Структура О-антигенных полисахаридов бактерий рода PROTEUS тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Виноградов, Евгений Владимирович
АВТОР
|
||||
|
доктора химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1994
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
ргб оа.
- 2 пив ш5
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. Н.Д.ЗЕЛИНСКОГО
На правах, рукописи
ВИНОГРАДОВ Евгений Владимирович
СТРУКТУРА О-АНТИГЕННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА PROTEUS
•02.00.Ю - Биоорганическая химия,-химия природных • -и физиологически активных веществ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва - 1994
Работа выполнена в Институте органической химии им. НД.Зелинского РАН.
Официальные оппоненты: • доктор химических наук, профессор А.И.Усов. доктор химических наук, профессор Ю.А.Берлин, доктор химических чаук, профессор БАДмитриез
Ведущая организация: Институт иммунологии Министерства здравоохранения РФ.
Защита состоится 19января1995 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д002.62.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора химических наук при Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН (117913, Москва, Ленинский проспект, 47, конференц-зал).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН.
Автореферат разослан 16 декабря 1994 года
Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук
ВАПетросян
Актуаяьность проблемы
Липопогисахарид (ЛПС, эндотоксин) является компонентом клеточной оболочки грам-отрицателькых бактерий, к которым относятся многие патогенные для человека микроорганизмы. ЛПС обладает широким спектром биологической активности, в частности антмгенностью, токсичностью и иммуномодуляторной активностью. Его изменчивая структура служит бактериям для приспособления к условиям среды обитания. Постоянно увеличивающееся число вызываемых грам-■ отрицательными б'-ктериями заболеваний и трудности в их лечении делэот исследования ЛПС одним из важнейших направлений науки.
О-Специфмческий полисахарид является частью ' ЛПС и определяет антигенную специфичность бактерий. Исследование структуры О-спзцифических полисахаридов имеет несколько целей: химическое обоснование и корректировка схем серологической классификации бактерий; объяснение на молекулярном уровне специфичности связывания ЛПС с антитела?,«*, что может привести в дальнейшем к созданию лекарственных и диагностических препаратов; объяснение механизмов клеточной адгезии, проникновения бактерий через защитные барьеры организма-хозяина и обеспечения бактерий устойчивости против иммунной системы.
Бактерии рода Proteus условно патогенны для человека и вызывают раневые инфекции, заболевания мочевыводящих путей, 'бгктеремию и другие заболевания. По частоте выделения от пациентов с заболеваниями мочевыводящих путей Р. mirabiiis занимает второе место после £ coli. Чаще всего они колонизируют почки, вызывая острый пиелонефрит и образование камней в почках и мочевом пузыре. Для возникновения такого рода инфекций важное значение имеет способность бактерии закрепиться в поражаемом органе, причем О-специфический полисахарид, видимо, участвует в "адгезии бактерии к тканям организма-хозяина. При проникновении Proteus в кровь возникает септицемия, симгтгомы которой обусловлены взаимодействием ЛПС с иммунной системой.
Различают четыре вида Proteus: Р. mirabiüs, P. vulgaris, P. penneri и P. myxofaciens. Общепринятая серологическая классификация О-антигенов Froteus, известная как схема Кауфмана-Перча, насчитывает 49 О-серогрупп; существует также значительное, количество нетипированных штаммов , в том числе все штаммы P. psrmeri.
К началу работы строение О-специфических полисахаридов Proteus было практически не изучено. Химический состав О-антигенов Р. mirabiüs и Р. vulgaris изучался в последние 30 лет и привел к
частичному установлению мономерного состава ЛПС. S основном состав изучался на целом ЛПС, положение компонентов в полисахаридной части или коре не определялось. Частично были изучены структуры двух О-специфических полисахаридов из нетипированных штаммов P. mirabilis. К настоящему времени опубликованы структуры еще двух полисахаридов, одна из которых совпадает с установленной нами. Цель работы
Целью настоящего исследования было изучение структуры О-специфических полисахаридов Proteus, корректировка, расширение и создание химической основы схемы серотипирования О-антигенов этих бактерий, нахождение корреляции химической структуры О-специфических полисахаридов с серологической специфичностью и патогенностью бактерий, а также выявление иммунодоминантных участков О-антигенов. В'первую очередь изучались штаммы, имеющие наибольшее значение для медицины. Самостоятельной задачей являлось совершенствование методов структурного анализа углеаодов. Научная новизна
В результате работы была установлена структура 18 полисахаридов P. mirabilis, P. vulgaris и P. penneri, в том числе нескольких наиболее патогенных штаммов и штаммов группы ОХ, используемых для диагностики риккетсиозов (тест Вайля-Феликса).
. Идентифицированы новые компоненты . О-антигенов - амиды . аминокислот (алани.:а, серина, треонина, лизина) с уроновыми кислотами (глюкуроновой и галаетуроновой), простые эфиры моносахаридов (глюкозы, глюкозамина) с (R)- и (З)-молочной кислотой, М-(2-гидроксиэтил)-0-аланин.
Полученные в ходе структурных исследований фрагменты полисахаридов и специально синтезированные модельные соединения _ были использованы в серологических экспериментах, позволивших найти иммунодоминантные компоненты антигенов и прояснить их серологические - взаимосвязи. В частности, установлена иммунодоминантная роль амидов аминокислот с уроновыми кислотами и фосфат-связанных заместителей в некоторых антигенах.
Найдено, что вирулентность серотипов Proteus коррелирует с присутствием в составе О-специфического полисахарида заряженных компонентов - уроновых кислот, аминокислот и фосфатных групп.
_ Разработан удобный метод определения последовательности моносахаридов в участках полисахаридов, содержащих амиды уроновых кислот с аминокислотами. Продолжено усовершенствование и
применение метода анализа структуры полисахаридов с помощью компьютерного анализа их ^с ЯМР спектров. Практическая значимость
Полученные данные служат химической основой серологической классификации О-антигенов Proteus. Показано, что все серологически различимые штаммы, в том числе неклассифицированные, продуцируют пс/н'.сзхариды с различной структурой. Неклассифицированные до сих пор штампы, в частнозти штаммы Р.реппел, отобранные на основании полночных данных по структуре О-специфических полисахаридов, должны быть, следовательно, включены в общую схему классификации Proteus как самостоятельные серотипы.
Данные по структуре полисахаридов, используемых в методе Вайля-Феликса диагностики риккетсиозов (перекрестная реакция анти-риккетсиозной сыворотки с клетками Proteus) необходимы для объяснения механизма этого теста.
Полученные данные ЯМР спектров полисахаридов и их фрагментов используются для структурного анализа и вошли в базу данных программы компьютерного анализа структуры углеводов.
Усовершенствованные в ходе исследования методы структурного анализа успешно применяются при изучении полисахаридов. Апробация рзботы
Основные результаты работы были представлены на (II Советско-ШеедсюЛл'симпоз1.(уме по'"химии углеводов (Киев, Т988), конференциях Международного эндотоксинового общества (Сан-Диего, 1S90; Вена, 1992; Хельсинки, 1994), XVI Международном углеводном симпозиуме (Париж, 1932), VII Европейском углеводном симпозиуме (Краков, 1993), 12 Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Краков, 1S33). Публикации
Основной материал изложен в 22 публикациях в отечественных и международных журналах. Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов и экспериментальной части. Работа излокена на f'^'cTp. текста с (J таблицами и \(з рисунками. Список литературы насчитывает !2*3 ссылок.
основное СОДЕРЖАНИЕ работы 1. Выделение полисахаридов
В работе использовались типовые штаммы P.mirabilis и P.vulgarís классификации Кауфмана-Перча из Чехословацкой национальной
коллекции типовых культур Института эпидемиологии и микробиологии в Праге и штаммы Р.реппеп из коллекции Д.Дж.Вреннера из Центра по контролю заболеваний (Атланта, США). Бактериальная масса выращивалась в Институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (Москва) под руководством проф. Е.С.Станиславского и в Институте микробиологии Университета Лодзи (Лодзь, Польша) под руководством проф. К.Котелко, и проф. З.Сидорчика.
ЛПС выделяли экстракцией горячим водным фенолом без разделения водной и фенольной фаз, посла диализа белки и нуклеиновые кислоты осаждали трихлоруксусной кислотой, ЛПС гидролизовали 2% уксусной кислотой для отщепления липида А. Полисахарид выделяли гель-хроматографией, выход составлял 2-4% от веса сухой бактериальной массы в зависимости от штамма.
2. Характеристика состава и строения О-антигеноо Proteus
Установленный нами мономерный состав О-антигенов Proteus приведен в таблицах 1 и 2, структуры повторяющихся звеньев - в таблице 3. Наиболее часто встречается D-глюкозамин (в 17 полисахаридах). Часто встречаются также другие распространенные в природе моносахариды: D-глюкоза, D-галактоза, D-глюкуроновая кислота, D-галаетуроновая кислота, . D-галактозамин и менее распространенный L-фухозамин (FucN). D-Рибоза найдена в двух, L-рамноза -.в трех полисахаридах,.три.О-антигена содержат редкие 6-дезоксиамикосахара: L-хиновозамин (QuiN, P.vulgaris 5/43), 3-амино-3,6-дидезокси-0-глюкозу (Qui3N, Р. penneri ' 14), и 3-амино-3,6-дидезокси-0-гапактозу (Fuc3N, Р. penneri 16).
Аминогруппа 2-амино-2-дезоксигексоз всегда ацетилирована; в 3-амино-сахарах она ацилирована N-ацетил-О-аланином (QuiSN в Р. penneri 14; такое производное найдено в природе впзрзые), или (R)-3-оксимасляной кислотой (Fuc3N в Р. penneri 16).
