Сканирующая зондовая микроскопия полимерных материалов и биополимеров тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.19 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ имени Н.Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи

РГб од

ЯМИНСКИЙ Игорь Владимирович

СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ И БИОПОЛИМЕРОВ

Специальность 01.04.19 - физика полимеров

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук в форме научного доклада

Москва 1997

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор физико-математических наук, профессор А.Р. Хохлов (Физический факультет МГУ)

доктор физико-математических наук, профессор В.И. Лобышев (СУНЦ МГУ)

доктор химических наук, профессор В.А. Огарев (Институт физической химии РАН)

Ведущая организация: Институт общей физики РАН

Защита состоится 22 мая 1997 г. в II00 час. на заседании Специализированного Совета Д.002.26.05 Института химической физики им. H.H. Семенова РАН в Актовом зале корпуса 6а института по адресу: Москва, Ленинский проспект, 38.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке института по адресу: Институт химической физики РАН, 117977, Москва, Воробьевское шоссе, 4.

Автореферат разослан 21 апреля 1997 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета, кандидат химических наук

Т.А. Ладыгина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Изучение структуры и локальных свойств поверхности полимерных материалов и биополимеров является одним из наиболее увлекательных приложений новых методов сканирующей зондовой микроскопии - туннельной и атомно-силовой микроскопии. Как правило, для полимерных материалов и биополимеров характерны низкая механическая жесткость и незначительная электропроводность, что ставит определенные трудности на пути визуализации поверхности этих материалов. Высокое (по сравнению с проводниками и полупроводниками) электрическое сопротивление полимеров и биообъектов препятствует процессу переноса электронов и соответственно визуализации поверхности с помощью сканирующего туннельного микроскопа. Низкая механическая жесткость биообъектов налагает жесткие требования на минимизацию силового воздействия на образец со стороны зондирующего острия как в сканирующей силовой, так и в туннельной микроскопии. Успешное наблюдение объектов с высоким электрическим сопротивлением и низкой жесткостью поверхности требует оптимизации старых и разработки новых нетрадиционных методов зондовой микроскопии.

При изучении поверхности твердых тел методы зондового анализа поверхности - сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия - продемонстрировали уникальные возможности по наблюдению атомов и молекул, а также осуществлению целенаправленных манипуляций с единичными атомами и молекулами (перемещения по поверхности, удаления, осаждения и пр.).

Применительно к биологическим объектам сканирующая зондовая микроскопия позволяет преодолеть основное ограничение растровой и просвечивающей электронной микроскопии, заключающееся в невозможности изучать непосредственно живые объекты. Электронная микроскопия исследует поверхность, запыленную проводящими материалами, либо поверхность реплик. Исследования в электронном микроскопе осуществляются в условиях вакуума, что также ограничивает круг наблюдаемых объектов и процессов на поверхности объектов. Сканирующая зондовая микроскопия позволяет проводить изучение объектов не только в вакууме, но и на воздухе и в жидких средах.

Цель работы. Основная цель работы заключается в разработке методов и создании аппаратуры зондовой микроскопии для изучения материалов с высоким электрическим сопротивлением и низкой механической жесткостью. Основными задачами, решение которых определяет успешное применение зондовой микроскопии применительно к органическим и биообъектам, являются:

- оптимальный выбор субстрата, оказывающего минимальное возмущение на картину наблюдаемого изображения,

- определение способа иммобилизации объекта на подложке (субстрате),

выбор наиболее подходящих условий наблюдений (температуры, состава окружающей среды, влажности воздуха и пр.),

- уменьшение аппаратных эффектов и искажений, вносимых измерительной аппаратурой,

- выбор оптимального метода измерений,

- адекватная интерпретация и выбор наглядного представления результатов.

Объектом настоящего исследования явились в основном перспективные полимерные материалы и играющие существенную роль во многих процессах в живой природе различные биополимеры.

Актуальность работы. Сканирующая зондовая микроскопия является динамично развивающимся направлением в физике, химии и биологии поверхности. За последние несколько лет появился ряд новых методов зондовой микроскопии, высоко зарекомендовавших себя при изучении полимерных объектов. Среди них следует выделить ультранизкотоковую сканирующую туннельную микроскопию, позволяющую исследовать объекты на проводящих и диэлектрических подложках. В случае диэлектрической подложки проводимость обеспечивается тонкой пленкой адсорбированной воды. Перспективными режимами атомно-силовой микроскопии являются различные резонансные методы измерения профиля и упругих свойств поверхности. Последнее время эти методы интенсивно внедряются в изучение сложных органических и биологических объектов. Открываются перспективы решения фундаментальных и прикладных задач молекулярной диагностики биополимеров, создания новых полимерных материалов с заданными свойствами.

Практическая ценность. Проведенные исследования продемонстрировали неразрушающий характер исследования поверхности органических и биологических объектов. Показана возможность достижения высокого пространственного разрешения при исследовании структуры полимерных материалов и биополимеров. Атомно-силовая микроскопия позволяет изучать совокупность наномеханических свойств материалов: упругость, трение, пластичность, адгезию, адсорбционную способность. Сканирующая туннельная микроскопия дает новую информацию об электрических и электронных свойствах поверхности, в том числе о процессах переноса заряда в органических тонких пленках и биообъектах.

В результате выполнения работы создана серия оригинальной аппаратуры сканирующей зондовой микроскопии, в том числе, сканирующий туннельный и атомно-силовой микроскопы с субнанометровым пространственным разрешением (соавторы С.И. Васильев, Ю.Н. Моисеев, В.И. Панов, C.B. Савинов). Разработанные микроскопы позволяют визуализировать отдельные атомы на поверхности различных материалов (упорядоченные органические пленки, слоистые материалы, металлы и пр.). Эти конструкции послужили базовой моделью при создании мелкосерийного

производства сканирующих туннельных и атомно-силовых микроскопов серии "Скан". Микроскопы серии "Скан" успешно применяются в академических и прикладных научных институтах, учебных заведениях высшей и средней школы. Интенсивные исследования с применением этих приборов осуществляются научными группами на Физическом и Химическом факультетах МГУ им. М.В. Ломоносова, в Ростовском гос. университете, Донецком гос. университете, Физическом институте РАН, Институте общей физики РАН, Санкт-Петербургском электро-техническом университете и других научных центрах.

Закончена практическая разработка принципиально новой конструкции зондового микроскопа на базе цифрового сигнального процессора с цифровой системой автоматического регулирования (соавторы A.B. Степанов, C.B. Савинов). Создано программное обеспечение для перспективных операционных систем Windows 95, Windows NT и OS2 для управления и контроля параметрами зондового микроскопа, построения и обработки экспериментальных данных и трехмерных изображений исследуемых поверхностей (соавтор A.C. Филонов). Программное обеспечение используется при анализе изображений поверхности в Институте биоорганической химии РАН, Институте элементоорганических соединений РАН, на Физическом и Химическом факультетах МГУ.

Разработан ультранизкотоковый сканирующий туннельный микроскоп с регистрацией туннельных токов в пико- и фемто-амперных диапазонах.

Составлен полный библиографический указатель научных работ по методам локального зондирования поверхности (1981-1996).

Научная новизна работы. Разработаны методы иммобилизации и наблюдения с помощью сканирующего туннельного и атомно-силового микроскопа липидных пленок и структур (липосом). Впервые на примере белка Цитохром Р450 продемонстрирована возможность визуализации белковых молекул, встроенных в липидную мембрану из фосфатидилхолина.

Разработаны методы иммобилизации живых энтеробактерий и визуализации тонкой структуры полимерной стенки бактерий. Впервые обнаружены морфологические изменения наружной поверхности стенки штаммов энтеробактерий, полученных при разработке живых векторных вакцин методом генетического обмена.

Обнаружены процессы самоорганизации и кристаллизации в смешанных органических пленках. Получены прямые результаты пространственной координации смешанных двух- и трехкомпонентных пленок с контролируемой степенью полярности.

Выяснены границы применимости макроскопической модели для описания сил вязкого гидродинамического трения в тонких пленках (до ед. нм) между твердыми поверхностями.

Разработан метод контроля остаточных загрязнений чистых жидкостей методом атомно-силовой микроскопии при избирательной

адсорбции на проводящих и диэлектрических подложках.

Обнаружено появление поверхностных зарядовых сверхструктур в пленках Ленгмюра-Блоджетт жидкокристаллических полимеров.

Методами зондовой микроскопии получена прямая информация о конформационных переходах молекул ДНК при взаимодействии с различными поверхностно-активными веществами в полярных и неполярных жидкостях.

Апробация работы. Основные результаты работ доложены на международных и отечественных конференциях:

SPIE's Technical Symposium on Microelectronic Processing Integration (Santa Clara, USA, 1990):

V.I. Panov, S.V. Savinov, S.I. Vasil'ev, I.V. Yaminsky, Manufacturing issues control in microelectronics by scanning tunneling microscopy;

SPIE Symposium (США, 1990):

Shapiro A.G., Yaminsky I.V., Nondestructive investigations of multilayer dielectrical coating.

Международный симпозиум "Scanning tunneling microscopy (STM'91)" (Интерлакен, Швейцария, 1991):

1. A.A. Belov, I.V. Yaminsky, V.V. Yaminsky, AFM with Capacitance Sensor for Hydrodynamic Studies;

2. S. Savinov, S. Vasil'ev, I. Yaminsky, STM Tip Preparation Using Step Etching;

3. Yu.N. Moiseev, V.Panov, S. Savinov, P. Todua, D. Znamensky, I. Yaminsky, Atomic Force Microscopy of Comb-Like Liquid Crystalline Monolayers.

4. Yu.N. Moiseev, V.I. Panov, S.V. Savinov, S.I. Vasil'ev, I.V. Yaminsky, AFM and STM Activities at Advanced Technologies Center.

Международная конференция "Scanning tunneling microscopy (Хемнитц, Германия, 1991)":

1. N.S. Maslova, Yu.N. Moiseev, V.I. Panov, S.V. Savinov, S.I. Vasilev, I.V. Yaminsky, Tunneling through Adsorbate and Thin Films, Induced Conductivity;

2. V.V. Yaminsky, I.V. Yaminsky. Hydrodynamic Investigations in Liquid Media.

Международный симпозиум "Nanostructures: Physics and Technology (Санкт-Петербург, 1993)":

A.A. Ejov, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, J. Pan, C. Leygraf, D. Thierry, Nanoscale modification of oxide semiconductor layer on Ti surface using electrochemical treatment: Scanning tunneling microscopy/spectroscopy observation.

УШ Симпозиум no растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 1993):

Moiseev Yu.N., Panov V.I., Savinov S.V., Yaminsky I.V., Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Atomic Force Microscopy of Thin Films.

Международная конференция "Nano'2" (Москва, 1993):

S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, STM observation of corrosion processes on Ti, Ni and Fe surfaces.

12th International Conference on Noise in Physical Systems and 1/f Fluctuations (Chicago, USA):

F. Bordoni, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, V.l. Panov, I.V. Yaminsky, Low frequency noise in scanning tunneling microscopy measurements.

Scanning tunneling microscopy (Пекин, Китай, 1993):

1. Yu.N. Moiseev, V.l. Panov, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, AFM and STM Investigations at Advanced Technologies Center;

2. A.A. Ejov, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, J.Pan, C. Leygraf, D. Thierry, STM investigation of corrosion processes on Polished Ti Surfaces.

Nanostructures: Physics and Technology (Санкт-Петербург, 1994):

Tuzov I.V., Demin V.V., Yaminsky I.V., Ex-situ observation of contaminants adsorbed on cleaved mica and graphite in liquid media using atomic force microscopy.

8th International Conference on Surface and Colloid Science (Adelaida, Australia, February 1994):

I.V. Yaminsky, AFM with Capacitative Sensor for Investigation in Liquid Medium.

Микроэлектроника-94 (Звенигород, ноябрь 1994):

A.B. Емельянов, B.B. Протасенко, B.H. Рябоконь, Н.С. Самсонов, A.B. Степенов, И.В. Яминский, Физическое моделирование процессов считывания в атомарных ЗУ на основе самоорганизующихся упорядоченных структур.

Восьмая международная конференция "Сканирующая туннельная микроскопия/спектроскопия и родственные методы STM'95 (Scanning tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques), 1995, США:

I.V. Yaminsky, L.G.T. Eriksson, P.M. Claesson, J.C. Eriksson, AFM and STM Investigation of Organic LB Films.

11-ая международная конференция "Поверхностные силы", 1996, Москва, Россия:

Gadau М., Hietschold М., Yaminsky I.V., Force measurements in scanning tunneling microscopy experiments.

International Conference "Nanomeeting" (Minsk, Belarus, 1995):

1. Stepanov A.V., Yaminsky I.V., The Role of Localized Processes in Tunnel Current Low-Frequency Noise Generation,

2. I.V. Tuzov, I.V. Yaminsky, Ex-situ Observation of Contaminants Absorbed on Cleaved Mica and Graphite in Liquid Media using Atomic Force Microscopy.

3. S.V. Savinov, A.V. Stepanov, I.V. Yaminsky, Fast Data Acquisition System for Local Probe Microscopy and Nanotechnology.

4th European Workshop on Modern Developments and Applications in Microbeam Analysis (St.Malo, France, 1995):

V. Oleshko, R.Gijbels, W. Jacob, I. Yaminsky, V. Panov, M. Alfimov, Combined characterization of nanostructures by means of AEM and STM. Международная конференция "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (Санкт-Петербург, 1996):

1. E.B. Аплеталина, M.O. Галлямов, Ю.Д. Иванов, О.И. Киселева, В.Ю. Уваров, И.В. Яминский. Визуализация липосом и протеолипосом методами сканирующей зондовой микроскопии.

2. М.О. Галлямов, O.A. Пышкина, В.Г. Сергеев, А.Б. Зезин, В.А. Кабанов, И.В. Яминский. Конформация комплексов ДНК-ПАВ в водных и органических средах: СТМ-исследование.

Fourth International Conference on Nanometer Scale Science & Technology Nano-IV (Beijing, 1996):

M.O. Gallyamov, V.A. Kabanov, O.A. Pyshkina, V.G. Sergeev, A.B. Zezin, I.V. Yaminsky, Surfactant-induced DNA condensation: STM study.

