Структура и генетика биосинтеза О-антигенов энтеробактерий рода Providencia тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

СТРУКТУРА И ГЕНЕТИКА БИОСИНТЕЗА О-АНТИГЕНОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ РОДА PROVIDENCIA

02.00.10 - Биоорганическая химия 03.01.03 -Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

На правах рукописи

005058282

ОВЧИННИКОВА

Ольга Геннадьевна

1 В МАЙ 2013

Москва-2013

005058282

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им. II.Д. Зелинского РАН (ИОХ РАН) и на факультете биологических наук и биотехнологии ТЕДА Нанкайского университета (г. Тянь-деинь, КНР).

Научный руководитель:

Книрель Юрий Александрович дС|(тор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Усов Анатолий Иванович доктор химических наук, профессор заведующий лабораторией ИОХ РАН

Ивашина Татьяна Владимировпа

кандидат биологических наук старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, Московская обл.)

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (Оболенск, Московская обл.)

Защита состоится 11 июня 2013 г. в 12.30 часов на заседании диссертационного совета Д 002.222.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии им. Н. Д Зелинского РАН по адресу: 119991 Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak2.ed.gov.ru.

Автореферат разослан 26 апреля 2013 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.222.01 доктор химических наук

Родиновская Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Соматические О-ангигены наряду с капсульными К-антигенами и жгутиковыми Н-антигенами представляют собой три основных типа биомолекул, на которых традиционно основывается классификация и идентификация грамотрицательных бактерий. С химической точки зрения О-антиген или О-специфический полисахарид (О-полисахарид, ОПС) представляет собой полисахаридную цепь S-формы липополисахарида (ЛПС) - гликоконьюгата, являющегося основным компонентом внешнего слоя наружной мембраны клеточной стенки бактерий. ОПС обычно построен из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев) и присоединяется к липидной части ЛПС (липиду А) через другой олигосахарид, называемый кором. Полисахаридная цепь направлена в сторону окружающей среды и содержит детерминанты иммуноспецифичности (эпитопы), которые являются сайтами связывания специфических антител, вырабатываемых системой адаптивного иммунитета в ответ на инфекцию и необходимых для эффективного фагоцитоза. В ходе эволюции сформировалось широкое структурное и, соответственно, иммунологическое разнообразие О-антигенных форм даже у бактерий одного вида. Оно служит основой для разработки серологических классификационных схем микроорганизмов, в которых серологически идентичные штаммы одного вида или нескольких близкородственных видов объединены в О-серогруппы. Структурные исследования ОПС позволяют выявить корреляцию между строением и иммуноспецифичностью О-антигенов и обосновать на химическом уровне часто наблюдающиеся серологические взаимосвязи штаммов внутри и между различными бактериальными таксонами.

В последнее время активно ведется разработка методов молекулярного типирования бактерий, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и технология на основе микрочипов. На генетическом уровне различия между структурами ОПС бактериальных клонов обусловлены полиморфизмом генного кластера О-антигена (ГКО) - определенного локуса генома, отвечающего за биосинтез О-полисахарида. Исследования генетики биосинтеза О-антигенов, направленные на решение таких фундаментальных задач, как выяснение молекулярных основ биосинтеза гликополимеров и изучение эволюционных путей формирования разнообразия антигенных форм, являются актуальными для современной науки. Функциональный анализ генов, участвующих в сборке О-звена и его полимеризации, позволяет выявлять гены, специфичные для каждой О-серогруппы, и использовать их в качестве маркеров для молекулярного типирования штаммов. Генетические данные также открывают пути для разработки биотехнологических подходов к производству гликовакцин нового поколения.

В рамках систематического структурно-генетического и иммунохимического изучения О-ангигенов условно-патогенных бактерий в лаборатории химии углеводов ИОХ РАН исследуется род Providencia семейства энгеробактерий (Enterobacteriaceae). Представители этого рода широко распространены в природе и являются частью нормальной микрофлоры кишечника человека, однако у людей с ослабленным иммунитетом они могут вызывать раневые инфекции, воспаления мочеполовых путей и кишечные заболевания, нередко становясь причиной внутрибольничных инфекций. Объединенная серологическая классификация трех наиболее важных в медицинском отношении видов Providencia - Р. alcalifaciens, Р. stuartii и Р. rustigianii - включает 63 О-серогруппы. К началу данной работы было установлено строение ОПС 13 О-серогрупп.

Ол 'V-

Цели и задачи работы. Настоящая работа направлена на создание химической основы для классификации Providencia по О-антигенам и обоснование серологических взаимосвязей между штаммами этих и других бактерий. Для этого требовалось установить строение ранее не изученных О-полисахаридов провиденсий. Еще одна цель работы - выяснение особенностей генетики биосинтеза О-антигенов Providencia. Для ее достижения необходимо было локализовать ГКО на хромосоме, секвенировать ГКО и провести функциональный анализ генов биосинтеза О-антигенов с использованием структурных данных; при необходимости получить биохимическое подтверждение предполагаемых функций генов.

Научная новизна работы заключается в установлении структур ОПС 23 О-серогрупп Providencia, из которых 22 структуры являются уникальными среди бактериальных полисахаридов. Близкое серологическое родство бактерий Р. stuartii 047 и Shigella boydii 05 объяснено наличием у них структурно идентичных О-антигенов. Получили обоснование серологические взаимосвязи, наблюдающиеся между некоторыми штаммами Providencia. В составе ОПС впервые идентифицирована б-дезокси-ылюкоза (L-хиновоза) и обнаружены ранее не встречавшиеся неуглеводные компоненты бактериальных гликанов, такие как (2Я,4Л)-2,4-дигидроксипентановая кислота, W-[(.S)-l-Kap6oKCH3Tiui]-L-anamiH (аланопин) и 2-фосфо-п-глицерамид

Впервые у бактерий Providencia ГКО локализован в полиморфном хромосомном локусе между генами срхА и yibK. В секвенированных ГКО девяти О-серогрупп предсказаны функции генов, кодирующих ферменты биосинтеза О-антигенов, включая синтез специфических моносахаридных компонентов ОПС.

Практическая ценность работы. Установленные структуры О-антигенов представляют собой химическую основу серологической классификации медицински важных видов Providencia, необходимой для серодиагностики инфекций и эпидемиологического мониторинга. Разработанные праймеры на основе генов, фланкирующих ГКО, могут быть использованы для амплифицирования и секвенирования ГКО неизученных О-серогрупп Providencia. Полученные нуклеотидные последовательности ГКО, депонированные в базу данных GenBank, могут быть использованы для разработки методов молекулярного типирования природных и клинических изолятов провиденсий.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 24 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены автором на одной российской и восьми международных конференциях

Личный вклад автора. Автор лично проводил выделение и очистку О-полисахаридов, химические анализы, интерпретацию спектров ЯМР и масс-спектров, создание библиотеки генов, биоинформатический анализ, получение рекомбинантных белков и тестирование их активности, а также участвовал в планировании экспериментов, обсуждении полученных результатов и формулировании выводов. Все статьи по материалам диссертации подготовлены при непосредственном участии автора.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, а также включает список литературы, список сокращений и приложения (табулированные данные спектров ЯМР О-полисахаридов, характеристики открытых рамок считывания ГКО). Работа изложена на 164 страницах, содержит 43 рисунка, 33 таблицы и 215 литературных ссылок.

2

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Содержание работы представлено в двух основных частях. В первой части описана общая стратегия структурного анализа, приведены установленные структуры ОПС Providencia, обсуждаются особенности их состава и корреляция с иммуноспецифичностью О-антигенов. Вторая часть посвящена локализации и биоинформатическому анализу секвенированных ГКО с использованием полученных структурных данных, а также биохимическому подтверждению функций генов пути биосинтеза нуклеотидного предшественника колитозы (GDP-колитозы).

1 Строение О-полисахаридов бактерий Providencia 1.1 Установление строения О-полисахаридов

В работе изучено строение ОПС типовых, штаммов 23 О-серогрупп Providencia (ОЗ, Об, 09, 022, 025, 027-032, 034-036, 040, 043, 044, 046-048, 049, 057 и 060) из Венгерской национальной коллекции медицинских бактерий (Национальный институт гигиены, Будапешт). ЛПС выделяли водно-фенольной экстракцией бактериальной массы по методу Вестфаля.* Для структурного анализа ОПС, свободный от липида А, получали мягким кислотным гидролизом ЛПС, расщепляющим кетозидную связь остатка 3-дезокси-в-л«ш//о-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo), которая соединяет кор с липидом А. ОПС выделяли хроматографией на геле Sephadex G-50.

Полисахариды некоторых О-серогрупп Providencia оказались неустойчивыми в этих условиях. Так, кислотная деградация ЛПС Р. alcalifaciens ОЗб привела к деполимеризации полисахаридной цепи по гликозидным связям остатков Kdo, присутствующих в О-звене. В результате вместо ОПС была выделена смесь олигосахаридов a-L-6dTal¿72R-(l-»3)-a-D-GlcpNAc-(l->7)-Kdo (R = Н или Ас), соответствующих химическому повторяющемуся звену О-полисахарида. В боковой цепи ОПС Р. alcalifaciens 06 присутствовали терминальные остатки 3,6-дидезокси-ь-ксг<ио-гексозы (колитозы), часть которых отщеплялась в условиях кислотной деградации. В обоих случаях дополнительно применялся альтернативный метод получения полимера для структурного анализа - мягкая щелочная деградация ЛПС, удаляющая О-связанные жирные кислоты в липиде А.

При необходимости полисахариды дополнительно очищали ионообменной хроматографией на геле DEAE-Trisacryl М. В случае Р. alcalifaciens ОЗ это позволило отделить нейтральный О ПС от кислого полисахарида, имеющего предположительно капсульное происхождение.

Для установления строения ОПС применялась комбинация традиционных химических методов анализа и спектроскопии 'Н и "С ЯМР." К первым относятся моносахаридный анализ методом ГЖХ ацетатов полиолов или ацетилированных метилгликозидов; идентификация аминокомпонентов и уроновых кислот с помощью аминокислотного и углеводного анализатора; анализ положений замещения моносахаридов методом метилирования, включающим идентификацию частично метилированных ацетатов полиолов методом ГЖХ/МС; определение абсолютных конфигурацией моносахаридов и неуглеводных компонентов (аминокислот и глицериновой кислоты, полученной из глицерамида) методом ГЖХ ацетилированных (¿)-2-окпигликозидов и (.S>2-o кг иловых эфиров, соответственно. Для определения абсолютной конфигурации моносахарида в простом эфире маннозы с 2,4-дигидроксипентановой кислотой эфир

Выращивание бактериальной массы проводилось в Институте микробиологии, биотехнологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша) под руководством профессора А. Рожальски.

Автор благодарит профессора А.С. Шашкова за съемку и помощь в интерпретации спектров ЯМР.

3

расщепляли действием ВСЬ. Определение конфигураций /У-(1-карбоксиэтильных) производных аминокислот -7V41-карбоксиэтил)лшина и ЛЧ1-карбоксиэтил)аланина - потребовало их выделения в индивидуальном виде с последующим сравнением спектров ЬС ЯМР со спектрами синтезированных стереоизомеров и измерением величины удельного оптического вращения. Следующая информация о структуре О-полисахаридов извлекалась из спектров ЯМР:

1. Степень регулярности, размер О-звена, природа моносахаридов и неуглеводных заместителей, наличие фосфатных групп (по одномерным спектрам 'Н, |3С и jlP ЯМР; примеры даны на рис. 1).

2. Размеры циклов и стереохимия моносахаридов, конфигурации гликозидных связей (по корреляциям в двумерных спектрах COSY, TOCSY и 'H,13CHSQC, константам спин-спинового взаимодействия вицинальных протонов, характерным химическим сдвигам 'Н и ЬС ЯМР).

3. Положения гликозилирования моносахаридов и места присоединения О-ацетильных, О-алкильных и фосфатных групп (по эффектам замещения - характерным смещениям сигналов ЬС ЯМР).

4. Положения УУ-ацильных заместителей аминосахаров и присутствие уроновых кислот в форме амидов (по корреляциям подвижных NH-протонов с СН-протонами при съемки спектров в H2O/D2O и протонов с атомами С. разделенными двумя и тремя связями, в спектре Н, JC НМВС).

5. Последовательность моносахаридов (по ядерным эффектам Оверхаузера в спектрах NOESY или ROESY, выявляющим сближенность протонов соседних остатков; по данным 'Н,ЬС НМВС).

6. Локализация фосфатных групп (по корреляциям протонов с атомом Р в спектре H,J Р НМВС).

