Структурное исследование О-антигенных полисахаридов отдельных представителей морских грамотрицательных бактерий методом спектроскопии ЯМР тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Кокоулин Максим Сергеевич

Структурное нсследоваппе О-антпгепных полисахаридов отдельных представителей морских грамотрпцательных бактерий методом спектроскоппп ЯМР

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 НОЯ 2014

Владивосток — 2014

005556081

005556081

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Егсякова ДВО РАН

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент

Командрова Надежда Алексеевна

доктор химических наук, ст. науч. сотр. Калшювскпи Анатолий Иванович

Официальные оппоненты: Усов Анатолий Иванович

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией растительных полисахаридов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Копнова Светлана Анатольевна

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва.

Защита состоится «25» декабря 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им Г.Б. Епякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

4.0-л fU>cJU>ya гь. 2014 года ¿^jL^L^3 Черников О.В.

/г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Химическое изучение биополимеров, образующих поверхность бактериальной клетки, является одной из важнейших проблем современного естествознания, которая состоит в изучении молекулярных основ взаимодействия живых клеток друг с другом и с окружающей средой. Решение этой проблемы представляет не только теоретический интерес, но является также актуальной практической задачей, потому что имеет прямое отношение к познанию таких биологических явлений как иммунитет к инфекционным возбудителям, тканевая несовместимость, злокачественный рост ткани, проникновение вируса в живую клетку и т.д.

Липополисахариды (ЛПС) или эндотоксины являются одними из основных компонентов внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий и представляют собой специфический класс биополимеров, которые обладают широким спектром биологического действия. Они являются антигенами бактериальной клетки; играют важную роль в определении специфичности каналов, ответственных за транспорт необходимых для роста клетки веществ; защищают ее от летального действия детергентов, ядов, некоторых антибиотиков; являются рецепторами для ряда специфических бактериофагов и бактериоцинов; играют ключевую роль в процессах межклеточного узнавания. Многие патофизиологические проявления грамотрицательных инфекций, в том числе септический шок, ассоциированы с уникальными, эндотоксическими свойствами этих углеводсодержащих биополимеров.

Биологические свойства молекулы ЛПС определяются своеобразной химической структурой составляющих его компонентов: О-специфического полисахарида (ОПС), олигосахарида кора и липида А. Тонкие вариации в структуре О-специфических полисахаридных цепей определяют серологическую специфичность грамотрицательных бактерий и могут использоваться в качестве молекулярной основы при создании внутривидовых классификационных схем микроорганизмов. Липид А является эндотоксическим центром молекулы ЛПС и отвечает за большинство физиологических и патофизиологический реакций, обусловленных воспалительным процессом, вызванным грамотрицательными микроорганизмами, таких как летальная токсичность, пирогенность, адъювантность, митогенная стимуляция и др.

Несмотря на значительный прогресс в области структурного анализа полисахаридов, антигены грамотрицательных бактерий исследованы крайне неравномерно. Наряду с довольно хорошо изученными полисахаридными антигенами патогенных и условно-патогенных бактерий, существуют менее изученные и совсем неизученные роды микроорганизмов. К последним можно отнести практически все микроорганизмы морского происхождения, хотя по количеству и разнообразию они не уступают наземным формам бактерий.

Микробные ценозы океана, как древнейшие на земле, включают особые, иногда лишь им присущие таксоны микроорганизмов, которые формировались на протяжении длительного периода эволюции. Микроорганизмы, находясь в весьма специфических условиях обитания, таких как открытые воды морей и океанов (низкая температура, высокое гидростатическое давление, соленость, циркуляция водных масс, низкие концентрации органических веществ) или морской шельф (резкие изменения температуры и солености, активное перемешивание, влияние приливных волн, наземных стоков и радиации), отличаются от наземных форм рядом приспособительных особенностей. Прежде всего, это относится к клеточной стенке бактерий, которая играет определяющую роль во взаимодействии микроорганизма с окружающей средой. Кроме того, они способны синтезировать физиологически активные соединения, отличные от тех, которые синтезируют наземные бактерии.

Имеющиеся на данный момент в мировой литературе результаты структурных исследований показывают, что клеточные стенки морских грамотрицательных бактерий

различных родов и видов продуцируют антигены уникального строения. Эти биополимеры содержат необычные кислые моносахариды, N-ациламино- и N-ацилдиаминосахара, кетосахара, высшие моносахариды, а также различные заместители неуглеводной природы, как распространенные в природе, так и не найденные в других источниках.

Изучение ЛПС направлено на решение таких фундаментальных задач, как классификация бактерий, выяснение взаимосвязи между структурой и функцией ЛПС, в том числе механизмов иммунного ответа к ним. Структура О-антигенов может служить в качестве одного из хемотаксонамических критериев, позволяющих устанавливать филогенетическое родство и прослеживать пути эволюции микроорганизмов. Знание строения ЛПС имеет важное практическое значение для создания искусственных вакцин и антибактериальных средств, включая препараты, изменяющие чувствительность бактерий к антибиотикам. Особое место в решении этих задач занимают ЛПС морских грамотрицательных бактерий, которые, в отличие от ЛПС наземных бактерий, часто проявляют низкую токсичность и могут быть потенциально активными субстанциями при разработке новых эффективных иммуномодуляторов и лекарственных средств, направленных на предотвращение септического шока.

Таким образом, структурные исследования О-антигенов морских грамотрицательных бактерий являются одной из актуальных проблем современной биоорганической химии. Необходимость ее решения стимулирует создание новых эффективных методов, совершенствующих арсенал инструментов структурного анализа сложных углеводов, что позволяет открывать новые биологически важные моносахариды и их производные.

Цели и задачи исследования. Цель исследования: установить строение О-антигенов отдельных представителей ранее неизученных морских грамотрицательных бактерий родов Cobetia, Rheinheimera, Idiomarína (класс Gammaproteobacteria), Litorimonas (класс Alphaproteobacteria) и Echinicola (тип Bacteriodetes) и оценить биологическую активность ЛПС из указанных выше морских микроорганизмов. Для реализации цели в ходе исследования было необходимо решить следующие задачи: 1) выделить ЛПС из 6 штаммоэ 5 родов ранее неизученных микроорганизмов: Cobetia pacifica КММ 3879т, С. pacifica КММ 3878, Rheinheimera pacifica КММ 1406х, Idiomarína abyssalis КММ 227 , Litorimonas taeanensis G5T, Echinicola vietnamensis KMM 6221T; 2) выделить О-антигенные полисахариды и определить их моносахаридный состав; 3) установить полную структуру повторяющихся звеньев О-антигенных полисахаридов для всех исследуемых микроорганизмов; 4) оценить цитотоксическую и цитокин-индуцирующую активности выделенных ЛПС.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые выделены и установлены полные структуры ОПС из 6 штаммов 5 родов морских грамотрицательных бактерий: С. pacifica КММ 3879т, С. pacifica КММ 3878, R. pacifica КММ 1406 ,1. abyssalis КММ 227т, L. taeanensis G5T и Е. vietnamensis КММ 6221Т. Среди них обнаружены три новых сульфатированных ОПС из морских бактерий С. pacifica КММ 3879т, С. pacifica КММ 3878 и I. abyssalis КММ 227т. В составе ОПС С. pacifica КММ 3878 идентифицирован дисульфатированный моносахарид - 2,3-0-дисульфат-0-галактоза; ОПС I. abyssalis КММ 227 содержит 3-(4-гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-0-глюкозу, сульфатированную по второму положению. Оба производных моносахаридов впервые обнаружены в природе.

ОПС L. taeanensis G5T содержит моносахарид 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-Ь-гексоз-4-улозу, впервые обнаруженный в природе, и редкий для бактериальных полисахаридов компонент - (35,55)-3,5-дигидроксигексановую кислоту. Для установления конфигурации асимметрических центров (33,58)-3,5-дигидроксигексановой кислоты был применен метод Мошера, который впервые использован в структурной химии углеводов.

Впервые изучена иммуностимулирующая активность ЛПС С. pacifica КММ 3879т, С. pacifica КММ 3878, R. pacifica КММ 1406т, I. abyssalis КММ 227т, I. taeanensis G5T и Е. vietnamensis КММ 6221 . Установлено, что все исследованные ЛПС не токсичны в диапазоне концентраций от 0.01 до 100 мкг/мл. Показано, что ЛПС всех бактерий являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а и ИЛ-6 и представляют

интерес с точки зрения изучения их антагонистических свойств. В дальнейшем, возможно, они могут быть использованы в качестве потенциально активных субстанций при разработке новых эффективных иммуномодуляторов и лекарственных средств, направленных на предотвращение септического шока.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на 5-й Балтийской конференции по микробным углеводам (Суздаль, Россия, 2012), 1-м Симпозиуме по морским ферментам и полисахаридам (Нячанг, Вьетнам, 2012), 2-й Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, Россия, 2014), 6-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, Россия, 2014).

