Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот и тонких органических пленок тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 53.087.22

Галлямов Марат Олегович

СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ТОНКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ПЛЕНОК

Специальность 01.04.07 — «Физика твердого тела»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва — 1999 г.

Работа выполнена на кафедре физики колебаний физического факультета Московского государственного университета им.М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

— доктор физико-математических наук, профессор Василий Васильевич Потемкин

— доктор физико-математических наук Игорь Владимирович Яминский Официальные оппоненты:

— доктор физико-математический наук, профессор Геннадий Семенович Плотников (Физический факультет МГУ)

— доктор физико-математических наук, профессор Александр Леонидович Суворов (Институт теоретической и экспериментальной физики, Москва)

Ведущая организация:

— Центр естественно научных исследований института общей физики РАН (Москва)

Защита состоится 17 июня 1999 г. в часов на заседании Диссер-

тационного Совета К053.05.19 в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу:

119899 Москва, Воробьевы горы, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, физический факультет, ауд. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ. Автореферат разослан « » мая 1999 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета K053.05.19 кандидат физ.-мат. наук

И. А. Никанорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы методы сканирующей зондовой микроскопии позволили достичь уникальных научных результатов в различных областях физики, химии и биологии. Новые экспериментальные возможности данного направления — неразрушающий характер исследований, высокое пространственное разрешение и возможность проведения экспериментов в жидких средах — делают особенно перспективным применение СЗМ1 (в частности, атомно-силовой микроскопии) для изучения структуры и свойств биологических и органических материалов. В то же время СЗМ-исследование этих объектов остается более сложной задачей в сравнении с аналогичными исследованиями поверхностей твердых (кристаллических) тел. Действительно, прошло более десяти лет с момента возникновения зондовой микроскопии (в 1981г.), прежде чем в 1992 г. была убедительно продемонстрирована адекватность этого метода для исследований биополимеров на примере АСМ2-визуализации молекулы ДНК3. За эти годы возникло понимание, что определяющей задачей успешности подобных исследований, требующей экспериментального решения в каждом конкретном случае, является иммобилизация биологических и органических структур на поверхностях твердых подложек в таком состоянии, чтобы было возможным исследовать их структурные особенности.

Весьма важным для адекватного применения СЗМ в широкомасштабных научных исследованиях является отслеживание и систематизация возможных механизмов возникновения артефактов, т.е. аппаратных эффектов, приводящих к наблюдению ложных или искаженных свойств исследуемого объекта.

Цель и задачи работы. Целью диссертации являлась разработка методов СЗМ-исследования нуклеиновых кислот и их комплексов, что и определило основные задачи:

разработка алгоритмов определения реальной геометрии объекта из анализа экспериментально измеренных параметров его АСМ-изображения (учет артефактов);

определение адекватных методик иммобилизации молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с белками и поверхностно-активными веществами в различных экспериментальных условиях;

отработка методов контролируемой модификации свойств подложки нанесением тонких органических пленок; исследование влияния природы подложки и процедуры формирования пленок на структуру покрытия.

'СЗМ — сканирующая зондовая микроскопия

2АСМ — атомно-силовая микроскопия

3ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

Материалы и методы. АСМ-исследования проводили в режимах постоянного или прерывистого4 контактов на приборе «Nanoscope-IIIa» (Digital Instruments, США) с использованием коммерческих Si или S^N кантилеверов (Nanoprobe, Digital Instruments, США). Эксперименты в жидких средах проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США). В качестве подложек использовали слюду (мусковит) или высокоориентированный пиролитический графит (пирографит): как поверхности свежего скола, так и модифицированные обработкой катионными ПАВ5, катионами металлов, аминопропилтриэтоксисила-ном или нанесением тонкопленочного органического покрытия. Обработку и построение АСМ-изображений проводили при помощи программного обеспечения «Nanoscope-IIIa» (Digital Instruments, США) и «Фемтоскан-001» (Центр перспективных технологий, Россия).

При приготовлении всех препаратов использовали бидистиллированную де-ионизованную воду, контроль чистоты воды проводили методом АСМ. При исследованиях нуклеиновых кислот и их комплексов на воздухе каплю препарата наносили на поверхность подложки, экспонировали, промывали и высушивали в естественной атмосфере. При исследовании в жидких средах препарат вводили в жидкостную ячейку прибора и исследовали структуры, адсорбировавшиеся из раствора на поверхность подложки.

При приготовлении пленок Ленгмюра-Блоджетт использовали автоматизированную ЛБ6 ванну, при этом формировали тонкопленочные покрытия как вертикальным методом ЛБ, так и методом горизонтального осаждения; давление выделения 7г поддерживали на уровне 20-40мН/м. При АСМ-анализе параметров молекулярной упаковки тонких пленок специальное внимание уделили исключению искажающего влияния температурного дрейфа.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны количественные методики описания двух искажающих эффектов АСМ: уширения и занижения профиля изображений отдельных микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Предложен простой в реализации алгоритм численного решения, позволяющий восстановить их истинные размеры. Проанализирован механизм достижения «атомного» разрешения в АСМ в свете результатов теории контактных деформаций. На основе соотношений Герца этой теории разработана методика определения модуля упругости микрообъектов, иммобилизованных на подложке, с использованием АСМ.

Апробирована методика приготовления образцов для АСМ-исследования молекул однонитевой РНК7 и их взаимодействия с белками. Применение данной

4TappingModeTM

5ПАВ — поверхностно-активные вещества

6ЛБ — Ленгмюра-Блоджетт

7РНК — рибонуклеиновая кислота

методики позволило впервые методом АСМ визуализировать стадии процесса высвобождения молекулы РНК из белковой оболочки частиц ВТМ8. При этом, в отличие от исследований электронной микроскопии, методика не включает процесс какого-либо дополнительного контрастирования молекул РНК (комплексоо-образования с белковой пленкой, запыления и т.п.). Проведение подобных АСМ-исследований в условиях близких нативным может дать вклад в понимание механизмов процесса размножения вирусов.

Динамика процессов компактизации/декомпактизации молекул высокомолекулярной ДНК Т4 впервые исследована методом АСМ непосредственно в водно-спиртовой смеси (при контролируемом изменении концентрации изопропанола). В сравнении с результатами флуоресцентной микроскопии удалось достичь существенно более высокого пространственного разрешения, что позволило визуализировать тороидальные образования, сформированные отдельными витками частично компактизованных молекул. По результатам наблюдений и анализа геометрии компактной глобулы предложена модель компактизации ДНК. Разработанный подход может позволить исследовать системы, моделирующие транспорт генетического материала внутрь живых клеток.

В экспериментах по АСМ-визуализации структуры пленок ЛБ показано преимущество метода горизонтального осаждения монослоев на подложку. С помощью АСМ анализировали влияние подложки на молекулярную упаковку тонких пленок. Проведение подобных исследований может позволить прояснить основные механизмы, определяющие формирование структуры пленки.

По разработкам диссертации поставлена задача спец. практикума кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ «Сканирующая зондо-вая микроскопия нуклеиновых кислот».

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены: на международных конференциях: 1-й и 2-й по химии высокоорганизованных веществ и научным основам нанотехнологии (Санкт-Петербург, июнь 1996 и 1998 гг.), 4-й и 5-й («NANO-4» и «-5») по наноразмерной науке и технологии (Пекин, Китай, сентябрь 1996 и Бирмингем, Великобритания, август 1998), «Фундаментальные проблемы науки о полимерах (к 90-летию академика В. А. Каргина)» (Москва, Россия, январь 1997), «Nanomeeting-97» и «-99» (Минск, Беларусь, май 1997 и 1999), 9-й по сканирующей туннельной микроскопии, спектроскопии и близким технологиям (Гамбург, Германия, июль 1997), пользователей NanoScope 1997 года (Санта-Барбара, США, август 1997); на международных симпозиумах: 7-м ежегодном «Фотоиндуцированный зарядовый перенос: реакции в живой материи» (Рочестер, США, июнь 1996), по коллоидной науке и науке о полимерах «Формирование и динамика самоорганизованных структур в растворах полимеров

8ВТМ — вирус табачной мозаики

и поверхностно-активных веществ — последние достижения» (Нагойа, Япония, октябрь 1996), 43-м национальном американского вакуумного общ-ва «Программа наноразмерной науки и технологии» (Филадельфия, США, октябрь 1996); на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, Россия, май 1998), на всероссийских рабочих совещаниях «Зондовая микроскопия-97», «-98» и «-99» (Нижний Новгород, Россия, март 1997, 1998 и 1999 гг.); на 2-м и 3-м Белорусских семинарах по СЗМ (Минск, Беларусь, май 1997 и Гродно, Беларусь, октябрь 1998), на Школе по химии и физике полимеров (Тверь, Россия, декабрь 1998).

