позволили определить тип гликозидных связей (1—>3- или 1—>4-) между этими остатками а-1_-фукопиранозы: Н1(А)/СЗ(Б) при 5,35/73,5 м.д., Н1(Б)/С4(В) при 5,29/83,8 м.д. и Н1(В)/СЗ(Г) при 5,34/73,9 м.д. Анализ спектров НБОС показал наличие сульфатных групп в положении 2 всех остатков фукозы: Н2/С2 при 4,47/76,6 (А), 4,60/74,7 (Б), 4,49/76,7 (В) и 4,52/74,7 (Г) м.д. Таким образом, основным компонентом фракции 1 является сульфатированный линейный тетрасахарид (рис. 12, таблица 4).

Исследование кинетики накопления продуктов ферментативного гидролиза полисахарида позволяет установить тип и особенности механизма действия ферментов. Гидролиз фукоидана фукоиданазами (при данной концентрации белков) останавливался после 24 ч инкубирования. Дальнейший гидролиз субстрата проходил только при добавлении новых порций ферментов, что свидетельствует о возможном ингибировании фукоиданаз конечными продуктами ферментативной реакции или, что более вероятно, потере активности ферментов при длительном инкубировании.

Анализ кинетики расщепления фукоидана из Р. еуапевсепз рекомбинантными

фукоиданазами РГА1 и РГА2 с помощью гель-проникающей хроматографии

(рис. 13) показал значительное уменьшение молекулярной массы фукоидана в течение реакции. В действии двух исследуемых ферментов имеются отличия. Внутриклеточная фукоиданаза РРА2 катализировала гидролиз фукоидана с большей скоростью: низкомолекулярные продукты хорошо заметны через 1 ч после начала реакции, в то время как при действии внеклеточной фукоиданазы РРА1 низкомолекулярные продукты надежно детектировались только спустя 3 ч. При действии

2 1,2

0.8

0,6

0,4

30 40 50 60 70 КО ооъсм.

Рисунок 11 - Анионообменная хроматография НМФ на колонке с носителем ОЕАЕ-ЗерИагове

ферментов на фукоидан образуется набор сульфатированных фукоолигосахаридов, имеющих различные молекулярные массы. Обе фукоиданазы РРА1 и РРА2 проявили свойства эндо-ферментов. Однако основные продукты гидролиза фукоидана фукоиданазами РРА1 и РРА2 имели различия в молекулярных массах. Так, время удерживания на колонке основного пика продуктов реакции РРА1 составило 36,02 мин (молекулярная масса около 5 кДа), а для РРА2 37,25 мин (молекулярная масса

меньше 4 кДа). Сульфатированная фукоза в продуктах в обоих случаях обнаружена не была.

Таблица 4 - Химические сдвиги (м.д.) в ЯМР спектрах низкомолекулярных фракций продуктов (фракции 1) ферментативного гидролиза фукоидана фукоиданазой РТА2

Остатки фукозы 1Н/ "С химические сдвиги (м.д.)

Н1 /С1 Н2/С2 НЗ/СЗ Н4/С4 Н5/С5 Н6/С6

A a-L-Fucp(20S03')-( 1 —3)- 5,35/95,0 4,47/76,6 4,11/68,8 3,89/73,2 4,51/68,0 1,25/16,8

Б —»3)-a-L-Fucp(20S03> (1-4)- 5,29/100,6 4,60/74,7 4,18/73,5 4,12/70,0 4,41/68,6 1,26/16,5

В —4)-or-L-Fucp(20S03> (1-3)- 5,34/95,3 4,49/76,7 4,19/69,0 4,00/83,8 4,52/68,9 1,39/16,6

Г —3)-or-L-Fucp(20S03") 5,49/91,8 4,52/74,7 4,05/73,9 4,08/69,9 4,23/67,1 1,24/16,7

Фракция 1

oso; oso. oso; oso,

1 i i i 2 2 2 a-L-Fuc^-(l—>3)-a-L-Fuc/>-(l->4)-a-L-Fucp-(l->3)-a-I,-Fuc^

Рисунок 12 - Структура основного олигосахарида фракции 1, полученной ферментативным гидролизом фукоидана из F. evanescens рекомбинантной фукоиданазой FFA2

Полученные данные свидетельствуют о том, что гидролиз фукоидана фукоиданазой FFA2 проходит с образованием более низкомолекулярных олигосахаридов, по сравнению с FFA1, что вполне согласуется с известными фактами. Считается, что некоторые внеклеточные ферменты проводят «предварительное» расщепление крупных молекул субстрата для проникновения их в клетки, а затем полученные фрагменты расщепляются на более мелкие продукты внутриклеточными ферментами.

Рисунок 13 - ВЭЖХ продуктов гидролиза, полученных при различном времени инкубирования фукоидана из Я evanescens и рекомбинантных фукоиданаз РРА1 и РРА2

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и специфичны к гидролизу а-1—>4-0-гликозидных связей в молекуле фукоидана из F. evanescens. Нужно отметить, что свойства и специфичность фукоиданазы FFA2 близки свойствам нативной фукоиданазы (FFA), выделенной из клеточного экстракта F. algae.

3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp.

Фукоиданаза была выделена из печени морского брюхоногого моллюска Lambis sp. Экстракт печени моллюска содержал большое количество ферментов, катализирующих гидролиз поли- и олигосахаридов.

Схема выделения фукоиданазы из Lambis sp. включала 7 стадий очистки с применением классических методов хроматографии белков (таблица 5). Гомогенная фукоиданаза была выделена с выходом 0,75 %. По результатам ДСН-ПААГ электрофореза молекулярная масса фукоиданазы составила 50±1 кДа (рис. 14).