Личный вклад соискателя. Автор лично участвовал в планировании экспериментов, обсуждении полученных результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций. Выделение и очистка ЛПС и ОПС, химические анализы, запись и интерпретация спектров ЯМР проводились автором лично или при его непосредственном участии. Основные положения диссертации, выносимые па защиту.

1. Морские грамотрицательные бактерии С. pacifica КММ 3879т и С. pacifica КММ 3878, (класс Gammaproteobacteria) продуцируют различные по структуре сульфатированные ОПС. В составе О-антигенного полисахарида С. pacifica КММ 3878 впервые обнаружен в природе остаток 2,3-0-дисульфат-0-галактозы, а также остаток 3,4-0-[(8-карбоксиэтилиден)]-0-галактозы - редкий для бактериальных гликанов компонент.

2. Глубоководные морские грамотрицательные бактерии R. pacifica КММ 1406х и I. abyssalis КММ 227т, (класс Gammaproteobacteria) продуцируют высокоаминированные кислые О-антигенные полисахариды. В составе ОПС R. pacifica КММ 1406т одновременно присутствуют D- и L- изомеры 2-ацетиламино-2-дезокси-галактуроновой кислоты. ОПС I. abyssalis КММ 227 содержит впервые обнаруженный в природе остаток 3-(4-гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-0-глюкозы, сульфатированный по второму положению.

3. В составе О-антигенного полисахарида морской грамотрицательной бактерии L. taeanensis G5T, (класс Alphaproteobacteriá), впервые идентифицирован остаток 2-ацетиламико-2,6-дидезокси-1^гексоз-4-улозы, а также обнаружен редкий моносахарид -2-ацетиламино-4-[(38,58)-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-0-глюкоза.

4. ОПС морской бактерии Е. vietnamensis КММ 6221Т, (тип Bacteroidetes), построен из разветвленных тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих в своем составе остатки 2-ацетиламино-2-дезокси-0-глюкозы, D-глюкуроновой кислоты, D-галактозы и остаток редкого моносахарида - колитозы.

5. ЛПС С. pacifica КММ 3879т, С. pacifica КММ 3878, R. pacifica КММ 1406т, /. abyssalis КММ 227т, L. taeanensis G5 и Е. vietnamensis КММ 6221т не обладают цитотоксической активностью в диапазоне концентраций от 0.01 до 100 мкг/мл. и являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а и ИЛ-6.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи в зарубежных рецензируемых журналах и 7 тезисов в материалах научных конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 185 источников. Диссертация изложена на 154 страницах и содержит 24 рисунка и 20 таблиц.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям к.х.н. Командровой Надежде Алексеевне и д.х.н. Калиновскому Анатолию Ивановичу за всестороннюю поддержку и помощь при выполнении диссертационной работы. Автор выражает глубокую признательность к.х.н. C.B. Томшич за помощь в работе и обсуждение полученных результатов. Автор также благодарен дб.н. Л.А. Романенко за

выполнение микробиологических экспериментов, д.х.н. Кича А.А. за помощь в получении оптически активных производных дисахаридов, к.х.н. Соколовой Е.В. и к.х.н. Мартыяс Е.А. за проведение биологических испытаний, Сильченко А.С. за помощь в проведении электрофоретических методов анализа.

Сокращения н условные обозначения: ГЖХ - газожидкостная хроматография, ИЛ -интерлейкин, КПС - капсульный полисахарид, ЛПС - липополисахарид, МС - масс-спектрометрия, ОПС - О-специфический полисахарид, ФНО - фактор некроза опухоли, ЭПС - экзополисахарид, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, 6dxylHexN-4-ulo - 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-ксшо-гексоз-4-улоза, Ас - ацетил, Ala - аланин, Col - 3,6-дидезокси-Ь-ксгмо-гексоза (колитоза), COSY - Correlation Spectroscopy, DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, Gal - галактоза, GalNA - 2-амино-2-дезокси- галактуроновая кислота, GD - Gated Decoupling, Glc - глюкоза, GlcNA - 2-амино-2-дезокси-глюкуроновая кислота, ЮВС - Heteronuclear 2 Bond Correlation, Hb - гидроксибутират, HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation, HSQC - Heteronuclear Single-Quantum Coherense, MTPA - a-метокси-а-грифтормегил-а-фенилацетилхлорид, p - пиранозид, Руг - пируват, Qui3N - 3-амино-3,6-дидезокси-глюкоза, Qui4N - 4-амино-4,6-дидезокси-глюкоза, QuiN4N - 2,4-диамино-2,4,6-тридезокси-глюкоза, GalN - 2-амино-2-дезокси-галактоза, Rha - рамноза, ROESY - Rotating-frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, TOCSY - Total Con-elation Spectroscopy.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Общие подходы к структурному анализу полисахаридов

В качестве объектов исследования были отобраны 6 штаммов микроорганизмов, выделенные из морских объектов и находящиеся в Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН: С. pacifica 3879 т, С. pacifica 3878, R. pacifica КММ 1406х, I. abyssalis КММ 227т (класс Cammaproteobacteria), L. taeanensis G5T (класс Alphaproteobacteria), и Е. vielnamensis КММ 6221Т (тип Bacteroidetes).

ЛПС выделяли из сухой, обезжиренной бактериальной массы экстракцией горячим водным фенолом по методу Вестфаля, предварительно удалив капсульный материал с поверхности клеток обработкой физиологическим раствором. Деградацию ЛПС проводили в условиях мягкого кислотного гидролиза 1 % (L. taeanensis G5T) и 2 % (С. pacifica 3879 т, R. pacifica КММ 1406т) АсОН при 100 °С. В некоторых случаях расщепление ЛПС проводили ацетатным буфером (рН 4.5) при 100 °С (С. pacifica 3878, Е. vietnamensis КММ 6221т) или О-дезацилировали ЛПС в мягких щелочных условиях обработкой 0.1 М NaOH при 37 °С (/. abyssalis КММ 227т). Осадок липида А и жирных кислот отделяли центрифугированием, ОПС получали гель-хроматографией водорастворимого материала на колонках с гелем TSK HW-50 и TSK HW-40.

Основным методом установления строения ОПС был метод спектроскопии ЯМР в сочетании с традиционными химическими методами анализа углеводов. Моносахаридный состав определяли методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных полиолов и метилгликозидов. Аминокислоты идентифицировали с помощью аминокислотного анализатора. Абсолютную конфигурацию моносахаридов определяли на основании величин их удельного оптического вращения, методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных (8)-2-октилгликозидов, а также с помощью спектроскопии ЯМР, используя известные закономерности, связывающие абсолютные конфигурации моносахаридов с химическими сдвигами их сигналов в спектрах "С-ЯМР. Спектры ЯМР снимали в D20 на приборе AVANCE-III (Bruker, Германия) с рабочей частотой 700.13 МГц для ядер 'Н и 176.04 МГц для ядер "С. Анализ с помощью одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н и 13С включал: 1) общую характеристику состава ОПС с помощью одномерных *Н и 13С-ЯМР и DEPT-135 экспериментов; 2) соотнесение сигналов в спектрах 'Н- и 13С-ЯМР с использованием двумерных корреляционных 'Н, 'H-COSY, 'Н, 'H-TOCSY, 'Н, "C-HSQC,

'Н, |3С-НМВС, 'Н, l3C-HSQC-TOCSY и 'И,'3С-Н2ВС экспериментов; 3) определение конфигурации глнкозидных связей и размеров моносахарндных циклов по величинам констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) углеродов с протонами в GD эксперименте; 4) устаноапение порядка замещения и последовательности моносахаридов, а также локализацию неуглеводных заместителей с помощью Н, 'H-ROESY и 'Н, ,3С-НМВС экспериментов. В случае необходимости применяли различные методы химической модификации ОПС, такие как О-дезацетилирование (С. pacifica 3879 т), десульфатирование (С. pacifica 3879 т) и распад по Смиту (/. abyssalis КММ 227т). В ряде случаев проводили расщепление ОПС безводной трифторметансульфокислотой для получения моносахаридов или олигосахаридных фрагментов (R. pacifica КММ 1406 и Е. vietnamensis КММ 6221Т). Продукты расщепления выделяли гель-хроматографией на колонке с гелем TSK HW-40, их строение устанавливали методом спектроскопии ЯМР, применяя двумерные эксперименты, описанные выше.

2 Структурное исследование ОПС Cobetia pacifica КММ 3879т

Анализ моносахаридного состава ОПС С. pacifica КММ 3879т показал наличие остатков Rha, Glc и Gal в соотношении 1:1:1. Абсолютная D-конфигурация остатков Glc и Gal и L-конфигурация остатка Rha была определена на основании величин их удельного оптического вращения.

