Установление строения О-антигенов кишечной палочки, содержащих нонулозоновые кислоты и другие необычные компоненты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

0050571Ь^

ШЕВЕЛЕВ Сергей Дмитриевич

УСТАНОВЛЕНИЕ СТРОЕНИЯ О-АНТИГЕНОВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ, СОДЕРЖАЩИХ НОНУЛОЗОНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ДРУГИЕ НЕОБЫЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 3 ДЕК 2012

Москва - 2012

005057162

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов ФГБУН Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Книрель Юрий Александрович кандидат химических наук Перепелов Андрей Вячеславович

Официальные оппоненты: Усов Анатолий Иванович

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией

Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН Тульская Елена Михайловна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: ГНЦ «Институт иммунологии» Федерального медико-

биологического агентства России

Защита диссертации состоится «2£>> декабря 2012 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.222.01 при ФГБУН Институте органической химии им Н.Д. Зелинского РАН по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak2.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «23» ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук

¿ъ* С._ Родиновская Л.А.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Важным компонентом клеточной оболочки грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС). Он удерживается на внешней мембране с помощью липидного якоря (липида А), а его О-специфичеекая полисахаридная цепь (ОПС), построенная из повторяющихся олигосахаридных звеньев и называемая О-антигеном, направлена в сторону окружающей среды. Серологически отличимые типы микроорганизмов продуцируют О-антигены со своей уникальной структурой, и, соответственно, серотип (иммуноспецифичность) микроорганизма тесно связан с хемотипом (составом и строением) ОПС. О-Антигены широко используются для серотипирования штаммов бактерий и серодиагностики. Интерес к ним обусловлен также их ролью в патогенезе инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями.

Изучение структуры и путей биосинтеза бактериальных углеводов является актуальной задачей современной биоорганической химии и гликобиологии. Оно позволяет решать целый ряд фундаментальных проблем микробиологии и иммунологии, как то: выяснять взаимосвязь между строением и функцией структурных компонентов бактериальной клеточной стенки, устанавливать механизмы иммунного ответа, прослеживать эволюционные пути формирования у микроорганизмов разнообразных антигенных структур. Знание строения О-антигенов имеет большое практическое значение для классификации бактерий, необходимой для эпидемиологического мониторинга, разработки новых диагностических препаратов и искусственных вакцин. Важную роль играет функциональный анализ генов биосинтеза О-антигенов, расположенных в хромосомных генных кластерах. Он позволяет выявить уникальные для данного серотипа гены, на основе которых создаются современные методы молекулярной диагностики и которые могут служить мишенями для целевой терапии инфекционных заболеваний.

Кишечная палочка (Escherichia coli), относящаяся к грамотрицательным бактериям семейства Enterobacteriaceae (энтеробактериям), обычно встречается в нижней части кишечника теплокровных животных. Большинство штаммов Е. coli не только являются безвредными, но и приносят пользу организму хозяина, предотвращая развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике. В то же время известны вирулентные штаммы этих бактерий, которые могут вызывать гастроэнтериты, воспаления мочеполовой системы и менингит у новорожденных. Наиболее опасны вероцитотоксин (токсин Шига)-продуцирующие штаммы, вызывающие геморрагические колиты и гемолитический уремический синдром, такие как Е. coli 0157 и 0104, а также исследованный в настоящей работе серотип 0145. Штамм Е. coli 0104 вызвал вспышку энтероколита в Северной Европе в 2011 г., унесшую жизни по меньшей мере 22 человек.

Кишечная палочка отличается большим разнообразием О-антигенных форм, которое рассматривается как один из факторов, способствующих адаптации бактерий в различных экологических нишах. Штаммы Е. coli объединяются в 186 О-серогрупп, основанных на сероспецифичности О-антигенов, и некоторые из серогрупп разделены на подгруппы. Хотя строение О-антигенов Е. coli интенсивно изучается на протяжении последних пятидесяти лет, к началу нашей работы были установлены структуры лишь немногим более половины всех известных О-антигенных форм.

Данная работа направлена на установление строения ранее неисследованных О-антигенов Е. coli, а также других важных генетически родственных энтеробакгерий -возбудителей сальмонеллеза (Salmonella enterica). Ее целью было также определение функций генов биосинтеза изученных О-антигенов путем анализа секвенированных генных кластеров с учетом полученных структурных данных. Эта часть работы была выполнена совместно с китайскими партнерами — генетиками из лаборатории функциональной геномики микробов Колледжа ТЕДА Нанкайского университета (г. Тянь-дзинь, КНР).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Научная новизна полученных результатов заключается в установлении структур ОПС десяти О-серогрупп кишечной палочки (029, 049, 0108, 0109, Ol 18, 0130, 0145, 0150, 0151 и 0161) и уточнении структур ОПС двух серогрупп (Ol 19 и 0123), определенных ранее с ошибками. Обнаружено родство трех изученных О-антигенов Е. coli с О-антигенами сальмонелл, установлена структура одного из них (.S'. enterica 058) и уточнена структура другого (S. enterica 048). В составе изученных О-антигенов обнаружены моносахариды, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, в том числе необычные высшие моносахариды, относящиеся к классу 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновых кислот. Одна из них - 8-эпилегионаминовая кислота - впервые выделена в свободном виде и надежно идентифицирована сравнением с заведомым синтетическим образцом. Впервые в О-антигенах найдено 7-М-аланильное производное другого представителя этого класса -легионаминовой кислоты, а также 4-К-[(5)-3-гидроксибутаноильное] производное 4-амино-4,6-дидезокхи-0-глюкозы.

На основании установленных структур ОПС и анализа секвенированных генных кластеров предположительно определены функции генов, кодирующих ферменты биосинтеза исследованных О-антигенов, в том числе охарактеризованы ранее неизвестные гены, участвующие в синтезе 8-эпилегионаминовой кислоты и N-ацетимидоильной группы. Полученные данные позволили сделать выводы о путях формирования генных кластеров О-антигенов в ходе эволюции энтеробактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты, полученные в ходе выполнения данного исследования, имеют практическое значение. Данные о структуре О-антигенов представляют собой молекулярную основу серологической классификации штаммов кишечной палочки, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга. Результаты функционального анализа генов биосинтеза О-антигенов могут быть использованы для разработки метода типирования клинических и природных изолятов Е. coli с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и служить молекулярными мишенями для целевой терапии инфекций, вызываемых патогенными штаммами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Результаты диссертационной работы были представлены на двух российских и четырех международных конференциях: I Молодежная конференция ИОХ РАН, Москва, 2005 г.; 18th International Symposium on Glycoconjugates, Florence, Italy, 2005; 13th European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 2005; 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Hyytiälä, Finland, 2010; IV Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2011 г.; FASEB Summer Research Conference Microbial Polysaccharides of Medical, Agricultural and Industrial Importance, Carefree, Arizona, USA, 2011. Полученные данные опубликованы в 12 статьях, включая один обзор, в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Автор лично проводил выделение, очистку, модификации и расщепление полисахаридов, все химические анализы, интерпретацию спектров ЯМР и масс-спектров. Он также участвовал в функциональном анализе генов биосинтеза изученных О-антигенов. Выводы работы основаны на данных, полученных автором лично или при его непосредственном участии в совместных исследованиях с соавторами, перечисленными в списке публикаций по теме диссертации. Все статьи по работе подготовлены при непосредственном участии автора.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена на 111 страницах и включает 19 таблиц и 38 рисунков. Работа состоит из введения, литературного обзора, глав «Результаты» и «Обсуждение результатов», экспериментальной части, выводов и списка литературы, состоящего из 150 наименований. Названия секций и шифры соединений в автореферате соответствуют главе «Результаты» диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Общие подходы к структурному анализу полисахаридов

Липополисахариды получали водно-фенольной экстракцией сухих бактериальных клеток и расщепляли мягким кислотным гидролизом 2% АсОН при 100 °С по кислотолабильной связи остатка кетодезоксиоктоновой кислоты, соединяющей липид А и углеводную часть ЛПС. Осадок липида А отделяли центрифугированием и водорастворимый материал фракционировали гель-хроматографией на колонке с гелем Sephadex G-50 Superfine, получая ОПС или, в случае присутствия нонулозоновых кислот с кислотолабильными гликозидными связями, олигосахарид, соответствующий повторяющемуся звену ОПС. Для структурного исследования кислотолабильных ОПС расщепление ЛПС проводили кислотным гидролизом в более мягких условиях при рН 4,2 или О-дезацилировали ЛПС в мягких щелочных условиях обработкой 12% NH4OH при 37 °С или 50 °С.

Основным подходом к установлению строения ОПС было сочетание традиционных химических методов анализа и спектроскопии ЯМР. К первым относятся определение моносахаридного состава и абсолютных конфигураций моносахаридов методом ГЖХ ацетатов полиолов и ацетилированных гликозидов с (5)-2-октанолом, полученных после полного кислотного гидролиза и алкоголиза полисахаридов, соответственно. Аминокомпоненты (аминосахара и аминокислоты) идентифицировали с помощью аминокислотного анализатора. Абсолютные конфигурации кислот неуглеводного рада (аминокислот, 3-гидроксимасляной кислоты, глицериновой кислоты, полученной окислением глицерина) определяли методом ГЖХ ацетилированных или трифторацетилированных (5)-2-октиловых эфиров. В некоторых случаях структуру и конфигурацию необычных моносахаридов устанавливали без их выделения в индивидуальном виде с помощью спектроскопии ЯМР, используя известные закономерности, связывающие абсолютные конфигурации моносахаридов с химическим сдвигами 13С ЯМР в дисахаридных фрагментах. В ряде случаев для определения типов замещения моносахаридов использовался метод метилирования, включающий идентификацию частично метилированных ацетатов полиолов с помощью ГЖХ/масс-спектрометрии.

Анализ с помощью одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н, 13С и 31Р включал: 1) предварительную характеристику состава ОПС с помощью одномерной спектроскопии, 2) отнесение сигналов в спектрах с использованием двумерных корреляционных экспериментов 'H.'HCOSY, TOCSY и 'Н,13С HSQC (в некоторых случаях также JH,13CHMQC-TOCSY), 3) определение конфигураций гликозидных связей и размеров моносахаридных циклов по величинам констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) вицинальных протонов, 4) выяснение мест гликозилирования и присоединения неуглеводных заместителей по характерным изменениям химических сдвигов 13С ЯМР; для локализации фосфатных групп

использовался также эксперимент 'Н,31РНМВС и 5) установление последовательности моносахаридов с помощью методик, основанных на ядерных эффектах Оверхаузера (двумерные эксперименты МЭЕЗУ или ЯОЕБУ) и выявляющих пространственную сближенность протонов соседних моносахаридных остатков; для некоторых полисахаридов с этой целью использовался

разделенных гликозидной связью. Последний метод применялся также для локализации необычных М-ацильных групп аминосахаров наряду со спектроскопией ЯМР в смеси НгО/ТЬО, позволяющей детектировать МН-протоны аминосахаров и выявлять их корреляции с СН-протонами М-ацильных групп. При необходимости применялись химические модификации ОПС, такие как О-дезацетилирование действием 12% М14ОН и дефосфорилирование обработкой 48% ОТ, с последующим сравнительным ЯМР-спектроскопическим анализом исходного и модифицированного полисахаридов.

В ряде сложных случаев необходимым оказалось также проведение избирательного расщепления ОПС для получения необычных производных моносахаридов или олигосахаридных фрагментов. С этой целью применялись сольволиз трифторметансульфокислотой, распад по Смиту и дефосфорилирование действием 48% ОТ, как описано ниже при рассмотрении структур соответствующих ОПС. Продукты расщепления выделяли гель-проникающей хроматографией на колонке с гелем ТЭК Н\У-40, их строение устанавливали методами спектроскопии ЯМР, как описано выше, и подтверждали определением молекулярной массы с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением.

В составе изученных ОПС обнаружены и идентифицированы N-ацильные производные трех нонулозоновых кислот - 5-амино-3,5-дидезокси-0-г/ш^е/?о-0-га<гжто-нон-2-улозоновой (нейраминовой, Neu), 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-П-2ягя/е/?о-П-га/га/аяо- и -L-глицеро-0-га'/акто-ноп-2-улозоновой (легионаминовой, Leg, и 8-эпилегионаминовой, 8eLeg, соответственно), имеющие следующее строение:

также эксперимент 'Н,13СНМВС, показывающий корреляции протонов и атомов углерода,

2. О-Антигены, содержащие нонулозоновые кислоты

он

он

он

Ncu5Ac

Leg5Ac7(D-Ala)

8cLcg5Ac7Ac

2.1. Установление структуры ОПС Е. coli 0145 и уточнение структуры ОПС S. enterica 048, содержащих нейраминовую кислоту

При мягкой кислотной деградации ЛПС из Е. coli 0145 ОПС произошло расщепление ОПС и образовался олигосахарид 1. Моносахаридный анализ 1 выявил присутствие D-GlcN и 2-амино-2,6-дидезокси-Ь-галактозы (2-амино-2-дезокси-Ь-фукозы, FucN). Дальнейшее исследование показало, что 1 содержит также производное нейраминовой кислоты, которая не обнаруживалась при анализе ГЖХ ацетатов полиолов из-за ее полного разрушения при кислотном гидролизе ОПС. По данным спектров 'Н и 13С ЯМР 1 включает две N-ацетильные группы (Ас) и одну N-ацетимидоильную группу (Am) (характерные сигналы NAc: СН3 при 5н 1,98 и 2,06 м.д., 8С 23,7 м.д., С=0 при 174,7 и 175,2 м.д.; NAm: СН3 при 8Н 2,30 м.д., Sc 20,5 м.д., C=N при 167,7 м.д.).

