Зондовая микроскопия биомакромолекул: нуклеиновых кислот, белков и их комплексов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Дубровин Евгений Владимирович

Щг

ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ: НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, БЕЛКОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ

Специальность 02.00.06 - высокомолекулярные соединения

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Яминский Игорь

Владимирович

Официальные оппоненты:

д.ф.-м.н., проф. Твердислов Всеволод Александрович к.ф.-м.н. Прохоров Валерий Васильевич

Ведущая организация: Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина

Защита состоится «26» октября 2005 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, физический факультет, ауд

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан А 2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 501.002.01 кандидат физико-математических наук .- Лаптинская Т.В.

ff€SG

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Методы сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) в том числе атомно-силовой микроскопии (АСМ), появившиеся в 1980-х годах, уже прочно вошли в арсенал физических методов, использующихся при изучении различных биологических объектов, прежде всего биополимеров и их комплексов. Разработка новых способов секвенирования ДНК, создание биологических контейнеров для доставки лекарств в организм, разработка живых векторных вакцин, - вот далеко не полный перечень актуальных на сегодняшний день вопросов, для решения которых необходимы исследования биополимеров с помощью СЗМ. Изучение поведения биополимеров и биополимерных комплексов на поверхности подложки и особенностей их адсорбции востребовано для развития молекулярной электроники или для дизайна молекулярных архитектур. Не менее актуально в настоящее время и решение фундаментальных проблем, связанных с изучением механизма трансляции в эукариотических клетках. Актуальность АСМ-исследований цианобактерий и их пилей (отростков) связана с тем, что цианобактерии используются как модельный объект для молекулярно-генетического изучения фотосинтеза растений.

Широкий спектр возможностей, предоставляемый зондовой микроскопией для изучения биополимеров, от получения трехмерных изображений с атомным разрешением до исследования локальных свойств объекта обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.

Целью диссертационной работы было получение на основе экспериментов по зондовой микроскопии новых данных о биополимерах (нуклеиновых кислотах, белках) и их комплексах, а также разработка методики исследования ДНК с помощью сканирующей туннельной микроскопии (СТМ).

В соответствии с поставленной целью решаются следующие задачи

1. Охарактеризовать состоящие из белковых молекул пили (отростки) одноклеточной цанобакгерии Synechocystis sp. РСС 6803, выяснить связь их морфологии, количества и геометрических характеристик с наличием фототаксиса.

2. Изучить особенности адгезии и адсорбции одного из представителей самого высокоорганизованного рибонуклеопротеида - вируса табачной мозаики (ВТМ) - на слюде и на графите, разработать новые методы нанесения частиц ВТМ для исследования в жидкости.

3. Охарактеризовать комплексы белка р50 и матричной РЖ (мРНК) при различных массовых соотношениях белка к мРНК.

4. Разработать методику нанесения ДНК на подложку из графита для последующего решения задачи сканирующей туннельной микроскопии ДНК на графите, а также построить модель заряженной линейной полимерной молекулы, адсорбированной на подложку в условиях гидродинамического потока.

Материалы и методы. АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope ГОа (Digital Instruments, USA) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,06, 0,32, 0,58 и 0,12 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, USA) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц. СТМ-измерения проводили на некоммерческом низкотоковом сканирующем туннельном микроскопе (Университет Наймегена, Нидерланды) и сканирующем туннельном микроскопе Фемтоскан (Центр перспективных технологий, Россия). Для обработки изображений использовали программу ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий, Россия). В качестве подложек использовали как свежесколотые, так и

подвергнутые различным модификациям поверхности слюды и графита. В качестве модификаторов слюды использовали такие соединения, как стеариновая кислота, различные алкиламины, MgC^, "у-аминопропилтриэтоксисиланом (АПС) (для исследований ДНК и РНК-белковых комплексов), изобутанол, триэтиламин, диэтилентриамин, бромид цетилтриметиламмония (для исследований ВТМ).

Моделирование молекулы РНК и решение задачи о восстановлении реального профиля поверхности по её АСМ-изображению проводились с использованием среды Matlab 6.0.

Штаммы цианобакгерии Synechocystis sp. были взяты из генетических коллекций кафедры генетики биологического факультета МГУ (неподвижный штамм) и Института Пастера (подвижный штамм) и выращены в питательной среде при умеренном освещении. Вирус табачной мозаики выделяли из зараженных листьев Tobacco nicotiana путём дифференциального центрифунирования, а затем дополнительно очищали центрифугированием в предварительно сформированном градиенте плотности водного раствора хлористого цезия на центрифуге Beckman L8. В работе использовалась плазмидная линеаризованная ДНК, а также несколько видов синтетических РНК и РНК, выделенная из вируса табачной мозаики. Белок р50 был синтезирован и выделен из бактерии Escherichia coli.

Для сканирования на воздухе на подложку наносили 10-20 мкл суспензии (иногда подложку помещали сверху на каплю), содержащей исследуемый объект, выдерживали 5-10 минут для адсорбции, а затем высушивали в потоке воздуха. Для сканирования в растворе жидкостную ячейку устанавливали над подложкой с нанесённой на неё каплей (20 мкл) суспензии.

Научная новизна диссертации.

1. Показана связь различных характеристик пилей с наличием или отсутствием фототаксиса, детально охарактеризованы пили одного из штаммов цианобактерии Synechocystis sp.

2. Впервые показаны некоторые особенности адгезии частиц ВТМ на поверхностях слюды и графита, разработаны способы модификации слюды для АСМ вирусов.

3. Впервые получены данные по морфологии и размеру комплексов белка р50 с мРНК при различных массовых соотношениях белка к мРНК, которые объясняют особенности трансляции в эукариотических клетках.

4. Разработан ряд методик иммобилизации биополимеров на проводящую подложку, позволяющих проводить СТМ-исследования ДНК.

5. Впервые адсорбция расправленной молекулы РНК на подложке интерпретирована с помощью модели заряженного биополимера, помещенного в гидродинамический поток.

Практическая значимость работы. Результаты диссертации позволяют продвинуться в решении следующих задач:

- создание новых прямых методов секвенирования ДНК на основе СТМ ДНК на графите;

- создание резистентных иммунной системе контейнеров для доставки лекарств на основе искусственных рибонуклеопротеидов;

- определение разновидности штамма цианобактерии по её пилям (дополнительный критерий);

- манипулирование отдельными молекулами ДНК, например, для молекулярного дизайна.

Кроме того, особенности и закономерности адсорбции частиц ВТМ на подложку, без сомнения, могут быть использованы в решении задач молекулярной электроники. Стоит также отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биополимеров, биофизике, молекулярной биологии и медицине.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах:

- Международный биофизический конгресс - 2005, Монпелье, Франция;

- научная школа NATO ASI «Functional Properties of Nanostructured Materials», Созополь, Болгария, 2005;

- научная школа NATO ASI «From Cells to Proteins: Imaging Nature across Dimensions», Пиза, Италия, 2004;

- Ш Международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, Россия, 2004;

- IV Международная конференция «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии», С-Петербург, Россия, 2004;

- Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «J1OMOHOCOB-2004», «JIOMOHOCOB-2005», Москва, Россия, 2004,2005;

- научная школа NATO ASI "Soft Condensed Matter Physics in Molecular and Cell Biology", Эдинбург, Великобритания, 2004;

- Международная конференция «STM-2003», Эйндховен, Нидерланды, 2003;

- Международная конференция «SPMP 2003», Керкраде, Нидерланды, 2003;

- Международная конференция «SPM 2003», Нижний Новгород, Россия, 2003;

- Конференция студентов и аспирантов, Дубна, Россия, 2002;

- Международная конференция «SPM 2002», Нижний Новгород, Россия, 2002.

Личный вклад автора. Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии выполнены автором лично.

Автор принимал участие в приготовлении образцов бактериальных клеток, вирусов, нуклеиновых кислот, белков и их комплексов совместно с сотрудниками биологического факультета МГУ им. MB. Ломоносова, НИИ ФХБ им. A.H. Белозерского, Института белка РАН, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы, включающего 182 наименования. Работа изложена на 112 страницах, содержит 47 рисунков и 4 таблицы.

Основное содержание работы

Во введении излагается актуальность выбранной темы диссертационной работы, определяются её цели и задачи.

Глава_1 содержит подробный обзор литературы по теме диссертации.

Рассматриваются основы методов зондовой микроскопии (раздел 1.1), в особенности атомно-силовой и сканирующей туннельной микроскопии (СТМ), их преимущества и недостатки по сравнению с методами электронной микроскопии, а также возможности при исследовании биологических объектов, таких как биополимеры. Описываются различные режимы работы АСМ. Особое внимание уделено рассмотрению сил, действующих между зондом и поверхностью во время сканирования, а также анализу силовых кривых в АСМ. Раздел 1.2 содержит краткую справочную информацию по изучаемым биополимерам (белкам и нуклеиновым кислотам, подраздел 1.2.1), а также обзор работ по конкретному применению АСМ (в основном) и СТМ для изучения биополимерных объектов (подразделы 1.2.2-1.2.5). В отдельные подразделы выделены исследования бактериальных клеток, вирусных частиц, белков, нуклеиново-белковых комплексов и нуклеиновых кислот. Перечислены как наиболее значимые достижения в этой области, так и те проблемы, которые до настоящего времени решить не удалось.

Дальнейшее изложение работы логически разделено на две части: экспериментальную (главы 2-4) и теоретическую (главы 5-6).

Глава 2 посвящена исследованию с помощью АСМ пилей одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Несмотря на сильное распространение методов АСМ для исследования бактериальных клеток, работы по изучению топографии и морфологических характеристик фотосинтезирующих

цианобактерий ещё не встречались. Дикий тип клеток ЗупесИосуз^ ер. РСС 6803 обладает положительным фототаксисом, т.е. способностью передвигаться по поверхности субстрата по направлению к свету. Фототаксис цианобактерии ЕупесЪ.осу$И$ РСС 6803 представляет собой подвижность клеток на поверхности субстрата, для осуществления которой необходимо наличие пилей IV типа. Пили IV типа состоят из спирально закрученных 500-1000 субъединиц полипептида пилина.

Рис. 1. Анализ подвижности (сверху) и опыты по АСМ (снизу), а -подвижный (дикий) штамм Synechocystis 6803; б - неподвижный (мутантный) пггамм Synechocystis 6803. Масштабные отрезки соответствуют 2 мм (опыты по подвижности) и 1 мкм (АСМ-изображения) соответственно.

