Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa

Быстрова, Ольга Витальевна

Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Быстрова, Ольга Витальевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2004 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa»

Автореферат диссертации на тему "Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

БЫСТРОВА ОЛЬГА ВИТАЛЬЕВНА

УСТАНОВЛЕНИЕ ПОЛНОЙ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИИ PSEUDOMONASAER UGINOSA

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Юрий Александрович Книрель

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Николай Владимирович Бовин кандидат химических наук Филипп Владимирович Тоукач

Ведущая организация:

Государственный научный центр прикладной микробиологии, Оболенск, Московская область

Защита состоится «_12 » марта 2004 г. в 10 часов

на заседании диссертационного совета К 002.222.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата химических наук при Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН по адресу 119991, Москва, Ленинский проспект, 47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН

Автореферат разослан «11» февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук

Людмила Александровна Родиновская

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) -грамотрицательный условно-патогенный микроорганизм, проявляющий себя при состояниях, связанных с резким угнетением иммунной системы, часто вследствие термических ожогов и хирургических операций, а также при предрасполагающих заболеваниях, таких как муковисцидоз и рак.

Липополисахарид (ЛПС) является одним из основных компонентов наружной мембраны клеточной оболочки грамотрицательных бактерий и фактором их вирулентности. Он играет важную роль во взаимодействии бактерий с окружающей средой, включая организм хозяина, по отношению к которому ЛПС проявляет себя как эндотоксин и антиген. Септический шок, вызываемый эндотоксином, остается актуальной медицинской проблемой в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и высокой летальности. Вместе с тем эндотоксин способен оказывать и благотворное влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к инфекциям.

ЛПС имеет сложное строение и включает три различные по составу и функциональному назначению области - О-полисахарид (О-антиген), построенный из повторяющихся олигосахаридных звеньев, липидный участок, - так называемый, липид А и соединяющий их олигосахарид, называемый кором. Такое строение ЛПС характерно для всех диких штаммов бактерий (ЛПС S-типа). Природные или искусственно полученные шероховатые мутанты имеют ЛПС R-типа, лишенный О-полисахарйдной цепи. В гладких штаммах наряду с ЛПС S-типа присутствуют также молекулы с О-полисахаридом, представленным одним олигосахаридным звеном (ЛПС SR-типа). Изучение строения ЛПС необходимо для понимания на молекулярном уровне патофизиологических процессов, происходящих при бактериальных инфекциях, и механизмов функционирования защитных систем животных и человека.

Хроническая респираторная инфекция у больных муковисцидозом вызывается шероховатыми штаммами P. aeruginosa. Этим обусловлен особый интерес к кору P. aeruginosa, который является лигандом, узнаваемым рецепторами эпителиальных клеток. Предполагается, что увеличение устойчивости P. aeruginosa к клеточному поглощению, способствующее поддержанию хронической инфекции, связано с изменениями в строении кора и липида А. Выяснение строения этих участков ЛПС необходимо для понимания того, как бактерия инициирует и поддерживает хроническую инфекцию, и для создания новых терапевтических подходов для борьбы с ней.

Напротив, больные с ослабленной иммунной системой страдают от инфекций, вызываемых гладкими штаммами P. aeruginosa. Эти штаммы серологически гетерогенны и разделяются на тринадцать О-серогрупп на основе их иммуноспецифичности, определяемой тонкой структурой О-полисахарида. Структурный анализ О-полисахаридов P. aeruginosa проводился ранее, однако строение, так называемого, биологического повторяющегося звена - олигосахарида, путем полимеризации которого в процессе биосинтеза ЛПС образуется О-полисахарид, в большинстве серогрупп оставалось неизвестным.; Решение этой

проблемы является важной задачей, поскол

роснациональная L *У iftfcjflöY^F фосновать

иммуиоспецифичность штаммов P. aeruginosa на молекулярном уровне. Данные о структуре биологических повторяющихся звеньев и строении области связывания О-полисахарида с кором способствуют также лучшему пониманию путей биосинтеза ЛПС и генетических и биохимических механизмов диверсификации поверхностных структур микробной клетки.

Цель работы. Целью настоящего исследования было а) определение полной структуры кора ЛПС шероховатого клинического изолята от больного муковисцидозом и гладких типовых штаммов серогрупп P. aeruginosa, выявление консервативных и вариабельных элементов строения кора; б) определение места присоединения и типа связи между О-полисахаридом и кором; в) установление строения биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов всех серогрупп P. aeruginosa и, как следствие, идентификация терминальных участков О-полисахаридов, вносящих наибольший вклад в иммуноспецифичность штаммов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе установлено строение ЛПС клинического изолята от больного муковисцидозом и типовых штаммов всех тринадцати О-серогрупп P. aeruginosa. Показано, что в ЛПС всех серогрупп присутствуют различные гликоформы кора, только к одной из которых может присоединяться О-полисахарид. Локализовано положение фосфатных групп и остатка дифосфоэтаноламина во внутренней области кора ЛПС. Впервые обнаружены О-ацетильные группы во внешней области кора P. aeruginosa и выявлен случайный характер их распределения. Определено строение биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов в одиннадцати серогруппах P. aeruginosa (из них в девяти серогруппах впервые) и тип связи между О-полисахаридом и кором. В частности, показано, что первым моносахаридом повторяющихся звеньев является 6-дезоксиаминосахар, который, вне зависимости от конфигурации его связи во внутренних повторяющихся звеньях О-полисахарида, присоединяется к кору Р-гликозидной связью. В результате установлено полное строение ЛПС P. aeruginosa, выявлены консервативные и вариабельные структурные элементы ЛПС, а также сделан ряд выводов о молекулярных основах иммуноспецифичности этих бактерий и особенностях биосинтеза их ЛПС.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 2000 г.), XI и XII Европейских симпозиумах по углеводам (Лиссабон, Португалия, 2001 г.; Гренобль, Франция, 2003 г.) и II Германо-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Москва, Россия, 2002 г.).

Публикации. По материалам исследований опубликовано шесть статей и тезисы трех докладов на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, результатов исследования строения ЛПС P. aeruginosa, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов, а также включает список литературы и приложение (табулированные данные спектров ЯМР). В литературном обзоре дана общая характеристика ЛПС и рассматриваются особенности строения кора ЛПС различных грамотрицательных бактерий. Работа изложена на стр., содержит

So рисунка/ '''^О'таблиц и з> ог литературных ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Содержание работы представлено в двух основных частях. В первой части описаны подходы к структурному анализу ЛПС и их применение для установления строения ЛПС шероховатого клинического изолята и гладких типовых штаммов различных серогрупп P. aeruginosa. Во второй части обсуждаются особенности строения ЛПС P. aeruginosa и значение полученных данных для понимания путей биосинтеза ЛПС и иммуноспецифичности P. aeruginosa на молекулярном уровне.

1. Установление строения липополисахаридов

1.1. Общие подходы к структурному анализу липополисахаридов

В работе исследованы ЛПС R-типа из шероховатого клинического изолята P. aeruginosa 2192 от больного муковисцидозом, лишенного О-полисахаридной цепи, и ЛПС S-типа девятнадцати типовых штаммов различных серотипов всех О-серогрупп P. aeruginosa по классификации Лани-Бергана. Гладкие штаммы выращивали в ЦНИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва) на плотной агаровой среде на бульоне Хотгингера, ЛПС выделяли экстракцией 45% водным фенолом по методу Вестфаля. Шероховатый штамм культивировали в ферментере на питательном соевом бульоне в Лаборатории Чэннинга Гарвардской медицинской школы (Бостон, США), ЛПС выделяли экстракцией смесью фенол/хлороформ/петролейный эфир по методу Галаноса.

Для установления строения ЛПС расщепляли двумя способами - жесткой щелочной обработкой и мягким кислотным гидролизом. Исследуя полученные продукты химическими методами, с помощью масс-спектрометрии (МС) и спектроскопии ЯМР, получали дополняющие друг друга данные о структуре ЛПС.

Жесткая щелочная деградация ЛПС, приводящая к полному дезацилированию ЛПС, применялась для установления строения углеводной основы кора, места и способа присоединения О-полисахарида, а также для локализации фосфатных групп. Она проводилась последовательно путем О-дезацилирования ЛПС гидразинолизом в мягких условиях и N-дезацилирования водной щелочью в жестких условиях. Двухступенчатая обработка ЛПС позволяла избежать Р-элиминирования в 3-ацилоксиацильных группах, присутствующих в липиде А, с образованием ненасыщенных жирных кислот, отщепляющихся труднее, чем насыщенные кислоты; тем самым достигалось более полное N-дезацилирование липида А и соответственно повышался выход целевых продуктов. Продукты деградации выделяли хроматографией на геле Sephadex G-50 и при необходимости фракционировали высокоэффективной анионообменной жидкостной хроматографией (ВЭАЖХ) на носителе CarboPac PA1 с импульсным амперометрическим детектированием.

Мягкий кислотный гидролиз нагреванием ЛПС с разбавленной уксусной кислотой или буфером при рН4,2 приводил к расщеплению кислотолабильной гликозидной связи остатков 3-дезокси-0-лшн«о-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo), один из которых соединяет кор с липидом А. В результате из ЛПС R-типа получали олигосахариды кора с остатком Kdo на восстанавливающим конце, а из ЛПС S-типа и SR-типа - олигосахарид кора с присоединенным О-полисахаридом или одним олигосахаридным повторяющимся звеном О-полисахарида соответственно (рис. 1). Этот подход использовался в основном для локализации ацильных заместителей и дифосфоэтаноламина в коре, а также для структурного анализа липида А.