Анализ с помощью двумерной спектроскопии ЯМР (COSY, TOCSY) выявил по одной спиновой системе для GlcN, FucN и Neu, и, таким образом, 1 является трисахаридом. С использованием экспериментов ROESY и 'Н,13С HSQC установлена структура 1, включая размеры циклов и положения замещения моносахаридов, их последовательность и конфигурации гликозидных связей. Сравнение спектров ЯМР трисахарида 1 с описанными в литературе данными для FucNAm и FucNAc показало, что N-ацетимидоильная группа в 1 присоединена к остатку FucN, и, следовательно, два другие аминосахара несут N-ацетильные группы. Структура 1 как трисахарида a-L-FucpNAm-(l-»3)-a-D-GlcpNAc-(l->4)-Neu5Ac подтверждена определением молекулярной массы методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Этот трисахарид, образовавшийся в результате расщепления ОПС по кислотолабильным гликозидным связям Neu5Ac, соответствует повторяющемуся звену ОПС.

Для определения конфигурации гликозидной связи Neu5Ac в ОПС и способа соединения повторяющихся звеньев друг с другом было проведено О-дезацилирование ЛПС в мягких щелочных условиях действием 12% NH4OH при 37 °С. Спектры ЯМР выявили структурную гетерогенность полученного полимера, вызванную частичным удалением N-ацетимидоильной группы и ее частичным превращением в N-ацетильную группу. Дезацилирование ЛПС в более жестких условиях при 50 °С привело к полисахариду, содержащему только одно производное фукозамина - FucNAc. Структурный анализ модифицированного полисахарида с помощью двумерной спектроскопии ЯМР, проведенный аналогично описанному выше для трисахариду 1, позволил установить строение ОПС Е. coli 0145:

->4)-a-Neup5Ac-(2-^3)-a-L-FucpNAm-(l—>3)-a-D-GlcpNAc-(l—>

Изученный ОПС обладает существенным структурным сходством с ОПС S. enterica 048, который согласно опубликованным данным отличается только присутствием остатка FucNAc

вместо остатка FucNAm и О-ацетилированием остатка Neu5Ac (Gamian et al. II Eur. J. Biochem. 2000, 267, 3160-3166). Проведенный нами анализ показал, что FucNAc в этом ОПС идентифицирован ошибочно и на самом деле он, также как и ОПС Е. coli 0145, содержит FucNAm. Следовательно, ОПС S. enterica 048 имеет следующую уточненную структуру:

—>4)-a-Neup5Ac7,90Ac-(2—»3)-a-L-FucpNAm-( 1 ->3)-a-D-GlcpNAc-(l

2.2. Структура ОПС Е. coli 0161, содержащего легионаминовую кислоту

Как и в случае Е. coli 0145, при мягком кислотном гидролизе ЛПС Е. coli 0161 полимерного продукта не образовалось, и был выделен олигосахарид 2. Как показало последующее исследование, деполимеризация ОПС была вызвана присутствием производного легионаминовой кислоты с кислотолабильной гликозидной связью. По данным химических анализов и спектра 13С ЯМР (рис. 1А) в состав олигосахарида 2 входили также D-GlcN, D-глюкуроновая кислота (D-GlcA) и D-апанин (D-Ala). Структура 2 как трисахарида ß-D-GlcpA-(l->3)-a-D-GlcpNAc-(l—>8)-Legp5Ac7(D-Ala) была установлена с помощью двумерной спектроскопии ЯМР аналогично трисахариду 1.

А1

-JA

GA1 GN1

GN3

GN4 L6

Y7,

19 A3

GAS

GN3

GN2

A2 L7

A3 L9

105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20

Рис. 1. Спектры С ЯМР трисахарида 2 (А) и О-дезацилированного ЛПС (В) из Е. coli 0161. А - Ala, GA - GlcA, GN - GlcN, L - Leg. Различные химические сдвиги сигналов L6 и GA4 в двух спектрах отвечают ß-конфигурации Leg и терминальному положению GlcA в 2 и ос-конфигурации Leg и замещению GlcA в положение 4 в ОПС, соответственно.

Структура Leg следовала из спектра 13С ЯМР, который содержал характеристичные сигналы для кето-группы (С-2), дезокси-групп (С-3 и С-9), атомов углерода, связанных с атомами азота (С-5 и С-7) и кислорода (С-4, С-6 и С-8). Положение дезокси-групп СН2 и СНз в Leg подтверждалось химическими сдвигами и характером спин-спинового расщепления сигналов Н-3 и Н-9 и соседних протонов. Конфигурация Leg определена на основании следующих данных:

1. Относительно большие КССВ J3ax,4, Í4.5 и J5.6 -10-12 Гц указывали на пиранозную форму цикла с аксиальной ориентацией Н-4, Н-5 и Н-6; следовательно, фрагмент С-4-С-6 имеет А-сшо-конфигурацига.

2. Положение сигнала С-6 при 70,2 м.д. характерно для арабино-конфигурации фрагмента С-6-С-8 нонулозоновых кислот с ксило-конфигурацией фрагмента С-4-С-6 и, таким образом, свидетельствует о Т)-глицеро-Т)-галакто- или Ъ-глицеро-О-галакто-конфигурации (в сравнении с литературными данными 70,9, 72,9, 77,3, и 76,0 м.д. для И-гяицеро-О-галакто-, Ь-глщеро-Т)-галакто-, Т>-глщеро-Ъ-альтро- и Ь-глицеро-Ь-алътро-изомеров, имеющих арабино-, ксило-, ликсо- и /шбо-конфигурацию фрагмента С-6-С-8, соответственно).

3. эритро-Конфигурация фрагмента С-7-С-8 следовала из пространственной близости протонов Н-9 и Н-7, а также протонов Н-8 и Н-6, которая выявлена в двумерном эксперименте ROESY. Такое расположение протонов характерно для легионаминовой кислоты, имеющей О-глицеро-и-галакто-конфигурацпю, тогда как корреляция между протонами Н-9 и Н-6 указывала бы на трео-конфигурацию фрагмента С-7-С-8, отвечающую 8-эпилегионаминовой кислоте с Ь-глт/еро-П-галакто-конфтурацией.

4. Относительно большое сильнопольное смещение сигнала С-9 Leg от 20,4 м.д. к 17,7 м.д., вызванное гликозилированием Leg остатком p-D-GlcNAc в положение 8, подтверждало D-конфигурацию С-8 и, следовательно, О-гяицеро-О-галакто-конфигурацию Leg. Такая же конфигурация была установлена для легионаминовой кислоты в ранее исследованных полисахаридах бактерий и подтверждена выделением Leg5Ac7Ac в свободном виде и ее сравнением с заведомым синтетическим образцом.

Положение N-ацильных заместителей - ацетильных групп и остатка аланина -определяли по данным спектров ЯМР для раствора трисахарида 2 в смеси H2O/D2O (9:1). С помощью эксперимента TOCSY были отнесены сигналы трех NH-протонов: NH-5 и NH-7 Leg и NH-2 GlcN. Эксперимент ROESY выявил корреляционные пики протонов NH-2 GlcN и NH-5 Leg с протонами NAc групп, определяющие положения ацетилирования, а кросс-пик между NH-7 Leg и Н-2 Ala указывал на присоединение остатка аланина к N-7 Leg. Следовательно, в состав 2 входит 5-М-ацстил-7-Ы-(0-аланил)легионаминовая кислота.

Сравнение данных спектров ЯМР трисахарида 2, соответствующего повторяющемуся звену ОПС, и полисахарида, полученного О-дезацилированием ЛПС 12% NH4OH (его спектр 13С ЯМР показан на рис. 1В), позволило установить замещение GlcA в положение 4 и a-конфигурацию гликозидной связи Leg. Таким образом, ОПС Е. coli Ol61 имеет следующую уникальную структуру:

—>8)-a-Legp5Ac7(D-Ala)-(2->4)-ß-D-GlcpA-(l-»3)-a-D-GlcpNAc-(l—>

2.3. Структура ОПС Е. coli 0108, содержащего 8-эпилегионаминовую кислоту.

Из-за присутствия в ОПС производного 8-эпилегионаминовой кислоты (8eLeg) с кислотолабильной гликозидной связью расщепление ЛПС Е. coli 0108 в стандартных условиях гидролиза 2% уксусной кислотой сопровождалось деполимеризацией ОПС. Деградация в более щадящих кислотных условиях при pH 4,2 позволила получить высокомолекулярный ОПС. Моносахаридный анализ показал присутствие в его составе D-Gal, D-GlcN и L-FucN. Спектры ЯМР показали, что ОПС имеет тетрасахаридное повторяющееся звено, включающее кроме перечисленных выше моносахаридов также производное 8eLeg, и что все аминосахара N-ацетилированы. Анализ с помощью двумерной спектроскопии ЯМР позволил установить следующую, также уникальную структуру ОПС Е. coli 0108:

->4)-a-8eLegp5Ac7Ac-( 1 ->6)-<x-D-Gal/?-( 1 ->3)-cc-L-FucpNAc-( 1 ->3)-a-D-GlcpNAc-(l

8-Эпилегионаминовая кислота была идентифицирована аналогично легионаминовой кислоте путем детального анализа спектров ЯМР. Так, большие величины КССВ J3ax,4, J4>5 и Í5.6 ~10 Гц свидетельствовали об аксиальной ориентации протонов Н-4, Н-5 и Н-6 и, таким образом, о ксило-конфигурации фрагмента С-4—С-6. Небольшие величины КССВ J6,7 ~2 Гц и J?,8 ~6 Гц указывали на тирео-конфигурацию фрагментов С-6-С-7 и С-7-С-8. Относительно большая разница (—0,9 м.д.) между химическими сдвигами протонов Н-Зах и H-3eq указывала на аксиальное положение карбоксильной группы и, следовательно, на а-конфигурацию гликозидной связи 8eLeg. Абсолютная конфигурация 8eLeg следовала из относительно небольшой величины (4,1 м.д.) a-эффекта гликозилирования остатком a-D-GlcNAc на С-4 остатка 8eLeg5Ac7Ac и относительно большой отрицательной величины (-3,4 м.д.) ß-эффекта гликозилирования на С-3, характерных для Ь-глицеро-О-галакто-коп^шурглщл.

Здесь следует отметить, что разница между параметрами спектров ЯМР различных изомеров нонулозоновых кислот сопоставима с отклонениями от значений для одного изомера, вызываемыми различными по природе соседними моносахаридами и N-ацильными заместителями в полисахариде. В связи с этим полная уверенность в том, что в природе

действительно существуют два эпимера по С-8, а не только один D-эпимер - легионаминовая кислота, могла быть достигнута только в результате выделения производного 8eLeg в свободном виде. Это впервые было осуществлено в настоящей работе с помощью трех последовательных деградаций по Смиту ОПС Е. coli 0108 (схема 1). Каждая из стадий включала периодатное окисление, боргидридное восстановление и мягкий кислотный гидролиз при pH 4,2 (i), а затем проводился кислотный гидролиз 2% уксусной кислотой при 100 °С (ii) полученного гликозида с этиленгликолем 3. Выделение 8eLeg5Ac7Ac непосредственно из ОПС невозможно, так как при мягком кислотном гидролизе не расщепляется гликозидная связь между GlcNAc и 8eLeg5Ac7Ac, а в более жестких условиях сама кислота 8eLeg5Ac7Ac полностью разрушается. Сравнение спектров 'Н и 13С ЯМР выделенной 8eLeg5Ac7Ac и заведомого синтетического образца однозначно продемонстрировало ее Ъ-глицеро-Т)-галакто-конфигурацию.

Oll

Схема 1. Выделение ди-1Ч-ацетил-8-эпилегионаминовой кислоты из ОПС Е. coli Ol 08.