7. Абсолютные конфигурации кислота лабильных моносахаридов, таких как 2,4-диамино-2,4-дидезоксифукоза (по закономерностям в эффектах гликозилирования в спектре JC ЯМР) и лактона 2,4-дигидроксипентановой кислоты (по ядерным эффектам Оверхаузера в спектре ROESY).

NAc (СО)

L

■ i' i 176

Al

В1

4wr

II

{Jifd

NAc (Me)

105 100 95 90 85

75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 ppm

NAc

1.0 ppm

Рис. ] - Спектры 13C ЯМР (А) и 'Н ЯМР (Б) ОПС Р. alcalifaciens 09. Структура ОПС приведена в таблице 1. Буквами обозначены моносахаридные остатки: А, В - Glc, С - Gal, D-F - GalNAc.

Следует отметить, что описанный ЯМР-спектроскопический подход для структурного анализа полисахаридов не является последовательным алгоритмом, однозначно приводящим к установлению структуры. Основными трудностями при расшифровке спектров являются перекрывание ключевых корреляционных пиков в двумерных спектрах ЯМР и нерегулярность структуры. Так, во многих О-серогруппах Providencia регулярность ОПС оказалась замаскированной наличием О-ацетильных групп в нестехиометрическом количестве. Для установления строения таких ОПС проводилось О-дезацетилирование действием 12% NH4OH, анализ спектров ЯМР полученного регулярного полимера и локализация О-ацетильных групп по их дезэкранирующему эффекту на ядра 'Н и |3С в спектрах ЯМР исходного полисахарида.

В ряде сложных случаев для подтверждения структуры ОПС подвергали распаду по Смиту, включающему окисление NaI04, восстановление NaBH4 и мягкий кислотный гидролиз 2% НОАс. Полученные олигосахаридные фрагменты выделяли хроматографией на геле TSK HW-40, их строение устанавливали методами спектроскопии ЯМР, как описано выше для ОПС, и подтверждали определением молекулярных масс с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (ESI-MS).

Так, распад по Смиту ОПС Р. stuartii 043 привел к олигосахариду с эритроновой кислотой (ЕгуА) в виде агликона, которая образовалась из остатка GlcA, замещенного в положение 4:

->3)-p-D-GalpA6-L-Ser-(l->3)-p-D-GlcpNAc-(l-^2)-a-D-Quip4NAc-(1^4)-p-D-GlcpA-(l-^

1. NaI04; 2. NaBH„; 3. НОАс P-D-GaIpA6-L-Ser-(l->3)-p-D-GlcpNAc-(l->2)-a-D-Qui/)4NAc-(1^3)-L-EryA

При распаде по Смиту О-дезацетилированного ОПС Р. stuartii 047 наряду с основным продуктом I был выделен побочный продукт 2, являющийся результатом неполного расщепления гликозидной связи окисленного остатка Gal при мягком кислотном гидролизе:

->3)-a-D-GlcpNAc-(l->2)-p-D-Galp-( 1 ->4)-p-D-Maiv>-( 1 ->3)-p-D-Man/?-( 1 ->4)-p-D-Glc/?A-( 1 н>

a-L-Rhap-(l->3)J l 1. NaI04; 2. NaBH4; 3. HOAc p-D-Manp-(l->3)-p-D-Mary7-(l-»3)-L-EryA 1 a-D-GlcpNAc-( 1 ->2)-p-D-Gal*-( 1 ->4)-P-D-Manp-( 1 ->3)-p-D-Manp-( 1 -*3)-L-EryA 2

Для выделения необычных компонентов ОПС и олигосахаридных фрагментов применялись также другие химические подходы. Так, обработка ОПС Р. alcalifaciens 022 48% HF привела к дефосфорилированному ОПС и первичному амиду глицериновой кислоты (GroAN), который был идентифицирован по спектру 'Н ЯМР в смеси H20/D20 (9:1) и ESI-масс-спектру. Дисахаридный фрагмент a-D-GlcpNAc30(S-lac)-(l->3)-L-FucpNAc, содержащий простой эфир GIcNAc с молочной

кислотой (lac), получен избирательным сольволизом ОПС Р. alcalifaciens 032 трифторметансульфокислотой. Сольволиз с последующим гидролизом CF3CO2H использован также для выделения в индивидуальном видеЛ^-(1-карбоксиэтил)аланинаиз ОПС Р. alcalifaciens 035.

Большинство изученных штаммов Providencia продуцируют не только ЛПС S-типа, но и некоторые количества ЛПС R- и SR-типов, углеводная часть которых ограничена кором или кором с присоединенным одним О-звеном, соответственно. Благодаря этому в результате мягкой кислотной деградации ЛПС наряду с ОПС выделяли также соответствующие олигосахариды. Анализ методом ESI-MS позволил определить молекулярную массу О-звена как разницу между молекулярными массами олигосахаридов обоих типов и тем самым независимо подтвердить структуру ОПС (рис. 2)." В этом же анализе выяснялось, присутствуют ли уроновые кислоты в свободной форме или в форме первичного амида, имеющих различные молекулярные массы.

2870,87

- Qui3NFo,üalAN,GalNAc,Gal, (О-эвено) &m 916,33

ñ 4

1954,54 2077,54

1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 miz

Рис. 2 - ESI-масс-спектр олигосахаридной фракции из ЛПС SR- и R-типов Р. alcalifaciens ОЗ. Приведены массы (Да) моноизотопных молекулярных ионов с остатком Kdo в ангидро-форме.

В штаммах трех серогрупп (03, 09 и 034) олигосахариды, полученные из ЛПС SR-типа, подвергали дополнительной очистке методом ВЭЖХ на обращенной фазе и использовачи для идентификации моносахарида О-звена, присоединенного непосредственно к кору в ЛПС SR-типа. Тем самым определяли строение биологического О-звена (см. ниже).

1.2 Особенности состава и строения О-полисахаридов

Структуры ОПС Providencia, установленные в настоящей работе, приведены в таблице 1. Все они специфичны для своих О-серогрупп, и, таким образом, отнесение изученных штаммов Providencia в отдельные О-серогруппы является обоснованным. Более того, эти структуры, за исключением ОПС серогруппы 047, являются уникальными среди известных структур бактериальных полисахаридов. Серологически родственные штаммы P. stuartii 047 и Shigella boydii 05 имеют идентичные ОПС, включая одинаковые положение и степень О-ацетилирования.

Изученные ОПС представляют собой гетерополисахариды, построенные из линейных или разветвленных О-звеньев, размер которых варьируется от трисахарида до гептасахарида. Общей особенностью большинства ОПС (-90%) является присутствие в них кислотных функций.

'Автор благодарит к.х.н. А.Н. Кондакову за съемку ESI-масс-спектров высокого разрешения.

Таблица 1 - Структуры О-полисахаридов бактерий рода Providencia, установленные в настоящей работе

Вид и серогруппа Штамм Структура О-полисахарида

Р. alcalifaciens 03:H3 3300/Р25 ->3)-a-D-Ga|pAN-(1^4)-a-D-Ga|pNAc-(l->4)-a-D-Galp-(l->3)-p-D-GalpNAc-(l->* a-D-Qujp3NFo-(l-»4)-l

Р. alcalifaciens Об:Н6 2634 ^4)-p-D-GlcpA-(l->3)-p-D-GlcpNAc-(l-> a-Colp-( l->2)-p-D-Galp-( l^-3)-p-D-GlcpNAc-( 1->6)-1

Р. alcalifaciens 09:Н8 5032 ->2)-p-d-Glcp-(l->6)-a-d-Galp-(l->6)-a-d-GaIpNAc-(l->4)-a-d-GajpNAc-(l->3)-a-d-GalpNAc-(l->* P-D-Glcp-(1->3)J

Р. alcalifaciens 022:Н21 166/49 ->4)-p-D-GaIpNAc-(l->4)-p-D-Galp-(l-»3)-p-D-FucpNAc4N-(l->* D-Gro AN-(2-P-3 )-l

Р. alcalifaciens 025:К2:Н4 5350/50 ->6)-p-D-GalpNAc-(l->4)-p-D-GlqpA-(l-»-3)-p-D-GlcpNAc-(l-> 2S, 5i?-alaLys-(2-6)-a-D-Ga!pA-( 1 ->-4)-l

Р. alcalifaciens 027:Н17 5824/50 ->2)-a-D-Quip4NFo-(l->4)-a-D-Glc/iA-(l->4)-P-D-Glcp-(l->3)-P-D-GalpNAc-(l-> -70% АсО-6-l

Р. alcalifaciens 028:1Ш 945/49 ->3)-p-D-GlcpNAc-(l->3)-a-L-Fuc/>-(l^-3)-P-D-GIcpNAc-(l-> a-d-GlcpA-(l-»3)-a-l-Fuc/?-(l-»4)J

Р. alcalifaciens 029:Н2 575/48 -»6)-a-d-GlcpNAc-( 1 ->3)-a-L-FucpNAc-( 1 ->3)-a-D-GlcpNAc-( 1 -> P-D-Glcp-(l->4)-l

Р. alcalifaciens 030:Н19 19372 ->2)-p-D-Quip4NFo-( 1 ->2)-p-D-Rib/-( l->4)-p-D-GlcpA-( l->4)-p-d-GlcpA-( 1 ->3)-a-D-FucpNAc4N-(l->-*

Р. alcalifaciens 031:Н- 5867 ->3)-a-D-Gal/?-(l->4)-p-D-GajpNAc-(l-»3)-P-D-GalpNAc-(l-» 2R,^-Dpa-(2^)-p-D-Manp-(l->4)-l

Р. alcalifaciens 032:Н11 1853/49 ->6)-a-D-GlcpNAc-( 1 ->3)-a-L-FucpNAc-( 1 ->3)-a-D-GIcpNAc-( l-> S-lac-3-l p-d-Glc/;-(l->4)-l

Р. гш^апи 034:Н- Нал ^)-Р-о-01с/)А-(1->4)-а-ь-Риср-(1->2)-а-о-Ма1¥'-(1-->2)-а-ь-Риср-(1->2)-р-о-С1ср-(1->3)-р-о-С1срЫАс-(1-^* а-о-Оа(рЫАс-(1-»3)-1

Р. а1саП/аает 035:Н18 901/49 ->4)-а-о-Оа|рЫАс-( 1^6)-а-о-аср-( 1->4)-р-о-01срА"( 1 ->3)-р-о-Оа1рНАс-( 1 1-(6<-1 )-р-о-(Зи\р4Ы-(4-2)-2Х «-А1о

Р. а!саИ/ас1епз 036:Н- 1757/7 ->7)-р-К.аор-(2^-3)-а-ь-6(1Та1р-(1->3)-а-п-С1срЫАс-(1-> -70% АсО-2-1

Р. акаИ/ааею 040:Н23 3261/51 ^4)-р-о-0и|рЗНРо-(1->-3)-а-в-Са1р-(1->3)-р-о-О1срА-(1->3)-Р-о-Са1рКАс-(1->**

Р. тагШ 043:Н28 1746/51 ->2)-а-0-ди!р4ЫАс-(1-И)-Р-п-01срА-(1->'3)-р-0а1рА-(1->3)-р-П-01срМАс-(1^ ь-Бег-б-!

Р. НиагШ 044:Н4 3768/51 ->4)-а-0-Са!рЫАс-(1->3)-а-Ь-Риср-(1->3)-а-0-01ср-(1->4)-а-ь-Ри1р-(1->3)-а-0-01срЫАс-(1-> Р-п-С1срА-(1->4)-1

Р. акаП/аЫею 046:Н18 1035/49 ->3)-р-0-01срА-(1->4)-а-ь-Риср-(1-И)-а-ьРиср-(1->2)-р-0-01ср-(1-)'3)-а-0-01срКАс-(1^ а-о-01ср-(1->3)-1 -80% АсО-6-1

Р. зшапп 047:Н4 3646/51 -35% АсО-6-| ->2)-р-о-Сф-(1->4)-Р-в-Ма1^-(1->-3)-р-п-Мапр-(1->4)-Р-п-01срА-(1->3)-а-п-01срЫАс-(1^-

Р. акаН/аает 048:Н25 918/49 ->3)-а-0-Магр-(1->2)-а-ь-Риср-(1->2)-р-0-01срА-(1->3)-а-0-Оа!рЫАс-(1-> АсО-4-1

Р. ¡тагШ 049:Н4 5875/52 ^4)-а-о-Оа|р-(1->6)-р-о-Оа1р-(1-^3)-Р-о-Оа^Ас-(1->

Р. МиагШ 057:Н29" 2615/53 ->2)-а-0-Са1р-(1->-3)-а-1-Ш1ар-(1->4)-а-0-01ср-(1->4)-а-0-Са1рА-(1->3)-Р-0-01с/)ЫАс-(1-> -75% АсО-2-1 ьА1а-6-1

Р. акаН/аает 060:Н24 1068/56 ^4)-р-0-01ср-(1^3)-а-о-0а|р-(1^4)-р-П-0а|рЫАс-(1->4)-р-о-01срА-(1->3)-р-о-0а1рЫАс-(1-» ь8ег-6-1

"Структура соответствует биологическому повторяющемуся звену ОПС. **В ОПС присутствует незначительное количество О-ацетильных групп.