7th Annual Symposium "Photoinduced Charge Transfer: Reactive Processes in Organized Media (Rochester, NY 14627, USA; June 26-28, 1996):

Yu.D. Ivanov, V.Yu. Uvarov, A.N. Romanov, M.O. Gallyamov, O.I. Kiselyova, I.V. Yaminsky, STM Study of Charge Transfer in Cytochrome P 450 Incorporated in Proteoliposomes.

Седьмой съезд эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997):

Демин В.В., Огнева Л.В., Яминский И.В. Сканирующая зондовая микроскопия в исследованиях структуры поверхности бактериальных клеток.

Международная конференция "Фундаментальные проблемы науки о полимерах' (Москва, 1997):

Яминский И.В., Демин В.В., Бондаренко В.М. Применение сканирующей силовой микроскопии для характеризации полимерной структуры клеточной стенки генетически связанных штаммов энтеробактерий.

Результаты работ доложены на научных семинарах Физического и Химического факультетов МГУ, Института проблем нефти и газа РАН, Университета г. Л'Аквилла (Италия), Института химии поверхности (Стокгольм, Швеция), Австралийского национального университета.

На основании научных материалов диссертации опубликованы обзорные статьи "Сканирующая зондовая микроскопия. Методы и аппаратура" (И.В. Яминский. Российский химический журнал, 1996, том XL, N 1 111-120), "Работы ученых МГУ в области туннельной спектроскопии и наноэлектроники" (И.В. Яминский, Электронная промышленность, 1993, N 10, 25-28), "AFM and STM Activities at Advanced Technologies Center" (Yu. N. Moiseev, V.l. Panov, S.V. Savinov, S.I. Vasil'ev, I.V. Yaminsky, Ultramicroscopy, 42-44, 1596-1601, (1992)). Составлен библиографический указатель по методам сканирующей зондовой микроскопии (6200 ссылок).

Результаты работ отражены в 32 оригинальных статьях в отечественных и зарубежных научных журналах и сборниках, 29 тезисах докладов на научных конференциях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Исследование топографии диэлектрических, проводящих или полупроводниковых поверхностей с рекордным субнанометровым пространственным разрешением - существенная, но далеко не единственная область применения приборов и методов локальной зондовой микроскопии (См. например, материалы конференций STM'91, STM'93, STM'95: Ultramicroscopy, 1992, 42-44; J. Vac. Sei. Technol. В., 1994, 12(3) (1994), J. Vac. Sei. Technol., В., 1996, 14(2)). Среди перспективных направлений зондовой микроскопии можно отметить:

исследование поверхности и локальных свойств материалов, для которых характерна низкая механическая жесткость - полимеров и биополимеров,

характеризация различных динамических процессов на поверхности (кристаллизации, конформационных переходов и пр.),

изучение процессов переноса электронов в биологических системах,

исследование свойств ультратонких приграничных пленок жидкости вблизи поверхности твердого тела.

В настоящей работе были разработаны две основные модификации зондовых микроскопов, получившие в последствии наименование "Скан" и "ФемтоСкан". Созданные модели послужили прототипами зондовых микроскопов для серийного производства.

Основные особенности разработанных приборов заключаются в следующем. В микроскопах серии "Скан" применена прецизионная электроника с аналоговой обратной связью. Механические системы позволяют осуществлять характеризацию поверхностей в режимах сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии. В атомно-силовом микроскопе в качестве измерителя малых перемещений применен туннельный датчик. Приборы позволяют визуализировать атомную и молекулярную структуру поверхности твердых тел.

В электронной системе зондового микроскопа "ФемтоСкан" применена цифровая обратная связь. Электронная схема построена на базе специализированного цифрового сигнального процессора, обеспечивающего высокую скорость при выполнении различных вычислений, которые часто применяются в системах автоматического регулирования. Основными достоинствами цифровой обратной связи являются высокая гибкость и адаптируемость к конкретным задачам исследований. Электронная система построена по компактной схеме: набор прецизионных цифро-аналоговых и аналого-цифровых преобразователей, подсоединенных через интерфейсную карту к внутренней шине персонального компьютера. Ведущую роль при этом приобретает интеллектуальное программное обеспечение. Для зондового микроскопа "ФемтоСкан" разработано специализированное

программное обеспечение для перспективных операционных систем Windows 95 и 96, Windows NT и OS/2. В механическую систему прибора входит ультранизкотоковый сканирующий туннельный микроскоп с точностью измерения туннельного тока до десятков фемтоампер.

На базе микроскопа "Скан" создана экспериментальная установка для одновременной регистрации туннельного тока и сил в туннельном контакте. Измерения туннельного тока проводились в диапазоне 0.05 -10 нА, сил между иглой и образцом - в диапазоне Ю-5 -Ю-10 н

При измерениях сил в адгезионном контакте одним из существенных и трудно реализуемых на практике требований является устранение продольного перемещения контактируемых тел. Обеспечение неподвижной зоны контакта при различных нагружающих силах и в различных динамических режимах позволяет проводить адекватную интерпретацию экспериментально измеренных силовых зависимостей. Разработанная аппаратура ультрадинамометра с емкостным датчиком применена для измерения гидродинамического трения в ультратонких слоях воды.

Измерения шумовых характеристик туннельного перехода проводили с использованием стандартной и специально адаптированной аппаратуры.

Характеризация органических и биологических структур больших размеров (более 1 мкм) проведена на атомно-силовых микроскопах "Nanoscope-2" и "Nanoscope-3" (фирма Digital Instrumnets, Santa Barbara, USA).

1.1. Выбор и характеристика подложек для фиксации образцов

Оптимальный выбор подложек для нанесения образцов имеет существенное значение в зондовой микроскопии.

Примеры изображения атомной и молекулярной структуры поверхности чистых и модифицированных подложек, традиционно применяемых в качестве субстрата в зондовой микроскопии, представлены на Рис. 1.1. Подложки из слюды и высокоориентированного графита получают методом межплоскостного скалывания, что обеспечивает уникальную чистоту их поверхности при низком содержании поверхностных дефектов на площадях в десятки-сотни мкм2. Высококачественная полировка кремния позволяет приготавливать пластины с низкой шероховатостью (среднеквадратичный перепад высот менее 0,2 нм на площадях в 1 мкм2).

В работе были применены как чистые, так и модифицированные подложки. Модификация поверхности подложки осуществлялась путем нанесения (переноса) монослойных и бислойных пленок или путем осуществления контролируемых поверхностных химических реакций.

Наблюдения биополимеров проведены с применением различных субстратов, что позволило оценить влияние подложки на результаты измерений зондовой микроскопии.

Рис. 1.1. Изображения поверхности подложек с атомным и молекулярным пространственным разрешением. Наблюдения поверхности с помощью сканирующего туннельного микроскопа: высокоориентированного пиролитического графита (1,9x1,9 нм2)- (а), монослоя стеариновой кислоты на поверхности графита (2,4x2,4 нм2) -(б), дисульфида молибдена (3,5x2,6 нм2) - (в). Наблюдения поверхности слюды методом атомно-сшювой микроскопии (7,3x8,4 нм2) - (г).

1.2. Контроль чистоты подложек

При осаждении образца на поверхность субстрата из жидкой фазы существенное влияние на наблюдаемую картину может оказать адсорбция остаточных примесей из жидкости, что в конечном итоге затруднит интерпретацию экспериментальных данных. Наличие незначительных примесей в жидкости может вследствие их адсорбции на подложке или исследуемом объекте оказывать радикальное влияние на поверхностные процессы.

Высокая чувствительность атомно-силовой микроскопии позволяет проводить исследования адсорбции вещества на твердой поверхности из растворов с предельно низким содержанием примесей, а также проводить изучение начальных этапов адсорбции: образование зародышей, кластеров и островков пленок.

• В работе проведено изучение адсорбции примесей из чистых растворов (дистиллированная вода, органические растворители и пр.) на различных подложках. Показано, что применение методов атомно-силовой микроскопии дает уникальную информацию о начальных стадиях адсорбции примесей из чистых растворов, позволяет качественно определять степень загрязненности чистых жидкостей.

С помощью атомно-силовой микроскопии можно контролировать количество (объем) вещества, адсорбированного на поверхности подложки из жидкой фазы.

При наблюдение биообъектов, осажденных из жидкой фазы, на поверхности субстрата практически всегда наблюдаются загрязнения, обусловленные адсорбцией остаточных примесей даже при применении сверхчистых растворителей. Для адекватной интерпретации результатов измерений зондовой микроскопии необходимо осуществлять аккуратный контроль всех применяемых химических реагентов по наличию и характеру имеющихся в них примесей. Существенно, что контроль чистоты исходных препаратов проще и надежнее всего проводить с применением методов зондовой микроскопии.

На рис. 1.2 представлены результаты наблюдения адсорбции примесей из дистиллированной воды на поверхности слюды, которая происходит с образованием как жестких, т.е. прочных, сильносвязанных, так и легко деформируемых и смещаемых поверхностных структур. Жесткие образования адсорбированного вещества видны на изображениях в виде стабильных светлых выступов. Мягкие формы адсорбированного вещества при сканировании смещаются. Если затем увеличить размеры кадра, то на первом увеличенном изображении можно заметить следы смещенного адсорбированного вещества. В результате сканирования слабосвязанные с подложкой примеси удаляются и поверхность слюды очищается. На рис. 1.2 б изображен фрагмент границы очищенного участка. На левой половине кадра пленка адсорбата удалена в результате многократного сканирования.

Рис. 1.2. а) Изображение поверхности слюды с остаточными следами адсорбированного вещества. Многократное сканирование осуществлено в области I. б) Изображение участка границы области сканирования: I -область многократного сканирования, II- в этой области осуществлено однократное сканирование при записи данного кадра.

На правой половине она присутствует, и это приводит к увеличению шероховатости. При размере окна 1 мкм2 разброс амплитуд высот для чистого участка составляет 0,8-1,4 нм, среднеквадратичное значение -0,15-0,2 нм. Для загрязненного участка колебания этих параметров составляют 2,5-3 нм и 0,3-0,4 нм соответственно.

Определение незначительных примесей в объеме жидкости является трудоемкой задачей. Однако при осаждении примесей на подложки высокая чувствительность метода сканирующей силовой микроскопии позволяет проводить количественный анализ концентрации примесей. Правильный подбор используемых подложек с заданными химическими свойствами создает условия для проведения селективного анализа примесей.

Чувствительность метода можно оценить следующим образом. Пускай п - поверхностная концентрация молекул адсорбционного слоя (число молекул на ед. площади подложек), Н - первоначальная толщина слоя жидкости (до испарения). Если при N измерениях (получении СТМ или АСМ кадра) зарегистрировано N молекул, то усредненная величина - одна молекула на кадр является разумным критерием чувствительности метода. При построении изображения поверхности по типичному значению точек 400x400 различить единичную молекулу возможно при размере кадра 100 нм. Размер молекулы условно принят 1x1x1 нм^, в изображении молекул участвует 16 точек. Это соответствует поверхностной концентрации молекул п~ 10~4. При первоначальной толщине слоя жидкости Н= 1 мм, это будет соответствовать объемной концентрации 10" Ю. Проведенная выше оценка чувствительности не является вполне строгой, поскольку не

учитывает различные факторы адсорбции. Так например, адсорбция может происходить с образованием больших кластеров, вероятность обнаружения которых может быть невелика. Предложенный метод напоминает широко используемый способ определения чистоты, например, воды по изучению следов адсорбированного вещества после испарения воды на чистом стекле. Следует отметить, что наилучшие образцы научной аппаратуры для определения чистоты воды (например, методами седиментации или фотометрии: Fison Scientific Equipment, International Apparatus, Catalogue 1994/1995, Bishop Meadow Road, Loughborough, Leicestershire LE11 ORG, United Kingdom, pp. 973980) позволяют регистрировать объемные концентрации примесей на уровне не лучше 10~8. Применение сканирующего силового микроскопа позволяет повысить чувствительность наблюдений на несколько порядков.

Атомно-силовой микроскоп можно применять не только для контроля чистоты образцов, но и для некоторой очистки зафиксированных биологических объектов и структур. При длительном сканировании поверхности образца зондом атомно-силового микроскопа наблюдается удаление из поля обзора незафиксированных загрязнений. Аналогичная картина наблюдается и в сканирующей туннельной микроскопии: при многократном повторном сканировании выбранной области образца снижается уровень шума туннельного перехода и происходит улучшение качества получаемых изображений.

Такой метод воздействия (многократное сканирование при значительных силах воздействия между зондом и образцом) часто используют при нанолитографии в атомно-силовой микроскопии для удаления участков в мягких органических и полимерных пленках (см. рис. 1.3).

Рис. 1.3.

Пример нанолитографии, осуществленной с помощью атомно-силового микроскопа на поверхности блоксополимера бутадиен-стирол. Размер кадра 3x3 мкм2.

1.3. Погрешности и артефакты зондовой микроскопии

Для сканирующей зондовой микроскопии характерен ряд погрешностей, аппаратных эффектов и часто наблюдаемых артефактов, знание и учет которых необходим для правильной интерпретации экспериментальных данных.

Для перемещения иглы (или образца) в сканирующих зондовых микроскопах используется пьезокерамический манипулятор. Неточности перемещения, допускаемые пьезоманипулятором, нелинейность, гистерезис, крип (медленное изменение размеров манипулятора после скачкообразного изменения прикладываемого к электродам напряжения) относятся к устранимым погрешностям. Наиболее простым методом компенсации ошибок манипулятора является программно-аппаратный. Управляющее напряжение формируется по специальным алгоритмам с учетом конкретных свойств керамики, а также скорости и амплитуды требуемых перемещений.

Сложнее обстоит дело с температурным дрейфом, который определяется недетерминированным процессом изменения температуры окружающей среды, а, следовательно, и изменением температуры (соответственно и линейных размеров) деталей самого прибора. Компенсация температурного дрейфа по нормали к образцу, как правило, осуществляется программным образом, например, путем вычитания плоскости среднего наклона из полученного изображения. Температурный дрейф в плоскости образца можно оценить в процессе измерений за счет изменения направления сканирования или путем отключения развертки по одному из двух направлений.

В практических схемах микроскопов удается добиться относительной точности перемещений лучше, чем 1%. В дорогостоящей метрологической аппаратуре зондовой микроскопии используются следящие системы обратной связи по трем координатам с применением линейных датчиков малых перемещений.