В качестве субстрата нами был использован фукоидан из F. evanescens. Для регистрации ферментативной активности использовали методы Нельсона и электрофореза в ПААГ.

Были изучены основные каталитические свойства фермента. Оптимальными условиями для проявления ферментативной активности фукоиданазы были рН 5 и температура 45 °С, что характерно для ферментов из беспозвоночных. Время полуинактивации фермента (снижение активности на 50%) составило 20 мин при 50 °С.

Таблица 5 - Схема выделения фукоиданазы из печени Lambis sp.

Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ед. Удельная активность, ед./мг белка Степень очистки, раз Выход, %

Экстракция 1443 37,4 0,026 1 100

Осаадение сульфатом аммония (фракция 80 % насыщения) 198 13,6 0,069 2,6 36

Гидрофобная хроматография на Phenyl Sepharose 6 fast flow 24,6 5,2 0,211 8,1 14

Гель-фильтрация на Sephacryl S-100 4,88 1,3 0,280 10,8 4

Ионообменная хроматография на DEAE-MacroPrep 1,74 0,56 0,327 12,6 1,5

Ионообменная хроматография на СМ-МасгоРгер 0,8 0,53 0,666 25,6 1,4

ВЭЖХ на колонке TSK gel G2000 SW 0,11 0,28 2,571 99,0 0,75

Фукоиданаза из Lambis sp. увеличивала свою активность в присутствии ионов Са2+ и Ba2t, ионы Мд2* не влияли на активность фермента, а ионы Cu2+, Zn2* и Hg2t оказывали ингибирующее действие. Вероятно, ионы металлов не входят в активный центр фукоиданазы, поскольку добавление в раствор фермента натриевой соли ЭДТА не влияло на уровень её активности.

Кинетика накопления низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза фукоидана из F. evanescens была изучена при помощи электрофореза в ПААГ. Образование сульфатированных олигосахаридов наблюдалось на электрофореграмме спустя 30 мин инкубирования реакционной смеси, максимальный выход продуктов ферментативного гидролиза фукоидана наблюдался через 48 ч (рис. 15). Специфичность действия фукоиданазы была изучена с использованием фукоиданов различной структуры, а также их химических производных. Было показано, что фукоиданаза расщепляла фукоиданы из F. evanescens и F. vesiculosus, содержащие а-1—>3- и а-1—>4-связанные остатки сульфатированной or-L-фукопиранозы. Фукоидан, выделенный из S. cichorioides, который состоял из

-4-100

cr-1 —»3-связанных остатков сульфатированной L-фукопиранозы, не подвергался ферментативному гидролизу (рис. 16).

4-350 Фукоиданаза была специфична к расщеплению

ст-1—»4-О-гликозидных связей в молекулах фукоиданов. Дезацетилированные и десульфатированные производные фукоидана из F. evanescens подвергались ферментативному гидролизу с большей скоростью по сравнению с исходным фукоиданом (таблица 6). По-видимому, наличие объемных заместителей при остатках фукозы в молекуле фукоидана уменьшает количество доступных для расщепления участков и вероятность образования продуктивного фермент-субстратного комплекса. С более низкой скоростью фермент гидролизовал фукоидан из F. vesiculosus по сравнению с фукоиданом из F. evanescens, что может быть связано с различиями в их структурах, например, расположением сульфатных групп или других заместителей. Другая причина - наличие в составе коммерческого препарата фукоидана из F. vesiculosus фирмы «Sigma» примесей анионных полисахаридов различной структуры, часть из которых, по-видимому, не подвергается ферментативному гидролизу. Для подтверждения специфичности выделенного фермента и для установления типа действия фукоиданазы были получены и выделены продукты ферментативного гидролиза фукоидана. Анализ суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (НМФ), полученной после осаждения высокомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (ВМФ) 75 % раствором этанола в воде, проводили при помощи ЯМР-спектроскопии.

Рисунок 14-ДСН ПААГ-электрофореэ очищенной фукоиданазы из печени ЬатЫв эр. (1) - маркеры молекулярной массы

белков, кДа; (2) - фукоиданаза из печени /.атЬ/я эр.

Кс Р

Рисунок 15 - Кинетика гидролиза ..к

фукоидана фукоиданазой из /.атйй Бр.; '* * • чй»»! т .*>

Кс - фукоидан Рисунок 16 - Электрофореграмма продуктов

гидролиза фукоиданов (Р) из Р. еуапе$сеп$ (Р.е, Рс1Ас - дезацетилированное производное), асЬопоШеь (Эх), Р. уеж^огиз фукоиданазой из печени /.атб/ззр.; Кс - фукоиданы

Выход НМФ составил 73%. Был проведен анализ 1Н-ЯМР спектров исходного фукоидана и суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза (НМФ) (рис. 17).

Фукоидан Относительная активность, %

Фукоидан из F. evanescens 100

F. dAc* 137

F. dAcS" 279

Фукоидан из F. vesículosus 27

Фукоидан из S. cichonoides 0

*F. dAc - дезацетилированное производное фукоидана из F. evanescens; **F. dAcS - дезацетилированное и десульфатированное производное фукоидана из F. evanescens (Fuc:0S03" = 1:0,2, моль/моль)

Сравнение интегральной интенсивности сигналов при 1,24-1,32 и 1,38-1,41 м. д., соответствующих протонам при Н-6 а-1-»3- и а-1—>4-связанных остатков фукозы, показало, что соотношение а-1->3- и а-1->4-связей в суммарной фракции низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза составило 2:1 (рис. 17). Соотношение этих типов связей в исходном фукоидане было практически 1:1. Таким образом, уменьшение количества сг-1->4-связей говорит об их расщеплении, а отсутствие сульфатов в 4 положении при сг-1-»3-связанных остатках фукозы в НМФ позволяет заключить, что расщепление идет внутри повторяющегося структурного фрагмента [->3-a-L-Fucp(20S03")-1->4-a-L-Fucp(20S03")-1->] молекулы фукоидана.