По результатам работы опубликовано 6 статей и 20 тезисов и рефератов докладов, сделанных на конференциях. В список литературы, представленный в автореферате, вошли статьи по теме диссертации, а также рефераты докладов, материалы которых не нашли полного отражения в опубликованных статьях.

Личный вклад автора. Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии, разработка и применение теоретических моделей для интерпретации и анализа экспериментальных данных выполнены автором лично. Автор принимал участие в совместной работе с научными группами Химического факультета МГУ по приготовлению образцов для исследований.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, общего обзора литературы, теоретической и экспериментальной части, выводов, библиографии (132 наименования) и приложения. Теоретическая часть состоит из одной, а экспериментальная из трех глав; каждая глава содержит краткий литературный обзор по конкретной теме исследования. Работа изложена на 227 стр. (с приложением), содержит 54 рисунка и 9 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Основные принципы СЗМ

В первой главе дан аналитический обзор основных методов и способов измерений зондовой микроскопии, ее возможностей и ограничений. Проанализировано место СЗМ в ряду других физических методов исследования поверхности, рассмотрены общие подходы к препарированию образцов нуклеиновых кислот для СЗМ-исследований.

Глава 2. Анализ искажающих эффектов АСМ

Результатом работы АСМ является АСМ-изображение: профиль перемещения зонда в процессе сканирования при фиксации системой обратной связи постоянного силового взаимодействия зонда и образца. АСМ-изображения могут неадекватно отображать реальную топографию исследуемой поверхности (говорят о наблюдении артефактов). В работе предложены количественные описания двух основных артефактов АСМ, проявляющихся при исследовании объектов, адсорбированных

на поверхность твердой подложки — эффектов уширения профиля и занижения высот их АСМ-изображений.

Контактные деформации зонда и образца

При сканировании зонд воздействует на образец с силой в единицы-десятки наноньютонов, что, в связи с малым радиусом кривизны кончика зонда (около 10 нм), приводит к значительному контактному давлению1, которое должно вызывать контактные деформации исследуемого объекта и приводить к занижению высоты его АСМ-изображения. Величина деформации контактирующих тел определяется известными соотношениями контактной задачи Герца2, которые показывают, что формой области контакта двух тел, сдавливаемых силой Р, является эллипс с полуосями а и Ь, причем величина сближения деформируемых тел может быть выражена через , , , упругий параметр области контакта 3, а также главные значения суммарного тензора кривизны контактирующих поверхностей — и , которые определяются геометрией контакта4.

Контакт сферического зонда и цилиндрического образца. Модель цилиндрического образца находит применение при анализе деформаций микрочастиц цилиндрической формы (вирусных частиц, линейных макромолекул и пр.). Однако в этом случае5 соотношения Герца, включающие систему нелинейных уравнений с неявными зависимостями от искомых параметров, напрямую не упрощаются. Поэтому реализовали общее численное решение, сведя исходные соотношения к независимым уравнениям относительно одного неизвестного.

Для двух частных случаев удалось получить аналитические формулы, выражающие искомые параметры явно:

а) Если Е06Р < Е30нд, то главные значения суммарного тензора кривизны различаются: А > В. Тогда а < Ь и, если, а2 <С Ь2, то можно показать, что:

где безразмерный параметр С (зависящий от а/Ь) для многих задач лежит в диапазоне от 1 до 3, и с достаточной точностью можно воспользоваться оценкой. б) Если Е0еР Е30нд, то А ~ В, тогда а ~ Ь и можно показать:

1по нашим оценкам: до 1 ГПа и более

2см., например, Л.Д.Ландау, Е. М. Лифшиц. Теория упругости. — М.: Наука, 1987 = 3/4 [(1 - т2)/Е + (1 - а'2)/Е'] , здесь Я, Я', <г но7 — модули Юнга и Пуассона материалов зонда и образца

4для контакта сферы радиуса Н30нз и боковой поверхности цилиндра радиуса Н0$р они выражаются: А = 1/2 (Х/Н^нд + 1/-^), В = 1/2ЯМн<)

5в отличие от известного случая сферической геометрии контактирующих тел

(1)

(2)

что имеет структуру, сходную с (1). В обоих случаях оказалось возможным получить формулы и для параметров эллиптической области контакта а и Ь, что позволяет определить контактное давление.

Результаты расчетов предсказывают тем большую величину относительных деформаций объектов, чем меньше их радиус кривизны, что подтверждается экспериментом. С целью экспериментальной проверки закона к ~ (см. (1), (2)) мы провели исследования зависимости деформации частиц ВТМ6 от силы воздействия зонда и обнаружили хорошее совпадение эксперимента с результатами, рассчитанными по разработанному подходу, см. рис. 1. Анализ экспериментальной зависимости позволил определить модуль упругости отдельной вирусной частицы (£~3^4ГПа).

Рис. 1. Экспериментальная и рассчитанная по соотношениям Герца зависимости высоты профиля АСМ-изображений частиц вируса табачной мозаики от величины нагружающей силы при сканировании.

Обоснование возможности достижения атомного разрешения в АСМ. Результаты применения теории контактных деформаций для контакта зонда с радиусом кривизны кончика R и плоского образца показывают, что при типичных условиях АСМ-эксперимента на воздухе радиус области контакта зонда и образца7 оказывается ~ 1 нм и превышает межатомное расстояние. Это означает, что при сканировании в каждый момент времени с зондом взаимодействуют несколько атомов образца. Возникает вопрос о механизме АСМ-визуализации атомной структуры. Действительно, контакт с единственным атомом (а ~ межатомного расстояния) может быть осуществлен лишь при минимизации силы воздействия зонда до величины 10^-100 пН, что требует специальных экспериментальных условий8.

Известны наблюдаемые в ряде случаев особенности АСМ-визуализации атомной структуры поверхности: инверсия контраста, визуализация «ложного атома»

6частицы вируса табачной мозаики имеют цилиндрическую форму

7

8например, проведения исследований в жидкости

на месте точечного дефекта. Ранее эти наблюдения объяснялись с позиции наличия на кончике иглы нескольких атомов, дающих одинаковый вклад во взаимодействие с образцом. Мы предлагаем подход, связывающий эти особенности с параметрами эксперимента, определяющими радиус контактной площадки .

В силу неоднородного распределения давления в области контакта вклад каждого атома образца в силовое взаимодействие с зондом будет определяться его положением относительно центра области контакта. Формула контактной задачи Герца, описывающая распределение контактного давления, позволяет ввести аппаратную функцию АСМ9 вида:

_А{х у') ~

если (3)

если

где — радиус области контакта. Введенная аппаратная функция связывает АСМ-изображение с реальной геометрией атомной решетки поверхности иссле-

дования :

(4)

Мы провели простейший анализ, вычисляя по (4) для двух случаев: когда центр зонда находится над атомом и между атомами решетки. Поверхностную решетку образца описывали как гексагональную с параметром й, в качестве атомных функций выбирали ¿-функции. Используя (3) и (4), обозначая для двух случаев вычисляемые функции как /1 и /2 и определяя разностную функцию АСМ-изображения:

(5)

рассчитали ее зависимость от а для ё = 0,52 нм (параметр решетки слюды), см. рис.2. Как следует из рисунка, значения разностной функции существенно варьируются в зависимости от параметра . Более того, при различных значениях может изменяться знак , что должно приводить к наблюдению инвертированного АСМ-изображения (инверсия контраста). Особо следует подчеркнуть, что не наблюдается тенденция к уменьшению значений максимумов разностной функции по мере увеличения области контакта и, следовательно, вовлечения в контакт все большего количества атомов; т.е. сохраняется возможность получения «атомного» разрешения.

Для сравнения с экспериментом проводили измерения зависимости от радиуса области контакта спектральной плотности сечения функции Ртр(х,у) АСМ-изображения поверхности слюды вдоль основной оси решетки на пространственной частоте нм , см. графики рис. 3. Измеряемая величина по своему

9ее применимость ограничена случаем плоского образца и сферического кончика зонда

-9-

Рис. 2. Зависимость разностной функции АСМ-изображе-ния (5) и ее модуля от радиуса области контакта для модельного случая гексагональной решетки (4 = 0,52 нм) с <5-функ-циями в качестве атомных.