Конечный радиус зондирующего острия приводит к уширению видимых размеров одиночных структур. При наблюдении одиночных нитей ДНК или отдельных молекул белка с помощью атомно-силового микроскопа может происходить многократное увеличение размеров изображения по сравнению с фактическим для исследуемого образца. Типичное значение наблюдаемой ширины молекулы ДНК достигает 20 - 40 нм при наблюдениях на воздухе в обычных лабораторных условиях (относительная влажность 40-70%). Снижение относительной влажности окружающей среды, как правило, приводит к уменьшению видимой ширины молекулы ДНК (15-20 нм). Конечный радиус острия зонда атомно-силового микроскопа приводит к тому, что наблюдаемый средний диаметр единичных белковых молекул возрастает до 30-50 нм при исходной величине в 4 нм. Наличие дополнительных боковых выступающих отростков на зондирующем острие может приводить к раздвоению изображений.

Асимметричность острия зондового микроскопа вызывает изменение видимой формы отдельных структур, например, удлинение

всех частиц в одном направлении. В подозрительных случаях для контроля формы острия необходимо использовать специальные тестовые структуры с известным профилем.

При исследовании периодических структур форма острия не приводит к погрешностям в оценке характерного периода, хотя может влиять на измеряемую амплитуду шероховатости. При примерном совпадении дискретного шага манипулятора и периода решетки можно регистрировать изображения с плавноизменяющимся видимым периодом. При этом видимый период на изображении зависит от величины дискретного перемещения манипулятора в процессе измерений. Такая картина возникает вследствие хорошо известного в радиофизике стробоскопического эффекта.

Традиционной для сканирующей туннельной микроскопии подложкой для нанесения образцов является поверхность высокоориентированного пиролитического графита. Для графита известно большое число артефактов, которые можно разделить на три основные группы:

1) появление аномальной высоты гофрировки на изображениях с атомным разрешением,

2) регистрация аномального периода, не характерного для кристаллической решетки графита,

3) наблюдение периодических структур вдоль атомных ступенек на поверхности графита.

Различному объяснению первых двух типов аномалий посвящено большое количество статей. Здесь уместно отметить, что при анализе аномалий не следует ограничиваться только измерением топографии поверхности. Как правило, при таких изображениях топографии наблюдаются и аномальные зависимости туннельного тока от расстояния между иглой и образцом. Эти аномалии, по всей видимости, не имеют общей причины происхождения и соответственно унифицированного объяснения, а определяются различными факторами, отражающими состояние поверхности графита и зондирующего острия, чистотой окружающей атмосферы, адсорбцией примесей из окружающей среды.

Аномальному изображению атомных ступенек на графите в значительной степени соответствует повышенная реакционная способность дефектных участков, для которых характерно наличие разорванных химических связей.

Возможность появления артефактов надо иметь в виду при изучении органических и биологических объектов. Некоторое количество серьезных ошибок, допущенных на начальном этапе применения сканирующей туннельной микроскопии (например, опубликование в журнале Science ступеньки на графите под видом ДНК) создали ложное впечатление о непригодности графитовой подложки для биоисследований. Четкое понимание и систематизация возможных артефактов позволяет исключить их влияние на точность в интерпретации экспериментальных данных зондовой микроскопии.

2. ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТИ И ЛОКАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ТОНКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ПЛЕНОК

Тонкие органические пленки представляют существенный интерес для зондовой микроскопии по крайней мере по двум причинам. Во-первых, тонкие пленки - это модельный объект для изучения как эффектов туннелирования методами туннельной микроскопии, так и механических свойств на уровне нанометровых масштабов методами атомно-силовой микроскопии. Во-вторых, тонкие пленки являются идеальным материалом при создании подложек с заданными физико-химическими свойствами. Модифицирующие покрытия значительно расширяют класс субстратов, пригодных для иммобилизации объектов исследования. Так, нанесение монослойных органических пленок на поверхность слюды позволяет создавать ровные поверхности с контролируемой степенью полярности (гидрофильности/гидрофобности).

2.1. Модифицирующие покрытия производными соединениями линейных насыщенных углеводородов

Слюда является наиболее распространенным материалом для приготовления подложек в атомно-силовой микроскопии. Чистую поверхность на слюде образуют межслойным скалыванием. Образованные при этом участки поверхности представляют собой кристаллические плоскости с чрезвычайно низким количеством дефектов. Уникальные свойства слюды обеспечили ее широкое применение в атомно-силовой микроскопии для визуализации органических и биологических объектов. Подложки из слюды оказались весьма перспективными при наблюдениях биообъектов с помощью ультранизкотоковой сканирующей туннельной микроскопии. Водная пленка, адсорбированная на поверхности слюды, имеет достаточную электропроводимость для наблюдения биообъектов в пикоамперном диапазоне значений токов.

Чистая (свежесколотая) поверхность слюды обладает ярковыраженными гидрофильными свойствами. Для создания гладких гидрофобных поверхностей с контролируемой степенью полярности нами осуществлено осаждение одно- и многокомпонентных пленок производными насыщенных линейных углеводородов на поверхность слюды по методу Ленгмюр-Блоджетт. В качестве исходных веществ выбраны эйкосиламин СНз-(СН2)19-МН2, арахиновая кислота СН3-(СГЬ^з-СООН, 1-эйкосанол СНз-(СН2)19-ОН (молекулы с одной полярной группой), а также докосандионовая кислота НООС-(СН2)2о-СООН и 1,22 докосандиол НО-(СН2)22-ОН (две полярные группы). В качестве подложки была выбрана разновидность слюды - мусковит КАЬ[А151зОю](ОН,р2), для которой характерно образование совершенных пластинчатых кристаллов с площадью в десятки и сотни кв. см. Перенесение пленок на поверхность слюды проведено при давлении 30 мН/м. Пленки, состоящие из молекул с одним полярным хвостом, образуют практически бездефектные монослойные покрытия.

Высокая адгезия обусловлена электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженной поверхностью слюды (вследствие растворения в воде ионов калия) и полярной головой молекул производных углеводородов. Наибольшая адгезия достигается для пленок эйкосиламина с положительно заряженной аминной группой. Небольшое количество дефектов в форме округлых дырок вызвано, по всей видимости, несоответствием между размером элементарной ячейки слюды (0,52 нм), несущей единичный отрицательный заряд, и характерным периодом полотноупакованной органической монослойной пленки (-0,45 нм). При варьировании процентного состава многокомпонентных пленок (различное содержание молекул с одним и двумя полярными хвостами) зарегистрировано изменение угла смачивания в пределах 80°-120°. При возрастании относительного количества двуполярных молекул замечено образование дополнительных слоев в виде островковых структур.

2.2. Наблюдения процессов самоорганизации органических пленок

Атомно-силовая микроскопия позволяет наблюдать динамические процессы самообразования в органических пленках. Нами была приготовлена модельная система с равным молярным содержанием эйкосиламина и докосандиола. При таком составе происходит существенное вытеснение молекул докосандиола на верхние слои относительно слюды с образованием плотноупакованных кристаллов различной высоты (рис. 3.1). Наличие краевых углов кристаллов в 120° указывает на гексагональную упаковку. Длина молекул эйкосиламина и докосандиола отличается на 0,3 нм. Измерения высоты отдельных слоев позволяют утверждать, что кристаллы образованы молекулами докосандиола. Представленное на рис. 3.2 изображение соответсвует двум монослоям докосандиола, на поверхности которого происходит образование третьего монослоя. При механическом взаимодействии верхнего монослоя с зондом (иглой) атомно-силового микроскопа происходит перемещение этого островка по поверхности второго монослоя. Однако при этом значительное механическое воздействие со стороны зонда не приводит к удалению молекул докосандиола с пьедестала, образованного первыми двумя монослоями. Наблюдаемая картина показывает, что молекулы верхнего островка, находящиеся на геометрическом возвышении, находятся в энергетической потенциальной яме. Многократное сканирование при попеременной кадровой развертке вверх и вниз приводит каждый раз лишь к частичному перемещению островка по направлению медленного сканирования. Различия в размерах островка на последовательных изображениях обусловлены тем фактом, что одна и таже игла одновремено осуществляет как перемещение островка, так и его визуализацию.

Слой пленки, прилегающей к поверхности слюды, состоит из молекул эйкосаниламина и, по всей видимости, частично из молекул докосандиола, которые становятся центрами зарождения отдельных

Рис. 3.1. Изображение кристаллов докосандиола на поверхности модифицированной слюды. Размер кадра 15 х 15 мкм2.

Рис. 3.2. Изображения кристалла докосандиола получены последовательно: а-б-в-г. Направления медленного сканирования обозначены стрелками. Размер кадра 2x2 мкм2.

кристаллов. Дальнейший вертикальный рост кристаллов обусловлен энергетически благоприятным взаимодействием между гидроксильными группами докосандиола.

2.3. Изучение процессов деградации поверхности титановых биоимплантантов

Изучение биологических объектов методами зондовой микроскопии выдвигает ряд требований к поверхностным свойствам субстрата, в частности, наличие химической инертности. Материалы с низкой химической активностью и высокой механической прочностью можно применять не только в качестве подложек, но и использовать при разработке различных биоимплантантов. Титан является перспективным материалом для задач восстановительной хирургии. Образование пассивирующих покрытий на поверхности титана играет ключевую роль для обеспечения его биосовместимости. Методами сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии проведена характеризация топографии и электрических свойств тонких оксидных пленок, сформированных в фосфатном буфере. Предполагается, что деградация поверхности титана в мышечных тканях может быть обусловлена наличием сильного окислителя - перекиси водорода Н2О2. Показано, что добавление перекиси водорода в буферный раствор приводит к процессам медленной коррозии, в результате которой происходит увеличение шероховатости оксидного слоя.

2.4. Тонкие пленки линейного ориентированного углеродного полимера

Углерод является традиционным материалом для изготовления подложек для зондовой микроскопии, и в первую очередь, сканирующей туннельной микроскопии. Методом пиролиза получают качественные подложки высоокориентированного пиролитического графита (ВОПГ). Другой модификацией углерода, перспективной для задач микроскопии, является линейный углеродный полимер - карбин. Молекулы карбина представляют собой линейные цепочки углерода с эр1 гибридизацией электронной оболочки атомов. Пленки ориентированного углерода контролируемой толщины получают распылением графита в плазменном разряде. С помощью атомно-силового микроскопа проведено измерение толщины пленки, исследована структура и молекулярная упаковка углеродной пленки.

Метод определения толщины пленки состоит в следующем. Пленка заданной толщины формируется на кристаллической поверхности хлорида натрия ЫаС1. Образованную пленку отделяют от подложки в дистиллированной воде и переносят подложку из слюды: при растворении №С1 в воде образуется свободно плавающая углеродная пленка, которую осаждают на поверхность слюды. Толщину пленки определяли по изучению участков границы осажденной пленки. Среднестатистическое значение толщины пленки определяли из

измерений по различным участкам границы пленки. На изображениях пленки большого масштаба хорошо различимы прямоугольные полосы. Происхождение полос вызвано структурой кристалла поваренной соли (кубическая гранецентрированная решетка), служившей субстратом при нанесении углеродной пленки.

Атомно-силовая микроскопия высокого разрешения демонстрирует, что отдельные молекулы углеродного полимера образуют гексагональную упаковку с периодом около 0,5 нм. В Фурье разложении хорошо различимы шесть максимумов, расположенных в вершинах правильного шестиугольника. Результаты атомно-силовой микроскопии находятся в хорошем согласии с данными по дифракции электронов.

Углеродные пленки имеют низкую шероховатость с характерным периодом 10-30 нм. Среднеквадратичное отклонение толщины пленки составляет около 1 нм при размере анализируемой площади в 1 мкм2.

Углеродные пленки имеют высокое электрическое сопротивление, однако сканирующий туннельный микроскоп позволяет получать их устойчивые изображения. Такие пленки могут служить модельными системами при изучении процессов туннелирования через различные органические пленки с диэлектрическими свойствами.

2.5. Исследование структурных изменений в полимерных пленках

Атомно-силовая микроскопия может быть успешно применена для характеризашш как однородных, так и нанокомпозитных полимерных пленок.

При исследовании неоднородных пленок помимо профиля поверхности возможно получение информации об их локальных механических свойствах. На изображении пленки блоксополимера бутадиен-стирол (Рис. 3.3) различимы доменные включения бутадиена, имеющие округлую форму. Атомно-силовая микроскопия позволяет идентифицировать межфазное разделение на полибутадиеновые и полистирольные области не только по наблюдаемой морфологии, но и за счет измерения упругого отклика различных областей поверхности.

Существенный интерес представляет применение методов атомно-силовой микроскопии для изучения структурных изменений полимерных пленок при различном механическом воздействии. При этом атомно-силовая микроскопия позволяет проводить измерения профиля реальной поверхности, что является недоступным для методов растровой и просвечивающей электроннной микроскопии.

Атомно-силовая микроскопия дает новую информацию о структурных изменениях морфологии полимеров при механических воздействиях. На рис. 3.4 представлено изображение структуры поверхности полимера и металлической пленки, образованной в результате принудительного растяжения. При приготовлении образцов металлическая пленка толщиной 10 нм формировалась на поверхности полимера методом термического испарения металла. При двухкратном

-bfcMWtWIus f'If.

Ele Stm Iools yiew Window Help

mi

Рис. 3.3.

ACM изображение блоксополимера бутадиен-стирол. Левое изображение получено при большей силе между зондом и исследуемым образцом, чем правое. Основные составляющие полимерной пленки - стирол и бутадиен - обладают различным значением механической жесткости. Увеличение силы приводит к большей деформации бутадиена (на сравниваемых изображениях относительные деформации отличаются в 1,4 раза). Методом атомно-силовой микроскопии проведено исследование локальной жесткости поверхности нанокомпозитного полимерного материала.

Обработка и построение изображения осуществлено с помощью программного пакета "ФемтоСкан". Представленные сечения выбраны вдоль одинаковых направлений на соответствующих участках двух изображений.

растяжении полимера суммарная длина разорвавшегося металлического покрытия осталась практически неизменной, что хорошо заметно из данных зондовой микроскопии.