ДА

A W / V,.....

1,53 1.50 1,45 1.40 1.35 1,30 1,25 1.20 1.15 м.д. *

JLf-l-

5,5 5.0 4,5 .1,0 3,5 3.0 2,5 2.0 1,5 1.0 «.д. Рисунок 17 - 'Н ЯМР спектры продуктов гидролиза фукоидана фукоиданазой из Lambis sp.

(А) и фукоидана (Б) 'Н ЯМР спектры фукоидана и продуктов его ферментативного гидролиза фукоиданазой из Lambis sp. (А) - Спектр НМФ ферментативнго гидролиза фукоидана;

(Б) - увеличенная область спектра НМФ: (В) - спектр фкоидана; ( +) - сигнал, соответствующий протонам фрагмента структуры; -»3-a-L-Fucp(2,40S03")-1->; (4Ц) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры: -^4-cr-L-Fucp(20S03")-1->; (.Щ) - область сигналов, соответствующая протонам фрагмента структуры: —>3-or-L-Fucp(20S03')-1-»

Для установления структуры образовавшихся олигосахаридов низкомолекулярные продукты реакции (НМФ) были разделены с помощью анионообменной хроматографии (рис. 18). Выход низкомолекулярных продуктов ферментативного гидролиза относительно общего количества Сахаров в реакционной смеси для фракций 1, 2, 3, 4 и 5 составил 3,6; 4; 5,4; 13,7; 15,8 % соответственно.

1Н и 13С ЯМР спектры фракций 3, 4 и 5 имели достаточное разрешение для детального изучения структуры олигосахаридов, входящих в их состав.

На спектрах COSY и TOCSY фракции 3 наблюдались два кросспика в аномерной области, что указывает на наличие двух типов остатков a-фукопираноз (А и Б) в молекуле. Анализ НМВС спектров фракции 3 показал, что остатки фукозы А связаны по положению СЗ с остатками Б (кросспик Н1(А)/СЗ(Б) при 5,33/74,1 м.д.). Анализ

спектров HSQC показал наличие сульфатных групп в положении С2 остатков А и Б (кросспики в слабом поле Н2/С2 при 4,47/76,4 и при 4,52/74,7 м.д. соответственно).

По результатам анализа спектров ЯМР можно сделать вывод о том, что фракция 3 содержит в основном дисахарид (рис. 19). Химические сдвиги этого дисахарида представлены в таблице 7.

Кросспики, соответствующие пяти различным типам остатков

йг-фукопиранозы (А", Б", В", Г" и Д"), были обнаружены в аномерной области 2D ЯМР спектров фракции 4. Остатки фукопиранозы отличались типами гликозидных связей, а также положениями заместителей. На спектрах НМВС присутствовали сигналы с химическими сдвигами, характерными как для сг-1—»3-, так и для сг-1—4-связанных остатков L-фукопиранозы (кросспики Н1(А")/СЗ(Б") при 5,29/77,2 м.д., Н-1(Б")/С-4(В") при 5,35/83,9 м.д.,

I 1.4 о ? 1,2

~ i

О 1

0,8 0,6 0,4' 0,2 (I;

J.2> ш

0 10 20 30 40 50 60

70 80 90 объем, мл Рисунок 18- Анионообменная хроматография НМФ на колонке с носителем DEAE-MacroPrep Н1 (В")/С4(Г") при 5,34/73,9 м.д Н1(Д")/С4(Б") при 5,49/79,6 м.д.). Наличие кросспиков в слабом поле, соответствующих Н2/С2 при 4,47/76,9 (А"), 4,73/75,1 (Б"), 4,47/76,7 (В") и 4,52/74,7 (Г") м.д. в спектрах HSQC, указывает на присутствие сульфатных групп в положении 2 этих остатков. На основании полученных данных можно предположить, что основным компонентом фракции 4 является разветвленный сульфатированный пентасахарид (рис. 19, таблица 7).

Структура фракции 5 была установлена с помощью одно- и двумерной спектроскопии ЯМР ('Н, 13С, COSY, HSQC, НМВС) (таблица 7). Она полностью совпадала со структурой фракции 1 (рис. 12), полученной при действии на фукоидан рекомбинантной фукоиданазы FFA2 из F. algae.

Таблица 7 - Химические сдвиги (м.д.) в ЯМР спектрах низкомолекулярных фракций продуктов

Фракция/остаток 1Н/ JC химические сдвиги (м.д.)