Рис. 1. Схематическое представление мягкого кислотного деградации ЛПС S-штамма.

Для определения моносахаридного состава олигосахаридных продуктов деградации ЛПС использовали ГЖХ-анализ ацетатов полиолов. Аминокомпоненты кора и липида A (GlcN, GalN, аланин и этаноламин) идентифицировали с помощью ВЭЖХ фенилизотиоцианатных производных на обращенной фазе. Абсолютные конфигурации моносахаридов определяли методом ГЖХ ацетилированных гликозидов с оптически активными спиртами. Места замещения моносахаридов определяли методом ГЖХ-МС частично метилированных ацетатов полиолов. Консервативный характер строения кора P. aeruginosa позволил ограничиться детальным анализом первых из исследованных ЛПС и делать выводы о составе и структуре кора остальных ЛПС на основании сравнительного анализа данных МС и спектроскопии ЯМР.

Масс-спектрометрия отрицательных ионов с ионизацией электрораспылением (МС ИЭР) или с лазерной десорбцией и ионизацией при соучастии матрицы использовалась для определения молекулярной массы продуктов деградации ЛПС, что давало информацию об их составе, а также о природе и степени их гетерогенности. Сравнительный анализ масс-спектров олигосахаридных смесей, полученных при деградации ЛПС различных серогрупп, позволял выявлять сходные структуры и отбирать соединения для более детального исследования. Увеличение ионизирующего потенциала при МС ИЭР вызывало диссоциацию ионов при впрыскивании с образованием фрагментов, анализ которых давал информацию о строении кора, включая положение неуглеводных заместителей.

Для детального структурного анализа продуктов деградации ЛПС использовалась спектроскопия ЯМР на ядрах 'Н, 13С И 31Р. Полное отнесение спектров 'н-ямр проводилось с помощью двумерной спектроскопии COSY и TOCSY. Спиновые системы различных моносахаридов идентифицировали на основании характерных значений КССВ J^, И J^s- Последовательность моносахаридных остатков определяли с помощью двумерных экспериментов ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY или ROESY), коррелирующих химические сдвиги сближенных в пространстве протонов соседних моносахаридных остатков. Конфигурацию гликозидных связей моносахаридов с глюко- и галакто-кофигурацией (Glc, GlcN, GalN, QuiN) определяли по величинам КССВ Ji^, которые имеют относительно большую величину (7-8 Гц) для Р-связанных моносахаридов и меньшую величину (3-4 Гц) для а-связанных моносахаридов. Аномерные конфигурации остальных моносахаридов определяли на основании типичных химических сдвигов в спектрах

'Н-ЯМР. В ряде случаев проводилось полное отнесение сигналов в спектрах 13С-ЯМР с использованием эксперимента 'H,13C-HMQC, коррелирующего химические сдвиги атомов углерода и присоединенных к ним протонов. При этом выявлялись спиновые системы аминосахаров на основании корреляции между протоном при атоме углерода, связанном с азотом, и соответствующим атомом углерода, а также определялись положения замещения моносахаридов по характерному слабопольному смещению сигналов замещенных атомов углерода. Положение фосфатных групп и дифосфоэтаноламина определяли с использованием экспериментов 'Н^'Р-НМрС и которые выявляли корреляции между атомами фосфора и соответствующими протонами моносахаридных остатков.

1.2. Установление строения ЛПС шероховатого клинического изолята 2192 1.2.1. Жесткая щелочная деградация

Щелочная деградация ЛПС R-типа из шероховатого клинического изолята P. aeruginosa 2192 проводилась как для исходного, так и для частично дефосфорилированного ЛПС и привела к продуктам, содержащим фосфорилированную в различной степени углеводную основу кора-липида А. Моносахаридный анализ продуктов показал присутствие типичных компонентов кора P. aeruginosa, включая D-глюкозу, L-рамнозу, Ь-глицеро-О-манно-гетозу (Hep) и D-галактозамин, а также D-глюкозамин, составляющий углеводную основу липида А. По данным МС все олигосахариды содержали также два остатка Kdo и являлись ундекасахаридами с углеводным составом

Для определения строения олигосахаридов проводили фракционирование их смесей с помощью ВЭАЖХ в суперосновной среде (для улучшения хроматографического разделения смеси предварительно N-ацетилировали). В результате из частично дефосфорилированного ЛПС получили три продукта (OC2192-I-I, OC2192-I-2 И ОС2192-1-З), а из интактного ЛПС - три основных продукта (ОС2192-2-1, ОС21,2-2-2 и ОС2192-2-3) и один минорный продукт (OC2i92-2-4) (рис.2.).

Рис.2. ВЭАЖХ N-ацетилированных продуктов жесткой щелочной деградации частично дефосфорилированного (слева) и интактного (справа) ЛПС P. aeruginosa 2192.

Минорный компонент из интактного ЛПС оказался наиболее

фосфорилированным продуктом, содержащим шесть фосфатных групп, тогда как основные продукты содержали по пять фосфатных групп (мол. массы 2644 и 2564 Да

соответственно; данные лазерной МС, рис. ЗА). Анализ ионов, образовавшихся за счет разрывов гликозидных связей остатков Hep и Kdo при лазерной фрагментации олигосахаридов в источнике, позволил получить информацию о распределении фосфатных групп в молекуле (рис. ЗВ). Фрагменты с невосстанавливающего конца ОСЦ92-2-4 образовались при расщеплении гликозидных связей остатков Kdo1 (ВЗ, m/z 1981), Hep1 (В2, m/z 1540) и Нерп (В[, m/z 1188); фрагменты Вз и В2 содержали по четыре фосфатные группы, а фрагмент Bj - две фосфатные группы, и, таким образом, каждый из остатков Hep1 и Нерп бисфосфорилирован (две оставшиеся фосфатные группы присоединены к дисахаридной основе липида А). Фрагментов с невосстанавливающего конца, меньших, чем Вь зарегистрировано не было, и, следовательно, внешняя область кора не содержит фосфатных групп.

Рис. 3. Масс-спектр с лазерной десорбцией и ионизацией при соучастии матрицы (А) и масс-спектр с лазерной фрагментацией в источнике (В) N-ацетилированных продуктов жесткой щелочной деградацииЛПС P. aeruginosa 2192.

Строение полученных продуктов установлено с помощью двумерной спектроскопии ЯМР, причем отнесение спектров 'Н-ЯМР (рис.4) проводилось поэтапно сначала для менее, а затем для более фосфорилированных соединений. Олигосахариды отличались структурой углеводной цепи, представляя две изомерные формы внешней области кора, названные нами гликоформами 1 и 2 (структуры 1 и 2, рис. 5). Имея общий тетрасахаридный фрагмент, включающий остаток галактозамина и три остатка глюкозы, они отличались положением остатка рамнозы. В соответствии с

этим моносахариды внешней области кора давали по две серии сигналов в спектре 'Н-ЯМР, тогда как каждый из остатков Hep, Kdo и GlcN внутренней области кора-лшшда А давал одну серию сигналов (рис. 4). Другие отличия между олигосахаридами связаны с количеством и характером распределения фосфатных групп, а также с неполнотой N-ацетилирования одного из остатков глюкозамина (рис. 5).

Рис. 4. Спектр Н-ЯМР N-ацетшшрованного продукта жесткой щелочной деградации с частичным дефосфорилированием ЛПС P. aeruginosa 2192 (ОСгш-Ы)- Сигналы остатков рамнозы из гликоформ кора 1 и 2 показаны прямым шрифтом и курсивом соответственно.

L-Rha-(l-+6)-Glcn-(l->4)-| R5-6-| R3-2-J p(4*-2)-KdoD

Glo'"-(l->6)-Glc'-(pi->3)-GalNAc-(l->3)-HepI,-(l-»3)-Hep,-{l->5)-Kdo1-(2-+6)-Glc№ Rl-(ßl->6)-GlcN'Ac-l-/'

R4-4-I R2-4J P-4J

Glcn41->4>| RS-6-| R3-2-J |-(4«-2)-Kdo"

Glc"'-(1 ^6>Glc'4ßl -+3>GaINAc41-+3>Hepn-(l ->3>Hep'-(l ->5>Kdo'-(2-^)-GlcN11 R1 -{ßl -»¿K'lcN'Ac-l-P L-Rha-(l-»3}l R4-4J R2-4J P-4-1

Олигосахарид Глвкоформа R1 R2 R3 R4 R5

ОС2192-1-1 1и2 Ас Р Н Н Н

ОС21И-1-2 1 и2 Н Р н н н

ОС2192-1-3 1 и2 Ас Р р н н

OC2192-2-I 2 Ас Р р р н

ОС2,92-2-2 1 Ас Р р р н

ОС2192-2-3 1 и2 Ас Р р н р

ОСзш-2-4 1 и2 Ас Р р р р

Рис.5. Строение N-ацетилированных продуктов жесткой щелочной деградации ЛПС P. aeruginosa 2192. Здесь и далее моносахариды находятся в пиранозной форме, имеют D-конфигурацию и присоединены ос-гликозидной связью, если не указано обратное.