С помощью атомно-силовой микроскопии определен механизм образования периодической структуры металлической пленки при растяжении полиэтилентерефталата в условиях нагрева. Для объемной области полимерной пленки характерно однородное растяжение. Вблизи металлической пленки при ее разрыве происходят неоднородные деформационные перемещения. Приграничной области полимера, расположенной вблизи образовавшегося свободного края металлической пленки, соответствуют минимальные механические напряжения, которые возрастают по мере удаления от края разрыва по направлению вдоль поверхности. При значительной адгезии металла к поверхности полимера наличие области пониженных деформаций в приграничной области полимера приводит к тому, что механические напряжения в металле вблизи разрыва меньше, чем в удаленных от разрыва участках металлической пленки. Вблизи разрыва появляется область с более низким механическим напряжением ("охранная зона"), препятствующая случайному появлению новой микротрещины и соответственно нового разрыва именно в этой "охранной зоне". Длина "охранной зоны" в значительной степени детерминирована упруго-пластичными свойствами соприкасающихся металла и полимера. Эта длина определяет характерный размер периодической решетки разорванной металлической пленки.

2.6. Жидкокристаллические пленки

Для многих применений пленки производных насыщенных углеводородов не обладают достаточной прочностью и стабильностью при изменении внешних параметров (температуры, электрического поля, давления и пр.). Перспективными материалами являются различные полимеризуюшиеся материалы. Нами проведено изучение морфологии и локальных свойств гребнеобразной жидкокристаллической пленки полимера ПХА-10 на различных подложках (кристаллический кремний, гидрогенизированный кремний, графит) с помощью сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии. Эти методы позволили визуализировать молекулярную упаковку в жидкокристаллических пленках и обнаружить наличие двух различных типов периодических структур.

Жидкокристаллические пленки могут служить модельными объектами при исследовании механизмов электронного туннелирования. На примере пленки ПХА-10 нами продемонстрирована с помощью туннельного микроскопа возможность возникновения периодических зарядовых структур в тонких органических пленках.

2.7. Исследования природы модифицирующего действия графита на полимеризацию полипропилена в присутствии закрепленных на поверхности катализаторов Циглера-Натга

Проведено исследование полимеризации полипропилена с использованием каталитической системы TiCl4-(C2Hs)2 AIC1 (катализатор Циглера-Harra) в присутствии графита. Графит оказывает значительное модифицируйте действие, выражающееся в резком увеличении скорости полимеризации и в увеличении степени изотактичности образующегося полипропилена. С целью изучения природы изотактических центров полимеризации а-олефинов были проведены исследования методами сканирующей туннельной микроскопии/спектроскопии (СТМ/СТС) и атомно силовой микроскопии (АСМ) двух типов образцов: комплекса катализатор TiCl4-(C2H5)2 A1CI - полипропилен (-СН(СН3)-СН2-)„, и алюмоорганической компоненты катализатора (С2Н5)2 А1С1, нанесенных на поверхность кристаллов высокоориентированного пиролитического графита.

Образцы для исследований готовились следующим образом. Пластины пирографита ПГ-6 вакуумировались при температуре 200° С до остаточного давления 1.3 Па (10 мм.рт.ст.). Затем при температуре 20° С в течение 15 мин. проводилась адсорбция паров (С2Н5)2А1С1. В случае приготовления поверхности, покрытой пленкой полипропилена, после этого образец снова вакуумировался и приводился в контакт с парами TiCl, на 10 мин. На последнем этапе после откачки паров TiCl, поверхность экспонировалась пропиленом при давлении последнего 100300 мм.рт.ст. Поглощение компонент каталитической системы и пропилена соответствовало практически монослойному покрытию.

Проведены исследования каталитического комплекса TiCI4 -(C2H5)j А1С1 + полипропилен и алюмоорганической компоненты катализатора (C2HS)2 А1С1, нанесенных на поверхность пирографита. В обоих случаях обнаружены линейные зигзагообразные квазипериодические структуры с расстоянием между грядами около 18 А и квазипериодом вдоль направления гряды порядка 6-10 Ä, которые могут быть ассоциированы с поверхностной решеткой, состоящей из димеров (С2Н5)2 А1С1. Плотность адсорбционных центров на единицу площади поверхности при этом составляет 1013 — Ю1" центров/см2 , что согласуется с известными данными. Прямым методом подтверждена высокая сплошность и однородность слоя (С2Н5)2 А1С1, адсорбированного на поверхности пирографита.

3. СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БИОПОЛИМЕРОВ

Биополимеры представляют собой высокомолекулярные соединения, в состав которых входят белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды. Эти соединения составляют структурную основу всех живых организмов и участвуют практически во всех процессах жизнедеятельности. Уникальные биологические свойства биополимеров во многом определяются их существованием в упорядоченной конформации. Основным преимуществом метода зондовой микроскопии по отношению к традиционным методам микроскопии является неразрушающий характер исследования объектов в различных условиях (на воздухе или в растворах при контроле за параметрами внешней среды). Зондовая микроскопия позволяет работать с живыми объектами, что является принципиально важным для изучения природы и процессов, происходящих в живой материи. В настоящее время накоплен большой фактический и методический материал для методов растровой и просвечивающей электронной микроскопии и оптической флуоресцентной микроскопии. Однако эти методы позволяют изучать лишь модифицированную специальными способами поверхность образцов. В электронной микроскопии для визуализации объектов применяются различные проводящие покрытия или различные способы приготовления реплик и тончайших срезов. При наблюдении в флуоресцентный микроскоп приходится фиксировать на поверхности биообъектов различные химические реагенты. Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия - практически единственные методы исследования поверхности, которые позволяют визуализировать атомную и молекулярную структуру поверхности без специальной подготовки образцов.

3.1. Нуклеиновые кислоты

Для визуализации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) применяют методы атомно-силовой микроскопии (АСМ). Результаты исследований последних лет демонстрируют, что осажденная на проводящей подложке ДНК в сканирующем туннельном микроскопе, как правило, не видна. Предполагается, что причиной тому является низкая электропроводность ДНК. Тем не менее проведены успешные наблюдения ДНК на диэлектрических подложках (слюда, кварц, стекло) с помощью ультранизкотокового СТМ. Присутствия адсорбированной пленки воды на поверхности диэлектрика оказывается достаточным для протекания токов фемто- и пикоамперных диапазонов.

На рис. 3.1. представлено типичное изображение кольцевой ДНК, полученное в контактном режиме АСМ. Анализ изображений осажденной на слюде ДНК показывает, что при наблюдении на воздухе во влажной атмосфере (относительная влажность 30%-80%) видимые размеры ДНК отличаются от ожидаемых. На АСМ-изображениях видимая ширина составляет 15-50 нм. Конечная кривизна зондирующего острия и наличие

Рис. 3.1. Изображение молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, осажденной на поверхность слюды. Размер кадра 1,2 х 0,8 мкм2. Наблюдения с помощью атомно-силового микроскопа.

«(А)

Гис. гиииухл^,------ ,ил/ичлкяси ДПГ^-ИЛО, исижиач^............1

графита. Размер кадра 0,38 х 0,38 мкм2. Наблюдения с помощью сканирующего туннельного микроскопа: туннельный ток - 0,5 нА, напряжение на переходе - 100 мВ. Справа представлено поперечное сечение комплекса.

Рис. 3.3. Изображение белкового кристалла, образованного молекулами лизоцима. Наблюдения с помощью атомно-силового микроскопа: режим постоянной силы - (а), изображение (а) с применением боковой подсветки - (б). Размер кадра 6x5мкм2.

Высота отдельных ступенек соответствует размеру отдельной белковой молекулы (4,5 нм). (Образец приготовлен Н.В. Гвоздевым).

4.062е*01 пт

Рис. 3.4. Изображение вируса табачной мозаики, осажденного на поверхности слюды. Наблюдаемая длина вируса - 350 нм. На поперечном сечение заметно увеличение ширины структуры за счет конечного радиуса зонда. (Образец приготовлен Ю. Ф. Дрыгиным).

пленки воды на поверхности подложки дают основной вклад в уширение изображения. Нитки ДНК имеют на изображениях наименьшую ширину при наблюдениях в газовой атмосфере, не содержащей паров воды. Методы АСМ представляют интерес при исследовании конформации и характера взаимодействия ДНК с белковыми молекулами, при разработке методов неполного картирования ДНК с применением белковых маркеров, а также для других задач биоорганической химии.

В настоящей работе методы АСМ применены для изучения конформационых переходов ДНК при взаимодействии с поверхностно-активными веществами (ПАВ). Нами продемонстрировано, что катионные поверхностно-активные вещества (цетилтриметиламмоний бромид, дистеароилдиметиламмоний хлорид) могут конденсировать ДНК с образованием комплексов ДНК-ПАВ тороидальной формы. Кулоновское отталкивание отрицательно заряженных участков молекулы ДНК является основным фактором, препятсвующим конденсации в растворах. Взаимодействие с положительно заряженными полярными концевыми группами ПАВ приводит к погашению поверхностного заряда. Осовобождающиеся при этом внутренние напряжения могут приводить к новой конформационной форме ДНК в комплексе ДНК-ПАВ. Наблюдаемые тороидальные структуры имеют диаметр 0,1-0,2 мкм, что соответсвует минимальному радиусу изгиба молекул ДНК, определяемому персистентной длиной.

Как отмечалось ранее, ДНК на проводящей подложке (в частности, на графите), как правило, не видна в СТМ. Однако наблюдение комплексов ДНК-ПАВ с помощью СТМ становится возможным на поверхности проводящих материалов (графите, сульфиде молибдена, металлических пленок и пр.). Липидные структуры (пленки, липосомы) дают устойчивые изображения в СТМ. По всей видимости наблюдение комплекса ДНК-ПАВ становится возможным с помощью СТМ благодаря наличию в комплексе липидной компоненты.

Рибонуклеиновая кислота (РНК) также дает устойчивые изображения в АСМ. В качестве тестового образца нами проведено изучение вируса табачной мозаики, состоящего из нити РНК и белковой оболочки. Структура вируса охарактеризована в полной мере различными методами, в том числе с помощью электронной микроскопии. Для устранения артефактов и надежной идентификации нити РНК белковую оболочку вируса мы использовали в наших экспериментах в качестве маркера РНК.

3.2. Белки и белок-мембранные комплексы.

Применение методов зондовой микроскопии для изучения белковых структур представляется интересным по следующим причинам. Туннельная микроскопия может дать ценную информацию о распределении электронной плотности в белках, о механизме переноса заряда и других электронных процессах в таких системах. Атомно-силовая микроскопия становится незаменимой при исследовании конформации белка в нативных условиях, изучении роста белковых кристаллов,

характеризации адгезионной способности молекул белка к различным подложкам.

При изучении кристаллов белка с помощью АСМ возможно достижение в определенных случаях молекулярного разрешения. На рис. 3.3 представлено изображение белкового кристалла со ступеньками, соответствующими монослоям молекул. Изображение вируса табачной мозаики приведено на рис. 3.4.

Визуализация одиночных белковых молекул в АСМ не вызывает, как правило, методических затруднений. Однако важным моментом является решение задачи очищения препаратов и обеспечение иммобилизации белка на поверхности подложки.

Напротив, визуализация мембранного белка наталкивается на существенные препятствия. Для понимания причин этого необходимо подробнее остановится на результатах исследования самих липидных структур. Атомно-силовая микроскопия дает устойчивые изображения липидных пленок и биомембран, различных образований (везикул, липосом), осажденных на поверхность различных материалов. Толщина пленок и размеры липосом, видимые в АСМ, находятся в хорошем соответствии с данными других методов - электронной микроскопии, оптического рассеяния, интерферометрии и элипсометрии. Заметное уплощение осажденных на поверхность слюды липосом, имеющих практически сферическую форму в растворах, указывает на низкую механическую жесткость этих структур. Липидные структуры имеют высокое электрическое сопротивление в объеме, однако тонкие липидные пленки и даже липосомы хорошо заметны в туннельном микроскопе. Природа туннельной проводимости липидных пленок в настоящее время не имеет убедительной теоретической интерпретации. Этот вопрос является частью общей нерешенной задачи о механизме визуализации тонких органических пленок, имеющих диэлектрические свойства в объеме. В настоящее время имеются обширные данные по наблюдению молекулярной структуры упорядоченных пленок длинных цепочек насыщенных углеводородов и их производных, жидкокристаллических пленок, полимерных слоев и пр.

Идентификация отдельных белковых молекул, встроенных в биомембрану, является весьма нетривиальной задачей. Надежно регистрировать белковые молекулы, расположенные в липидной матрице

низкой механической жесткости, является весьма затруднительным. Достоверная интерпретация данных атомно-силовой микроскопии

требует дополнительных методов контроля.

Результаты СТМ исследования фосфатидилхолиновых липосом с мембранным белком Цитохром Р 450 продемонстрировали возможность визуализации отдельных белковых молекул.

Рис. 3.5. СТМ изображение протео-липосом на золотой подложке. Размер кадра 350x350 нм2, высота 30 нм.

Рис. 3.6. СТМ изображение протеолипосом на пирографитовой подложке. Размер кадра 53x53 нм2, высота 3 нм.

Визуализация органических и биологических структур на твердой подложке методами сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии (СТМ и АСМ) дает простой и надежный способ контроля их топографии и поверхностных свойств, а также позволяет определить влияние подложки на их пространственную структуру. В настоящей работе проводилось наблюдение липосом из димиристоилфосфатидилхолина со встроенными молекулами гемсодержащего мембранного белка цитохрома Р-450 2В4. Липосомы со средним диаметром 15-20 нм получали озвучанием, затем инкубировали с цитохромом Р-450 2В4. Методом холатного диализа были получены

протеолипосомы со средним диаметром 70-75 нм

Непосредственно перед нанесением на подложку раствор разводили дистиллированой водой в отношении 1:1000. Раствор (2 мкл) наносили на подложку и высушивали. Эксперименты

проводились в режиме постоянного туннельного тока (СТМ) и в режиме постоянной Были получены липосом, приготовленных холатным методом, на напыленных пленок золота (рис. 3.5) и никеля (рис. 3.6).

Протеолипосомы со средним диаметром 15-20 нм наблюдали на поверхности высоко ориентированного пиролитического графита (рис. 3.6). Адгезия липосом к поверхности оказалась достаточной для получения четких СТМ изображений. Липосомы хорошо видны при туннельном напряжении в интервале от -1 до 1 В. Высота АСМ изображения липосом (рис.3.8) лежит в интервале 6-12 нм. Высота СТМ изображения - 1,5-6 нм на графите и 5-20 нм на металлах. Измерения средних латеральных размеров липосом и протеолипосом,

адсорбированных на

поверхности различных

подложек (металлы, слюда, Рис. 3.8. АСМ изображение протеолипосом на графит), дают результаты, подложке из слюды. Размер кадра 1500x1500 совпадающие с косвенными нм2, высота 20 им.