Спектры 'Н- и ЬС-ЯМР ОПС указывали на структурную нерегулярность полисахарида, вследствие присутствия в нестехиометрическом количестве О-ацетильных групп, идентифицированных по характерным сигналам при 5с 21.7. и 8н 2.17 м.д. Для дальнейшего структурного исследования ОПС был подвергнут О-дезацетилированию.

Первичный анализ спектра |3С-ЯМР (Рисунок 1) модифицированного полисахарида (ОПС-1), включая DEPT-135 эксперимент, указывал на регулярную структуру его трисахаридного повторяющегося звена, состоящего из остатков L-Rha, D-GIc и D-Gal (один из остатков гексоз имел замещение в положение 6).

Gal 1 Glc1

10$ 100 9$ 90 85 ВО 75 70 65 60 3$ SO 45 40 35 30 25 20 М.Д.

Рисунок I - Спектр 13С-ЯМР ОПС-1 С. pacifica КММ 3879т

Из данных спектров 'Н, 'H-COSY и 'Н, 'H-TOCSY были выделены спиновые системы для трех моносахарндных остатков с глюко-, манно- и гспакшо-конфигурациями. Анализ

спектра 'Н, l3C-HSQC ОПС-1 позволил соотнести сигналы протонов всех моносахаридных остатков с соответствующими им атомами углерода (Таблица 1). Из данных эксперимента GD следовало, что все моносахаридные остатки находятся в пиранозной форме, а также то, что остатки L-Rha и D-Glc имели a-конфигурацию гликозидной связи, а остаток D-Gal - ¡3-конфигурацию.

Результаты 'Н, 'H-ROESY и 'Н, ,3С-НМВС экспериментов определили порядок замещения и последовательность моносахаридных остатков в ОПС и продемонстрировали, что остаток ü-D-Glcp был замещен в положение 6, а остаток a-L-Rhap - в положение 2 и 4. Остаток (З-D-Gal/? замещения не имел и находился в боковом ответвлении (Рисунок 2).

Таблица 1 - Данные спектров 'Н- и ,3С-ЯМР ОПС-1 С. pacifica КММ 3879т(хим. сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток Н/С 1 2 3 4 5 6а,6b

->6>a-D-Glcp3S03 -(1-> 'н 5.09 3.75 4.56 3.82 4.27 3.91,3.91

ÜC 99.3 71.2 83.0 68.8 71.6 67.0

->2,4>a-L-Rhap-(l-> 'н 4.94 4.06 4.14 3.83 3.90 1.40

ljc 99.3 77.9 70.9 82.3 68.8 17.9

P-D-Galp3S03 -(1-> 'н 4.79 3.72 4.36 4.31 3.74 3.78.3.82

IJC 104.7 71.0 81.5 68.0 75.9 61.9

Рисунок 2 - Структура повторяющегося звена ОПС С. pacifica КММ 3879т

Таким образом, на основании всех повторяющееся звено ОПС С. pacifica КММ трисахарид и имеет следующую структуру:

—>6)-a-D-Glc/?2Ac3 S03"-( 1 -

Значительное смещение в слабое поле сигналов С-3 атомов остатков а-0-01ф и р-0-0а1р к 8с 83.0 и 81.5 м.д., соответственно, по сравнению с их положением в незамещенных моносахаридах (5с 74.0 и 74.1 м.д., соответственно), указывало на присутствие неуглеводных заместителей в третьем положении обоих остатков. Анализ полисахарида

турбидиметрическим методом

показал присутствие в его составе сульфатных групп (23%), что было подтверждено методом ИК-спектроскопии (полоса поглощения при 1253 см"1).

Сравнение спектров ,3С-ЯМР ОПС и ОПС-1 позволило определить местоположение О-ацетильной

группы. Было установлено, что О-ацетильная группа находилась во втором положении остатка а-0-С1ср (степень ацетилирования - 30-50%). полученных данных, установлено, что 3654т представляет собой разветвленный

4

т 1

Р-Э-Оа^Оз"

Структура ОПС С. pacifica КММ 3654т является необычной для грамотрицательных бактерий. Ранее был обнаружен только один сульфатированный ОПС из морской бактерии Pseudoalteromonas agarivorans КММ 232 (S-форма). Кроме того, некоторые грамотрицательные бактерии продуцируют сульфатированные ЭПС. Наиболее близким по структуре к ОПС С. pacifica КММ 3654т является ЭПС морской бактерии Pseudomonas WAK-1, повторяющееся звено которого также содержит остатки D-Glcp, D-Galp и две сульфатные группы.

2 Структурное исследование ОПС Cobetiapacifica КММ 3878

Моносахаридный анализ ОПС С. pacifica КММ 3878 выявил наличие остатков Gal и 3,4-0-[1-карбоксиэтилиден]-галактозы в соотношении ~ 2:1. Определение абсолютной конфигурации моносахаридов методом ГЖХ в виде ацетилированных S-октилгликозидов показало, что все остатки Gal имеют D-конфигурацию. Анализ полисахарида турбидиметрическим методом показал присутствие в его составе сульфатных групп (22.9%), наличие которых было подтверждено методом ИК-спектроскопии (характерная полоса поглощения при 1253 см"1).

Результаты анализа спектров 13С-ЯМР ОПС (Рисунок 3), включая эксперимент DEPT-135, указывали на регулярную структуру трисахаридного повторяющегося звена, содержавшего три остатка D-Gal, два из которых имели замещение в положение 6, а один был замещен остатком пировиноградной кислоты (характерные сигналы при 5с 24.6 (СНз), 109.1 (С-2 атом углерода) и 178.8 м.д. (СООН)). С помощью GD эксперимента было показано, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме и имели ß-конфигурацию гликозидной связи.

G'"-3

CHj (Руг)

G"-1 Gm

СО (Руг)

G'-1

СООН (Руг)

ФШ0Щ01

170 160 ISO 140 110 120 110 100

Рисунок 3 - Спектр 13С-ЯМР ОПС С. pacifica КММ 3878

Анализ спектров 'Н, 'H-COSY и *Н, 'H-TOCSY ОПС выявил спиновые системы для трех моносахаридных остатков с гагактио-конфигурацией (P-D-Gal'p, P-D-Gal"p и p-D-Gal'"p). Из данных спектра 'Н, 13C-HSQC были соотнесены сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для остатков p-D-Gal"^ и P-D-Gal"'p. Плохое разрешение сигналов Н-2 и Н-3 атомов остатка ¡5-D-Gal1/? не позволило провести точное соотнесение сигналов его С-2, С-3 и С-4 атомов. Полное соотнесение сигналов для остатка р-D-Gal'p было проведено с помощью 'Н, 13С-Н2ВС эксперимента (Таблица 2).

Таблица 2 - Данные спектров 'Н- и 13С-ЯМР ОПС С. pacifica КММ 3878 (хим. сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток Н/ 1 2 3 4 5 6 (6a,6b)

->4-p-D-Gal'p2,3 S03"-( 1 'H 4.78 4.51 4.52 4.61 3.81 3.82,3.87

ljc 103.0 77.2 79.1 74.8 75.0 61.6

->6)-P-D-Gal"/)3,4(S-Pyr)-(l-> 'H 4.45 3.46 4.22 4.10 4.26 3.99,4.18

uc 103.4 74.5 79.7 76.2 73.7 70.1

-»6)-P-D-GalIup-(l-> 'H 4.74 3.59 3.73 4.02 3.86 3.86,4.23

1JC 104.6 72.1 73.7 70.0 75.3 71.2

S-Pyr 'H 1.59

uc 178.8 109.1 24.6

Последовательность и порядок замещения моносахаридных остатков в полисахариде были определены из данных спектров 'Н, 'Н-1ЮЕ8У и 'Н, 13С-НМВС (Рисунок 4).

Полученные результаты показали, что остаток р-В-Оа1!/> замещен в положение 4, остатки Р-О-Са!11/) и р-О-ва!111/? - в положение 6.

Локализация сульфатных групп определена на основании величин химических сдвигов их сигналов в спектрах Н- и С-ЯМР ОПС и эффектов сульфатирования. Значительное смещение в слабое поле сигналов С-2, С-3 и Н-2, Н-3 атомов остатка p-D-Gal'p к 8С 77.2 (а-эффект +5.6 м.д.), 79.1(а-эффект +5.3 м.д.) и 8Н 4.51 (а-эффект +0.99 м.д), 4.52 м.д. (а-эффект +0.87 м.д), соответственно, по сравнению с их положением в незамещенных моносахаридах (8с 73.2, 74.1 м.д. и 8н 3.52, 3.64 м.д., соответственно), указывало на присутствие сульфатных групп во втором и третьем положениях остатка p-D-Gal'p. Такие небольшие наблюдаемые эффекты сульфатирования по сравнению с литературными данными (+7.2 м.д. для С-2, +7.8 м.д. для С-3 атомов), могли быть вызваны нарушением аддитивности в результате 2,3-расположения сульфатных групп в моносахаридном остатке.