Принятые сокращения в таблице 1. Моносахариды: Col - 3,б-дидезокси-Ь-ксило-гексоза (колитоза); 6dTal - 6-дезокситалоза; Fue - фукоза; FucNAc - 2-ацетамидо-2-дезоксифукоза; FucNAc4N -4-амино-2-ацетамидо-2,4-дидезоксифукоза; GalA, GalAN - галактуроновая кислота, галаюуронамид; GlcA - плюкуроновая кислота; Qui - б-дезоксиглюкоза (хиновоза); Qui3NFo - 3-формамидо-3-дезоксихиновоза; Qui4NAc, Qui4NFo - 4-ацетамидо-, 4-формамидо-4-дезоксихиновоза; Kdo -3-дезокси-о-л<анно-окт-2-улозоновая кислота; Rha - рамноза. Неуглеводные заместители: alaLys -Л'£-(1-карбоксиэтил)лизин (аланинолизин); Alo - Л'-(1-карбоксиэтил)аланил (аланопин); Dpa -2,4-дигидроксипентановая кислота; GroAN - глицерамид; lac - 1-карбоксиэтил; Р - фосфат.

Из моносахаридов чаще всего встречаются типичные для энтеробактерий аминосахара d-G1cNAc и d-GalNAc, а также d-Glc, d-Gal и d-G1cA. Реже присутствуют d-Rib, d-Man, l-Rha, L-Fuc, D-GalA, различные 6-дезоксиаминосахара и D-FucNAc4N. Кроме того, обнаружены сахара, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, такие как l-Qui, L-6dTal, Col и Kdo:

L-Qui впервые в полисахаридах достоверно идентифицирована в настоящей работе в ОПС P. stuartii 044 (ранее было сделано предположение, что она входит в состав ЛПС Legionellafeeleii). Впоследствии L-Qui была обнаружена также в ОПС Yersinia pseudotuberculosis 012, имеющим с ОПС P. stuartii 044 общий дисахаридный фрагмент a-L-Qui/j-(l->3)-D-Glc/?NAc.

L-6dTal и Kdo входят в состав ОПС P. alcalifaciens ОЗб. Ранее L-6dTal была обнаружена в ряде других гликанов, в том числе в ОПС Escherichia coli 088, и она ответственна за перекрестную серологическую реакцию ЛПС этой бактерии и Р. alcalifaciens 036. Kdo является обязательным компонентом кора ЛПС, однако в ОПС ее обнаруживают редко. Кроме провиденсий, Kdo была найдена только в ОПС энтеробактерий рода Cronobacter и таксономически отдаленной морской бактерии Pseudoalteromonasßavipulchra. Интересно, что ОПС Р. alcalifaciens 036 обладает заметным структурным сходством с полисахаридом Р. ßavipulchra, имеющим структуру ->7)-a-Kdo-(2-»3)-a-L-6dTal4Ac-(l ->3)-ß-D-Gal-( 1 -» и отличающимся только одним моносахаридом (Gal вместо GlcNAc), положением О-ацетильной группы и аномерной конфигурацией остатка Kdo.

Терминальный остаток колитозы входит в состав общего трисахаридного фрагмента a-Col-(l->2)-ß-D-Gal-(l-»3)-ß-D-GlcNAc, который присутствует в ОПС Р. alcalifaciens 06, Е. coli 055 и Salmonella enterica 050 (две последние бактерии продуцируют идентичные ОПС) и очевидно обусловливает наблюдаемое между ними серологическиое родство. Этот же трисахаридный мотив характерен для ОПС Pseudoalteromonas tetraodonis I AM 14160T, Aeromonas trota и капсульного полисахарида Vibrio cholerae 0139, но их серологические исследования не проводились. Наличие такого мотива предположительно связано с молекулярной мимикрией, позволяющей патогенным бактериям избегать адаптивного иммунного ответа Действительно, колитоза является 3-дезокси-аналогом L-фукозы, и таким образом трисахаридный фрагмент О-антигенов имитирует антигенную детерминанту Н типа 1, связанную со структурой a-L-Fuc-(l-»2)-ß-D-Gal-(l->3)-ß-D-GlcNAc.

СН2ОН

l-Qui

l-6dTal

Col

Kdo

Карбоксильные группы уроновых кислот присутствуют в свободной форме или в виде амидов. В ОПС Р. alcalifaciens ОЗ обнаружен первичный амид D-галактуроновой кислоты (D-GalAN), однако более распространены амиды d-G1cA и d-GalA с аминокислотами, включая l-аланин (серогруппа 057), L-серин (серогруппы 043 и 060) и производное аминокислоты семейства опинов -N*-[(R)- 1-карбоксиэтилН-лизин (так называемый аланинолизин, 2.S,5/í-alaLys) в серогруппе 025:

.соон

conh

& У"

он

D-GaIA6(L-Ala)

,СООН

hcTY

CONH

но)-О

<он>~он

D-GalAó(L-Ser)

ХООН

CONH

HOOO^-N^^/v^^-C СН3 CONH

D-GalAô^SM-alaLys)

d-GlcA6(l-Ser)

Амиды D-GlcA и d-GalA с 25,<S/?-alaLys и стереоизомерным ii'.SÎ'-alaLys обеспечивают перекрестную серологическую реактивность О-антигена P. alcalifaciens 025 и ЛПС серогрупп 014 и 023. Как оказалось, абсолютная конфигурация 1-карбоксиэтильной группы, различная в серогруппах 014,023 и 025, существенного иммунологического значения не имеет.

Аминогруппы аминосахаров обычно ацетилированы, однако 6-дезоксиаминосахара с аминогруппой в положении 3 или 4 могут нести ЛЦюрмильную группу. D-FucNAc4N в ОПС P. alcalifaciens 022 и ОЗО, как и во всех других известных РисЫАс4Ы-содержащих полисахаридах бактерий, имеет свободную аминогруппу в положении 4. Ее сочетание с фосфатной группой или карбоксильной группой уроновой кислоты придает указанным ОПС цвиперионный характер. Отметим, что в отличие от нейтральных и кислых полисахаридов, которые индуцируют Т-независимый иммунный ответ без формирования иммунной памяти, цвиггерионные полисахариды являются Т-зависимыми антигенами и обладают иммуномодуляторными свойствами.

В ОПС P. alcalifaciens 035 присутствует еще один представитель семейства опинов -ЛЧ(5)-1-карбоксиэтилН-аланин (аланопин, 2S,4S-Mo), являющийся АЧщильным заместителем D-Qui4N (рис. 3). В полисахаридах бактерий он обнаружен впервые в настоящей работе и одновременно в ОПС Proteus vulgaris 076, а также в коре ЛПС Proteus mirabilis 06 и 057, где он первоначально был ошибочно идентифицирован как дипептид аланина. Благодаря присутствию аланопина ЛПС всех перечисленных бактерий дают перекрестные серологические реакции, сн.

сн3 сн3

Vr

çh3 chîoh

СН2ОН

J——0L

¿H соон

НзС^-^у1

снгон

o-Qu¡4N(2S.«-Alo) D-GlcNAc30(S-lac) 0-Man40(2«,«-Dpa) i>Man40(2&-«-Dpl)

Рис. 3 -ЛГ-Аланопильное производное Qu¡4N и простые эфиры GlcNAc и Man с гидроксикислотами.

Кроме аминокислот; в ОПС Providencia обнаружены гидроксикислоты (рис. 3). В ОПС Р. alcalifaciens 032 (5)-молочная кислота (S-lac) образует простой эфир с остатком D-GIcNAc, называемый /V-ацетилизомурамовой кислотой. В отличие от Я-1ас-изомера - N-ацетилмурамовой кислоты, широко распространенной как компонент пептидогликана клеточной стенки бактерий, -

10

Л^-ацегилизомурамовая кислота ранее была обнаружена только в ОПС Proteuspenneri 031 и 064. Интересно, что как у протея так и у провиденсий существуют О-антигенные формы, имеющие такую же структуру основной цепи, как ЛЧас-содержащие ОПС, но отличающиеся отсутствием молочной кислоты. Таким О-антигеном, параллельным О-антигену Р. alcalifaciens 032, является ОПС Р. alcalifaciens 029, также изученный в настоящей работе. Идентичность углеводного скелета очевидно объясняет наблюдаемую серологическую кросс-реактивность этих бактерий.

Уникальным компонентом ОПС Р. alcalifaciens 031 является (2R4R)-2,4-дигидрокси-пентановая кислота (Dpa), которая образует простой эфир с D-Man и частично находится в форме 1,4-лактона (Dpi) (рис. 3). Это первый случай ее обнаружения в бактериальных полисахаридах. Эфир диастереомерной (2S,4R)-Dp& с D-GlcNAc был одновременно найден в ОПС Р. alcalifaciens 08.

Хотя фосфорилирование нетипично для О-антигенов Providencia, в изученных штаммах найден ОПС, в котором фосфатная группа присутствует в составе заместителя 2-фосфо-D-глицерамида (серогруппа 022). Семь ОПС Providencia включают О-ацетильные группы, которые во всех серогруппах, за исключением 048, присутствуют в нестехиометрическом количестве.

В таблице 1 приведены установленные (для серогрупп ОЗ, 09 и 034 в результате структурного анализа и серогрупп 022 и 030 при генетическом анализе, см. ниже) или предполагаемые структуры биологических О-звеньев - олигосахаридов, которые собираются и затем полимеризуются в ходе биосинтеза ОПС. Как и в других энтеробактериях, в ОПС Providencia первым моносахаридом О-звена, перенос которого из нуклеотидного предшественника на липидный носитель инициирует биосинтез О-антигена, оказался Л-ацетил-п-гексозамин. Гликозидная связь этого моносахарида, соединяющая первое О-звено ОПС с мэром и образующаяся при участии фермента лигазы (олигосахарилтрансферазы), во всех изученных ЛПС имеет p-конфигурацию. В то же время за полимеризацию О-звеньев отвечает фермент О-антиген-полимераза, и в зависимости от специфичности этого фермента гликозидная связь, соединяющая О-звенья друг с другом, может иметь как а-, так и p-конфигурацию. Например, в О-антигене Р. alcalifaciens 09 остаток GalNAc в первом О-звене имеет (1-конфигурацию, а во всех остальных звеньях - а-конфигурацию.

Наиболее часто (в 12 О-серогруппах) первым моносахаридом О-звена является GlcNAc, а в остальных О-серогруппах, за исключением 022 и 030, его место занимает GalNAc. ОПС Р. alcalifaciens ОЗО не содержит в своем составе iV-ацетилгексозаминов, а в ОПС Р. alcalifaciens 022 к остатку GalNAc присоединен 2-фосфо-о-глицерамид, что делает его участие в инициации биосинтеза О-антигена маловероятным. Однако оба эти ОПС содержат диаминосахар FucNAc4N, известный как первый моносахарид О-звена в ОПС Shigella sonnei. То, что именно с этого моносахарида начинаются также О-звенья Р. alcalifaciens 022 и ОЗО, подтверждено в ходе функционального анализа генов биосинтеза О-антигенов этих бактерий (раздел 2.3).

Как видно из структур биологических О-звеньев, показанных в таблице 1, в ОПС 110-серогрупп на невосстанавливающем конце полисахаридной цепи находятся наиболее необычные компоненты (Kdo, Col, Лг-ацильные производные Qui3N и Qui4N, эфиры с 1ас и Dpa, амид с alaLys, фосфат GroAN). Эти терминальные группы наиболее доступны для взаимодействий с другими биологическими объектами, включая клетки иммунной системы и антитела. Их уникальность увеличивает антигенное разнообразие бактерий и может давать им преимущества в различных экологических нишах, в частности, помогать патогенам избегать защитного действия механизмов приобретенного иммунитета.