3. Фосфорилированные О-антигены 3.1. Структура ОПС Е. coli 029 и 0130, содержащих фосфат глицерина

Моносахаридный анализ выявил присутствие Glc, Gal, GlcN и FucN в составе ОПС Е. coli 029. Спектр 3,Р ЯМР показал наличие одной монофосфатной группы (сигнал при 1,43 м.д.). Дефосфорилирование ОПС 48% HF привело к увеличению содержания глюкозы в гидролизате (соотношения моносахаридов изменилось от 1,1:1:0,9:0,7 до 1,8:1:0,7:0,6, соответственно), что указывало на присутствие в ОПС двух остатков глюкозы, один из которых фосфорилирован. ЯМР-спектроскопическое исследование позволило установить структуру как олигосахарида 4, полученного дефосфорилированием ОПС:

a-D-Glcp-( 1 —>6)-a-D-Galp 1 i 3

ß-D-Glcp-( 1 —>4)-a-L-FucpNAc-( 1 —3)-ß-D-GlcpNAc-( 1 —3)-D-Gro, так и ОПС E. coli 029:

a-D-Glcp-( 1 —>6)-a-D-Galp 1 i 3

—>3)-D-Gro-1 -P-(0—>6)-ß-D-Glc/)-( 1 —>4)-a-L-Fuc¿>NAc-( 1 ->3)-ß-D-Glc/?NAc-(l —

Этот ОПС содержит глицерофосфат (D-Gro-1-P) в основной цепи и, таким образом, построен по типу глицеринтейхоевых кислот, больше характерных для грамположительных бактерий

Второй ОПС, в состав которого входит глицерофосфат, обнаружен у Е. coli 0130. Компонентами этого ОПС являются D-Glc, D-Gal и D-GalNAc. Глицерофосфат входит в боковую цепь ОПС, и поэтому при его дефосфорилировании получен модифицированный полисахарид того же состава, что и исходный ОПС. С помощью спектроскопии ЯМР установлены следующие структуры дефосфорилированного полисахарида:

ß-D-GalpNAc 1 i 3

4)-a-D-Galp-( 1 ->6)-a-D-Glc/>-( 1 ->3)-ß-D-GalpNAc-( 1

и исходного ОПС Е. coli 0130:

Gro-2-F-(0-»4)-ß-D-GalpNAc 1 I

3

-> 4)-a-D-Gal/>( 1 ->6)-a-D-Glcp-( 1 -»3)-ß-D-GalpNAc-( 1 -*

3.2. Структура ОПС Е. coli 0118 и 0151, содержащих фосфат рибита

Моносахаридный анализ показал, что ОПС Е. coli 0118 и 0151 имеют одинаковый состав и содержат D-Gal, D-GlcN и FucN. В спектрах 31Р ЯМР обоих ОПС присутствовал сигнал фосфатной группы при 1,30 м.д. После дефосфорилирования в гидролизате обнаружен также рибит. В спектрах 'Н ЯМР и 13С ЯМР (рис. 2А,В) присутствовали характерные сигналы N-ацетимидоильной группы (Н-2 при 2,26 м.д., С-1 и С-2 при 167,5-167,7 и 20,5-20,6 м.д., соответственно). Ее положение на остатке FucN и N-ацетилирование остатка GlcN установлено на основании корреляций протонов СНз ацильных групп с NH-протонами аминосахаров, выявленных при съемке двумерного спектра ROESY в смеси H2O/D2O.

А R|

i I * е

í

,, In-»

У. о

■»VrW^VtM^V

kMiAW+^Jivv

о А о ~

II II

VWWWwm»-'

G2

5 г

í I

170 105 100 95 90 85 eo 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 ppm

Рис. 2. Спектры 13C ЯМР ОПС E. coli Ol 18 (А) и 0151 (В). F - FucN, G - GlcN, R- Rib-ol. Различные химические сдвиги сигналов R3 и R2 в двух спектрах указывают на замещение остатка рибита в положение 3 или 2 в ОПС Е. coli 0118 и 0151 соответственно.

С помощью двумерной спектроскопии ЯМР установлены следующие близкородственные структуры обоих ОПС, построенных по типу рибиттейхоевых кислот:

Е. coli от

->3)-D-Rib-ol-5-F-(0->6)-a-D-Gal^-(l->3)-a-L-FucpNAm-(l->3)-ß-D-Glc^NAc-(l-> E.coli Ol51

ß-D-GlcpNAc 1 i 4

—>2)-D-Rib-ol-5-.P-(0—»6)-a-D-Gal;?-( 1 ->3)-a-L-Fuc/>NAm-(l ->3)-ß-D-GlcpNAc-( 1 -»

Эти ОПС отличаются друг от друга только местом замещения остатка рибита (в положение 3 или 2) и присутствием бокового остатка D-GlcNAc в ОПС Е. coli 0151. Сходную линейную структуру, совпадающую со структурой основной цепи ОПС Е. coli 0151, имеет ОПС S. enterica 047, изученный независимо от данной работы (А. В. Перепелов и др. // Биохимия 2009, 74, 416-420):

->2)-D-Rib-ol-5-P-(0->6)-a-D-Galp-(l->3)-a-L-FucpNAm-(l->3)-ß-D-GlcpNAc-(l->

4. Другие О-антигены 4.1. Структура ОПС Е. coli 0150, содержащего 2-ацетамидо-2-дезокси-4-[(5)-1-карбоксиэтил]-0-глюкозу

В ОПС Е. coli 0150 идентифицированы D-Glc, L-Rha и D-GlcN. Судя по присутствию в спектрах ЯМР характерных сигналов молочной кислоты (Н-2 и Н-3 при 4,45 и 1,29 м.д., С-1 и С-3 при 179,4 и 18,8 м.д. соответственно), в состав ОПС входит также гликолактиловая кислота — простой эфир моносахарида с молочной кислотой (lac).

Двумерный эксперимент ROESY выявил пространственную сближенность протонов Н-2 молочной кислоты и Н-4 остатка GlcNAc и тем самым продемонстрировал присутствие в ОПС остатка GlcNAc41ac. Этот моносахарид был выделен в индивидуальном виде сольволизом ОПС действием безводной трифторметансульфокислоты и идентифицирован как (5)-изомер по молочной кислоте D-GlcNAc4(51ac) сравнением данных спектров 'Н и 13С ЯМР и удельного оптического вращения с данными для заведомых синтетических образцов (R)- и (5)-изомеров.

Структура, установленная методами ЯМР-спектроскопии, была подтверждена распадом ОПС по Смиту, который привел к гликозиду трисахарида 5 с остатком глицеринового альдегида в качестве агликона a-L-Rhap-(l->3)-ß-D-GlcpNAc-(l->3)-ß-D-GlcpNAc4(51ac)-(l-»2)-Gro-al. На основании полученных данных сделан вывод о том, что ОПС Е. coli 0150 имеет следующую структуру:

—>3)-ß-D-GlcpNAc4(Slac)-( 1 ->2)-a-L-Rhap-( 1 ->2)-a-L-Rhap-( 1 ->3)-ct-L-Rhap-( 1 ->3)-ß-D-GlcpNAc-(l

2 t 1

a-D-Glcp

H*OC. P h

HO / "-«OH

AcNH

D-GlcNAc4Slac

4.2. Установление структур ОПС Е. coli 049 и S. enterica 058 и уточнение структуры ОПС Е. coli 0123, содержащих производные 4-амино-4,6-дидезокси-0-глюкозы (4-амино-4-дезокси-0-хиновозы, D-Qui4N)

В составе ОПС Е. coli 049 обнаружены L-Rha, D-GlcN и D-GalN. Четвертый компонент ОПС - производное Qui4N - не удалось идентифицировать с помощью химического анализа, поскольку Qui4N полностью разрушался в условиях кислотного гидролиза. Его структура и абсолютная конфигурация, а также присутствие на нем (5)-3-гидроксибутаноильной группы (iSHb) в качестве N-ацильного заместителя были определены методами спектроскопии ЯМР. С помощью этого же подхода была установлена следующая структура ОПС Е. coli 049 (курсивом показано нестехиометрическое содержание О-ацетильной группы, составляющее ~30%):

—>2)-a-D-Quip4N(5Hb)-(l->4)-ß-D-Gal/)NAc-(l—>4)-a-L-Rhap-(l-^3)-ß-D-GlcpNAc6CMc-(l—>

Другим ОПС кишечной палочки, содержащим производное Qui4N, является О-антиген Е. coli 0123, для которого была установлена следующая структура (степень О-ацетилирования остатка GlcNAc также составляет -30%) (Clark et al. II J. Med. Microbiol. 2009, 58, 884-894):

-»3)-ß-D-Qui/>4N(L-Ala-Ac)-( 1 ->6)-a-D-Glc/?NAc-( 1 ->3)-a-L-QuipN(SHb)-( 1 ->3)-cx-D-GlcpNAc60/fc-( 1 ->

В нашей работе эта структура была уточнена. Так, анализ ГЖХ ацетилированных (5)-2-октигликозидов привел к идентификации D-аланина, и, таким образом, абсолютная конфигурация этой кислоты в ОПС должна быть исправлена на D, а ЯМР-спектроскопическое исследование показало, что должно быть изменено также распределение N-ацильных заместителей аминосахаров. Локализация обеих N-ацильных групп [D-аланильной и (S)-3-гидроксибутаноильной] на одном, а не на разных моносахаридах подтверждена серией трех последовательных распадов ОПС по Смиту (i), которая привела к гликозиду производного Qui4N 6 (схема 2).

Таким образом, с учетом уточнений ОПС Е. coli 0123 имеет следующую структуру:

->3)-ß-D-Qui/?4N(D-Ala-SHb)-( 1 ->6)-a-D-GlcpNAc-( 1 ->3)-a-L-Qui/>NAc-( 1 -»3)-a-D-GlcpNAc604c-( 1 ->

Сходная структура установлена нами для ОПС S. enterica 058, единственное отличие которого от ОПС Е. coli 0123 заключается в отсутствии О-ацетильной группы на остатке GlcNAc:

->3)-ß-D-Qui/j4N(D-Ala-5Hb)-( 1 -+6)-a-D-Glc/jNAc-( 1 -+3)-a-L-Qui/>NAc-( 1 ->3)-a-D-Glc/>NAc-( 1

сн,он

е а. ро о—^

i f о—^ 1_'„о—i"1 i /он У CHjOII

"^V^-NH ¿н .bC^-^-NH

".CYYN" по О 6

но о

Схема 2. Выделение гликозида 4-[(5)-3-гидроксибутаноил]амино-4,6-дидезокси-0-глюкозы 6

из ОПС Е. coli от.

4.3. Установление структуры ОПС Е. coli 0109 и уточнение структуры ОПС Е. coli Ol 19, содержащих производные 2,3-диамино-2,3,6-тридезокси-Ь-маннозы (2,3-диамино-2,3-дидезокси-Ь-рамнозы, L-RhaN3N)

Моносахаридный анализ показал, что в состав ОПС Е. coli 0109 входят 6-дезокси-L-талоза (6dTal), D-Glc и D-GlcNAc. С помощью спектроскопии ЯМР идентифицирован еще один компонент этого ОПС - редко встречающийся в природе диаминосахар 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-Ь-рамноза. Он не выявлялся при анализе ГЖХ ацетатов полиолов из-за низкой летучести его производного, однако ГЖХ ацетилированных (5)-2-октилгликозидов позволила определить его абсолютную конфигурацию. Структура ОПС была установлена с помощью двумерной спектроскопии ЯМР без применения избирательного расщепления. В ОПС присутствуют О-ацетильные группы, положение которых было установлено по характерному смещению в слабое поле сигналов протонов при ацетоксилированных атомах углерода: Н2 6dTal и Н4 RhaNAc3NAc. Таким образом, ОПС Е. coli 0109 имеет следующую структуру:

ß-L-RhapNAc3NAc4Ac 1

з

—»4)-a-D-Glcp-(l-»3)-a-L-6dTalp2Ac-( 1 ->3)-ß-D-Glc/;NAc-( 1

Другое производное RhaN3N - 2-ацетамидо-3-формамидо-2,3,6-тридезоксиманноза (RhaNAc3NFo) - было обнаружено ранее в составе ОПС Е. coli Ol 19 (Anderson et al. 11 Carbohydr. Res. 1992, 237, 249-262). На основе анализа межзвеньевых ядерных эффектов Оверхаузера этому моносахариду была приписана D-конфигурация. Сравнительный анализ генных кластеров биосинтеза О-антигенов Е. coli 0109 и Е. coli 0119 показал высокую степень гомологии генов синтеза RhaN3N, что указывало на вероятную идентичную абсолютную конфигурацию этого моносахарида в ОПС обеих бактерий. В связи с этим мы провели повторное исследование ОПС Е. coli 0119 и с помощью анализа ГЖХ ацетилированных (5)-2-октилгликозидов установили, что на самом деле RhaN3N представлен в нем L-формой, то есть, как и ожидалось на основании генетических данных, этот моносахарид имеет такую же абсолютную конфигурацию, как в ОПС Е. coli 0109.