Использование АСМ для изучения пилей Synechocystis 6803 оказалось эффективным благодаря как преимуществам АСМ, так и хорошей адгезии этих клеток на поверхность слюды. Данные, полученные в режимах контактном и прерывистого контакта АСМ, дополняя друг друга, создали общую картину изучаемого объекта. На рис.1 представлены результаты опытов по подвижности (сверху) и АСМ (снизу) дикого типа Synechocystis (а) и его неподвижного мутанта (б), не способного к фототаксису. Synechocystis имеет два типа пилей, которые на

а

б

АСМ-изображениях отличаются по высоте: толстые пили (4 нм), отвечающие за фототаксис, и тонкие (2 нм), функция которых до сих пор неизвестна. Тонкие пили распределены равномерно по поверхности клетки, тогда как толстые обычно концентрируются в определённых местах. Оказалось, что у неподвижного мутанта Synechocystis толстые пили длиннее (более 10 микрон) и их количество в 3-5 раз больше, чем у дикого типа, длина толстых пилей которых не превышает 2 микрон Различие в тонких пилях у этих двух штаммов обнаружено не было. Таким образом, хотя толстые пили необходимы для фототаксиса, их повышенное количество приводит к потере подвижности. Наличие на АСМ-изображениях мелких нитей (диаметром менее 1 нм), выходящих из тонких пилей, позволяет предположить наличие у них внутренней структуры, состоящей из волокон, переплетённых между собой. Данные результаты являются очень важными, т.к. показывают связь морфологии клетки и белковых пилей с ее двигательной функцией. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о перспективности использования метода АСМ для исследования цианобактерий разных штаммов при решении различных задач биофизики и биологии.

Глава 3 посвящена изучению с помощью АСМ рибонуклеопротеидов. Вирусы являются наиболее высокоорганизованными рибонуклеопротеидами, существующими в природе. В разделе 3 1 главы 3 исследуется вирус табачной мозаики, особенности его адсорбции на подложках из слюды и высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ), а также предлагаются и анализируются различные способы химической модификации слюды для увеличения адгезии частиц ВТМ.

Вирус табачной мозаики представляет собой "палочки" диаметром 18 нм и длиной 300 нм, состоящие из белка и РНК. АСМ-изображения частиц ВТМ, осажденных на слюду и графит, полученные на воздухе в режиме прерывистого контакта, представлены на рис. 2 (сверху). Анализ распределений по длинам частиц ВТМ на разных подложках (рис. 2 снизу) показал заметное отклонение от нормы в длинах частиц ВТМ, адсорбированных на подложку из графита: пик распределения приходится на значение, равное 250 нм, тогда как длина вириона ВТМ составляет 300 нм (что и получается для вирусов на слюде). Это

свидетельствует о влиянии графитовой подложки на частицы ВТМ, которое приводит к частичному разрушению белковой оболочки вируса. Еще одно различие при адсорбции ВТМ на слюде и на графите состоит в направлении отдельных вирусных частиц на этих подложках: в ориентации частиц ВТМ на ВОПГ есть выделенное направление, совпадающее с направлением ступенек, всегда присутствующих на графите вследствие наличия дефектов в его кристаллической решетке. Кроме того, показана корреляция ориентации вирусных частиц на подложке с направлением её кристаллографических осей, т.е. максимумы в распределении взаимной ориентации частиц, адсорбированных на графит, приходятся приблизительно на углы 30°, 60° и 90°.

Рис. 2. Полученные на воздухе АСМ-изображения частиц ВТМ (сверху) и гистограммы их распределения по длинам: а - частицы ВТМ адсорбированы на поверхность слюды, сВтм=1,3 мг/мл; б - частицы ВТМ адсорбированы на поверхность графита, свтм=0,065 мг/мл. Размер АСМ-изображений -2.95x2.95 мкм.

Количество частиц, осажденных на скол ВОПГ из дисперсии с концентрацией вируса 0,325 мг/мл, составило около 200 мкм"2, тогда как при нанесении на скол слюды из дисперсии, в 4 раза более концентрированной, это число составило всего 3-6 мкм"2. Высокая адсорбционная активность вирусных частиц по отношению к поверхности ВОПГ по сравнению с поверхностью слюды объясняется гидрофобным взаимодействием частиц с подложкой (частицы наносились из водного раствора). Способность вирусных частиц в значительном количестве осаждаться на графите, не означает, однако, наличия сильного адгезионного взаимодействия между подложкой и ВТМ- при сканировании в жидкости даже в режиме прерывистого контакта, когда воздействие зонда на образец минимизировано, можно наблюдать, как резко уменьшается количество частиц ВТМ на двух последовательно полученных изображениях. Похожие результаты были получены и при сканировании в жидкости частиц ВТМ, адсорбированных на слюде, обработанной -у-аминопропилтриэтоксисиланом. Таким образом, для эффективного исследования ВТМ в жидкости необходима предварительная модификация поверхности подложки с целью более прочного закрепления на ней вирусных частиц. Поскольку разница в сорбции вирионов связана, скорее всего, с гидрофобным взаимодействием поверхности подложки и частиц ВТМ, то количество вирусных частиц, сорбированных на единицу площади поверхности, может быть своеобразным показателем гидрофобности этой поверхности.

Чтобы повысить

гидрофобность поверхности слюды, ее свойства были изменены путем модифицирования различными химическими соединениями: изобутанолом, триэтиламином, диэтилентриамином, цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ). Наиболее эффективным модификатором оказался ЦТАБ, который повысил

Ьи^шН!

8 триэтиламие двтгилеш рнаиин

««¡исколоти шобугавол „ТАБ

слюда (контроль) 4

Рис. 3. Гистограмма, показывающая количество вирусных частиц, адсорбированных на единице площади поверхности слюды, модифицированной различными химическими соединениями.

адсорбцию ВТМ к слюде более чем в 10 раз по сравнению с немодифицированной слюдой (рис. 3).

Раздел 3.2 посвящен изучению белка р50 - мажорного белка цитоплазматических матричных рибонуклеопротеидов (мРНП) и его комплексов с РНК. Данные комплексы используются как модель для изучения природных мРНП, поскольку о™ максимально близки как по составу, так и по физико-химическим свойствам. Взаимодействуя с РНК или ДНК, р50 кардинально влияет на важнейшие процессы в клетке, связанные с реализацией генетической информации: транскрипцию и трансляцию. Белок р50 состоит из трех доменов- на N-кояце находится небольшой домен, богатый аланином и пролином (А/Р-домен), далее идет домен холодового шока (CSD), а за ним протяженный С-концевой домен, состоящий из чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислот, с размером каждого кластера примерно в 30 остатков.

АСМ-изображение белка р50 в свободном (мультимерном) виде представлено на рис. 4а: это частицы высотой 8-10 нм и диаметром (на

О 300 SOO 900 1200 nm D ICD 2Ш 300 400 500 600 пш

0 <0 80 12Р 1Е0 200 nm D 40 60 120 1Б0 nm

Рис.4. АСМ-изображения свободного мультимерного (а) и мономерного (б) белка р50. Сечения, проходящие по пунктирным линиям на АСМ изображениях, приведены под этими изображениями.

полувысоте) 30-40 нм. Наблюдаемые на изображениях ди- и тримеры являются, вероятно, результатом слипания гранул друг с другом.

Для получения изображения мономерного белка он диссоциировал в 1М LiCl Возможно, высокая концентрация соли при высушивании образца не позволяет получить четких АСМ изображений мономеризованного белка р50. Для преодоления этой проблемы мономерный белок сканировали при помощи АСМ в растворе с высокой концентрацией соли В этих условиях белковые молекулы выглядели как частицы со средней высотой около 4 нм (рис. 46).

В природе существует два вида мРНП: свободные (нетранслируемые), характеризующиеся высоким массовым соотношением входящих в их состав белка р50 и РНК mP50/mp1iK=3/l, и полисомные (транслируемые), характеризующиеся низким соотношением тр5о/трнк =2/1. В полисомных мРНП происходит процесс трансляции, в результате которого синтезируется белок по матричной РНК, тогда как мРНК свободных мРНП недоступна для факторов трансляции.

Поэтому в работе изучались комплексы белка р50 с РНК при разных степенях насыщения. Для визуализации мы использовали комплексы р50-РНК, собранные на

гиг

а

200 9 DC 800 30Р 0

Рис. 5. АСМ-изображения ненасыщенного комплекса р50/мРНК на воздухе. Комплексы собраны на (а) глобиновой, (б) 2Ьис РНК. Сверху показаны типичные изображения, снизу - увеличенные отдельные комплексы.

РНК различной длины. Кроме глобиновой мРНК (660 нуклеотидов), мы использовали 2Luc мРНК (-3000 нуклеотидов). Комплексы были сшиты глютаровым альдегидом. Сначала с помощью АСМ нами были изучены ненасыщенные комплексы (рис. 5). В этих комплексах массовое отношение белка р50 к РНК тр5(>/трнк составляло 0,5/1, что соответствует молярному соотношению 3/1 для глобиновой мРНК и 14/1 для 2Luc мРНК. Анализ АСМ-изображений этих комплексов (особенно для более длинной 2Luc мРНК) показал, что комплексы находятся в достаточно расправленном состоянии и их высота менее 2 нм: это скорее всего свидетельствует о том, что р50 входит в эти комплексы в мономерном виде. Средняя высота комплекса составляет 1,7 нм для глобиновой мРНК и 1,9 нм для 2Luc мРНК. Тот факт, что эти значения меньше высоты свободного мономерного р50, изображения которого были получены нами в растворе на модифицированной АПС слюде (~4 нм), может быть объяснен как взаимодействием р50 с мРНК, так и эффектом высушивания р50 на модифицированной слюде. Таким образом, на АСМ-изображениях ненасыщенных мРНП отсутствует сидящий на РНК р50 в мультимерной форме, что доказывает его диссоциацию при связывании с РНК.

Насыщенные комплексы (mp50/mPHK =8/1) белка с РНК оказались значительно компактнее, чем ненасыщенные мРНП (рис 6). Комплексы белка р50 с глобиновой мРНК выглядят как глобулы высотой 6,2±0,9 нм, т.е. в 3 раза выше самых больших ненасыщенных комплексов Насыщенные комплексы представляют собой одиночные глобулы либо дичеры, что является, вероятно, ассоциацией двух глобул. Распределение количества глобул на комплекс показывает, что подавляющая часть комплексов состоит только из одной глобулы (рис. 6а, снизу). Размер этих глобул свидетельствуй о том, что каждая из них состоит из нескольких молекул белка, что подтверждает представление о мультимеризации белка р50 при насыщении им мРНК Таким образом, образование насыщенных комплексов происходит в два этапа: сначала исходный мультимерный р50 диссоциирует на мономеры для связывания с РНК, а затем, по мере увеличения концентрации белка, мульгимеры р50 формируются вновь на РНК.

Эксперименты с 2Ьис мРНК, которая в 4,5 раза длиннее, чем глобиновая мРНК, показали формирование мРНП, состоящих из нескольких последовательных глобулярных частиц высотой 6,8±0,9 нм (рис. 66). В отличие от комплексов, собранных на глобиновой мРНК, большинство комплексов на основе 21 ж РНК состояли из четырех последовательных глобул, расстояние между центрами

Рис. 6. АСМ-изображения насыщенных комплексов р50 с РНК (сверху) и

гистограммы распределения количества глобул в комплексе (снизу) а -комплекс собран на глобиновой РНК (660 нуклеотидов), б - комплекс собран на 2-Luc РНК (3000 нуклеотидов), в - комплекс собран на РНК ВТМ (6000 нуклеотидов) Масштабный отрезок соответствует 1 мкм.