1.2.2. Мягкий кислотный гидролиз

Олигосахариды, полученные при мягком кислотном гидролизе ЛПС при рН 4,2, содержали рамнозу, глюкозу и гептозу в соотношении 1:3,4:0,3 наряду с галактозамином и аланином в соотношении 1,2:1 и следовыми количествами этаноламина. Дефосфорилирование олигосахаридов привело к заметному увеличению содержания гептозы в гидролизате (Rha:Glc:Hep 1:3,5:1,0 соответственно).

Спектры ЯМР показали значительную структурную гетерогенность продукта кислотного гидролиза. Это подтверждалось данными масс-спектра ИЭР, которые показали присутствие соединений, отличающихся количеством фосфатных групп (до пяти) и О-ацетильных групп (до четырех), а также продуктов частичной дегидратации остатка Kdo. В состав олигосахаридов входили также карбамоильная группа (Cm) и аланин. Масс-спектр ИЭР с диссоциацией ионов при впрыскивании показал разрыв связи между остатками Hep. Образовавшиеся ионы фрагментов с невосстанавливающего конца имели такой же характер О-ацетилирования, как и вся молекула в целом, и, следовательно, О-ацетильные группы расположены во внешней области кора.

Двумерные спектры COSY и TOCSY продукта кислотного гидролиза ЛПС показали значительное смещение в область слабого поля на ~ 1,2 м.д. части сигналов Н2 остатка рамнозы обеих гликоформ кора по сравнению с их положением в спектре О-дезацетилированных олигосахаридов. Это смещение, вызванное дезэкранирующим эффектом О-ацетилирования, указывало на локализацию одной из О-ацетильных групп в положении 2 остатка рамнозы. Попытка установить положение остальных О-ацетильных групп не удалась из-за высокой структурной гетерогенности образца.

Полученные данные о строении кора ЛПС клинического изолята P. aeruginosa 2192 обобщены на рисунке 6.

Glcm41^6>GlcI4ßl^3>GlN<1^3)-Hepn41^3>Hep4l-^5)-Kdo1

Glcnl-(1 ->6)-G|cI-(ßl-^3)-GalN-{l->3>Hepn-(l -»■3)-Нер1Ч1 ->5)- Kdo1

Рис. 6. Строение продуктов мягкого кислотного гидролиза ЛПС P. aeruginosa 2192 (верхняя и нижняя структуры кора соответствуют гликоформам 1 и 2). к = 0 или 1; m, n и р = 1 или 2; т + п = 2 или 3.0-Ацетильные группы внешней области кора, не показаны.

1.3. Установление строения ЛПС гладких типовых штаммов серогрупп 1.3.1. Жесткая щелочная деградация

Щелочная деградация ЛПС типовых штаммов серогрупп проводилась без последующего N-ацетилирования. Полученные продукты исследовались с помощью МС ИЭР, и для большинства из них также проводился детальный структурный анализ с помощью спектроскопии ЯМР. Продукты, полученные из ЛПС серогрупп 0-14 и 0-15, представляли собой изомерные пентакисфосфорилированные ундекасахариды

(соединения За и 4) (рис.7), аналогичные сответствующим олигосахаридам, полученным из клинического изолята P. aeruginosa 2192 (раздел 1.2.1). Из ЛПС каждого из типовых штаммов остальных серогругш получены олигосахариды двух типов. Первый соответствовал пентакисфосфорилированной углеводной основе кора-липида А гликоформы 1 (соединения 3) и был либо идентичен ундекасахариду За {гликоформа 1а), либо отличался от него присутствием дополнительного, четвертого остатка глюкозы (ЗЬ, гликоформа 1Ь). Продукт второго типа включал пентакисфосфорилированную углеводную основу кора-липида А гликоформы 2, замещенную повторяющимся звеном О-полисахарида (соединения 5-7) или его фрагментом (соединения 8-11) (рис. 7).

R->2>L-Rha-{l-»6)-GlcI4l->4)-| Р-6-1 Р-2-j |-(4<-2)-Kdou

Glc[,,-<l-+6)-Glct-(pl->-3)-GalN4W3>Hepn-(l->3>HepI-(l-»5)-Kdo,42->6)-GlcNI!4Pl->6>GlcN,-l-/>

р-4 J f-4-l

Серогруппа Соединение R Мол. масса

0-1, 0-3,0-б, 0-9, 0-12-0-15 За Н 2357,51-2357,54

0-7, 0-Ю ЗЬ Glc^-Cßl 2519,64

Glc"-{1->4)-j P-6-J P-2-j ^4<-2>Kdon

Glcm-(1^6)-GlcI-(ßI-»3)-GaiN-(l-»3)-Hepn-(l-»3)-HepI-(l-*5)-Kdo'-(2->6)-GlcNII-(pl-*6)-GlcN'-l-/> R-»3)-L-Rha-(l-»3)J P-4J P-4 J

Серогруппа Соединение R Мол. масса

0-14,0-15 4 Н 2357,52

0-7 5 Pse-(«2->4)-Xyl-(ß 1 ->3)-FucN-(ß 1 2866,75

0-9 6а Pse-(ß2-M)-FucN-(cel->3)-QuiN-(ß 1 2879,81

6Ь Pse-(ß2-H)-FucN-(al-»3)-QuiNAc-(ßl 2921,82

0-12 7а 8eLeg-(ct2->3>L-FucN-(al->3)-QuiN-(ßl 2879,51

7Ь 8eLeg-(a2->3)-L-FucN-(al->3)-QuiNAc-(ßl 2921,52

0-6, 0-13 8 L-AHcxNA-(ßl->3>QuiN-(ßl 2659,64

0-10 9 AHexNA-(ß 1 —»3)-QuiN-(ß 1 2659,62

О-З 10 AIIexNA-(ßl->3)-QuiN4N(3HOBu)-(ßl 2477,70

0-1 11а FucN-(al->3)-QuiN-(ßl 2647,66

lib FucN-(al ->3)-QmNAc-(ß 1 2689,68

Рис. 7. Продукты жесткой щелочной деградации ЛПС типовых штаммов серо групп с кором гликоформы 1 (соединения 3) и гликоформы 2 (соединения 4-11). Моноизотопные молекулярные массы (Да) приведены по данным МС ИЭР. Условные обозначения: Рее и 8е1^ - 5,7-Диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-г1и^о-Ь-л<анно-нон-2-улозоновая (псевдаминовая) и -]^глицеро-0-га1акто-нон-2-улозотвая (8-эпилегионаминовая) кислоты, ДHexNA - 2-амино-2-дезокси-7ирео-гекс-4-енуроновая кислота, ОиГЫ - 2-амино-2,6-дидеэоксиглюкоза, БисИ -2-амино-2,6-дидезоксигалахтоза, - 2,4-диамино-2,4,6-трйдезоксиглюкоза

(бациллозамин), ЗНОВи- 3-гидроксибутаноил.

Соединения 8-10 образовались из ЛПС 8- и 8К-типа, в О-полисахаридах которых содержатся 4-замещенные производные 2-амино-2-дезоксиЛ)- или -Ь-галактуроновой кислоты (ОаША). Эти моносахариды подвергались Р-элиминированию в щелочных условиях и превращению в соответствующие аминогекс-4-енуроновые кислоты (АНехЫА), вызывая деполимеризацию О-полисахаридных цепей (рис. 8А). При деградации ЛПС серогруппы 0-1, содержащего 2,3-диамино-2,3-дидезокси-1)-гаюкуроновую кислоту, наблюдалась аналогичная деполимеризация О-полисахарида, однако остаток образующейся

диаминогекс-4-енуроновой кислоты подвергался более глубокой деструкции в щелочных условиях и полностью отщеплялся (соединения 11).

Рис. 8. Жесткая щелочная деградация ЛПС гладких штаммов P. aeruginosa на примере ЛПС серогруппы 0-6 (иммунотип 1) (А) и серотипа 0-9a,9d (В). В ЛПС серогруппы 0-6 гликозидная связь остатка QuiNAc имеет а-конфигурацию между повторяющимися звеньями О-полисахарида и ß -конфигурацию между О-полисахаридом и кором. Acyl в ЛПС серотипа 0-9a,9d обозначает (К)-З-гидроксибутаноил.

О-Полисахариды серогрупп 0-7, 0-9 и O-12 содержат проговодные нонулозоновых кислот, которые не подвергались р-элиминированию в ходе деградации, и выделенные соединения 5-7 образовались из ЛПС SR-типа (рис. 8В). В некоторых случаях обнаруживали также минорные продукты (до 20%), представляющие собой гекса- и тетракисфосфорилированные олигосахариды, незамещенный олигосахарид гликоформы 2 (4) и олигосахарид, лишенный остатка рамнозы. При деградации ЛПС серогрупп 0-1, 0-9 и 0-12 наблюдалось неполное удаление N-ацетильной группы с остатка 2-амино-2,6-дидезокси-1)-глюкозы и наряду с полностью

дезацилированными продуктами 6а, 7а и 11а были выделены соответствующие минорные MOHo-N-ацетилированные производные 6Ь, 7Ь и lib (до 15%). З-Гидроксибутаноильная группы (ЗНОВи) на остатке 2,4-диамино-2,4,6-тридезокси-Е)-глюкозы (QuiN4N) была устойчива в щелочных условиях, и в результате вместо ожидаемого полностью дезацилированного продукта было выделено MOHo-N-ацилированное производное 10. Жесткая щелочная деградация ЛПС серогрупп 0-2,0-4 и 0-11 не проводилась.