Характерной особенностью полисахаридов Proteus является присутствие амидоз глкжуроновой или галакгуроновой кислот с аминокислотами - L-аланином, L-серином, L-треонином и L-лизином), присоединенными через а-аминогруппу. Такие компоненты встречаются в полисахаридах других бактерий крайне редко.
Ниже приведены структурные формулы редко встречающихся и впервые найденных в природе компонентов полисахаридов Proteus: амидов D-галактуроновой и D-глюкуроновой кислоты с L-аминокислотами, карбоксиэтилирозанных моносахаридов
("гликолаетиповых кислот"), • аминосахаров с необычными
змгстителями • при аминогруппе
соон
моносахаридов: соон
сож—
Н°1—О Мэ
Ьн у—он он Са1АА!а
сомн-
(он )-он
м
он Са1А5ег
и фосформлировакных соон
сокн-
соон
СХ)МН-
н?ч- *
(он У-сн Т
мн->
он
носс
он
7"Л
(он У-он
--он
Ме
он вайТЫ
соон
С01МН-
(¡оЛ-сн
НО*-(
он
асМуэ
N42
соон
Н".
'Н
I
к
но\ , НЫЛе
&>н
НЫАс
Ме
АсНМ-"] -О
Ме Гш Уон но^н/ он
0и13ИА1аАс
РисЗШ!
ОН
I
э—р—о--с II \0 ;он У-он
но4
I
НМАс
к
Ме^р-СООН
-кн? ?н Т
НО/1-О II
.о
^он Ьон
он
Таблица 1. Распределение моносахаридов в полисахаридах Proteus. Число в скобках указывает общее количество полисахаридов, содержащих данный моносахарид
Моносахарид Серогруппа или штамм
Р. т!гаЬШз P. vulgaris P. pennerl
03 027 028 033 043 1959 019 023 02S S/43 8 12 14 16 35 42 52 62
D-Rlb (2) ■ + +
D-Glc (9) + + + + + + + + +
D-Gal (7) + + >+ +■ + + +
L-Rha (3) +. +
D-GIcA (4) + i- + +■
D-Ga!A (10) + + + + + + + + + +
D-GIcN (17) + + + + + + + + + + + + + - + +
D-GalN (6) + + + + + +
L-QuiN (1) +
1,,-FucN (4) + + + +
D-Qui3N (1) +
D-Fuc3N (1) +
Таблица 2. Распределение неуглеводных компонентов в полисахаридах Proteus
Компонент Ceporpynna или штамм ,
P. mirabilis P. vulgaris P. psnneri
03 027 020 033 043 1959 OI9 023 02G 5/43 8 12 14 18 35 42 52 62
NAc
+ + + +
+ + + + + + + +
(R)-ÇH3CHOHCH2CO Ac-D-Ala
OAc +
(я)-сн3снсоон
(s)-ch3chcooh
h2nch2ch20p02- +
(r)-ch3chcooh +
I ' '
hnch2ch2opo2-
Заместители при карбоксильной группе уроновых кислот L-Ala + ■
L-Ser +
L-Thr
L-Lys + + +
+ + + + +
+
+
+
+
+
Полисахариды P. mirabilis 027 и P. psnneri 3 содержат этаноламин, присоединенный фосфодиэфирной связью в положение 6 N-ацэтилгалакгозамина и галактозы, соответственно. Фосфоэтаноламин является обычным компонентом кора ЛПС грам-отрицательных бактерий, но ранее не был найден в О-специфических полисахаридах других бактерий. Ы-(2-гидроксиэтил)-0-аланин, присутствующий в О-антигене P. mirabilis 03 в качестве заместителя при фосфатной группе, обнаружен в природных углеводах впервые.
В трех полисахаридах были обнаружены редко встречающиеся простые эфиры Сахаров с молочной кислотой (гликолактиловые кислоты): D-глкжозы с (В)-молочной кислотой (P. vulgaris 025) и N-ацетип-О-глюкозамина с (Б)-молочной кислотой в положениях 4 и 3 (Р. penneri 35 и P. penneri 62, соответственно). Последние два соединения найдены в природе впервые. Найденная в P. vulgaris 025 3-[(R)-1-карбоксиэтил]-0-глкжоза недавно была обнаружена также в О-спеЦифическом полисахариде Pseudomonas fragi и капсульном полисахариде Alteromonas haloplanktis КММ 156.
Как видно из таблицы 3, О-специфические полисахариды Proteus построены из линейных или разветвленных повторяющихся звеньев, содержащих от 3 до 6 моносахаридов в повторяющемся звене. Обычно они содержат одну или две кислотных группы (карбоксил или фосфат), и иногда основную функцию (аминогруппу) в дополнение к кислотной. Как и' в других' микроорганизмах. Полисахариды- только с основными группами не найдены.
О-Ацетилирование, широко распространенное в бактериальных полисахаридах, встречается также в полисахаридах Proteus, где, как правило, содержание ацетильных групп ниже стехиометрического (2070%). Исключение составляет О-антиген P. mirabilis 028, где ацетилирование стехиометрическое.
О-Антигены Р.реппеп не имеют серологической классификации, поэтому в их коллекциях часто встречаются штаммы с одинаковыми 0-антигенами. Мы провели выделение и первичный анализ ряда щтаммов, предоставленных проф. ДДж-Бреннером (Û.J.Brenner, Center for Disease Control, Atlanta, USA), с помощью 1H и ЯМР спеетросхопии. О-Антигены большинства исследованных штаммов отличаются по своему строению, тогда как штаммы 16, 18, 32 и 45; 1, 35 и 65; 52, 53 и 67; 3, 14 и 23 продуцируют практически одинаковые полисахариды. Незначительные различия обнаружены только в степени О-ацетилирования, что может быть связано с различными условиями выращивания бактерий. Таким образом, при создании серологической
классификации Р .pennen такие штаммы следует объединить в соответствующие серогруппы.
Высокая концентрация заряженных групп в поверхностных полисахаридах (до 5 на повторяющееся звено в P. mirabilis 027) придает клеточной поверхности бактерий амфотерные свойства, которые могут способствовать адаптации бактерий- к среде обитании с высокой концентрацией ионов (мочевыводящие пути). В пользу такого предположения говорит высокая частота обнаружения штаммов Р. mirabiiis серсгрупп 03, 027 и 028 с амфотерными О-антигенами. Наиболее часто выделяемые от пациентов с воспалениями мочевых путей и бактеремией штаммы серогруппы 03 продуцируют полисахарид, содержащий фосфат М-(2-аминоэтил)-0-аланика. Возможно, этот заместитель играет роль s адгезии бактерий к тканям инфицированного организма. Самым распространенным уропатогенным микроорганизмом является E.COÜ, вызывающий пиелонефрит. О-Специфические полисахариды наиболее патогенных штаммов Eco// в отличие от полисахаридов уропатогенных Proteus не содержат заряженных компонентов. Однако клетки Ecoli окружены капсулой, причем капсула патогенных штаммов обычно имеет высокую плотность заряда, 1 карбоксил или фосфат на 1-2 моносахарида. Капсулы непатогенных штаммов относятся к другому типу, несущему меньшую плотность заряда. Более того, подобно О-специфическим полисахаридам Proteus, капсульный антиген уропатогенных штаммов E.coli К54 содержйт амиды ß-глюкуроновой кислоты с серином и треонином. Известно, что капсула является фактором вирулентности бактерий. Клетки Proteus также окружены полисахаридной капсулой, которая во всех известных случаях имеет то >:<е строение, что и О-специфический полисахарид. Все эти факты говорят в пользу предположения о связи присутствия в поверхностных полисахаридах бактерий аминокислот и других наряженных компонентов со способностью вызывать пиелонефрит.
л
Таблиид 3. Структуры полисахаридов Proteus
Р. mirabilis ОЗ
-6)-ß-D-Glc-{1-3)-ß-D-Gal-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-3)-a-D-Gal-(1-
6 I
{R)-H00CCHNHCH2CH20P02 ч
I
СНз
Р. mirabilis 023
-4)-ci-D-GalA-{1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-2)-ß-D-GalA^1-3)-a-D-GalNAc-(1-
Р. m/rabffis 027
ß-D-GIcNAc
1 -80% PEtN
i I
4 L 6
-3)-ß-D-GlcALys-{ 1 -3)-a-D-GaIAAIa-( 1 -3)-ß-D-GIcNAc-( 1 -
P. mirabilis 028 Ac
I
4
-4)-ct-D-GalALys-(1-4)-a-D-Gal-(1-3)-a-D-GalASer-(1-3)-ß-D-GlcNAc-{1-
P. mirabilis ОЗЗ
-4)-a-L-FucNAe-<1-3)-ß-D-GleNAc-<1-3
l 1
a-D-GIcA
P. mirabilis 043
-4)-a-D-GalA-(1-3)-£i-D-GalA-(1-3)4i-D-G!cNAc-(1-4)-a-D-Glc-{1-
P. mirabais 1S59(OXK)
-4)-ß-D-GlcA-(1-3)-ß-D-GalNAc-(1-6)-ß-D-GalNAc:-(1-2 - 4
I I
1 1 a-D-GIc a-D-GalALys
P. vulgaris 019
-4)-e-D-GalNAc-( 1 -3)-ct-l-FucNAc-( 1 -3)-ß-D-GlcNAe-(1-3)-a-D- Gal-(1 -
P. vulgaris 023
-3}-ß-D-G!cA-(1-4}-a-L-FucNAc-(1-3)-a-D-GicNAc-(1-3
i 1
a-D-Gal
P. vulgaris C25
-4}-ci-D-GalNAc-(1-3)-ß-D-G!cNAc-(1-2)-a-L-Rha-(1-2)-ß-D-Ribf-(1-
3 e
I
- . - 1 a-D-Gio 3
I
(R)-CH3CHCOOH
P. vulgaris 5143 (0X19)
-2)-ß-D-Glc-(1-S)-a-D-GicWAc-(1-3)-a-L-QuiNAc-(1-3)-ß-D-GlcNAc-{1-
6 . I
70% Ac
P. penneri 8
-3)-ß-D-GlcNAc(1-4)-ß-D-GalA-(1-3)-a-D-GalNAc-(1-3)-a-L-Fu=NAc-{1-6 6 4
I I I
PEtN 1 1
a-D-GIc ß-D-Glc
P. pennen 12
-4)-ß-D-GlcMAc-{1-4)-ß-D-GalNAc-(1-3)-ß-L-Rha-(1-6 3
■ i I
-40% Ac 1
ct-D-GalAThr-(3-Ac -30% . .