И

2 Характеристика генных кластеров О-антигенов Providencia 2.1 Локализация и организация генных кластеров О-антигенов

Гены синтеза специфических моносахаридных компонентов О-антигенов являются наиболее консервативными из генов, входящих в ГКО, и имеют высокую степень гомологии между бактериями независимо от их таксономического положения. Благодаря этому такие гены могут использоваться для локализации ГКО путем обнаружения гомологичных им открытых рамок считывания (ОРС) при полногеномном анализе бактерий с неизвестным положением ГКО. До нашей работы к таким бактериям относились и провиденсии.

Анализ секвенированных геномов двух штаммов Providencia с установленными структурами О-антигенов - Р. aicalifaciens 019 и Р. stuartii 047 (номера доступа GenBank ABXWOOOOOOOO и ABJDOOOOOOOO, соответственно) выявил ОРС, гомологичные генам биосинтеза dTDP-D-Fuc3NAc, dTDP-L-Rha и GDP-D-Man - нуклеотидных предшественников моносахаридных компонентов О-антигенов этих штаммов. В обоих геномах искомые ОРС находились на хромосоме между двумя генами «домашнего хозяйства» срхА и yibK, кодирующими двухкомпонентную сенсорную киназу и тРНК/рРНК-метилтрансферазу, соответственно. В геноме Р. rustigianii DSM 4541 (номер доступа GenBank ABXV00000000) с неизвестной структурой О-антигена область cpxA-yibK также содержала гены, ассоциированные с биосинтезом полисахарида. На основании этих данных сделано предположение, что ГКО бактерий рода Providencia локализован между генами срхА и yibK. Оно было подтверждено дальнейшими исследованиями.

На основе нуклеотидных последовательностей фланкирующих генов срхА и yibK разработаны праймеры, с помощью которых методом ПЦР длинных фрагментов амплифицированы ГКО штаммов Providencia 022, 028, ОЗО, ОЗб, 039, 040 и 044. Продукты ПЦР размером -20000 пар нуклеотидов фрагментировали и клонировали в плазмидный вектор pUC18 для создания библиотеки генов и секвенирования методом дробовика. Кроме того, ГКО Р. aicalifaciens Об, идентичный ГКО серогруппы 039 (см. ниже), был амплифицирован и секвенирован по частям, используя праймеры, созданные на основе нуклеотидной последовательности ГКО Р. aicalifaciens 039.

Организация ГКО изученных штаммов Providencia и соответствующие структуры О-антигенов показаны на рис. 4. ГКО различаются по размеру и содержат от 10 до 20 ОРС, причем все они, за исключением двух генов транспозаз в ГКО Р. aicalifaciens 022, транскрибируются в одинаковом направлении от срхА к yibK. Функции ОРС предсказаны с помощью программы BLASTp на основании гомологии с аннотированными генами биосинтеза полисахаридов других бактерий, представленными в базе данных генетических последовательностей GenBank.

В каждом ГКО обнаружен специфический набор генов, включая а) гены биосинтеза нуклеотидных предшественников моносахаридов, являющихся специфическими компонентами О-антигенов, б) гены гликозилтрансфераз, участвующих в сборке О-звена на липидном носителе на цитоплазматической стороне внутренней мембраны, и в) гены процессинга О-антигена -трансмембранного переноса О-звена и полимеризации. Функции генов, предсказанные in silico, соответствовали установленным структурам О-антигенов девяти штаммов, в то время как штамм Р. aicalifaciens 039 имел ГКО, практически идентичный ГКО Р. aicalifaciens Об, но другую структуру О-антигена, совпадающую со структурой О-антигена Р. aicalifaciens 035 (таблица 1).

P. tilcíilifadens Об )-р-С.1сЛ-( I ->3Hl-GlcNAc-(l -»

a.Cül-(l->2)-P-üal-(l->3)|)-GkN'.\c-(l-»h)J

GDP-Col . UDP-GlcA l'DP-Gal

! \ i гнГ i i lit i ~i t it t t il п n

cp-\A hzï ОТ gmd colC coll) gmm nwfiC mauB GT >i-V GT agit GT galE »-и нzb wer yîbK

P. alcalifacíens 019 ->2)-|î-Fuc3NAc4Ac-(l->3)-n-GlcNAc-( l->4)-a-Gnl-( l->4)-|l-Gal-(l ->3H!-GlcNAc-(l-

i-pyr42-i.6)J

dTDP-Fuc3NAc ОЛс руг UDP-Gal

П M i i ti ni n ¡n

fill

P. alcaUfaciens 022 -+4)-ß-GalNAc-(l->4)-ß-Gal-(l->3)-ß-FucNAc4N-(l->

U-GroAN-(2-P-3)J

CDP-GroAN UDP-FucNAc4.\' UDP-Gal

(3 I И i i \> I ) И i \ I n n

срхЛ "11 fifi «I» af4 GT .rrv CTvbzXuhgÏ \rbgZ gulE CU] m ríhK

tnp

P. ateaUfaciem 028 -»3)-ß-GkNAc-(l-»3)-o-L-Fuc-(l-»3)-|!-GIcNAc-( 1-

a-GlcA-( 1 ->3)-n-L-Fuc-< 1 ->4)J

GDP-L-Fuc (¡DP-GlcA UDP-Gal

I I

P. ukaUfutiens 030 ->2V(l-Qui4NFo-(1 ->2)-ß-Rib-( l->4)-|l-GlcA-{ l->4)-(i-G!cA-(l -»3)-a-FucNAc4\-( 1 -

dTDP-Qui4NFo UDP-GlcA UDP-FucNAc4N UDP-Gal

O I i i i 1 i i tu \ i i i ib I H n

ерхЛ i»f rmlA ira nal GT GT »-"Г GT ml GT *bgX nbgï «bgZ £„•!£ inj w.-i' WM:

P. alcaUfatk'ns 036 ->7)-|i-Kdo-(2->3)-<i-L-(idTal.(l-»3)-a-GlcNAc-(l->

АсО-2-l (-70%)

dTDP-L-OdTal OAc CMPKdo UDP-Gal

D i и i i н i nmnn^i n

t/u.) —-— Ш GT GT AT nzx кг —-Í-.AA' »fC «M »='■ »=c г/Ж

i-W í-л

й alcali/miens 040 ->4)-(!-Oui3NFo-( l->3)-a-Gal-( l->31-(l-G!t'A-(l->3)-P-GalNAt-( I->

ítTDP-OiiilNFo OAc UDP-GlcA LntiPP-GalNAc UDP-Gal

CD i mrn e t h ' п t Ii h п

c/>.r.4 í/J/F rmlA ~--— nr.r GT H"v (7Г 4 T mGT gnu gulE ит« и~h vre yihK

qdt

o i 2 3 -/ í 6 ? t¡ » io si i: и ¡4 m /о r j,4 19 ;i> 21 :: ;í .v кь

! sluartii 044 -»4)'Ci-Ga]N'Ac-(l->.l)-n-L-Fuc-(l->3)-ii-Ck'-(l->4)-o-L-Oui-(l->3)-a-GlcNAc-(l-»

|l-GlcA-(l->4)J

GDP-L-Qui GDP-I. Fue L'DP-GlcA UDIMül

□ OD I I I H~M fr ¡> i и t i 1 ti И —ГПП

rpx.4 ИТ/ int нтг GT GT u n GT GT </"' Я""' J< > X""" GT топ В u¿,¡ и u-h »rr <,'./.'£ у/ЛА'

AcO-6-. (-35 14 o)

Р. лгио/т// 047 -»2)-p-Gal-( 1 -И )-p-Man-( 1 -+3)-p-Man-(l -H)-P-GlcA-( 1 ->3)-a-GlcNAc-( 1 -»

a-L-Rha-(l-»3}-Í

dTDP-L-Rha GDP-Man UDP-GlcA l.'DP-Gal

t p.U \xzi —--——--— GT ОТ v.rv ОТ GT matiC та ti В </trrf ОТ ч;« кгЛ иге уа/£ yibK

rml

Р. rustigianü DSM 4541 UndPP-GalNAc VDP-GíA

I \ i H E ¡> i> fr » & 1) E i>

í-pxA iirt<B t:i?J) uti hn'F GT ОТ ur\ tíT gnu a11IE vihK

■I 1 2 J * 5 Л 7 .v !<! 11 12 И 14 15 Id 17 la 14 Jfi 21 22 2i 2* Lü

Рис. 4 - Организация ГКО Providencia. Гены трансфераз обозначены следующим образом: GT -гликозилтрансфераза, АТ - ацетилтрансфераза, РТ - пируваттрансфераза. Приведенные структуры О-антигенов, за исключением О-антигена Р. atcalifaciens 019, установлены в настоящей работе, руг - 1-карбоксиэтилиден (ацеталь пировиноградной кислоты). Нуклеотидные последовательности ГКО серогрупп 022, 028, 030, 036, 039 (>99% идентичности с ГКО серогруппы 06), 040 и 044 депонированы в базу данных GenBank под номерами JQ417203, JQ319041, JQ801294, НМ583639, JN097785, НМ583640 и JN097784, соответственно. ГКО Р. rustigianii DSM 4541 показан как еще один пример, демонстрирующий гетерогенность области cpxA-yibK, но не был включен в анализ, так как структура его О-антигена неизвестна.

Как и в других изученных энтеробактериях, ГКО Providencia отличаются пониженным содержанием GC-nap по сравнению с геномом в целом (31-36% против 41%), причем их наименьшим содержанием обладают гены процессинга О-антигена wzx и и'гу. Это может объясняться приобретением ГКО путем горизонтального переноса от других бактерий, но остается неясным, почему содержание GC-nap в ГКО всегда ниже по сравнению со среднегеномным.

Для удобства дальнейшего изложения гены ГКО условно разделены на четыре группы в соответствии с их предполагаемыми функциями.

2.2 Гены биосинтеза нуклеотидных предшественников моносахаридов

Пути биосинтеза специфических моносахаридных компонентов О-антигенов штаммов Providencia с секвенированными ГКО представлены на рис. 5. Гены синтеза нуклеотидных предшественников распространенных моносахаридов (UDP-Glc, UDP-GlcNAc и ADP-Rib) являются генами "домашнего хозяйства" и в ГКО не дублируются. UDP-Gal и UDP-GalNAc синтезируются путем обратимой 4-эпимеризации UDP-Glc и UDP-GlcNAc, катализируемой ферментами GalE и Gne, соответственно. В бактериях, способных утилизировать экзогенную галактозу, ген galE вместе с генами galT и gal К находится в галактозном опероне. Вне gal-onepoHa

различить §а1Е и gne только на основании гомологам ДНК трудно. Это связано как с ограниченным числом биохимически охарактеризованных ферментов, так и с тем, что каждая из 4-эпимераз может проявлять обе активности, обладая большей специфичностью по отношению к ШР-01с/Са1, иОР-СШАсЛЗа^Ас или одинаковой специфичностью к обоим субстратам.

d-Glc-l-P ÍEÜ* c1TDP-d-G1c rm'1> (1ТОР-6-деюкс11-о-п:ил»-гексоз-4-улоза

dTI)P-L-Uha

RmlC „„„ ,

dTDP-6-;iciüKCii-L-.i¡íKaí-icKcoi-4-y.io_ja-|

—> dlDP-l-édTal

¿ТОР-б-детокси-о-гаип-геков-З-улога dTDP-U-Fuc3N dTDP-l)-Kuc3NAc

^Íí^ атОР-6-деюкси-о-/л1«)-гек;оз-3-уло!а dTDP-D-Qui3NdTDP-i>-Qui3NFo

VinA VioF —% dTDP-D-Qui4N-> dTDP-[).QuMNTo

UDP-l>-Gal

Ugd

UDP-n-GlcA

d-GIcN-1-Р-» OTP-d-GIcnac-

OTP-n-GalNAc

WrrA** finii

UndPP-D-GlcNAc UndPP-d-Gal.\Ac

и[)Р-2-ацсгамило-2.6-диле'1йк"С(|-0-И((7<>гсксй1-4-уло'т —UDP-D-FucNAc4N

ManA" ManB ManC „

d-Fm-6-Р -> d-Man-6-Р-»D-Man-I-P-► GUP-n-Man

!_1

GDP-D-Man GDP-6-,ae:i0Kcii-D-.7i//x-(>-rcKL'03-4-ynü:!a i Fcl> GDP-l-FhcGDP-l-QuJ

I Coll) Col С

(ШР-3,6-диде:юю;и-о-ш/?ео-гексоз-4-уло:1а-> GDP-Col

, „ KdsD , . _ KdsA „ . „ _ KdsC** , KdsD 1)-рн(1ул1Иа-5-Р-» l>-Ara-5-P-> Kdo-8-Р-> Kclo -> CMP-Kdo

Рис. 5 - Пути биосинтеза нуклеотидных предшественников моносахаридов, входящих в изученные О-антигены Providencia. Предсказанные пути, не подтвержденные биохимически, обозначены пунктиром. Расшифровка принятых сокращений моносахаридов дана в примечании к таблице 1. •Фермент кодируется геном вне ГКО, который дублируется в ГКО только в составе оперона rmlBDAC. **Фермент кодируется геном вне ГКО.