1.3.2. Мягкий кислотный гидролиз

Мягкий кислотный гидролиз ЛПС серогрупп О-14 и 0-15 привел только к продуктам с незамещенным кором, что соответствовало результатам жесткой щелочной деградации этих ЛПС (раздел 1.3.1). Из ЛПС остальных типовых штаммов серогрупп получены смеси олигосахаридов незамещенного кора и кора с присоединенным повторяющимся звеном О-полисахарида. Из ЛПС серогруппы 0-7 получен олигосахарид кора с присоединенным фрагментом повторяющегося звена, состоящим из остатков FucNAc и Xyl, который образовался в результате отщепления третьего компонента - псевдаминовой кислоты с кислотолабильной гликозидной связью. При мягком кислотном гидролизе ЛПС серогруппы 0-9 олигосахаридных продуктов выделено не было.

Мягкий кислотный гидролиз затрагивал также неуглеводные заместители (О-ацетильные и фосфатные группы, фосфоэтаноламин). Гидролиз в различных условиях (1% АсОН или при рН4,2) приводил к продуктам с различным содержанием неуглеводных заместителей, причем деградация ЛПС при рН4,2 меньше затрагивала О-ацетильные группы, а гидролиз 1% АсОН - фосфатные группы. Комбинирование условий гидролиза позволяло выявлять наиболее представительные структуры кора. N-Связанный аланин и О-карбамоильная группа, присутствующие в коре всех изученных штаммов, при мягком кислотном гидролизе не затрагивались.

Анализ методом МС ИЭР показал, что в коре ЛПС большинства серогрупп присутствует дифосфоэтаноламин (рис. 9). Наиболее высокое его содержание (~75% от стехиометрического) отмечено в ЛПС серогруппы 0-15, однако не исключено, что наблюдаемое в этом и других ЛПС неполное замещение является результатом частичного расщепления дифосфоэтаноламина в ходе мягкой кислотной деградации ЛПС (аналогично может происходить превращение дифосфатных групп, найденных в коре ЛПС некоторых серогрупп, в монофосфатные группы). Как и в ЛПС клинического изолята 2192 (раздел 1.2.2), в ЛПС типовых штаммов серогрупп 0-4, 0-6,0-11 и 0-14 фосфоэтаноламин присутствовал в следовых количествах.

В коре P. aeruginosa 0-1, 0-3, 0-4, 0-6, О-11, 0-12, 0-14 и 0-15 с помощью МС ИЭР обнаружены от одной до пяти О-ацетильных групп. Все они присутствовали в

Рис. 9. Масс-спектр ИЭР продукта мягкого кислотного гидролиза ЛПС серогруппы 0-12. М и Ml относятся к олигосахаридам незамещенного кора состава ödHexiHexjHexNiHej^aKdoiAlaiCmi/^Aci (область В) и кора с присоединенным повторяющимся звеном О-полисахарида и таким же составом варьирующихся неуглеводных компонентов (область А) соответственно. Приведенные величины m/z соответствуют моноизотопным молекулярным массам пиков молекулярных ионов, полученных путем компьютерной трансформации присутствующих в масс-спектре пиков одно- и многозарядных ионов каждого соединения.

нестехиометрическом количестве, так что суммарная степень 0-ацетилирования не превышала 50%, а часто и 10%, однако эти данные могут быть заниженными вследствие частичного О-дезацетилирования при мягком кислотном гидролизе ЛПС. Содержание О-ацетильных групп в незамещенном коре выше, чем в коре с присоединенным повторяющимся звеном О-полисахарида (рис. 9). По данным спектров 'Н-ЯМР гликоформа 1а О-ацетилирована более интенсивно, чем гликоформа 2, независимо от того, замещена последняя 0-полисахаридом или нет, тогда как гликоформа 1Ь не содержит заметных количеств О-ацетильных групп.

Несмотря на высокую структурную гетерогенность продуктов мягкого кислотного гидролиза ЛПС, строение их углеводной основы исследовалось с помощью спектроскопии ЯМР, и полученные данные согласовывались с данными МС ИЭР и с результатами исследования продуктов жесткой щелочной деградации (раздел 1.3.1). В частности, подтверждено, что присутствие того или иного варианта гликоформы 1 (соединения 12) является, как правило, характеристикой серогруппы, но в то же время в одних серотипах серогруппы 0-2 присутствует гликоформа-1а (12а), а в других - гликоформа lb (12b). Для ЛПС, щелочная деградация которых не проводилась (серогруппы. 0-4 и 0-11), анализi продуктов мягкого кислотного гидролиза 13 и 14 позволил идентифицировать гликоформу кора, а также тип и конфигурацию связи между повторяющимся звеном и кором (рис. 10). Несмотря на присутствие в О-полисахариде ЛПС серотипа 013а, 13с бокового остатка глюкозы (см. таблицу 1 в разделе 2), найдено, что в первом повторяющемся,. звене, присоединенном к кору, остаток глюкозы отсутствует.

Glcm-( 1 ->6)-Glc'-( pl ->3)-GjIN-( 1 -*3)- Нерп-(1 ->3)- Нер1^! -*5 У Kdo'

Ceporpyima (штамм) Соединение R RI Мол. масса

0-1,0-2,0-З, О-12,0-13,0-15 12а H PPEtn 1892,38-1892,40

0-2a,2d,2f, 0-7,0-Ю 12Ь Glc^-CPl PP¥Jn 2054,46-2054,49

2192,0-4,0-6, 0-11,0-14 12с H P 1769,40-1769,43

Glc"-(1->4>| jP-4.| j-2-Rl

GlcIII-(l->6)-GlcI-(Pl->3>GalN-(l-43)-HepD41->3>Hep4l-*5)-KdoI R->3)-L-Rha-(l-*3>l Ala-2-J Cm-7J Ц-Р

13-15

Серогруппа Соединение R RI Мол. масса

0-4a,4b 13 L-Rha-(al ->3)-L-FucNAc-(a 1 ->3)-L-FucNAc4al->3)-QuiNAc-(31 P 2476,76

O-ll 14 Glc-(P 1 ->3)-L-FucNAc-(a 1 ->3)-FucNAc-(pi P 2305,65

0-13a,13b, 0-13a,13c 15 L-Rha-(al ->3)-L-Rha-(al ->4)-GalNAcA-(al-»3)-QuiNAc-(pi PPEtn 2588,71

Рис. 10. Продукты мягкого кислотного гидролиза ЛПС с кором гликоформы 1 (соединения 12) и гликоформы 2 (соединения 13-15). Моноизотопные молекулярные массы (Да) приведены по данным МС ИЭР. Наряду с показанными трисфосфорилированными соединениями в продуктах присутствуют менее фосфорилированные, О-ацетилированные, а иногда также О-декарбамоилированнные и дерамнозилированные олигосахариды. Фосфоэтаноламин присутствует в олигосахаридах в нестехиометрическом количестве.

Для локализации дифосфоэтаноламина из олигосахарида кора серотипа О-10а, 10Ь с помощью ВЭАЖХ в нейтральных условиях была выделена фракция, содержащая четыре фосфатные группы и этаноламин. Это следовало из ее молекулярной массы 2036,47 Да (данные МС ИЭР) и из присутствия сигналов этаноламина в спектре ' и дифосфатной группы в спектре 3,Р-ЯМР. Эксперимент 'h,3IP-HMQC показал корреляцию одного из атомов фосфора дифосфатной группы с СН20-группой этаноламина, а второго атома - с протоном Н2 остатка Hep1, и, таким образом, дифосфоэтаноламин присоединен в положение 2 остатка Hep1.

Для определения положения О-ацетильных групп олигосахариды незамещенного кора из ЛПС серогруппы 0-12 после очистки методом ВЭАЖХ в нейтральных условиях исследовали с помощью серии-экспериментов TOCSY с различными временами смешивания (от 50 до 150 мсек). Это позволило выявить протоны при ацетоксилированных атомах углерода по характерному смещению их сигналов в слабое поле за счет дезэкранирования. Полученные данные показали, что каждое из трех возможных положений на остатке рамнозы является сайтом 0-ацетилирования (рис.11) и, следовательно, распределение О-ацетильных групп носит случайный характер. Остальные сайты О-ацетилирования очевидно находятся на соседних остатках глюкозы внешней области кора.

Рис. И. Область сигналов СНз-групп в спектре Н-ЯМР олигосахарида незамещенного кора серогруппы 0-12, выделенного ВЭАЖХ из продуктов мягкого кислотного гидролиза ЛПС. Сигналы Н6 остатков Rha в гликоформах 1 и 2 кора показаны прямым шрифтом и курсивом соответственно.

1.3.3. Структурный анализ липида А

Липид А, выделенный при мягкой кислотной деградации ЛПС серотипа 0-Юа,ЮЬ, исследован методом МС ИЭР отрицательных ионов (рис. 12). Найдено, что в соответствии с литературными данными препарат липида А, имеющего бисфосфорилированную диглюкозаминовую основу, гетерогенен по составу и содержанию жирных кислот. Наиболее ацилированные производные содержат шесть остатков жирных кислот (ЛАгекса), включая два ]Ч-связанных остатка 3-гидроксидодекановой кислоты (ЗОН12:0), два первичных О-связанных остатка

ЗОН10:0 и два вторичных остатка 12:0 и/или 20H12:0 (пики при m/z 1601,01, 1617,00 и 1632,99). Менее ацилированные производные (ЛАпента и JLVpgjpa) включали на один или два первичных остатка ЗОН 10:0 меньше, а производное ЛА^и было лишено также одной из вторичных кислот. Присутствующие в спектре монофосфорилированные производные образовались в результате частичного дефосфорилирования липида А в ходе мягкого кислотного гидролиза ЛПС.