которых составляло 20-25 нм, а средняя длина этих мРНП равна 130±20 нм. Так как на глобиновой мРНК (660 нуклеотидов) формируется преимущественно одна мультимсрная глобула, а на 2Luc мРНК (3000 нуклеотидов) - четыре глобулы, нами было предположено, что одна глобула формируется приблизительно на 600700 нуклеотидов РНК. Для того чтобы проверить это предположение, мы исследовали Насыщенные комплексы с еще более протяженной РНК ВТМ (6000 нуклеотидов). Как и с остальными видами РНК, используемыми нами, белок р50 образует похожие глобулы высотой 6,5±0,8 нм и на РЖ ВТМ (рис. 6в). Большинство таких комплексов содержит восемь мультимерных глобул (см. диаграмму на рис. 3.15в), тем самым подтверждая наше предположение. Средняя длина насыщенных комплексов р50/РЖ ВТМ, измеренная из АСМ изображений, составляет 270±50 нм, что означает (принимая во внимание длину расправленной

РНК ВТМ -1,5 мкм), что насыщение РНК ВТМ белком р50 сопровождается ее 4-5 - кратной компактизацией.

Глава 4 посвящена зондовой микроскопии ДНК на слюде и на графите. Фиксация молекул ДНК на проводящей и достаточно инертной подложке из графита является достаточно сложной задачей. Для получения хорошей адсорбции ДНК на подложку из высокоориентированного пиролитического графита нами предложен ряд методик,

позволяющих равномерно модифицировать '>ис' АСМ-изображение молекул

ДНК на графите. Размер кадра 1,55 эту поверхность, оставляя ее достаточно мкм.

гладкой. Шероховатость модифицированной в

парах пентиламина поверхности составляет 0,2-0,5 нм, а перепады высот 0,4-1 нм. Благодаря этой процедуре, удалось впервые получить стабильные и хорошо воспроизводимые АСМ-изображения молекул ДНК на графите (рис. 7). Получившиеся размеры молекул гораздо ближе к нативным размерам молекулы ДНК, чем на изображениях на слюде. Ширина молекулы, измеряемая на полувысоте, оказывается равной 15-17 нм на графите, тогда как на слюде - 22-26 нм. Получаемые высоты молекул ДНК на графите приближаются к 1 нм, а на слюде - около 0,5 нм. Все сравнения проводятся для изображений, полученных одним и тем же кантилевером в режиме прерывистого контакта.

В работе также была исследована модификация поверхности графита в парах стеариновой кислоты (СНз(СН2)1бСООН), додециламина (С^НиМИг) и октадециламина (С!8Нз71ЧН2). Кроме того, стояла задача понять, как именно происходит модификация на молекулярном уровне. Для решения этой задачи применялась низкотоковая сканирующая туннельная микроскопия.

Нами было обнаружено, что на поверхности ВОПГ, модифицированной в парах стеариновой кислоты, образуется самоорганизующийся монослой (рис. 8), который не разрушается при воздействии на него водного раствора, что является важным аргументом для нанесения на него ДНК из раствора. Внешне похожие монослои образуются на поверхности графита также при модификации в парах додециламина и октадециламина. Алкановые производные самоорганизуются на поверхности кристалла в монослои, в которых углеводородные цепочки ориентируются вдоль кристаллографических осей подложки параллельно друг к другу, в то время как концевые группы выстраиваются в линию, образуя прямолинейные бороздки Эти бороздки являются разделительной полосой, отделяющей ряды функциональных групп молекулы, которые могут быть как положительно так и отрицательно заряжены, ог рядов гидрофобных углеводородных цепочек.

На рис 9 представлены АСМ-изображения молекул ДНК, адсорбированных на модифицированной в парах октадециламина поверхности ВОПГ. Иммобилизация молекул ДНК на монослой алкиламина становится возможной благодаря

*

электростатическому взаимодействию разноименно заряженных цепей ДНК с бороздками функциональных групп монослоя. Для того чтобы последовательно растянуть две молекулы на подложке с помощью атомно-силового микроскопа, кантилевер был приведен в контакт с подложкой во внутренней части кольца плазмидной ДНК, а затем перемещался во внешнюю по отношению к этому кольцу сторону. Последующее сканирование в режиме прерывистого контакта демонстрирует результат растягивания молекул ДНК (рис. 9, а-д).

Рис. 8. СТМ-изображение монослоя стеариновой кислоты, нанесенного из паров, 111=0,72 В, 1,-3 пА. Размер кадра 20x17 нм

Рис. 9. ACM изображения молекул ДНК на графите, модифицированном в парах октадециламина. Манипулирование проводилось над указанными черной и белой стрелками молекулами.

Рис. 10. СТМ-изображения молекул ДНК на графите, модифицированном (а, б) октадециламином, (в) додециламином. Размер кадра (а, б) 932x704 нм, (в) 1090x640 нм. и:=0,94 В, 1^1,8 пА - (а,б); и(=0,7 В, ^=3 пА - (в). Стрелками показаны молекулы ДНК.

Образцы ДНК, адсорбированные на поверхность ВОПГ, позволяют изучать их с помощью низкотоковой СТМ. К сожалению, туннельная микроскопия не позволяет так же тщательно отслеживать силу воздействия зонда на образец, как атомно-силовая микроскопия. Для минимизации силы воздействия зонда на образец необходимо увеличивать величину этого зазора, а значит по возможности увеличивать напряжение туннелирования и уменьшать туннельный ток. СТМ-изображения молекул ДНК, адсорбированных на модифицированном графите, представлены на рис. 10. Отдельные молекулы легко передвигались зондом по поверхности, в результате чего в некоторых областях толщина молекулы оказывалась завышенной. На двух последовательных изображениях (рис. 10 а, б) видно, что молекулы сметаются зондом и переносятся на новые места.

Возможность получать СТМ-изображения ДНК на поверхности графита -большой шаг вперед в зондовой микроскопии нуклеиновых кислот. Умение точно позиционировать и растягивать молекулы ДНК в комбинации в высокоразрешающими методами СТМ обеспечаг новые колоссальные возможности для прямого секвенирования ДНК.

Глава 5 посвящена моделированию молекулы РНК, адсорбированной на подложке в условиях гидродинамического потока.

Молекула РНК представлена в виде заряженной цепочки, звеньями которой являются шарики, соединенные нерастяжимыми

нитями (рис. 11). Заряд сосредоточен в каждом звене, таким образом, он распределен дискретно и эквидистантно. В точке закрепления молекулы с массивной (по сравнению

t t t t t ft f tA

Рис. 11. Модель молекулы РНК для вычисления формы ее контура. Fei -электростатическая сила со стороны остальных звеньев, Fr« - сила давления со стороны гидродинамического потока, Free - результирующая сила реакции, vnow - скорость гидродинамического потока.

с молекулой) подложкой заряда нет. Полный заряд молекулы Q есть сумма элементарных зарядов всех звеньев: Вся эта система помещена в

I

гидродинамический поток со скоростью v. На каждый элемент цепи действует электростатическая сила отталкивания Fei со стороны остальных звеньев, сила сопротивления Fra со стороны жидкости и сила реакции системы со стороны нерастяжимой нити Freac. Для оценки Fres взята формула Стокса Fm = 6xrrjv, а

= ^-—'jf,. • гДе гш ~ радиус-вектор, направленный от /-ого звена к атому, индекс а означает текущее звено, а суммирование производится по всем звеньям, кроме а. Система уравнений, составленная из второго закона Ньютона и уравнения связи:

\F~*/ =tg<p(x)'

V / reacx

где Freacy и Freaac - проекции Freac на оси у их соответственно (см. рис. 11), ф - угол, образованный касательной к контуру молекулы в некоторой точке, была решена численно с использованием программы Matlab 6.0.

Для наблюдаемых в эксперименте молекул их заряды составили согласно модели несколько сотен электронов. Данная модель может применяться для других заряженных полимерных молекул, расправленных гидродинамическим потоком.

В главе 6 рассматривается задача восстановления реального профиля объекта по его АСМ-изображению, которая возникает из-за артефактов атомно-силовой микроскопии,

например такого, как эффект уширения. В общем виде она является многопараметрической и поэтому её решение достаточно проблематично. В

/

Рис. 12. Реальный профиль объекта типа «бусин на нити» и траектория зонда, формирующая АСМ-профиль. к - высота объекта, <1 - расстояние между центрами глобул, I - высота зазора между глобулами на АСМ-изображении.

работе решается частная проблема восстановления реального профиля объекта типа «бусины на нити» в предположении сферического зонда и эллиптической формы бусин. Данная задача возникла при необходимости более точной оценки геометрических параметров насыщенных комплексов белка р50 с мРНК, исследования которых с помощью АСМ подробно описаны в разделе 3.2.

Задача решалась в предположении сферической формы острия зонда и эллиптической формы глобул. На рис. 12 изображены реальный и полученный с помощью АСМ профили объекта. Для оценки геометрии комплексов типа «бусин на нити» использовался параметр / - высота зазора между глобулами на АСМ-изображении (см. рис. 12). Решение производилось варьированием величины горизонтальной полуоси эллипса а. Параметр / непрерывно изменяется при изменении а, кроме того параметры I и а имеют взаимнооднозначное соответствие при фиксированных параметрах 'п (высота комплекса), d (расстояние между центрами глобул) и R (радиус острия зонда), т.е. каждому значению I соответствует лишь одно значение а. Радиус острия зонда R оценивался по стандартным алгоритмам восстановления профиля зонда по изображению тестового образца, полученному этим кантилевером, и из электронномикроскопических фотографий зонда.

Применительно к комплексам белка р50/мРНК, изображенным на рис. 3.16, получается, что они состоят из эллиптических глобул, практически вплотную примыкающих друг к Другу. В частности, эти глобулы не могут иметь сферическую форму, т.к. в этом случае I было бы в 3-4 раза больше, чем на записанных профилях.

Данная задача, хотя и решалась для конкретного случая, исходила из достаточно общих предпосылок, поэтому результаты ее решения, очевидно, будут полезны и при исследовании других подобных структур.

Выводы

1. С помощью атомно-силовой микроскопии впервые охарактеризованы состоящие из белковых молекул пили (отростки) одноклеточной цианобактерии БупескосузШ 6803: их разновидности, количество, длина, толщина, распределение по поверхности полисахаридной оболочки клетки. Показана связь фототаксиса этой цианобактерии и ее неподвижного мутанта с количеством, длиной и морфологией толстых пилей.

2. Экспериментально показаны особенности адсорбции вируса табачной мозаики (ВТМ) на слюде и на графите, такие как различная степень адсорбции на слюду и графит, корреляция ориентации вирусных частиц на подложке с направлением её кристаллографических осей, укорачивание вирусной частицы, адсорбированной на графит; предложены и экспериментально проверены варианты модификации слюды для увеличения степени адсорбции на неё ВТМ.