Полногеномный поиск гомологов генов UDP-Glc 4-эпимеразы и UDP-GlcNAc 4-эпимеразы в Р. alcalifaciens, Р. stuartii и Р. rustigianii выявил два гомолога galE, один из которых расположен в gal-опероне (кроме Р. alcalifaciens), а другой в ГКО. Гомолог galE располагается на З'-конце ГКО Providencia рядом с генами ига, w:b, wzc (см. ниже) в консервативной области, отличающейся от остальной части ГКО содержанием GC-nap, близким к среднегеномному. В штамме Р. alcalifaciens 019, лишенном gal-оперона, но содержащем галактозу в О-антигене, galE очевидно кодирует UDP-Glc 4-эпимеразу. В ГКО Р. alcalifaciens 022 и Р. stuartii 044, О-антигены которых содержат GalNAc, единственным кандидатом, которому можно приписать функцию gne, также является galE. Этот ген вместе с генами ш сохраняется и в ГКО серогрупп, в которых UDP-предшественники Gal и GalNAc не требуются для синтеза О-антигена, в то время как остальная часть ГКО варьируется от серогруппы к серогруппе.

В О-антигене Р. alcalifaciens 040 первым моносахаридом биологического повторяющегося звена является GalNAc. У энтеробактерий его предшественником является не нуклеотидное, а липидное производное UndPP-GalNAc, которое синтезируется 4-эпимеризацией UndPP-GlcNAc, образующегося из UDP-GIcNAc и ундекапренилфосфата (UndP). Соответственно для синтеза UndPP-GalNAc необходима другая 4-эпимераза, которую, однако, долгое время не отличали от UDP-GlcNAc 4-эпимеразы и называли также Gne. Недавно для их различения было предложено переименовать UndPP-GlcNAc 4-эпимеразу в Gnu. Гомолог gnu найден в ГКО Р. alcalifaciens 040, а также Р. rustigianii DSM 4541, структура О-антигена которого не установлена

Специфическими моносахаридными компонентами О-антигенов серогрупп 019, ОЗО, 036, 040 и 047 являются d-Fuc3NAc, d-Quí4NFo, l-6dTal, d-Qui3NFo и L-Rha, соответственно. Биосинтез их нуклеотидных предшественников протекает через общий интермедиат dTDP-6-дезокси-о-ксгмо-гексоз-4-улозу, образующуюся из глюкозо-1 -фосфата в две стадии, катализируемые тимидилтрансферазой RmlA и 4,6-дегидратазой RmlB (рис. 5). Для синтеза dTDP-L-Rha в ГКО Р. stuartii 047 имеется полный набор генов rmlBDAC, тогда как для синтеза dTDP-производных остальных четырех Сахаров найдены все ожидаемые гены, за исключением rmlB. Это позволило предположить, что rmlB находится вне области cpxA-yibK. Действительно, полногеномный анализ штаммов P. alcalifaciens, P. stuartii и P. rustigianii выявил гомологи rmlA и rmlB [номера доступа GenBank ЕЕВ46719, EDU58095, EFB72495 (rmlA) и ЕЕВ46720, EDU58094, EFB72496 (rmlB)] в генном кластере общего энтеробакгериального антигена (ОЭА), так как оба эти гена необходимы для синтеза d-Fuc4NAc - одного из компонентов ОЭА. Таким образом, rmlA дублируется в ГКО всех штаммов, О-ангигены которых содержат указанные выше 6-дезоксисахара, a rmlB дублируется только в составе оперона rmlBDAC для синтеза dTDP-l-Rha Превращение dTDP-d-Qui3N и dTDP-d-Qu¡4N в dTDP-d-Qui3NFo и dTDP-d-Qui4NFo требует участия формилтрансфераз, и кодирующие их гены qdiF и vioF обнаружены в ГКО Р. alcalifaciens 040 и ОЗО, соответственно. Функция vioF как dTDP-d-Qui4N формилтрансферазы подтверждена биохимически.

Для предшественников остальных моносахаридов с известными путями биосинтеза -UDP-GlcA, GDP-D-Man, GDP-L-Fuc и GDP-Col - все ожидаемые гены найдены в ГКО соответствующих штаммов Providencia.

Нуклеотидный предшественник d-FucNAc4N, входящего в состав О-антигенов P. alcalifaciens 022 и ОЗО, предположительно синтезируется из UDP-GlcNAc в две стадии, катализируемые специфической 4,6-дегидратазой и аминотрансферазой (рис. 5). Этот компонент и гены обоих ферментов ранее были найдены у бактерии Shigella sonnei. Если идентификация wbgX как гена аминотрансферазы не вызывала сомнений, то на ген 4,6-дегидратазы в ГКО 5. sonnei было два кандидата - wbgZ и wbgV. В ГКО провиденсий серогрупп 022 и ОЗО найдены гомологи wbgX и wbgZ. Отсутствие wbgV свидетельствует о том, что 4,6-дегидратаза кодируется геном wbgZ, однако для окончательного решения этого вопроса необходимо биохимическое подтверждение.

В отличие от многих других 6-дезоксисахаров, путь биосинтеза l-хиновозы в бактериях оставался неизвестным, вероятно, из-за низкой распространенности этого моносахарида в полисахаридах. Недавнее обнаружение L-Qu¡ в О-антигене Yersinia pseudotuberculosis 012 и анализ его ГКО, включая сравнение с ГКО P. stuartii 044, указывает на то, что GDP-l-Qui

"Подтверждение функции vioF6ыло проведено В. Liu (Нанкайский университет, Тянь-дзинь, КНР).

16

синтезируется в одну стадию из GDP-l-Fuc с помощью специфической 4-эпимеразы, названной Qui. Гомолог Qui, кодируемый в ГКО P. stuartii 044, на 54,5% идентичен Qui Y. pseudotuberculosis и очевидно выполняет такую же функцию.

Kdo является обязательным компонентом кора ЛПС всех энтеробакгерий, включая Providencia. Четыре гена kdsABCD для синтеза СМР-производного Kdo (рис. 5) обычно разбросаны по хромосоме. В штамме P. alcalifaciens 036, содержащем Kdo не только в коре, но и в О-антигене, три из четырех генов, кодирующие KdsD, KdsA и KdsB, дублируются в ГКО. Интересно, что гены синтеза CMP-Kdo в ГКО Р. alcalifaciens обладают большей степенью сходства на аминокислотном уровне с гомологичными генами морских бактерий (Marinomonas, Pseudoalteromonas, Vibrio sp.), чем с генами синтеза Kdo кора Providencia, находящимися вне ГКО. Эти данные и близкое структурное сходство полисахаридов Р. alcalifaciens 036 и Pseudoalteromonasflavipulchra позволяет предположить, что гены kds в ГКО Providencia были приобретены путем горизонтального переноса. Отметим, что в двух штаммах Cronobacter sakazakii 05 и 06, О-антигены которых также содержат Kdo, но не обладают структурным сходством с О-антигеном Р. alcalifaciens ОЗб, гены для синтеза CMP-Kdo не дублируются в ГКО. Таким образом, у различных бактерий для синтеза кора и О-ангигена могут использоваться ферменты пути синтеза CMP-Kdo, кодируемые одними и теми же генами (С. sakazakii) или двумя различными наборами генов (P. alcalifaciens).

2.3 Гены гликозилтрансфераз

GlcNAc и GalNAc присутствуют в О-антигенах большинства серогрупп Providencia и, как и в других энтеробакгериях, один из них предположительно является первым моносахаридом биологического О-звена. Это подтверждено в настоящей работе структурным анализом ЛПС SR-типа трех О-серогрупп Providencia, а также лит. данными для P. rusligianii 014 и Р. alcalifaciens 019.

Синтез этих О-антигенов инициируется переносом GlcNAc-1-фосфата с UDP-GlcNAc на липидный акцептор UndP с помощью гликозилфосфаттрансферазы WecA, которая в отличие от гликозилтрансфераз, растворенных в цитозоле, является мембраносвязанным белком. У всех ранее изученных энтеробакгерий ген wecA находится в генном кластере биосинтеза ОЭА и в ГКО не дублируется. В доступных геномах Providencia гомолог wecA также найден только в генном кластере ОЭА (номера доступа GenBank ЕЕВ46724, EDU58090, EFB72500), и очевидно кодируемый им фермент WecA участвует в синтезе как ОЭА, так и О-антигена.

В ГКО P. alcalifaciens 022 и ОЗО найдены гомологи гена wbgY, кодирующего другую гликозилфосфаттрансферазу. WbgY Providencia на 55% идентична WbgY Shigella sonnei, предполагаемой функцией которой является инициация биосинтеза О-антигена путем переноса FucNAc4N-1-фосфата на UndP (то, что FucNAc4N является первым моносахаридом О-звена S. sonnei, подтверждено структурным анализом). О-Антигены серогрупп 022 и ОЗО также содержат FucNAc4N, и, таким образом, этот диаминосахар является первым моносахаридом в О-звеньях и этих бактерий, тем более что в О-антигене серогруппы ОЗО нет других А'-ацетил-d-гексозаминов, которые могли бы играть роль инициирующего моносахарида.

Для сборки UndPP-связанных три-, тетра-, пента- и гексасахаридных О-звеньев необходимо две, три, четыре и пять индивидуальных гликозилтрансфераз, соответственно. Нужное число генов гликозилтрансфераз найдено в ГКО всех штаммов Providencia с известными структурами

О-антигенов, за исключением серогруппы 036 (рис. 4). ГКО Р. alcalifaciens 036 с Kdo-содержащим трисахаридным О-звеном включал только один ген, имеющий явную гомологию с генами гликозшггрансфераз. Единственным кандидатом на роль второй гликозилтрансферазы был продукт ОРС-5, гомологичный белкам KpsS, которые участвуют в биосинтезе К-антигенов ряда бактерий и предположительно отвечают за присоединение К-антигена к фосфагидил-Kdo. Кроме того, продукт ОРС-5 на 37% идентичен предсказанной методом исключения гликозилтрансферазе WepM, кодируемой в ГКО Cronobacter sakazakii 06,0-антиген которого также содержит Kdo.

Гликозилтрансферазы специфичны к гликозилдонору, гликозилакцептору, а также к положению и конфигурации создаваемой ими гликозидной связи, что обуславливает большое разнообразие этих ферментов. Лишь немногие из них охарактеризованы биохимически, и вследствие этого отнесение к конкретным гликозидным связям генов гликозилтрансфераз, участвующих в биосинтезе О-антигенов Providencia, в настоящей работе не проводилось.

2.4 Гены процессинга О-антигена

Белки Wzx и Wzy - О-антиген флиппаза и О-антиген полнмераза, обеспечивающие перенос UndPP-связанного О-звена через внутреннюю мембрану и его полимеризацию, соответственно. Они являются гидрофобными мембранными белками, имеющими характерную топологию с множественными трансмембранными сегментами. Гены wzx и wzy найдены во всех изученных ГКО Providencia, и, следовательно, соответствующие О-антигены синтезируются по Wzx/Wzy-зависимому пути, типичному для гетерополисахаридов бактерий с О-звеном от трисахарида и выше.

Белки Wzx и Wzy отличаются низкой степенью идентичности со своими гомологами (у Providencia 26-45% и 25-37%, соответственно), и, таким образом, они специфичны для каждой О-серогруппы. Это делает wzx и игу перспективными кандидатами в гены, на основе которых может быть разработан метод молекулярного типирования природных и клинических изолятов провиденсий.

Третий компонент Wzy/Wzx-зависимого процессинга - мембранный белок Wzz, модулирующий распределение длин цепи О-антигена, - обычно кодируется геном вне ГКО. В трех полностью секвенированных геномах Providencia гомологи исг (fepE) (номера доступа GenBank ЕЕВ45532, EDU60377, EFB71782) также найдены вне ГКО в кластере генов, ассоциированных с синтезом и транспортом хелатора железа энтеробактина (энтерохелина).