На основании полученных результатов, установлено, что ОПС С. pacifica КММ 3678 построен из линейных трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих остатки P-D-Galp, пировиноградной кислоты и сульфатные группы:

->4)-p-D-Ga!/>2,3S03~( 1 -+6>p-D-Gal/?3,4(S-Pyr)-( 1 ->6>p-D-Galp-( 1

Как и в случае ОПС С. pacifica КММ 3879т, повторяющееся звено ОПС С. pacifica КММ 3878 представлено трисахаридом, содержащим две сульфатные группы. Отличительной особенностью данного полисахарида является наличие дисульфатированного моносахарида - 2,3-0-дисульфат-0-галактозы, обнаруженного в природе впервые. Пировиноградная кислота является частым компонентом бактериальных полисахаридов, но в тоже время остаток D-Galp3,4(S-Pyr) был идентифицирован лишь в составе ОПС Proteus mirabilis 024 PrK 47/57 и КПС Klebsiella pneumoniae К13, КЗО, КЗЗ.

3 Струк-гурное исследование ОПС Rheinheimerapacifica КММ 1406т

Компонентный анализ ОПС R. pacifica КММ 1406т показал, что в его состав входят остатки GalN, GalNA, QuiN4N, Qui4N и Ala ~ 1:2:1:1:1. Абсолютная D-конфигурация остатка Ala была определена на основании величины его удельного оптического вращения. Абсолютная D-конфигурация остатка GalN установлена методом ГЖХ в виде ацетилированного S-октилгликозида.

Первичный анализ спектра 13С-ЯМР ОПС (Рисунок 5) указывал на регулярную структуру пентасахаридного повторяющегося звена, содержащего два остатка GalNA (GalNA и GalNA11) и по одному остатку D-GalN, QuiN4N, Qui4N и D-Ala (характерные сигналы при 5С 18.1 (СН3), 51.3 (C-N) и 177.0 м.д. (СООН)).

Рисунок 5 - Спектр 13С-ЯМР ОПС R. pacifica КММ 1406х

Из данных спектров 'Н, 'H-COSY и 'Н, 'H-TOCSY были выделены спиновые системы для трех моносахаридных остатков с голшаио-конфигурацией, две спиновые системы для моносахаридных остатков с гяюко-конфигурацией, а также спиновая система, состоявшая из протонов фрагмента остатка D-Ala. Сигналы протонов и соответствующих им атомов углерода для всех моносахаридных остатков были соотнесены с помощью 'Н, l3C-HSQC эксперимента. Вследствие плохого разрешения сигналов Н-3 и Н-4 атомов остатка D-Qui4N, для соотнесения сигналов его С-3 и С-4 атомов был применен 'Н, 13С-Н2ВС эксперимент (Таблица 3).

Спектр "С-ЯМР ОПС, снятый без подавления спин-спинового взаимодействия атомов углерода с протонами показал, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме и что остатки D-GalN, GalNA1 и GalNA11 имели a-конфигурацию гликозидной связи, а остатки QuiN4N и Quip4N - р-конфигурацию.

Таблица 3 - Данные спектров 'Н- и 13С-ЯМР ОПС R. pacifica КММ 140бт(хим. сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток H/C 1 2 3 4 5 6

-*4)-a-D-GalpNAc-(l—» 'H 5.35 4.16 4.03 4.07 3.92 3.55,

UC 99.2 51.5 67.4 77.3 72.2 60.3

->4)-a-L-Gal/>NAcA'-( 1-> 'H 5.23 4.28 4.00 4.43 4.29

uc 98.6 50.5 68.7 76.7 71.8 174.1

->3)-P-D-QuipNAc4NAc-(l -> 'H 4.63 3.85 3.81 3.61 3.56 1.09

uc 103.3 57.7 77.1 56.7 70.9 17.6

->2)-P-D-Quip4N(Acyl)-( 1 -> 'H 4.48 3.49 3.52 3.52 3.40 1.11

bc 103.7 81.9 75.2 58.5 71.7 18.0

->4)-a-D-GalpNAcA"-( 1 -» 'H 5.11 4.07 4.16 4.57 5.07

bc 99.0 52.6 68.4 81.4 70.8 172.8

D-AlaAc 'H 4.25 1.38

bc 177.0 51.3 18.1

Хим. сдвиги для N-ацетильных групп: SH 1.95-2.04; 5С 22.9-23.5 (Ме), 175.3-175.9 (СО)

Порядок замещения и последовательность моносахаридных остатков в полисахаридной цепи были определены из анализа данных 'Н, 'Н-110Е8У и 'Н, 13С-НМВС экспериментов, которые продемонстрировали, что остатки а-0-Са1рМАс, а-Юа^ЫАсА1 и а-0-Са1рЫАсАп замещены в положение 4, остаток р-0-С?шрЫАс4КАс имел замещение в положение 3, а остаток р-В-<Зш/?4М(Асу1) - в положение 2 (Рисунок 6).

Рисунок б - Структура повторяющегося звена ОПС R. pacifica КММ 1406т

Места присоединения остатка D-Ala и N-ацетильных групп были определены, с помощью 'Н, вС-НМВС эксперимента. Было установлено, что аминогруппы остатков а-GalpNA1, cc-GalpNA11, p-QuipN4N, а-D-GaIN и D-Ala ацетилированы. Корреляционный кросс-пик между Н-4 атомом остатка p-Quip4N и С-1 атомом остатка D-AlaAc свидетельствовал о том, что остаток аминокислоты присоединяется к аминогруппе в 4 положении остатка р-Quip4N. Абсолютные конфигурации остатков <x-L-GalpNAcAr, a-D-GalpNAcA11, p-QuipN4N

и P-Qui/?4N установлены на основании величин химических сдвигов их сигналов и а- и Р-эффектов гликозилироваиия, найденных из спектра 13С-ЯМР ОПС. Показано, что остатки а-GalpNAcA11, P-QuipNAc4NAc и p-Qui/?4N(D-AlaAc) имели абсолютную D-конфигурацию, а остаток a-GalpNAcA1- L-конфигурацию.

Таким образом, повторяющееся звено ОПС R. pacifica КММ 1406т представляет собой линейный пентасахарид и имеет следующую структуру:

—>4)-a-D-GalpNAc-(l—►4)-a-L-Gal^NAcA-(l—>3)-P-D-QuipNAc4NAc-(l—»2)--p-D-Quip4N(DAlaAc)-( 1 — 4)-a-D-GalpNAcA-( 1 -»

Интересно отметить, что все пять моносахаридных остатков в повторяющемся звене ОПС представлены аминосахарами. ОПС R. pacifica КММ 1406т является вторым бактериальным полисахаридом, содержащим D- и L-изомеры GalNAcA. Ранее оба этих изомера были обнаружены в составе ОПС P. haloplanktis АТСС 14393т. Кроме этого, ОПС R. pacifica КММ 1406 имеет близкую структуру с ОПС P. haloplanktis АТСС 14393 и КПС Alteromonas sp. КММ 155. О-антигенный полисахарид Р. haloplanktis АТСС 14393 также построен из пентасахаридных повторяющихся звеньев, но содержит остаток 0-D-Quijo3N(DAlaAc) вместо p-D-Quip4N(DAlaAc) и остаток ct-D-Ga!p2,6Ac вместо a-D-GalpNAc. Отличием КПС Alteromonas sp. КММ 155 от ОПС R. pacifica КММ 1406т является отсутствие остатка a-D-GalpNAcA.

4 Структурное исследование ОПС Idiomarina abyssalis КММ 227т

Моносахаридный анализ ОПС I. abyssalis КММ 227т привел к идентификации остатков Rha, GlcNA, QuiN4N и Qui3N в соотношении ~ 1:2:1:1. Абсолютная L-конфигурация остатка Rha определена на основании его удельного оптического вращения.

Регулярная структура пентасахаридного повторяющегося звена ОПС, содержащего два остатка GlcNA (GlcNA и GlcNA11) и по одному остатку Rha, QuiN4N и Qui3N, следовала из данных спектра 13С-ЯМР (Рисунок 7). Кроме того, в спектре присутствовали характеристичные сигналы для 4-гидроксибутановой кислоты при 6с 28.7 и 33.8 (СНг), 62.2 (СНгОН) и 178.1 м.д.(СООН). Наличие пяти сигналов атомов углерода, связанных с азотом и только четырех сигналов N-ацетильных групп свидетельствовали о том, что 4-гидроксибутановая кислота присоединялась к аминогруппе одного из моносахаридных остатков.