Фракция 3 Н1 /С1 H2/C2 НЗ/СЗ Н4 / C4 Н5 / С5 Н6/С6

A o-L-Fucp(20S03')-(1—3)- 6,33/95,4 4,47/76,4 4,02/68,5 3,89/73,3 4,46/68,1 1,23/16,6

Б ->3)-a-l-Fucp(20S03) 5,49/91,7 4,52/74,7 4,02/74,1 4,06/70,0 4,22/67,1 1,24/16,6

Фракция 4

A" a-L-Fucp(20S03'H1—3)- 5,29/98,7 4,47/76,9 4,20/68,6 3,89/73,5 4,54/68,2 1,25/16,7

Б" —3.4)-o-L-Fucp(20S03')-(1-4). 5,35/100,6 4,73/75,1 4,03/77,2 4,24/79,6 4,47/68,6 1,23/16,5

В" —4)-cr-L-Fucp(20S03> (1-3)- 5,34/95,3 4,47/76,7 4,19/68,9 4,00/83,9 4,45/70,5 1,39/16,9

Г" —>3)-Gr-L-Fucp(20S03") 5,49/91,8 4,52/74,7 4,14/73,9 4,01/69,9 4,23/67.1 1,24/16,6

Д " o-L-Fucp-(1-.4) 5,49/100,1 3,82/73,5 4,05/70,6 3,84/70,7 4,27/68,0 1,37/17,2

Фракция 5

A' a-L-Fucp(20S03>(1—3)- 5,35/95,0 4,47/76,6 4.11/68,8 3.89/73,2 4,51/68,0 1,25/16,8

Б' -»3)-a-L-Fucp(20S03')-(1-4)- 5,29/100,6 4,60/74,7 4,18/73,5 4,12/70,0 4,41/68,6 1,26/16,5

В' —>4)-a-L-Fucp(20S03*)-(1-3)- 5,34/95,3 4,49/76,7 4,19/69,0 4,00/83,8 4,52/68,9 1,39/16,6

Г —3)-a-L-Fucp(20S03-) 5,49/91,8 4,52/74,7 4,05/73,9 4,08/69,9 4,23/67,1 1,24/16,7

Фракция 3

Л S

yso, oso.

2 2

А" oso,

Фракция 4

В" li-

oso, oso,

—il-u-l-fiK/)

Г f>

I Л'ис/Н I

Л'

oso,

Фракция 5

lioso; t

В'

oso.

os о

i '

Рисунок 19 - Структура олигосахаридов фракций 3, 4 и 5, полученных ферментативным гидролизом фукоидана из F. evanescens фукоиданазой из Lambis sp.

Установление N-концевой аминокислотной последовательности гомогенной фукоиданазы методом Эдмана не было успешным из-за заблокированной ЫНг-группы N-концевой аминокислоты. Были установлены аминокислотные последовательности некоторых внутренних пептидов фукоиданазы, полученных при действии трипсина, методом MALDI масс-спектрометрии. Поскольку пептиды оказались короткими, создать специфические праймеры для поиска гена, кодирующего фукоиданазу в Lambis sp., не удалось. Работа по установлению первичной структуры фукоиданазы из Lambis sp. будет продолжена.

4 Алыинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp.

Часть наших исследований была посвящена поиску новых альгинат-лиаз из морских организмов. Экстракты из клеток морской бактерии F. algae и печени морского моллюска Lambis sp. анализировали на присутствие альгинат-лиаз. В качестве субстрата использовали полигулуроновую кислоту. Активность определяли методом Нельсона. Удельная активность альгинат-лиаз в экстракте печени Lambis sp. была на порядок больше, чем в клеточном экстракте F. algae (0,08 ед/мг для Lambis sp. и 0,006 ед/мг для F. algae). Поэтому для детального изучения свойств альгинат-лиазы в качестве источника был выбран морской моллюск Lambis sp. Из печени Lambis sp. была выделена альгинат-лиаза, гомогенная по данным ДСН ПААГ-электрофореза. Схема очистки представлена в таблице 8. Молекулярная масса выделенной альгинат-лиазы по результатам ДСН ПААГ-электрофореза составила 31±1 кДа (рис. 20).

Таблица 8 - Схема выделения альгинат-лиазы из печени Lambis sp.

№ Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ед. Удельная активность, ед./мг белка Степень очистки, раз Выход, %

1 Экстракция 1443 111,21 0,08 1 100

2 Осаждение сульфатом аммония 82 57,79 0,33 4 51,97

3 Гидрофобная хроматография на Phenyl Sepharose 6 fast flow 59 22,69 0,92 12 20,41

4 Гель-фильтрация на колонке с Sephacryl S-100 4.8 7,48 1,36 17 6,73

5 ВЭЖХ на колонке TSK gel G2000 SW 0.58 2,29 1,98 25 2,08

1 кДа 2

—1'П

Рисунок 20-ДСН ПААГ-электрофорез очищенной

альгинат-лиазы из печени морского моллюска LamЫs ер. (1) - маркеры молекулярной массы белков, кЦа; (2) - очищенная альгинат-лиаза из печени LamЫs гр.

Максимальную активность альгинат-лиаза из LamЫs эр. проявляла при рН 5,0 (рис. 21 А) и температуре 40-55 "С (рис. 21 Б). Оптимум рН оказался нетипичным для альгинат-деградирующих ферментов из морских беспозвоночных, которые в основном проявляли активность в нейтральной или слабощелочной областях рН. Альгинат-лиаза обладала

устойчивостью к действию температуры, время ее полуинактивации составило 20 мин при 63 °С (рис. 21 В).

Показано, что ионы К* и №* в низких концентрациях (0,12 М) увеличивали

ферментативную активность, однако высокие концентрации солей вызывали ингибирующий эффект (рис. 21 Г)- Ионы Ва2* и Са2* увеличивали ферментативную активность, в то время как ионы Си2* и Нд2* заметно её снижали.