3. Показано, что комплексы мРНК с белком р50 - модели матричных рибонуклеопротеидов (мРНП) - имеют структуру «бусин на нити», причем

(¡) в насыщенном комплексе каждая бусина (глобула) состоит из нескольких

молекул белка р50, т.е. имеет место мультимеризация при насыщении; (и) образование насыщенных комплексов происходит в два этапа: 1) мультимеры р50 диссоциируют на мономер для связывания с РНК 2) мультимеры р50 формируются вновь по мере насыщения РНК белком; (Ш) одна глобула в насыщенном комплексе формируется приблизительно на

700 нуклеотадов РНК; (п>) насыщение РНК ВТМ белком р50 сопровождается 4-5-кратной компактизацией РНК.

4. Разработаны методики химической модификации графита, позволяющие адсорбировать на него молекулы ДНК, получены первые СТМ-изображения ДНК на графите. Также показана возможность манипулирования отдельными молекулами ДНК на подложке.

5. Построена модель, объясняющая форму контуров молекул РНК, адсорбированных на гладкой поверхности в условиях гидродинамического потока. Вычислены заряды молекул РНК, адсорбированных на слюду. Данная

модель может применяться для других заряженных линейных полимерных молекул, расправленных потоком.

6. Разработана методика восстановления реального профиля объекта типа «бусины на нити» по его АСМ-изображению в предположении сферического зонда и эллиптической формы бусин.

Список публикаций по теме диссертации

1. E.V. Dubrovin, I.A. Kirik, М.М. Babykin, I.V. Yaminsky. Atomic force microscopy study of pili in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. In "From Cells to Proteins: Imaging Nature across Dimensions " ed. by Evangelista, V.; Barsanti, L.; Passarelli, V.; Gualtieri, P. Springer, NATO Security Through Science Series, Sub-Series B: Physics and Biophysics, v.3, 2005, pp. 154-159.

2. E.B. Дубровин, M.H. Кирикова, B.K. Новиков, Ю.Ф. Дрыгин, И.В. Яминский. Изучение особенностей адгезии вируса табачной мозаики методом атомно-силовой микроскопии // Коллоидный журнал, т. 66, 2004, №6, сс. 750-755.

3. М.А. Skabkin, O.I. Kiselyova, K.G. Chernov, A.V. Sorokin, E.V. Dubrovin, I.V. Yaminsky, V.D. Vasiliev and L.P. Ovchinnikov. Structural organization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1 // Nucleic Acids Research, v. 32, 2004, No. 18, pp. 5621-5635.

4. D.V. Klinov, E.V. Dubrovin, and I.V. Yaminsky. Scanning Probe Microscopy of DNA on Mica and Graphite // AIP Conference Proceedings, v. 696, 2003, pp. 452-456.

5. D.V. Klinov, E.V. Dubrovin, I.V. Yaminsky. Substrate for Scanning Probe Microscopy of DNA: HOPG versus mica // Physics of Low-Dimensional Structures, v. 3-4,2003, pp.119-124.

6. M.O. Gallyamov, E.V. Dubrovin, and I.V. Yaminsky. Micromechanics of Nucleic Acids // Physics of Low-Dimensional Structures, v, 5-6,2002, pp.7-11.

7. E.V. Dubrovin, M.N. Kirikova, V.K. Novikov, Yu.F. Drygin, I.V. Yaminsky. Atomic force microscopy study of tobacco mosaic virus adhesion. Third International Symposium "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures". Abstracts. Kazan, Russia, 20-24 September, 2004, p. 73.

8. Кирикова M.H., Дубровин E.B., Новиков B.K., Яминский И.В., Дрыгин Ю.Ф. Исследование сорбции вируса табачной мозаики на слюде и графите методом атомно-силовой микроскопии. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "ЛОМОНОСОВ-2004" (12-15 апреля 2004 года). Секция "Химия". МГУ им. М.В. Ломоносова, том 1, с.95.

9. D.V. Klinov, E.V. Dubrovin, I.V. Yaminsky. Probe microscopy imaging of DNA on graphite. 12th International Conference on Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques. Book of Abstracts. Eindhoven University of Technology. July 21-25, 2003 Eindhoven, the Netherlands, p. We-Pos-02.

10.A.V. Bolshakova, A.S. Filonov, M.O. Gallyamov, D.Yu. Gavrilko, E.V. Dubrovin, O.I. Kiselyova, A.M. Lomonosov, E.B. Meshkov, I.V. Yaminsky. Open Experimental Internet Practical Studies in Nanoscopy of Polymers. The Third International Conference on Scanning Probe Microscopy of Polymers. (SPMP 2003). Book of Abstracts. 15-18 July 2003. Rolduc Abbey, Conference Center, Kerkrade, the Netherlands, p. 82.

11. D.V. Klinov, E.V. Dubrovin, I.V. Yaminsky. Probe microscopy of DNA on graphite. Scanning Probe Microscopy-2003. Proceedings. Nizhny Novgorod, March 2003, pp. 261-263.

12.Дубровин E.B, Яминсккй И.В. Микромеханика нуклеиновых кислот. Конференция студентов и аспирантов. Тезисы докладов. Дубна, апрель 2002, с.25.

13.М.О. Gallyamov, E.V. Dubrovin, I.V. Yaminsky. Micromechanics of nucleic acids. Scanning Probe Microscopy-2002. Proceedings. Nizhny Novgorod, March 2002, pp. 206-207.

ООП МГУ Заказ 146-100-05

Us 1 7 О 7 3

РНБ Русский фонд

2006-4 11616

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии.

1.1.1. Сканирующая туннельная микроскопия.

1.1.2. Атомно-силовая микроскопия.

1.1.3. Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта.

1.2. Применение СЗМ для исследования биополимерных объектов.

1.2.1. Строение и состав биополимеров.

1.2.2. Биополимеры бактериальных клеток.

Нанесение бактериальных клеток на подложку для АСМ.

АСМ бактерий.

1.2.3. Биополимеры вирусных частиц.

1.2.4. Белки и нуклеиново-белковые комплексы.

1.2.5. Нуклеиновые кислоты.

Экспериментальная часть

2. Применение АСМ для исследования пилей цианобактерий.

2.1.Одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp.

2.2. Материалы и методы.

2.3. Результаты и обсуждение.

2.4. Выводы.

3. АСМ-исследования рибонуклеопротеидов

3.1. Изучение особенностей адсорбции ВТМ на слюду и графит.

3.1.1. Введение.

3.1.2. Материалы и методы.

3.1.3. Результаты и обсуждение.

3.1.4. Выводы.

3.2. Изучение белка р50 и его комплексов с РНК.

• 3.2.2. Материалы и методы.69

3.2.3. Результаты и обсуждение.70

3.2.4. Выводы.75

4. Зондовая микроскопия ДНК.77

4.1. Материалы и методы.77

4.2. Результаты и обсуждение.78

4.3. Выводы.86

Теоретическая часть

5. Микромеханика РНК.87

6. Задача восстановления реального профиля объекта по АСМ-изображению.91

Заключение.94

Выводы.94

Благодарность.96

Библиография.97 Л

Список иллюстраций

1.1. Блок-схема атомно-силового микроскопа.

1.2. Потенциал Леннарда-Джонса (взаимодействие двух атомов).

1.3. Зонд над поверхностью образца.

1.4. Баланс сил, действующих на кантилевер, при прямом (а) и обратном (б) изгибах левера.

1.5. Силовая кривая атомно-силового микроскопа.

1.6. Режимы работы атомно-силовой микроскопии.

1.7. Механизм возникновения артефактов СЗМ. а - эффект уширения, б - эффект двоения изображения.

1.8. Пример данных, иллюстрирующий двоение изображения.

1.9. Химическая структура фрагментов молекул ДНК и РНК.

1.10. Первичная структура белка. Ri,R2,R-3,.Rfi - аминокислотные остатки.

1.11. Схематическое изображение монослоя из алкановых производных на поверхности графита.

2.1. Эксперименты по подвижности клеток Synechocystis 6803.

2.2. Трехмерное АСМ-изображение клеток Synechocystis 6803 (подвижный штамм wtR).

2.3. АСМ-изображения клеток подвижного штамма Synechocystis 6803.

2.4. Гистограмма распределения высот пилей в клетках подвижного wtR штамма Synechocystis 6803.

2.5. АСМ-изображения клеток неподвижного штамма wtM Synechocystis 6803: (а) общий вид одиночной клетки (режим отклонения контактной моды сканирования); (б) толстые и тонкие пили (режим прерывистого контакта, канал «высота»).

3.1. Трехмерное изображение частиц ВТМ, полученное с помощью АСМ.

3.2. Полученные на воздухе АСМ-изображения частиц ВТМ, сорбированных а) на слюду (свтм=1,3 мг/мл) и б) на графит (свтм=0,065 мг/мл). Размер кадра 2.95 мкм

3.3. Фрагмент АСМ-изображения ВТМ на слюде и сечение, иллюстрирующие возможность использования вируса табачной мозаики в качестве эталона для калибровки пьезосканера в вертикальном направлении.

3.4. Гистограмма распределения по длинам частиц ВТМ, сорбированных а) на слюду и б) на графит.

3.5. АСМ-изображение частиц ВТМ на слюде, иллюстрирующее агрегацию частиц бок в бок (горизонтальная стрелка) и стыковку торец в торец (вертикальная стрелка).

3.6. Гистограмма распределения по углам частиц ВТМ, адсорбированных на подложку из графита.

3.7. Гистограмма распределения пар соседних частиц ВТМ, адсорбированных на графит, по углам, образованным между ними.

3.8. Схема, иллюстрирующая фрагмент гексагональной кристаллической решетки высокоориентированного пиролитического графита.

3.9. Последовательные АСМ-изображения ВТМ на графите, полученные в жидкости.

3.10. Гистограмма, показывающая количество вирусных частиц, адсорбированных нединицу площади слюды, модифицированной четырьмя различными химическими соединениями.

3.11. Структурная организация белка р50.

3.12. Возможная модель участия р50 в регуляции трансляции.

3.13. АСМ изображения свободного мультимерного и мономерного белка р50.

3.14. АСМ-изображения ненасыщенного комплекса р50/мРНК на воздухе. Комплексы собраны на (а) глобиновой, (б) 2Luc РНК. Слева показаны типичные изображения, справа - увеличенные отдельные комплексы и сечения, построенные вдоль маркированных линий.

3.15. АСМ изображения насыщенных мРНП комплексов, собранных на (а) глобиновой мРНК, (б) 2Luc мРНК, (в) РНК ВТМ.

3.16. АСМ изображения насыщенных комплексов, сформированных на основе 2Luc РНК при большом увеличении.

4.1. АСМ-изображение молекул ДНК, адсорбированных на модифицированном в парах пентиламина высокоориентированном пиролитическом графите (слева) и сечение (справа).

4.2. АСМ-изображение молекул ДНК, адсорбированных на слюду в присутствии ионов Mg2+ и NH»+ (слева) и сечение (справа).

4.3. Предполагаемый поперечный профиль молекулы ДНК, адсорбированной на подложку из слюды и ВОПГ.