Рис. 12. Масс-спектр ИЭР липида А Р. aeruginosa 0-10 и структуры ЛАпенга и JIAreKCa с двумя остатками 20H12:0. Кластеры пиков с разницей m/z 16 отвечают присутствию вторичных остатков 12:0 и 20H12:0 в различных комбинациях.

Для локализации остатка ЗОН 10:0 на невосстанавливающем остатке GlcN в ЛАпента использован эксперимент МС/МС положительных ионов с инфракрасной мультифотонной диссоциацией. Разрыв гликозидной связи между двумя остатками GlcN привел к ионам триацильных фрагментов с невосстанавливающего конца, тогда как диацильные фрагменты производных с невосстанавливающего конца отсутствовали. Таким образом, в ЛАпента остаток З0Н10:0 находится только на невосстанавливающем остатке глюкозамина, как показано на рисунке 12. Аналогичный МС/МС-эксперимент с не содержащим остатков ЗОН10:0,

показал симметричное распределение двух первичных и двух вторичных остатков производных лауриновой кислоты между двумя остатками глюкозамина.

2. Особенности строения, биосинтеза и иммуноспецифичности липополисахаридов

В настоящей работе исследовано строение углеводной части ЛПС P. aeruginosa, включая олигосахарид кора и О-полисахарид, а для серотипа О-10а, 10Ь — также строение липида А, являющегося структурно-консервативным участком ЛПС. Полученные данные в совокупности с литературными данными позволили впервые установить полную структуру ЛПС P. aeruginosa, приведенную на примере ЛПС серотипа О-10а, 10Ь на рисунке 13.

Результаты нашего исследования подтвердили высокую степень структурной гетерогенности липида А гладких штаммов P. aeruginosa за счет различного состава и содержания жирных кислот, что является следствием особенностей биосинтеза ЛПС. Отметим, что описанные ранее образцы липида А гладких штаммов P. aeruginosa содержали только две из трех возможных комбинаций, то есть были менее гетерогенными. Остальные структурные особенности липида А, включая состав первичных 3-гидроксиалкановых кислот (N-связанных ЗОН 12:0 и О-связанных ЗОН10:0), очевидно являются общими для всех гладких штаммов P. aeruginosa. Согласно литературным данным, в штаммах P. aeruginosa от больных муковисцидозом, присутствует модифицированный липид А, содержащий в составе гексаацильного производного остаток 16:0 (его положение не установлено) и остатки 4-амино-4-дезоксиарабинозы при фосфатных группах. Эти штаммы обладают повышенной устойчивостью к катионным антимикробным пептидам и повышенной способностью стимулировать образование провоспалительных цитокинов. Таким образом, строение липида А является фактором вирулентности бактерий P. aeruginosa.

Наше исследование ЛПС P. aeruginosa показало присутствие в коре как консервативных, так и вариабельных элементов строения. Внутренняя область кора состоит из двух остатков 3-дезокси-0-л<йн«о-окт-2-улозоновой кислоты и двух остатков Ь-глщеро-В-манно-гстозы, к которым присоединяется остаток галакгозамина. Эта

область характеризуется высокой степенью фосфорилирования, причем три основных сайта фосфорилирования распределены между двумя остатками гептозы и замещение фосфатными группами является стехиометрическим. Результаты нашего исследования и проводившегося одновременно изучения ЛПС a/gC-мугаши P. aeruginosa PAO1 показали ошибочность более раннего представления о локализации всех трех фосфатных групп на одном остатке гептозы и тем самым положили конец дискуссии последних лет на эту тему. В коре типовых штаммов ряда серогрупп нами обнаружен дифосфоэтаноламин в нестехиометрическом количестве (до 75%), и определено место его присоединения в положении 2 одного из остатков гептозы.

Нами показано, что существование двух гликоформ (1 и 2) внешней области кора P. aeruginosa, обнаруженных ранее Садовской и др. в ЛПС одного из серотипов серогруппы О-2, является общей характеристкой ЛПС как клинического изолята, так и

Рис. 10. Полное строение ЛПС P. aeruginosa О-10а, 10b. Пунктирные линии обозначают нсстехиометрическое замещение. О-Ацетильные группы в коре этого штамма отсутствуют.

О-полисахарид

типовых штаммов всех серогрупп P. aeruginosa. Обе гликоформы, строение которых приведено ниже, имеют общий тетрасахаридный фрагмент, включающий остаток галактозамина и три остатка глюкозы, но отличаются положением остатка рамнозы. Одна из гликоформ имеет два структурных варианта (1а и 1Ь), отличающихся отсутствием или присутствием четвертого остатка глюкозы. Эти варианты встречаются в штаммах различных О-серогрупп или различных подгрупп одной О-серогруппы.

L-Rha-( 1 ->6)-Glc-( 1 ->4)-| Glc-(ßl->2)-L-Rha-(l->6)-Glc-(l->4)-|

GIc-(I-»6)-Glc-(ßl->3)-GalNAla-(l-» Glc-(l->6)-Glc-(ßl-)-3)-GalNAla-(l-».

В настоящей работе впервые в коре P. aeruginosa обнаружены множественные О-ацетильные группы, присутствующие в нестехиометрическом количестве как в клиническом изоляте, так и в типовых штаммах большинства серогрупп. О-Ацетильные группы локализованы преимущественно на терминальном остатке рамнозы гликоформы 1а и в меньшей степени на других моносахаридах внешней области кора, причем их распределение носит случайный характер. Два других ацильных заместителя, присутствующих в коре P. aeruginosa, - L-аланин на аминогруппе остатка галактозамина и О-карбамоильная группа на одном из остатков гептозы, были известны ранее. Они найдены в стехиометрическом количестве во всех изученных нами штаммах.

Таким образом, к консервативным элементам структуры кора могут быть отнесены: а) строение углеводной основы внутренней области, б) присутствие двух гликоформ внешней области, в) стехиометрическое фосфорилирование по трем основным сайтам, г) 0-карбамоилирование остатка гептозы и д) N-ацилирование остатка галактозамина L-аланином. К необязательным элементам структуры кора можно отнести а) глюкозилирование остатка рамнозы в гликоформе 1, б) фосфорилирование по четвертому сайту, в) присутствие дифосфоэтаноламина, г) присутствие дифосфатных групп и д) 0-ацетилирование внешней области. Количественное содержание необязательных заместителей (кроме глюкозы в гликоформе 1Ь) заметно варьируется от штамма к штамму.

В изученных нами типовых штаммах всех серогрупп (кроме 0-14 и 0-15, см. ниже) кор гликоформы 2 полностью или почти полностью замещен О-полисахаридом, присоединяющимся в положение 3 терминального остатка рамнозы. Напротив, ни один из структурных вариантов кора гликоформы 1 не способен присоединять О-полисахарид. После обнаружения двух гликоформ в серогруппе 0-2 было высказано предположение о том, что гликоформа 2 образуется из гликоформы 1 путем транслокации остатка рамнозы перед присоединением

О-полисахарида. Однако, присутствие в исследованном нами ЛПС шероховатого штамма P. aeruginosa, лишенном О-полисахарида, обеих незамещенных гликоформ кора показывает, что их биосинтез происходит независимо от присоединения О-полисахарида.

При довольно разнообразном моносахаридном составе О-полисахариды одиннадцати из тринадцати серогрушт P. aeruginosa (за исключением серогрупп 0-14 и 0-15) объединены присутствием в них Ы-ацетил-б-дезокси-В-гексозаминов (6dHexNAc) - 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-0-глкжозы (QuiNAc), 2-ацетамидо-2,6-дидезокси-В-галактозы (FucNAc) или 2-ацетамидо-4-ациламино-2,4,6-тридезокси-В-глюкозы В настоящей работе нами установлены структуры

биологических повторяющихся звеньев этих 0-полисахаридов и показано, что 6dHexNAc является первым моносахаридом повторяющегося звена в каждой из серогрупп. При одновременном присутствии в О-полисахариде двух 6dHexNAc -FucNAc и QuiNAc (серогруппы 0-1 и 0-9) - инициирующим моносахаридом является QuiNAc. Нами показано также, что образуемая при связывании О-полисахарида с кором гликозидная связь имеет -конфигурацию в ЛПС всех серогрупп

независимо от того, какую конфигурацию имеет гликозидная связь этого между повторяющимися звеньями в О-полисахариде.

Эти результаты соответствуют современным представлениям о биосинтезе О-антигенов по зависимому пути, согласно которому он инициируется

переносом на ундекапренольный носитель первого моносахарида биологического повторяющегося звена i(6dHexNAc в случае P. aeruginosa), за которым следует сборка полного повторяющегося звена путем последовательного переноса остальных моносахаридов, катализируемого соответствующими трансферазами. Характер образующейся при последующей полимеризации связи между внутренними повторяющимися звеньями полисахаридной цепи определяется специфичностью О-антиген-полимеразы Wzy, а связи между О-полисахаридом и кором гликоформы 2 -специфичностью лигазы которая очевидно одинакова у типовых штаммов всех

серогрупп P. aeruginosa.

Согласно литературными данными, у бактерий P. aeruginosa существует одиннадцать различных генных кластеров xvbp, которые контролируют биосинтез О-полисахаридов серогрупп '0-1— 0-4, 0-6, 0-7, 0-9 —0-13. В соответствии с этим О-полисахариды этих одиннадцати серогрупп P. aeruginosa имеют различные по размеру и составу повторяющиеся звенья (таблица 1).