На основании этих данных ОПС Е. coli Ol 19 имеет следующую уточненную структуру:

ß-L-RhapNAc3NFo 1 i 3

—»2)-ß -D-Manp-( 1 —>3)-a-D-Galp-(l ->4)-a-L-Rhap-( 1 ->3)-a-D-GlcpNAc-( 1 ->

5. Особенности состава и строения изученных О-антигенов: обобщение

В составе всех исследованных О-антигенов Е. coli обнаружены редко встречающиеся моносахариды, такие как нонулозоновые кислоты (нейраминовая, легионаминовая, 8-эпилегионаминовая), гликолактиловая кислота и 6-дезоксиаминосахара с необычными N-ацильными заместителями. Различные производные нейраминовой кислоты - сиаловые кислоты - широко распространены в природе как компоненты гликолипидов (ганглиозидов) и гликопротеинов животных, однако в полисахаридах бактерий этот моносахарид находят относительно редко и только в N-ацетилированной форме. Кроме указанных выше О-антигенов, Neu5Ac обнаружена в О-антигенах ряда энтеробактерий, включая четыре другие серогруппы Е. coli, нескольких штаммов Vibrio cholerae и Shewanella alga, а также в некоторых капсульных полисахаридах Е. coli и менингококков (Neisseria meningitidis). Легионаминовая кислота впервые обнаружена в ОПС бактерии Legionella pneumophila, давшей ей название, и позднее в полисахаридах Acinetobacter baumannii, Vibrio parahaemolyticus и Vibrio salmonicida, а в настоящей работе впервые в энтеробактериях у Е. coli Ol61. Если ранее в ЛПС были найдены N-ацетильные, N-ацетимидоильные и Л-[(5)-3-гидроксибутаноильные] производные Leg, то в настоящей работе обнаружено 1Ч-(0-аланильное) производное, которое прежде как компонент О-антигенов описано не было. 8-Эпилегионаминовая кислота, найденная впервые в О-антигене Pseudomonas aeruginosa 013,

была обнаружена также в нескольких энтеробактериальных полисахаридах, включая О-антигены Е. coli 061 и в настоящей работе Е. coli 0108, а также у морской бактерии Shewanella putrefaciens.

Моносахарид, относящийся к гликолактиловым кислотам, - простой эфир D-GlcNAc с (5)-молочной кислотой, идентифицирован в О-антигене Е. coli 0150. Он является регио- и стереоизомером N-ацетилмурамовой кислоты - компонента пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий. Кроме Е. coli 0150, D-GlcNAc4(Slac) и его (й)-изомер по молочной кислоте находили только в О-антигенах бактерий рода Proteus. В четырех исследованных О-антигенах присутствуют фосфатные группы, вводящие в полисахариды глицерин (Е. coli 029 и 0130) и рибит (Е. coli 0108 и 0151). При этом О-антигены всех серогрупп, кроме 0130, содержат фосфат полиола в основной цепи, то есть построены аналогично тейхоевым кислотам, характерным для грамположительных бактерий, тогда как у грамотрицательных бактерий полимеры такого типа встречаются редко.

Для одного из найденных в ОПС 6-дезоксиаминосахаров - D-Qui4N - характерно присутствие на атоме азота необычных N-ацильных заместителей, среди которых встречаются такие группы как формил, малонил, сукцинил, N-ацетилглицил, N-ацетиласпартил, М-[(й)-3-гидроксибутаноил]-Ь-аланил, 2,4-дигидрокси-3,3,4-триметил-5-оксопролил и др. Однако М-[(5)-3-гидроксибутаноилыюе] и К-[(5)-3-гидроксибутаноил]-Б-аланильное производные D-Qui4N обнаружены нами в составе ОПС Е. coli 049 и 0123 и S. enterica 058 впервые. Другой необычный 6-дезоксиаминосахар - L-RhaN3N — в одном из изученных нами О-антигенов {Е. coli 0109) ди-Ы-ацетилирован, а в другом (Е. coli Ol 19) несет ацетильную группу при N-2 и формильную группу при N-3. Кроме Е. coli этот моносахарид находили только в одном из О-антигенов Proteus penneri. Более распространенный 6-дезоксиаминосахар L-FucN найден как в обычной N-ацетилированной форме (Е. coli 029 и 0108), так и несущим N-ацетимидоильную группу (Е. coli 0108, 0145 и 0161). L-FucNAm идентифицирован нами также в О-антигене S. enterica 047, тогда как раньше предполагалось, что в его состав входит L-FucNAc. N-Ацетимидоильная группа обладает основными свойствами и нейтрализует заряд кислотных компонентов, входящих в повторяющееся звено наряду с FucNAm (Neu в Е. coli 0145, фосфатная группа в Е. coli Ol 18 и 0151), придавая ОПС цвитгерионный характер.

Присутствие в ОПС необычных компонентов потребовало поиска индивидуальных подходов к их идентификации и структурному анализу содержащих их полисахаридов. Так, высокомолекулярные ОПС, включающие нонулозоновые кислоты с кислотолабильными гликозидными связями, не могли быть получены стандартным методом — кислотной деградацией ЛПС разбавленной уксусной кислотой, так как в этих условиях происходила их

деполимеризация. Для преодоления этой трудности использовались два альтернативных подхода - гидролиз буферным раствором при более высоком значении pH или мягкое щелочное О-дезацилирование ЛПС. Далее, нонулозоновые кислоты и некоторые другие моносахариды (например, Qui4N) не могли быть идентифицированы при обычном моносахаридном анализе из-за кислотолабильности самих Сахаров. Для определения их строения применялась спектроскопия ЯМР полисахаридов или полученных из них олигосахаридов с использованием закономерностей, установленных в ходе проводившихся ранее структурных исследований углеводов, содержащих эти или аналогичные моносахариды.

Полученные данные о строении О-антигенов являются существенным вкладом в создание химической основы для классификации штаммов Е. coli. Большинство установленных структур являются уникальными среди О-антигенов Е. coli, что свидетельствует об обоснованности отнесения исследованных штаммов в отдельные О-серогруппы. Серологическое различие между серогруппами 0118 и 0151, имеющими родственные по структуре О-антигены, очевидно обусловлено присутствием бокового остатка GlcNAc в О-антигене Е. coli 0151. Действительно, известно, что моносахариды, находящиеся в боковых цепях разветвленных полисахаридов и на невосстанавливающем конце основной цепи наиболее доступны для взаимодействия с антителами и вносят наибольший вклад в иммуноспецифичность бактерий. При этом концевыми часто являются редко встречающиеся и уникальные моносахариды, как это имеет место и в изученных О-антигенах Е. coli, что ведет к максимальной диверсификация антигенных структур, позволяя бактериям избегать защитного действия иммунной системы.

6. Функциональный анализ генных кластеров О-антигенов

Анализ секвенированных генных кластеров О-антигенов выполнялся совместно с китайскими партнерами путем сравнения с нуклеотидными и предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в доступной базе данных GenBank, с использованием онлайновой программы BLAST и учитывая полученные данные о строении О-антигенов. Анализ выявил присутствие в кластерах всех генов, необходимых для биосинтеза изученных ОПС, в том числе а) генов для синтеза нуклеотид-активированных предшественников необычных компонентов ОПС, б) генов гликозилтрансфераз, последовательно переносящих моносахариды на растущее повторяющееся звено, сборка которого происходит на липидном носителе на цитоплазматической стороне внутренней мембраны, и в) генов процессинга О-антигена, которые кодируют флиппазу и полимеразу, предназначенные для переноса повторяющегося звена через мембрану и соединения звеньев в

полисахаридную цепь, соответственно. Анализ показал также, что первым моносахаридом повторяющихся звеньев, с переноса которого на липидный носитель начинается синтез О-антигена, является М-ацетил-О-гексозамин - D-GlcNAc или D-GalNAc.

Особый интерес представляет обнаружение в генных кластерах О-антигенов Е. coli Ol61 и 0108 генов биосинтеза производных легионаминовой и 8-эпилегионаминовой кислот. Гены первого имеют высокую степень гомологии с генами, кодирующими ферменты известного пути биосинтеза ди-Ы-ацетиллегионаминовой кислоты и катализирующие также другие аналогичные биохимические реакции. Это указывает на то, что 7-Ы-аланильное производное легионаминовой кислоты синтезируется по такому же пути, что и Leg5Ac7Ac, а единственное структурное различие между моносахаридами обусловлено измененной субстратной специфичностью ацилтрансферазы, переносящей ацетильный или аланильный остаток на аминогруппу в положении 7. В генном кластере О-антигена Е. coli 0108 найдены семь генов пути биосинтеза ди-М-ацстил-8-опилегионаминовой кислоты, предсказанные функции которых сходны с функциями генов биосинтетического пути производных Leg. Путь биосинтеза 8eLeg5Ac7Ac до сих пор остается невыясненным, но, учитывая сходство ее строения со строением Leg5Ac7Ac и полученные генетические данные, можно предположить, что биосинтез 8eLeg5Ac7Ac протекает по сходному пути, показанному на схеме 3. В дальнейшем этот путь должен получить биохимическое подтверждение.

В генных кластерах всех О-антигенов, содержащих L-FucNAm, как изученных в настоящей работе (Е. coli 0108, 0145, 0151, S. enterica 047 и 048), так и содержащихся в базе данных, присутствует одинаковый оперон, включающий ген гликозилтрансферазы wbuB, переносящий FucNAm на остаток GIcNAc с образованием общего фрагмента a-L-FucpNAm-(1 —>3)-D-GlcpNAc, три гена пути синтеза FucNAc fnlABC, ген аминотрансферазы WbuX, которая превращает N-ацетильную группу в N-ацетимидоильную, два гена, имеющие высокую степень гомологии с генами hisF и hisH, а также ген wbuC с неизвестной функцией (рис. 3). Гены hisY и hisH кодируют белки, один из которых высвобождает аммиак из глутамата, а второй транспортирует его по внутримолекулярному каналу. Их предположительная функция - обеспечение синтеза N-ацетимидоильной группы при отсутствии или недостаточном содержании аммиака в окружающей среде. Остальные гены кластеров специфичны для различных структур О-антигенов, что указывает на образование новых генных кластеров по пути горизонтального переноса оперона FucNAm от бактерии, где он сформировался впервые, к другим бактериям.

но

но

0rf1

AcNH

OUDP

II,0

AcNH

Orf2

OUDP l-GIu а-кетоглутарат

H,N

AcNH

0rf5

OUDP Ac-CoA CoA

AcNH

Orf3

OUDP

Orf6

OUDP H)0

UDP

Orf4

OH

ФЕП

CH

OH

OH

CO,H

Orf8

CTP

PI';

CH

OH

Схема 3. Предполагаемый путь биосинтеза 8eLeg5Ac7Ac и ее нуклеотид-активированного производного CMP-8eLeg5Ac7Ac у Е. coli 0108. ФЕП - фосфоенолпируват, Ас-СоА -ацетилкоэнзим А, СМР - цитидинмонофосфат, СТР - цитидинтрифосфат, UDP -уридиндифосфат, P¡, PPj - неорганический фосфат, дифосфат. Orfl-Orf6, OrfB - ферменты, номера которых соответствуют порядковым номерам генов в генном кластере О-антигена.

Генные кластеры структурно родственных О-антигенов Е. coli и S. enterica организованы одинаково (рис. 3), и соответствующие гены обладают высокой степенью гомологии, что свидетельствует о том, что эти кластеры сформировались у эволюционного предшественника этих двух родов бактерий. В большинстве случаев они не претерпели изменений после дивергенции двух родов, а наблюдающиеся небольшие структурные различия между О-антигенами, связанные с О-ацетилированием или боковым гликозилированием, появились за счет приобретения внекластерных генов, кодирующих О-ацетилтрансферазы или гликозилтрансферазы. В одном из рассмотренных случаев (Е. coli 0118, 0151 и S. enterica 047) наблюдается полиморфизм гена полимеразы, возникший в ходе эволюции бактерий. Его результатом является диверсификация структур О-антигенов за счет различия в типе связи между повторяющимися звеньями, определяемом специфичностью полимеразы.

E. coli 0145, S. enterica 048

-»4)-a-Neup5Ac-(2->3)-a-L-FucpNAm-( 1 ->3)-a-D-GlcpNAc-( 1 -> E. coli 0118 и 0151, S. enterica 047

-^2/3)-D-Rib-ol-5-P-(0^6)-a-D-Galp-(1^3)-a-L-FucpNAm-(1^3)-ß-D-GlcpNAc-(1^-

E. coli 0145

Идентичность ДНК % Идентичность белков %

£. coli 0118/0151

Идентичность ДНК % Идентичность белков %

S. enterica 047

Идентичность ДНК % Идентичность белков %

S. enterica 048

Рис. 3. Организация генных кластеров и гомология генов биосинтеза структурно родственных О-антигенов Е. coli и S. enterica. Гомология соответствующих генов Е. coli Ol 18 и Ol51 составляет около 100%. Гены синтеза моносахаридных предшественников, гены гликозилтрансфераз и гены процессинга показаны светло-серым, темно-серым и черным цветом соответственно. Оперон синтеза и переноса L-FucNAm взят в прямоугольную рамку. Вверху показаны базовые структуры О-антигенов, синтезируемые генами, входящими в кластеры.

У всех изученных бактерий гены процессинга wzx и wzy, обнаруженные в генных кластерах О-антигенов и кодирующие полимеразу и флиппазу, соответственно, оказались высокоспецифичными для каждого серотипа Е. coli, что подтверждено ПЦР-тестированием соответствующих праймеров, проведенным китайскими партнерами. Таким образом, на основе этих генов может быть создан высокоспецифичный и высокочувствительный метод ПЦР-диагностики инфекций, вызываемых кишечной палочкой. Гены wzx и wzy и кодируемые ими белки могут служить также молекулярными мишенями для целевой терапии этих заболеваний.