P. penned 3 = 14 = 23
P. penneri 16=18 = 32 = 45
-6)-cc-D-G!c-(1-4)-ß-D-GlcA-(1-3)-a-D-GlcNAc-(1-2)-ß-D-Fuc3NBt-(1-2
i 1
a-D-G!c
P. penneri 1 = 35 = 65
-2)-a-D-Gal-(1-3}-ß-D-GlcNAc-(1-3)-a-L-Rha-(1-2)-a-L-Rha-(1-6 2
. ! ... J.....-
40% OAc 1
ß-D-Glc-( 1 -3)-ß-GlcNAc 4
I
(S)-CH3CHCOOH
P. penneri 42
-2)-ß-D-GIc-(1-4)-ß-D-Glc-(1-3)-ß-D-GlcNAc-(1~4)-a-D-GalA-(1-
P. penneri 52 = 53 = 67
-4)-ß-D-GalA-{1-3)-ß-D-GlcNAc-(1-4)-ß-D-GalNAc-{1-3)-a-D-GalNAc-(1-
3
I
1 .
ß-D-GIcNAc
P. penneri 62
-3)-a-D-Gal-(1-3)-ß-D-G!cNAc-(1-6)-ß-D-G!cNAc-(1-6 3
I I
-70% Ac (S)-CH3CHCOOH
3. Серологе песете исследования
Полученные сведения о химической структуре О-антигенов Proteus были использованы для изучения серологических взаимосвязей антигенов и поиска иммунодоминантных фрагментов. Серологические зкслзрименты были выполнены с поликлональными кроличьими антиоьшоротками с применением метода ELISA и ингибирования ELISA, количественной микропреципитации и ее ингибирования, Вестерн-блота с гель-злектрофорезом ЛПС в присутствии SDS, а также двойного , "иммунозлектрофореза. В реакциях использовались ЛПС, полисахариды и полученные в ходе исследования структуры их производные, а также синтетические модельные соединения.
В полисахаридах, не содержащих разветвлений и неуглеводных заместителей {Р. vulgaris 019, 0X19), не удается идентифицировать ярко выраженных иммунодоминантных компонентов, все олигосахаридные фрагменты полимера в большей или меньшей степени реагируют с антисывороткой.
М-Ацетил^-фукозамин в исследованных полисахаридах Proteus присутствует всегда в составе дисахарида cx-L-FucNAc-(1-3)-D-GlcNAc (P. mirabilis О33, Р. vulgaris 019, 023, Р. penneri 8), который, видимо, не является иммунодоминантным фрагментом. Антисыворотка содержит небольшое количество антител к нему. Эти штаммы дают лишь слабые перекрестные реакции между собой и с содержащим тот же фрагмент штаммом Salmonella arizonae 059, хотя этот дисахарид в случае трисахаридного повторяющегося звена составляет 66% структуры.
-3}-ct-L-FucNAc-( 1 -3}-ß-D-GlcNAc-( 1 -3)-cc-D-Gal-( 1 -4)-ct-D-GalNAc-( 1 -P. vulgaris 019
-3)-a-L-FucNAc-( 1 -3)-ß-D-GlcNAc-( 1 -2)-a-D-Gal-( 1 -S. arizonae 059
Полисахарид P. penneri 14 обладает интересным структурным сходством с полисахаридом Escherichia с off 0:114, повторяющееся звено последнего отличается отсутствием галакгуроновой кислоты и некоторыми локальными заменами. Однако серологичесхое родство этих О-антигенов незначительно, что может быть связано с различным размером повторяющегося звена, и, соответственно, конформацией полимера, или с иммунодоминантной релью амида галакгуроноаой кислоты с аланином в полисахариде P. penneri 14, который отсутствует в полисахариде Escherichia coii 0:114. При этом трисахарид p-D-Qui3NA!aAc-{ 1 -4)-a-D-Ga!AA!a-{ 1-2)-j$-D-Rib и моносахарид D-Qui3NAIaAc проявляют заметную активность в торможении EL1SA с антисывороткой к P. penneri 14.
-4)-p-D-GaH l-3)-p-D-GlcN Ас-{ 1-2)-p-0-Qui3N AJaAc-{ 1 -4)-a-D-CaIAAJa-{ 1 -2 )-p-D-Ribf-{ 1-P. penneri 14
-4)-p-0-Gai-(i-3)-<z-D-GlcNAc-(1-4)-p-D-Qui3NSerAc-(1-3)-p-D-Ribf-(1-£ со//0:114
О-Слецифичесхйй полисахарид P. vulgaris 025 и капсульный полисахарид Alteromonas haloplanktis KMM 156 содержат общий трисахаридный фрагмент, включающий L-рамнозу, N-ацетил-О-глюкозамин и эфир D-глюкозы с (й)-молочной кислотой. К сожалению, данные о серологическом родстве этих микроорганизмов неизвестны.
-4)-a-D-GalNAc-(1-3)-j}-D-GlcNAc-(1-2)-a-L-Rha-(1-2)-p-D-Ribi-(1-
3
I 1
(R)-MeCHC00H->3)-a-D-Glc Р, vulgaris 025
-4)-p-D-GlcNAc-(1-2)-a-L-Rha-(1-2)-p-D-Rha-(1-3
I 1
(R)-MeCHCOQH-^3)-a-D-Glc A. haloplanktis KMM 156
Преципитация антисыворотки к P.penneri 16 его липополисахаридом тормозится тетрасахаридом и моносахаридом на 37
и 42% соответственно, то есть моносахарид D-Fuc3NBt является выраженным иммунодоминантным звеном.
-6)-a-D-Glc-(1-4)-p-D-G!cA-(1-3)-a-D-GlcNAc-(1-2)-P-D-Fuc3NBt-(1-2
i , 1
ц-D-Glc P. penneri 16
a-D-G!c-(1-2)-P-D-GlcA-(1-3)-a-D-G!cNAc-(1-2)-D-Fuc3NBt
Me
Me 0H (D-Fuc3NBt)
Серологические эксперименты с фрагментами полисахарида Р. mirabilis 1959 выябили иммунодоминантную роль терминального остатка амида cc-D-галактоп.иранозилуроновой кислот с L- лизином. Отщепление этого моносахарида или N-ацетилирование лизина приЕодт к • прекращению взаимодействия полисахарида с антисывороткой. -
В серотипэ 027, ' содержащем амид a-D-галактопиранозилуроновой кислоты с L- лизином в осноеной цепи полимера, отдепьмые модификации структуры не приводят к полной потере активности; N-ацетилирование лизина и этаноламинфосфата или отщепление бокового остатка глюкозамина снижает активность в реакции преципитации примерно вдвое. Таким образом, сыворотка содержит ряд сходных по активности антител к разным фрагментам структуры.
В полисахариде Р.реппеп 12 боковой остаток амида a-D-галактопиранозилуроновой кислот с L-треонином имеет явно выраженную иммунодоминантную роль. Окисление этого сахара приводит к полной потере активности полисахарида в тесте количественной преципитации с гомологичной антисывороткой.
На основании наших результатов по определению структуры полисахаридов специально для серологических исследований были синтезированы амиды (î-D-глюкопиранозилуроновой и а- и p-D-галактопиранозилуроновой кислот с L- и D-аминокислотами - лизином,
аланином, серином и треонином в виде низкомолекулярных гликозидоз и на полимерном носителе.
Серологические эксперименты с этими соединениями подтвердили иммунодоминантную роль амида D-галактуроновой кислоты с L-лизином в О-антигенах P. mirabilis 028 и 1959, причем в первом случае он находится в основной цепи, а во втором - присоединен в качестве ответвления, и амида D-галактуроновой кислоты с L-треонином в О-антигенах P. penneri 12. Напротив, в содержащем различные неуглезодные заряженные группы О-антигене P. mirabilis 027 амид D-глюкуроновой кислоты с L-лизином не является единственным иммунодоминантным фрагментом. Антитела к содержащим аминокислоты фрагментам всех антигенов специфичны к данной аминокислоте и не реагируют с модельными соединениями, содержащими другие аминокислоты.
Неуглеводные заместители, присоединенные фосфодиэфирной связью - фосфоэтаноламин в P. mirabilis 027 и P. penneri 8 и 2-[(R)-1-карбоксизтиламино]этилфосфат в P. mirabilis 03, играют важную роль в проявлении серологической специфичности О-антигенов. Отщепление 2-[(ЭД-1-карбоксиэтиламино]этпфосфата от полисахарида серотипа ОЗ приводит к полной потере серологической активности. Серологическое родство P. mirabilis 027 и P. penneri 8 основано именно на присутствии в обоих фосфоэтаноламина.