Рис. 3.7. СТМ изображение протеолипосом на никелевой подложке. Размер кадра 220x220 нм2, высота 6 нм.

силы (АСМ). изображения поверхности

данными оптического контроля.

В СТМ экспериментах обнаружена аномальная зависимость спектроскопических изображений (пространственного распределения производной туннельного тока по напряжению на переходе) от полярности напряжения на переходе. В режиме с11/с1и(х,у) при положительном напряжении между иглой и образцом липосома (рис. 3.9.а) наблюдается в виде углубления (рис. 3.96), а при отрицательном - в виде выпуклости (рис. 3.9в), что свидетельствует об асимметрии процесса протекания туннельного тока в системе зонд/образец/подложка.

Рис. 3.9. Изображения липосомы в режимах: топографии (а) и спектроскопии еИ/сШ (б и в). Размер кадра 46x46 нм2. Изображение (б) получено при положительной полярности напряжения на игле (+0,75 В), (в) - при отрицательной (-0,75 В).

При исследовании топографии поверхности протеолипосом продемонстрирована возможность идентифицировать отдельные молекулы цитохрома Р-450, встроенные в липосому (рис. 3.10). При отрицательном напряжении на игле молекулы белка видны на поверхности липосомы, как выступы диаметром 2 нм. При смене полярности на тех же местах видны углубления того же диаметра.

Рис. 3.10. СТМ изображение протеолипосом на пирографитовой подложке. Размер кадра 35x35 нм2, высота 3,5 нм. Углубления при положительном напряжении на игле (а) и выступы при отрицательном (б) показаны стрелками. Приведен результат выборочного измерения в многократной серии экспериментов.

4. АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В ИССЛЕДОВАНИЯХ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И МОРФОЛОГИИ ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Липополисахариды являются углеводородсодержашими биополимерами, состоящими из липида А, олигосахаридного остова и О-специфической полисахаридной цепи. Структура этой цепи построена из повторяющихся олигосахаридных блоков и определяет специфичность иммунного ответа высшего организма на инфекцию данным штаммом микроорганизма. Липополисахариды составляют внешнюю оболочку клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Наибольший интерес представляет разработка методов характеризации структуры липополисахаридов живой клетки. Методы сканирующей зондовой микроскопии оказываются весьма перспективными для решения фундаментальных и практических задач биологии и медицины. В последнее время в этом направлении достигнуты существенные результаты, отражающие общий прогресс зондовой микроскопии. Атомно-силовая микроскопия позволяет проводить визуализацию бактерий с нанометровым пространственным разрешением в различных средах: в вакууме, на воздухе и в жидких средах. Возможность наблюдения бактерий в жидких средах яатяется необходимой особенно для тех бактерий, для которых жидкость является естественной средой обитания. Поддержание незначительных сил взаимодействия между зондирующим острием и поверхностью бактерии, осуществляемое при получении изображения, позволяет проводить неразрушаюшие наблюдения структуры бактериальной поверхности. Атомно-силовая микроскопия дает уникальную информацию не только о геометрических параметрах (топографии) бактерии, но и позволяет проводить измерения локальных механических свойств. При измерении упругих свойств можно получать информацию о внутреннем строении клетки. Недавно опубликованные работы продемонстрировали возможность наблюдения динамических изменений в структуре бактерий. В работе Н. Oberleithner et al. ( European Journal of Phisiology, 425, 506-510 (1993)) приведены результаты прямых наблюдений образования микропор в бактериальной стенке при воздействии ионов кальция, размер наблюдаемых пор составлял 30 нм.

В настоящей работе метод атомно-силовой микроскопии применен для характеризации структуры поверхности и локальных механических свойств клеточной стенки энтеробактерий. Экспериментальные результаты убедительно демонстрируют, что новый метод исследования позволяет получать пространственное разрешение при изучении поверхности энтеробактерий не только не уступающее, но в ряде случаев и превышающее предельное разрешение, достигаемое растровой и просвечивающей электронной микроскопией. Для визуализации поверхности образцов методами атомно-силовой микроскопии не требуются специальные

подготовительные операции, обязательные для различных видов электронной микроскопии, как-то, запыление, оттенение и декорирование различными металлами или приготовление тончайших срезов образцов. Процедура подготовки образцов для атомно-силовой микроскопии заключается в их иммобилизации на ровной подложке. Материал подложки можно варьировать в широких пределах в зависимости от поставленных задач. Традиционно в качестве субстрата используются атомно-гладкие подложки из слюды, графита и других слоистых материалов, а также различные стекла, полимерные материалы и металлические поверхности. Варьируя подложки, можно изучать вопросы адгезии бактерий на поверхности различных материалов. Помимо характеризации морфологии поверхности бактерий методами атомно-силовой микроскопии возможно изучение локальных механических свойств бактерий: жесткости, пластичности и адгезивности. Атомно-силовая микроскопия позволяет проводить сравнительный анализ фрикционных свойств различных участков бактериальной стенки.

Клеточная стенка прокариот играет роль защитного барьера, предохраняющего бактерию от механического воздействия. В ее состав входят специфические полимерные комплексы, которые не содержатся в других клеточных структурах. Химический состав и строение клеточной стенки постоянны для определенного вида и являются важным свойством, который может служить диагностическим признаком для зондовой микроскопии.

В качестве тестовой структуры в настоящей работе выбраны бактерии Escherichia coli различных штаммов.

КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА, колибактерия (Escherichia coli) -грамотрицательная бактерия семейства энтеробактерий. Имеет слегка вытянутую форму палочки с закругленными концами (0,4-0,8 х 1-3 мкм). В естественных условиях подвижна, факультативный анаэроб, сбраживает глюкозу, лактозу и др. углеводы. Кишечная палочка -один из наиболее обычных представителей нормальной кишечной флоры млекопитающих. Является классическим объектом микробиологических и молекулярно-генетических исследований. Изучение разнообразных мутантов штамма кишечной палочки позволило наиболее полно составить генную карту и генный каталог бактериальной хромосомы. Используется в генетической инженерии для получения интерферона, инсулина и как продуцент некоторых ферментов.

Для штамма Escherichia coli К12 J62 характерно наличие на поверхности бактериальной стенки длинных отростков - жгутиков. Жгутик представляет собой относительно жесткую спираль, состоящую только из одного типа белка - флагеллина. Кишечная палочка - подвижная бактерия, перемещение которой обеспечивается с помощью жгутиков.

Отростки другого вида наблюдаются на поверхности клеточной стенки бактерий Escherichia coli JM 109 (рис. 4.1). Такие ворсинки построены также только из одного вида белка, в данном случае -пилина. Они представляют собой прямолинейные белковые отростки круглого поперечного сечения.

Приготовление культуры клеток Е. coli JM 109 и HB 101 осуществлено по стандартной методике. Культура клеток была выращена в жидкой среде LB (на 150 мл.: 1,5 г Bacto-trypton, 0,75 г Bacto-yeast extract, 1,5 г NaCl, раствор NaOH до рН=7.5) путем заражения среды соответствующим штаммом в соотношении 1:100 до средней логарифмической фазы (D=0,5 при Х=600 nm) при 37 °С. Полученные колонии клеток высевались на чашки Петри со средой LB, содержащей агар до 2,25 % и выдерживались при температуре 37 °С в течение 8-12 часов. С полученных отдельных колоний скалывали определенное количестко клеток для нанесения на соответствующий субстрат.

Свежесколотые бактерии с помощью петли перемещали в дистиллированную воду. Контроль требуемой концентрации бактерий осуществлялся визуально по мутности раствора. Концентрация бактерий перед нанесением составляла 109 в 1 мл. Каплю приготовленного раствора помешали на подложку из свежесколотой слюды размером 6x6 мм2. Осаждение бактерий осуществлено также на плоских подложках из других материалов (стекло, полированный титан, пленка из сплава золото-палладий). Первоначальные наблюдения на микроскопе проводили непосредственно через 10-15 минут после нанесения образцов. Последующие измерения осуществляли через более продолжительные интервалы времени (сутки-месяцы). В зависимости от времени наблюдения деградации поверхности бактерий замечено не было.

Наблюдения проведены на атомно-силовом микроскопе Nanoscope-3. Для контактного режима применены кантилеверы различной жесткости в пределах 0,06-0,6 Н/м с острием из нитрида кремния. В режиме прерывистого контакта (Tapping mode) использованы кантилеверы с кремниевым острием. Специальные меры предосторожности для минимизации силы воздействия на образец в экспериментах не предпринимались.

Обработка и построение трехмерных изображений было осуществлено с помощью специализированного программного пакета "Фемтоскан-001", позволяющего анализировать изображения, полученные с помощью сканирующего зондового микроскопа.

Анализ экспериментальных данных сканирующей силовой микроскопии продемонстрировал, что бактерии образуют на поверхности слюды монослойные плотноупакованные островковые структуры. Характерной особенностью наблюдаемой картины

является практически полное остутствие многослойных образований бактерий. Формирование монослойных покрытий, по всей видимости, связано с адгезивными свойствами, присущими бактериям. Можно предположить, что в естественных условиях

Рис. 4.1.

Изображение одиночной бактерии Е. coli JM109, осажденной на поверхность слюды.

Размер изображения 3 х 2,5 мкм2. Изображение получено с помощью силового микроскопа в режиме постоянной силы. Для оттенения мелких деталей при построении изображения применена боковая подсветка.

бактерии также образуют монослойные пленки на поверхности эпителия.

Размеры бактерий E.coli JM109 по данным наблюдений составляют: длина 1-4 мкм, высота 0,6-1,5 мкм. При высыхании бактерий на твердой подложке заметно их некоторое уплощение. Возвышение бактерий над плоской поверхностью подложки составляет 0,2-0,4 мкм. Результаты атомно-силовой микроскопии указывают на однотипную морфологию поверхности бактериальных клеток. Поверхность клеток имеет структурированную поверхность с характерным периодом 50 нм. На изображении одиночной бактерии (рис. 4.1) хорошо различимы характерные отростки (пили) длиной в 1-2 мкм.

Для штамма бактерий Escherichia coli НВ101 характерно полное отсутствие отростков (пилей), что хорошо видно на изображении на рис. 4.2.

Наблюдение бактериальных клеток осуществлялось также на других подложках (покровном стекле, полированном титане, пленках из сплава золота и палладия). При адгезии бактерий на поверхности этих субстратов также происходило образование только монослойных островковых структур. При нанесении образцов на поверхность этих подложек высокого смачивания и соответственно растекания препарата не происходило. В результате осаждение остаточных примесей из воды осуществлялось в меньшей области подложки, что приводило к декорированию адсорбированными из раствора

примесями мелких структурных деталей бактерий. Наблюдаемые изображения не давали высокой четкости и контраста. Для высококонтрастного наблюдения бактерий на таких субстратах необходимо предпринимать специальные меры по предварительной отмывке образцов в дистиллированной воде.

Рис. 4.2.

Изображение одиночной бактерии Е.соЧ

штамма НВ101.

Изображение получено в режиме постоянной высоты. Размер кадра 2.8 х 2.5 мкм2. Для оттенения мелких деталей применена боковая подсветка.

Проведенные измерения убедительно демонстрируют возможности метода атомно-силовой микроскопии применительно к визуализации бактериальных клеток с нанометровым пространственным разрешением. Зондовая микроскопия может быть применена для изучения структуры и локальных механических свойств различных прокариотических клеток. С помощью атомно-силового микроскопа становится реальным изучение адгезии клеток к различным субстратам, что может быть чрезвычайно полезным при разработке детергентов для стерилизации хирургического инструмента, при создании новых материалов для пластиковой и полимерной посуды и различных медицинских изделий, при создании контактных глазных линз с антибактерицидными свойствами.

4.1. Различия структуры полимерной оболочки клеточной стенки генетически связанных штаммов бактерий, выявляемые с помощью атомно-силовой микроскопии

Методом атомно-силовой микроскопии проведены исследования клеточной поверхности исходного родительского штамма Escherichia coli К|2 J62 his" Ra-хемотипа и трансдуктанта Escherichia coli К12 J62 his+, приобретшего способность синтезировать первичные S-специфические боковые цепи липополисахарида О-антигена Shigella flexneri (группоспецифический фактор 3,4). Сравнительный анализ изображений генетически связанной пары штаммов Е. coli К12 J62 выявил существенные отличия в топографии поверхностных структур сравниваемых бактериальных клеток, отличающихся по способности синтезировать фактор 3,4 Shigella flexneri, представленный повторяющимися цепями L рамнозы и N ацетил-О-глюкозамина.

В настоящее время с помощью методов генетического обмена возможно конструирование заданных по характеристике пар штаммов различных видов бактерий, отличающихся по структуре биополимеров, входящих в состав клеточных стенок, представленных на поверхности определенными антигенами, детально изученными у ряда патогенных бактерий. Для нас интерес представили штаммы Escherichia coli Kl 2, наследующие генетические детерминанты Shigella flexneri, контролирующие синтез основной антигенной структуры их первичных S-специфических боковых цепей липополисахарида О-антигена (антиген 3,4). Так как ранее в генетических экспериментах с шигеллами использовали хорошо изученные многочисленные мутанты штамма Escherichia coli К12 J62, являющегося шероховатым, то в качестве исходного реципиента нами и был использован исходный клон, зависимый по гистидину, удобный для передачи rfb-генов Shigella flexneri, сцепленных с his-маркером их хромосомы. Целью настоящей работы явилось выяснение возможности использования атомно-силовой микроскопии для дифференциации поверхности бактериальных клеток Е. coli К12, различающихся по наличию первичных S-специфических боковых цепей липополисахарида О антигена, контролируемых наследуемым кишечными палочками rfb-геном S. flexneri.

В опытах использовали изогенную пару штаммов: исходный реципиентный штамм Е. coli К12 J62 his- trp- pro" и его гибрид Е. coli К]2 J62 his+ а 3,4+, полученный путем трансдукции фагом PI his"1" маркера от донорного штамма S.flexneri 2а 516 (11:3,4). Трансдуктант, обозначенный как E.coli К[2 J62 his+ а 3,4+ №16-95, аглютинирует с адсорбированной монорецепторной сывороткой 3,4 S. flexneri на стекле в течение 30 секунд (сразу под петлей). Бактерии трансдуктанта в отличие от исходной родительской культуры E.coli К12 J62 (Ra-хемотипа) утратили способность

лизироваться шероховатым фагом F8 и приобрели лизабельность S-фагом Fl.