Гены синтеза CMP-Neu5Ac

nnaD ппаВ ппаС ппаА wzx wzy wbuW

Ген синтеза CDP-Rib-ol

rib wzx wdbl wzy wdbJ

Ген синтеза CDP-Rib-ol

Гены синтеза UDP-L-FucNAm

wbuX 82 83

wbuX hisH 80 ; 82 86 ; 83

rib wzx wdbl wzy wdbJ j: wbuX : hisH 88 ; 98 91 : 99

Гены синтеза CMP-Neu5Ac

nnaD ппаВ ппаС nnaA vjzx wzy wbuW

hisF fnIA fnlB tnIC

87 91 91 99

91 92 90 98

hisF Ш MB MC

83 82 78 83

86 94 78 94

hisF Ш MB fnIC

99 99 99 99

99 98 99 99

hisF fnIA MB MC

99 : 97 : : 95;

выводы

1. Установлены новые структуры О-спецнфических полисахаридов (О-антигенов) десяти серогрупп кишечной палочки (Esherichia coli) и одной серогруппы сальмонелл (Salmonella enterica) и уточнены ранее предложенные структуры полисахаридов двух серогрупп Е. coli и одной серогруппы S. enterica. Эти данные вносят существенный вклад в создание химической основы для классификации штаммов энтеробактерий по О-антигенам, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга.

2. В составе изученных полисахаридов обнаружены редко встречающиеся у бактерий моносахариды, такие как нонулозоновые кислоты (нейраминовая, легионаминовая и 8-эпилегионаминовая), гликолактиловая кислота - простой эфир N-ацетилглюкозамина с (5)-молочной кислотой, необычные N-ацильные производные 6-дезоксиаминосахаров и диаминосахар 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Ь-рамноза. Впервые производное 8-эпилегионаминовой кислоты выделено в свободном виде и идентифицировано сравнением с заведомым синтетическим образцом.

3. С использованием данных о строении полисахаридов определены предположительные функции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза исследованных О-антигенов, включая пути синтеза предшественников нонулозоновых кислот. Выявлена генетическая основа родства О-антигенов Е. coli и S. enterica и формирования наблюдающегося разнообразия их структур. Полученные данные могут быть использованы для разработки метода молекулярного типирования клинических и природных изолятов кишечной палочки, а также ПЦР-диагностики и целевой терапии инфекций, вызываемых патогенными штаммами этой бактерии.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Обзор

1. Y. A. Knirel, S. D. Shevelev, A. V. Perepelov / Higher aldulosonic acids: components of bacterial glycans // Mendeleev Commun. 2011, 21, 173-182.

Экспериментальные статьи

2. L. Feng, S. N. Senchenkova, J. Tao, A. S. Shashkov, B. Liu, S. D. Shevelev, P. Reeves, J. Xu, Y. A. Knirel, L. Wang / Structural and genetic characterization of enterohaemorrhagic Escherichia coli 0145 О antigen and development of an 0145 serogroup-specific PCR assay // J. Bacteriol. 2005, 187,758-764.

3. A. V. Perepelov, Q. Wang, S. N. Senchenkova, S. D. Shevelev, G. Zhao, A. S. Shashkov, L. Feng, Y. A. Knirel, L. Wang / Structure of a teichoic-acid like O-polysaccharide of Escherichia coli 029II Carbohydr. Res. 2006, 341, 2176-2180.

4. А. В. Перепелов, Б. Лю, С. Н. Сенченкова, С. Д. Шевелев, В. Ванг, А. С. Шашков, Л. Фенг, Л. Ванг, Ю. А. Книрель. Структура глицерофосфатсодержащего О-специфического поли с ах ар If да Escherich ia coli 0130. Биоорган, химия 2007, 33, 64-68.

5. А. V. Perepelov, W. Han, S. N. Senchenkova, S. D. Shevelev, A. S. Shashkov, L. Feng, Y. Liu, Y. A. Knirel, L. Wang / Structure of the O-polysaccharide of Escherichia coli 0150 containing 2-acetamido-4-0-[(5)-l-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucose // Carbohydr. Res. 2007, 342, 648-652.

6. А. В. Перепелов, К. Ванг, С. Н. Сенченкова, С. Д. Шевелев, А. С. Шашков, Л. Фенг, Ю. А. Книрель, Л. Ванг / Структура и характеристика генного кластера О-антигена Escherichia coli 049, содержащего 4,6-дидезокси-4-[(5)-3-гидроксибутаноиламино]-В-глюкозу // Биохимия 2008, 73, 498-503.

7. Y. A. Knirel, S. N. Senchenkova, A. S. Shashkov, А. V. Perepelov, S. D. Shevelev, В. Liu, L. Feng, L. Wang / First isolation and identification of a derivative of 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxy-"L-glycero-D-galacto-non-l-uXosomc (8-epilegionaminic) ac\AU Adv. Sci. Lett. 2009, 2, 384-387.

8. А. В. Перепелов, Б. Лю, С. Н. Сенченкова, А. С. Шашков, С. Д. Шевелев, Л. Фенг, Л. Ванг, Ю. А. Книрель / Структура О-антигена и характеристика кластера генов биосинтеза О-антигена Escherichia coli 0108, содержащего 5,7-диацетамидо-3,5,7,9-тетрадезокси-Ь-глш1еро-0-галакто-нон-2-упозстовую (8-эпилегионаминовую) кислоту // Биохимия 2010, 75, 27-33.

9. X. Li, А. V. Perepelov, Q. Wang, S. N. Senchenkova, В. Liu, S. D. Shevelev, X. Guo, A. S. Shashkov, W. Chen, L. Wang, Y. A. Knirel / Structural and genetic characterization of the O-antigen of Escherichia coli 0161 containing a derivative of a higher acidic diamino sugar, legionaminic acid// Carbohydr. Res. 2010, 345, 1581-1587.

10. B. Liu, A. V. Perepelov, D. Guo, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, L. Feng, A. S. Shashkov, L. Wang, Y. A. Knirel / Structural and genetic relationships between the O-antigens of Escherichia coli 0118 and 0151 /1FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2010, 60, 199-207.

11. A. V. Perepelov, B. Liu, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, A. S. Shashkov, L. Feng, Y. A. Knirel, L. Wang / Relatedness of the O-polysaccharide structures of Escherichia coli 0123 and Salmonella enterica 058, both containing 4,6-dideoxy-4-{N-(5)-3-hydroxybutanoyl]-D-alanyl}amino-D-glucose; revision of the E. coli 0123 O-polysaccharide structure // Carbohydr. Res. 2010, 345, 825-829.

12. A. V. Perepelov, Z. Ni, Q. Wang, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, A. S. Shashkov, L. Wang, Y. A. Knirel / Structure and gene cluster of the O-antigen of Escherichia coli 0109; chemical and genetic evidences of the presence of L-RhaN3N derivatives in the O-antigens of E. coli 0109 and Ol 19 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2011, 61, 47-53.

Тезисы докладов

13. С. Д. Шевелев, А. В. Перепелов, С. Н. Сенченкова, А. С. Шашков / Структурные исследования липополисахаридов бактерии Escherichia coli - от строения к биосинтезу О-антигенов // I Молодежная конференция ИОХ РАН, Москва, 31 марта-1 апреля 2005 г. Сборник тезисов докладов. М: МАКС Пресс, 2005, с. 136-138.

14. S. D. Shevelev, L. Feng, Q. Wang, В. Liu, L. Wang / Chemical and genetic studies of the O-antigens of Shigella boydii and their relationship to the O-antigens of Escherichia coli II 18th International Symposium on Glycoconjugates, Florence, Italy, 4-9 September 2005. P212.

15. A. V. Perepelov, S. D. Shevelev, S. N. Senchenkova, A. S. Shaskov, Y. A. Knirel, L. Feng, Q. Wang, B. Liu, L. Wang / New structures of the O-antigens of Escherichia coli 029,0130 and 0150 related to Shigella dysenteriae II 13th European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 21-26 August 2005. OP69.

16. S. N. Senchenkova, A. V. Perepelov, S. D. Shevelev, A. S. Shashkov, Y. A. Knirel, B. Liu, L. Feng, L. Wang / The completed Salmonella enterica O-antigen structure elucidation // 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, 19-22 September 2010, Hyytiala, Finland.

17. Ю. А. Книрель, А. В. Перепелов, С. H. Сенченкова, С. Д. Шевелев, А. С. Шашков, Б. Лю, Л. Фенг, Л. Ванг / Структурно-генетическое исследование О-антигенов энтеробактерий // IV Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 14-16 сентября 2011 г. Сборник тезисов докладов, с. 9-10.

18. Y. A. Knirel, А. V. Perepelov, S. N. Senchenkova, S. D. Shevelev, A. S. Shashkov, B. Liu, L. Feng, L. Wang / Structure, genetics and evolution of variation of the O-antigens of closely related enterobacteria Salmonella enterica and Escherichia coli II FASEB Summer Research Conference "Microbial Polysaccharides of Medical, Agricultural and Industrial Importance", Carefree, Arizona, USA, June 5-10,2011.

Заказ № 98-а/11/2012 Подписано в печать 21.11.2012 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:гак@с[г.т

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1.ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Высшие моносахариды - компоненты бактериальных липополисахаридов

2.1. Общая характеристика липополисахаридов грамотрицательных бактерий

2.2. Гептозы и гептулозаровая кислота

2.3. Октулозоновые кислоты

2.4. Нонулозоновые кислоты

2.4.1. N-Ацетилнейраминовая кислота

2.4.2. Производные 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновых кислот

2.4.2.1. Псевдаминовая кислота

2.4.2.2. Легионаминовая кислота

2.4.2.3. 8-Эпилегионаминовая кислота

2.4.2.4. 4-Эпилегионаминовая кислота

2.4.2.5. Биосинтез 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезоксинон-2-улозоновых кислот

2.4.3. Другие нонулозоновые кислоты

2.5. Высшие разветвленные моносахариды

2.6. Биологическое значение высших Сахаров

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Общие подходы к структурному анализу полисахаридов

3.2. О-Антигены, содержащие нонулозоновые кислоты

3.2.1. Установление структуры ОПС Е. coli 0145 и уточнение структуры ОПС

S. eníerica 048, содержащих нейраминовую кислоту

3.2.2. Структура ОПС Е. coli 0161, содержащего легионаминовую кислоту

3.2.3. Структура ОПС Е. coli 0108, содержащего 8-эпилегионаминовую кислоту

3.3. Фосфорилированные О-антигены

3.3.1. Структура ОПС Е. coli 029 и 0130, содержащих фосфат глицерина

3.3.2. Структура ОПС Е. coli 0118 и 0151, содержащих фосфат рибита

3.4. Другие О-антигены

3.4.1. Структура ОПС Е. coli 0150, содержащего 2-ацетамидо-2-дезокси

4-[(£)-1 -карбоксиэтил]-0-глюкозу

3.4.2. Установление структур ОПС Е. coli 049 и S. eníerica 058 и уточнение структуры ОПС Е. coli 0123, содержащих производные 4-амино-4,6-дидезокси-О-глюкозы (4-амино-4-дезокси-Б-хиновозы)

3.4.3. Установление структуры ОПС Е. coli 0109 и уточнение структуры ОПС Е. coli 0119, содержащих производные 2,3-диамино-2,3,6-тридезокси-Ь-маннозы (2,3-Диамино-2,3-Дидезокси-Ь-рамнозы)

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Особенности состава и строения изученных О-антигенов

4.2. Функциональный анализ генных кластеров О-антигенов

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5.1. Бактериальные штаммы и культивирование

5.2. Выделение липополисахаридов

5.3. Получение полисахаридов и олигосахаридов

5.4. Химические методы анализа

5.4.1. Определение состава полисахаридов

5.4.2. Определение абсолютных конфигураций компонентов

5.5. Сольволиз трифторметансульфокислотой

5.6. Распад по Смиту

5.7. Спектроскопия ЯМР

5.8. Масс-спектрометрия 97 ВЫВОДЫ 98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ДПС - О-дезацетилированный полисахарид

ЛПС - липополисахарид

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия

ОПС - О-специфический полисахарид

ОРС, orf - открытая рамка считывания (open reading frame)

ФЕП - фосфоенолпируват

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Abe - 3,6-дидезокси-0-д:сшо-гексоза (абеквоза)

Asc - 3,6-дидезокси-Ь-а/>абшо-гексоза (аскарилоза)

Ас - ацетил

Ас-СоА - ацетилкоэнзим А

Ala - аланил

Am - ацетимидоил

Cm - карбамоил

CMP, СТР - цитидинмонофосфат, цитидинтрифосфат

COSY - корреляционная спектроскопия

DEPT - усиление без искажения путем переноса поляризации (distortionless enhancement by polarization transfer

Fo - формил

Fuc - 6-дезоксигалактоза (фукоза)

FucN - 2-амино-2,6-дидезоксигалактоза (фукозамин)

FucNAc - 2-ацетамидо-2,6-дидезоксигалактоза (N-ацетилфукозамин)

FucNAm - 2-ацетимидоиламино-2,6-дидезоксигалактоза

Fuc3N - 3-амино-3,6-дидезоксигалактоза

Gal - галактоза

GalNAc - 2-ацетамидо-2-дезоксигалактоза (N-ацеталгалактозамин) gHep - и-глицеро-В-галакто-геитоза

Glc - глюкоза

GlcA - глюкуроновая кислота

GlcNAc - 2-ацетамидо-2-дезоксиглюкоза (N-ацетилглюкозамин)

Glc4Slac - 4-[(<S)-1 -карбоксиэтил]глюкоза

Glu - глютамат

Gro - глицерин

Gro-al - глицериновый альдегид

Hep - Ъ-глщеро-О-манно-гептоза

Hep* - D-znuijepo-D-MdHHo-remo3a.