О-Антигены P. vuigaris серогруплы ОХ перекрестно реагируют с антигенами Kckettsia, что используется для диагностики тифа (тест
,соон
R
Me (L-AJa)
Me p-Ala)
PHANHj IXyi)
Py^Hj (D-Lys)
CHjOH i.-Sar)
CHMeOH (LHir)
OH
[TCI^CH^CHjCHfCHjCHJyl, rpHjCH^CHjCHpHjCHJy-V,
conhj conh2 conhj conhj
Вайля-Феликса), пятнистой лихорадки и других риккетсиозов. Хотя эта а методика давно известна, до сих пор не идентифицированы участвующие в ней антигенные детерминанты. Нами установлены структуры О-антигенов P. vulgaris штамм 5/43 и P.mirabilis штамм 1959, представителей серогрупп ОХ19 и ОХ К. знание которых необходимо для исследования причины перекрестной реактивности.
4. Установление структуры О-антигенов.
Присутствие в составе изучаемых О-антигенов компонентов различной природы - аминокислот, фосфатов, алкильных и ацильных заместителей, Сахаров с различной устойчивостью гликозидных связей и стабильностью в условиях расщепления - требует использования методов оценки всей структуры сразу, во избежание потери необнаружизаемых аналитическими методами компонентов или ошибочного приписывания к повторяющемуся звену легко обнаруживаемых компонентов кора или примесей. Для этого использовалась ЯМР спектроскопия. Общая идея структурного анализа состояла в определении структуры по возможности только бездеструктивными методами ЯМР, химические методы использовались лишь для прояснения оставшихся вопросов и подтверждения результатов. Надежность получаемой информации обеспечивалась тем, что каждый элЬмёнт структуры доказывался двумя или более способами. Нами были отобраны и приспособлены к требованиям изучаемых объектов наиболее эффективные методы, что позволило значительно ускорить и упростить анализ структуры полисахаридов. 1
4.1. Анализ структуры полисахаридов методом ЯМР
Изучение структуры полисахаридов начиналось со съемки ЯМР спектров. В работе использовалась ЯМР спектроскопия на ядрах 1Н, 13С и, при наличии фосфорсодержащих заместителей, 31Р. Применялась следующая схема извлечения структурной информации:
1. По количеству, структуре и положению сигналов делался вывод о количество и природе моносахаридных остатков и неуглеводных заместителей.
2. По константам спин-спинового взаимодействия (КССВ) и положению сигналов определялась стереохимия и размер окисного цикла моносахаридов и конфигурация гликозидных связей.
3. По ядерным эффектам Оверхаузера (ЯЭО) и эффектам гликозилирования определялся способ соединения моносахаридов и неуглеводных заместителей.
4. При необходимости по эффектам гликозилирования определялась абсолютная конфигурация моносахаридов.
Посла первичного анализа ЯМР спектров принималось решение о том, какие ЯМР и химические методы следует применить для окончательного определения структуры.
При полной расшифровке ^Н, и ЯЭО спектров в удачном случае можно определить полную структуру полисахарида за исключением абсолютной конфигурации всей молекулы. В то же время . пока не решена проблема определения конфигурации и положения некоторых заместителей, например, часто встречающихся в полисахаридах Proteus остатков молочной кислоты или аминокислот.
4.1.1. 1Н ЯМР спектроскопия
По 1Н ЯМР спектру определяли количество альдоз (по числу сигналов HI), их аномерную и относительную конфигурацию (по вицинальным КССВ), количество метильмых и метиленовых групп, которые дают сигналы в области 1-2,5 м.д. Частично эту информацию можно извлечь .уже. из нерасшифрованнрго одномерного спектра (Рцс. Ii-
Для расшифровки протонных спектров на начальных стадиях работы использовалась спектроскопия двойного гомоядерного резонанса, вытесненная впоследствии двумерной спектроскопией. Главным образом применялся метод COSY (Correlation Spectroscopy), в котором наблюдаются корреляционные пики атомов, непосредственно связанных спин-спиновым взаимодействием, а также COSY RCT (Relayed Coherence Transfer) и BCT2, где кроме корреляционных пиков между протонами, связанными спин-спинозым взаимодействием, содержатся также сигналы корреляций со следующими по цепи спин-спинового взаимодействия атомами (одним или двумя, соответственно).
Напригмр, спектр COSY О-дезацетилированного полисахарида Р. mirabilis 023 (Рис. 2) позволил сделать отнесение сигналов всех протоноз. Это связано с удачным расположением сигналов, особенно с отсутствием перекрывания протонов, связанных спин-спиноеым взаимодействием, и наличием в повторяющемся звене двух уроновых кислот, не иаеющих протонов Н6. Чаще приходилось привлекать другие двумерные спектры.
Т9
'ис. 1. Протонные спектры О-дезацатилированных полисахаридов Р. тнаЬШз 528 (вверху) и Р. роппоп 16 (внизу). Обозначена принадлежность сигналов к функциональным группам.
-4)-a-D-GalALys-(1 -4)-c^D-Gal-{1 -3)-a-D-Ga!ASer-{1 -3)-f3-D-G!cN Ao-{1 -ABC D
Рис. 2. Фрагмент спектра COSY 0-дезацвтипирозанного полисахарида Я. mirabiUs 028 ■ соответствующая область 1Н ЯМР спектра.
Например, спектр COSY RCT полисахарида P.penneri 16 (Рис. 3) содержит корреляции между протонами Н1 - Н2 - НЗ. В спектре COSY RCT2 полисахарида P.vulgaris 5/43 (Рис. 4) видны корреляционные пики меаду Н1 - Н2 - НЗ - Н4 каждого моносахаридного остатка (некоторые сигналы перекрываются). Обычно в этих спектрах удавалось идентифицировать корреляционные пики до Н4 в сахарах с глюко- или галаАлп-конфигурацией и до НЗ в сахарах с /вднно-конфигурацией.
При изучении некоторых полисахаридов дополнительно применялся метод TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), главным образом в одномерном варианте (Рис. 5). Спектр TOCSY содержит корреляционные пики между всеми атомами в цепи спин-спиносого взаимодействия. Как и в методе COSY RCT, очень маленькие КССВ служат препятствием для переноса поляризации; например в остатках галзкто-сахаров корреляции просматриваются только до Н4 из-за маленькой константы J45 < 1 Гц и до НЗ в сахарах с манно-конфигурацией.
Последовательность моносахаридов и способ их соединения определялись с помощью спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) и по эффектам гликозилирования, в частности, с помощью компьютерного анализа спектров (см. ниже). Для определения последовательности моносахаридов получали ЯЭО спектры с последовательным предоблучением всех аномерных протонов. Аномерный-протон ■ гликозилирующего• остатка обычно дает ЯЭО на трансгликозидном протоне. ЯЭО спектры использовались также для расшифровки протонного спектра, так как эффект наблюдается внутри облучаемого остатка между атомами Н1 и Н2 для а-аномеров и Н2, НЗ и Н5 для (5-аномеров (при глюко-конфигурации). В зависимости от конформации молекулы ' наблюдались также ЯЭО между другими протонами, что также использовалось для получения информации о структуре. На рис. 6 приведены ЯЭО спектры О-дезацетилированного полисахарида P.mirabilis 028, по которым была установлена последовательность моносахаридов и типы их замещения в полимере. ЯЭО между протонами А1 и В4, В1 и СЗ, С1 и D3, D1 и А4 непосредственно указывают на способ соединения моносахаридов; кроме того, наблюдаются интенсивные ЯЭО между А1 и В6, и В1 и С4, что типично для соответствующих дисахаридных фрагментов. При предположении о замещении остатка В в положение 6 ЯЭО на В4 не ' наблюдался бы вследствие неподходящего расположения протонов; так же был бы необъясним ЯЭО на СЗ при замещении остатка С в положение 4.
5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.
4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.;
A B с D
-6)-a-D-Glc-(1-4)-ß-D-GlcA-(1-3)-a-D-GlcNAc-(1-2)-ß-D-Fuc3NBt-(1-
2
l 1
a-D-GIc
E
Рис. 3. Фрагмент спектра COSY RCT О-дезацетилиройанного полисахарида P. pennen 16.
-2)-(ИМ31с-(1 -8)-a-D-GlcNAo-(1 -3)-a-L-QuiNAc-(1 -3)-^-D-GlcNAc-(1-A В С D
Рис. 4. Фрагмент спектра COSY RCT2 О-дезацетилированного полисахарида P. vulgaris 5/43 и соответствующая область ^Н спектра.
E F А В
-3)-ß-0-GlcNAc(1-4)-ß-D-GalA-(1-3)-a-D-GaINAc-(1-3)-a-L-FucNAc-(1-
6 4
I I
1 1 С a-D-Glc ß-D-GIc D
Рис. 5. ЯМР спектр дефосфорилированного полисахарида Р. penneri 8 (внизу) и одномерные TOCSY спектры, полученные при предоблучении аномерных протонов остатков A-F.
-4)-a-D-GalALys-(1 -4)-ct-D-Gal-{1 -3)-<i-D-GalASer-(1 -3)-p-D-GlcNAe-{1 A В • С D
Рис. 6. ^H ЯМР cneinp О-дезацетилированного полисахарида P. mirabilis 028 (а) и одномерные ЯОЭ спектры (b-е), полученные при предобпучении аномерных протонов.
Кроме обычной спектроскопии ЯЭО использовался метод ROESY (ROtating frame nuclear Overhauser SpectroscopY), главны?' образом в одномерном варианте (Рис. 7). Он имеет некоторые преимущества в чувствительности.