Бактерии генетически связанной пары штаммов Е. coli К^ J62 и Е. coli К12 J62 №16-95 выращивали в мясо-пептонном бульоне или мясо-пептонном агаре в течение 16 часов при 37 °С. Бактерии в объеме 0,1 мл бульонной культуры разводили в 0,9 мл дистиллированной воды, или готовили смыв с агара в концентрации 1х109 микробных клеток в 1 мл дистиллированной воды. Далее каплю раствора объемом 4 мкл наносили на поверхность свежесколотой слюды. Промежуток времени от приготовления раствора до нанесения его на поверхность подложки варьировали в пределах 1-60 минут. Для этого интервала времени результаты последующих измерений с помощью АСМ были идентичны. Измерения проводились после естественного высыхания капли раствора, происходившего в течение 15-30 минут. Осуществлялись также контрольные измерения образцов через 15 и 60 дней после их приготовления.

В экспериментальных исследованиях структуры поверхности бактерий применялся атомно-силовой микроскоп Наноскоп-2 фирмы Digital Instruments (Санта-Барбара, США). В качестве зондирующих острий были использованы кантилеверы с острием из нитрида кремния, механическая жесткость кантилеверов составляла 0,06 и 0,12 Н/м. Величина силы взаимодействия между острием и исследуемой поверхностью составляла величину около Ю-9 Н.

Изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа, показывают, что осаждение бактерий на поверхность слюды при высыхании раствора происходило, как правило, в виде плотноупакованных монослойных островковых образований. Многослойные структуры на изображениях замечены не были. Типичная островковая структура, образованная отдельными бактериями, представлена на рис. 4.3. Размеры отдельных бактерий варьируются в пределах 1,5-2,5 мкм по длине и 0,4-0,5 мкм по видимой ширине. Высота бактерии составляет 0,05-0,2 мкм и указывает на некоторую деформацию бактерии при адгезии на поверхности слюды. На изображениях одиночных бактерий хорошо различимы длинные отростки - флагеллы длиной 1-6 мкм. Оболочка бактерии имеет хорошо различимую на изображении структурированную поверхность. На основании полученных изображений можно утверждать, что при помещении бактерий в процессе приготовления для исследования в дистиллированную воду лизис (разрушение) клеток не происходил. Применение дистиллированной воды позволило исключить образование солевых отложений, присутствующих в большом количестве при осаждении бактерий из солевого буфера. На АСМ изображениях иногда заметно незначительное количество вещества, расположенное на поверхности слюды вблизи бактерий и являющееся по всей видимости результатом метаболизма бактерий.

Рис. 4.3. Изображение moho- \ слойного покрытия, образуемого бактериями Е. coli на поверхности слюды. Размер кадра 32 х 32 мкм2.

т*

Рис. 4.4. Изображение родительского (слева) и гибридного (справа) штаммов Escherihia coli. Размер кадра 3x3 мкм2

На Рис. 4.4 представлены изображения исходного штамма Е. coli К|2 J62 и модифицированного штамма Escherichia coli К12 J62 №16-95, приготовленных описанных выше образом. Заметно общее сходство изображений с предыдущими наблюдениями исходного не модифицированного генетически связанного штамма. Атомно-силовая микроскопия выявляет существенные отличия в морфологии поверхности сравниваемых штаммов Escherichia coli J62. Для штамма бактерий E.coli К-12 J62 №16-95 характерна высокая структурированность поверхности с образованием ламелей в форме продолговатых пластинок. Отдельные ламели имеют длину в диапазоне 200-500 нм при ширине 30-40 нм. Ламели на поверхности штамма плотноупакованы, и образуют единую поверхность бактериальной клетки. Для исходного штамма Е. coli К^ J62 изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа, указывают на практически полное отсутствие ламелярной поверхности клеточной стенки. При этом наблюдаются поверхностные структуры, видимая граница раздела между которами имеет округлую форму. Характерный диаметр этих структур имеет значение в пределах 30-50 нм.

Общепризнана роль липополисахарида О-антигена в вирулентности грамотрицательных бактерий. Кластеры генов rfa-rfb обеспечивают биосинтез липополисахарида О-антигена Shigella flexneri, который, как полагают, защищает бактерии от разрушающего действия кислого рН желудочного сока, желчных кислот в просвете желудочно-кислотного тракта, а также местных антител и фагоцитов.

В серии исследований иммунохимической структуры липополисахарида О-антигена S. flexneri, начатых D.A.R. Simmons (1971) и продолженных Lindberg et al. (1973) и Kenne et al. (1978) с использованием метода метилирования, показано, что в основе липополисахарида сероваров S.flexneri 1-5 лежит структура группового антигена 3,4. Этот антиген включает полисахаридные цепи, содержащие L-рамнозу и N-ацетил-О-глюкозамин. Исключение составляет серовар 6 S. flexneri (S. newcastle). Основная структура антигена VI включает N-ацетил-галактозамин. Эти данные были подтверждены в генетических экспериментах, в которых была доказана возможность перехода S.flexneri сероваров 1-5 в исходный "у" вариант в результате замещения при коньюгации с Е. coli К12 Hfr-штаммами 1ас-рго-области хромосомы.

Типовые антигены S. flexneri 1-5 являются модификацией основной структуры (антигена 3,4) и у S. flexneri 2а и представлены цепями а глюкозы.

На основании полученных методом атомно-силовой микроскопии изображений мы предполагаем, что наблюдаемые различия в клеточной поверхности гибридных бактерий Escherichia coli К^ обусловлены изменениями морфологии мутантного штамма, наследующего rfb-a3,4 ген Shigella flexneri.

4.2. Атомно-силовая микроскопия энтеробактерий

Нами осуществлена визуализация энтеробактерий различных таксономических групп Escherichia coli, Klebsiella, Helicobacter pyroli, Lactobacillus fermentum и Bifidobacterium longum. Атомно-силовая микроскопия позволяет проводить экспресс-анализ бактериальных клеток. При этом представленный методический подход упрощает изучение поверхности микробных клеток, снижает количество трудозатрат, освобождает от трудоемкой фиксации клеток и позволяет применять метод атомно-силовой микроскопии в широкой клинической практике.

КЛЕБСИЕЛЛА (Klebsiella) - грамотрицательная, неподвижная, неспорообразующая энтеробактерия, факультативный анаэроб. Изображение микробных клеток представлено на рис. 4.5. Klebsiella pneumoniae - наиболее изученная бактерия рода Klebsiella. Обитает на слизистой оболочке носа, рта и кишечника здоровых людей. Условно патогенна: может вызывать воспаления легких. Сбраживает сахара с образованием 2,3-бутандиола, этанола и органических кислот. На изображениях, полученных с помощью атомно-силового микроскопа, видно, что Клебсиелла не имеет боковых отростков. Снаружи клеточная стенка окружена слизистым веществом, плотнообволакивающим клетку. Слизистое образование - капсула -сохраняет механическую связь с клеточной стенкой и имеет аморфное строение. Наблюдаемая в атомно-силовой микроскоп толщина капсулы составляет 0,1 мкм. Капсула является результатом биосинтеза прокариотами органических полимеров и отложения их вокруг клеток.

ГЕЛИКОБАКТЕР ПИРОЛИ (Helicobacter pyroli) энтеробактерия, открытая австралийскими учеными в 1983 году. В настоящее время общепризнано, что Helicobacter pyroli является возбудителем язвенной двенадцатиперстной кишки (100% случаев заболеваний) и желудка (70% заболеваний). Отдельные бактерии имеют продолговатую форму со средней длиной в 1,5 мкм (рис. 4.6.).

Методами атомно-силовой микроскопии изучены также другие энтеробактерии:

ЛАКТОБАЦИЛЛЫ (Lactobacillus) - обычно неподвижные и бесспоровые молочнокислых бактерии, которые могут осуществлять ферментативное молочнокислое брожение. Встречаются в молочных, мясных и растительных продуктах, паразитируют в ротовой полости, кишечном и мочеполовом тракте многих теплокровных животных. За редким исключением непатогенны.

БИФИДОБАКТЕРИИ (Bifidobacterium) - грамположительные, бесспоровые, неподвижные бактерии. Составляют 80-90% нормальной кишечной флоры детей и молодняка сельско-хозяйственных животных в период молочного вскармливания.

Рис. 4.5. Изображение бактерий Klebsiella, образующих монослойную островковую структуру, на поверхности слюды. Режим постоянной силы. Размер кадра - 10 х 10 мкм2, перепад по высоте - 1 мкм: а) высота передана градациями серого, темные участки расположены ниже светлых; б) для оттенения мелких деталей применена боковая подсветка. а б

t-rf Ч V

Г

ij-'i ъц--

■щшштт f

X 1.000 UM/div Z 1.523 рн/div

Рис. 4.6. Изображение энтеробактерий Helicobacterpyroli. Атомно-сшювая микроскопия в режиме прерывистого контакта (Tapping mode).

j.

5. ФЛУКТАЦИОННАЯ СКАНИРУЮЩАЯ ТУННЕЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ ПОВЕРХНОСТИ, НИЗКОЧАСТОТНЫЕ ФЛУКТУАЦИИ ТУННЕЛЬНОГО ТОКА, ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРОЦЕССАМИ ПОВЕРХНОСТНОЙ ДИФФУЗИИ И ДЕГРАДАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ

Изучение низкочастотных флуктуаций туннельного тока представляется интересным, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, именно шумовые характеристики туннельного тока определяют предельное пространственное разрешение по нормали к образцу, достигаемое в сканирующей туннельной микроскопии, на уровне 1(И -Ю"5 нм/УГц. Важно заметить, что низкочастотные флуктуации имеюг фундаментальный характер и наблюдаются в различных физических, биохимических, биологических системах. На практике о надежности радиоэлектронных элементов и изделий можно судить по мощности генерируемых ими низкочастотных шумов. В медицине по характеру шумов биения сердечной мышцы можно осуществлять раннюю диагностику некоторых сердечных заболеваний, регистрировать возрастные изменения в работе сердца.

Для измерения спектральной плотности шума использовали разработанный нами сканирующий туннельный микроскоп с пьезоманипулятором, выполненным в виде трипода (длина Х,У и 2. электродов - 30 мм, поперечное сечение 3,5x3,5 мм2). Частота первого механического резонанса пьезоманипулятора составляла 4 кГц. Эффективная сейсмическая развязка устраняла механические колебания пьезоманипулятора, которые могли бы приводить к модуляции туннельного тока на резонансах первого и более высокого порядка. Температурный дрейф механической системы был ниже уровня десятых долей нм в минуту. Нестабильность и шумы высоковольтного напряжения, прикладываемого к электродам манипулятора, могут приводить к модуляции зазора туннельного перехода. При измерениях шума 200 применяли предварительную д прецизионную установку зонда на расстояние менее 100 нм. Это позволило исключить необходимость применения высоковольтных усилителей, являющихся потенциальными источниками дополнительного шума. Для управления пьезоманипулятором применено низковольтное (-13 - +13 В) выходное напряжение, создаваемое малошумящим операционным усилителем. Напряженность электрического поля в пьезокерамике манипулятора при таких напряжениях была не более 30 В/см, а механический гистерезис менее долей процента. В экпериментах не наблюдались

Рис. 5.1 Спектральная плотность шума туннельного тока (измерения на выходе цепи обратной связи).

резкие изменения управляющего напряжения, которые могли бы привести к крипу (медленному изменению размеров керамики после скачка напряжения на электродах).

Коэффициент преобразования входного усилителя составил К[и=80 мВ/нА. Эквивалентный шум входного тока и напряжения предварительного операционного усилителя составили 1ус=10"6 нА Гц'/2 и иус = 10 нВ Гц'/2 в диапазоне частот 1 Гц - 100 кГц. Суммарный шум предварительного усилителя составлял менее 10"6 нА Гц1/2 при сопротивлении на входе усилителя более 10 Мом. Избыточный (низкочастотный) шум усилителя был по крайней мере на 1-2 порядка ниже низкочастотных флуктуаций тока туннельного перехода. Измерения проводились на воздухе в обычных лабораторных условиях. В качестве образца применена пленка золота, нанесенная методом термического испарения на поверхность слюды. Иглы изготовлены методом механического среза платино-иридиевой проволоки (Р^.з^о.г) диаметром 0,4 мм. Типичный спектр шума туннельного тока на низких частотах соответствует флуктуациям со спектром 1Д.

Шум туннельного перехода образован дробовым шумом туннельного тока, тепловым шумом сопротивления перехода и избыточными шумами со спектральной плотностью вида 1Д. Шум предварительного усилителя, представленный эквивалентными генераторами тока и напряжения, вносит дополнительный вклад в шум всей системы. Результирующую спектральную плотность шума можно выразить соотношением

5,=2е1+4квТ/Ке(Г+1ус+иус/Ке|Т+5схс,

где I - туннельный ток, кв - постоянная Больцмана, =11^/(1^+1^) - суммарная величина параллельно включенных сопротивления туннельного перехода и сопротивления в обратной связи предварительного усилителя. Эфективное сопротивление туннельного перехода можно выразить соотношением К=Г10е-2к2, где т - расстояние между иглой и образцом, к - постоянная затухания волновой функции, определяемая высотой потенциального барьера. Измеренный на практике избыточный шум низкочастотных флуктуаций имеет спектральную плотность вида 1/Р. Величина а = 1,0± 0,2. Для частот ниже 1 кГц дробовой и тепловой шумы туннельного перехода приблизительно одинаковы и составляют величину около 10"5 нА Гц1/2.

Во время измерений с помощью туннельного микроскопа величина зазора между иглой и образцом поддерживается цепью обратной связи постоянной в выбранном диапазоне частот. Шум выходного сигнала цепи обратной связи (напряжение на пьезоманипуляторе, контролирующее величину туннельного зазора) определяется эквивалентным входным шумом всей системы и параметрами цепи обратной связи

и2Ы = К0а>)К,и1п/(1+Кам)Ки1К12К2и),

КО®) - коэффициент усиления цепи обратной связи.

Традиционно в цепи обратной связи используется интегральное звено, которое обеспечивает высокие значения коэффициента усиления на низких частотах К0<э) ~ Ю5 ...106. Коэффициент преобразования напряжение-расстояние пьезоманипулятора составлял величину К/и = 2 нм/В. Коэффициент К[/ определяется зависимостью туннельного тока от расстояния

I = 10 ехр(-2 К2и Т) .