в*

Рисунок 7 - Спектр 13С-ЯМР ОПС I. abyssalis КММ 227т

Из данных спектров 'Н, 'Н-СОБУ и 'Н, 'Н-ТОСБУ ОПС были выделены спиновые системы для четырех моносахаридных остатков с гякжо-конфигурацией, одна спиновая система, соответствовавшая моносахаридному остатку с лмнно-конфигурацией, и спиновая система, состоявшая из протонов фрагмента остатка 4-гидроксибутановой кислоты. Анализ спектра 'Н, 13С-Н5<ЗС позволил соотнести сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для всех моносахаридных остатков (Таблица 4).

В связи с плохим разрешением сигналов Н-3 и Н-4 атомов остатка (2шЗК точное соотнесение сигналов его С-3 и С-4 атомов было проведено с помощью 'Н, 13С-Н2ВС эксперимента. Анализ спектра вП О ПС показал, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме, а также то, что остатки С1ср1ЧАсА:, Ис^АсА11, (ЗшрМЫ и (ЗшрЗК имели р-конфигурацию гликозидной связи, остаток ЯЬар - а-конфигурацию.

Таблица 4 - Данные спектров'Н- и 13С-ЯМР ОПС I. аЪуззаШ КММ 227т (хим. сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток Н/С 1 2 3 4 5 6

->4)-Р-0-асрКАсА'-( 1 -> 'н 4.44 3.55 3.69 3.69 3.65

|3С 103.4 56.1 72.4 82.7 76.9 173.6

->3)-Р-0-<ЗшрНАс4КАс-(1-> 'н 4.52 3.61 3.84 3.50 3.49 1.23

ис 101.8 57.3 79.4 56.9 71.1 18.2

->3,4)-Р-0-ас/ЛМАсАи-( 1 'н 4.55 3.83 3.88 3.73 3.86

13с 102.5 56.3 76.5 77.8 76.5 174.6

->2)-а-Ь-Ш1а/>-(1-> 'н 5.14 3.95 3.76 3.43 4.37 1.31

"с 99.6 83.1 70.8 73.8 69.9 17.9

Р-0-(2шр280з"ЗМ(4НЬ)-( 1 -> 'н 4.65 4.06 3.99 3.25 3.65 1.32

ис 104.2 78.9 56.7 74.4 74.3 18.2

4НЬ = -СО-СН2-СН2-СН2ОН 'н 2.34 1.84 3.61

ис 178.1 33.8 28.7 62.2

Хим. сдвиги для И-ацетильных групп: 8Н 1.93-2.07; 5С 23.5-23.8 (Ме), 175.2-175.4 (СО)

Значительное смещение в слабое поле химических сдвигов сигналов С-4 атома остатка р-ИсрКА1, С-3 атома остатка Р-Ош/>Ж>}, С-3 и С-4 атомов остатка Р-С1с/?НАсА" и С-2 атома остатка а-Ь-ЯЬар к 5с 82.7, 79.4, 76.5 и 77.8, 83.1 м.д., соответственно, по сравнению с их значениями в незамещенных моносахаридах (6с 73.1, 72.8, 74.5 и 73.1, 72.1 м.д., соответственно), указывало на порядок замещения моносахаридных остатков в полисахаридной цепи. Наличие 3,4-дизамещенного остатка р-ЯсрЫАсА11 означало, что полисахарид имел разветвленную структуру, с точкой разветвления на данном моносахариде.

Последовательность замещения моносахаридных остатков в полисахариде была определена с помощью 'Н, 'Н-ЯОЕвУ и 'Н, ,3С-НМВС экспериментов (Рисунок 8).

В спектре 'Н, 13С-НМВС были найдены кросс-пики между протонами и атомами углерода, участвующими в образовании гликозидной связи, для всех моносахаридных остатков, кроме кросс-пика Н-1 р-ОшрК4№С-3 Р-ИсрКАсА1'. Поэтому, на основании того, что химический сдвиг сигнала С-3 атома моносахаридного остатка Р-йсрКАсА11 был сдвинут в слабое поле к 6с 76.5 м.д., по сравнению с его значением в незамещенном моносахариде (6с 74.5 м.д.), было сделано предположение, что остаток Р-С^ш/Л^Ш гликозилировал остаток р-С1срКАп в третье положение. Наличие корреляций Н-1 Р-(2шрЗМ/С-2 а-Ь-ЯЬар и Н-1 а-Ь-КЬар/С-4 р-ИсрКАсА11, а также отсутствие корреляции к остатку р-(?1фЗК свидетельствовало о том, что дисахаридный фрагмент р-(31фЗМ-(1—>2)-а-Ь-Ш1ар1—> являлся боковым ответвлением и присоединялся к остатку Р-С1с/>МАсА" в положение 4.

Локализация остатка 4-гидроксибутановой кислоты была установлена из данных спектра 'Н, 13С-НМВС. Корреляционные кросс-пики между Н-3 и Н-2 атомами остатка Р-(ЗшрЗЫ и С-1 атомом остатка 4-гидроксибугановой кислоты свидетельствовали о том, что остаток 4-гидроксибугановой кислоты присоединялся к аминогруппе при С-3 атоме остатка Р-(2шрЗМ. Кроме того, данные спектра 'Н, "С-НМВС указывали на то, что аминогруппы остатков р-О^АсА1, р-О^АсА" и Р-ОшрЖЫ ацетилированы.

Значительное смещение в более слабое поле сигналов С-2 (8с 78.9 м.д., а-эффект +5.8 м.д.) и Н-2 (5н 4.06 м.д., а-эффект +0.71 м.д.) атомов остатка Р-С?шрЗМ(4НЬ) по сравнению с их значениями в незамещенном моносахариде (8с 73.1 м.д. и 8н 3.35 м.д.), указывало на присутствие неуглеводного заместителя во втором положении этого остатка. Анализ полисахарида методом ИК-спектроскопии показал наличие в составе полисахарида сульфатной группы (характерная полоса поглощения при 1253 см"1).

Таким образом, повторяющееся звено ОПС представляло собой разветвленный пентасахарид, в основной цепи которого находились остатки р-вкрЫЛсА1, р-0!с/>КАсА" и р-ОшрШЫ, с точкой разветвления на остатке Р-01срКАсАп, а в боковой цепи дисахарид-1$-0-дшр2803~ЗМ(4НЬ)-(1—2)-а-Ь-Шцр.

Для подтверждения предполагаемой структуры и последовательности моносахаридов в основной цепи, ОПС был подвергнут распаду по Смиту. В результате гель-хроматографии продуктов реакции выделен модифицированный полисахарид (ОПС-1), который был изучен методом спектроскопии ЯМР, включая двумерные эксперименты.

Сопоставление данных спектров 13С-ЯМР ОПС и ОПС-1 показало отсутствие в спектре 13С-ЯМР ОПС-1 характеристичных сигналов при 5с 99.6 и 17.9 м.д. для остатка а-Ь-ЯЬар; при 8с 104.2, 56.7 и 18.2 м.д. для остатка Р-0-С>шрЗМ(4НЬ); при 8с 178.1, 33.8, 28.7 и 62.2 м.д. для остатка 4-гидроксибутановой кислоты. Это подтвердило замещение остатка а-Ь-Ю1ар по второму положению и нахождение дисахаридного фрагмента, Р-О-С>шр280з~ЗН(4НЬ)-(1—<2)-а-Ь-Ю1ар, в ответвлении. Основная цепь ОПС-1 построена из трисахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка р-В-С1срЫАсА и один остаток р-(2шрКАс4ЫАс. Наличие спин-спинового взаимодействия между Н-1 атомом остатка р-(2шрЫАс4^с и С-3 атомом остатка p-GIcpNAcA в спектре 'Н, ,3С-НМВС ОПС-1 подтвердило, что остаток р-С2шрКАс4НАс гликозилировал остаток Р-СТсрНАсА11 в третье положение.

Абсолютная И-конфигурация остатков p-QшpNAc4NAc, ОшрЗМ(4НЬ), р-ИсрНАсА1 и Р-ИсрЫАсА" была определена на основании величин химических сдвигов их сигналов и а-и р-эффектов гликозилирования, найденных из данных спектров 13С-ЯМР ОПС и ОПС-1.

На основании всех полученных результатов, было установлено, что ОПС I. аЬуязаНз КММ 227т имеет следующую структуру:

-^■3)-Р-0-ди1рМАс4КАс-(1-»3)-Р-0-С1срНАсА11-(1-^4)-р-0-С1с/?МАсА1-(1-^

4

Г 1

Р-П-дшр250з-ЗК(4НЬ)-(1->2)-а-Ы1Ьа

ОПС I. аЬузяаНз КММ 227т имеет уникальную структуру и содержит три кислых компонента в пентасахаридном повторяющемся звене. В его составе впервые в природе обнаружен остаток 3-(4-гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-0-глюкозы,

сульфатированный по второму положению. Сульфатные группы, как уже отмечалось ранее, являются редким компонентом ОПС грамотрицательных бактерий, а присутствие сульфатной группы в аминосахаре обнаружено впервые.