Рис. 3. Зависимость спектральной плотности сечения функции АСМ-изображения слюды на пространственной частоте нм вдоль основной оси решетки от радиуса области контакта а. Измеренная величина нормирована на спектральную плотность шума на той же частоте. Зависимости получены для трех различных зондов.

физическому смыслу должна коррелировать с введенной выше разностной функцией (ее модулем, рис.2). Эксперимент показывает, что при увеличении радиуса области контакта и увеличении числа контактирующих с зондом атомов образца действительно сохраняется возможность визуализации двумерной периодической структуры.

Однако, согласно проведенному анализу, визуализируемая «атомная» структура10 не является «истинной»11: структура элементарной ячейки на АСМ-изображении может отображаться неадекватно (инверсия контраста); влияние точечного дефекта перераспределяется по области размера . Отличие предлагаемого механизма визуализации атомной структуры в АСМ от описанных в литературе состоит в том, что он позволяет связать особенности (контраст, качество) АСМ-изображения атомной структуры с реальными параметрами эксперимента (силой воздействия зонда, модулями упругости зонда и образца, радиусом кривиз-

10с теми же параметрами решетки, что и исследуемая поверхность

11 при типичных условиях АСМ-эксперимента на воздухе

ны иглы и степенью ее асимметрии), а не с абстрактным «количеством атомов на кончике иглы».

Восстановление истинной геометрии объектов по АСМ-изображению (учет эффекта уширения)

Эффект уширения проявляется в том, что у АСМ-изображений одиночных объектов12 завышены значения ширины профиля, и связан с тем, что зонд микроскопа имеет конечный радиус кривизны кончика. Традиционно для учета эффекта уширения объект исследования описывают сферической геометрией. Мы обобщили этот подход для модели эллипсоидального объекта (в сечении — эллипс с полуосями и ), что представляется существенным в свете изложенных выше результатов о контактных деформациях образцов под действием зонда.

Образец \ /р Зонд /

И Г ь > У

Рис. 4. Геометрия контакта зонда и образца (к объясне

й Подложка нию эффекта уширения)

Была рассмотрена геометрическая модель (рис.4), учитывающая взаимодействие объекта только с кончиком зонда («низкий» объект). Кончик зонда аппроксимировали либо полусферой радиуса Д, либо параболоидом вращения (г = кр2, где к— коэффициент параболы), при этом было показано, что результаты применения двух методик фактически тождественны13. Ставили задачу: по заданным значениям высоты АСМ-профиля (26), параметра геометрии иглы (Я или к) и ширины профиля АСМ-изображения на полувысоте ( ) определить истинное значение ширины объекта . Анализ геометрии контакта позволил в обоих случаях свести задачу к одному уравнению с одним неизвестным, для которого был создан алгоритм численного решения. Причем показали, что полученное уравнение не имеет решения в случае, когда выполняется условие (для модели параболической иглы):

к < Ь/й2 (6)

(сходное соотношение было получено и в модели сферической иглы). Смысл данных ограничений очевиден: если измеренные АСМ-профили объектов «острые», то и игла, с помощью которой они были прописаны, также должна быть достаточно «острой».

Как показывает анализ устойчивости решения, определяющий вклад в погрешность а вносит погрешность параметра й; типичные значения стандартного отклонения для найденных значений а могут превышать 20%, поэтому для уменьшения ошибки необходим набор достаточной статистики.

12 адсорбированных на поверхность подложки

13количественная разница найденных решений составляет < 10%

Глава 3. АСМ-исследования взаимодействия вирусной РНК с белками

1 Выбор объекта исследования объясняется следующим. Вирусы являются простейшими природными объектами, способными к репликации, и состоят из носителя генетической информации (молекулы нуклеиновой кислоты) и белковой оболочки. Процесс репликации регулируется спецификой взаимодействия молекулы нуклеиновой кислоты с белками. Наблюдение свободной РНК позволяет исследовать это взаимодействие, что может дать вклад в понимание механизмов процесса сборки вирусов, структурной организации и функционирования рибонуклеопротеидов.

В настоящее время разработан ряд методик фиксации макромолекул ДНК на поверхностях подложек для АСМ-исследований. Однако в литературе отсутствовали работы, посвященные подобным экспериментам с высокомолекулярной одно-нитевой РНК, что объясняется проблемой ее фиксации на подложке в расправленном состоянии. В работе апробировали методику приготовления вирусной РНК для АСМ-исследования и провели визуализацию стадий процесса последовательного высвобождения РНК из белковой оболочки частиц вируса табачной мозаики под действием химических реагентов. Следует отметить, что разработанная методика не включает какого-либо дополнительного контрастирования молекул РНК, в отличие от препарирования нуклеиновых кислот для электронной микроскопии (ЭМ).

Рис. 5. Частицы вируса табачной мозаики, адсорбированные на пирографит; АСМ-исследование

Цельные частицы ВТМ были исследованы в режимах постоянного и прерывистого контактов на поверхностях пирографита и слюды (рис. 5). Было обнаружено, что скорость сорбирования вирусных частиц на подложку тем выше, чем больше степень гидрофобности ее поверхности; мы связываем это наблюдение с проявлением гидрофобного эффекта.

1 Результаты, изложенные в данной главе, получены в ходе совместной работы с научной группой д . х . н . Ю . Ф . Дрыгина (НИИ ФХБ им . А . Н . Белозерского МГУ)

В мягких условиях депротеинизации наблюдали рибонуклеопротеиды (РНП) с выходящими из них (с одного конца или с обоих) нитями РНК, см. рис. 6а. Протестировав три известные методики частичной депротеинизации ВТМ и высвобождения РНК, описанные в литературе, обнаружили, что наиболее перспективным является метод с применением диметилсульфоксида (ДМСО). Метод депротеинизации в растворах со щелочным значением рН характеризуется большим фоном получаемых АСМ-изображений. Кроме того, молекулы РНК в этом случае склонны к агрегации и в значительной степени сохраняют элементы вторичной структуры. Метод с использованием мочевины позволяет получать АСМ-изображения с незначительным фоном, но при этом наблюдается агрегация вирусных РНП.

Рис. 6. а) Частично разрушенные рибонуклеопротеиды ВТМ, наблюдаются выходящие из концов частиц нити РНК; б) полностью высвобожденные молекулы РНК; АСМ-исследование, подложка — слюда

В жестких условиях депротеинизации белковая оболочка разрушается, и макромолекула РНК полностью высвобождается (рис.бб). Изображенные здесь молекулы отделены от молекул разрушенной белковой оболочки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и адсорбированы на свежий скол слюды из 36% ДМСО в присутствии 1% ВАС (бензилалкиламмоний хлорида). Присутствие ДМСО способствует расправлению молекул, а ВАС — иммоблизации их на подложке.

Проводя анализ вирусных частиц, находящихся на промежуточной стадии разрушения, обнаружили, что в 40% случаев у вирусной частицы наблюдается две выходящих из остова нити частично высвобожденной РНК (в остальных случаях — одна нить). Статистический анализ зависимости длины обеих нитей от длины вирусного остова позволил зафиксировать асимметрию процесса высвобождения РНК из белковой оболочки для двух концов частицы, т.о. нами подтверждена полярность2 разрушения вирусных частиц табачной мозаики.

2впервые обнаружена по данным ЭМ

Глава 4. Зондовая микроскопия процессов конденсации ДНК

1 В живой природе (внутри вирусов и клеток) молекула ДНК находится в существенно «компактизованном» состоянии, занимая объем на несколько порядков (до 10б) меньший, чем в растворе2. В лабораторных условиях при помощи ряда конденсирующих агентов может быть осуществлена т.н. ■¡/»-компактизация3 ДНК (переход клубок глобула); известно, что двумя основными формами ф-компактизованной молекулы являются тороидальная и стержневая. Применение метода АСМ для исследований компактизации молекул ДНК представляется весьма перспективным, поскольку оказывается возможным проводить исследования в нативных или близких к ним условиях, при этом можно определять не только форму, но и размеры исследуемых структур.

Определение геометрии комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода/хлороформ

Компактизация ДНК при взаимодействии с катионными ПАВ и прохождение комплексов ДНК-ПАВ через межфазную границу вода/малополярный органический растворитель может рассматриваться как модель транспорта генетической информации в клетку. Представлялось интересным исследовать морфологию комплексов, перешедших из воды в хлороформ, и оценить количество молекул ДНК, входящих в комплекс, восстановив (по методике учета эффекта уширения, стр. 11) истинную геометрию объектов.