2.S Другие гены

В ГКО Р. alcalifaciens 019 и 036 найдены гомологи генов О-ацетилтрансфераз, которые предположительно отвечают за 4-0-ацетилирование UDP-d-Fuc3NAc и 2-О-ацетилирование dTDP-L-6dTal, соответственно. Белковый продукт ОРС-Ю в ГКО Р. alcalifaciens 040 является гомологом предполагаемой ацетилтрансферазы Bacteroides thetaiotaomicron, ответственной за О-ацетилирование остатка галактозы. Это согласуется с присутствием минорной О-ацетильной группы в О-антигене серогруппы 040, хотя ее положение на остатке галактозы химически не подтверждено. ГКО серогруппы 019 содержит гомолог гена пируватгрансферазы, роль которой очевидно заключается в синтезе ацеталя пировиноградной кислоты на остатке GlcNAc.

В О-антигене Р. alcalifaciens 022 присутствует о-глицерамид-2-фосфат. Биосинтез

нуклеотидного производного d-GroAN предположительно начинается с 2-фосфо-о-глицерата, который является интермедиатом в гликолизе. Белковый продукт ОРС-2 в ГКО серогруппы 022 на 82% идентичен глицеро-3-фосфат цитидилтрансферазе, а ОРС-1 на 60% идентичен аспарагинсинтетазе, катализирующей амидирование карбоксильной группы аспартата. Таким образом, можно предположить, что эти гены ответственны за двухстадийный синтез CDP-GroAN, включающий нуклеотид-активацию 2-фосфо-о-глицерата и амидирование. Продукт ОРС-4 является гомологом CDP-глицерофосфаггтрансферазы и очевидно необходим для переноса GroAN-2-фосфата с CDP-GroAN на остаток GalNAc.

Кроме фланкирующего гена yibK, в ГКО P. alcalifaciens 036 присутствует его дефектный гомолог, инакгивированный в результате нонсенс-мутации. В ГКО P. alcalifaciens 022 и P. stuartii 044 найдены гены транспозазы и ингегразы, соответственно, известных как белки, обеспечивающие транспозицию мобильных генетических элементов.

Интригующей особенностью ГКО P. alcalifaciens и P. stuartii является присутствие на З'-конце консервативной группы генов, представляющих собой гомологи пса, w:b и w:c. Эти гены не относятся к биосинтезу О-антигенов, но у бактерий Е. coli они участвуют в синтезе и транслокации K-антигенов групп 1 и 4, которые могут экспрессироваться в липид А-связанной форме, образуя так называемые К-ЛПС. Кроме этих трех генов, в ГКО Р. stuartii 044 и 047 найден гомолог гена wzi, который кодирует мембранный белок, специфичный для K-антигенов группы 1. Присутствие гомологов этих генов в ГКО свидетельствует о связи О-антигенов с К-антигенами также и у провиденсий, однако их точную роль в экспрессии поверхностных полисахаридов этих бактерий еще предстоит выяснить.

2.6 Биохимическое подтверждение функций генов биосинтеза GDP-колитозы

В то время как у всех остальных исследованных О-серогрупп ГКО отвечал структуре О-антигена, для серогруппы 039 такого соответствия не наблюдалось. В частности, анализ не выявил генов rmlA, rmlB, vioA, необходимых для синтеза dTDP-D-Qui4N, и гена gnu для синтеза UndPP-GaINAc - предшественников компонентов О-антигена этой О-серогруппы. Вместо этого присутствовали гомологи генов тапВ и тапС пути биосинтеза GDP-маннозы, а также гомолог гена GDP-Man 4,6-дегидратазы (gmd) и еще два гена биосинтеза нуклеотидных предшественников Сахаров (ОРС-4 и ОРС-5), которые очевидно участвуют в дальнейших превращениях GDP-Man. Продукт ОРС-4 принадлежит к семейству NAD-зависимых эпимераз/дегидратаз и обладает наибольшей идентичностью с GDP-l-Fuc синтазой ряда бактерий, а также гомологичен предполагаемому белку биосинтеза GDP-колитозы Salmonella enterica. Продукт ОРС-5 относится к суперсемейству пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР)-зависимых аспартатных аминотрансфераз и обладает до 64% идентичности с аминотрансферазами различных бактерий. Высокая гомология наблюдалась также с предсказанной пиридоксамин-5-фосфат (РМР)-зависимой дегидразой Е. coli Olli. Таким образом, продукты ОРС-4 и ОРС-5 имеют высокую степень сходства с ферментами, участвующими в биосинтетических путях разных моносахаридов и имеющими различные функции, но при этом не играют очевидной роли в синтезе О-антигена серогруппы 039.

Для подтверждения функции gmd и выяснения функций ОРС-4 и ОРС-5 три кодируемых ими белка из P. alcalifaciens 039 были экспрессированы в Е. coli BL21 в растворимой форме с С-терминальным Hiss тэгом и очищены никель-аффинной хроматографией.

19

3

исходный

t i , , , ! , , , , j i i i i ( , , i ! i i ■ i l ( i i i i субстрат 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Время (мим)

Рис. 6 - Анализ ВЭЖХ на обращенной фазе исходного субстрата (А) и продуктов реакций (Б-Г), катализируемых ферментами, указанными справа 3 - GDP-D-Man, 4 - ООР-б-дезокси-о-лмссо-гексоз-4-улоза, 5 - ООР-3,6-дидезокси-о-/ире0-гексоз-4-улоза, 6 - GDP-Col, 7 - NAD+. Время удерживания NADH составляет 41,5 мин, и его пик не показан.

4,6-Дегидратазная активность Gmd подтверждена инкубированием GDP-D-Man с Gmd и последующим анализом продуктов реакции методом ВЭЖХ. Субстрат GDP-D-Man 3 (рис. 6А) полностью превращался в продукт 4, элюирующийся в виде широкого пика (рис. 6Б). ESI-масс-спектр 4 содержал пик иона [М-НГ при m/z 586, и, следовательно, молекулярная масса продукта 4 на 18 Да меньше по сравнению с исходным субстратом 3, дававшим в ESI-масс-спекгре пик иона [М-Н]~ при m/z 604. Таким образом, 4 является продуктом дегидратация 3.

Для мониторинга методом спектроскопии ЯМР реакцию с Gmd проводили в ЯМР-ампуле и идентифицировали продукт 4 непосредственно в реакционной смеси (рис. 7А,Б). В первые несколько минут после добавления Gmd наблюдалось снижение концентрации GDP-d-Man 3 и появление сигналов СОР-6-дезокси-о-лилго-гексоз-4-улозы 4, существующей в равновесии с гем-диольной формой 4' в соотношении -3:1. Соединение 4' давало такие же корреляционные картины в двумерных спектрах COSY и TOCSY, но все сигналы 'Н ЯМР были сдвинуты в сильное поле по сравнению с кето-формой 4. Идентификация 4' как гем-диольной формы 4 показывает ошибочность предположения, что 4' представляет собой 3-кето-изомер 4, которое было сделано ранее при исследовании пути биосинтеза GDP-d-Rha у бактерий Pseudomonas aeruginosa.

Добавление белкового продукта ОРС-5 и L-шутамага в реакционную смесь, содержащую 4 и 4', привело к образованию нового продукта 5, который также элюировался в виде широкого пика, что указывало на сохранение кето-группы (рис. 6В). Известно, что функция аспартатных аминотрансфераз требует L-глутамата и кофактора PLP, и, действительно, при отсутствии L-глутамата конверсии 4 не наблюдалось. В то же время экзогенный PLP не был необходим для образования 5, и это заставило предположить, что продукт ОРС-5 был очищен в виде комплекса с эндогенным PLP. Присутствие PLP подтверждалось УФ-абсорбцией раствора фермента, наблюдавшейся при 326 нм, aero рассчитанное насыщение кофактором составляло ~10%. ESI-масс-спекгр 5 содержал пик иона [М-Н]~ при m/z 570, который указывал на уменьшение молекулярной массы на 16 Да по сравнению с исходным соединением 4, то есть на его дезоксигенирование.

"Автор благодарит профессора Т.В. Демидкину за помощь в определении PLP.

20

—11—'—•—' ' I—' ' ' ' I • ' ' ' I ' ' ■ • I ' • ' ' I ' ' ' ' I ' ' 1 ' I ' 1 ' 1 1 ' 1'I 1

6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

4JV

4 6"

4■

UL

OGDP

_и

6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm

5" 4" \|2'

6" 5"- 1"

4 "f^ OH

OH

J «

jL^JL

J

Рис. 7 - Спектры 'H ЯМР исходного субстрата GDP-Man 3 (А), СВР-6-дезокси-о-лм/ссо-гексоз-4-улозы 4 (в равновесии с гем-диольной формой 4', отнесение сигналов которой показаны курсивом) (Б) и конечного продукта GDP-Col 6 (В). Спектры 3 и 4 записаны в реакционном буфере (10% D20, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5), спектр 6 снят в DjO. Сигнал Н8 гуанина при 8,10 м.д. на спектрах не показан. Звездочкой отмечены сигналы примесей этанола, глицерина и триэтиламина.

Добавление к реакционной смеси белкового продукта ОРС-4 и NADH привело к образованию соединения б, сопровождавшемуся конверсией NADH в NAD+ (рис. 6Г). ESl-масс-спектр 6 содержал ионный пик [М-Н]~ при т.h 572, и, следовательно, молекулярная масса этого соединения увеличилась на 2 Да по сравнению с 5, что указывало на восстановление кето-группы. Продукт 6, элюирующийся в виде острого пика, был очищен ВЭЖХ и с помощью спектроскопии 'Н, 13С и 31Р ЯМР идентифицирован как ООР-3,6-дидезокси-ь-/сс«ло-гексоза (GDP-колитоза)

(рис. 7В). Из этих данных следовало также, что исходное соединение 5 являлось ОПР-3,6-длдезоксигексоз-4-улозой.

Таким образом, ОРС-4 и ОРС-5 являются гомологами генов со/С и соЮ пути биосинтеза GDP-колитозы (рис. 8). ОРС-5 (colD) кодирует PLP-зависимую СОР-6-дезокси-о-.та/«:о-гексоз-4-улоза 3-дезоксигеназу, катализирующую 3-дезоксигенирование продукта Gmd в присутствии L-глутамата (реакция протекает через промежуточное образование основания Шиффа с последующей Р-дегидратацией и гидролизом образующегося енамина). ОРС-4 (со/С) кодирует бифункциональную СОР-3,6-дидсзокси-о-/и/>ео-гексоз-4-улоза 5-эпимеразу/4-редуктазу, которая катализирует превращение продукта ColD в GDP-Col. Ранее путь биосинтеза GDP-Col был биохимически охарактеризован только в Yersinia pseudotuberculosis, и наше исследование показало, что P. alcalifaciens использует тот же путь синтеза этого нуклеотидного предшественника, он

о<

"о Gmd JP-O ColD СоЮ

w — I ■ ---

нго i plp

ÓGDP " ""рм?"""" OGDP OH

S 6

Рис. 8 - Путь биосинтеза GDP-Col 6.

Как уже отмечалось, ГКО Р. alcalifaciens 039 в области cpxA-yibK в целом и присутствие генов пути биосинтеза GDP-Col в частности не соответствует структуре О-антигена, который не содержит колитозу. В то же время колитоза является компонентом О-антигена Р. alcalifaciens Об, и ГКО этой бактерии, полностью соответствующий структуре ее О-антигена (рис. 4), практически не отличается от ГКО Р. alcalifaciens 039 (>99% идентичности ДНК, гены colC и colD попарно идентичны на 100%). Можно предположить, что пгтамм Р alcalifaciens 039 произошел от штамма Р. alcalifaciens Об путем инактивации ГКО в области cpxA-yibK и приобретения другого генного кластера для синтеза существующего О-шггигена, расположившегося в другом месте генома Для локализации

этого альтернативного ГКО необходимо полногеномное секвенирование Р. alcalifaciens 039.

* * *

Таким образом, идентичность ГКО Providencia, впервые локализованного в настоящей работе, подтверждена следующими данными: а) специфичным к О-серогруппе полиморфизмом области cpxA-yibK, продемонстрированным для десяти штаммов; б) отсутствием в геномах Р. alcalifaciens 019 и Р. stuartii 047 другого генного кластера, потенциально ассоциированного с синтезом О-антигена или другого полисахарида, отличного от ОЭА; в) соответствием функций генов, предсказанных in silico, установленным структурам О-антигенов; г) клонированием и биохимическим подтверждением функций трех ферментов пути синтеза нуклеотидного предшественника колитозы GDP-Col и формилтрансферазы пути синтеза dTDP-D-Qui4NFo.