5 Структурное исследование ОПС Ьиоптопт /легшем.™ С5Т

Моносахаридный анализ ОПС Ь. Шеапеп515 в5т показал наличие только двух моносахаридных остатков: (ЗшШЫ и ваВДА. Анализ спектра 13С-ЯМР ОПС указывал на трисахаридный размер повторяющегося звена. Точная идентификация третьего моносахарида была проведена с помощью метода спектроскопии ЯМР.

В спектре 13С-ЯМР ОПС (Рисунок 9), среди прочих, присутствовали: сигнал четвертичного атома углерода при 94.2 м.д. (данные экспериментов ВЕРТ-135 и СБ), относительно слабопольный для метильной группы 6-дезоксисахара сигнал при 6с 12.1 м.д. и пять сигналов, характерных для 3,5-дигидроксигексановой кислоты при 5с 22.9 (СНэ), 44.7, 46.2 (СН2, ОЕРТ-135), 66.4, 67.5 (СНОН), 174.5 м.д. (СООН).

Рисунок 9 - Спектр "С-ЯМР ОПС Ь. 1аеапепз15 С5Т

Анализ спектра |3С-ЯМР ОПС, снятого без подавления спин-спинового взаимодействия атомов углерода с протонами показал, что все три моносахаридных остатка находились в пиранозной форме и имели а-конфигурацию гликозидной связи.

Последовательная корреляция сигналов в спектрах 'Н, 'Н-СОвУ и 'Н, 'Н-ТОСЭУ позволила выделить спиновые системы для трех моносахаридных остатков. Одна из них содержала сигналы пяти протонов и была отнесена к остатку гексуроновой кислоты с галакто-конфигурацией. Вторая спиновая система принадлежала остатку 6-дезоксисахара с глюко-конфигурацией. Третьему моносахаридному остатку с ксгмо-конфигурацией соответствовали две изолированные спиновые системы. Первая содержала три сигнала, включая сигнал протона, резонирующий в аномерной области, а вторая - сигналы протонов СНз-СН-группы. Кроме того, в спектрах были выделены корреляционные кросс-пики, отнесенные к взаимодействию протонов остатка 3,5-дигидроксигексановой кислоты.

С помощью 'Н, 13С-Н8(2С эксперимента были соотнесены сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для остатков а-Са1/?КА, а-<2шрЖЫ и 3,5-дигидроксигексановои кислоты. Спектр 'Н, "С-НМВС позволил объединить две изолированные протонные спиновые системы третьего моносахаридного остатка на основании корреляций между сигналами Н-1/С-5, Н-6/С-4 и Н-З/С-4 при 5н/6с 5.15/70.3, 1.20/94.2 и 3.86/94.2 м.д., соответственно. Сигнал С-4 атома при 94.2 м.д. указывал на наличие гидратированной кетогруппы - СН(ОН)2. Таким образом, третий моносахаридный остаток представлял собой 2-амино-2,6-дидезокси-ксшю-гексоз-4-улозу (а-6с1ху1НехМ-4-и1о) (Таблица 5).

Последовательность моносахаридных остатков и порядок их замещения в полисахариде были определены с помощью 'Н, 'Н-ЯОЕЗУ и 'Н, |3С-НМВС экспериментов. Было показано, что остатки а-СЗшрШЫ и а-6(1ху1НехМ-4-и1о замещены в положение 3, в то время как остаток а-Оа1рМА замещен в положение 4 (Рисунок 10).

Таблица 5 - Данные спектров 'Н- и 13С-ЯМР ОПС Ь. 1аеапепз15 05т (хим. сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток Н/С 1 2 3 4 5 6

->4)-а-0-Са1ЫАсА-( 1 -> 'н 5.29 4.28 3.92 4.39 4.3

иС 98.0 50.3 68.5 76.8 71.5 173.5

->3)-а-0-(2шМАс4КАсу1-(1-> ,'Р 5.09 4.11 4.02 3.87 4.29 1.14

С 98.0 53.3 74.1 57.7 68.2 17.2

-> 3)-а-Ь-6(1ху1НехК-4-и1о-( 1 -> 'и 5.15 4.20 3.86 3.83 1 20

99.0 53.7 76.0 94.2 70.3 12.1

Асу1=-СО-СН2-СН(ОН)-СН2-СН(ОН)-СН3 'н 2.32, 4.13 1.61, 3.97 1.22

ис 174.5 44.7 67.5 46.2 66.4 22.9

Хим. сдвиги для [^-ацетильных групп: 5Н 1.897-2 02; 6С 23.0-23.4 (Ме), 175.0-175.4 (СО)

Наличие четырех сигналов атомов углерода, связанных с азотом и только трех сигналов М-ацетильных групп, найденных из спектра 13С-ЯМР ОПС, свидетельствовали о том, что 3,5-дигидроксигексановая кислота присоединялась к аминогруппе одного из моносахаридных остатков. Из данных 'Н, 13С-НМВС эксперимента установлено, что сигналы протонов при С-2 атомах остатков а-СаМАсА, а-С)1^Ас4К и а-6(1ху1Нех>}-4-и1о коррелировали с соответствующими сигналами карбонильных атомов углерода 14-ацетильных групп, то есть аминогруппы при этих атомах - ацетилированы. Сигнал С-4 атома остатка а-(2шМАс4Ы при 8с 57.7 м.д. свидетельствовал о том, что аминогруппа в этом положении также замещена. Следовательно, 3,5-дигидроксигексановая кислота присоединялась к аминогруппе при С-4 атоме моносахаридного остатка а-(2шНАс4М.

Для подтверждения наличия кетосахара в полисахаридной цепи, ОПС восстанавливали боргидридом натрия, в результате чего карбонильная группа остатка а-6с1ху1НехМ-4-и1о была восстановлена до гидроксильной.

Моносахаридный анализ восстановленного полисахарида показал наличие остатков (2ш/ЯЧАс и РисрЫАс - эпимеров по С-4 атому, полученных при восстановлении кетогруппы 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-/ссшо-гексоз-4-улозы.

Абсолютная Ь-

конфигурация остатка (ЗшИАс, эпимера а-6с1ху1НехМ-4-и1о, была определена на основании величины его удельного оптического вращения. Следовательно, и остаток а-6с1ху1Нех1Ч-4-и1о имел такую же Ь-конфигурацию.

Абсолютная конфигурация остатков а-ОаМАсА и а-<ЗшКАс4И была установлена, исходя из величин химических сдвигов их сигналов в спектре 13С-ЯМР восстановленного полисахарида и а- и (3-эффектов гликозилирования, и показано, что они имели Б-конфигурацию.

асимметрических центров в 3,5-дигидроксигексановой кислоте применяли метод Мошера с использованием /?-, 5-а-метокси-а-трифторметил-а-фенилацетилхлорида (МТРА). Известно, что абсолютную конфигурацию 1,2-, 1,3-, 1,4- и 1,5-диолов с двумя хиральными центрами можно определить, сравнив спектры ЯМР бис-(Я)- и бис-^-МТРА-эфиров (Таблица 6).

Таблица 6 - Данные спектров 'Н-ЯМР МТРА-эфиров 3,5-дигидроксигексановой кислоты (хим. сдвиги, м.д.)

МТРА-эфиры 35,55- дигидроксигексановой кислоты Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 Н-6

Я-МТРА 3.28 дд (4.7 Гц; 16.9 Гц) 3.94 дд (7.9 Гц; 16.5 Гц) 6.03 м 2.14 м, 2.36 м 5.52 м 1.42 д (6.3 Гц)

Я-МТРА 3.36 дд (5.3 Гц; 16.6 Гц) 3.98 дд (7.2 Гц; 16.9 Гц) 6.10 м 2.16 м, 2.30 м 5.36 м 1.28 д (6.1 Гц)

Д(85,-ЗЛ) -0.08, -0.04 -0.07 -0.02, 0.06 0.16 0.14

Нам не удалось выделить 3,5-дигидроксигексановую кислоту в индивидуальном состоянии, поэтому для получения МТРА-эфиров был использован дисахарид, 0-Са1МАсА-(1—>3)-0-(ЗшЫАс4КАсу1, полученный в результате сольволиза ОПС и содержавший 3,5-дигидроксигексановую кислоту. В связи с присутствием в спектре 'Н-ЯМР дисахарида двух наборов сигналов протонов для 3,5-дигидроксигексановой кислоты, он был восстановлен. Карбоксильную группу остатка ва^ДсА метилировали диазометаном для лучшего

Рисунок 10 - Структура повторяющегося звена ОПС /аеапега« в5т

Для определения абсолютной конфигурации

растворения восстановленного дисахарида в пиридине. Далее модифицированный дисахарид был использован для получения МТРА-эфиров. Полученные МТРА-эфиры исследовали с помощью спектроскопии ЯМР и на основании разницы сигналов протонов А(85-5й) было установлено, что асимметрические центры в 3,5-дигидроксигексановой кислоте имели (3S.5S) конфигурацию.