Штаммы серогрупп 0-14 и 0-15 имеют критические генные кластеры серогруппы 0-3 или 0-11, которые нефункциональны вследствие различных мутаций. Тем не менее эти штаммы синтезируют полисахариды, определяющие их сероспецифичность и имеющие следующее строение:

0-14 ->3)-ManNAc-(ßl->4)-L-Rha-(al->

0-15

Эти полисахариды отличаются от О-полисахаридов одиннадцати других серогрупп P. aeruginosa меньшим размером повторяющегося звена и отсутствием ödHexNAc. Более того, в то время как О-полисахариды остальных серогрупп

Таблица 1. Строение биологических повторяющихся звеньев О-антигенов P. aeruginosa

Серогруппа (подгруппа) Терминальное биологическое повторяющееся звено О-полисахарида

I ОаШАс-(а1->4)-СШАсЗКАсА-(Р1->3)-РисКАс-(а1-*3>ОшМАс-(а1-^4)

2а,2Ь 2а,2Ь,2е (2а),2с 2а,2<1 2а,2<1,2е (2а), ЖЯ иммунотшх7 МапЫАсЗНАтА-(Р 1 ->4)-МапМАсЗЫАсА-(Р 1 -*3)-Рш^Ас-(Р 1 ->4) МапЫАсЗИАтА-(Р1->4)-МапКАсЗМАсА-(р1-^3)-ГисМАс4Ас-(р1->4) МалКАсЗКАтА-ф 1 -+4)-Ь-Ои1КАсЗНАсА-(а1 ->3)-ГисКАс-(Р 1 ->4) МапКАсЗКАюА-(Р 1 ->4)-МапКАсЗНАсА-(Р 1 -»3)-р1кДОАс-(а 1 ->4) МапМАсЗКАтА-ф 1 ->4)-ЮиШАсЗКАсА-(а1 ->3)-РисКАс-(а 1 ->4) L-GulNAcЗNAmA-(pl->4)-ManNAcЗNAcA-(ol->3)-FucNAc4Ac-(аl->4) ЮиШАсЗИАтА-ф 1 ->4)-МаяНАсЗМАсА-(а1 -►3)-РисКАс-(а 1 ->4)

За,ЗЬ За,ЗЬ,Зс 3а,3<1 Ь-ЮгаЗ Ас-(а 1 ->6)-01сКАс-(а 1 ->4)-ЮаП^АсА-{а1 ->з)-дштс4К(знови>(р 1 ->2) Ь-КЬаЗ Ас-(а 1 ->6)-01сМАс-(а 1 ->4)-Ь-Оа[КАсА4 Ас-(а 1 ^3)-ОиШАс4К(ЗНОВи)-(Р1-»2) Ь-Шт-(а 1 ->6)-С1сНАс-(а1 ->4)-Юа1КАс А-(а1 -»3)-(}шКАс4КАс-(Р 1 ->3)

4а,4Ь 4а,4с Ь-И1а-(а1->3)-Ь-РисНАс-(а1->3)-Ь-РисКАс-(а1-+3)-ди1НАс-(а1-»2) Ь-КЬ-(а1->3)-1лРисЫАс-(а1->3)-Ь-РисНАс-(а1-+3)-РисЫАс-(а1-^2)

6а 6а,6Ь 6а,6с 6а,6(1 иммунотип 1 Ь-К11а-(а1->4)-СаШАсАЗАс-(а1->4)-ОаШАсА-(а1->3>-ОшНАс-(а1->3) • ИУ1а-(а 1 ->4)-Оа1МАсА-(а 1 ->4)-ОаШАсАЗ Ас-(а1 ->3)-(21^Ас-(а 1 ->2) ИУ1а-(а1-^4)-ОаВДАсАЗАс-(а1->4)-Са1КАсАЧа1^3)-ОшКАс-(а1->3) Ь-Шта-(а 1 ->4)-Са1ЫАсАЗ Ас-(а 1 ->4)-ОаВД Ас А-(а 1 -»ЗУ-ОшИ Ас-(Р 1 ->3) Ь-Юи1-(а 1 ->4)-ОаШАс АЗ Ас-(а 1 ->4)-ОаШАсА-(о1 ->3)-0иШАс-(а 1 ->2)

7а,7Ъ,7с 7а,7Ь,7<1 7а,7<1 Р8е5(ЗНОВи)7Ро4Ас-(а2->4>Ху1-(Р1->3)-РисКАс-(а1-^4) Рве5 Ас7Ро4Ас-(а2-^4)-Ху1-(Р 1 -»3>Ристс-(а1 -И) Р5е5Ас7Ро-(а2->4)-Ху1-(р 1 ->-3)-РисКАс-(а1 ->4)

9а,9Ь 9а,9с Р5е5Лс7(31ЮВи)-(Р2->4)-Р^Ас-(а1->3)-дшКАс-(р1->8) Рве5Ас7(ЗНОВи)4АсЧР2->4)-РисКАс-(а1->3)-Ои1ЫАс-(р1->Е)

10а,10Ь 10а,10с Ь-КЬа2Ас-(а1->4)-Ь-Оа1КАсА-(а1->3)-ршКАс-(а1->3) Ь-ИЬа-(а1 -И)-Ь-Оа1ЫАсА-(а1-»3)-0шНАс-(а1 ->3)

11 01с-(р1->3)-Ь-РисЫАс-(а1->3)-РисКАс-(Р1->2)

12 8е1^5Ас7Ас-(а2^3>ЬРисКАтЧа1^3)-ОшНАс-(а1->8)

13а,13Ь 13а,13с ЬЮш-(а 1 ->3)-Ь-Им-(а 1 ->4)-ОаМАсАЗ Ас-(а1 -»3)-0штс-(Р 1 -+2) Ыит-(а1->3)-ЬК11а-(а1-»4)-Са1НАсА-(а1->3)-0шКАс-(р1->2)

Примечание. Амидирование ваША, характерное для серо групп О-б и 0-13, не показано. Условные обозначения: Рее - 5,7-даамино-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глицеро-Ь-л4аш(0-нон-2-улозоновая (псевдаминовая) кислота, 8е1^ - 5,7-даамино-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глщеро-В-галакто-нон-2-улозоновая (8-эпилегионаминовая) кислота, Аю - ацетимидоил, Ро - формил, ЗНОВи - 3-гидроксибутаноил. Моносахариды находятся в пиранозной форме и имеют Б-конфигурацию, если не указано обратное.

уникальны по структуре, полисахариды серогрупп 0-14 и 0-15 обнаружены в ряде других, часто таксономически отдаленных друг от друга микроорганизмах, включая Burkholderia cepacia, Burkholderia plantarii, Serratia marcescens и Vibrio fluvialis. Следовательно, в отличие от генных кластеров 0-антигенов wbp, гены биосинтеза полисахаридов серогрупп 0-14 и 0-15 относительно легко переходят от одних бактерий к другим. Можно предположить, что, приобретя в ходе эволюции эти гены, штаммы серогрупп 0-3 и 0-11 утратили способность синтезировать собственный О-полисахарид и превратились в штаммы серогрупп 0-14 и 0-15.

При исследовании серогрупп 0-14 и 0-15 нами не было найдено ЛПС SR-типа с олигосахаридом кора гликоформы 2, замещенным одним повторяющимся звеном О-полисахарида, присутствие которого характерно для типовых штаммов всех остальных серогрупп. Таким образом, литературные и полученные нами данные ставят вопросы о способе присоединения полисахаридов серогрупп 0-14 и 0-15, о характере их биосинтеза и месторасположении их генного кластера.

Диверсификация О-полисахаридов внутри серогрупп достигается различными путями. Она может происходить на этапе полимеризации, контролируемой стерео- и региоспецифичностью О-антиген-полимеразы Wzy. Сопоставление установленных нами структур биологических повторяющихся звеньев (таблица 1) показало, что именно такой механизм реализуется в серогруппах 0-2, 0-3 и 0-6, где О-полисахариды всех серотипов образуются путем полимеризации одного и того же олигосахарида, но имеют различные структуры за счет образования новой гликозидной связи различных типов (например, al->3, al—>2 или ßl—>3 в серогруппе 0-6).

К другому способу диверсификации относятся постполимеризационные модификации О-полисахаридов P. aeruginosa, такие как, например, глюкозилирование остатка рамнозы в серотипе О-13а, 13с (таблица 1). Постполимеризационный характер присоединения глюкозилирования подтверждается нашими данными об отсутствии остатка глюкозы в первом повторяющемся звене, присоединенном к кору, что было бы невозможно в случае включения остатка глюкозы на стадии сборки повторяющегося звена. К постполимеризационным модификациям относятся также эпимеризация производных в соответствующие производные

a-L-GulN3MA в серогруппе 0-2, 0-ацетилирование и амидирование производных GalNA в серогруппах 0-6 и О-13.

Установление строения биологических повторяющихся звеньев (таблица 1) позволило обосновать иммуноспецифичность штаммов P. aeruginosa на молекулярном уровне. Наибольший вклад в иммуноспецифичность, определяющий групповую принадлежность штаммов, вносят терминальные участки на невосстанавливающем конце О-полисахаридов. В одних серогруппах (0-1, 0-2, 0-11 и 0-12) присутствуют уникальные терминальные моносахариды, а в других терминальным является одинаковый моносахарид (псевдаминовая кислота в серогруппах 0-7 и 0-9 или L-рамноза в серогруппах 0-3, 0-4,0-6,0-Ю и 0-13), но он присоединяется к различным моносахаридам, делая уникальным терминальный

дисахаридный фрагмент О-полисахарида (остаток псевдаминовой кислоты в серогруппах 0-7 и 0-9 отличается также аномерной конфигурацией).