Отметим, что в бактериях рода Proteus, включенного вместе с родом Providencia в трибу Proteeae, ГКО располагается в том же месте хромосомы за геном срхА по ходу транскрипции. Для обоих родов также характерны уникальные компоненты О-антигенов, такие как М-ацетил-изомурамовая кислота и (1-карбоксиэтил)аминокислоты, и общие эпитопы, обеспечивающие многочисленные межродовые перекрестные серологические реакции. В то же время имеются и различия; так, бактерии Proteus не содержат в ГКО генов w: и не продуцируют ЛПС SR-типа.

22

выводы

1. Установлены структуры О-спецнфических полисахаридов (О-антигенов) 23 О-серогрупп важных в медицинском отношении видов энтеробактерий рода Providencia - P. alcalifaciens, P. stuartii и P. rustigianii. Полученные данные вносят существенный вклад в создание химической основы классификации штаммов Providencia по О-антигенам и позволяют обосновать серологические взаимосвязи между штаммами, относящимися к различным О-серогруппам, а также между провиденсиями и другими энтеробакгериями.

2. В изученных О-полисахаридах обнаружены различные кислоты неуглеводной природы, в том числе впервые в составе природных гликополимеров найдены (2Л,47?)-2,4-дигидроксипентановая кислота, Лг-[(5)-1-карбоксиэтил]-ь-аланин (аланопин) и 2-фосфо-й-глицерамид. Впервые идентифицирован редко встречающийся в бактериальных гликанах моносахарид L-хиновоза.

3. Впервые у бактерий Providencia генный кластер О-антигена локализован в полиморфном хромосомном локусе между генами срхЛ и yibK. Выявлены особенности его организации у провиденсий, предсказаны функции генов биосинтеза О-антигенов 9 О-серогрупп и пути биосинтеза нуклеотидных предшественников их специфических моносахаридных компонентов. Полученные данные могут быть использованы для разработки метода молекулярного типирования природных и клинических изолятов провиденсий, основанного на генах процессинга О-антигенов, специфичных для каждой О-серогруппы.

4. Путем клонирования и проведения биохимических реакций с полученными рекомбинантными ферментами подтверждены функции генов пути биосинтеза GDP-колитозы - нуклеотидного предшественника одной из редко встречающихся 3,6-дидезоксигексоз, входящей в состав О-антигена серогруппы Об. Найдено, что биосинтез GDP-колитозы у провиденсий протекает по тому же пути, что и у ранее изученных бактерий Yersinia pseudotuberculosis.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах: Статьи

1. Bushmarinov I.S., Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Blaszczyk A., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide of Providencia stuartii 049 // Carbohydr. Res. 2004,339, 1557-1560.

2. Ovchinnikova O.G., Kocharova N. A., Bakinovskiy L.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii 047 // Carbohydr. Res. 2004,339,2621-2626.

3. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Bushmarinov I.S., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii 057 containing an amide of D-galacturonic acid with L-alanine // Carbohydr. Res. 2005,340, 775-780.

4. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Torzewska A., Blaszczyk A., Shashkov A S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii 043 containing an amide of D-galacturonic acid with L-serine // Carbohydr. Res. 2005, 340, 1407-1411.

5. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii 044 contains L-quinovose, a 6-deoxy sugar rarely occurring in bacterial polysaccharides // Carbohydr. Res. 2005, 340, 1419-1423.

6. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 030 // Carbohydr. Res. 2006, 341, 786-790.

7. Bushmarinov I.S., Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov AS., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 029II Carbohydr. Res. 2006, 341, 1181-1185.

8. Bushmarinov I.S., Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide and serological cross-reactivity of the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 032 containing Л-acetylisomuramic acid // Carbohydr. Res. 2007,342,268-273.

9. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 036 containing 3-deoxy-d-mawio-oct-2-ulosonic acid II Carbohydr. Res. 2007, 342, 665-670.

10. Ovchinnikova O.G., Bushmarinov I.S., Kocharova N.A., Toukach F.V., Wykrota M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. New structure for the O-polysaccharide of Providencia alcalifaciens 027 and revised structure for the O-polysaccharide of Providencia stuartii 043 II Carbohydr. Res. 2007, 342, 1116-1121.

U. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Wykrota M„ Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of a colitose-containing O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens Об // Carbohydr. Res. 2007, 342, 2144-2148.

12. Kocharova N. A., Kondakova A.N., Vinogradov E., Ovchinnikova O.G., Lindner В., Shashkov A.S., Rozalski A., Knirel Y.A. Full structure of the carbohydrate chain of the lipopolysaccharide of Providencia rustigianii 034 // Chem. Eur. J. 2008, 14, 6184-6191.

13. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Shashkov A.S., Bialczak-Kokot M., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 031 containing an ether of d-mannose with (2/?,4ß)-2,4-dihydroxypentanoic acid // Carbohydr. Res. 2009, 344, 683-686.

14. Kocharova N.A., Kondakova A.N., Ovchinnikova O.G., Perepelov A.V., Shashkov A S., Knirel Y.A. N-( 1 -Carboxyethyl)alanine (alanopine), a new non-sugar component of lipopolysaccharides of Providencia and Proteus II Carbohydr. Res. 2009,344, 2060-2062.

15. Овчинникова О.Г., Кочарова H.A., Шашков A.C., Книрель Ю.А., Рожальски А. Структура О-специфического полисахарида бактерии Providencia alcalifaciens 046 II Биоорган, химия 2009, 35, 408-413.

16. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Parkhomchuk A.A., Bialczak-Kokot M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 060 // Carbohydr. Res. 2011, 346, 377-380.

17. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Shashkov A.S., Arbatsky N.P., Rozalski A., Knirel Y.A. Elucidation of the lull O-polysaccharide structure and identification of the core type of the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 09 И Carbohydr. Res. 2011,346, 644-650.

18. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Kondakova A.N., Bialczak-Kokot M., Shashkov AS., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens 028II Carbohydr. Res. 2011, 346,2638-2641.

19. Кочарова H.A., Овчинникова О.Г., Бялчак-Кокот M., Шашков A.C., Книрель Ю.А., Рожальски А. Структура О-полисахарида Providencia alcalifaciens 025, содержащего амид d-галактуроновой кислоты с ДС-[(п)-1-карбоксготил]-Ь-лизином II Биохимия 2011, 76, 864-871.

20. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A Structure of the

24

O-polysaccharide from the lipopotysaccharide of Providencia alcalifaciens 048 // Carbohydr. Res. 2012, 347, 168-171.

21. Ovchinnikova O.G., Liu В., Guo D., Kocharova N.A., Shashkov A S., Chen M„ Feng L., Rozalski A., Knirel Y.A., Wang L. Localization and molecular characterization of putative O-antigen gene clusters of Providencia spccies H Microbiology 2012, 158, 1024-1036.

22. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Bialczak-Kokot M., Shashkov A.S., Rozalski A., Knirel Y.A. Structure of the O-polysaccharide of Providencia alcalifacieiis 022 containing d-glyceramide 2-phosphate // Eur. J. Org. Chem. 2012, 3500-3506.

23. Ovchinnikova O.G., Liu В., Guo D., Kocharova N.A., Bialczak-Kokot M., Shashkov A.S., Feng L., Rozalski A., Wang L., Knirel Y.A. Structural, serological, and genetic characterization of the O-antigen of Providencia alcalifaciens 040 И FEMS Immunol. Med Microbiol. 2012, 66, 382-392.

24. Ovchinnikova O.G., Kondakova A.N., Kocharova N.A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Structure of the O-polysaccharide of Providencia alcalifaciens 03 containing 3,6-dideoxy-3-formamido-d-glucose and d-galacturonamide // Carbohydr. Res. 2012,361,27-32.

Тезисы докладов на конференциях

25. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii 047 // III German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates, Wroclaw, Poland, October 6-9, 2004, p. 78.

26. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Kondakova A.N., Knirel Y. A., Rozalski A. Structures of the lipopolysaccharides of bacteria of the genus Providencia Н XIV European Carbohydrate Symposium, Lübeck, Germany, September 2-7, 2007, p. 397.

27. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Kondakova A.N., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. New structures of l-fucose-containing O-polysaccharides of bacteria of the genus Providencia and the full lipopolysaccharide structure of Providencia rustigianii 034 // XXIV International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, July 27-August 1,2008, F-P058.

28. Ovchinnikova O.G., Parchomchuk A.A., Kocharova N.A., Kondakova A.N., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A. Further progress in structural studies of lipopolysaccharides from bacteria Providencia //XV European Carbohydrate Symposium, Vienna, Austria, July 19-24, 2009, PB 020.

29. Овчинникова О.Г., Кочарова II.A., Пархомчук A.A., Кондакова A.H., Шашков А.С., Киирель Ю.А., Рожальски А. Прогресс в структурных исследованиях липополисахаридов бактерий рода Providencia II XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 7-14 сентября 2009 г., с. 50.

30. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Shashkov A.S., Liu В., Feng L., Rozalski A., Wang L„ Knirel Y.A. Genetic studies oí Providencia O-antigens // 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Hyytiala Forestry Field Station, Hyytiaia, Finland, September 19-22,2010, p. 33.

31. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Shashkov A.S., Liu В., Feng L„ Rozalski A., Wang L., Knirel Y.A. Molecular analysis of the putative Providencia O-antigen gene cluster // FASEB Summer Research Conference Microbial Polysaccharides of Medical, Agricultural and Industrial Importance, Carefree, Arizona, USA, June 5-10,2011.

32. Ovchinnikova O.G., Liu В., Kocharova N.A., Guo D., Shashkov A.S., Bialczak-Kokot M., Feng L., Rozalski A., Wang L., Knirel Y.A. Structure and gene cluster of the O-antigen of Providencia alcalifaciens 022 containing d-glyceramide 2-phosphate // XXVI International Carbohydrate Symposium, Madrid, Spain, July 22-27,2012, P460.

33. Ovchinnikova O.G., Liu В., Shashkov A.S., Chen M., Perepelov A.V., Zhou D., Feng L., Rozalski A.,

Wang L., Knirel Y.A. Functional analysis of O-antigen biosynthesis genes in Providencia spp. //

5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Suzdal, Russia, September 2-6,2012, 027.

25

Подписано в печать:

22.04.2013

Заказ № 8405 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук

На правах рукописи

04201356964

Овчинникова Ольга Геннадьевна

Структура и генетика биосинтеза О-антигенов энтеробактерий рода Providencia

02.00.10 - Биоорганическая химия 03.01.03 - Молекулярная биология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель доктор химических наук, профессор Книрель Юрий Александрович

Москва - 2013

¿y

СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................3

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................................................................................7

Биосинтез липополисахаридов грамотрицательных бактерий

2.1 Общая характеристика липополисахарида..............................................................................7

2.2 Биосинтез нуклеотидных предшественников Сахаров.........................................................12

2.3 Биосинтез кора-липида А........................................................................................................17

2.4 Биосинтез О-антигена..............................................................................................................28

2.5 Лигирование и экспорт липополисахарида на внешнюю мембрану...................................37

3 РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................................................................40

3.1 Классификация бактерий рода Providencia............................................................................40

3.2 Установление строения О-полисахаридов бактерий Providencia........................................42

3.2.1 Общие подходы к структурному анализу О-полисахаридов.........................................42

3.2.2 Строение О-полисахаридов различных О-серогрупп....................................................44

3.3 Характеристика генных кластеров О-антигенов Providencia...............................................81

3.3.1 Локализация и организация генных кластеров О-антигенов........................................81

3.3.2 Функциональный анализ генов гп silico..........................................................................84

3.3.3 Биохимическое подтверждение функций генов биосинтеза GDP-колитозы...............91

4 ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................................................................................96

4.1 Особенности состава и строения О-антигенов Providencia.................................................96

4.2 Серологические взаимосвязи О-антигенов Providencia и других бактерий.....................105

4.3 Генетика биосинтеза О-антигенов Providencia....................................................................109

5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..............................................................................................113

5.1 Бактериальные штаммы и выращивание бактерий..............................................................113

5.2 Выделение и деградация липополисахаридов......................................................................113

5.3 Химические и физические методы........................................................................................116

5.4 Генетические и биохимические методы...............................................................................121

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................125

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ........................................................................................................126

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................129

ПРИЛОЖЕНИЕ А Данные спектров ЯМР................................................................143

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Характеристика генов...............................................................158

1 ВВЕДЕНИЕ

Соматические О-антигены наряду с капсульными К-антигенами и жгутиковыми Н-антигенами представляют собой три основных типа биомолекул, на которых традиционно основывается серологическая классификация и идентификация грамотрицательных бактерий. С химической точки зрения О-антиген или О-специфический полисахарид (О-полисахарид) представляет собой полисахаридную цепь Б-формы липополисахарида (ЛПС). Липидная часть ЛПС (липид А) образует внешний слой бислойной наружной мембраны клеточной стенки и удерживает молекулу ЛПС на поверхности клетки за счет гидрофобных взаимодействий с фосфолипидами, образующими внутренний слой мембраны. Липид А также отвечает за большинство биологических активностей ЛПС, в том числе за его узнавание специфическими клеточными рецепторами иммунной системы хозяина, служащее сигналом для включения защитных механизмов врожденного иммунитета. О-Полисахарид обычно построен из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев) и присоединяется к липиду А через олигосахарид, называемый кором. Он ориентирован в сторону окружающей среды и несет на себе иммунодетерминанты (эпитопы), которые являются сайтами связывания для специфических антител, вырабатываемых иммунной системой в ответ на инфекцию и необходимых для эффективного фагоцитоза. В ходе эволюции сформировалось широкое структурное разнообразие О-антигенных форм даже у бактерий одного вида, что, как полагают, способствует адаптации бактерий в различных экологических нишах, а также помогает патогенам избегать адаптивного иммунитета организма-хозяина. Иммуноспецифичность и вариабельность О-антигенов служат основой для разработки серологических классификаций медицински значимых микроорганизмов, востребованных при серодиагностике бактериальных инфекций и эпидемиологическом мониторинге. В этих классификациях серологически идентичные штаммы одного вида или нескольких близкородственных видов бактерий объединены в О-серогруппы.