Таким образом, на основании полученных результатов установлено, что повторяющееся звено ОПС L. taeanensis G5T представляет собой трисахарид и имеет следующую структуру:

—4)-a-D-GalNAcA-( 1 -+3)-a-D-QuiNAc4NAcyl-( 1—»3 )-a~L-6dxylHexN-4-ulo-( 1 -»

Где Acyl - (З^^-З^-дигидроксигексановая кислота.

Отличительной особенностью данного полисахарида является одновременное присутствие в его составе двух редко встречающихся в природе Сахаров: кетосахара - 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-Ь-ксггло-гексоз-4-улозы и 2-ацетиламино-4-[(35,,5>?)-3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4-дидезокси-0-глюкозы. Такой же кетосахар, только с абсолютной D-конфигурацией, был обнаружен в составе ОПС Flavobacterhtm columnare АТСС 43622, P. rubra АТСС 29570, Vibrio ordalii 0:2, КПС Streptococcus pneumoniae type 5 и Staphylococcus saprophytics АТСС 15305. Интересно отметить, что во всех этих полисахаридах, за исключением последнего, 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-0-ксгшо-гексоз-4-улоза гликозилирует в положение 4 моносахарид с ji-D-глюко конфигурацией, а сама гликозилирована в положение 3 моносахаридом с a-L-конфигурацией. В случае ОПС L. taeanensis G5T 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-Ь-ксмто-гексоз-4-улоза гликозилирует моносахарид с a-D-галакшо конфигурацией в положение 4, а гликозилирована в положение 3 моносахаридом, имеющим a-D-глюко конфигурацию. Другой редкий моносахарид, 2-ацетиламино-4-[(35,,5^)-3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-0-глюкоза, был идентифицирован ранее только в ОПС F. psychrophilum (259-93). Одновременное присутствие 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-Ь-ксыло-гексоз-4-улозы и 2-ацетиламино-4-[(35,55)-3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-0-глюкозы в составе

полисахарида обнаружено нами впервые.

6 Структурное исследование ОПС Echinicola vietnamensis КММ 6221т

Определение моносахаридного состава и первичный анализ спектра 13С-ЯМР ОПС Е. vietnamensis КММ 6221Т (Рисунок 11) показали, что полисахарид построен из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из остатков GalN, GlcA, GlcNA и Col.

в-6

А-З А-б

NHAc(Cbg

С-5

D-6

NHAC (СО)

С-3

Рисунок 11- Спектр 13С-ЯМР ОПС Е. vietnamensis КММ 6221Т

Из данных спектров *Н, 'H-COSY и 'Н, 'H-TOCSY были выделены спиновые системы для четырех моносахаридных остатков. Два моносахаридных остатка имели относительную гякжо-конфигурацию, третий - галакто-конфигурацию, и последний моносахаридный остаток (Col) содержал корреляционные кросс-пики от Н-1 до Н-4 атома, включая аксиальный и экваториальный Н-3 атомы и спин-спиновое взаимодействие Н-5 атома с Н-6.

Анализ спектра 'Н, l3C-HSQC ОПС позволил соотнести сигналы протонов всех моносахаридных остатков с соответствующими им атомами углерода (Таблица 7). Из данных GD эксперимента следовало, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме, а также то, что остатки GlcA и GlcNA имели Р -конфигурацию гликозидной связи, а остатки D-GalN и Col - а -конфигурацию.

Таблица 7 - Данные спектров 'Н- и 13С-ЯМР ОПС Е. vietnamensis КММ 6221Т (хим. сдвиги, м.д.)

Моносахаридный остаток Н/С 1 2 3 4 5 6 6а,6Ь)

—>4)-p-D-GlcpNAcA-(l—» 'н 4.61 3.74 3.75 3.84 4.00

1JC 102.5 57.1 75.6 77.0 75.6 173.9

а-Со\р-( 1 —> 'н 5.18 3.99 1.77 (а) 1.94 (э) 3.71 4.12 1.11

ьс 99.9 64.4 34.1 69.7 67.8 16.7

—>2,4)-P-D-GlcpA-(l—► 'н 4.76 3.54 3.84 3.77 3.93

"с 103.1 78.5 76.1 81.7 75.3 173.1

—>3)-a-D-GalpNAc-(!—► 'н 5.44 4.18 4.04 4.09 3.89 3.68,3.68

IJC 98.2 50.2 75.4 69.7 72.0 61.7

Хим. сдвиги для N-ацетильных групп: 5Н 2.05 (Ме), 5С 23.3-23.7 (Ме), 175.0-175.9 (СО)

Значительное смещение в слабое поле химических сдвигов сигналов С-4 атома остатка Р-Ос/ЯЧА, С-2 и С-4 атомов остатка р-ЯсрА, С-3 атома остатка а-Оа1рЫАс к 5с 77.0, 78.5 и 81.7, 75.4 м.д., соответственно, по сравнению с их значениями в незамещенных моносахаридах, указывало на порядок замещения моносахаридных остатков в ОПС. Последовательность моносахаридных остатков в ОПС была определена с помощью 'Н, 'Н-ЯОЕЗУ и 'Н, 13С-НМВС экспериментов (Рисунок 12).

Рисунок 12 - Структура повторяющегося звена ОПС Е. vietnamensis КММ 6221х

Абсолютная D-конфигурацня остатка GalNAc была определена на основании величины его удельного оптического вращения. Также, на основании величины удельного оптического вращения подтверждена абсолютная L-конфигурация остатка Col. Абсолютная конфигурация остатков p-GlcNAcA и p-GlcA была установлена на основании величин химических сдвигов их сигналов в спектрах 'JC-flMP и а- и Р-эффектов гликозилирования и показано, что они имели D-конфигурацию.

Таким образом, на основании полученных результатов, установлено, что повторяющееся звено ОПС Е. vielnamensis КММ 62211 представляет собой тетрасахарид и имеет следующую структуру:

a-Colp

1

1

2

-»4)-P-D-GlcpNAcA-( 1 ->4)-P-D-GlcpA-( 1 -+3)-P-D-GalpNAc-( 1 -> 7 Цитокин-индуцирующая активность липополисахаридов

Известно, что ЛПС обладают способностью к взаимодействию с различными сайтами на поверхности иммунокомпетентных клеток, что обеспечивает модуляцию различных компонентов иммунной системы хозяина. ЛПС активируют компоненты плазмы (системы комплемента и свертывания крови) и клетки иммунной системы (моноциты и макрофаги, полиморфоядерные клетки и лимфоциты), что приводит к продукции цитокинов (ФНО-а, интерлейкины) и других провоспалительных медиаторов. Недавние исследования способности ЛПС морских микроорганизмов выступать в качестве антагонистов эндотоксинов патогенных грамотрицательных бактерий показали перспективность работ в этом направлении. Известные к настоящему моменту антагонисты эндотоксинов являются нетоксичными или слаботоксичными веществами. В рамках данного исследования мы оценили эндотоксический потенциал ЛПС изученных нами морских бактерий.

Определение цитотоксической активности ЛПС по отношению к лимфоцитам селезенки мыши показало, что они не обладают токсичностью в диапазоне концентраций от 0.01 до 100 мкг/мл. Для характеристики эндотоксического потенциала ЛПС была определена их способность индуцировать синтез медиаторов восполительного процесса ФНО-а (Рисунок 13 а) и ИЛ-6 (Рисунок 13 Ь) в клетках цельной крови человека.

30 а) 2500-, Ь)

25 2000

г 4 15 ■ 0 01 мкг/мл ■ 01 мг/мп 01 MtfMTl 1 1500 | 1000 ■ 0 01 utr/un ■ 0 1 иг/un □ 1 икг/ип

5 , J i. 1 500

•v «ь > <о <6 «1 <ь

с*

Рисунок 13 - Индукция синтеза ФНО-а (а) и ИЛ-6 (Ь) ЛПС морских бактерий в клетках цельной крови человека. 1 - ЛПС С. pacifica 3879т, 2 - ЛПС С. pacifica 3878, 3 - ЛПС R. pacifica КММ 1406т, 4 - ЛПС I. abyssalis КММ 227т, 5 - ЛПС L. taeanensis G5T, 6 - ЛПС Е. vietnamensis КММ 6221т

Обнаружено, что максимальной способностью индуцировать синтез ФНО-а (Рисунок 13 а), среди изученных ЛПС, обладали ЛПС С. pacifica 3879' и /. abyssalis КММ 227 при концентрации 1 мкг/мл. При концентрации 0.1 мкг/мл активность этих ЛПС была невысокой.