100

о 60

X Щ 40

1 < 20

ео 70 80 температура, °С

0,2 0,4 0,6 0,8 1 концентрация, М

Рисунок 21 - Каталитические свойства альгинат-лиазы из печени ¿.атй/'г эр.: А - рН-Оптимум апьгинат-лиазы. (О) - 0,025 М сукцинатный буфер; (♦) - 0,025 М трис-НС1 буфер);

Б - Температурный оптимум альгинат-лиазы; В - Температурная стабильность альгинат-лиазы;

Г - Влияние ионов К* ( ■ ) и Ыа* (О ) на ферментативную активность альгинат-лиазы

Специфичность альгинат-лиазы устанавливали с помощью серии субстратов различной структуры. Выделенный фермент с высокой скоростью расщеплял полигулуронат натрия, в то время как альгинат натрия, выделенный из 5. дио'алоуае, состоящий преимущественно из остатков маннуроновой кислоты, подвергался ферментативной деградации в меньшей степени (таблица 9). Данный факт указывает на специфичность альгинат-лиазы из ¿атЬ/э ер. к участкам альгиновых кислот,

построенным из остатков гулуроновой кислоты, что позволяет классифицировать данный фермент как поли-1—>4-ог-1--гулуронат-лиазу (КФ 4.2.2.11). Таблица 9 - Субстратная специфичность альгинат-лиазы из ¡.атЫь ер.

Субстрат Активность, %

Полиманнуроновая кислота из Р. еуалезселг 0

Полигулуронозая кислота 100

Альгановая кислота из 5. дицапоуае 41

Специфичность и механизм действия фермента подтвердили спектры 'Н ЯМР исходного полигулуроната натрия и продуктов его ферментативного расщепления (рис. 22), На спектрах продуктов наблюдается появление сигналов при 5,85 и 5,20 м.д., соответствующих Н4 и Н1 модифицированного остатка гулуроновой кислоты, имеющего двойную связь на невосстанавливающем конце олигосахаридов, что говорит о механизме расщепления полисахарида ферментом по типу /3-элиминирования. В спектре были идентифицированы сигналы с химическими сдвигами 5,03 и 4,88 м.д., соответствующие Н1 остатков гулуроновой кислоты, которые включены в основную цепь и находятся на восстанавливающих концах молекул олигоуронатов. Следует отметить, что ферменты аналогичной специфичности были найдены в бактериях и морских водорослях. К настоящему времени известна только одна полигулуронат-лиаза, выделенная из представителя морских беспозвоночных - моллюска НаНоИй ги1езсеп$.

5,0 4,5

химический СДВИГ, М.Л.

3.5

Рисунок 22 - 1Н ЯМР спектры продуктов расщепления полигулуроната натрия альгинат-лиазой из печени ¡.атЬй эр. (А) и полигулуроната натрия (Б)

При исследовании состава продуктов исчерпывающего ферментативного гидролиза полигулуроновой кислоты методом МАШ1 масс-спектрометрии обнаружили олигоурониды со степенью полимеризации п = 2-5 (рис. 23). Таким образом, проведенное исследование показало, что в печени морского моллюска 1атЫв Бр. содержится альгинат-лиаза редкой субстратной специфичности, которая катализирует расщепление сг-1-»4-гликозидных связей между остатками 1_-гулуроновой кислоты.

О оп

У н 75

= 50

/-Ч. 0

Димер гример 351.3 527,3

¡1.

Тстрзмср 71«, 2

Пситамер 879,1

100 :00 300 400 500 600 700 800 900 ] ООО т/г

Рисунок 23 - МАЮ1-ТОР масс-спектр продуктов гидролиза полигулуроната натрия альгинат-лиазой из печени г.атЬв ер.

Фермент (КФ 4.2.2.11).

классифицирован

как поли-1—»4-ст-Ьгулуронат-лиаза

выводы

1.Для обнаружения фукоиданаз в микроорганизмах разработан простой метод определения утилизации фукоидана бактериями, растущими на агаризованной питательной среде.

2. Из морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т впервые выделена внутриклеточная фукоиданаза FFA с молекулярной массой 96±1 кДа. Изучены основные свойства фукоиданазы и установлена структура продуктов ферментативного гидролиза фукоидана из Fucus evanescens. Фермент классифицирован нами как эндо-1->4-сг-!.-фуканаза (КФ 3.1.1.-).

3. В геноме морской бактерии F. algae определены два гена, кодирующие внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы. Биоинформационный анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз выявил их мультидоменную организацию. Молекулярные массы вне- и внутриклеточной фукоиданаз составили 111 и 97,9 кДа соответственно. На основании полученных нами данных об аминокислотной последовательности фукоиданаз FFA1 и FFA2 оба фермента отнесены к 107 структурному семейству

0-гликозидгидролаз.

4. Получены рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 и их усеченные с С-конца производные (FFA1-SD, FFA1-KD, FFA2-SD и FFA2-KD). Способность усеченных производных фукоиданаз к гидролизу фукоидана свидетельствует о том, что С-концевой домен полипептидных цепей фукоиданаз не участвует в каталитическом акте.

5. Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 различались каталитическими свойствами: FFA2 имела более широкий диапазон оптимума рН (6,5-9), чем FFA1 (6,5-8); ионы Со2* и Мп2* активировали фукоиданазу FFA2, но не влияли на активность FFA1; молекулярные массы основных продуктов гидролиза фукоидана составляли около 5 кДа для FFA1 и меньше 4 кДа для FFA2. Показано, что FFA1 и FFA2 способны расщеплять 1—>4-гликозидные связи мехеду остатками a-L-фукозы в молекуле фукоидана, что позволило классифицировать их как эндо-1->4-ст-1_-фуканазы (КФ 3.1.1.-).