4.1.2. 'Зс ЯМР спектроскопия
Первичный анализ ЯМР спектров гетсрополисахаридов
позволяет определить общее число моносахаридов в посторяющемся звене, их структуру и структуру неуглеводных компонентов. Например, сигналы в области 92-110 м.д. относятся к аномэрным атома;.: углерода, сигналы в интервале 46-58 м.д. принадлежат атомам углерода несущим аминогруппу (С2, СЗ или С4 аминосахаров, С2 аминокислот); CS 6-дезоксисахаров дают сигналы при 16-19 м.д., С6 ар/идов уроновых кислот с аминокислотами, часто встречающихся в полисахаридах Proteus, при 170-172 мл, С1 аминокислот проявляется при, 176-178 м.д.; легко могут быть идентифицированы О-и N-ацетильные группы (СНз при 21-24 мд„ СО при 173-175 м.д.), остатки молочной кислоты (СНз при 19-21 мд., СООН при 180-183 м.д.), 2-аминоэтилфосфат (С1 при 63-64 м.д., С2 при 41-42 м,ц.) и другие неуглеводныв заместители (Рис. 8).
Для определения числа связанных с атомом углерода протоноз использовался метод DEPT - (DistortionlesS Enhancement Ьу Polarisation Transfer) (Рис. 8).
Отнесение 13с ЯМР спектров проводилось с помощью спектроскопии 1Н /13С COSY (Рис. 9).
Анализ смещения положения сигналов вследствие гликозилирозания использовался для определения последовательности и способа соединения моносахаридов.
Для определения аномерной конфигурации применялась зависимость КССВ 1Jci и положения сигналов в углеродном спектре от аномерной конфигурации.
Конфигурация остатка молочной кислоты в ее простых зфирах с сахарами (гликолактиловых кислотах) может быть определена тольхо по положению сигналов в сравнении с известными моделями, т.е.методом "фингерпринта", что делало необходимым встречный синтез впервые найденных гликолактиловых кислот.
4.1.3. Компьютерный анализ спектров.
Положение сигналов в ^С ЯМР спектрах олигосахаридов зависит от природы моносахаридов и способа их соединения. Нами была
Рис. 7. 1Н ЯМР спектр полисахарида Р. penneri 62 (внизу), одномерные ROESY спектры, полученные при предоблучении аномерных протонов остатков А-С и Н-2 остатка молочной кислоты (L), и структура повторяющегося звена полисахарида с указанием наблюдаемых ЯЭО.
CHOR (C2-C5)
CHNR,
OCHOR (CD
CH3CO
-Lw
CK2OH (CS)
CHjNRÎ c«2
'/iwJfi^
100 90 - 60 70
50 40
(ррш)
Рис. 8. DEPT (вверху) и (внизу) спектры О-дезацетилированного полисахарида P. mirabilis 028. Обозначена принадлежность сигналов к функциональным группам, в скобках указано обычное расположение атомов данного типа в альдозах.
v
Рис. 9. Гетероядерный 13С - 1Н COSY спектр полисахарида P. vulgaris 025 и соответствующие области одномерных спектров.
создана программа для персонального компьютера, позволяющая находить совместимые с данным углеродным спектром поли- и олигосахаридные структуры размером до 5 моносахаридов, построенные из гексоз и их производных. Расчетные спектры составляются на основе базы данных, содержащей специальным образом подготовленные экспериментальные значения химических сдвигов и эффектов гликозилирования моносахаридов со всеми возможными типами замещения. Работа программы состоит из 5 этапов.
1. Ввод данных: химических сдвигов экспериментального спектра, типа структуры (полисахарид или олигосахарид) и, по возможности, известной структурной информации (аномерных конфигураций, последовательности и мест замещения), и моносахаридного состава
2. Генерация возможных структур.
3. Вычисление химических сдвигов углеродного спектра для каждой структуры.
4. Сравнение расчетных и экспериментальных данных.
5. Вывод результата.
Вычисление спектра производится прибавлением эффекта гликозилирования к- химическому сдвигу С1 замещающего сахара. Все остальные эффекты гликозилирования (на С2, С5 и атомы вокруг места замещения) учтены в базе данных.
Сравнение рассчитанного и экспериментального спектров происходит путем вычисления суммы квадратов попарных разностей между рассчитанными и экспериментальными химическими сдвигами. Для примера приведены результаты расчета структуры О-специфического полисахарида Р. vulgaris 0X19 (штамм 5/43) (Табл. 4,5).
Результаты расчета очень чувствительны к абсолютной конфигурации моносахаридов, так как эффекты гликозилирования существенно различаются в парах моносахаридов с одинаковой и разной абсолютной конфигурацией. Это явление использовалось для определения абсолютной конфигурации. Так, при попытке изменить конфигурацию хиновозамина с L- на D- (последняя строка в Табл. 4) расчет, показывает большое отклонение от экспериментального спектра,.
Таблица 4. Структуры с наименьшими отклонениями расчетного спектра от экспериментального для полисахарида Р.ш1дапз 0X19 (вй/гидаг -квадратичное отклонение на 1 моносахарид).
Структура города г
-а-0-С1сМАс-2-р-0-С!с-3-а-1-ОшМАс-3-р-0-С1сМс-6- Г7
-р-0-в1с-6-а-0-61сМАс-3-а-1-0иМАс-3-р-0-С!сЫАс-2- 1.8
-Р-0-С1с-4-а-0-С1сМАс-3-а-1.-0ш^с-3-{$-0-С1сМАс-6- 2.6
-а-0-С1сМАс-3-а-1-ОиМАс-3-р-0-С1с-6-|3-0-61сМс-4- 2.7
-р-О-ас-б-а-О-Ос^Ас-З-Р-О-ОсМАс-З-а-О-ОшМАс-г- 3.6
Таблица 5. Результаты расчета спектра полисахарида Р-уи/даг/э 0X19 -Для структуры -а-0-С!сМАс'-2-р-0-С1с-3-а-Ь-01МАс-3-р-0-С1сМАс-6- (са!с-рассчитанный спектр, ехр- экспериментальный, с-е- разность между ними).
Звено С1 С2 СЗ С4 С5 С6
-а-0-С!сМАс-2- еа!с 97.7 55.3 72.0 71.4 72.3 69.8
ехр 98.1 54.9 72.0 71.0 72.1 69.4
с-е 0.4 -0.4 0.0 -0.4 -0.2 -0.4
-Р'-0-С1с-3- *са!с 104.1 79.1 75.7 70.9 '77.2 "62.1"
ехр 102.9 78.1 74.9 70.0 77.2 62.5
с-е -1.2 -1.0 -0.8 -0.9 0.0 0.4
-а-ЮшЫАс-З- са!с 98.9 54.5 81.5 77.0 69.4 17.9
ехр 98.5 54.8 80.3 76.9 68.9 17.9
с-е -0.4 0.3 -1.2 -0.1 -0.5 0.0
-р-О-^сИАс-б- са!с 102.9 56.9 79.5 69.9 77.0 62.1
ехр 102.7 57.1 79.3 69.8 76.8 61.8
с-е -0.2 0.2 -0.2 -0.1 -0.2 -0.3
Расчетный метод был успешно применен при изучении структуры полисахаридов Р.ткаЬИт 03, Р.ш/дапэ 019 и 0X19, Р.реппеп 42. Даже в Тех случаях, когда расчет показывал несколько структур с близкими спектрами или, наоборот, рассчитанные спектры всех структур с данным составом плохо согласовались с наблюдаемым спектром, результаты расчета были использованы для решения некоторых частных проблем, возникающих при анализе структуры другими методами.
4.2. Химические методы установления структуры полисахарздоз
Химическая модификация полисахаридой применялась в настоящей работе в основном для получения веществ, более подходящих для исследования методом ЯМР, или для подтверждения и дополнения результатов, полученных этим методом. Всегда, когда это было возможно, проводилось выделение моносахаридов и других компонентов полимеров • и их идентификация хроматографическими методами. При необходимости проводился встречный синтез ноьых соединений.
Для получения олигосахаридов и модифицированных полисахаридов использовался распад по Смиту, сольвслиз безводны« фтористым водородом и мягкий кислотный гидролиз. Каждый' из ятих методов имеет преимущества и недостатки, выбор метода зависит от стоящей задачи. Модифицированные полимеры выделяли гель-хроматографией. Для разделения смесей олигосахаридов использовались последовательно гель-хроматография, обращенно-фазовая и, в случае заряженных молекул, ионообменная хроматография.
Определение положения замещения и размера цикла моносахаридов проводилось методом метилирования с анализом метилированных продуктов ГЖХ-масс-спектрометрией после гидролиза, восстановления в полиолы и ацетилирования. Для идентификации производных неамидированных уроновых кислот метилированные полисахариды восстанавливали боргидридом лития.
О-Дезацетилироэание, применявшееся ко всем 0-ацетилированным полисахаридам для получения регулярных полимеров, проводилось действием основания в мягких условиях, обычно 12% аммиака при 60е. Положение О-ацетильной группы определялось по эффектам ацетилирования в ^Н и ЯМР спектрах.
4.2.1. Идентификация компонентов полисахаридов
Моносахариды и аминокислоты идентифицировали после отщепления их кислотным гидролизом и в некоторых случаях
кислоты определяли с помощью анионообменной хроматографии в боратном буфере на углеводном анализаторе. Аминокислоты и аминосахара идентифицировали с помощью аминокислотного анализатора. Моносахариды идентифицировали также ГЖХ и ГЖХ-масс-спекгрометрией в виде ацетатов полиопов, что позволяло определить положение аминогруппы в аминосахарах.
Абсолютная конфигурация моносахаридов определялась ГЖХ их гликозидоз с оптически активными 2-октанолом или 2-бутанолом или по величине оптического вращения, конфигурация аминокислот - ГЖХ их эфиров с 2-бутанолом, ВЭЖХ на хиральной фазе, по величине оптического вращения или по спектру кругового дихроизма.