Рис. 7. Тороидальные комплексы ДНК-ПАВ, перешедшие в хлороформ из водной фазы, и адсорбированные для АСМ исследования на поверхность слюды

На рис. 7 приведены результаты АСМ-визуализации комплексов ДНК-ПАВ, перешедших в хлороформ: формой комплекса является тор. С целью анализа геометрии комплексов измеряли параметры: О— диаметр тора, о?— диаметр сече-

Результаты, изложенные в данной главе, получены в ходе совместной работы с к.х.н.

О.А.Пышкиной и к.х.н. В.Г.Сергеевым (Химический факультет МГУ)

2

2в хорошем растворителе

3от ip — psi — polymer and salt induced

l

ния тора, fo— высота тороидальной структуры над подложкой, и определили их средние значения4: D = 100 ± 30 нм, d = 25 ± 9 нм и h = 5 ± 2нм. Для статистики пар значений d и h тестировали выполнение условия (6) и определяли предельное значение параметра геометрии иглы ( или ), при котором появляются случаи отсутствия решения. Так определили, что верхняя граница значения R, характеризующего конкретный зонд, составляет 12 нм (т.о. путем анализа АСМ-изображений объектов получена информация и о параметрах зонда). Было рассчитано, что если радиус зонда составляет нм (нижняя граница получена из анализа тест-объектов), то среднее значение истинной ширины сечения тора а составляет 10 -г-11 нм (т.о., формой комплекса ДНК-ПАВ является сплюснутый тор). Это позволило определить, что в состав 80% комплексов входит от 2 до 16 молекул ДНК.

Исследование изменений конформации ДНК в водно-спиртовых средах

Ранее сообщалось о результатах исследований флуоресцентной микроскопии (ФМ) динамики перехода клубок глобула для гигантской ДНК T4 в водно-спиртовой смеси при вариации концентрации спирта (этанол, изопропанол) в присутствии катионов Na . При этом структуру частично компактизованных образований и геометрию компактной глобулы определить не удавалось в силу ограничения разрешающей способности метода ФМ5. Представлялось достаточно показательным применить метод СЗМ для исследования той же системы: визуализировать процесс в реальном масштабе времени непосредственно в водно-спиртовой среде (в жидкостной ячейке АСМ).

Препарат, содержащий молекулы ДНК Т4 в водно-спиртовой смеси при 80% концентрации изопропанола, вводили в жидкостную ячейку. При этих условиях макромолекулы ДНК осаждались на поверхность слюды в виде компактных глобул (рис. 8а). Применение методики учета эффекта уширения (стр. 11) позволило сделать вывод, что истинной геометрической формой глобулы является сплюснутый и слегка вытянутый эллипсоид, причем каждая глобула образована одной молекулой ДНК, находящейся в достаточно плотно упакованном состоянии.

При понижении концентрации спирта в ячейке с 80% до 40% наблюдали частичную декомпактизацию глобулярных структур, см. рис.8б. Однако оказалось, что дальнейший процесс разворачивания глобул не происходит, что можно объяснить влиянием подложки. Поэтому макромолекулы ДНК в промежуточном состоянии (между глобулой и клубком) получали следующим образом. В жидкостную ячейку вводили молекулы ДНК, находящиеся в 40% изопропаноле6, а затем повышали концентрацию спирта в ячейке, при этом молекулы выпадали на поверх-

4в качестве погрешности указаны стандартные отклонения, N = 180

5

5определяется пределом разрешения оптического микроскопа

6переход клубок глобула происходит при концентрации изопропанола более 50%

Рис. 8. Динамика процессов компактизации/декомпактизации молекул ДНК в водно-спиртовой среде; а) — компактные глобулы, выпавшие на поверхность слюды из 80% водного раствора изопропанола: б) — частично декомпактизованные глобулы (тот же участок поверхности) после понижения концентрации спирта до 40%; АСМ-исследование в жидкостной ячейке

ность подложки в частично компактизованном состоянии, рис. 9. Было обнаружено, что начальным процессом компактизации ДНК является закручивание отдельных участков макромолекулы в тороидальные структуры, которые, по-видимому, и являются центрами дальнейшей компактизации, приводящей к формированию плотных глобул, визуализированных на рис. 8а.

11.0 им

I

-3.00 1-2.00

Рис. 9. Частично компактизованные молекулы ДНК, выпавшие на поверхность слюды из 40-50% водного раствора изопропанола; АСМ-исследование в жидкостной ячейке

Глава 5. Применение метода АСМ для анализа структуры тонких органических пленок

1 Метод Ленгмюра-Блоджетт формирования органических покрытий состоит в перенесении плотноупакованных монослоев амфифильных молекул с границы фаз жидкость/газ на твердую подложку. Перенос обычно осуществляют вертикальным

1 Результаты, изложенные в данной главе, получены в ходе совместной работы с к. х. н. Г. К. Жавнерко (ИФОХ АН Беларуси, Минск)

способом, мы использовали также метод горизонтального осаждения монослоев (при параллельности пленки и подложки). Технология ЛБ позволяет достаточно просто изменять свойства поверхности и формировать качественные пленочные покрытия с заданной структурой, что объясняет интерес к потенциальному использованию пленок ЛБ в высокотехнологичных отраслях. Однако для их широкомасштабного применения необходимо прояснить основные механизмы, определяющие структуру сформированных покрытий, и здесь новая информация может быть получена АСМ.

Мы обнаружили, что во многих случаях метод ГО2 позволяет формировать более качественные покрытия, чем вертикальный метод ЛБ, что может объясняться отсутствием искажающего влияния переориентации молекул в процессе переноса в этом случае (монослой переносится на подложку «как есть», в большей степени сохраняя свою структуру). Так, при АСМ-исследовании монослойных пленок беге-новой кислоты, сформированных на слюде методом ГО с водной субфазы, удалось визуализировать сосуществование двух областей, отличающихся высотой монослоя (разница 0,3-0,6 нм), см. рис.10. Мы полагаем, что области разной высоты относятся к участкам различного двумерного фазового состояния пленки («твердая» и «жидкоконденсированная» фазы) с различной ориентацией молекул. При использовании традиционного вертикального метода ЛБ выделения монослоя визуализировать такие особенности структуры не удавалось.

Рис. 10. Монослой бегеновой кислоты, приготовленный горизонтальным методом осаждения на слюду.

Визуализированы участки различного фазового состояния молекул пленки, характеризующиеся различной высотой монослоя. Наряду с этим в пленке наблюдаются поры глубиной до подложки (интенсивно темные области). АСМ-исследование

мономолекулярных пленках бегеновой кислоты и динамика процессов их разрушения/восстановления. Мы обнаружили, что мономолекулярная пленка бегеновой кислоты, горизонтально осажденная на поверхность подложки (как слюды, так и пирографита) с субфазы, содержащей тиол-стабилизированные полупроводниковые С^е кластеры3, содержит ламелярные кристаллические включения (рис. 11а). Было показано, что их формирование имеет место лишь при наличии в субфазе С^е кластеров.

2ГО — горизонтального осаждения

3С^4Т^2(ЗСНСНОН^^50 — перспективный объект опто- и наноэлектроники

Формирование кристаллитов в

б)

Рис. 11. Кристаллиты, сформировавшиеся в монослое бегеновой кислоты, осажденном на подложку слюды методом ГО с субфазы, содержащей СЛе кластеры:

а) визуализированные при минимальном силовом воздействии зонда; б) частично разрушенные при увеличении силы воздействия зонда (более 100нН); в) частично восстановленные при последующей минимизации силы воздействия зонда

Однако доказать методом АСМ присутствие кластеров в сформированном покрытии не удалось. Тем не менее, представлялось интересным исследовать структурные особенности кристаллитов. Было установлено, что ламели ориентированы не произвольным образом, а вдоль некоторых выделенных направлений решетки подложки. Так, углы между ламелями кратны 60°, как при использовании подложки из слюды, так и графита. Оказалось, что на подложке из слюды ламели ориентированы к основным осям решетки подложки под углом, близким 20°, а на пирографитовой подложке — близким . При этом вектор молекулярной решетки поверхности кристаллитов (ЦП4-тип, см. ниже) ориентирован по направлению ламели.