В то же время терминальные участки О-полисахаридов одинаковы у всех серотипов одной серогруппы (кроме серогруппы 0-2), что объясняет тесные серологические взаимосвязи между ними. В серогруппе 0-2 терминальный и следующие за ним моносахариды могут иметь различную (ß-D-манно или a-L-гуло) конфигурацию, однако, как уже отмечалось, превращение последних в первые является постполимеризационным процессом, протекающим нестехиометрично, и поэтому в О-полисахариде каждого из серотипов присутствуют в большем или меньшем количестве терминальные участки, построенные из производных ß-D-ManN3NA. Серологическая дифференциация на серотипы в сложных серогруппах основана на структурных модификациях О-полисахаридов, обсуждавшихся выше.

Демонстрация терминального положения псевдаминовой кислоты в О-полисахариде позволила обосновать на молекулярном уровне серологическое родство ЛПС и пилина P. aeruginosa 1244 (серогруппа 0-7) - гликопротеина фимбрий, обеспечивающих подвижность бактерии. Углеводная цепь пилина, защищающая его от протеолитического расщепления, имеет структуру трисахарида Pse5(3HOBu)7Fo-

и представляет собой биологическое повторяющееся звено О-полисахарида серотипа О-7а,7Ь,7с, присоединенное О-гликозидной связью к остатку серина. В результате за счет идентичности терминальных углеводных участков обоих гликоконъюгатов обеспечивается антигенная гомогенность поверхности внешней мембраны и фимбрий бактерии.

5,7-Диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновые кислоты, характерные для О-полисахаридов трех О-серогрупп P. aeruginosa, встречаются и в ЛПС других бактерий, причем некоторые из них являются серологически родственными P. aeruginosa. В свете полученных нами данных попарная перекрестная серологическая реактивность P. aeruginosa O-9/Shigella boydii тип 7 и P. aeruginosa О-12/Salmonella arizonae 0-61 может быть объяснена присутствием в их О-полисахаридах общих терминальных моносахаридов - производных псевдаминовой кислоты и 8-эпилегионаминовой кислоты соответственно. Эти данные подтверждают иммунодоминантную роль моносахаридов, расположенных на невосстанавливающем конце О-полисахаридов.

ВЫВОДЫ

1. Установлена полная структура липополисахарида P. aeruginosa, включая строение липида А, олигосахарида кора и О-полисахарида.

2. Показано, что существование двух гликоформ кора, только к одной из которых может присоединяться О-полисахарид, является общей структурной особенностью липополисахаридов шероховатого и гладких штаммов P. aeruginosa.

3. Впервые продемонстрировано присутствие О-ацетильных групп и случайный характер их распределение во внешней области кора в основном на терминальном остатке рамнозы. Определены места присоединения фосфатных групп и дифосфоэтаноламина на остатках гептозы внутренней области кора.

4. Установлено строение биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов в одиннадцати серогруппах P. aeruginosa (из них в девяти серогруппах впервые). Тем самым выявлены моносахариды, находящиеся на невосстанавливающем конце О-полисахаридов и вносящие наибольший вклад в иммуноспецифичность бактерий.

5. Найдено, что первым моносахаридом повторяющихся звеньев О-полисахаридов одиннадцати серогрупп P. aeruginosa является N-ацетил-б-дезокси-В-гексозамин, который вне зависимости от конфигурации его связи во внутренних повторяющихся звеньях О-полисахаридов присоединяется к остатку рамнозы кора b-гликозидной связью. Эти данные свидетельствуют о сходстве путей биосинтеза О-полисахаридов различных серогрупп.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Knirel Y. A., Shashkov A. S., Kocharova N. A., Bystrova О. V., Senchenkova S. N., Moll Н., Lindner В., Zahringer U., Pier G.B. (2000) Structure of the highly phosphorylated carbohydrate backbone of the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa rough strain 2192. Abstracts of the XXth International Carbohydrate Symposium, Hamburg, Germany, August 27-September 1,2000, p. 19.

2. Knirel Y. A., Bystrova O. V., Shashkov A. S., Kocharova N. A., Senchenkova S. N., Moll H., Lindner В., Zahringer U., Hatano K., Pier G. B. (2001) Structural analysis of the lipopolysaccharide core of a rough, cystic fibrosis isolate of Pseudomonas aeruginosa. European Journal of Biochemistry, 268,4708-4719.

3. Bystrova O.V., Shashkov A. S., Kocharova N.A., Knirel Y.A., Lindner В., ZahringerU., Pier G.B. (2001) Studies on the lipopolysaccharide core and O-chain structures in Pseudomonas aeruginosa immunotype 1, Abstracts of the Xlth European Carbohydrate Symposium, Lisbon, Portugal, September 2-7,2001, p. 327.

4. Bystrova O. V., Shashkov A. S., Kocharova N. A., Knirel Y. A., Lindner В., Zahringer U., Pier G. B. (2002) Structural studies on the core and the O-polysaccharide repeating unit of Pseudomonas aeruginosa immunotype 1 lipopolysaccharide. European Journal of Biochemistry, 269,2194-2203.

5. Быстрова О. В., Шашков А. С, Кочарова Н. А., Книрель Ю. А., Цэрингер У., Пайер Дж. Б. (2003) Изучение строения кора лшюполисахарида и связи между кором и О-антигеном Pseudomonas aeruginosa иммунотипа 5 с помощью жесткой щелочной деградации липополисахарида. Биохимия, 68,1119-1128.

6. Bystrova О. V., Lindner В., Kocharova N.A., Shashkov A. S., Knirel Y.A., ZahringerU., Pier G.B. (2003) Lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa:

conserved and- variable structural features. Abstracts of the Xllth European Carbohydrate Symposium, Grenoble, France, July 6-11,2003, p. 188.

7. Bystrova O. V., Lindner В., Moll H., Kocharova N. A., Knirel Y. A., Zahringer U., PierG. B. (2003) Structure of the biological repeating unit of the O-antigen of Pseudomonas aeruginosa immunotype 4 containing both 2-acetamido-2,6-dideoxy-D-glucose and 2-acetamido-2,6-dideoxy-D-galactose. Carbohydrate Research, 338, 1801-1806.

8. Bystrova O. V., Lindner В., Moll H., Kocharova N. A., Knirel Y. A., Zahringer U., Pier G. B. (2003) Structure of the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa O-12 with a randomly O-acetylated core region. Carbohydrate Research, 338, 1895-1905.

9. Быстрова О. В., Линднер Б., Моль X., Кочарова Н. А., Шашков А. С, КнирельЮ. А., Цэрингер У., Пайер Дж. Б. (2004) Полное строение липополисахарида Pseudomonas aeruginosa иммунотипа 5. Биохимия, 69,211-217.

Принято к исполнению 10/02/2004 Исполнено 11/02/2004

Заказ № 38 Тираж: 130 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

0 - 4 89 25

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Быстрова, Ольга Витальевна

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Общее строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2.2. Строение области кора липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2.2.1. Семейство Aeromonadaceae.

2.2.1.1. Род Aeromonas

2.2.2. Семейство Alcaligenaceae.

2.2.2.1. Род Bordetella

2.2.3. Семейство Alteromonodaceae.

2.2.3.1. Род Shewanella

2.2.4. Семейство Bradyrhizobiaceae.

2.2.4.1. Род Bradyrhizobium

2.2.5. Семейство Burkholderiaceae.

2.2.5.1. Род Burkholderia

2.2.6. Семейство Campylobacteraceae.

2.2.6.1. Род Campylobacter

2.2.7. Семейство Chlamydiaceae.

2.2.7.1. Род Chlamydia

2.2.8. Семейство Enterobacteriaceae.

2.2.8.1. Род Citrobacter

2.2.8.2. Род Erwinia

2.2.8.3. Род Escherichia

2.2.8.4. Род Hofnia

2.2.8.5. Vor Klebsiella

2.2.8.6. Род Proteus

2.2.8.7. Род Plesiomonas

2.2.8.8. Род Salmonella

2.2.8.9. Род Shigella

2.2.8.10. Род Serratia

2.2.8.11. Род Yersinia

2.2.9. Семейство Francisellaceae.

2.2.9.1. Род Francisella

2.2.10. Семейство Helicobacteriaceae.

2.2.10.1. Род Helicobacter

2.2.11. Семейство Legionellaceae.

2.2.11.1. Род Legionella

2.2.12. Семейство Moraxellaceae.

2.2.12.1. Род Acinetobacter

2.2.12.2. Род Moraxella

2.2.13. Семейство Neisseriaceae.

2.2.13.1. Род Neisseria

2.2.14. Семейство Pasteurellaceae.

2.2.14.1. Род Haemophilus

2.2.14.2. Род Histophilus

2.2.14.3. Род Mannheimia

2.2.15. Семейство Pseudomonadaceae.

2.2.15.1. Род Pseudomonas

2.2.16. Семейство Rhizobiaceae.

2.2.16.1. Род Agrobacterium

2.2.16.2. Род Rhizobium

2.2.16.3. Род Sinorhizobium

2.2.17. Семейство Vibrionaceae.