При концентрации 0.01 мкг/мл невысокую активность проявляли ЛПС L. taeanensis G5T и ЛПС Е. vietnamensis КММ 6221т. Остальные ЛПС не вызывали индукцию синтеза цитокина ФНО-а. Как видно из данных рисунка 13 Ь, наибольшей способностью индуцировать синтез цитокина ИЛ-6 обладали также ЛПС С. pacifica 3879т и I. abyssalis КММ 227т при концентрации 1 мкг/мл. При концентрациях 0.01 и 0.1 мкг/мл их активность была примерно одинакова. ЛПС С. pacifica 3878, L. taeanensis G5T и Е. vietnamensis КММ 6221т проявляли невысокую индуцирующую активность при этих же концентрациях. ЛПС R. pacifica КММ 1406т при всех концентрациях индуцирующей активности не проявлял.

Полученные результаты показывают, что ЛПС всех изученных бактерий являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а и ИЛ-6. Выявленные различия в способности ЛПС индуцировать синтез ФНО-а и ИЛ-6, по-видимому, можно объяснить наличием различных функциональных групп в составе липидов А, обуславливающих их эндотоксическую активность. Это позволяет предположить, что эти ЛПС могут быть потенциальными антагонистами эндотоксинов грамотрицательных бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена полная структура шести О-антигенных полисахаридов из неизученных ранее морских грамотрицательных бактерий: Cobetia pacifica КММ 3879 , Cobetia pacifica КММ 3878, Rheinheimera pacifica КММ 1406T, Idiomarina abyssalis КММ 227T, Litorimonas taeanensis G5T, Echinicola vietnamensis KMM 6221T.

2. Установлено, что два штамма морского микроорганизма Cobetia pacifica (КММ 3879т и КММ 3878) продуцируют различные по структуре сульфатированные О-специфические полисахариды, построенные из трисахаридных повторяющихся звеньев. Отличительной особенностью О-антигенного полисахарида С. pacifica КММ 3878 является наличие 2,3-0-дисульфат-0-галактозы, обнаруженной в природе впервые, и 3,4-0-[(5-карбоксиэтилиден)]-0-галактозы - редкого компонента для бактериальных гликанов.

3. Показано, что глубоководные морские бактерии Rheinheimera pacifica КММ 1406т и Idiomarina abyssalis КММ 227 продуцируют высокоаминированные кислые О-антигенные полисахариды, построенные из пентасахаридных повторяющихся звеньев. О-специфический полисахарид Idiomarina abyssalis КММ 227т содержит впервые обнаруженную в природе 3-(4-гидроксибутаноил)-амино-3,6-дидезокси-0-глюкозу, сульфатированную по второму положению.

4. В составе О-антигенного полисахарида морского микроорганизма Litorimonas taeanensis G5T впервые идентифицирован остаток 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-Ь-гексоз-4-улозы и обнаружено редко встречающееся в природе производное моносахарида - 2-ацетиламино-4-[(35,55)-3,5-дигидроксигексаноил]-амино-2,4,6-тридезокси-Э-глюкоза.

5. Показано, что метод Мошера с использованием R-, 5-а-метокси-а-трифторметил-а-фенилацетилхлорида позволяет определить абсолютную конфигурацию неуглеводного заместителя с двумя асимметрическими центрами. Конфигурация асимметрических центров (35,55)-3,5-дигидроксигексановой кислоты в составе полисахарида Litorimonas taeanensis G5T установлена с помощью метода Мошера, который впервые применен в структурной химии углеводов.

6. В результате изучения иммуностимулирующей активности ЛПС С. pacifica КММ 3879т, С. pacifica КММ 3878, R. pacifica КММ 1406т, I. abyssalis КММ 227т, L, taeanensis G5 и Е. vietnamensis КММ 6221Т впервые установлено, что все исследованные ЛПС не токсичны и являются слабыми индукторами провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а и ИЛ-6, что представляет интерес с точки зрения изучения их антагонистических свойств.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в рецензируемых журналах

1. Kokoulin M.S., Kalinovskiy A.I., Komandrova N.A., Tomshich S.V., Tovarchi V.E., Nedashkovskaya O.I., Vaskovsky V. E. The structure of the O- specific polysaccharide from marine bacterium Litorimonas taeanensis G5T containing 2-acetamido-4-((3S,5S)-3,5-dihydroxyhexanamido)-2,4-dideoxy-D-quinovose and 2-acetamido-2,6-dideoxy-L-xylo-hexos-4-uIose // Carbohydr. Res. 2013. V. 375. P.105-111.

2. Kokoulin M.S., Kalinovskiy A.I., Komandrova N.A., Tomshich S.V., Romanenko L.A., Vaskovsky V. E. The sulfated O-specific polysaccharide from the marine bacterium Cobetia pacifica KMM 3879T// Carbohydr. Res. 2014. V. 387, N 1. P.4-9.

3. Komandrova N.A., Kokoulin M.S., Kalinovskiy A I., , Tomshich S.V., Romanenko L.A., Vaskovsky V. E. The O-specific polysaccharide of the marine bacterium Rheinheimera pacifica KMM 1406T containing D- and L-2-acetamido-2-deoxy-galacturonic acids // Carbohydr. Res. 2014. V. 394. P.l-6.

4. Kokoulin M.S., Kalinovskiy A.I., Komandrova N.A., Tomshich S.V., Romanenko L.A., Vaskovsky V. E. The new sulfated O-specific polysaccharide from marine bacterium Cobetia pacifica KMM 3878, containing 3,4-0-[(S)-l-carboxyethylidene]-d-galactose and 2,3-O-disulfate-d-galactose // Carbohydr. Res. 2014. V. 397, N 1. P.46-51.

Тезисы конференций

1. Kokoulin M.S., Komandrova N.A., Kalinovskiy A.I., Tomshich S.V., Romanenko L.A. Structure of the O-Specific polysaccharide from a marine bacterium Litorimonas taeanensis G5T // S"1 Baltic meet, in microb. Carbohydr., Suzdal, Russia, 2-6 Sept. 2012: progr. and abstrs. - Suzdal: О 6.

2. Komandrova N. A., Isakov V. V., Tomshich S. V., Kokoulin M. S., Romanenko L. A. Structure of an acidic O-specific polysaccharide of the marine bacterium ldiomarina abyssalis KMM 227т// 5"1 Baltic meet, in microb. Carbohydr., Suzdal, Russia, 2-6 Sept. 2012: progr. and abstrs. - Suzdal: P 21.

3. Komandrova N. A., Kokoulin M, S., Isakov V. V., Tomshich S. V., Romanenko L. A. Structure of O-specific polysaccharide of the marine bacterium Rheinheimera pacifica KMM 1406T // Г Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides, Nha Trang, Vietnam, 10-17 Dec. 2012: abstract book and sci. progr. - Nha Trang: VAST, 2012. -P. 56.

4. Kokoulin M.S., Komandrova N.A., Kalinovskiy A.I., Tomshich S.V., Romanenko L.A. Structural study of the O-specific polysaccharide from a marine bacterium Cobetia pacifica KMM 3879T // Is' Symp. on Marine Enzymes and Polysaccharides, Nha Trang, Vietnam, 10-17 Dec. 2012: abstract book and sci. progr. - Nha Trang: VAST, 2012. - P. 19.

5. Командрова H.A., Томшич СВ., Кокоулин М.С. Пислягин Е.А. Структурные особенности О-антигенов некоторых представителей морских протеобактерий и их биологическая активность // 2-я Всероссийская конф. «Фундаментальная гликобиология», Саратов, Россия, 7-11 июля, 2014 г.: мат. конф. - Саратов: ООО «Ракурс», 2014.-С 11.

6. Кокоулин М.С., Командрова Н А., Калиновский А.И., Томшич С.В. Структуры сульфатированных О-специфических полисахаридов морских бактерий рода Cobetia // 2-я Всероссийская конф. «Фундаментальная гликобиология», Саратов, Россия, 7-11 июля, 2014 г.: мат. конф. - Саратов: ООО «Ракурс», 2014. -С 35.

7. Кокоулин М.С., Командрова Н А, Калиновский А.И., Томшич С.В., Романенко JI.A. О-антигенные полисахариды морских глубоководных грамотрицательных бактерий Rheinheimera pacifica KMM 1406т и ldiomarina abyssalis KMM 227т // 6-й Международный симпозиум «Химия и химическое образование», Владивосток, Россия, 28 сентября-3 октября, 2014 г.: сборник науч. трудов - Владивосток: Дальневост. Федерал. Ун-т, 2014. -С 32-33.

Кокоулин Максим Сергеевич

Структурное исследование О-антигенных полисахаридов отдельных представителей морских грамотрицательных бактерий методом спектроскопии ЯМР

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 21.10.2014. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 498.

Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10