Было обнаружено, что эти кристаллические образования разрушаются при увеличении воздействующей силы зонда (до 100 нН). После нескольких сканирований с увеличенной силой воздействия кристаллиты «исчезают» с АСМ-изображения (при этом окружающий их монослой остается), см. рис. 11 б. Мы считаем, что резервуаром для удаленного материала кристаллитов является боковая поверхность зонда. Если после разрушения кристаллитов продолжать сканирование, минимизировав силу воздействия зонда, то через несколько последовательных сканирований кристаллические структуры частично восстанавливаются в тех участках поверх-

4ЦП — центрированная прямоугольная

ности, где были прежде, см. рис. 11в. При этом восстанавливается и их высота, что свидетельствует о значительной механической стабильности этих образований.

Исследование молекулярной упаковки тонких органических пленок

Метод АСМ представляется весьма перспективным для исследования структуры молекулярной упаковки тонких органических пленок. Основным препятствием подобных исследований является неустойчивость пленок к локальному воздействию зонда при сканировании участков малой площади, что часто приводит к локальному разрушению покрытий. Тем не менее, для ряда пленок оказалось возможным с помощью АСМ достичь молекулярного разрешения и определить параметры элементарной ячейки. Основным фактором, ограничивающим точность подобных АСМ-измерений, является температурный дрейф, поэтому для исключения его искажающего влияния параметры молекулярной упаковки определяли путем усреднения результатов измерений значительного числа АСМ-изображений, полученных при разной ориентации держателя левера и образца и при различном направлении сканирования. Ниже приведены значения средних арифметических для измеряемых параметров, в качестве погрешности приведены величины стандартного отклонения5; точность калибровки прибора мы оцениваем на уровне 2%.

Бегеновая кислота. Структурная формула: С21Н43СООН.

Таблица 1. Параметры двумерной решетки молекулярной упаковки тонких пленок бегеновой кислоты (ЦП-ячейка). №1 и №2 — для поверхности кристаллитов (см. выше); №3 — для монослоя, перенесенного вертикальным методом ЛБ на слюду, №4 — для монослоя, горизонтально осажденного на слюду.

Значения параметров молекулярной упаковки поверхности кристаллитов (№1 и №2 таблицы 1), сформированных в монослоях бегеновой кислоты на субфазе, содержащей С(1Те кластеры (см. выше), близки значениям а = 0,496 и Ь = 0,785 нм, определенным Китайгородским6 из принципа плотной упаковки углеводородных цепей для слоев молекул с И-подъячекой. Мы обнаружили, что близкими значениями характеризуется также молекулярная упаковка монослоя пчелиного воска на поверхности пирографита (инертная подложка). Можно предположить, что в этих случаях влияние подложки на молекулярную структуру минимально. В то же время для монослоев бегеновой кислоты на слюде (№3 и №4 таблицы 1) параметры решетки отличаются от значений, определяемых принципом

5ниже — число измеренных АСМ-изображений

6См., например, А.Н.Китайгородский. Молекулярные кристаллы. — М.: Наука, 1971г.

№ под- а, нм Ъ, нм N

ложка

1 слюда 0,48 ± 0,03 0,77 ± 0,06 60

2 графит 0,50 ± 0,02 0,78 ± 0,06 70

3 слюда 0,47 ±0,02 0,88 ± 0,08 70

4 слюда 0,53 ± 0,03 0,77 ± 0,04 10

плотной упаковки углеводородных цепей, что может объясняться влиянием подложки. При использовании подложки пирографита молекулярного разрешения достичь не удается. АСМ визуализирует иной тип структуры: материал пленки организуется в периодические образования (период нм) с углом взаи-

моориентации и углом к осям решетки подложки ; мы полагаем, что эти структуры являются полуцилиндрическими мицеллами.

Пленки кетоамидов. Было получено молекулярное разрешение для перенесенных методом ГО на слюду монослойных пленок соединений:

№5 Ы,Ы'-диоктадецилпропандиамида синзукн-с-снг-с-кн-синзу

о о

№6 Ы-гексадецилацетамида с^щ^^с-Шг-с-сиз

о о

№7 Ы,Ы'-дигексадецилпропандиамида с^и^-с-^г-с-га-с^зз

оо

№8 Ы-гексадецил-Ы'-(2-нафтил)пропандиамида с^в^н-с-сн^с-м

о о

№9 N -гексадецил-Ы'-(6-хинолин)пропандиамида с1ен^кн с сн^с N3

о о

7 Было обнаружено, что за одним исключением8 АСМ-изображения пленок исследованных соединений (№5-7 и №9) характеризуются гексагональной решеткой с параметром ячейки, весьма близким9 значению 0,48 нм, которое характеризует упаковку слоев углеводородных цепей с Н-подъячейкой (т.н. «газокристаллическая» фаза10). Молекулы соединений №5 и №7 имеют по два углеводородных фрагмента равной длины, и можно предположить, что каждой молекуле на АСМ-изображении соответствуют две пучности. Однако наблюдение гексагональной упаковки углеводородных цепей, попарно объединенных в молекулы, несколько неожиданно, поскольку для объяснения высокой симметрии «газокристаллической» фазы допускают, что углеводородные цепи сохраняют возможность независимого ротационного движения вокруг своей оси.

Таблица 2. Параметры двумерной решетки молекулярной упаковки тонких пленок 5-октадецил-2,4,6(1Н, 3Н, 5Н)пиримидинтриона (ЦП-ячейка). №10 — для монослоя, №11 — для кристаллитов (3, 6 и 9 слоев), №12 — для островковых образований (2 слоя)

7молекулы соединений №5-7 переорганизовывались в трехслойные образования, пленки №8, №9 сохраняли монослойную структуру

8№8, для которого параметры решетки: а = 0,566 ± 0,015, Ь = 0,80 ± 0,03 нм

9различие менее 1%

10другое название — «ротационно-кристаллическая» фаза

№, под- а, нм Ь, нм N

тип ложка

10 слюда 0,548±0,009 1,56 ±0,08 20

11 слюда 0,549±0,009 1,31 ±0,06 110

12 слюда 0,508±0,007 1,37 ±0,08 40

Сосуществование различных типов упаковок в структуре пленок 5-окта-децил-2,4,6(1Н, 3Н, 5Н)пиримидинтриона. Для этого соединения, структур-

ная формула которого сл^^^0 , мы обнаружили три различных типа упаковки

о

(таблица 2) для участков различной структуры пленки (рис. 5а): монослоя, остров-ковых образований и кристаллитов, спонтанно формирующихся в монослойном покрытии, переносимом методом ГО на слюду. Молекулярная упаковка островковых и кристаллических образований характеризовалась ЦП-ячейкой с отличающимися параметрами и , но близкими значениями площади, приходящейся на молекулу (0,35 нм2 и 0,36 нм2), см. таблицу 2. В то же время АСМ-изображение молекулярной упаковки монослоя характеризовалось, во-первых, сверхструктурой (рис. 5б), а во-вторых, большей площадью на молекулу. Это может объясняться влиянием подложки, поскольку направление вектора в этом случае совпадает с одной из кристаллографических осей слюды, причем параметр нм соизмерим

с параметром решетки подложки — 0,52 нм (при этом параметр а имеет то же значение, что и для кристаллитов).

а)

т\>Ы

ж \ >ч

Рис. 12. Структура тонких пленок 5-октаде-цил-2,4,6(1Н, 3Н, 5Н)пиримидинтриона, АСМ-исследование.

а) — Визуализированы области различной организации пленки: монослой, островки (2 слоя) и ламели (3, 6 и 9 слоев); б) — визуализация молекулярной упаковки монослоя ив) — поверхности кристаллитов.

б)

в)

ми

Т.о., мы показали, что параметры молекулярной структуры пленок определяются несколькими конкурирующими факторами: принципом плотной упаковки углеводородных цепей, значением площади полярной группы и влиянием подложки.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны модели и построены алгоритмы учета двух основных артефактов АСМ: эффектов уширения и занижения высоты профиля одиночных объектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Предложена методика определения упругих параметров отдельного микрообъекта. С позиции теории контактных деформаций проанализирован механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности.

2. Апробирована методика иммобилизации на поверхности подложки свободных молекул однонитевой вирусной РНК в расправленном состоянии. Методом АСМ визуализированы стадии процесса высвобождения РНК из белковой оболочки частиц вируса табачной мозаики и подтверждена асимметрия протекания этого процесса относительно двух концов молекулы.