4.4. ВОПГ, а - СТМ-изображение. Ut=70 мВ, It=30 пА; б - схематическое изображение структуры.

4.5. СТМ-изображения монослоя стеариновой кислоты, а - полученное в геле, Ut=0,6 В, It=3 пА; б - нанесенного из паров, Ut=0,72 В, It=3 пА.

4.6. СТМ-изображения монослоя додециламина, а - полученное в геле, Ut=0,5 В, It=20 пА; б - нанесенного из паров, Ut=0,7 В, It=2 пА.

4.7. ACM изображения молекул ДНК на графите, модифицированном в парах октадециламина. Манипулирование проводилось над указанными черной и белой стрелками молекулами.

4.8. СТМ-изображения молекул ДНК на графите, модифицированном (а, б) -октадециламином, (в) - додециламином.

5.1. Молекулы РНК вируса энцефаломиокардита мыши, адсорбированные на модифицированной ВАС слюде.

5.2. Модель молекулы РНК.

5.3. Контуры молекул РНК с разными зарядами. Скорость гидродинамического потока - 5 см/сек.

5.4. Заряд молекулы как функция скорости гидродинамического потока при фиксированном параметре к.

5.5. Заряды молекул (в электронах), вычисленные из модели.

6.1. Реальный профиль объекта типа «бусин на нити» и траектория зонда, формирующая АСМ-профиль.

6.2. Расчетная зависимость параметра / от большой полуоси эллипса а.

Список таблиц

2.1. Средние значения высоты (в нм) толстых и тонких пилей клеток, принадлежащих штаммам wtR и wtM Synechocystis 6803.

3.1. Высоты частиц ВТМ (в нанометрах), адсорбированных на слюду и графит, вычисленные из изображений, которые получены с помощью АСМ на воздухе и в жидкости.

4.1. Вычисленные из АСМ-изображений высота и ширина молекул ДНК (в нм), осаждённых на поверхности слюды и ВОПГ.

4.2. Длины различных фрагментов ДНК (в нм), адсорбированных на слюду и ВОПГ в одинаковых солевых условиях.

Список используемых сокращений

АПС - у-аминопропилтриэтоксисилан

АСМ - атомно-силовая микроскопия

ВОПГ-высокоориентированный пиролитический графит

ВТМ - вирус табачной мозаики

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота мРНК - матричная РНК мРНП - матричные рибонуклеопротеиды

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

РНК - рибонуклеиновая кислота

СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия

СТМ - сканирующая туннельная микроскопия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ЦТАБ - бромид цетилтриметиламмония

CSD - домен холодового шока

Введение

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — относительно новая группа методов исследований свойств объектов различной природы с высоким пространственным разрешением. История СЗМ началась с изобретения в 1981 году сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [1]. Его изобретатели - швейцарские ученые Герхард Бинниг и Хайнрих Рорер - были отмечены Нобелевской премией по физике за 1986 год. Создание в том же году атомно-силового микроскопа [2], использующего в своей основе детектирование обменного взаимодействия атомов, значительно расширило применение зондовой микроскопии, так как на изучаемые образцы перестало накладываться условие их электрической проводимости. Разрешение таких микроскопов достигает доли нанометров, что позволяет наблюдать атомы. Получением изображений не ограничиваются возможности этих приборов. Например, с помощью атомно-силового микроскопа можно изучать взаимодействие двух объектов: измерять силы трения, упругости, адгезии, а также перемещать отдельные молекулы и атомы [3, 4], осаждать и удалять их с какой-либо поверхности.

Зондовая микроскопия помогает решать фундаментальные и прикладные задачи в физике, химии, биологии, медицине. В настоящее время СЗМ имеет более двух десятков модификаций и уже прочно вошла в арсенал физических методов, использующихся при изучении различных биологических объектов, прежде всего биополимеров и биополимерных структур. Общее для всех этих приборов является то, что заострённый зонд как-либо взаимодействует с поверхностью, и детектируется величина этого взаимодействия. При движении зонда относительно поверхности количественная величина взаимодействия меняется, что и позволяет восстанавливать форму поверхности с помощью физических законов и математических алгоритмов. Важными преимуществами этих методов по сравнению с традиционными методами электронной микроскопии являются возможность получения трехмерных изображений с разрешением вплоть до атомного, относительная простота приготовления образцов (например, не требуется контрастирования атомами тяжёлых металлов), отсутствие необходимости создания вакуума во время сканирования, возможность проводить исследование объектов в жидкости, в частности, изучать биологические объекты in vivo и др.

В данной работе представлены результаты исследований с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) двух наиболее важных классов природных биомакромолекул, белков и нуклеиновых кислот, а также комплексов и структур на их основе. Более точно, объектами изучения являлись одноклеточные цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и их пили - белковые отростки, с помощью которых они осуществляют движение к источнику света (или от него); вирус табачной мозаики (ВТМ), представляющий по сути самоорганизованную смесь РНК и белка; белок р50 и матричные рибонуклеопротеиды (мРНП) - структуры, присутствующие в каждой клетке и играющие важнейшую роль в её жизни; молекулы плазмидной ДНК.

Разработка новых способов секвенирования ДНК, создание биологических контейнеров для доставки лекарств в организм, разработка живых векторных вакцин, — вот далеко не полный перечень актуальных на сегодняшний день вопросов, для решения которых необходимы такие исследования. Изучение поведения биополимеров и биополимерных комплексов на поверхности подложки и особенностей их адсорбции востребовано для развития молекулярной электроники и дизайна молекулярных архитектур. Не менее актуально в настоящее время и решение фундаментальных проблем, связанных с изучением механизма трансляции в эукариотических клетках. Актуальность АСМ-исследований цианобактерий и их пилей (отростков) связана с тем, что цианобактерии используются как модельный объект для молекулярно-генетического изучения фотосинтеза растений.

Широкий спектр возможностей, предоставляемый зондовой микроскопией для изучения биополимеров, от получения трехмерных изображений до исследования локальных свойств объекта обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.

Большая часть результатов, получаемая с помощью АСМ, требует глубокого статистического анализа, для некоторых же из них бывает необходима дополнительная интерпретация с помощью компьютерного моделирования. В данной работе вопросами, рассмотренными теоретически, были моделирование молекулы РНК, адсорбированной на подложке, и анализ одного из артефактов АСМ — эффекта уширения. Поскольку моделирование этих процессов производилось исходя из достаточно общих предпосылок, полученные результаты применимы и за пределами данной работы.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы было получение на основе экспериментов по зондовой микроскопии новых данных о биополимерах (нуклеиновых кислотах, белках) и их комплексах, а также разработка методики исследования ДНК с помощью сканирующей туннельной микроскопии (СТМ).

В соответствии с поставленной целью решаются следующие задачи исследования:

1. Охарактеризовать состоящие из белковых молекул пили (отростки) одноклеточной цанобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, выяснить связь их морфологии, количества и геометрических характеристик с наличием фототаксиса.

2. Изучить особенности адгезии и адсорбции одного из представителей самого высокоорганизованного рибонуклеопротеида - вируса табачной мозаики (ВТМ) - на поверхностях слюды и графита, разработать новые методы нанесения частиц ВТМ для исследования в жидкости.

3. Охарактеризовать комплексы белка р50 и матричной РНК (мРНК) при различных массовых соотношениях белка к мРНК.

4. Разработать методику нанесения ДНК на подложку из графита для последующего решения задачи сканирующей туннельной микроскопии ДНК на графите, а также построить модель заряженной линейной полимерной молекулы, адсорбированной на подложку в условиях гидродинамического потока.

Научная новизна диссертации

1. Показана связь различных характеристик пилей с наличием или отсутствием фототаксиса, детально охарактеризованы пили одного из штаммов цианобактерии Synechocystis sp.

2. Впервые показаны некоторые особенности адгезии частиц ВТМ на поверхностях слюды и графита, разработаны способы модификации слюды для АСМ вирусов.

3. Впервые получены данные по морфологии и размеру комплексов белка р50 с мРНК при различных массовых соотношениях белка к мРНК, которые объясняют особенности трансляции в эукариотических клетках.

4. Разработан ряд методик иммобилизации биополимеров на проводящую подложку, позволяющих проводить СТМ-исследования ДНК.

5. Впервые адсорбция расправленной молекулы РНК на подложке интерпретирована с помощью модели заряженного биополимера, помещенного в гидродинамический поток.

Практическая значимость работы

Результаты диссертации позволяют продвинуться в решении следующих задач: создание новых прямых методов секвенирования ДНК на основе СТМ ДНК на графите;

- создание резистентных иммунной системе контейнеров для доставки лекарств на основе искусственных рибонуклеопротеидов;

- определение разновидности штамма цианобактерии по её пилям (дополнительный критерий);

- манипулирование отдельными молекулами ДНК, например, для молекулярного дизайна.

Кроме того, особенности и закономерности адсорбции частиц ВТМ на подложку, без сомнения, могут быть использованы в решении задач молекулярной электроники. Стоит также отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биополимеров, биофизике, молекулярной биологии и медицине.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах:

- Международный биофизический конгресс - 2005, Монпелье, Франция;

- научная школа NATO ASI «Functional Properties of Nanostructured Materials», Созополь, Болгария, 2005; научная школа NATO ASI «From Cells to Proteins: Imaging Nature across Dimensions», Пиза, Италия, 2004;

- Ill Международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, Россия, 2004;

IV Международная конференция «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии», С-Петербург, Россия, 2004;

Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ-2004», «JIOMOHOCOB-2005», Москва, Россия, 2004,2005; научная школа NATO ASI "Soft Condensed Matter Physics in Molecular and Cell Biology", Эдинбург, Великобритания, 2004;

- Международная конференция «STM-2003», Эйндховен, Нидерланды, 2003;

- Международная конференция «SPMP 2003», Керкраде, Нидерланды, 2003;

- Международная конференция «SPM 2003», Нижний Новгород, Россия, 2003;

- Конференция студентов и аспирантов, Дубна, Россия, 2002;

- Международная конференция «SPM 2002», Нижний Новгород, Россия, 2002.

Личный вклад автора

Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии выполнены автором лично. Автор принимал участие в приготовлении образцов бактериальных клеток, вирусов, нуклеиновых кислот, белков и их комплексов совместно с сотрудниками биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, НИИ ФХБ им. Белозерского, Института Белка РАН, ИБХ им. Шемякина и Овчинникова.

Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Выводы

1. С помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) впервые охарактеризованы состоящие из белковых молекул пили (отростки) одноклеточной цианобактерии Synechocystis 6803: их разновидности, количество, длина, толщина, распределение по поверхности полисахаридной оболочки клетки. Показана связь фототаксиса этой цианобактерии и ее неподвижного мутанта с количеством, длиной и морфологией толстых пилей.

2. Экспериментально показаны особенности адсорбции вируса табачной мозаики (ВТМ) на слюде и на графите, такие как различная степень адсорбции на слюду и графит, корреляция ориентации вирусных частиц на подложке с направлением её кристаллографических осей, укорачивание вирусной частицы, адсорбированной на графит; предложены и экспериментально проверены варианты модификации слюды для увеличения степени адсорбции на неё ВТМ.