Аминосахара с заместителями при аминогруппе и амиды уроновых кислот с аминокислотами выделяли после расщепления полисахаридов сольволизом безводным фтористым водородом для сохранения амидно связанных заместителей. Таким способом удалось получить 3,6-дидезокси-3-[(й)-3-гидроксибутирил]амидо-0-галактозу и 3-(М-ацетил-0-апанил)амидо-3,6-дидезокси-0-глюкозу из О-антигенов P. penneri 14 и 16; D-галактуроноил-и-аланин и 2-(0-галактуроноил)-1_-лизин из полисахаридов-"Я mirabilis 1959 и Р. " penneri ' 14; простые эфиры' моносахаридов с молочной кислотой - 3-[(5)-1-карбоксиэтил]-2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкозу из О-антигена P. penneri 62 и 4-[(S)-1-карбоксиэтил]-2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкозу из О-антигена Р. penneri 35. Полученные соединения идентифицировали с помощью ЯМР спектроскопии и масс-спекгрометрии в виде ацетатов полиолов. Структура 4-[(8)-1-карбоксиатил]-2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкозы из О-антигена P. penneri 35 и М-(2-гидроксиэтал)-0-аланина из О-антигена P. mirabilis ОЗ подтверждена встречным синтезом.
4.2.2. Идентификация характерных для Protevs компонентов О-антигеноз без выделения о индивидуальном состоянии.
Характерной особенностью полисахаридов Proieus является присутствие амидов уроновых кислот с аминокислотами, найденных в О-антигенах P.mirabilis 027, 028 и 1959 и P.penneri 12 и 14. Только в двух
случаях - P.m/rabffis 1959 и P.penneri 14 - зти моносахариды был'/, выделены из полисахаридов в свободном виде с помощью сользолиза безводным HF и полностью охарактеризованы химическими и физико-химическими методами. В составе остальных полисахаридов они были идентифицированы без выделения. При этом использовались следующие доказательства структуры. Уроновую киолоту и аминокислоту по отдельности идентифицировали обычными методами. Присоединение аминокислоты амидной связью следовало из устойчивости этой связи в условиях гидролиза сложных эфнров и отсутствия в спектрах полисахарида сигналов, которые можно было бы интерпретировать как свидетельство наличия ацильных или алкильных заместителей у моносахаридов. В области сигналов карбонильных групп характерным образом проявляются сигналы С6 уроновой кислоты (170171 м.д.) и С1 аминокислоты (177-178 м.д.). Положение сигналов Н5 аудированной уроновой кислоты не зависит- от рН раствора, в то время как у уроновой кислоты со свободной карбоксильной группой этот сигнал смещается примерно на 0,5 м.д. при изменении рН от 2 до 12. В случае содержащих лизин производных аудирование по NH-2 было доказано на выделенном из P.mirabilis 1S59 образце и в дальнейшем структура доказывалась идентичностью ЯМР спектров.
Среди исследованных полисахаридов три - P.penneri 35 и 62 и P.vulgaris 025 - содержали производные моносахаридов, ал копированные по гацроксильной группе остатком молочной кислоты.
Me
он
P. vulgaris 025
Необычные моносахариды в двух случаях, P.penneri 35 и 62, были выделены в индивидуальном состоянии с помощью сольволиза
COOH
НМАс P.penneri 35
. безводным HF, в составе полисахарида P.vulgaris 025 моносахарид был идентифицирован без выделения. Положение алкилирования во всех случаях было доказано по смещению сигнала атома углерода при положении алкилирования на 8-9 м.д. в слабое поле и по ЯЭО. наблюдавшемуся между Н2 остатка молочной кислоты и протоном при , . положении алкилирования. Неизвестный ранее изомер мурамовой кислоты, найденный в полисахариде Р.реппеп 35, для идентификации, был синтезирован.
Среди изученных полисахаридов два - Р.реппеп 16 и Р.реппеп 14 - содержали редко встречающиеся 3-амино-3,б-дидезоксигексозы с необычными заместителями при аминогруппе. Ключевым моментом в идентификации этих соединений является определение положения аминогруппы по положению сигнала несущего ее атома углерода в области 48-58 м.д. и доказательство структуры N-ацильного заместителя по ЯМР спектрам и масс-спектру ацетата полиола моносахарида.
4.2.3. Дефосфорилироваиие и определение положения фосфатов
Фосфатные группы в исследованных полисахаридах встречалось в штаммах P. mirabilis 03 и 027 и P. penneri 08, причем по данным ЯМР в случае P. mirabilis 027 фосфорилировано было около 80% повторяющихся звеньев, а в остальных двух штаммах около 100%. Для устранения нерегулярности и упрощения структуры применялось дефосфсрилирование 48% HF, обычно протекающее без побочных реакций. Положение фосфатной группы определялось из ЯМР спектров по характерным С-Р и Н-Р КССВ и эффектам фосфорилирования при сравнении спектров исходного и дефосфорилированного полимеров. При Дефосфорилировании полисахарида P. mirabilis 03 был получен линейный полимер и ^-2-гидроксиэтил-0-аланин. Структуре дефосфорилированного полисахарида определена с помощью -компьютерного расчета ^3С ЯМР спектра и периодатного окисления.
М-2-Гидроксизтил-0-аланин, впервые найденный в природе, был выделен после дефосфорилирования в индивидуальном виде, его структура определена с помощью ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии и подтверждена встречным синтезом. Для определения абсолютной конфигурации была использована спектроскопия кругового
дихроизма. Способ присоединения аминокислоты к полисахариду определен методом ЯМР спектроскопии.
-е)-р-0-С!с-(1-3)-р-0-Са1-{1-3)-р-0-С1сМАс-(1-3)-а-0-'За!-{1- Р. тгабйв ОЗ
I
(Я)-Н00ССНШСН2СН20Р02
'I
сн3
4- 48% НР
СООН
I
Н-С-ЫН-СН2СН2ОН I
СНз
4.2.4. Распад по Смиту
Распад по Смиту применялся для .получения олкгосахаридов или, б случае окисления только боковых заместителей, модифицированных полисахаридов. Таким образом была получена основная цепь полисахарида Р. гЫгаЫЧв 1959, сравнение ЯМР спектра которой со спектром исходного полимера позволило установить места присоединения боковых заместителей.
-4)-р-0-С1сА-(1-3)-р-0-Са1ЫАс-(1-6)-р-0-Са1МАс-(1- Р. ткаЫИэ 1959 2 4
I I
1 1 а-0-й'|С . а-СМЗа^ув
■I- №104, ИаВЦф АсОН
-4)-|3-0-С1сА-(1-3)-р-0-СаМАс-(1-6)-р-0-СаМАс-(1-
Полимеры, полученные в результате отщепления боковых цепей от полисахаридов, были использованы для серологических исследований, позволивших показать в некоторых случаях иммунодоминантную роль находящихся боковых цепях остатков моносахаридов.
4.2.5. Сольволиз бэсзодным фтористым водородом
Сольволиз безводным HF является универсальным методом расщепления гликозидных связей при сохранении амидных, что позволяет получать олигосахариды или, что особенно важно, моносахариды, с сохранением N-ацильных заместителей, в частности, с амидами уроновых кислот. Стабильность гликозидных связей в HF увеличивается в ряду пентозы < 6-дезоксигексозы < 6-дезоксиаминогексозы < гексозы < 2-аминогексозы < уроновые кислоты. Сольволиз HF сопровождается полным дефосфорилированием.
При изучении структуры полисахарида Р. mirabilis 1959 сольволиз безводным HF был основным экспериментом, позволившим получить максимум структурной информации. Набор продуктов, образовавшийся при сольволизе, хорошо иллюстрирует сравнительную устойчивость гликозидных связей различных Сахаров. Сольволиз привел к образованию тетрасахарида, трисахарида, двух дисахаридов и амида "галактуронопой кислоты с лизином. Связи гексоз (в данном случае бокового остатка глюкозы) наименее устойчивы к действию HF, и этот моносахарид отщепился полностью. Следующие по стабильности связи 2-ацетамидогексоз разрушились частично; получены продукты как с аминосахарами на восстанавливающем конце, так и в середине цепи. Наиболее устойчивы связи уроновых кислот: глюкуроновая кислота не отщепилась вовсе, а ' Б-галактуроИоил-и-лизин отщепился только частично. Структура всех полученных соединений была установлена, с помощью 13С ЯМР спектроскопии.
-4)-p-D-G!cA-(1-3)-p-D-GalNAc-(1-6)-p-D-GalNAc-(1- Р. mirabilis 1959 2 4
I I
1 • 1 a-D-Glc a-D-GalALys
1 HF, 0°, 30 мин.
p-D-G!cA-{1-3)-p-D-Ga!NAc-(1-6)-[a-D-GalALys-(1-4)]-D-GalNAc. P-D-GIcA-(1-3)-p-D-GslNAc-(1-6)-D-GalNAc D-GalALys P-D-G!cÁ-(1-3)-D-Ga!NAc ct-D-Ga!ALys-(1-4)-D-GalNAc
Варьирование условий сольволиза позволяет провести направленное расщепление гликозидных связей. Сольволиз
полисахарида P. mirabilis 027 с тетрасахаридным повторяющимся звеном, содержащим фосфоэтамоламин, аланин и лизин, при сольволизе HF в зависимости от температура давал преимущественно тетрасахарид, который представляет собой дефосфорилированное повторяющееся звено, или трисахарид.
P-D-GIcNAc
1 -80% PEiN
! - l 4 . 6
-3)-p-D-GlcALys-(1-3)-a-D-GalAAIa-(1-3)-p-D-GloNAc-(i- R mirabilis 027
i HF (0 «C), NaBH4
|5-D-GlcNAc-(1-4)-p-D-GlcALys-(1-3)-a-D-Ga!AAia-(1-3)-D-GlcNAc-o!