6. Из печени морского моллюска Lambis sp. выделена фукоиданаза с молекулярной массой 50±1 кДа. Охарактеризованы каталитические свойства фукоиданазы. Показано, что продуктами ферментативного гидролиза фукоидана являются сульфатированные по второму положению фукоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 5. Установлено, что фермент способен расщеплять

1-»4-гликозидные связи между остатками cr-L-фукозы в фукоидане из F. evanescens. Фермент был классифицирован как эндо-1->4-а-1--фуканаза (КФ 3.1.1.-).

7. Из печени морского моллюска Lambis sp. выделена новая альгинат-лиаза с молекулярной массой 31±1 кДа. Определены каталитические свойства альгинат-лиазы, установлена структура продуктов ферментативного гидролиза полигулуроната натрия, степень полимеризации которых составляла от 2 до 5 остатков гулуроновой кислоты. Альгинат-лиаза из Lambis sp. отнесена к поли-1->4-а-1--гулуронат-лиазам (КФ 4.2.2.11).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОН России

1. Сильченко А.С., Кусайкин М.И., Захаренко A.M., Звягинцева Т.Н. Выделение и каталитические свойства альгинат-лиазы с редкой субстратной специфичностью из морского моллюска Lambis sp. //Химия природ, соедин. - 2013. - № 2. - С. 188-190.

2. Silchenko A.S., Kusaykin М.1., Kurilenko V.V., Zakharenko A.M., Isakov V.V., Zaporozhets T.S., Gazha A.K., Zvyagintseva T.N. Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium, Formosa algae II Mar. Drugs.-2013.-Vol. 11, N7.-P. 2413-2430.

3. Silchenko A.S., Kusaykin M.I., Zakharenko A.M., Menshova R.V., Huynh Hoang Nhu Khanh, Dmitrenok P.S., Isakov V.V., Zvyagintseva T.N. Endo-1,4-fucoidanase from Vietnamese marine mollusk Lambis sp. which producing sulphated fucooligosaccharides II J. Mol. Cat. B: Enzymatic.-2014.-Vol. 102.-P. 154-160.

1. Сильченко A.C., Кусайкин М.И. Каталитические свойства фукоидан-гидролазы из морской бактерии Formosa a/gae II 5-й Междунар. симп. «Химия и химическое образование», Владивосток, 12-18 сент. 2011 г. : сб. науч. тр. - Владивосток : Иэд-во Дальневост. федерал, ун-та, 2011. - С. 38-39. - ISBN 978-5-7444-2568-5.

2. Silchenko A.S., Zakharenko A.M., Kusaykin M.I. Substrate specificity and catalytic properties of the fucoidanase from Formosa algae KMM 3553 // «1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, Vietnam, 10-17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. - Nha Trang : VAST, 2012. - P. 28. - ISBN 978-5-7442-1548-4

3. Silchenko A.S., Zakharenko A.M., Khanh H.H.N., Ly B.M., Kusaykin M.I. Substrate specificity and catalytic properties of the fucoidanase from Lambis sp. // «1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, Vietnam, 10-17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. - Nha Trang : VAST, 2012. - P. 70. - ISBN 978-5-7442-1548-4

4. Silchenko A.S., Zakharenko A.M., Khanh H.H.N., Hang C.T. Т., Kusaykin M.I. The novel alginate lyase with rare specificity from the marine mollusk Lambis sp. // «1th Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides», Nha Trang, Vietnam, 10-17 Dec. 2012 : abstrs book and sci. progr. - Nha Trang : VAST, 2012. - P. 73. - ISBN 978-5-7442-1548-4.

5. Сильченко А.С., Захаренко A.M., Кусайкин М.И. Некоторые каталитические свойства рекомбинантных фукоиданаз из морской бактерии Formosa algae [Электронный ресурс] II Всероссийская молодежная конференция «Взгляд в будущее», Владивосток, 7-14 нояб. 2013 г.: сб. работ. - Владивосток, 2013. - С. 26-27. Kusaykin M.I., Ermakova S.P., Zakharenko A.M., Silchenko A.S., Zvyagintseva T.N. Marine polysaccharides with multiple activities // TU-SBRAS-FEBRAS-ISTC Seminar - Indigenous flora and marine fauna of Russia with health promoting ingredients, Sendai, Japan, 7 Nov. 2013 : progr. and abstr. -Sendai, 2013.-P. 10.

6. Silchenko A., Kusaykin M., Zakharenko A. Cloning and expression of fucoldanases from the marine bacterium Formosa algae KMM 3553 // 2nd International symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, Sept. 4-9, 2013 : progr. and abstrs. Vladivostok, 2013. - P. 90. - ISBN 978-5-8044-1400-0.

7. Zakharenko A.M., Kusaykin M. I., Silchenko A.S., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. Carbohydrate metabolism enzymes of marine organisms as a tools for production of new food supplements // The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application, Gangneung, Republic Korea, Oct. 25, 2013. -Gangneung, 2013.-P. 79-89.

Тезисы конференций

Соискатель

Сильченко А. С.

Сильченко Артем Сергеевич

Фуконданазы и альгинат-лназы морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т и морского моллюска Lambis sp.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 07.05.2014г. Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1.39. Тираж 120 экз. Заказ 225 Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Сильченко, Артем Сергеевич, Владивосток

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

л/ол4/С о7л На правах рукописи

V I -т ^ / I и I

Сильченко Артем Сергеевич

Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т и морского моллюска Lambis sp.