В последнее время активно развиваются методы молекулярного типирования бактерий, такие как полимеразная цепная реакция и технология на основе микрочипов. На генетическом уровне различия между структурами О-полисахаридов бактериальных клонов обусловлены полиморфизмом генного кластера О-антигена (ГКО) - определенного локуса генома, отвечающего за биосинтез О-антигена. Секвенирование и последующий анализ ГКО позволяют выявлять гены, специфичные для каждой О-серогруппы, и использовать их в качестве специфических маркеров для молекулярного типирования штаммов. Функциональный анализ генов, участвующих в сборке и полимеризации О-звеньев, имеет практическое значение для разработки биотехнологических подходов к получению гликовакцин нового поколения, в которых требуемые фрагменты О-полисахаридов частично

или полностью продуцируются in vivo. Структурно-генетические исследования О-антигенов ставят своей целью также ряд фундаментальных задач, таких как изучение молекулярных и. механистических основ биосинтеза гликоконьюгатов и выяснение эволюционных путей формирования разнообразия О-антигенных форм.

Настоящая работа посвящена установлению строения О-полисахаридов и характеристике ГКО представителей рода Providencia семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae). Провиденсии широко распространены в природе. Они обитают в почве, сточных водах и загрязненных водоемах; их также выделяют из большого круга живых организмов по всему миру от насекомых до акул, морских черепах и пингвинов. Бактерии Providencia составляют часть нормальной микрофлоры кишечника человека, но в то же время они являются условными патогенами, вызывая у людей с ослабленным иммунитетом воспаления мочеполовых путей, раневые инфекции и кишечные заболевания. Нередко они становятся причиной внутрибольничных инфекций.

Объектом настоящей работы стали три наиболее важных в медицинском отношении вида Providencia - P. alcalifaciens, P. stuartii и P. rustigianii. Начиная с конца 1990-х годов, систематическое химическое и иммунохимическое изучение ЛПС этих бактерий проводится в лаборатории химии углеводов ИОХ РАН совместно с Институтом микробиологии, биотехнологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша). Оно ставит своей основной целью создание молекулярной основы для классификации провиденсий. Объединенная серологическая классификация рассматриваемых трех видов Providencia включает 63 О-серогруппы, из которых к началу нашей работы в отношении строения О-полисахаридов были изучены 13 О-серогрупп. В ходе данного исследования установлены структуры О-антигенов еще 23 О-серогрупп. Наряду с распространенными компонентами бактериальных полисахаридов, в их составе, обнаружены и идентифицированы производные моносахаридов, редко встречающиеся в природных гликополимерах или найденные впервые. Выявлена корреляция структурных данных с иммуноспецифичностью О-антигенов, что позволило обосновать на молекулярном уровне серологическое родство внутри рода Providencia и между штаммами этого и других родов энтеробактерий {Proteus, Escherichia, Salmonella).

Еще одной целью работы было изучение генетики биосинтеза О-антигенов Providencia, первым этапом которого стал поиск ГКО в полногеномных последовательностях штаммов трех видов Providencia, имеющихся в доступной базе генетических данных. Локализация полиморфного ГКО на хромосоме между консервативными генами «домашнего хозяйства» срхА и yibK дала возможность разработать праймеры и провести секвенирование области cpxA-yibK в штаммах 8 О-серогрупп. Биоинформатический анализ на основе гомологии предсказанных аминокислотных последовательностей и с учетом полученных данных о

строении О-полисахаридов позволил выявить характерные особенности организации ГКО и предположительно определить функции генов, кодирующих ферменты биосинтеза О-антигенов, включая синтез специфических моносахаридных компонентов О-полисахаридов. Нуклеотидные последовательности ГКО Providencia, депонированные в международную базу данных GenBank, могут быть использованы для разработки методов молекулярного типирования изолятов провиденсий и молекулярной диагностики вызываемых ими инфекций.

Результаты работы опубликованы в 24 статьях [1-24] и 9 тезисах докладов и представлены автором на III Немецко-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Вроцлав, Польша, 2004 г.), XIV и XV Европейских симпозиумах по углеводам (Любек, Германия, 2007 г.; Вена, Австрия, 2009 г.), XXIV и XXVI Международных симпозиумах по углеводам (Осло, Норвегия, 2008 г.; Мадрид, Испания, 2012 г.), XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2009 г.), IV и V Балтийских конференциях по микробным углеводам (Хюитиэле, Финляндия, 2010 г.; Суздаль, 2012 г.) и Летней исследовательской конференции FASEB «Микробные полисахариды, имеющие значение для медицины, сельского хозяйства и промышленности» (Кэрфри, Аризона, США, 2011 г.).

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, а также включает список литературы, список сокращений и приложения (табулированные данные спектров ЯМР, характеристика генов в генных кластерах О-антигенов). Литературный обзор посвящен биосинтезу липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Глава «Результаты» начинается со вступительного раздела, затрагивающего вопросы таксономической и серологической классификации провиденсий, за которым следуют два основных раздела В первом разделе описана общая стратегия структурного анализа и приведены данные по установлению строения О-полисахаридов провиденсий. Второй раздел посвящен локализации и биоинформатическому анализу секвенированных ГКО Providencia с использованием полученных структурных данных, а также биохимическому подтверждению функций генов пути биоснтеза нуклеотидного предшественника 3,6-дидезокси-ь-лгшю-гексозы (колитозы) - одного из редко встречающихся компонентов гликополимеров. В главе «Обсуждение» рассматриваются особенности состава и строения всех 36 изученных к настоящему времени О-полисахаридов Providencia, дается обоснование иммуноспецифичности О-антигенов на уровне их детального химического строения, обсуждаются сходство и отличия ГКО Providencia от ГКО других энтеробактерий, подчеркивается фундаментальное и практическое значение проведенного исследования. Работа изложена на 164 страницах, содержит 43 рисунка, 33 таблицы и 215 литературных ссылок.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю профессору Юрию Александровичу Книрелю за постановку задачи, неизменное внимание к работе и помощь при интерпретации полученных результатов. Автор благодарит декана факультета биологических наук и биотехнологии ТЕДА Нанкайского университета (г. Тянь-дзинь, КНР) профессора Лея Ванга за предоставленную возможность проведения генетических исследований в его лаборатории и декана Института микробиологии, биотехнологии и иммунологии Университета Лодзи (г. Лодзь, Польша) профессора А. Рожальского и его сотрудников за выращивание бактерий и проведение серологических исследований. Автор искренне признателен профессору Александру Степановичу Шашкову за съемку и помощь в интерпретации спектров ЯМР, к.х.н. Нине Алексеевне Кочаровой за обучение химическим методам структурного анализа и помощь в экспериментальной работе, к.х.н. Николаю Петровичу Арбатскому за помощь в анализе компонентов на автоматических анализаторах, к.х.н. Александру Олеговичу Чижову и к.х.н. Анне Николаевне Кондаковой за съемку масс-спектров высокого разрешения, а также коллективам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН и лаборатории функциональной геномики микробов колледжа ТЕДА Нанкайского университета за ценные советы и под держку.

2 ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР Биосинтез липополисахаридов грамотрицательных бактерий 2.1 Общая характеристика липополисахарида

Окрашивание по Граму позволяет дифференцировать два основных типа клеточной стенки бактерий, которые характерны для грамположительных и грамотрицательных бактерий, дающих темно-синюю или красную окраску, соответственно. Оба типа бактерий имеют внутреннюю (цитоплазматическую) мембрану и пептидогликановый (муреиновый) каркас. Внутренняя мембрана - полупроницаемый барьер, окружающий цитоплазму и состоящий из фосфолипидного бислоя. Она регулирует транспорт веществ, в ней осуществляются процессы дыхания и биосинтез многих компонентов клеточной стенки, включая липополисахарид (ЛПС). Пептидогликан придает форму и прочность бактериальной клетке и обеспечивает ее осмотическую защиту. Его полисахаридные цепи построены из чередующихся Р-(1—>4)-связанных остатков Ы-ацетилглкжозамина и Ы-ацетилмурамовой кислоты (эфира ОкИАс и молочной кислоты) и соединены друг с другом через остатки молочной кислоты короткими пептидными сшивками. В грамположительных бактериях слой пептидогликана толстый (20-80 нм) и является наружной поверхностью клетки. В грамотрицательных бактериях тонкий слой пептидогликана (10-15 нм) окружен внешней мембраной (рис. 2.1) [25].

грамотрицател ьн ые бактерии

грамположительные бактерии

капсульныи полисахарид

липополисахарид порин

фосфолипид лииопоротеин пептидогликан белок

капсульныи полисахарид ^ М-белок

липотейхоевая кислота тейхоевая кислота

пептидогликан фосфолипид

белок

Рис. 2.1 - Строение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий. Рисунок адаптирован из статьи в книге [26]

Внешняя мембрана представляет собой асимметричный бислой, внутренний слой которого построен из глицерофосфолипидов, а внешний слой у большинства грамотрицательных бактерий (за исключением Borrelia burgdorferi, Borrelia hispanica, Sphingomonas capsúlate, Sphingomonas paucimobilis, Thermus thermophilus, Treponema pallidum и Meiothermus taiwanensis [27]) состоит из ЛПС. Внешняя мембрана включает также

липопротеины и белки, такие как порины, служащие каналами для транспорта небольших гидрофильных молекул.

Полная молекула ЛПС содержит гидрофобную часть - липид А, к которому через олигосахарид, называемый кором, присоединяется О-специфический полисахарид (О-антиген), построенный из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев) (рис. 2.2). Этот так называемый ЛПС S-типа (от англ. smooth - гладкий) характерен для бактерий, растущих в форме гладких колоний. Бактерии, образующие колонии шероховатой формы, являются мутантами, утратившими способность синтезировать О-полисахаридную цепь или присоединять ее к кору. Соответственно продуцируемый ими ЛПС R-типа (от англ. rough -шероховатый) состоит только из кора и липида А. Кроме того, некоторые бактерии синтезируют ЛПС SR-типа (semi-rough), в котором О-полисахарид представлен одним О-звеном (рис. 2.2). Долгое время считалось, что для выживания бактериям необходима минимальная структура кора, присоединенная к липиду А, однако недавно были получены жизнеспособные мутанты, синтезирующие негликозилированный липид А [28-30]. Тем не менее, О-полисахарид и кор важны для существования бактерий в природных условиях. Так, они обеспечивают эффективный барьер для антибиотиков, защиту от фагоцитоза и лизиса, опосредованного системой комплемента. Хотя ЛПС S-типа характерен для большинства встречающихся в природе бактерий, дикие штаммы некоторых важных патогенов человека, таких как Yersinia pestis [30], Bordetella pertusis [31], Neisseria meningitides [32] и Haemophilus influenzae [33], продуцируют ЛПС R-типа.

|— О-специфический полисахарид —| |- олигосахарид кора —| |- липид А -1

(О-антиген)

I— ЛПС Я-типа -1

I—ЛПС БЯ-типа -1

I— ЛПС в-типа-1

Рис. 2.2 - Схематическое строение липополисахарида

Липид А отвечает за большинство физиологических эффектов, вызываемых ЛПС в организмах животных и человека. Молекулярные механизмы этих эффект