4. HF (20 °C), NaBH4
P-D-GlcALys-('t-3)-a-D-GaiAAIa-('i-3)-D-GlcNAc-o(
Сольволиз альдоз протекает через образования а-гликозилфторида, сольволиз г-ациламиносахароь - через гликозилфтормда и оксазолиновые производные, которые обычно быстро гидролизуется и после обработки реакционной смеси водой превращаются в восстанавливающие сахара. Лишь в случае 'полисахарида P. pënneri 1S сольволиз привел к убтойчмзому сс- ' олигозияфториду, который гидролизовался г.ри продолжительном нагревании в воде. Повышенная стабильность этого соединения вероятно связана с замещением гликозилфторидг в положение 2.
P. penneri 16
4- HF (25 ос)
a-D-Glc-(1-2)-j5-D-GlcA-(1-3)-a-D-G!cNAc-(1-2)-ci-D-Fuc3NDt-(1-F
4- Н20 (90 ОС) a-D-G!c-(1-2)-p-D-GlcA-(1-3)-a-D-GlcNAc-(1-2)-D-Fuc3WBi
Результат сольволиза зависит от конфигурации гликозидной связи. При сольволизе полисахарида P. permeri 8 был получен пентасахарид в результате расщепления связей фукозамина и а-глюкозы, которые '
имеют примерно одинаковую устойчивость в ИР. Связь р-глюкозы -при этом не расщепилась. 3
-3)-р-0-3!сМАс(1-4)-)3-0-Са!А-{1-3)-а-0-Са!МАс-(1-3)-а-1-РисМАс-(1-
6
6
4
РЕЭД
1
а-О-Ск
1
Р. реппеп 8
X НЯ (25 ОС)
0-О-О1сМАс(1-4)-3-О-Са(А-(1-3)-а-О-Са(МАс-(1-3)-[(3-О-С1с-(1-4)]-1-РисМАс
4.2.6. Частичный кислотный гидролиз
Гидролиз разбавленной соляной кислотой во многих случаях дает те же олигосахаридные продукты, что и сольволиз фтористым водородом. ^ Сравнительная стабильность гликозидных связей большинства Сахаров совпадает с описанной для сольеолиза. М-Ацильные заместители при этотакже сохраняются. Мягким кислотным гидролизом были получены, например, олигосахариды из полисахарида Р. реппеп 14:
р-0-Са1-(1-3)-0-С1сМАс + р-0-01нЗМА1аАс-(1-4)-а-0-Са1АА1а-(1-2)-0-ГОЬ
В некоторых случаях частичный гидролиз имеет преимущества перед сольволизом. Например, из полисахарида Р.ш/дапз 0X19 сольаолизом удалось получить только один дисахаридный фрагмент, тогда как при гидролизе были выделены тетрасахарид и два трисахарида, содержащие практически всю информацию о строении повторяющегося звена.
Р. реппеп 14
4- 0.1М НС!
Р-ОЧЗИ1 -6)-а-0-01сМАс-( 1 -3)-а-1-0шМАс-( 1 -ЗуП-ОШАс
ß-D-Glc-{1-6)-a-D-GlcNAc-(1-3)-L-QuiNAc a-D-G!cNAc-(1-3)-ct-L-Qu¡NAc-(1-3)-D-GlclMAc
4.2.7. Определение последовательности с участках полисахгридной цепи, содержащих остатки урановых км слот, аудированных аминокислотами
Для определения последовательности остатков уроновых кислот, амидированных аминокислотами, нами был разработан метод, состоящий в мягком кислотном гидролизе микроколичеств полисахарида, боргидридном восстановлении, метилировании полученной смесл оиигосахаридов и ГЖХ-масс-спектрометрическом анализе. При этом гликозидные связи связи гексоз и гексозаминов расщепляются, а связи уроновых кислот и амидные связи сохраняются. Метилирование производных гидроксиаминокислот (серина или треонина) приводит к С-метилированию и элиминированию, остальные компоненты метилируются без побочных реакций. Образуется достаточно хорошо разделяющаяся в хромато-мазс-спектрометре смесь олигосахаридных продуктов, по масс-спектрам которых можно получить информацию о последовательности моносахаридных остатков и расположении аминокислот. При при^ьнгнда этого метода к полисахариду Р. mirabíiis 028, содержащему амиды гэлактуроновой кислоты с серином и лизином, образовались производные двух дисахаридов 1 и 2. Последовательность моносахаридов в полисахаридной цепи была определена по молекулярной массе по л ао лоз на восстанавливающем конце дисахаридов: лизи;-содержащий дисахзрид 3 содержит полиол нейтральной гексозы (m/z 235), а серин-содержащие продукты 5-С содержат полиол ге;:созамина (m/z 276. Было найдено единственное содерхащэе лизин соединение 3 - продукт нормального М,0-метилирозажш, с тс срэмя как серин-содержащий гликозил-полиол вместо ожидр.емого соединения 4 с Мг 640 превратился в ряд С-метилированн.ых и/иго*. нснасыщьниых соединений 5-8 (Табл. 4). ). Происхождение соединений 5-8 объяснено следующим образом Главный продукт 5 с М,- 654 является продуктом С-метилирозания остатка серина.- Другие производные соединения S представляли собой ненасыщенный гликозид б с Мг 608 - продукт отщепления метанола без С-метилироаания - и два его гомолога 7 и 8 ■>(МГ 622 и 636), содержащие одну и две С-метильные группы
Ас
я т/гамй 028
-4)-а-0-6а1А1уз-(1-4)-а-0-Оа1-{1-3)-а-0-6а1А8ег-(1-3)-Р-0-в1сМАс-(1.
4. 1. АсгО - МаНС03; 2. 0,1 М НС1, 100°, 3 ч; 3. ЫаВН4
а-П-Са1А1.у5МАс-(1-4)-а-0-Са1-о1 а-0-ва!АЗег-( 1 -ЗИЗ-О-ОсМАс-о! 1 2
АсМеЦСН2)4-
-СООМе
т/2 235
ОСММв Мер)—п
т/г 431
СНгОМэ —ОМа
—ОМе СНгОМе
т/г 276
СИ2°Мв
—ШаЛе.
СН2°Ме
3 4-8
Таблица Характерные ионы в масс-спектрах соединений 4-13
Соединение Я [М+Н]+ В
4 МеООССНСН2ОМе 641 " 348
5 МеООССМеСН2ОМе 655 362
6 МеООСС=СН2 609 316
7 МеООСС=СНМе 623 330
8 МеООСС=СДЛе2 637 344
9 МеООССМеСМе2ОМе 682 390
10 МеООСС=СМе2 637 344
11 МеООСС=СНМе 623 330
12 Ме 539 246
13 Н 525 232
При исследовании этим методом полисахарида Р. реппеп 12, содержащего только один остаток галахтуроноилтреонина, метилирование также сопровождалось С-метмлированием и отщеплением метанола. Масс-спектры главных продуктов соответствовали структурам, имеющим одинаковый углеводный скелет
GalA-GlcNAc-ol (m/z агшкона 276), что доказывало-присоединение галактуроноилтреонина к остатку аминосахара.
-4)-ß-D-GlcNAc-(1-4)-ß-D-GaINAc-(1-3)-ß-L-Rha-(1- Р. рзппеп 12 6 3
II " '
-40% Ас 1 .
a-D-Ga!AThr-(3-Ac -30%
11. Ас20 - NaHC03; 2. 0,1 М HCl, 100°, 3 ч; 3. NaBH4; 4. Mel - NaOH - ДМСО
Минорный продукт 9 содержал ди-С-метилированный остаток треонина. Главный компонент 10 образовался в результате элиминирования одной молекулы метанола и моно-С-метилироваьия. В большом количестве образовался также продукт 11 в результате потери молекулы метанола без С-метилирования. Обнаружены также моно- и диметиламиды 12 и 13, что указывает на присутствие в полисахариде первичного амида уроновой кислоты, и неамидированное производное 14, аналог которого найден также среди продуктов метилирования полисахарида Р. pennerí 12.
Полученные результаты показывают, что хотя метилирование амидов уроновых кислот с гидроксиаминокислотами осложняется побочными реакциями, предлагаемый метод можно успешно применять для структурного анализа.
4. Заключение
В настоящей работе проанализировано строение О-специфических полисахаридов, продуцируемых типовыми штаммами 12
О-серотипов P.mirsbilis и P.vulgaris и 14 нетипированными штаммами P.penneri. В результате установлено строение повторяющихся звеньев 19 различных полисахаридов, в том числе наиболее вирулентных серотипов и показано, что ряд штаммов Р.раппеп продуцирует одинаковые полисахариды.
Хотя изучены антигены не всех известных О-серотипов и штаммов Proteus, уже сейчас можно сделать выводы о характерных особенностях их структуры - присутствии неуглеводных компонентов, аминокислот и аминоалкилфосфатов, редко встречающихся в полисахаридах бактерий других типов, и высокой концентрации заряженных групп - в наибольшей степени присущих самым вирулентным уропатогенным штаммам. Это позволяет высказать предположение о связи вирулентности со спецификой структуры О-антигенов, что подтверждается аналогией со структурой капсульных полисахаридов уропатогенных £со//, являющихся фактором вирулентности этих бактерий. Механизм действия полисахаридов в качестве факторов вирулентности неизвестен. Возможно, они участвуют в адгезии бактерий к тканям организма-хозяина или влияют на их жизнеспособность.