Измерение коэффициента К2и осуществлялось экспериментально для выбранных рабочих точек. В оценочных расчетах использовали значение К2и порядка 10 нА/нм. Оптимальная регулировка цепи обратной связи позволяет минимизировать вносимые ей погрешности

и2(]ш) = 1,ЛК12К2и) ~ 1„.

Низкочастотный шум туннельного тока, по всей видимости, обусловлен совокупностью различных причин. Определенный вклад в шум туннельного тока может вносить вероятностный характер квантово-механического процесса туннелирования электронов через потенциальный барьер. Вероятность туннелирования может меняться во времени вследствие деградации поверхности. Медленные физико-химические процессы (окисление, образование пленки адсорбированного вещества) приводят к увеличению низкочастотных флуктуаций туннельного тока. Следует заметить, что низкочастотные флуктуации туннельного тока наблюдаются и для чистых поверхностей образца и иглы в условиях сверхвысокого вакуума. Причиной шумов вакуумного туннельного перехода могут быть процессы поверхностной дифузии и миграции атомов, случайные изменения геометрии зондирующего острия.

Шумы тока туннельного перехода при наличии глубокой отрицательной связи приводят к нестабильности поддержания туннельного зазора на уровне 10"5 нм/Гц'/2. Эта величина является также фундаментальным ограничением на точность измерений малых перемещений с помощью туннельного датчика. Низкий уровень шумов туннельного датчика позволяет успешно применять его для регистрации положения кантилевера (силового индентора) в атомно-силовой микроскопии. Практически такие схемы широко используются при разработке низко-температурных атомно-силовых микроскопов, поскольку тепловые нагревы такого датчика пренебрежимо малы.

На роль поверхностной диффузии и миграции атомов на генерацию низкочастотных шумов туннельного тока указывают сравнительные шумовые измерения для образцов из золота и высокоориентированного пиролитического графита. Пиролитический графит является слоистым материалом, атомы которого образуют замкнутые химические связи в плоскости монослоя, взаимодействие между слоями вызвано слабым ван-дер-ваальсовым притяжением. На

поверхности золота, напротив, возможно наличие одиночных атомов. Скорость поверхностной диффузии таких атомов составляет доли нм в секунду. Поверхностная диффузия атомов золота приводит к постепенному заплыванию микроуглублений, которые можно искусственно создать на поверхности золота с помощью иглы сканирующего туннельного микроскопа. Углубления в поверхности графита, созданные также методами нанолитографии, обладают значительно большей стабильностью во времени. Измерения шумов туннельного перехода для образцов золота и графита при прочих равных условиях показывают, что уровень шума для образца графита в 2-3 раза меньше, чем для образца из золота.

Значительный интерес представляет измерение шумов туннельного перехода в динамических условиях. Такие измерения позволяют в некоторой степени дифференцировать процессы на поверхности образца и иглы. Это утверждение можно пояснить на следующем частном примере. Допустим, что основной вклад в генерацию шумов вносят особенности процессов на поверхности иглы. В этом случае относительное перемещение иглы вдоль образца (при неизменной величине зазора) не будет приводить к изменению величины туннельного тока и величины его шума. В том случае, если доминирующими причинами шумов туннельного перехода являются процессы на поверхности образца (миграция атомов, динамика образования дефектов, деградация поверхности и пр.), то наличие или отсутствие взаимного перемещения образца и иглы в латеральном направлении может иметь существенное значение. Различные динамические процессы на поверхности (например, образование дефекта или миграция атома) имеют ограниченный радиус действия в пространстве, сравнимые с размером одиночного атома. Для описания шумового воздействия такие процессы можно представить в виде локальных флуктуаторов, каждый из которых имеет свою независимую фазу и амплитуду шумовых колебаний. При неподвижной или медленно перемещающейся игле (например, в результате теплового дрейфа) взаимодействие с отдельным флуктуатором может быть продолжительным во времени. При быстром сканировании (продольном перемещении иглы) время взаимодействия отстрия с каждым из флуктуаторов уменьшается. При этом результирующий шум перехода является суммой шумов, обусловленных отдельными флуктуаторами со случайной амплитудой и фазой. В предельном случае (бесконечно большое число независимых флуктуаторов и малое время взаимодействия с каждым из них) должна наблюдаться трансформация шума вида 1Д в белый шум. На практике при увеличении скорости сканирования мы наблюдали некоторое уплощение (уменьшение мощности шума на низких частотах) кривой зависимости спектральной плотности шума от частоты.

Флуктуационная туннельная микроскопия дает дополнительную косвенную информацию о динамических процессах на поверхности тел.

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ УЛЬТРАТОНКИХ ПЛЕНОК ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ ЕМКОСТНОГО УЛЬТРАДИНАМОМЕТРА

При установлении механического контакта между зондом и поверхностью твердого тела основными факторами адгезии являются ван-дер-ваальсовы силы и капиллярные эффекты, возникающие в результате капиллярной конденсации паров, присутствующих в газовой среде в кольцевой зоне, окружающей места контакта зонд-образец. Изучение вопросов адгезии в таких системах имеет особый практический интерес для исследования прилипания частиц порошков к твердым субстратам. В атомно-силовой микроскопии учет сил в области контакта имеет принципиальное значение, поскольку именно эти силы определяют деформационные изменения зонда и поверхности образца, геометрию и площадь контакта и соответственно пространственное разрешение, достигаемое при визуализации поверхности объектов во влажной среде или в жидкости. При изучении материалов низкой механической жесткости достижение высокого пространственного разрешения возможно при снижении сил в области контакта за счет выбора оптимальных условий наблюдений (обеспечения прерывистого контакта зонд-образец, уменьшения влажности окружающего воздуха, гидрофобизации поверхности острия зонда, наблюдения в жидких средах и пр.).

Сила взаимодействия между двумя макроскопическими частицами рассчитана В.Б. Дерягиным на основе строгого термодинамического подхода при следующих существенных допущениях: а) радиусы кривизны частиц значительно больше радиуса действия поверхностных сил и расстояния между телами, б) частицы достаточно жесткие, так что их деформациями поверхностными силами можно пренебречь. Сила взаимодействия ^ между выпуклыми частицами с радиусами кривизны Я] и определяется удельной энергией взаимодействия \У(Н), рассчитываемой на единицу площади противоположных участков плоскопараллельных пластин,

к, + я2

Это соотношение является термодинамическим, т.е. оно не связано с какими-либо конкретными предположениями о природе сил взаимодействия, за исключением предположений об их равновесно обратимом характере и затухании на расстояниях, малых по сравнению с размерами частиц. Взаимодействию выпуклой частицы с плоской поверхностью соответствует предельный случай Л, -> оо

Р(Н) = -2лЯНг(Н)

В этом приближении сила адгезии выпуклой частицы к плоской поверхности просто связана с работой адгезии

С учетом связи поверхностного натяжения у5У с работой по разъединению двух плоских поверхностей единичной площади А^^жл^у, для силы адгезии получаем соотношение

Практическое значение это соотношение имеет для случая установления контакта между телами в жидкости, поскольку поверхностное натяжение на границе раздела жидкости у=у51 легко определить в эксперименте.

На реальной поверхности твердого тела, расположенной на воздухе, происходят в той или иной мере процессы адсорбции примесей из окружающей среды. В случае влажного воздуха конденсация молекул воды на чистых поверхностях охарактеризована подробно, в том числе методами атомно-силовой микроскопии.

При наличии пленки воды на поверхности происходит увеличение силы адгезии за счет капиллярных сил. Образование водного мениска вокруг острия приводит к эффективному увеличению сил адгезии.

При установлении контакта между зондом и поверхностью в жидкости определенную роль может играть вязкость прослойки, которая должна быть выдавлена для достижения контакта. Аналогичный эффект можно наблюдать при сближении тел на воздухе, на поверхности которых имеется пленка воды. Для вязких масел и растворов полимеров кинетика нарушения контакта определяется вязким сопротивлением прослойки процессу ее деформации в зоне контакта. Экспериментальное измерение величины

гидродинамического трения тонких прослоек жидкости в зоне контакта имеет важное значение для теоретической интерпретации динамических процессов в области контакта.

Прямое измерение гидродинамических сил в зоне контакта между твердыми поверхностями. Корректное количественное измерение гидродинамических сил в области контакта поверхностей необходимо проводить при соблюдении необходимых требований:

- известна точная геометрия поверхности контактирующих тел;

- обеспечено отсутствие поверхностных факторов, приводящих к погрешности и невоспроизводимости измерений (неконтролируемая адсорбция примесей, наличие дополнительного электростатического взаимодействия и пр.);

- устранено продольное смещение образцов в процессе сближения, т.е. не происходит смещение зоны контакта относительно поверхности образцов.

Классическая схема атомно-силового микроскопа с микрокантилевером для этих измерений не подходит по крайней мере по двум причинам. Во-первых, определение формы острия (кремниевой пирамиды, выращенной на окончании упругого

кантилевера) затруднено. Во-вторых, при измерении сил взаимодействия зонд-образец происходит продольное перемещение области контакта по поверхности образца. Применяемые методы коррекции, обеспечивающие синхронное движение образца, уменьшают, но не устраняют скольжение области контакта.

Для измерения гидродинамического взаимодействия поверхностей в растворе электролита была сконструирована экспериментальная установка. Образцами являлись стеклянные сферы диаметром 7 мм, оплавленные на концах стеклянных трубок непосредственно перед установкой в прибор. Процедура установления образцов до начала измерений составляла несколько минут. Измерение макроскопического радиуса осуществляли с помощью оптического микроскопа с измерительной шкалой. Отсутствие микроскопических шероховатостей на поверхности оплавленного стекла контролировалось с помощью атомно-силового микроскопа.

Схема прибора представлена на рис. 6.1. Один из образцов 2 позиционируется микроманипулятором 4 относительно другого образца 1, установленного на биконсольной пружине 3 (с жесткостью К=102 Н/м). Магнитоэлектрическая система (6,7) позволяет прикладывать к образцу 1 внешнюю силу. В режиме линейно изменяющейся во времени t внешней силы с заданной скоростью развертки а уравнение баланса сил имеет вид

ait - KAz + f = 0 , (6.1)

где f - сила взаимодействия образцов. Перемещение Az образца 1 измеряется по изменению емкости конденсатора 5 с воздушным зазором (одна из обкладок которго является элементом конструкции пружины 3). Сигналы с конденсатора и магнитоэлектрической системы поступают в блок измерительной обработки и выводятся на самописец в виде зависимости силы f от перемещения Az.

Эффективная масса пружины с образцом 1 составляла несколько долей грамма. Прибор защищен колпаком от конвективных потоков воздуха и установлен на аммортизирующей подвеске с характерными частотами порядка 1 Гц. Измерения проводили в обычных лабораторных условиях, при этом шумовой фон находился в пределах 0,5 нм по перемещению и 5 х Ю-8 Н по силе.

Контрольные измерения на воздухе обнаруживают большие силы адгезии, характерные для молекулярно-гладких поверхностей оплавленного стекла; при измерениях в бидистиллированной воде наблюдались экспоненциально спадающее с расстоянием отталкивание двойных электрических слоев (по ДЛФО) - в полном согласии с сообщавшимися данными для стекла и кварца (Рабинович Я.И. Коллоидный журнал. 1977, т. 39, № 6, с. 1094; Horn R.G., Smith D.T., Haller W. Chem. Phys. Letters, 1989, v. 162, N 4/5, p. 404). Добавление электролита (Ю-1 M NaCl) устраняет это отталкивание и делает возможным непосредственное наблюдение сил гидродинамической (вязкой) природы, которые становятся существенными при достаточно высоких скоростях а нагружения (развертки внешней силы).

(вязкой) природы, которые становятся существенными при достаточно высоких скоростях а нагружения (развертки внешней силы).

Л1ИША Л

-6

10,н

-10. н

Рис. 6.1. Схема ультрадинамометра: 1,2-исследуемые образцы, 3 - биконсольная пружина, 4 - микроманипулятор, 5 - 0 измерительный конденсатор, 6,7 магнитоэлектрическая система

Рис. 6.2. Зависимость силы взаимодействия от перемещения Аг для стеклянных сфер (К=3,5 Ш3 м) в 0,1 М водном растворе МаС1 при их сближении и удалении при различных скоростях нагружения: а= ±2,5 10~8 (а), а= ± 2,5 10-7 (б), а= ± 2,5 1&6 Н/с (в); г - теоретические зависимости силы / от расстояния г для а= ±2,5 10-6 Н/с, 77 = 10-3 Па с.

10 ям

^ ' ¿1 а

г

у* 5

■г

^^ Г

■р

а

Результаты измерений в растворе соли показаны на рис. 6.2. При небольших скоростях нагружения (квазистатический режим) наблюдается слабое притяжение (ГсО) на расстояниях порядка единиц нанометра (рис. 6.2.а), объяснимое действием молекулярных сил. Кривые для сближения (а<0) и удаления (а>0) поверхностей практически совпадают. При больших скоростях развертки а (рис. 6.2в) возникает сила вязкого сопротивления, направленная навстречу движению образца (Ь0 при сближении и Г<0 при удалении). При сближении поверхностей сила Г монотонно нарастает (в условиях заданного для внешней силы режима а=сопзк0), а при удалении (а=соп500) кривая проходит через минимум (вязкостное

"прилипание"), глубина которого при достаточно больших а многократно превосходит глубину минимума, наблюдаемого в квазистатических условиях.

Сила взаимодействия между двумя сферическими (математическими) поверхностями радиуса R, обусловленная вязким сопротивлением прослойки сплошной однородной среды толщиной Z с вязкостью т], дается известным асимптотическим (Z«R) уравнением (Israelashvili J.N., J. Colloid.Interface.Sci. 1986, v. 110, N 1, p. 263.):

/ = - f^If. (6.2)

Из уравнения движения (6.1) скорость v=dZ/dt можно выразить в виде

4 Kdz'

что после подстановки в уравнение (6.2) гидродинамической модели дает

--^Г (6-4)

з

где a = -^rjR2. В частности, при df/dZ=0 из выражений (6.3) и (6.4) имеем соответственно соотношения v.=a/K и

f-z-=~aJ (6.5)

справедливые на "бесконечных" расстояниях и для координат экстремума (возникающего в режиме удаления поверхностей).