3. Показано, что комплексы мРНК с белком р50 - модели матричных рибонуклеопротеидов (мРНП) - имеют структуру «бусин на нити», причем i) в насыщенном комплексе каждая бусина (глобула) состоит из нескольких молекул белка р50, т.е. имеет место мультимеризация при насыщении; ii) образование насыщенных комплексов происходит в два этапа: 1) мультимеры р50 диссоциируют на мономер для связывания с РНК 2) мультимеры р50 формируются вновь по мере насыщения РНК белком;

Hi) одна глобула в насыщенном комплексе формируется приблизительно на 700 нуклеотидов РНК; iv) насыщение РНК ВТМ белком р50 сопровождается 4-5-кратной компактизацией РНК.

4. Разработаны методики химической модификации графита, позволяющие адсорбировать на него молекулы ДНК, получены первые СТМ-изображения ДНК на графите. Также показана возможность манипулирования отдельными молекулами ДНК на подложке.

5. Построена модель, объясняющая форму контуров молекул РНК, адсорбированных на гладкой поверхности в условиях гидродинамического потока. Вычислены заряды молекул РНК, адсорбированных на слюду. Данная модель может применяться для других заряженных линейных полимерных молекул, расправленных потоком. Разработана методика восстановления реального профиля объекта типа «бусины на нити» по его АСМ-изображению в предположении сферического зонда и эллиптической формы бусин.

Благодарность

Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю - Игорю Владимировичу Яминскому, а также Ольге Киселёвой и Анастасии Большаковой за постановку задач, обучение различным методикам СЗМ и приготовлению образцов, многочисленные консультации, помощь и поддержку в процессе выполнения этой работы. Большое спасибо Александру Филонову за предоставленное програмное обеспечение и консультации по его работе.

Я также благодарен Д.В. Кпинову за обучение методикам нанесения ДНК.

Особую благодарность хочу выразить группе проф. Сильвии Спеллер и в частности Яну Герритсену, работа с которыми шла приятно и продуктивно.

Кроме того, не могу не отметить благодарностью всех тех, с кем я сотрудничал в процессе выполнения этой работы - проф. Ю.Ф. Дрыгина и Марину Кирикову, Андрея Ломоносова, Максима Скабкина и Константина Чернова, Инессу Кирик и многих других.

Заключение

1. Binning G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy // Surface Science, - 1983, -v. 126,-pp. 236-244.

2. Binning G., Quate C. Atomic force microscope II Phys. Rev.Lett., 1986, - v.56, -pp.930-933.

3. Severin N., Barner J., Kalachev A.A., and Rabe J.P. Manipulation and Overstretching of Genes on Solid Substrates // Nano Lett., 2004, - v.4, - №. 4, -pp.577-579.

4. Eigler D.M., Schweizer E.K. Positioning single atoms with a scanning tunnelling microscope // Nature, 1990, - v.344, - pp.524-526.

5. Saens J.J., Garcia N., Grutter P., Meyer E., Heinzelmann H., Wiezendanger R., Rosenthaler L., Hidber H.R., and Guntherodt H.J. Observation of magnetic forces by the atomic force microscope II J. Appl. Phys., — 1987, v. 63, - pp.4293-4295.

6. Nonnenmacher M., O'Boyle M.P., and Wickramasinghe H.K. Kelvin probe force microscopy II Appl. Phys. Lett., 1991, - v.58, - pp.2921-2923.

7. Simmons J.G. Generalized formula for the electronic tunnel effect between similar electrodes separated by a thin insulating film // J. Appl. Phys, 1963, - v. 34, — pp.1793-1803.

8. Gerritsen J.W., Elemans J.A.A.W., Hulsken B., Travaille A.M., van Kempen H., Rasing Th., and Speller S. STM in a Gel Environment // A IP Conference Proceedings, 2003, - v. 696, - pp.365-368.

9. Guckenberger R., Heim M., Cevc G., Knapp H. F., Wiegrabe W., and Hillebrand A. Scanning tunneling microscopy of insulators and biological specimens based on lateral conductivity of ultrathin water films // Science, — 1994, v. 266, - pp. 15381540.

10. Shi B., Lu X., Zou R., Luo J., Chen D., Liang H., Huang L. Observations of the topography and friction properties of macromolecular thin films at the nanometer scale // Wear, 2001, - v.251, - pp. 1177-1182.

11. Hamaker H.C. HPhysica, 1937, - v.4, - p.1058.

12. Zlatanova J., Lindsay S.M., Leuba S.H. Single Molecule Force Spectroscopy in Biology Using the Atomic Force Microscope // Prog. Biophys. Mol. Biol, — 2000, -v. 74,-pp.37-61.

13. Филонов А.С., Яминский И.В. Зондовая микроскопия: построение и обработка изображений. В кн. «Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров» под ред. И.В. Яминского. М.: Научный мир, 1997.

14. Stemmer A. and Engel A. Imaging biological macromolecules by STM: quantitative interpretation of topographs // Ultramicroscopy, 1990, - v.34, -pp.129-140.

15. Gallyamov M.O, Yaminskii I.V. Quantitative methods for restoration of true topographical properties of objects using the measured AFM-images. 2. The effect of broadening of the AFM-profile // Surface Investigation, 2001, — v. 16, -pp.1135-1141.

16. Arscott P.G., Lee G., Bloomfield V.A. and Evans D.F. Scanning tunneling microscopy of Z-DNA // Nature, 1989, - v.339, - pp.484-486.

17. Clemmer C.R., Beebe T.P. Graphite: A mimic for DNA and other biomolecules in scanning tunneling microscopes studies // Science, — 1991, v.251, - pp.640-642.

18. Большая Советская Энциклопедия, http://www.rubricon.com/bse 1 .asp.

19. Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. Курс лекций. Москва: Книжный Дом Университет, 2002.

20. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of protein complexes. In "Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications" (Methods in Molecular Biology, vol. 242), Ed. by P.C. Braga, D. Ricci. Humana Press, 2004, pp. 217-230.

21. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Microbial Surfaces Investigated Using Atomic Force Microscopy // Biotechnol. progress, — 2004, — v. 20, № 6, -pp. 1615-1622.

22. Wahl R., Raff J., Selenska-Pobell S., Mertig M., Pompe W. A Fast Screening Method for Surface Layers on Gram-Positive Bacteria // Biotechnol. Lett., 2001, - v.23, -pp.1485-90.

23. Kasas S., Fellay B., Cargnello R. Observation of Action of Penicillin on Bacillus subtilis using Atomic Force Microscopy: Technique for the Preparation of Bacteria // Surf. Interface Anal, 1994, - v.21, - pp.400-401.

24. Sokolov I.Y., Firtel M., Henderson G.S. In situ Highresolution Atomic Force Microscope Imaging of Biological Surfaces // J. Vac. Sci. Technol., A, 1996, -v. 14,- pp.674-678.

25. Bolshakova A.V., Vorobyova E.A., Yaminsky I.V. Indication of Living Bacterial Cells in Native Soil and Permafrost // Phys. Low-Dim. Struct., 2003, - v.3/4, -pp. 105-112.

26. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Yu., Lyubchenko Yu.L., Yaminsky I.V. Comparative Studies of Bacteria with Atomic Force Microscopy Operating in Different Modes // Ultramicroscopy, 2001, - v.65, -pp.121-128.

27. Robichorn D., Girard J.-C., Centiempo Y., Cavellier J.-F. Atomic Force Microscopy Imaging of Dried or Living Bacteria // C. R. Acad. Sci., Ser. Ill, -1999, v.322 - pp.687-693.

28. Razatos A., Ong Y.-L., Sharma M.M., Georgiou G. Molecular Determinants of Bacterial Adheasion Monitored by Atomic Force Microscopy // Appl. Biol. Sci., — 1998, v.95, - pp.11059-11064.

29. Camesano T.A., Natan M.J., Logan B.E. Observation of Changes in Bacterial Cell Morphology Using Tapping Mode Atomic Force Microscopy // Langmuir, 2000, - v.16, - pp.4563-4572.

30. Lister T.E., Pinhero P.J. In Vivo Atomic Force Microscopy of Surface Proteins on Deinococcus radiodurans II Langmuir, — 2001, — v. 17, — pp.2624-2628.

31. Muller D.J., Baumeister W., Engel A. Conformational Change of the Hexagonally Packed intermediate Layer of Deinococcus radiodurans Monitored by Atomic Force Microscopy II J. Bacteriol., 1996, - v.178, - pp.3025-3030.

32. Lomonosov A.M., Egorov S.N., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. AFM of Bacterial Cells Subjected to Different Factors // Phys. Low-Dim. Struct., 2003, -v.314,- pp. 125-130.

33. Amro N.A., Kotra L.P., Wadu-Mesthridge K., Bulychev A., Mobashery S., Liu G. High-resolution Atomic Force Microscopy Studies of the Escherichia coli Outer Membrane: Structural Basis for Permeability // Langmuir, 2000, - v.16, -pp.2789-2796.

34. Arnoldi M., Kacher C., Bauerlein E., Radmacher M., Fritz M. Elastic Properties of the Cell Wall of Magnetospirillum Gryphiswaldense Investigated by Atomic Force Microscopy IIAppl. Phys. A, 1997, - v.66, - pp.S613-S618.

35. Ong Y.-L., Razatos A., Georgiou G., Sharma M.M. Adhesion Forces Between E. coli Bacteria and Biomaterial Surfaces // Langmuir, 1999, - v.15, - pp.27192725.

36. Bhaya D., Watanabe N., Ogawa Т., Grossman A.R. The role of an alternate sigma factor in motility and pili formation in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 // Proc Natl Acad Sci USA, 1999, - v.96, - pp.3188-93.

37. Bhaya D., Takahashi A., Grossman A.R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803 // Proc Natl Acad Sci USA, 2001, - v.98, - pp.7540-745.

38. Bhaya D., Bianco N.R., Bryant D., Grossman A. Type IV pilus biogenesis and motility in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 // Mol Microbiol, — 2000, v.37, - №4, - pp.941-51.

39. Kiselyova O.I., Nasikan N.S., Yaminsky I.V., Novikov V.K. AFM imaging of PVX particles and PVX RNA // Phys. Low-Dimen. Struct., 2001, - v.3/4, -pp.167.

40. Britt D.W., Buijs J., Hlady V. Tobacco mosaic virus adsorption on self-assembled and Langmuir-Blodgett monolayers studied by TIRF and SFM II Thin Solid Films, 1998, - v.327-329, - pp.824-828.

41. Drygin Yu.F., Bordunova O.A., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy examination of tobacco mosaic virus and virion RNA II FEBS Letters, -1998, v.425, - pp.217-221.

42. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., and Atabekov J.G. AFM Study of Potato Virus X Disassembly Induced by Movement Protein II J. Mol. Biol., 2003, - v.332, - pp.321-325.

43. Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., Lucas R.W., and McPherson A. Surface Processes in the Crystallization of Turnip Yellow Mosaic Virus Visualized by Atomic Force Microscopy II Journal of Structural Biology, 1999, - v. 127, - pp.35-43.

44. Sophia Hohlbauch. Bibliography of Atomic Force Microscopy In Biological Sciences. Digital Instruments, Veeco Metrology Group Biological Bibliography. http://www.di.com

45. Day J., Kuznetsov Yu.G., Larson S.B., Greenwood A., and McPherson A. Biophysical Studies on the RNA Cores of Satellite Tobacco Mosaic Virus // Biophys. J.,- 2001, v.80, - pp.2364-2371.

46. Stanley W.M. Isolation of a crystalline protein possessing the properties of tobacco-mosaic virus IIScience,— 1935,-v.81, —pp.644-645.

47. Kuznetsov Yu.G., Malkin A.J., Lucas R.W., McPherson A. Atomic force microscopy studies of icosahedral virus crystal growth // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2000, - v. 19, - pp.333-346.

48. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Proteins and membrane-protein complexes // Colloid Journal, 1999, - v.61, - pp. 1-19.

49. Zhang J., Chi Q., Dong S., and Wang E. In situ electrochemical scanning tunneling microscopy investigation of structure for horseradish peroxidase and its electrocatalytic property // Biochem Bioenergetics, — 1996, v.39, - pp.267-274.

50. Chang H., Bard A.J. Observation and characterization by scanning tunneling microscopy of structures generated by cleaving highly oriented pyrolytic graphite // Langmuir, 1991, - 7, - pp. 1143-1153.

51. Bustamante C., Vesenka J., Tang C.L., Rees W., Guthold M., and Keller R. Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy // Biochemistry, 1992, - v.31, - pp.22-26.

52. Onishi S., Hara M., Furuno T., Okada T., Sasabe H. Direct visualization of polypeptide shell of ferritin molecule by atomic force microscopy II Biophys. Journal, 1993, - v.65, - pp.573-577.

53. Shlyakhtenko L.S., Potaman V.N., Sinden R.N. and Lyubchenko Yu.L. Structure and dynamics of supercoil-stabilized DNA cruciforms // Journal of Molecular Biology,- 1998, v.280, - pp.61-72.

54. Mazeran P.-E., Loubet J.-L., Martelet C., Theretz A. Under buffer SFM observation of immunospecies adsorbed on a ciano grafted silicon substrate // Ultramicroscopy, 1995, - v.60, - pp.33-40.

55. Andersen J.E.T., Moller P., Pedersen M.V. , Ulstrup J. Cytochrome c dynamics at gold and glassy carbon surfaces monitored by in situ scanning tunnel microscopy // Surface Science, 1995, - v.325, - 193-205.

56. Weisenhorn A.L., Drake B., Prater C.B., Gould S.A.C., Hansma P.K., Ohnesorge F., et al. Immobilized proteins in buffer solution at molecular resolution by atomic force microscopy // Biophys. J., 1990, - v.58, - pp.1251-1258.

57. Zhang J., Chi Q., Dong S., and Wang E. STM of folded and unfolded haemoglobin molecules electrochemically deposited on highly oriented pyrolytic graphite // J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1995, - v.91, -pp.1471-1475.

58. Kim D.T., Blanch H.W., and Radke C.J. Direct Imaging of Lysozyme Adsorption onto Mica by Atomic Force Microscopy // Langmuir, 2002, - \.18, - pp.58415850.

59. Ta T.C., Sykes M.T., McDermott M.T. Real-Time Observation of Plasma Protein Film Formation on Well-Defined Surfaces with Scanning Force Microscopy H Langmuir, 1998, - v.14, - pp.2435-2443.

60. McMaster T.J., Miles M.J., Shewry P.R., and Tatham A.S. In Situ Surface Adsorption of the Protein C Hordein Using Atomic Force Microscopy // Langmuir, 2000, -v.l6,- pp.1463 - 1468.

61. Cullen D.C., Lowe C.R. AFM Studies of Protein Adsorption: 1. Time-Resolved Protein Adsorption to Highly Oriented Pyrolytic Graphite // J. Colloid Interface Sei. ,-1994,- v.166,- pp. 102-108.

62. Guryev O.L., Dubrovsky T., Chernogolov A., Dubrovskaya S., Usanov S., Nicolini C. Orientation of cytochrome P450scc in Langmuir-Blodgett monolayers // Langmuir, 1997, - v. 13, -pp.299-304.

63. Waner M.J., Gilchrist M., Schindler M., Dantus M. Imaging the molecular dimensions and oligomerization of proteins at liquid/solid interfaces // J. Phys.Chem. B., 1998, - v.102,-pp.1649-1657.

64. Nettikadan S., Tokumasu F., and Takeyasu K. Quantitative Analysis of the Transcription Factor AP2 Binding to DNA by Atomic Force Microscopy // Biochemical and biophysical research communications, 1996, - v.226, - pp.645649.

65. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Yu., Dorokhov Yu.L. and Atabekov J.G. Visualization of TMV movement protein-RNA complexes formed in vitro by atomic force microscopy // Journal of general virology, 2001, - v.82, -pp. 1503-1508.

66. Smith B.L., Gallie D.R., Le H.and Hansma P.K. Visualization of Poly(A)-Binding Protein Complex Formation with Poly(A) RNA Using Atomic Force Microscopy // Journal of structural Biology, 1997, - v. 119, - pp. 109-117.

67. Preobrazhensky A.A. and Spirin A.S. (1978) Informosomes and their protein components: the present state of knowledge. In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Acad Press Inc New York, San Francisco, London, v.21, -pp. 1-38.

68. Collins F.S., Green E.D., Guttmacher A.E. and Guyer M.S. A vision for the future of genomics research // Nature, 2003, - v.422, - pp.835-847.

69. Driscoll R.J., Youngquist M.G. & Baldeschwieler J.D. Atomic-scale imaging of DNA using scanning tunneling microscopy // Nature, 1990, - v.346, - pp.294296.

70. Dunlap D. and Bustamante C. Images of single-stranded nucleic acids by scanning tunneling microscopy // Nature, 1989, - v.342, - pp.204-206.

71. Keller D., Bustamante C., and Keller R.W. Imaging of single uncoated DNA molecules by scanning tunneling microscopy // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, - v.86, - pp.5356-5360.

72. Lindsay S.M., Thundat T., Nagahara L.t Knipping U., Rill R.L. Images of the DNA double helix in water // Science, 1989, - v.244, - pp. 1063-1064.

73. Travalgini G., Rohrer H., Amrein M. and Gross H. Scanning tunneling microscopy on biological matter II Surf. Sei.,- 1987,-v.181,-pp.380-390.

74. Hansma H.G., Sinscheimer R.L., Li M.Q., Hansma P.K. Atomic force microscopy of single- and double-stranded DNA // Nucleic. Acids Res., 1992, - v.20, -pp.3585-3590.

75. Hansma H.G., Sinsheimer R.L., Groppe J., Bruice T.C., Elings V., Gurley G., Bezanilla M., Mastrangelo I.A., Hough P.V.C., Hansma P.K. Recent advances in atomic force microscopy of DNA // Scanning, 1993, - v. 15, - pp.296-299.

76. Pope L.H., Davies M.C., Roberts C.J., Tendler S.J.B. and Williams P.M. DNA analysis with scanning probe microscopy // Analytical Communications, 1998, -v.35, -pp.5H-7H.

77. Hamai С., Tanaka H., and Kawaia T. Surface structure characterization of DNA oligomer on Cu(lll) surface using low temperature scanning tunneling microscopy II J. Vac. Sci. Technol. В,- 1999,-v.7 7,-pp. 1313-1316.

78. Muller D.J., Amrein M.and Engel A. Adsorption of biological molecules to a solid support for scanning probe microscopy // Journal of Structural Biology, 1997, -v,119,-pp.l72-188.

79. Hansma H.G. and Laney D.E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy // Biophysical Journal, 1996, - v.70, -pp.1933-1939.

80. Rivetti C., Guthold M. and Bustamante C. Scanning force microscopy of DNA deposited onto mica: equilibration versus kinetic trapping studied by statistical polymer chain analysis // J. Mol. Biol., 1996, - v.264, - pp.919-932.

81. Tanigawa M., Okada T. Atomic force microscopy of supercoiled DNA structure on mica II Analytica Chimica Acta, -1998, v.365, - pp.19-25.

82. Li M.Q. Scanning probe microscopy (STM/AJFM) and applications in biology // Appl. Phys. A., 1999, - v.68, - pp.255-258.

83. Schaper A., Pietrasanta L.I. and Jovin T.M. Scanning force microscopy of circular and linear plasmid DNA spread on mica with a quaternary ammonium salt // Nucleic Acids Research, 1993, - v.21, - pp.6004-6009.

84. Schaper A., Starink J.P.P., Jovin T.M. The scanning force microscopy of DNA in air and in n-propanol using new spreading agents // FEBS Letters, 1994, - v.355, -pp.91-95.

85. Hansma H.G., Laney D.E., Bezanilla M., Sinsheirner R.L., and Hansma P.K. Application for atomic force microscopy of DNA // Biophysical Journal, 1995, -v.68,-pp. 1672-1677.

86. Dunlap D. Scanning tunneling microscopy of DNA // IEEE Engineering in Medicine and Biology, 1996, - January/February, - pp.46-50.

87. Химическая энциклопедия под редакцией И.Л.Кнунянца. Научное издательство «Большаяроссийская энциклопедия», 1992. Т. 3. Сс. 297-301.

88. Klinov D.V., Dubrovin E.V., and Yaminsky I.V. Scanning Probe Microscopy of DNA on Mica and Graphite // AIP Conference Proceedings, 2003. - v. 696, -pp.452-456.

89. Bustamante C., Bryant Z., Smith S.B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics // Nature, 2003, - \.421, - pp.423-427.

90. Rief M., Oesterhelt B., Heymann B., Gaub H.E. Single Molecule Force Spectroscopy on Polysaccharides by Atomic Force Microscopy // Science, 1997, -\.275, -pp. 1295-1297.

91. Bensimon A., Simon A., Chiffaudel A., Croquette V., Heslot F., Bensimon D. Alignment and Sensitive Detection of DNA by a Moving Interface // Science, — 1994, v.265, - pp.2096-2098.

92. Dubrovin E.V., Staritsyn S.N., Yakovenko S.A., Yaminsky I.V. Self-organized structures of polyA molecules on the stearic acid LB monolayer // European Biophysics Journal, — 2005, v.34, -pp.669.

93. Hu J., Zhang Y., Gao H., Li H., Hartmann U. Artificial DNA Patterns by Mechanical Nanomanipulation // Nano Lett. , — 2002, v.2, - pp.55-57.

94. Darzins A., Russell M.A. Molecular genetic analysis of type-4 pilus biogenesis and twitching motility using Pseudomonas aeruginosa as a model system a review // Gene, - 1997, - v. 192, -pp. 109-15.

95. Ubbink J., Schar-Zammaretti P. Probing bacterial interactions: integrated approaches combining atomic force microscopy, electron microscopy and biophysical techniques // Micron (2005), in press.