3. Методом АСМ исследована динамика процесса компактизации молекулы ДНК T4 в водно-спиртовых средах, визуализированы молекулы, находящиеся на различной стадии компактизации. Обнаружено, что частично ком-пактизованные структуры включают тороидальные участки, образованные отдельными витками молекулы. По результатам измерений АСМ восстановлена реальная геометрия компактных структур и рассчитан их молекулярный состав.

4. По результатам АСМ-исследований структуры ЛБ пленок показана перспективность метода горизонтального осаждения монослоев на подложку. Для ряда тонкопленочных покрытий получено молекулярное разрешение и определены параметры решетки с погрешностью в единицы процентов. Показано, что структура пленки определяется совокупностью факторов: принципом плотной упаковки углеводородных цепей, значением площади полярной группы на поверхности субфазы и влиянием подложки.

Список публикаций по теме диссертации

1. V. Yu. Uvarov, Yu. D. Ivanov, A. N. Romanov, M. O. Gallyamov, O. I. Kiselyova, I. V. Yamin-sky. Scanning tunneling microscopy study of cytochrome P-450 2B4 incorporated in proteoliposomes // Biochimie. — 1996. — V. 78. — P. 780-784.

2. V. G. Sergeyev, O. A. Pyshkina, M. O. Gallyamov, I. V. Yaminsky, A. B. Zezin, V. A. Kabanov. DNA-surfactant complexes in organic media / / Progr Colloid Polym Sci. — 1997. — V. 106. — P. 198-203.

3. М. О. Галлямов, И. В. Яминский. Нуклеиновые кислоты / / Учебное пособие «Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров» / под ред. д.ф.-м.н. И.В.Яминского. — М.: Научный мир, 1997. — С. 25-40.

4. М. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В.Г.Сергеев, И. В. Яминский. Применение методов сканирующей зондовой микроскопии к исследованию конформационных свойств ДНК // Поверхность; РСНИ. — 1998. — №2. — С. 79-83.

5. С. А. Бычихин, М. О. Галлямов, В.В.Потемкин, А.В.Степанов, И. В.Яминский. Сканирующий туннельный микроскоп — измерительное средство наноэлектроники / / Измерительная техника. — 1998. — №4. — С. 58-61.

6. Yu. F. Drygin, O. A. Bordunova, M. O. Gallyamov, I. V. Yaminsky. Atomic force microscopy examination of TMV and virion RNA // FEBS letters. — 1998. — V.425. — P. 217221.

7. G. K. Zhavnerko, V. E. Agabekov, M. O. Gallyamov, I. V. Yaminsky, I.V. Lokot, F. A. Lach-vich. AFM study of morphological peculiarities of Langmuir-Blodgett films from amphiphilic derivatives of 4-hydroxy-6-methyl-2-pyrone / / Conference proceedings of third Belarussian seminar on scanning probe microscopy. — Grodno, Oktober 1998. — P. 91-93.

8. М. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В.Г.Сергеев, И. В.Яминский. Структура поликомплексов в водных и органических средах // Материалы всероссийского рабочего совещания «Зондовая микроскопия-99». — Н. Новгород, март 1999. — С. 230-236.

9. М. О. Галлямов, И. В.Яминский. Количественные методики восстановления истинных топографических свойств объектов по измеренным АСМ-изображениям: 1. Контактные деформации зонда и образца; 2. Учет эффекта уширения АСМ-профиля / / Материалы всероссийского рабочего совещания «Зондовая микроскопия-99». — Н. Новгород, март 1999. — С. 357-364; — С. 365-371

10. М. О. Галлямов, Ю. Ф. Дрыгин, И. В. Яминский. Визуализация РНК и рибонуклеопро-теидов вируса табачной мозаики методами атомно-силовой микроскопии // Поверхность; РСНИ. — 1999. — №7. (в печати)

11. Г. К.Жавнерко, Т. А. Кучук, В. Е. Агабеков, М. О. Галлямов, И. В.Яминский. Свойства и структура мономолекулярных пленок на основе №октадецил-3,4:9,10-перилен-бис(дикарбоксидиимида) // Журнал физической химии. — 1999. — №7. (в печати)

12. А.С.Андреева, М. О. Галлямов, О. А. Пышкина, В.Г.Сергеев, И. В.Яминский. Морфология комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода-хлороформ, по результатам атомно-силовой микроскопии / / Журнал физической химии. — 1999. — № 9. (в печати).

см. также раздел «Апробация работы».

Подписано в печать 05.05.1999. Заказ 198. Усл. печ. л. 1.5. Тираж 75 экз. Формат 60 X 90/16 • ООП Центра перспективных технологий. Москва, Б.Никитская 24-7.

Введение

Цель и задачи исследования.

Обзор литературы

1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии

1.1. Общие принципы работы сканирующего зондового микроскопа

1.2. Сканирующая туннельная микроскопия.

1.3. Атомно-силовая микроскопия.

1.3.1. Силовое взаимодействие зонда и образца.

1.3.2. Принцип работы АСМ.

1.4. Основные методы исследования биологических и органических объектов и структур

1.5. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот

1.5.1. Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот

1.5.2. Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов

Теоретическая часть

2. Анализ искажающих эффектов атомно-силовой микроскопии 50 2.1. Контактные деформации зонда и образца.

2.1.1. Контакт двух тел: решение контактной задачи Герца

2.1.2. Контакт сферического зонда и сферического образца

2.1.3. Контакт сферического зонда и цилиндрического образца.

2.1.4. Динамика переходного процесса контактных деформаций

2.1.5. Возможность достижения атомного разрешения с помощью АСМ.

2.2. Задача восстановления реальной геометрии объектов по

АСМ-изображению (учет эффекта уширения).

2.2.1. Постановка и решение задачи об определении ширины объектов по измеренным параметрам АСМ-профиля

Экспериментальная часть

3. АСМ-исследования взаимодействия вирусной РНК с белками

3.1. Исследование процессов разрушения белковой оболочки частиц вируса табачной мозаики и высвобождения вирусной РНК.

3.1.1. Результаты и их обсуждение.

3.1.2. Анализ распределения молекул РНК по длинам

3.1.3. Краткие выводы.

4. Зондовая микроскопия процессов конденсации ДНК

4.1. Исследование конформационных изменений ДНК при взаимодействии с поверхностно-активными веществами

4.1.1. Возможность исследования конформационных свойств комплексов ДНК-ПАВ методом СТМ

4.1.2. Определение геометрии комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода/хлороформ, по результатам АСМ.

4.2. Исследование изменений конформации ДНК в водноспиртовых средах

4.2.1. Исследование сконденсированных в водно-спиртовой среде молекул ДНК при проведении исследований на воздухе.

4.2.2. Исследование процессов конденсации ДНК непосредственно в водно-спиртовой среде

4.2.3. Краткие выводы.

5. Применение метода АСМ для анализа структуры тонких органических пленок

5.1. Влияние процессов внедрения CdTe-кластеров на структуру тонкопленочных покрытий бегеновой кислоты

5.1.1. Экспериментальная часть.

5.1.2. Результаты и их обсуждение.

5.2. Исследование тонких пленок белков.

5.3. Исследование влияния условий формирования покрытий и природы подложки на молекулярную упаковку тонких органических пленок.

5.3.1. Результаты исследований молекулярной упаковки тонких пленок.

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ), объединяющая широкий спектр современных методов исследования поверхности, насчитывает полтора десятка лет своей истории — с момента создания в 1981 г. Бинни-гом и Рорером сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [1, 2]. За прошедшие годы применение зондовой микроскопии позволило достичь уникальных научных результатов в различных областях физики, химии и биологии. Наиболее яркими демонстрациями возможностей этого экспериментального направления при исследовании поверхностей твердых тел могут служить: результаты по прямой визуализации реконструкции поверхностей [3]^, манипуляция отдельными атомами для записи информации с рекордной плотностью, исследование локального влияния поверхностных дефектов на зонную структуру образца [4] и пр.

Новые экспериментальные возможности рассматриваемого направления в сравнении с традиционными методами исследования поверхности делают особенно перспективным применение зондовой микроскопии (в частности атомно-силовой микроскопии (АСМ) [5]) для изучения биологических и органических материалов. На этом пути в последние годы также был достигнут значительный прогресс. В частности, применительно к исследованиям нуклеиновых кислот, можно упомянуть о таких результатах, как визуализация отдельных молекул ДНК [6] и исследование их конформационного состояния в жидких средах, прямое измерение сил взаимодействия комплементарных нуклеотидов [7], визуализация в реальном масштабе времени процессов взаимодействия ДНК с белками [8].