Для сближения (а<0) сфер с R=3,5 Ю-3 м в режиме постоянной скорости нагружения a=±2,5 10"6 Н/с с достаточно больших исходных расстояний, при которых f=0 (df/dZ=0 и отвечающая данному значению а начальная скорость v.=a/K=25 нм/с), результатом численного интегрирования уравнения (6.4) является кривая 1 на рис. 6.2г. Интегрирование уравнения (6.4) при положительном (удалении) значении a=+2,5 10"6 Н/с и экстремальном значении f«=-l,25 Н ( в соответствии с экспериментально измеренным) дает кривую 2 на рис. 6.2г, которой согласно (6.5), отвечает Z.= l,2 нм.

Как следует из сопоставления рис. 6.2, виг, экспериментальные кривые как в процессе сближения, так и в процессе удаления поверхностей практически совпадают (в пределах точности измерений) с теоретическими, полученными в континуальном приближении с использованием объемной вязкости воды. Тем самым подтверждается вывод об отсутствии значительных аномалий вязкости водных прослоек вдоль до толщины порядка нанометров.

ВЫВОДЫ

1. Продемонстрирована перспективность методов атомно-силовой микроскопии для изучения морфологии и локальных механических свойств поверхности полимерных материалов. Показано, что в отличие от традиционных методов высокого разрешения (растровой и просвечивающей электронной микроскопии) зондовая микроскопия позволяет исследовать не только морфологию поверхности, но и локальные механические свойства с нанометровым пространственным разрешением. При исследовании структурно неоднородных полимерных материалов зондовая микроскопия позволяет получить прямые данные о трехмерном профиле поверхности. Экспериментальные результаты зондовой микроскопии применены для объяснения механизма возникновения в тонком металлическом слое, напыленном на поверхность полимерной пленки, периодической структуры, возникающей при растяжке полимера.

2. На примере визуализации Цитохрома Р-450 показана возможность наблюдения с помощью сканирующей туннельной микроскопии отдельных белковых молекул, встроенных в биомембрану. Проведено исследование топологии липидных пленок и биомембран методами зондовой микроскопии. Проведен сравнительный анализ подложек, перспективных для нанесения липидных структур.

3. Показано, что атомно-силовая микроскопия позволяет проводить экспресс-анализ морфологии полимерной поверхности живых бактериальных клеток. Методами атомно-силовой микроскопии осуществлена визуализация энтеробактерий различных таксономических групп Escherichia coli, Klebsiella, Helicobacter pyroli, Lactobacillus fermentum и Bifidobacterium longum. Впервые зарегистрировано изменение структуры липополисахаридов клеточной стенки бактерий Escherichia coli, наследующих генетическую детерминанту, контролирующую синтез первичных боковых цепей дизентерийных бактерий. Такие бактерии применяют в клинической практике в качестве живых векторных вакцин против энтерозаболеваний.

4. Получены прямые результаты пространственной координации смешанных двух- и трехкомпонентных пленок производных насыщенных углеводородов (докосана и эйкосана) с контролируемой степенью полярности. Проведено исследование процессов самоорганизации и начального роста кристаллов в смешанных органических пленках. На примере кристалла докосандиола с помощью атомно-силового микроскопа впервые продемонстрировано наличие пространственных областей, соответствующих минимуму потенциальной энергии молекул, расположенных на кристаллической поверхности.

5. Разработан метод контроля остаточных загрязнений чистых жидкостей методом атомно-силовой микроскопии при избирательной адсорбции на проводящих и диэлектрических подложках. Показано, что чувствительность метода контроля остаточных примесей в чистых жидкостях с помощью атомно-силового микроскопа на порядок превосходит чувствительность современных методов седиментации и фотометрии.

6. Впервые получены прямые данные о конформационных переходах молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), обусловленных взаимодействием с поверхностно-активными веществами (ПАВ). Структурные данные комплекса ДНК-ПАВ выявлены с помощью методов сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии.

7. Определен характер низкочастотных флуктуаций туннельного тока. Показано, что спектральная плотность шума туннельного перехода имеет вид 1/1° (а= 1+0.1), и мощность шума коррелирует с интенсивностью поверхностной диффузии, миграции атомов и дефектов на поверхности. Проведена оценка предельной чувствительности сканирующего туннельного микроскопа при измерениях малых перемещений по нормали к образцу.

8. Создана экспериментальная установка для измерения поверхностных сил с помощью емкостного ультрадинамометра. Проведено исследование гидродинамического вязкого трения в ультратонких пленках воды. Показана применимость модели сплошной среды для описания динамических процессов в тонких пленках толщиной до ед. нм.

9. Разработана серия аппаратуры сканирующей зондовой микроскопии для исследования поверхности твердых тел, тонких органических пленок и биологических структур, обеспечивающая субнанометровое пространственное разрешение - сканирующие туннельные и атомно-силовые микроскопы различной модификации, ультранизкотоковый сканирующий туннельный микроскоп, система для одновременного измерения туннельного тока и сил в туннельном переходе.

Составлен библиографический указатель по методам сканирующей зондовой микроскопии (6200 ссылок на научные работы).

ПУБЛИКАЦИИ

Основные результаты диссертации отражены в следующих публикациях:

1. Белов А.А., Бонч-Бруевич В.В., Яминский И.В. О возможности наблюдения электрического дипольного резонанса по изменению

статической поляризации. Журнал физической химии, т. 59, с. 10491051 (1985).

2. Белов А.А., Яминский И.В. Эффект Штарка первого порядка в спектрах двухатомных молекул, адсорбированных на поверхности металла. Поверхность: химия, физика, механика, 147-149 (1985).

3. Белов А.А., Яминский И.В. Чувствительный радиоспектроскоп для регистрации спектров поглощения газов по изменению статической поляризаации методом емкостного датчика. Москва, деп. в ВИНИТИ, N 3758-85 от 30.05.85, 14 с.

4. Шкель Ю.М., Лукашевич М.В., Яминский И.В. Применение LC-генератора для изучения процессов с малыми изменениями магнитных свойств жидкости. Магнитная гидродинамика, N4, 86-90 (1988).

5. Савинов С.В., Степанов А.В., Яминский И.В. Высоковольтный прецизионный вторичный источник питания. Приборы и техника эксперимента, N 2, 131-133 (1991).

6. Васильев С.И., Моисеев Ю.Н., Никитин Н.И., Савинов С.В., Яминский И. В. Сканирующий туннельный микроскоп "Скан": конструкция и области применения. Электронная промышленность, N 3, 36-39 (1991).

7. Васильев С.И., Савинов С.В., Яминский И.В. Зондирующие эммитеры для сканирующей туннельной микроскопии. Электронная промышленность, N 3, 42-45 (1991).

8. Shapiro A.G., Yaminsky l.V. Nondestructive investigations of multilayer dielectrical coating. Proceedings of the SPIE - The International society for Optics, 1362(2), 834-840 (1991).

9. Моисеев Ю.Н., Панов В.И.. Савинов С.В., Яминский И.В. Применение атомно-силового микроскопа для исследования структуры поверхности различных материалов. Электронная промышленность, N 3, 39-41 (1991).

Ю.Стеблин В.Н., Щукин В.Д., Яминский В.В., Яминский И.В. Гидродинамическое взаимодействие поверхностей в растворе электролита. Новый метод исследования поверхностных сил с использованием емкостного ультрадинамометра. Коллоидный журнал, том 53, N 4, с. 684-687 (1991).

11. Yu. N. Moiseev, V.I. Panov, S.V. Savinov, S.I. Vasil'ev, and l.V. Yaminsky, AFM and STM Activities at Advanced Technologies Center, Ultramicroscopy, 42-44, 1596-1601, (1992).

12. Yu. Moiseev, V. Panov, S. Savinov, I. Yaminsky, P. Todua, D. Znamensky, Atomic force and scanning tunneling microscopy of comb-like cholesteric liquid crystalline polymer LB film, Ultramicroscopy, 42-44, 304-309, (1992).

13. Yaminsky l.V. Scanning tunneling/atomic force microscope "Scan-8". Moscow, Avanced Technologies Center. 1992, - 42 p.

14. V.N. Steblin, E.D. Shukin, V.V. Yaminsky, l.V. Yaminsky, Hydrodynamic Interaction in Electrolyte Solution. A New Method of Investigation of

Surface Forces using a Capacitor Ultradynamometer, Mendeleev Communications, N 2, 42-44 (1992).

15.N.S. Maslova, Yu.N. Moiseev, V.I. Panov, S.V. Savinov, S.I. Vasilev, I.V. Yaminsky, Tunneling through Adsorbate and Thin Films, Induced Conductivity, Charge Density Waves, Physica Status Solidi (a), 131, 35-45,

(1992).

16. F. Bordoni, V.I. Panov, S.V. Savinov, A.V. Stepanov, I.V. Yaminsky, Low frequency noise in scanning tunneling microscopy measurements, AIP Conference Proceedings 285 Noise in Physical Systems and 1/f Noise fluctuations, St.Louis, 1993, p. 487-490

17.Яминский И.В. Работы ученых МГУ в области туннельной спектроскопии и наноэлектроники. Электронная промышленность, N 10, 25-28 (1993).

18. Васильев С.И., Казанцев Д.В., Моисеев Ю.Н., Панов В.И., Савинов С.В., Яминский И.В. Приборы локального зондирования поверхности. Электронная промышленность, N 10, 29-33 (1993).

19. Васильев С.И., Моисеев Ю.Н., Панов В.И., Савинов С.В., Яминский И.В., Герасимов А.В., Зиневич А.Я., Саморуков В.Д. Сканирующий туннельный атомно-силовой микроскоп "Скан-8". Электронная промышленность, N 10, 34-35 (1993).

20.Акципетров О.А., Захарченко В.В., Казанцев Д.В., Кобляков Н.В., Панов В.И., Яминский И.В. Электрохимический сканирующий туннельный микроскоп. Электронная промышленность, N 10, 38-40

(1993).

21. Казанцев Д.В., Савинов С.В., Яминский И.В. Высоковольтный усилитель для пьезоманипулятора сканирующего туннельного микроскопа. Электронная промышленность, N 10, 40-42 (1993).

22. Казанцев Д.В., Савинов С.В., Яминский И.В. Высокоскоростной сканирующий туннельный микроскоп. Электронная промышленность, N 10, 45-48 (1993).

23. Яминский И.В. Сканирующая туннельная микроскопия. Электронная промышленность, N 10, 62-63 (1993).

24.А.А. Ejov, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, J. Pan, C. Leygraf, D. Thierry, Nanoscale modification of oxide simiconductor layer on Ti surface using electrochemical treatment: Scanning tunneling microscopy/spectroscopy observation. International Symposium "Nanostructures: Physics and Technology. Abstracts of Invited Lectures and Contributed Papers.

St.Petersburg, 1993, 96-98.

25.A.A. Ejov, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, J.Pan, C. Leygraf, D. Thierry, Ex situ scanning tunneling microscopy investigations of the modification of titanium surface due to corrosion processes. J.Vac.Sci.Technol. В 12(3), 1547-1550 (1994).

26. Yu.N. Moiseev, V.I. Panov, S.V. Savinov, I.V. Yaminsky, Local probing instrumentation at Advanced Technologies Center: Surface and force devices with tunneling sensor. J.Vac.Sci.Technol. В 12(3), 1690-1693 (1994).

27. Ю.Н. Моисеев, C.B. Савинов, И.В. Яминский, П.М. Недорезова, Ф.С. Дьячковский. Исследование природы модифицирующего действия графита на полимеризацию пропилена в присутствии закрепленных на поверхности катализаторов Циглера-Натта методами сканирующей туннельной микроскопии/спектроскопии и атомно-силовой микроскопии. Химическая физика, т. 13, N 10, 100-107 (1994).

28. И.В. Яминский. Сканирующая зондовая микроскопия. Методы и аппаратура. Российский химический журнал, том XL, N 1 111-120 (1996).

29. E.B. Аплеталина, М.О. Галлямов, Ю.Д. Иванов, О.И. Киселева, В.Ю. Уваров, И.В. Яминский. Визуализация липосом и протеолипосом методами сканирующей зондовой микроскопии. Авторефераты 1-ой международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (Санкт-Петербург, 1996), с, 157159.

30. М.О. Галлямов, O.A. Пышкина, В.Г. Сергеев, А.Б. Зезин, В.А. Кабанов, И.В. Яминский. Конформация комплексов ДНК-ПАВ в водных и органических средах: СТМ-исследование. Авторефераты 1-ой международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (Санкт-Петербург, 1996), с, 179181.

31. Яминский И.В., Еленский В.Г. Библиографический указатель по методам сканирующей зондовой микроскопии (6200 ссылок на научные работы). М.: ЦПТ, 1996 - 62 с.

32. Uvarov V.Yu., Ivanov Y.D., Romanov A.N., Gallyamov M.О., Kiselyova О.Г., Yaminsky I.V., Scanning tunneling microscopy study of cytochrome P450 2B4 incorporated in proteoliposomes, Biochimie, v. 78, N 8/9, p. 780784 (1996)

33. A.C. Филонов, И.В. Яминский. Программный пакет управления и обработки данных для сканирующей зондовой микроскопии "ФемтоСкан-ООГ'.М.: Центр перспективных технологий, 1996. - 12 с.

34.Яминский И.В., Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Семенов А.Э., Филонов A.C. Визуализация прокариотических клеток с помощью атомно-силовой микроскопии. Сборник докладов Всероссийского рабочего совещания "Зондовая микроскопия-97". Нижний Новгород, 1997, с. 124-127.

35. М.О. Галлямов, O.A. Пышкина, В.Г. Сергеев, И.В. Яминский. Применение методов сканирующей зондовой микроскопии к исследованию конформационных свойств ДНК. Сборник докладов Всероссийского рабочего совещания "Зондовая микроскопия-97". Нижний Новгород, 1997, с. 128-131.

36. С.А. Бычихин, В.В. Потемкин, A.B. Степанов, И.В. Яминский. Шумы сканирующего туннельного микроскопа. Материалы докладов международного научно-технического семинара "Шумовые и

деградационные процессы в полупроводниковых приборах (метрология, технология, диагностика)". Москва, 1997, с. 40-43. 37. -64. Тезисы отечественных и международных конференций (см. раздел "Апробация работы").

АТС. з. 197 т. 100 17.04.97