2.2.17.1. Род Vibrio

Введение диссертация по химии, на тему "Установление полной структуры липополисахаридов бактерии Pseudomonas aeruginosa"

Род Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae объединяет грамотрицательные микроорганизмы, занимающие в природе различные экологические ниши. В их числе находится синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa - условно-патогенный микроорганизм, проявляющий себя при состояниях, связанных с резким угнетением иммунной системы, часто вследствие термических ожогов и хирургических операций, а также при предрасполагающих заболеваниях, таких как муковисцидоз и рак.Липополисахарид (ЛПС) является одним из основных компонентов наружной мембраны клеточной оболочки грамотрицательных бактерий и общепризнанным фактором их патогенности. ЛПС играет важную роль во взаимодействии бактерий с окружающей средой, включая организм хозяина, по отношению к которому он проявляет себя как эндотоксин и антиген. Септический шок, вызываемый эндотоксином, остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и высокой летальности. Вместе с тем эндотоксин способен оказывать и благотворное влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к бактериальным инфекциям.ЛПС имеет сложное строение, включая в себя три различные по составу и функциональному назначению области - 0-полисахарид (0-антиген), липидный участок, - так называемый, липид А и соединяющий их олигосахарид, называемый кором.Изучение строения ЛПС необходимо для понимания на молекулярном уровне патофизиологических процессов, происходящих при бактериальных инфекциях, и механизмов функционирования защитных систем животных и человека.Особый интерес к кору ЛПС Р. aeruginosa связан с тем, что он является бактериальным лигандом, ответственным за узнавание микроорганизма рецепторами эпителиальных клеток. Узнавание и последующее поглощение бактериальных клеток являются важными этапами процесса очистки слизистой оболочки дыхательных путей при хронической респираторной инфекции, вызываемой Р. aeruginosa у больных муковисцидозом. Потенциальное терапевтическое значение может иметь препарат полного кора, под действием которого улучшается способность эпителиальных клеток поглощать бактерии Р. aeruginosa за счет продуцирования большего числа рецепторов.Другим перспективным подходом к лечению инфекционных заболеваний представляется использование протективных антител к кору ЛПС Р. aeruginosa, имеющему сходную структуру у всех штаммов. Предполагается, что увеличение устойчивости микроорганизма к клеточному поглощению, способствующее поддержанию хронической инфекции, связано с изменениями в строении кора и липида А. Таким образом, выяснение строения кора и липида А имеет большое значение для понимания того, как бактерия инициирует и поддерживает хроническую инфекцию, и для создания новых терапевтических подходов для борьбы с ней.В то время как у больных муковисцидозом хроническая инфекция вьвывается шероховатыми штаммами, ЛПС которых лишен 0-полисахаридной цепи, больные с ослабленной иммунной системой страдают от синегнойной инфекции, которая вызывается гладкими штаммами Р. aeruginosa, продуцирующими полный ЛПС. Эти штаммы являются серологически гетерогенными, и их классифицируют на основе иммуноспецифичности ЛПС, которая определяется тонкой структурой 0-полисахаридной цепи, 0-Полисахариды построены из повторяющихся олигосахаридных звеньев, причем установлено, что наибольший вклад в иммуноспецифичность вносит терминальный участок последнего повторяющегося звена, находящегося на невосстанавливающем конце цепи. В связи с этим важной задачей является также установление строения О-полисахаридов различных 0-серогрупп Р. aeruginosa, включая структуру, так называемого, биологического повторяющегося звена - олигосахарида путем полимеризации которого в процессе биосинтеза ЛПС образуется высокомолекулярный 0-полисахарид. Данные о структуре биологического повторяющегося звена, а также о строении области связывания 0-полисахарида с кором ЛПС способствуют лучшему пониманию путей биосинтеза ЛПС, а также генетических и биохимических механизмов диверсификации поверхностных структур микробной клетки.Липополисахариды Р. aeruginosa систематически изучаются с 70-х годов, и к началу нашей работы было установлено строение химических повторяющихся звеньев О-полисахаридов типовых штаммов всех 0-серогрупп Р. aeruginosa, а также липида А. В то же время структура биологического повторяющегося звена бьша установлена лишь для одного 0-полисахарида, а данные о строении олигосахарида кора были неполными и в некоторых аспектах противоречивыми.Целью настоящей работы было выяснение строения кора ЛПС клинического изолята Р. aeruginosa от больного муковисцидозом и типовых штаммов серогрупп Р. aeruginosa, строения биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов всех 0-серогрупп Р. aeruginosa, а также места присоединения и типа связи между 0-полисахаридом и кором. В результате этой работы впервые удалось установить полную структуру ЛПС Р. aeruginosa, выявить консервативные и вариабельные элементы структур кора и О-полисахаридов, а также сделать ряд выводов о молекулярных основах иммуноспецифичности и об особенностях биосинтеза ЛПС этих бактерий.Диссертация включает "Литературный обзор", в котором дана общая характеристика ЛПС грамотрицательных бактерий, приведены данные о структурах кора бактерий, принадлежащим к различным семействам и родам, и выявлены общие и специфические особенности строения этой части ЛПС. В главе "Результаты" дано соответствие между некоторыми из существующих схем серологической классификации Р. aeruginosa и описана общая стратегия структурного анализа ЛПС, включая различные подходы к деградации ЛПС, а также химические, масс-спектрометрические и ЯМР-спектроскопические методы исследования. Во второй части этой главы приведены особенности и результаты структурного анализа каждого из исследованных штаммов Р. aeruginosa. В главе "Обсуждение результатов" проведен сравнительный анализ установленных в ходе работы структур с привлечением лит. данных по этой теме и обсуждается значение полученных результатов для понимания биологической роли и путей биосинтеза ЛПС Р. aeruginosa. В экспериментальной части описано выделение ЛПС и его компонентов и приведены методики их структурного анализа.Работа была поддержана грантами РФФИ 02-04-04005, АФГИР RN1-422 и RB1-2042, ННИО 436 RUS 113/314/0-3 и ИНТАС YS 2001-2/6, а также Грантами поддержки ведущих научных школ РФ 00-15-97373 и НШ-1557.2003.3. Часть работы по изучению кора и липида А была проведена в Центре медицины и биологических наук Исследовательского центра Борстеля (Борстель, Германия). Результаты работы опубликованы в шести статьях [1-6] и тезисах трех докладов [7-9] и бьши представлены автором в виде стендовых и устного доклада на XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 2000 г.), XI и XII Европейских симпозиумах по углеводам (Лиссабон, Португалия, 2001 г.; Гренобль, Франция, 2003 г.) и II Германо-польскороссийской конференции по бактериальным углеводам (Москва, 2002 г.).Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н. Юрию Александровичу Книрелю за постановку задачи, определение основных направлений работы, помощь при интерпретации результатов и подготовке статей для печати. Автор благодарит проф. Александра Степановича Шашкова за съемку и помощь в интерпретации спектров ЯМР, Буко Линднера, Хермана Моля и Анну Николаевну Кондакову за съемку масс-спектров, к.х.н. Нину Алексеевну Кочарову за передачу своего опыта проведения химических экспериментов, зав. лаб. химии углеводов проф.Владимира Николаевича Шибаева за внимание к работе и обсз^ждение ее биосинтетических аспектов. Автор искренне признателен академику Николаю Константиновичу Кочеткову за интерес к работе, а также коллективу Лаборатории химии углеводов за товарищескую поддержку.2. ЛИТЕРАТУРНЬШ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

5. Найдено, что первым моносахаридом повторяющихся звеньев О-полисахаридов одиннадцати серогрупп P. aeruginosa является Ы-ацетил-6-дезокси-0-гексозамин, который вне зависимости от конфигурации его связи во внутренних повторяющихся звеньях О-полисахаридов присоединяется к остатку рамнозы кора ß-гликозидной связью. Эти данные свидетельствуют о сходстве путей биосинтеза О-полисахаридов различных серогрупп.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Быстрова, Ольга Витальевна, Москва

1. Bystrova,O.V., Lindner,В., Moll,H., Kocharova,N.A., Knirel,Y.A., Zähringer,U., Pier,G.B. (2003) Structure of the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa 0-12 with a randomly O-acetylated core region. Carbohydr. Res. 338, 1895-1905.

2. Быстрова,О.В., Линднер,Б., Моль X., Кочарова,Н.А., Шашков,А.С., Книрель,Ю.А., Цэрингер,У., Пайер,Дж.Б. (2004) Полное строение липополисахарида Pseudomonas aeruginosa иммунотипа 5. Биохимия, 69,211-217.

3. Bystrova,O.V., Lindner,В., Kocharova,N.A., Shashkov,A.S., Knirel,Y.A., Zähringer,U., Pier,G.B. (2003) Lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa: conserved and variable structural features. Abstr. Xllth Eur. Carbohydr. Symp. 188.

4. Bystrova,O.V., Shashkov,A.S., Kocharova,N.A., Knirel,Y.A., Lindner,В., Zähringer,U., Pier,G.B. (2001) Studies on the lipopolysaccharide core and O-chain structures in Pseudomonas aeruginosa immunotype 1. Abstr. Xlth Eur. Carbohydr. Symp. PB027.

5. Raetz,C.R.H. (1990) Biochemistry of endotoxins. Ann. Rev. Biochem. 59,129-170.

6. Holst,O., Ulmer,A.J., Brade,H., Flad,H.D., Rietschel,E.T. (1996) Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 16, 83-104.

7. Zähringer,U., Lindner,В., Rietschel,E.T. (1994) Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 50,211-276.