96. Wall D., Kaiser D. Type IV pili and cell motility // Mo! Microbiol, 1999, - v.32, -pp. 1-10.

97. Lauer P., Albertson N.H., Koomey M. Conservation of genes encoding components of a type IV pilus assembly-two-step protein export pathway in Neisseria gonorrhoeae // Mol Microbiol, — 1993, v.8, — pp.357-68.

98. Filonov A.S., Gavrilko D.Yu., Yaminsky I.V. "FemtoScan" Software for Three-Dimensional Image Processing. Moscow: Advanced Technologies Center, 2001.

99. Rippka R., Deruelles D.E., Waterbury J.B., Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria // J Gen Microbiol, — 1979, -v. 111, — pp.1—61.116.117.118.119.120,121.122.123.124,125,126,127128

100. The Universal Virus Database. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/ Milner J. J. Tobacco mosaic virus: the first century // Trends in microbiology, -1998, v.6, - № 12, - pp.466-467.

101. Zaitlin M. The Life of a Virus: Tobacco Mosaic Virus as an Experimental Model, 1930-1965 II Endeavour, 2002, - v.26, - № 2, - pp.76.

102. Maeda H. An Atomic Force Microscopy Study for the Assembly Structures of Tobacco Mosaic Virus and Their Size Evaluation // Langmuir, 1997, - v. 13, -pp.4150-4161.

103. Spirin A.S., Belitsina N.V. and Lerman M.I. Use of formaldehyde fixation for studies of ribonucleoprotein particles by caesium chloride density-gradient centrifugation // J Mol Biol, 1965, - v. 14, - pp.611-615.

104. Ovchinnikov L.P., Voronina A.S., Stepanov A.S., Belitsina N.V. and Spirin A.S. Informosome-like complexes were formed by RNA adding to animal cell homogenates // Mol Biol. (USSR), 1968, - v.2, - pp.752-763.

105. Baltimore D. and Huang A.S. Interaction of HeLa cell proteins with RNA // J Mol Biol., 1970, - v.47, - pp.263-273.

106. Spirin A.S. The second Sir Hans Krebs Lecture. Informosomes // Eur JBiochem, — 1969, v.10, — pp.20-35.

107. Huez G., Burny A., Marbaix G. and Lebleu B. Release of messenger RNA from rabbit reticulocyte polyribosomes at low concentration of divalent cations // Biochim Biophys Acta, 1967, - v. 145, - pp.629-636.

108. Belitsina N.V., Ovchinnikov L.P., Spirin A.S., Gendon Y.Z. and Chernos V.I. The informosomes of HeLe cells infected by smallpoxvaccine virus // Mol. Biol. (USSR), 1968, - v.2, - pp.727-735.

109. Henshaw E.C. Messenger RNA in rat liver polyribosomes: evidence that it exists as ribonucleoprotein particles IIJ Mol Biol, 1968, - v.36, - pp.401-411.

110. Kafatos F.C. and Reich J. Stability of differentiation-specific and nonspecific messenger RNA in insect cells // Proc Natl Acad Sci USA, 1968, - v.60, -pp. 1458-1465.

111. Perry R.P. and Kelley D.E. Messenger RNA-protein complexes and newly synthesized ribosomal subunits: analysis of free particles and components of polyribosomes IIJ Mol Biol, 1968, - v.35, - pp.37-59.

112. Spohr G., Kayibanda B. and Scherrer K. Polyribosome-bound and free-cytoplasmic-hemoglobin-messenger RNA in differentiating avian erythroblasts // Eur J Biochem, 1972, - v.31, - pp. 194-208.

113. Cartouzou G., Attali J.C. and Lissitzky S. Messenger ribonucleic acids of the thyroid gland. I. Rapidly-labelled RNA of nuclei and polysomes // Eur J Biochem, 1968,-v.4,-pp.41-54.

114. Burny A., Huez G., Marbaix G. and Chantrenne H. On a messenger ribonucleoprotein complex from rabbit reticulocytes // Biochim Biophys Acta, -1969, v. 190, - pp.228-231.

115. Spirin A.S. Messenger ribonucleoproteins (informosomes) and RNA-binding proteins // Mol Biol Rep, 1979, - v.5, - pp.53-57.

116. Morel C., Kayibanda B. and Scherrer K. Proteins associated with globin messenger RNA in avian erythroblasts: Isolation and comparison with the proteins bound to nuclear messenger-likie RNA IIFEBSLett, 1971, - v. 18, - pp.84-88.

117. Blobel G. Protein tightly bound to globin mRNA // Biochem Biophys Res Commun, 1972,-v.47,-pp.88-95.

118. Dreyfuss G. Structure and function of nuclear and cytoplasmic ribonucleoprotein particles 11 Annu Rev Cell Biol, 1986, - v.2, - pp.459-498.

119. Vincent A., Goldenberg S. and Scherrer K. Comparisons of proteins associated with duck-globin mRNA and its polyadenylated segment in polyribosomal and repressed free messenger ribonucleoprotein complexes // Eur J Biochem, 1981, — v.l 14,-pp. 179-193.

120. Minich W.B. and Ovchinnikov L.P. Role of cytoplasmic mRNP proteins in translation // Biochimie, 1992, - v.74, - pp.477-483.

121. Murray M.T., Schiller D.L. and Franke W.W. Sequence analysis of cytoplasmic mRNA-binding proteins of Xenopus oocytes identifies a family of RNA-binding proteins II Proc Natl Acad Sci USA, 1992, - v.89, -pp.11-15.

122. Lindberg U. and Sundquist B. Isolation of messenger ribonucleoproteins from mammalian cells // J Mol Biol, 1974, - v.86, - pp.451 -468.

123. Jain S.K., Pluskal M.G. and Sarkar S. Thermal chromatography of eukaryotic messenger ribonucleoprotein particles on oligo (dT)-cellulose. Evidence for common mRNA-associated proteins in various cell types // FEBS Lett, — 1979, — v.97, pp.84-90.

124. Minich W.B., Maidebura I.P. and Ovchinnikov L.P. Purification and characterization of the major 50-kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes // Eur J Biochem, 1993, - v.212, - pp.633-638.

125. Ruzanov P.V., Evdokimova V.M., Korneeva N.L., Hershey J.W. and Ovchinnikov L.P. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments // J Cell Sci, 1999, - v.l 12 , - pp.34873496.

126. Tafiiri S.R. and Wolffe A.P. DNA binding, multimerization, and transcription stimulation by the Xenopus Y box proteins in vitro // New Biol, 1992, - v.4, -pp.349-359.

127. Kloks C.P., Spronk C.A., Lasonder E., Hoffmann A., Vuister G.W., Grzesiek S. and Hilbers C.W. The solution structure and DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein YB-1 // J Mol Biol, 2002, - v.316, -pp.317-326.

128. Ladomery M. and Sommerville J. Binding of Y-box proteins to RNA: involvement of different protein domains // Nucleic Acids Res, 1994, - v.22, - pp.5582-5589.

129. Bouvet P., Matsumoto K. and Wolffe A.P. Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins. An essential role for the cold shock domain // J Biol Chem, 1995, - v.270, - pp.28297-28303.

130. Dreyfuss G., Matunis M.J., Pinol-Roma S. and Burd C.G. hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA // Annu Rev Biochem, 1993, - v.62, - pp.289-321.

131. Murray, M.T. Nucleic acid-binding properties of the Xenopus oocyte Y box protein mRNP3+4 // Biochemistry, — 1994, v.33, - pp.13910-13917.

132. Safak M., Gallia G.L. and Khalili K. Reciprocal interaction between two cellular proteins, Puralpha and YB-1, modulates transcriptional activity of JCVCY in glial cells // Mol Cell Biol, 1999, - v. 19, -pp.2712-2723.

133. Manival X., Ghisolfi-Nieto L., Joseph G., Bouvet P. and Erard M. RNA-binding strategies common to cold-shock domain- and RNA recognition motif-containing proteins // Nucleic Acids Res, 2001, - v.29, - pp.2223-2233.

134. Marello K., LaRovere J. and Sommerville J. Binding of Xenopus oocyte masking proteins to mRNA sequences II Nucleic Acids Res, — 1992, v.20, - pp.5593-5600.

135. Giorgini F., Davies H.G. and Braun R.E. MSY2 and MSY4 bind a conserved sequence in the 3' untranslated region of protamine 1 mRNA in vitro and in vivo // Mol Cell Biol, 2001, - v.21, - pp.7010-7019.

136. Skabkina O.V., Skabkin M.A., Popova N.V., Lyabin D.N., Penalva L.O. and Ovchinnikov L.P. Poly(A)-binding protein positively affects YB-1 mRNA translation through specific interaction with YB-1 mRNA IIJ Biol Chem, 2003, -v.278,-pp.18191-18198.

137. Yu J., Hecht N.B. and Schultz R.M. RNA-binding properties and translation repression in vitro by germ cell-specific MSY2 protein // Biol Reprod, — 2002, -v.67, -pp.1093-1098.

138. Sommerville J. and Ladomery M. Masking of mRNA by Y-box proteins // Faseb J, 1996,-v. 10, -pp.435-443.

139. Graumann P.L. and Marahiel M.A. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain // Trends Biochem Sci, 1998, - v.23, - pp.286-290.

140. Jiang W., Hou Y. and Inouye M. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone IIJ Biol Chem, 1997, - v.272, - pp. 196202.

141. Evdokimova V.M. and Ovchinnikov L.P. Translational regulation by Y-box transcription factor: involvement of the major mRNA-associated protein, p50 // Int JBiochem CellBiol,- 1999,-v.31,-pp.l39-149.

142. Lyubchenko Y.L., Oden P.I., Lampner D., Lindsay S.M. and Dunker K.A. Atomic force microscopy of DNA and bacteriophage in air, water and propanol: the role of adhesion forces // Nucleic Acids Res., 1993, - v.21, - pp.1117-1123.

143. Kick D., Barrett P., Cummings A. and Sommerville J. Phosphorylation of a 60 kDa polypeptide from Xenopus oocytes blocks messenger RNA translation // Nucleic Acids Res., 1987, - v.15, - pp.4099-4109.

144. Matsumoto K., Tanaka K.J., Aoki K., Sameshima M. and Tsujimoto M. Visualization of the reconstituted FRGY2-mRNA complexes by electron microscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, - v.306, - pp.53-58.

145. Бухараев А.А., Овчинников Д.В., Бухараева A.A. Диагностика поверхности с помощью сканирующей силовой микроскопии // Заводская лаборатория, -1997, №5,-сс. 10-27.

146. Галлямов М.О. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот и тонких органических пленок. Диссертация . канд. физ.-мат. наук, МГУ, 1999-227с.

147. Garcia V.J., Martinez L., Briceno-Valero J.M., and Schilling C.H. Dimensional metrology of nanometric spherical particles using AFM: II, application of model— tapping mode // Probe Microscopy,—1998, —v. 1,— №2,— pp. 117-125.1. As