Hb, RUh, 5Hb - 3-гидроксибутаноил, (R)-, (5)-3-гидроксибутаноил

HMBC - гетероядерная мультисвязевая корреляция

HSQC - гетероядерная одноквантовая когеренция

Kdo - 3-дезокси-0-лш////о-окт-2-улозоновая (кетодезоксиоктоновая) кислота

Kdo8N - 8-амино-3,8-дидезокси-0-лш/шо-окт-2-улозоновая

Ко - В-глицеро-В-тало-окт-2-упозоновая (кетооктоновая) кислота lac - 1-карбоксиэтил (остаток молочной кислоты)

Leg - 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-0-г//г/г/еро-В-2алак/ио-нон-2-улозоновая легеонаминовая) кислота

LPSOH - О-дезацилированный ЛПС

Man - манноза

ManNAc - 2-ацетамидо-2-дезоксиманноза (N-ацетилманнозамин)

Neu5Ac - 5-ацетамидо-3,5-дидезокси-В-глыг/е/7о-В-г<атгак-/ио-нон-2-улозоновая

N-ацетилнейраминовая) кислота

NOESY - двумерная спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера

Р, Р! - фосфат, неорганический фосфат

РР, РР, - дифосфат, неорганический дифосфат

Par - 3,6-дидезокси-0-рибо-гексоза (паратоза)

Pse - 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-Е-глиг/еро-Е-л<анно-нон-2-улозоновая псевдаминовая) кислота

QuiNAc - 2-ацетамидо-2,6-дидезоксиглюкоза (N-ацетилхиновозамин)

Qui3N - 3-амино-3,6-дидезоксиглюкоза

Qui4N - 4-амино-4,6-дидезоксиглюкоза

QuiN4N - 2,4-диамино-2,4,6-тридезоксиглюкоза (бациллозамин)

RhaN3N - 2,3-диамино-2,3-Дидезоксирамноза

Rha - 6-дезоксиманноза (рамноза)

Rib-ol - рибит

ROESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат

TOCSY - полная корреляционная спектроскопия

TDP - тимидиндифосфат

ТРР - тиаминдифосфат

Tyv - 3,6-дидезокси-0-арабино-гексоза (тивелоза)

UDP - уридиндифосфат

YerA, YerB - 4-С-[(Я)-, (5)-1-гидроксиэтил]-3,6-дидезокси-Б-к:смло-гексоза (йерсиниза А, В)

Ху1 - ксилоза

4eLeg - 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-В-глмг/е/?о-В-то//о-нон-2-улозоновая

4-эпилегионаминовая) кислота

4НЬ - 4-гидроксибутаноил

6dGul - 6-дезоксигулоза

6dHep - б-дезокси-О-лганно-гептоза

6dTal - 6-дезокситалоза

8eLeg - 5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадезокси-Е-г//г/г/е/»о-В-галакАг20-нон-2-улозоновая (8-эпилегионаминовая) кислота

Настоящая работа посвящена изучению строения О-антигенных полисахаридов кишечной палочки, отличающихся необычным составом за счет содержания в них высших нонулозоновых кислот и других редко встречающихся моносахаридов, а также неуглеводных компонентов. Кишечная палочка {Escherichia coli) относится к грамотридательным бактериям семейства Enterobacteriaceae. Она была открыта в 1885 году, и с тех пор интерес к ее исследованию не ослабевает. На сегодняшний день она является одной из наиболее изученных бактерий. Е. coli обычно встречается в нижней части кишечника теплокровных животных. Большинство штаммов не только являются безвредными, но и приносят пользу организму хозяина, предотвращая развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике. В то же время известны вирулентные штаммы этих бактерий, которые могут вызывать гастроэнтериты, воспаления мочеполовой системы и менингит у новорожденных. Наиболее опасны энтерогеморрагические штаммы, вызывающие геморрагические колиты и гемолитический уремический синдром. К ним относятся штаммы серогрупп Е. coli 0157 и 0104, а также исследованный в настоящей работе штамм серогруппы 0145.

Важным компонентом грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), расположенный на внешней мембране клеточной оболочки. Полисахаридная цепь ЛПС определяет специфичность иммунного ответа на инфекцию и, соответственно, она называется О-специфическим полисахаридом (ОПС) или О-антигеном. Серологически отличимые типы микроорганизмов продуцируют ОПС со своей уникальной структурой, что позволяет использовать О-антигены для серотипирования штаммов бактерий и серодиагностики. Интерес к О-антигенам обусловлен также их ролью в патогенезе инфекционных заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными бактериями.

Исследования структуры, биосинтеза и функционирования ЛПС, в том числе О-антигенов, являются актуальной задачей современной биоорганической химии и гликобиологии. Они позволяет решать целый ряд фундаментальных проблем микробиологии и иммунологии, как то: выяснять взаимосвязь между строением и функцией структурных компонентов бактериальной клеточной стенки, устанавливать механизмы иммунного ответа, прослеживать эволюционные пути формирования у микроорганизмов разнообразных антигенных структур. Знание строения О-антигенов имеет большое практическое значение для классификации бактерий, разработки новых диагностических препаратов и искусственных вакцин. Функциональный анализ генов биосинтеза О-антигенов, расположенных в хромосомных генных кластерах, позволяет выявлять уникальные для данного О-серотипа гены, на основе которых создаются современные методы молекулярной диагностики и которые могут служить мишенями для целевой терапии инфекционных заболеваний.

Кишечная палочка отличается большим разнообразием О-антигенных форм, которое сформировалось под постоянным воздействием окружающей среды, включая другие биологические системы, и которое, как предполагают, способствует адаптации бактерий в различных экологических нишах. Штаммы Е. coli объединяются в 186 О-серогрупп, основанных на сероспецифичности О-антигенов, и некоторые из серогрупп разделены на подгруппы. Хотя О-антигены Е. coli были одними из первых объектов структурного исследования среди бактериальных полисахаридов и их строение продолжало интенсивно изучаться на протяжении последних пятидесяти лет, к началу нашей работы были установлены структуры лишь немногим более половины всех известных О-антигенных форм.

Целью данной работы было установление строения ОПС десяти ранее неисследованных О-серогрупп кишечной палочки (Е. coli 029, 049, 0108, 0109, 0118, 0130, 0145, 0150, 0151 и 0161). В ходе исследования было обнаружено, что ранее структуры ОПС двух других серогрупп (Е. coli 0119 и 0123) были определены с ошибками, и эти структуры были уточнены в настоящей работе. Кроме того, было найдено, что О-антигены некоторых изученных нами серогрупп (Е. coli 0118, 0123, 0145, 0151) структурно близкородственны О-антигенам других важных энтеробактерий - возбудителей сальмонеллёза (Salmonella enterica), было установлено строение одного из них (S. enterica 058) и уточнена структура другого (S. enterica 048).

Объекты данного исследования были выбраны на основании предварительного генетического исследования, которое позволило предположить наличие редких компонентов в составе ОПС вышеперечисленных серогрупп. Сделанное предположение подтвердилось в ходе дальнейшего структурного анализа выбранных ОПС; в частности, в составе трех из них были обнаружены и идентифицированы производные редко встречающихся в бактериальных углеводах высших Сахаров, относящихся к классу нонулозоновых кислот. Это определило выбор темы литературного обзора настоящей диссертации. В других ОПС были обнаружены такие компоненты, как простой эфир моносахарида с молочной кислотой - гликолактиловая кислота, 6-дезоксиаминосахара с необычными N-ацнльными заместителями, 6-дезоксидиаминосахар, фосфаты глицерина и рибита.

Установление строения ОПС необычного состава вызывает особый интерес, в частности, в связи с существенным вкладом редких моносахаридов в иммуноспецифичность бактерий, что важно для создания их серологических классификационных схем. Однако оно является трудной задачей, для решения которой потребовалось применение как классических методов структурной химии углеводов, таких как мягкий кислотный гидролиз ЛПС, полный кислотный гидролиз ОПС, ГЖХ-анализ летучих производных моносахаридов, распад по Смиту, так и нетрадиционные химические подходы (сольволиз ОПС, мягкий щелочной гидролиз ЛПС), а также новейшие методы, основанные на различных методиках двумерной спектроскопии ЯМР.

Еще одной целыо работы было определение функций генов биосинтеза изученных О-антигенов путем анализа секвенированных генных кластеров с учетом полученных структурных данных. Исследование генных кластеров О-антигенов, содержащих необычные моносахаридные и неуглеводные компоненты, позволило сделать предположения о происхождении сходных антигенных структур в различных группах бактерий и тем самым пролить свет на их эволюционную историю. Эта часть работы была выполнена совместно с китайскими партнерами - генетиками из лаборатории функциональной геномики микробов Колледжа ТЕДА Нанкайского университета (г. Тянь-дзинь, КНР).

Результаты, полученные в ходе выполнения настоящего исследования, имеют практическое значение. Данные о структуре О-антигенов представляют собой молекулярную основу серологической классификации штаммов кишечной палочки, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга. Данные функционального анализа генов биосинтеза О-антигенов могут быть использованы для разработки методов молекулярного типирования природных и клинических изолятов Е. coli, а также диагностики и целевой терапии вызываемых ими инфекций.

Результаты диссертационной работы опубликованы в 12 статьях, включая один обзор, в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК [1-12]. Они были представлены на двух российских и четырех международных конференциях: I Молодежная конференция ИОХ РАН, Москва, 2005 г.; 18th International Symposium on Glycoconjugates, Florence, Italy, 2005; 13th European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 2005; 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Hyytiälä, Finland, 2010; IV Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2011 г.; FASEB Summer Research Conference Microbial Polysaccharides of Medical, Agriculiural and Industriell Importance, Carefree, Arizona, USA, 2011.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания результатов, их обсуждения, экспериментальной части и выводов, а также включает список сокращений и список литературы. Литературный обзор посвящен высшим моносахаридам - компонентам ЛПС. В нем также дается общая характеристика ЛПС грамотрицательных бактерий. В главах «Результаты» и «Обсуждение результатов» описано установление строения ОПС кишечной палочки и использование полученных данных для функционального анализа генных кластеров О-антигенов, обсуждаются особенности состава изученных полисахаридов, фундаментальное и практическое значение выполненной работы. В главе «Экспериментальная часть» собраны методики выделения полисахаридов, их химического анализа, модификации и избирательного расщепления, проведения ЯМР-спектроскопнческих и масс-спектрометрических экспериментов.

выводы

1. Установлены новые структуры О-специфических полисахаридов (О-антигенов) десяти серогрупп кишечной палочки (Esherichia coli) и одной серогруппы сальмонелл {Salmonella enterica) и уточнены ранее предложенные структуры полисахаридов двух серогрупп Е. coli и одной серогруппы S. enterica. Эти данные вносят существенный вклад в создание химической основы для классификации штаммов энтеробактерий по О-антигенам, необходимой для серодиагностики и эпидемиологического мониторинга.

2. В составе изученных полисахаридов обнаружены редко встречающиеся у бактерий моносахариды, такие как нонулозоновые кислоты (нейраминовая, легионаминовая и 8-эпилегионаминовая), гликолактиловая кислота - простой эфир N-ацетилглюкозамина с (5)-молочной кислотой, необычные N-ацильные производные 6-дезоксиаминосахаров и диаминосахар 2,3-диамино-2,3-дидезокси-Ь-рамноза. Впервые производное 8-эпилегионаминовой кислоты выделено в свободном виде и идентифицировано сравнением с заведомым синтетическим образцом.

3. С использованием данных о строении полисахаридов определены предположительные функции генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза исследованных О-антигенов, включая пути синтеза предшественников нонулозоновых кислот. Выявлена генетическая основа родства О-антигенов Е. coli и S. enterica и формирования наблюдающегося разнообразия их структур. Полученные данные могут быть использованы для разработки метода молекулярного типирования клинических и природных изолятов кишечной палочки, а также ПЦР-диагностики и целевой терапии инфекций, вызываемых патогенными штаммами этой бактерии.

1. Perepelov A.V., Wang Q., Senchenkova S.N., Shevelcv S.D., Zhao G., Shashkov A.S., Feng L., Knirel Y.A., Wang L. Structure of a teichoic-acid like O-polysaccharide of Escherichia coli 029 // Carbohydr Res 2006, 341, 2176-2180.

2. Перепелов A.B., Вонг К., Сенченкова C.H., Шевелев С.Д., Шашков A.C. и др. Структура и характеристика генного кластера О-антигена Escherichia coli 049, содержащего 4,6-дидезокси-4-(5')-3-гидроксибутаноиламино.-0-гл10козу // Биохимия 2008, 73, 498-503.

3. Liu В., Perepelov A.V., Guo D., Shevelev S.D., Senchenkova S.N., Feng L., Shashkov A.S., Wang L., Knirel Y.A. Structural and genetic relationships between the O-antigens of Escherichia coli 0118 and 0151 // FEMS Immunol Med Microbiol 2010,60,199-207.