В то же время зондовая микроскопия биологических и органических объектов и структур остается более сложной задачей в сравнении с СЗМ-анализом поверхностей твердых тел. Действительно, прошло более например, поверхности Si(111)7 х 7 десяти лет с момента возникновения СЗМ, прежде чем была убедительно показана ее адекватность для исследований биообъектов (в 1992 г. на примере молекулы ДНК [6]). Это связано с такими особенностями подобных объектов, как низкая проводимость2^ и невысокая механическая жесткость. Актуальной является проблема иммобилизации данных структур на поверхностях твердых подложек в процессах приготовления образцов и при исследованиях (особенно в жидких средах). Важно, чтобы объекты были зафиксированы на подложке в таком состоянии, чтобы было возможно исследовать их интересующие структурные особенности. Возможным подходом к решению этой задачи может служить, например, модификация свойств подложки путем контролируемого осаждения на ее поверхность тонких органических пленок с заданными свойствами.

Весьма важным для адекватного применения зондовых микроскопов в широкомасштабных научных исследованиях является отслеживание и систематизация возможных механизмов возникновения артефактов, т.е. аппаратных эффектов, приводящих к наблюдению ложных или искаженных свойств исследуемого объекта, которое может быть обусловлено, например, воздействием на объект самого инструмента исследования и пр.

Действительно, сканирующий зондовый микроскоп представляет собой «проектор», проецирующий объекты и явления микромира на доступный нашему восприятию «экран» — в силу многих причин удобно, чтобы им служил экран монитора компьютера. В этом случае проекция становиться отчасти «осязаемой», поскольку допускает возможность дополнительного анализа с помощью соответствующего программного обеспечения. Однако подобное «проецирование» несет только частичную информацию об объекте, к тому же отчасти искаженную влиянием самого «проектора». Восстановление по проекции реальных свойств исследуемых объектов является типичной обратной задачей, требующей решения и для зондовой микроскопии. важно при СТМ-исследованиях

Цель и задачи исследования

Целью работы являлась разработка методов исследования нуклеиновых кислот и их комплексов с помощью зондовой микроскопии.

В этой связи основными задачами настоящей работы являлись:

• разработка методов определения истинной геометрии объектов путем анализа экспериментально измеренных параметров их АСМ-изображений (учет артефактов);

• определение адекватных методик иммобилизации молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с белками и поверхностно-активными веществами в различных экспериментальных условиях (при проведении исследовании в жидких средах или на воздухе) на различных подложках;

• отработка подходов к решению задачи модификации свойств подложки путем контролируемого осаждения тонких органических пленок; исследование влияния на качество (однородность, бездефектность) и структуру сформированного покрытия специфики процедуры его формирования и природы подложки.

При решении основных задач возникла необходимость или возможность рассмотрения ряда дополнительных и вспомогательных вопросов и проблем. Так, анализируя проблему определения истинной геометрии объекта по результатам исследования АСМ (глава 2), рассмотрели два основных артефакта, проявляющихся при исследовании микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки: эффект уширения (раздел 2.2) и эффект занижения высот АСМ-профиля (раздел 2.1). При разработке методики количественного описания эффекта занижения высот привлекли теорию контактных деформаций; следствия ее применения для анализа результатов АСМ потребовали (этому посвящен раздел 2.1.5) объяснить с позиций контактной теории механизм АСМ-визуализации атомной или молекулярной структур поверхности.

Определение адекватной методики иммобилизации одноцепочечной вирусной РНК (глава 3) на поверхности подложки позволило визуализировать стадии процесса последовательного разрушения вирусной частицы с высвобождением молекулы РНК, находящейся в белковой оболочке

раздел 3.1.1), и проанализировать неэквивалентность протекания этого процесса для двух концов вирусной частицы (раздел 3.1.2).

Разработка методов определения истинной геометрии объектов позволила, при проведении исследований компактизации3} молекул ДНК (глава 4), проанализировать количественный молекулярный состав ком-пактизованных структур. Отработка методики исследования нуклеиновых кислот в жидких средах (описана в разделе 4.2.2) позволила изучить промежуточные стадии процесса компактизации ДНК непосредственно в жидкостной ячейке АСМ и определить структуру конденсированной молекулы.

При исследовании тонких пленок (см. главу 5), применение метода формирования искусственных дефектов (см. рис. 5.10) дало возможность проанализировать углы взаимоориентации осей решетки пленки и подложки. Кроме того, для ряда тонкопленочных покрытий удалось осуществить АСМ-визуализацию молекулярной упаковки и определить параметры элементарной ячейки. Это позволило сделать выводы о природе механизмов, определяющих молекулярную структуру пленок. переход «клубок» —»• «глобула»

Выводы

1. Разработаны модели и построены алгоритмы учета двух основных артефактов АСМ: эффектов уширения и занижения высоты профиля одиночных объектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Предложена методика определения упругих параметров отдельного микрообъекта. С позиции теории контактных деформаций проанализирован механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности.

2. Апробирована методика иммобилизации на поверхности подложки свободных молекул однонитевой вирусной РНК в расправленном состоянии. Методом АСМ визуализированы стадии процесса высвобождения РНК из белковой оболочки частиц вируса табачной мозаики и подтверждена асимметрия протекания этого процесса относительно двух концов молекулы.

3. Методом АСМ исследована динамика процесса компактизации молекулы ДНК T4 в водно-спиртовых средах, визуализированы молекулы, находящиеся на различной стадии компактизации. Обнаружено, что частично компактизованные структуры включают тороидальные участки, образованные отдельными витками молекулы. По результатам измерений АСМ восстановлена реальная геометрия компактных структур и рассчитан их молекулярный состав.

4. По результатам АСМ-исследований структуры ЛБ пленок показана перспективность метода горизонтального осаждения монослоев на подложку. Для ряда тонкопленочных покрытий получено молекулярное разрешение и определены параметры решетки с погрешностью в единицы процентов. Показано, что структура пленки определяется несколькими факторами: принципом плотной упаковки углеводородных цепей, значением площади полярной группы на поверхности субфазы и влиянием подложки.

Благодарность

Приношу глубокую благодарность своим научным руководителям — Василию Васильевичу Потемкину и Игорю Владимировичу Яминско-му — за постоянное внимание, поддержку и помощь в работе. Также выражаю признательность Алексею Ремовичу Хохлову и Игорю Владимировичу Яминскому за предоставленную возможность использования экспериментального оборудования. Я в неоплатном долгу перед коллегами по совместным исследованиям — Юрием Федоровичем Дрыгиным, Ольгой Александровной Пышкиной, Владимиром Глебовичем Сергеевым, Геннадием Константиновичем Жавнерко, затратившим огромное количество усилий и творческой энергии на разработку и постановку экспериментов, результаты которых нашили отражение в диссертации. Многие ценные замечания по прочитанной рукописи были высказаны Юрием Федоровичем Дрыгиным и Геннадием Константиновичем Жавнерко, за что им искреннее спасибо. Хочу поблагодарить студентов Химического факультета МГУ — Барского Артема, Зинченко Анатолия, Андрееву Асю, а также аспирантку Чалмерского технологического университета Малин Ардхаммар — за помощь в проведении исследований. Я признателен всем сотрудникам, аспирантам и студентам объединенной группы зондовой микроскопии за теплую творческую атмосферу, в значительной степени способствовавшую выполнению работы. Не могу не упомянуть отдельно труд Александра Сергеевича Филонова по созданию высокоинтеллектуального программного обеспечения, облегчившего обработку экспериментальных результатов.

Мне особенно приятно выразить благодарность моей жене Оле, которая взяла на себя основные заботы о сыне Эльдаре и значительный труд по правке языка рукописи, и которой принадлежит основная заслуга в том, что эта работа была завершена.

Спасибо.

Заключение

Целью проведенных исследований служила разработка зондово-микроскопических методов исследования нуклеиновых кислот. Попутно, при решении задач контролируемой модификации свойств подложки для иммобилизации нуклеиновых кислот, были затронуты вопросы, связанные с тонкими органическими пленками: выяснение основных механизмов, определяющих структуру покрытия.