Схемы серотипирования лишь приблизительно классифицируют О-антигены. С установлением структуры О-специфических полисахаридов значительной доли известных штаммов Proteus открыта возможность
типирования и идентификации О-антигенов по структуре полисахаридов,
1
далеко превышающая по своим возможностям серологические методы. Данные по структуре позволяют идентифицировать антигенные детерминанты и объяснять серологические взаимосвязи между антигенами. Нами, в частности доказана иммунодоминантная роль амидов уроновых кислот с аминокислотами и других неуглеводных компонентов в ряде О-антигенов.
В ходе исследования отработаны и оптимизированы подходы к анализу структуры полисахаридов на базе известных методов и созданных нами модификаций. Они позволяют быстро и надежно устанавливать структуры полисахаридов и используются в
•к
в исследовании О-спецкфическмх полисахаридов различных микроорганизмов.
Выводы
1. Установлены структуры 18 О-специфичесгаж полисахаридов Р. mirabilis, Р. vulgaris, и Р. pennen, в том числе нескольких наиболее патогенных штаммов и штаммов группы ОХ, испслькуемых для диагностики риккетсиозэв (тест Вайля-Феликса).
2. Идентифицированы новые компоненты О-антигенных полисахаридов - амиды аминокислот (аланина, серинг, треонина, лизина) с уроновыми кислотами (глюкуроновой и галактуроновой), производные моносахаридов (глюкозы, глюкозамина) с (R)- и (S)-молочной кислотой, Ы-(2-гидроксиэтил)-Р-аланин.
3. На основе существующих, модифицированных и разработанных методов создана эффективная технология определения структуры полисахаридов. Разработан метод определения положения аминокислот в полисахаридах, содержащих амиды, уроновых кислот с аминокислотами, основанный на частичном кислотном гидролизе полисахарида с последующим метилированием и ГЖХ-масс-спектрометрическим анализом. Усовершенствован?. программа компьютерного анализа 13С ЯМР спектров поли- и олигосахаридов.
4. Полученные данные служат химическим обоснованием серологической классификации О-антигенов Proteus, позволяющим классифицировать .антигены на основе их структуры. Неклассифицированные штаммы с новыми структурами могут быть помещены в общую схему классификации Proteus как отдельные серотипы.
5. Штаммы Proteus pennen впервые классифицированы по структуре О-антигеков. Найдено, что некоторые из считавшихся разными штаммов Р.реппеп продуцируют полисахариды одинакового строения, что следует учесть при построении классификации антигенов этого микроорганизма.
6, Полученные в ходе исследования фрагменты полисахаридов были использованы s серологических экспериментах, позволивших найти и и.у н од о м и н а нтн ы е компоненты антигенов и прояснить их серологические связи. Дохззэна иммунодоминантная роль амидов аминокислот с уроновыми кислотами и фосфат-связанных заместителей р.. антигенах, содержащих эти компоненты.
7. Найдено, что зирулентность серотипов Proteus коррелирует с присутствием в составе О-специфических полисахаридов заряженных компонентов - уроновых кислот, аминокислот и фосфатных фупп.
Основное содержание диссертации изложено в следующих
публикациях. <
- , ' ■ v
1. Виноградов Е.В., Шашков А.С., Книрель ЮА, Кочетков Н.К., Холодкоаа Е.В., Станиславский Е.С. Антигенные полисахариды бактерий. 22. Структура О-специфической лолисахаридной цепи липополисахарида Proteus hauseri. Биоорггн-жмия. 1987. Т. 13. С. 660-669.
2. Каса W., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kotelko К. Structure of the O-specific polysaccharide of Proteus mirabilis S 1959. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1S87.V.35. P. 431437.
3. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis cf 13C-n.mx data. Carbohydr. Res. 1983. V. 175. P. 59-75.
4. Виноградов E.B., Петрашик Д., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Структура О-специфического полисахарида Proteus mirabilis 027, содержащего аминокислоты и фосфоэтаноламин. Бмоорган^симия. 1988. Т. 14. С. 1282-128S
5. Vinogradov EV„ Каса W., Knirel Y.A., Rozalski A., Kochetkov N.K. Structural studies on the fucosamine-containing O-specffic polysaccharide of Proteus vulgaris 019. Eur. J. Biochem. 1989. V. 180. P. 95-39.
6. Vinogradov E.V., Krajewska-Pietrasik D., Kaca W., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Kochetkov N.K. Structure of Proteus mirabilis 027 O-specffic polysaccharide containing amino acids and phosphoethanolamine. Eur. J. Biochem. 1989. V. 185. P. 645-650.
7. Виноградов E.B., Каца В., Шашков А.С., Петрашик Д., Розальски А., Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Структура О-специфичесхого полисахарида
Proteus mirabilis 03 содержащего Ы-(2-гидроксиэтяп)-0-алап;:н. Биоорган.химия. 1989. Т. 15. С. 1431-1434.
8. Vinogradov E.V., Каса W., Shashkov A.S., Krsjewska-Pietrasik D., Rozabki A., Knirel Y A, Kochetkov N.K. The structure of Proieus mirabilis 03 0-specific polysaccharide containing A/-(2-hydroxyethyl)-D-slanine. Eur. J. Biochem. 1990. V. 18S. P. 645-651.
9. Vinogradov E.V., Kaca W., Knirel YA, Rozslski A., Kotslko K„ Kochetkov N.K. The structure of O-specific polysaccharide of Proteus yi/'garis 019 lipopolysaccharide. Adv. Exp. Med. Biol. 1920. V. 256. P. 127-130.
10. Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Kochetkov N.K., Sidorczyk Z., Swierzko A The structure of the Proteus penneri strain 14 O-specific polysaccharide containing D-and L-alanine. CXrbonydr. Res. 199 i. V. 219. P. C1-C3.
11. Vinogradov E.V., Sidorczyk Z., Swierzko A., Rozalski A., Daeva E.D., Shashkov A.S., Knirel YA, Kochetkov N.K. The structure of the O-specific polysaccharide chain of Proteus penneri strain 16 lipopolysaccharide. Eur. J. Biochem. 1991. V. 197. P. 93-103.
12. Vinogradov E.V., Каса W„ Rozalski A., Shashkov A.S., Cedzynski M., Knirei YA, Kochetkov N.K. Structural and immunochemical studies of G-specific polysaccharide of Proteus vuigaris 5/43 belonging to 0X19 group (O-variants). Eur. J. Biochem. 1991. V. 200. P. 195-201.
13. Knirel YA, Paramonov NA, Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Kochetkov N.K., Sidorczyk Z., Swierzko A. Structure of the O-specific polysaccharide chain of Proteus penneri 62 containing 2-acetamido-3-0-[(S)-1-carboxyelhyfl-2-deoxy-D-glucose (N-aceiylisomuramic acid). Carbohydr. Res. 1S92. V. 235. P. C19-C23.
14. Книрель ЮА, Виноградов E.B., Шашкоз A.C., Сидорчик 3., Каца В., Розальски А., Котелко К., Кочетков Н.К. Структура О-специфических полисахаридов Proteus. Доклады Академии нау:;. 1532. Т. 324. С. 333-333.
15. Кочетков Н.К., Виноградов Е.З., Книрель ЮА, Шашков А.С., Липкинд Г.М. Программа SCAN для структурного анализа полисахаридов на основе деииых ЯМР спектров с использованием персональных компьютеров. Биэорган.хшкя. 1992. Т. 18. С. 116-125.
16. Cedzynski М., Rozsteki A., Koteiko К., Кас& W./Vinogradov E.V., Knire! YA, Kochetkov N.K. Structural arid immunological studies of Proteus
mirabilis 033 О- specific polysaccharide. Med. Dosw. Mikrobiol. 1993. V. 45. P. 93-97.
17. Knirel Y A, Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Sidorczyk Z., Rozalski A., Radziejewska-Lebrecht J., Kaca W. Structural study of O-specific polysaccharides of Proteus. J. Carbohydr. Chem. 1993. V. 12. P. 379-414.
13. Sidorczyk Z., Swierzko A., Lipinska M., Vinogradov E.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A. Immunochemical studies of O-specific polysaccharide from Proteus penneri 14 iipopolysaccharide. Med. Dosw. Mikrobiol. 1993. V. 45. P. 85-87.
19. Sidorczyk Z., Swierzko A., Zych K., Shashkov A.S., Vindgradov E.V., Knirel Y.A. Immunochemical studies of O-specific polysaccharide of Proteus penneri 42 Iipopolysaccharide. Med. Dosw. Mikrobiol. 1993. V. 45. P. 85-92.
20. Виноградов E.B., Книрепь Ю.А., Кочетков H.K., Радзиевска-Лебрехт П., Каца В. Структурное изучение О-специфических ч полисахаридов Proteus mirabilis 028 и 3/6, содержащих амиды D-галактуроновсй кислоты с L-амииокислотами. С-Метипирование и ß-элиминирование в остатках L-серина и L-треонина при анализе методом метилирования. Биоорган.химия. 1993. Т. 19. С. 1132-1136.
21. Knirel Y.A., Paramonov N.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K., Sidorczyk Z., Zych К. 2-Acetamido-4-0-[(S)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucose, a new natural isomer of N-acetylmuramic acid from the O-specific polysaccharide of Proteus pennsri-25. Carbohydr.-Res. 1994. V. 259. P. C1-C3. .
22. Sidorczyk Z., Swierzko A., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Chernyak A.Ya„ Kononov L.O., Cedzynski M., Rozalski A., Kaca W., Shàshkov A.S., Kochetkov N.K. Structure and epitope specificity of the O-specific polysaccharide of Proteus penneri 12 (ATCC 33519} containing amide of D-galacturonic acid with L-threonine. Eur. J. Biochem. в печати.
Подписано к Отпечатано ва ротапринте в Производственном комбинате Литературного Фояла
л
печати/.J 199*/г.
Фариат букзгк 30x42/4 Объен п. л Зак. ^¿г^ Тир. 100