4. Перепелов A.B., Лыо Б., Сенченкова C.Ii., Шевелев С.Д., Вонг В., Шашков A.C., Фенг Л., Вонг Л., Книрель Ю.А. Структура глицерофосфат-содержащего О-специфического полисахарида Escherichia coli Ol30II Биоорган химия 2007, 33, 57-60.

5. Knirel Y.A., Shevelev S.D., Perepelov A.V. Higher aldulosonic acids: components of bacterial glycans // Mendeleev Commun 2011,21,173-186.

6. Hoist 0. Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides // Endotoxin in Health and Disease (Hoist O., Brade IL, Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C., eds), Marcel Dekker, New York, 1999. P. 115-154.

7. Knirel Y.A., Shashkov A.S., Tsvetkov Y.E., Jansson P-E, Zähringer U. 5,7-Diamino-3,5,7,9-tetradeoxynon-2-uIosonic acids in bacterial glycopolymers: chemistry and biochemistry // Adv Carbohydr Chem Biochem 2003, 58, 371-417.

8. Kosma P. Occurrence, synthesis and biosynthesis of bacterial heptoses // Curr Org Chem 2008, 12, 1021-1039.

9. Angata T., Varki A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: an evolutionary perspective // Chem Rev 2002, 102,439-469.

10. Edebrink P., Jansson P.-E., Bogwald J., Hoffman J. Structural studies of the Vibrio salmonicida lipopolysaccharide // Carbohydr Res 1996, 287,225-245.

11. Vinogradov E.V., Sidorczyk Z. The structure of the carbohydrate backbone of the rough type lipopolysaccharides from Proteuspenneri strains 12, 13, 37 and 44 // Carbohydr Res 2002, 337, 775-777.

12. Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Jimenez N., Merino S., Tomas J.M. Structural studies on the R-type lipopolysaccharide of Aeromonas hydrophila II Carbohydr Res 2004, 339, 787-793.

13. Altman E., Chandan V., Li J., Vinogradov E.V. Lipopolysaccharide structures of Helicobacter pylori wild-type strain 26695 and 26695 IIP0826::Kan mutant devoid of the O-chain polysaccharide component // Carbohydrate Res 2011, 346,2437-2444.

14. Vinion-Dubiel A.D., Goldberg J.B. Lipopolysaccharide of Burkholderia cepacia complex // J Endotoxin Res 2003,9,201-213.

15. De Castro C., Sturiale L., Parrilli M. Characterisation of the a-(l->3) homopolymer of L-glycero-D-manno-heptose units isolated from the O-chain polysaccharide of Agrobacteriwn radiobacter H Eur J Org Chem 2004, 2436-2440.

16. Ansari A.A., Kenne L., Lindberg B.5 Gustafsson B., Holme T. Structural studies of the O-antigen from Vibrio cholerae 0:21 // Carbohydr Res 1986,150,213-219.

17. Chowdhury T.A., Jansson P-E., Lindberg B., Gustavsson B., Holme T. Structural studies of the Vibrio cholerae 0:3 O-antigen polysaccharide // Carbohydr Res 1991,215, 303-314.

18. Kondakova A.N., Sevillano A.M., Shaikhutdinova R.Z., et al. Revision of the O-polysaccharide structure of Yersinia pseudotuberculosis 0:1a, confirmation of the function of WbyM as paratosyltransferase // Carbohydr Res 2012, 350, 98-102.

19. Kondakova A.N., Ho N., Bystrova O.V., et al. Structural studies of the O-antigens of Yersinia pseudotuberculosis 0:2a and mutants thereof with impaired 6-deoxy-D-waw?o-heptose biosynthesis pathway // Carbohydr Res 2008, 343,1383-1389.

20. Kondakova A.N., Bystrova O.V., Shaikhutdinova R.Z., et al. Structure of the O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis 0:4a revised // Carbohydr Res 2009,344, 531-534.

21. Feng L., Senchenkova S.N., Yang J., et al. Structural and genetic characterization of the Shigella boydii type 13 O-antigen // J Bacteriol 2004, 186, 4510-4519.

22. Vinogradov E.V., Brade H., Hoist O. The structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide from Chromobacterium violaceum NCTC 9694 // Carbohydr Res 1994, 264, 313-317.

23. Russa R., Urbanik-Sypniewska T., Shashkov A.S., et al. Partial structure of lipopolysaccharides isolated from Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 24 and its GalAnegative exo" mutant AR20 // Syst Appl Microbiol 1996, 19,1-8.

24. Banaszek A. Synthesis of the unique trisaccharide repeating unit, isolated from lipopolysaccharides Rhizobium leguminosarum bv trifolii 24, and its analogs // Carbohydr Res 1998, 306,379-385.

25. Unger F.M. The chemistry and biological significance of 3-deoxy-D-w£/wjo-2-octuIosonic acid (KDO) // Adv Carbohydr Chem Biochem 1981, 38, 323-388.

26. Rund S., Lindner B., Brade H., Hoist O. Structural analysis of the lipopolysaccharide from Chlamydia trachomatis serotype L2 II J Biol Chem 1999, 274,16819-16824.

27. Knirel Y.A., Lindner B., Vinogradov E.V., et al. Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis II Biochemistry 2005,44, 1731-1743.

28. Vinogradov E.V., Müller-Loennies S., Petersen B.O., et al. Structural investigation of the lipopolysaccharide from Acinetobacter haemolyticus strain NCTC 10305 (ATCC 17906, DNA group 4) // Eur JBiochem 1997, 247, 82-90.

29. Vinogradov E.V., Korenevsky A., Beveridge T.J. The structure of the core region of the lipopolysaccharide from Shewanella algae BrY, containing 8-amino-3,8-dideoxy-D-»zawzo-oct-2-ulosonic acid // Carbohydr Res 2004, 339, 737-740.

30. Muldoon J., Perepelov A.V., Shashkov A.S., et al. Structure of an acidic polysaccharide from the marine bacterium Pseudoalteromonas jlavipulchra NCIMB 2033T II Carbohydr Res 2003, 338,459-462.

31. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Torzewska A., et al. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 036 containing 3-deoxy-D-/»a««o-oct-2-ulosonic acid // Carbohydr Res 2007, 342, 665-670.

32. Shashkov A.S., Arbatsky N.P., Knirel Y.A. Structures and genetics of Kdo-containing O-antigens of Cronobacter sakazakii G706 and G2704, the reference strains of serotypes 05 and 06 // Carbohydr Res 2011, 346,1924-1929.

33. MacLean L.L., Vinogradov E.V., Pagotto F., Perry M.B. Structure of the O-antigen polysaccharide present in the lipopolysaccharide of Cronobacter dublinensis (subspecies lactaridi or lausannensis) HPB 3169 // Can J Microbiol 2012, 58, 540-546.

34. MacLean L.L., Vinogradov E.V., Pagotto F., Farber J.M., Perry M.B. Characterization of the O-antigen in the lipopolysaccharide of Cronobacter (Enterobacter) malonaticus 3267 // Biochem Cell Biol 2009, 87, 927-932.

35. Knirel Y.A. O-Specific polysaccharides of Gram-negative bacteria // Microbial Glycobiology: Structures, Relevance and Applications (Moran A., Brennan P., Hoist O., Von Itzstein M., eds), Elsevier, Amsterdam, 2009. P. 57-73.

36. Hoist O. Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharide phosphates // Bacterial Toxins. Methods and Protocols (Hoist O., ed), Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2000. P. 345-353.

37. Cipolla L., Gabrielli L., Bini D., Russo L., Shaikh N. Kdo: a critical monosaccharide for bacteria viability II Nat Prod Rep 2010,27,1618-1629.

38. Stead C., Tran A., Ferguson D., et al. A novel 3-deoxy-D-wtfWzo-oetulosonic acid (Kdo) hydrolase that removes the outer Kdo sugar of Helicobacter pylori lipopolysaccharide // JBacteriol 2005, 187, 3374-3383.

39. Chung H.S., Raetz C.R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide // Proc Natl Acad Sci USA 2011, 108, 510-515.

40. Klenk E. Neuraminic acid, the cleavage product of a new brain lipoid // Physiol Chem 1941, 268, 50-58.

41. Gamian A., Jones C., Lipinski T., Korzeniowska-Kowal A., Ravenscroft N. Structure of the sialic acid-containing O-specific polysaccharide from Salmonella enterica serovar Toucra 048 lipopolysaccharide // Eur J Biochem 2000, 267, 3160-3166.

42. Stenutz R., Weintraub A., Widmalm G. The structures of Escherichia coli O-polysaccharide antigens // FEMS Microbiol Rev 2006, 30, 382-403.

43. Vinogradov E.V., Hoist O., Thomas-Oates J.E., Broady K.W., Brade H. The structure of the O-antigenic polysaccharide from lipopolysaccharide of Vibrio cholerae strain Hll (non-Ol) // Eur J Biochem 1992,210,491-498.

44. Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Nazarenko E.L., et al. Structure of the acidic polysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Shewanella alga 48055 // Carbohydr Res 1998,309,103-108.

45. Hood D.W., Randle G., Cox A.D., et al. Biosynthesis of cryptic lipopolysaccharide glycoforms in Haemophilus influenzae involves a mechanism similar to that required for O-antigen synthesis H JBacteriol 2004,186,7429-7439.

46. Inoue S., Kitajima K. KDN (deaminated neuraminic acid): dreamful past and exciting future of the newest member of the sialic acid family // Glycoconj J2006,23,277-290.

47. Knirel Y.A., Kocharova N.A., Shashkov A.S., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Klebsiella ozaenae serotype K4 containing 3-deoxy-D-glycero-D-galacto-non\x\osornc acid // CarbohydrRes 1989, 188, 145-155.

48. Тульская E.M., Шашков A.C., Стрешинская Г.М., Сенченкова С.Н., Потехина Н.В., Козлова Ю.И., Евтушенко Л.И. Тейхуроновые и тейхулозоновые кислоты актиномицетов И Биохимия 2011, 76, 904-913.

49. Knirel Y.A., Vinogradov E.V., L'vov V.L., et al. Sialic acids of a new type from the lipopolysaccharides of Pseudomonas aeruginosa and Shigella boydii II Carbohydr Res 1984, 133,5-8.

50. Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Shashkov A.S., et al. Identification of 5-acetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-7-(i?)-3-hydroxybutyramido.-L-g(y£;ero-L-/Hüf/2rto-nonulosonic acid as a component of bacterial polysaccharides // Carbohydr Res 1985,141,1-3.

51. Staaf M., Weintraub A., Widmalm G. Structure determination of the O-antigenic polysaccharide from the enteroinvasive Escherichia coli 0136 // Eur J Biochem 1999, 263, 656-661.

52. Perepelov A.V., Shashkov A.S., Tomshich S.V., et al. A pseudoaminic acid-containing O-specific polysaccharide from a marine bacterium Cellulophaga fucicola II Carbohydr Res 2007, 342,1378-1381.

53. Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Shashkov A.S., et al. Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa. The structure of O-specific polysaccharide chains of P. aeruginosa OlO (Lanyi) lipopolysaccharides // Eur J Biochem 1986, 157, 129-138.

54. Львов В.JI., Шашков А.С., Дмитриев Б.А. Антигенные полисахариды бактерий. Структура повторяющегося звена специфического полисахарида Shigella boydii 7 II Биоорган химия 1987, 13, 223-233.

55. Kenne L., Lindberg В., Schweda Е., et al. Structural studies of the O-antigen from Vibrio cholerae 0:2 // Carbohydr Res 1988,180,285-294.

56. Назаренко Е.Л., Шашков A.C., Книрель Ю.А., Иванова Е.П., Оводов Ю.С. Необычные кислые моносахариды компоненты О-специфических полисахаридов бактерий рода Vibrio II Биоорган химия 1990, 16, 1426-1429.

57. Sun Y., Arbatsky N.P., Wang М., et al. Structure and genetics of the O-antigen of Cronobacter Uiricensis G3882 from a new serotype, C. turicensis 02, and identification of a serotype-specific gene II FEMS Immunol Med Microbiol 2012,66, 323-333.

58. Hashii N., Isshiki Y., Iguchi Т., Kondo S. Structural characterization of the carbohydrate backbone of the lipopolysaccharide of Vibrio parahaemolyticus O-untypeable strain KX-V212 isolated from a patient // Carbohydr Res 2003, 338, 2711-2719.

59. Haseley S.R., Wilkinson S.G. Structural studies of the putative O-specific polysaccharide of Acinetobacter baumannii 024 containing 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxy-L-g/ycero-D-gfl/ac/o-nonulosonic acid II Eur JBiochem 1,997,250, 617-623.

60. Knirel Y.A., Rietschel E.T., Marre R., Ziihringer U. The structure of the O-specific chain of Legionella pneumophila serogroup 1 lipopolysaccharide 11 Ear J Biochem 1994, 221,239-245.

61. Knirel,Y. A., Iielbig J. H., Ziihringer U., et al. Structure of a decasaccharide isolated by mild acid degradation and dephosphorylation of the lipopolysaccharide of Pseudomonas fluorescens strain ATCC 49271 // Carbohydr Res 1996, 283, 129-139.