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.б.н. Кусайкин Михаил Игоревич

ВЛАДИВОСТОК - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................4

1 ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................5

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.................................................................................................................8

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения...................8

2.2 Классификация фукоиданов........................................................................................................9

2.2.1 Фукоиданы, построенные из а-1—>3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы........................................................................................................................................10

2.2.2 Фукоиданы, построенные из а-1—>3- и а-1 —>4-связанных остатков сульфатированной L-фукозы.......................................................................................................13

2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы................................................................15

2.2.4 Фукансульфаты иглокожих.................................................................................................16

2.3 Фукоиданазы. Общая информация...........................................................................................21

2.3.1 Номенклатура и классификация фукоиданаз....................................................................21

2.3.2 Методы определения фукоиданазной активности............................................................22

2.3.2.1 Колориметрические методы.............................................................................................22

2.3.2.2 Физико-химические методы.............................................................................................23

2.3.3 Распространение фукоиданаз..............................................................................................25

2.3.4 Выделение и очистка фукоиданаз......................................................................................26

2.3.5 Физико-химические свойства фукоиданаз........................................................................28

2.3.6. Тип действия и специфичность фукоиданаз....................................................................30

2.3.7 Структура фукоиданаз.........................................................................................................40

2.3.8 Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах....................................................43

2.4 Альгиновые кислоты..................................................................................................................49

2.4.1 Структура альгиновых кислот...............................................................................................50

2.6 Альгинат-лиазы..........................................................................................................................51

2.6.1 Номенклатура и классификация альгинат-лиаз................................................................51

2.6.2 Методы регистрации альгинолитической активности.....................................................52

2.6.3 Распространение альгинат-лиаз..........................................................................................53

2.6.4 Альгинат-лиазы бактерий....................................................................................................53

2.6.5 Альгинат-лиазы грибов, бактериофагов и вирусов..........................................................54

2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей................................................56

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................58

3.1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий....................................................58

3.2 Фукоиданазы морской бактерии Formosa algae КММ 3553Т...............................................60

3.2.1 Влияние различных углеводных компанентов питательной среды на биосинтез фукоиданаз в морской бактерии F. algae КММ 3553Т.............................................................60

3.2.2 Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии

F. algae КММ 3553Т.....................................................................................................................64

3.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз)................................................................................69

3.2.4 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae КММ 3553Т.....................................75

3.3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp.......................................................................83

3.4 Альгинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp.....................92

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................................................98

4.1 Материалы и реагенты...............................................................................................................98

4.3 Методы исследования................................................................................................................99

5 ВЫВОДЫ.........................................................................................................................................115

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................117

Приложение Б.....................................................................................................................................135

Приложение В.....................................................................................................................................139

Приложение Г.....................................................................................................................................140

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А.о. - аминокислотный остаток

БСА (В SA) - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО (DMSO) - диметилсульфоксид

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия

ДТТ (DTT) - дитиотреитол

ДЭАЭ-целлюлоза (DEAE-cellulose) - диэтиламиноэтил-целлюлоза ИПТГ (IPTG) - изопропил-/?-0-1-тиогалактопиранозид

МАЛДИ (MALDI) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

ПААГ-электрофорез (PAGE) - электрофорез в полиакриламидном геле

ПСА (APS) - персульфат аммония

Р.И. - рефрактометрический индекс

ТФУ (TFA) - трифторуксусная кислота

УФ (UV) - ультрафиолетовое излучение, Х=280-320нм

ЯМР (NMR) - ядерный магнитный резонанс

Fue - фукоза

Gal - галактоза

Glc - глюкоза

Man - манноза

Rha - рамноза

U - уроновая кислота

Ху1 - ксилоза

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение уникальных ферментов морских организмов, расщепляющих полисахариды бурых водорослей, характеристика их каталитических свойств и структуры - актуальная задача современной энзимологии. Объектами нашего исследования являются фукоиданазы и альгинат-лиазы морских беспозвоночных и бактерий, принимающие участие в катаболизме полианионных полисахаридов морских водорослей. Эти ферменты исследованы недостаточно, поэтому их изучение расширит наши теоретические знания о структурно-функциональных свойствах этих ферментов и позволит направленно использовать их для установления структуры природных полисахаридов.

Субстратами для исследуемых ферментов являются альгиновые кислоты (гомо- и гетерополисахариды, состоящие из остатков маннуроновых и/или гулуроновых кислот) и фукоиданы (высокосульфатированные гомо- и гетерополисахариды). Эти полисахариды бурых водорослей относят к так называемым «поливалентным биомодуляторам», так как они обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, радиопротекторной, антиопухолевой, антивирусной, антимикробной, антикоагулянтной, гепатозащитной и другими. Все эти свойства делают возможным использование полисахаридов бурых водорослей в медицине. Однако лекарства на их основе еще не созданы. Это связано с недостатком информации о взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов водорослей и отсутствием простых и воспроизводимых методов стандартизации препаратов. Существуют трудности в установлении структуры этих биополимеров, характеризующихся большим структурным разнообразием, гетерогенностью получаемых фракций, сложным построением молекул. Для стандартизации природных полисахаридов, установления их структуры, увеличения биологической активности и снижения побочных эффектов, наиболее перспективным является использование ферментов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Показаны особенности действия новых ферментов и возможности их дальнейшего применения для исследования структур фукоиданов и альгиновых кислот. Рекомбинантные фукоиданазы могут найти свое применение в биотехнологии для получения сульфатированных фукоолигосахаридов, которые имеют перспективы использования их в качестве биологически активных добавок и лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод обнаружения фукоиданаз в бактериях, применим для масштабного поиска продуцентов этих ферментов.

2. Внутриклеточная фукоиданаза (FFA), выделенная из морской бактерии F. algae КММ 3553Т, является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление а-1 —>4-0-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из Fucus evanescens.

4. Фукоиданазы FFA1 и FFA2 относятся к 107 структурному семейству О-гликозидгидро лаз.

5. Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и катализируют расщепление а-1—»4-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

6. Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление а-1—+4-0-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.

7. Альгинат-лиаза из морского моллюска Lambis sp., является ферментом эндо-типа действия, и имеет редкую для альгинат-лиаз морских беспозвоночных специфичность: катализирует расщепление а-1—>4-гликозидных связей между остатками L-гулуроновой кислоты. Фермент классифицирован как поли-1—»4-а-Ь-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11). Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на:

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из списка ВАК РФ и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 213 источников. Диссертация изложена на 141 страницах и содержит 41 рисунок, 24 таблицы и 4 приложения.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения

Полианионные полисахариды являются обширной группой биополимеров, которые обнаружены во всех классах морских водорослей. Интерес к изучению этих полисахаридов вызван широким спектром их биологического действия. Они обладают противовирусным, противоопухолевым, иммуномодулирующим,

противовоспалительным, антикоагулянтным, антиадгезивным, антиангиогенным действием [1-11].

Среди полианионных полисахаридов наибольшее внимание привлекают фукоиданы - сульфатированнные полисахариды бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Фукоиданы принадлежат к семейству сульфатированных гомо- или гетерополисахаридов, основным, а иногда единственным мономером которых являются сульфатированные и, в некоторых случаях, ацетилированные по различным положениям остатки a-L-фукозы. Кроме остатков фукозы, в состав фукоиданов бурых водорослей часто входят и другие моносахариды, такие как галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Xyl), рамноза (Rha), уроновые кислоты (U). Остатки галактозы также могут содержать сульфаты подобно остаткам фукозы.

Содержание фукоиданов в бурых водорослях колеблется в довольно широких пределах: от 0,4 до 20,4 % от сухого веса и зависит от вида водоросли и сезона ее сбора. Самое высокое содержание фукоидана (20,4 %) было обнаружено Усовым А.И. с соавторами в бурой водоросли Saundersella simplex, принадлежащей к порядку Dicyosiphonales [12]. Достаточно высокое содержание фукоиданов наблюдается в водорослях порядка Fucales: от 13,4 % до 16,5 % у F. vesiculosus и от 10,0 % до 11,5 % у Ascophyllum nodosum [13]. В дальневосточных представителях порядка Laminarinales содержание фукоиданов меньше - от 0,6 % до 6,5 %, а в дальневосточных водорослях порядка Fucales - от 1,5 % и до 7,9 % [14; 15].

Известно, что содержание и структура сульфатированных полисахаридов бурых

водорослей варьируют в зависимости от эндо- и экзогенных факторов [14-16].

Структуры фукоиданов, синтезируемых одним видом водоросли, могут иметь

значительные различия. В качестве примера можно привести фукоидан из F. vesiculosus,

который удалось разделить на 16 фракций, имеющих различный моносахаридный

состав [17]. Из бурой водоросли Kjellmaniella crassifolia были выделены две фракции

фукоиданов, первая фракция представляла собой фукансульфат, построенный из а-1—>3-связанных остатков сульфатированной Ь-фукозы, а вторая являлась фукоглюкурономаннаном [18; 19].

Вероятно, эти отличия в структурах связаны с ферментными системами, участвующими в биосинтезе полисахаридов. Состав этих ферментов может быть различен у каждого вида водоросли, а уровень экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, может изменяться, так как зависит от факторов внешней среды.

В настоящее время сульфатированные фукозосодержащие полисахариды, несмотря на сложности установления их химической структуры, вызывают интерес в качестве основы для создания биологически активных добавок и лекарственных препаратов нового поколения.

2.2 Классификация фукоиданов

На сегодняшний день можно выделить несколько структурных групп фукоиданов, различающихся типом О-гликозидной связи между остатками а-Ь-фукозы в полисахариде:

1. Сульфатированные а-Ь-фуканы, построенные из остатков фукозы, связанных а-1 —>3-0-гликозидными связями. Данный тип фукоиданов встречается в бурых водорослях порядков Ьаттапа1ез и ЕсЮсагра1е5.

2. Фукоиданы, построенные из остатков а-Ь-фукозы, связанных 1—>3- и 1—>4-0-гликозидными связями. Синтезируются бурыми водорослями порядка Бисакв.

3. Сульфатированные галактофуканы, основными компонентами которых являются остатки а-Ь-фукозы и /?-0-галактозы, связанные 1—»3- и/или 1—»4-О-гликозидными связями. Синтезируются бурыми водорослями порядка Ьаттапа1ез.

4. Фукоиданы более сложного состава, молекулы которых содержат в значительных количествах помимо остатков фукозы и другие моносахариды.

Классификация фукоиданов является сложной задачей из-за способности водорослей одного вида синтезировать помимо а-Ь-фуканов другие фукозосодержащие полисахариды: сульфатированные галактофуканы, фукогалактаны,

фукоглюкурономаннаны и ксилофукоглюкуронаны. Подобные наборы

сульфатированных фукозосодержащих полисахаридов описаны практически для каждого порядка бурых водорослей.

2.2.1 Фукоиданы, построенные из а-1—+3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы

Бурые водоросли порядка Laminariales и Ectocarpales синтезируют фукоиданы, основным структурным мотивом которых являются а-1—»3-связанные остатки сульфатированной фукозы (рис. 2.1).

Фукоиданы, выделенные из водорослей порядка Laminariales, построены из а-1—>3-связанных остатков фукозы, сульфатированных по С2 и/или С4 положениям. Фукоиданы такого строения были выделены из бурых водорослей Saccharina cichorioides (Laminaria cichorioides) [20; 21], S. latissima