62. Hashii N., Isshiki Y., Iguchi Т., Kondo S. Structural analysis of the carbohydrate backbone of Vibrio parahaemolyticus 02 lipopolysaccharides // Carbohydr Res 2003, 338, 1063-1071.

63. D-ga/ac/o-non-2-ulosonic (di-iV-acetyI-8-epilegionaminic) acid II J Carbohydr Chem 2009, 28, 463-472.

64. Shashkov A.S., Kocharova N.A., Zatonsky G.V., et al. Structure of the O-antigen of Providencia stuartii 020, a new polysaccharide containing 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-L-glycero-D-galacto-non-2-u\osomc acid // Carbohydr Res 2007,342,653-658.

65. Beynon L.M., Richards J.C., Perry M.B., The structure of the lipopolysaccharide O-antigen from Yersinia ruckerii serotype 01 // Carbohydr Res 1994,256,303-317.

66. Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., et al. The structure of the O-specific polysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Salmonella arizonae 061 // Carbohydr Res 1992, 231, 1-11.

67. Kilcoyne M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., et al. Structural investigation of the O-specific polysaccharides of Morganella morganii consisting of two higher sugars // Carbohydr Res 2002, 337,1697-1702.

68. Shashkov A.S., Torgov V.l., Nazarenko E.L., et al. Structure of the phenol-soluble polysaccharide from Shewanella putrefaciens strain A6 // Carbohydr Res 2002, 337, 1119-1127.

69. Назаренко E.JI., Перепелов A.B., Шевченков Л.С. и др. Структура О-специфического полисахарида Shewanella japónica КММ 3601, содержащего 5,7-диадетамидо-3,5,7,9-тетрадезокси-О-глм/ер0-О-»/а//о-нон-2-улозоновую кислоту // Биохимия 2011, 76, 969-975.

70. Tsvetkov Y.E., Shashkov A.S., Knirel Y.A., et al. Synthesis and identification in bacterial lipopolysaccharides of 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-D-g/^cero-D-ga/ac/o- and D-g/ycero-D-ta/o-nonuIosonic acids // Carbohydr Res 2001, 331, 233-237.

71. Knirel Y.A., Kochetkov N.K. 2,3-Diamino-2,3-dideoxyuronic and 5,7-diamino-3,5,7,9-tetradeoxynonulosonic acids: new components of bacterial polysaccharides // FEMS Microbiol. Rev 1987,46,381-384.

72. Chou W.K., Dick S., Wakarchuk W.W. Identification and characterization of NeuB3 from Campylobacter jejuni as a pseudaminic acid synthase H J Biol Chem 2005, 280, 35922-35928.

73. Schoenhofen I.C., Vinogradov E., Whitfield D.M., et al. The CMP-legionaminic acid pathway in Campylobacter, biosynthesis involving novel GDP-linked precursors // Glycobiology 2009, 19,715-725.

74. Glaze P.A., Watson D.C., Young N.M., Tanner M.E. Biosynthesis of CMP-N,N'-diacetyllegionaminic acid from UDP-N,N'-diacetylbacillosamine in Legionella pneumophila II Biochenistry 2008,47, 3272-3282.

75. Thibault P., Logan S.M., Kelly J.F., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin II J Biol Chem 2001,276,34862-34870.

76. Lewis A.L., Desa N., Hansen E.E., et al. Innovations in host and microbial sialic acid biosynthesis revealed by phylogenomic prediction of nonulosonic acid structure // Proc Natl Acad Sei USA 2009,106,13552-13557.

77. Vinogradov E., MacLean L.L., Crump E.M., et al. Structure of the polysaccharide chain of the lipopolysaccharide from Flexibacter maritimus H EurJBiochem 2003, 270,1810-1815.

78. Corsaro M.M., Evidente A., Lanzetta R., et al. 5,7-Diamino-5,7,9-trideoxynon-2-ulosonic acid: a novel sugar from a phytopathogenic Pseudomonas lipopolysaccharide // Carbohydr Res 2002, 337, 955-959.

79. Kocharova N.A., Knirel Y.A., Widmalm G., et al. Structure of an atypical O-antigen polysaccharide of Helicobacter pylori containing a novel monosaccharide 3-C-methyl-D-mannose // Biochemistry 2000,39,4755-4760.

80. Zdorovenko E.L., Valueva O.A., Kachala V.V., et al. Structure of the O-polysaccharide of Azorhizobium caulinodans HAMBI 216, identification of 3-C-methyl-D-rhamnose as a component of bacterial polysaccharides 11 Carbohydr Res 2012, 358,106-109.

81. Toman R., Skultety L., Ftacek P., Hricovini M. NMR study of virenose and dihydroxystreptose isolated from Coxiella burnetii phase I lipopolysaccharide // Carbohydr Res 1998, 306, 291-296.

82. Грошкова Р.П., Зубков B.A., Исаков В.В., Оводов Ю.С. Структурные особенности О-специфического полисахарида из липополисахарида Yersinia pseudotuberculosis VI II Биоорган химия 1983,9,1068-1073

83. Грошкова Р.П., Зубков В.А., Исаков В.В., Оводов Ю.С., Новый разветвленный сахар из липополисахарида Yersinia enterocolitis 0:4,32 II Биоорган химия 1987, 13, 1146-1147.

84. Sonesson A, Jantzen E. The branched-chain octose yersiniose A is a lipopolysaccharide constituent of Legionella micdadei and Legionella maceachernii И J Microbiol Methods 1992, 15, 241-248.

85. Грошкова Р.П., Исаков B.B., Зубков В.А., Оводов Ю.С. Структура О-специфического полисахарида из липополисахарида Yersinia bercovieri 0:10 Н Биоорган химия 1994, 20, 1231-1235.

86. Грошкова Р.П., Исаков В.В., Зубков В.А., Оводов Ю.С. Структура О-специфического полисахарида из липополисахарида Yersinia frederiksenii 0:16,29 II Биоорган химия 1989, 15,1627-1633.

87. Mattos К.A., Todeschini A.R., Heise N., et al. Nitrogen-fixing bacterium Burkholderia brasiliensis produces a novel yersiniose A-containing 0-polysaccharide // Glycobiology 2005, 15,313-321.

88. Zubkov V.A., Gorshkova R.P., Ovodov Y.S., et al. Synthesis of 3,6-dideoxy-4-C-(4I-hydroxyethyl)hexopyranoses (yersinioses) from 1,6-anhydro-ß-D-glycopyranose // Carbohydr Res 1992,225, 189-207.

89. Сенченкова C.H., Шашков A.C., Книрель Ю.А. и др. Структура О-полисахарида Envinia carotovora ssp. atroseptica GSPB 9205, содержащего новый высший разветвленный моносахарид. ИзвАНСерхим 2005,1276-1281.

90. De Castro С., Lanzetta R., Molinaro A., et al. Acetyl substitution of the O-specific polysaccharide caryophyllan from the phenol phase of Pseudomonas (Burkholderia) caryophylli И Carbohydr Res 2001, 335,205-211.

91. Molinaro A., De Castro C., Petersen B.O., et al. Acetyl substitution of the O-specific caryan from the lipopolysaccharide of Pseudomonas (Burkholderia) caryophylli leads to a block pattern // Angew Chem Int £¿/2000, 39, 156-160.

92. Adinolfi M., Corsaro M.M., De Castro C., et al. The relative and absolute configurations of stereocenters in caryophyllose // Carbohydr Res 1995,274,223-232.

93. Adinolfi M., Corsaro M.M., De Castro C., et al. Caryose: a carbocyclic monosaccharide from Pseudomonas caryophylli II Carbohydr Res 1996, 284, 111-118.

94. Filippov A.A., Sergueev K.V., He Y., et al. Bacteriophage-resistant mutants in Yersiniapestis: identification of phage receptors and attenuation for mice // PLoS One 2011,6, e25486.

95. Yuki N. Human gangliosides and bacterial lipo-oligosaccharides in the development of autoimmune neuropathies // Functional Glycomics (Li J., ed), Humana Press, 2010. P. 51-65.

96. Länyi В., Vörös S., Adam M.M. Serological relationship between Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae. II. Relationship of Pseudomonas aeruginosa О antigens to Escherichia,

97. Shigella, Proteus, Morganella, Rettgerella and Providencia II Acta Microbiol Acad Sci Hung 1973, 20, 249-254.

98. Helbig J.H., Luck P.C., Knirel Y.A., Zahringer U. Molecular characterization of a virulence-associated epitope on the lipopolysaccharide of Legionella pneumophila serogroup 1 // Epidemiol Infect 1995, 115, 71-78

99. Zahringer U., Knirel Y.A., Lindner В., et al. The lipopolysaccharide of Legionella pneumophila serogroup 1 (strain Philadelphia 1): chemical structure and biological significance 11 Prog Clin Biol Res 1995, 392,113-139.

100. Шашков A.C., Усов А.И., Книрель Ю.А., Дмитриев Б.А., Кочетков Н.К. Определениеабсолютной и аномерной конфигурации сахарных остатков олиго- и полисахаридов с11использованием эффектов гликозилирования в С ЯМР спектрах // Биооргап хгшия 1981,7,1364-1371.

101. Shashkov A.S., Lipkind G.M., Knirel Y.A., Kochetkov N.K. Stereochemical factors determining the effects of glycosylation on the 13C chemical shifts in carbohydrates // Magn Reson Chem 1988,26,735-747.

102. Knirel Y.A., Perepelov A.V. Trifluoromethanesulfonic acid: a useful reagent for the solvolytic cleavage of glycosidic linkages in structural analysis of bacterial polysaccharides // Aust J Chem 2002, 55, 69-72.

103. Altona C., Haasnoot C.A.G. Prediction of anti and gauche vicinal proton-proton coupling constants in carbohydrates: a simple additivity rule for pyranose rings // Org Magn Reson 1980, 13,417-429.1 "i

104. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computerassisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-NMR data // Carbohydr Res 1988,175, 59-75.

105. Rundlof Т., Widmalm G. A method for determination of the absolute configuration of chiral glycerol residues in natural products using TEMPO oxidation and characterization of the glyceric acids formed // Anal Biochem 1996, 243, 228-233.

106. Nomenclature of carbohydrates // Carbohydr Res 1997,297, 1-92.

107. Перепелов А.В., Вонг К., Сенченкова С.Н. и др. Структура О-антигена и характеристика О-антигенного генного кластера Salmonella enterica 047, содержащего фосфат рибита и 2-ацетимидоиламино-2,6-дидезокси-Ь-галактозу // Биохгтия 2009,74, 515-521.

108. Knirel Y.A., Paramonov N.A., Vinogradov E.V., et al. 2-Acetamido-4-0-(S)-l-carboxyethyl.-2-deoxy-D-glucose, a new natural isomer of N-acetylmuramic acid from the O-specific polysaccharide of Proteus penneri 35 // Carbohydr Res 1994, 259,1-3.

109. Clark C.G., Kropinski A.M., Parolis H., et al. Escherichia coli 0123 О antigen genes and polysaccharide structure are conserved in some Salmonella enterica serogroups // J Med Microbiol 2009, 58, 884-894.

110. Knirel Y.A., Paramonov N.A., Shashkov A.S, et al. Structure of the polysaccharide chains of Pseudomonas pseudomallei lipopolysaccharides // Carbohydr Res 1992, 233, 185-93.

111. Arbatsky N.P., Shashkov A.S., Toukach F.V., et al. Structure of the O-specific polysaccharide of a serologically separate strain Proteus penneri 2 from a new proposed serogroup 066 // Eur JBiochem 1999, 261, 392-397.

112. Anderson A.N., Richards J.C., Perry M.B. Structure of the O-antigen of Escherichia coli 0119 lipopolysaccharide // Carbohydr Res 1992,237,249-262.

113. Rundlof Т., Weintraub A., Widmalm G., Structural studies of the enterovasive Escherichia coli (EIEC) 028 O-antigenic polysaccharide // Carbohydr Res 1996,291, 127-139.

114. Кондакова A.H, Линднер Б, Фудала P. и др. Новые структуры О-специфических полисахаридов Proteus. Часть 4. Полисахариды, содержащие необычные кислые N-ацильные производные 4-амино-4,6-дидезокси-Б-глюкозы // Биохгтия 2004, 69, 1271-1282.

115. Robbins P.W., Uchida Т. Studies on the chemical basis of the phage conversion of O-antigens in the E-group Salmonella II Biochemistry 1962,1, 323-335.

116. Westphal O, Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Methods Carbohydr Chem 1965, 5, 83-91.

117. Sawardeker J.S., Sloneker J.H., Jeanes A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromatography II Anal Chem 1965, 37,1602-1603.

118. Arbatsky N.P., Wang M., Shashkov A.S., Chizhov A.O., Feng L., Knirel Y.A., Wang L. Structure of the O-antigen of Cronobacter sakazakii serotype 02 with a randomly O-acetylated L-rhamnose residue // Carbohydr Res 2010, 345,2090-2094.

119. Leontein K., Lindberg B., Lônngren J. Assignment of absolute configuration of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols // Carbohydr Res 1978, 62, 359-362.

120. Leontein K., Lônngren J. Determination of the absolute configuration of sugars by gas-liquid chromatography of their acetylated 2-octyl glycosides // Methods Carbohydr Chem 1993, 9, 87-89.