Исследования органических пленок, сформированных по технологии ЛБ, показали, что они являются весьма перспективным объектом для СЗМ-анализа, поскольку методы зондовой микроскопии могут позволить получить здесь принципиально новую информацию. Поэтому мы провели ряд исследований тонкопленочных покрытий (глава 5) в которых эти структуры являлись основным объектом исследования (безотносительно к нуклеиновым кислотам). В экспериментах мы анализировали влияние процедуры выделения пленки, состава субфазы и природы подложки как на микроструктуру пленки (дефектность и однородность на микронных размерах поверхности), так и на молекулярную упаковку молекул в сформированных покрытиях.

Возможность достижения молекулярного разрешения при исследовании плоских поверхностей (тонких пленок, кристаллических подложек), и невозможность достижения столь же высокого латерального пространственного разрешения в исследованиях нуклеиновых кислот и вирусных частиц, требовали объяснения. Вопрос о механизме достижения «атомного» разрешения в АСМ возник и в свете результатов применения теории контактных деформаций для описания контакта зонда и образца (раздел 2.1 — учет эффекта занижения высот АСМ-изображений объектов). Действительно, согласно соотношениям Герца этой теории, размер области контакта зонда и образца при типичных условиях АСМ-исследований на воздухе составляет единицы квадратных нанометров и значительно превышает, например, типичную площадь на молекулу в ЛБ пленках ~ 0,2 нм2. В разделе2.1.5 механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности был обоснован с позиций контактной теории, что позволило объяснить ряд экспериментально наблюдаемых закономерностей.

С использованием соотношений Герца удалось разработать методику определения упругих параметров отдельных микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Эта методика нашла отражение в экспериментальной части задачи31^ «Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот» специального физического практикума по зондовой микроскопии кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ. Измерения по результатам АСМ-эксперимента, проводимые студентами, подтвердили, в частности, что деформации микрообъектов с характерными размерами ~ 10 нм (и более) хорошо описываются теорией контактных деформаций.

Перспективы применения разработанных подходов

Алгоритм построения численного решения для учета эффекта уширения, разработанный в разделе 2.2, представляется весьма простым в реализации, а проведение расчетов фактически не требует каких-либо затрат компьютерного времени. Это позволяет надеяться, что предложенная методика найдет применение среди специалистов, занимающихся зондовой микроскопией биоструктур. Среди отличительных особенностей реализованного подхода стоит упомянуть его общность («эллипсоидальный» объект32^), а также наличие «реперных» соотношений (2.38) и (2.39), позволяющих оценить «остроту» самого зонда непосредственно по анализируемому АСМ-изображению.

Логическим обобщением результатов четвертой и пятой глав стали проводимые нами в последнее время исследования влияния молекул ДНК и синтетических полиэлектролитов, присутствующих в субфазе, на свойства ленгмюровских пленок поверхностно-активных веществ, находящихся на поверхности жидкой субфазы (и переносимых для АСМзадача поставлена автором совместно с д. ф.-м. н. И. В. Яминским в отличие от традиционно используемой модели сферического объекта исследований на твердую подложку). Полученные результаты33^ носят предварительный характер (и не вошли в диссертацию), однако позволяют сделать вывод о высокой чувствительности структуры и свойств сформированных монослоев к природе объектов, находящихся в субфазе. Различие во влиянии, оказываемом молекулами ДНК и синтетическими полиэлектролитами (полиметакриловой кислоты) на структуру монослоев позволяет констатировать различие механизмов их взаимодействия с ПАВ.

Результаты проводимых нами исследований тонких пленок свидетельствуют о большом потенциале метода АСМ в этой области (это частично отражено в диссертации). Действительно, позволяя непосредственно «видеть» структуру поверхности и измерять ее характерные параметры, метод АСМ служит удачным дополнением других физических методов исследования тонких пленок. Это позволяет адекватно интерпретировать результаты комплексных исследований. Представляется, что набор достаточного количества фактических экспериментальных данных позволит, при их анализе и обобщении, сделать фундаментальные выводы относительно основных механизмов, определяющих структуру тонкопленочных покрытий. Есть все основания полагать, что метод зондовой микроскопии найдет в ближайшее годы широкое применение в этой области исследований и результаты, изложенные в работе, будут полезны при обобщающем анализе.

Определение адекватной методики иммобилизации одноцепочечной вирусной РНК (глава 3) на поверхности подложки позволяет нам в настоящее время проводить исследования биоспецифического взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Разработанные подходы могут быть полезны в актуальных микробиологических исследованиях, проводимых в условиях, максимально близких нативным.

В заключении сформулируем основные выводы по результатам, изложенным в диссертационной работе. Эти положения выносятся на защиту.

33') Доложены на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии: О. А. Пышкина, Е. А. Барышникова, М. О. Галлямов, В. Г. Сергеев, И. В. Яминский. Свойства и морфология комплексов ДНК или полиметакриловой кислоты с катион-ным ПАВ в монослоях // Рефераты докладов и сообщений №2, — С.-Петербург, 1998, — с. 451.

1. G. Binnig and H. Rohrer, Scanning tunneling microscopy// Helv. Phys. Acta., — 1982, — v. 55, — pp. 726-735.

2. G. Binnig, H. Rohrer, C. Gerber, and E. Weibel, Tunneling through a controllable vacuum gap// Appl. Phys. Lett., — 1982, — v. 40, — pp.178-180.

3. Г. Бинниг, Г. Рорер, Сканирующая туннельная микроскопия — от рождения к юности// УФН, — 1988, — т. 154, — №2, — сс. 261-277.

4. N. S. Maslova, A. I. Oreshkin, V. I. Panov, S. V. Savinov, A. A. Kalachev, and J. P. Rabe, STM evidence of dimensional quantization on the nanometer size surface defects // Solid State Communications, — 1995, — v. 95, — №8, — pp. 507-510.

5. G. Binning, C. F. Quate, and C. Gerber, Atomic force microscopy// Phys. Rev. Lett., — 1986, — v. 56, — №9, — pp. 930-933.

6. C. Bustamante, J. Vesenka, C. L. Tang, W. Rees, M. Guthod, and R. Keller, Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy// Biochemistry, — 1992, — v. 31, — pp. 22-26.

7. G. U. Lee, L. A. Chrisey, and R. J. Colton, Direct measurements of the forces between complementary strands of DNA// Science, — 1994, — v. 266, — pp. 771-773.

8. J. J. Saens, N. Garcia, P. Grutter, E. Meyer, Н. Heinzelmann, R. Wiezendanger, L. Rosenthaler, H. R. Hidber, and H. J. Guntherodt, Observation of magnetic forces by the atomic force microscope // J. Appl. Phys., — 1987, — v. 63, — pp. 4293-4295.

9. U. Durug, D. W. Pohl, and F. Rohrer, Near field optical scanning microscopy// J. Appl. Phys., — 1986, — v. 59, — pp. 3318-3327.

10. J. Hu, X.-D. Xiao, D. F. Ogletree, and M. Salmeron, Imaging the condensation and evaporation of molecularly thin film of water with nanometer resolution// Science, — 1995, — v. 268, — pp. 267-269.

11. С. В. Савинов, Сканирующая туннельная микроскопия и спектроскопия тонких пленок на поверхности графита. Автореф. дис. канд. физ.-мат. наук., Физический ф-т МГУ, — М., 1993. — 14с.

12. J. G. Simmons, Generalized formula for the electronic tunnel effect between similar electrodes separated by a thin insulating film// J. Appl. Phys., — 1963, — v. 34, — pp. 1793-1803.

13. R. M. Feenstra, J. A. Stroscio, and A. P. Fein, Tunneling spectroscopy of the Si(111)2 x 1 surface // Surf. Sci., — 1987, — v. 181, — pp. 295-306.

14. H. C. Hamaker, // Physica, — 1937, — v. 4, — pp. 1058.

15. F.London,//Z. Phys. Chem., — 1930, — v.B11, — pp.222.

16. Б. В. Дерягин, Н. В. Чураев, В. М. Муллер, Поверхностные силы.1. М.: Наука, 1985. — 398 с.

17. Е. М. Лифшиц, // ЖЭТФ, — 1955, — т. 29, — сс. 94.

18. U. Hartmann, Theory of van der Waals microscopy// J. Vac. Sci. Technol. B, — 1991, — v. 9, — №2, — pp. 465-469.

19. А. Адамсон, Физическая химия поверхностей. — М.: Мир, 1979. — 568 с.

20. J. T. Woodward, J. A. N. Zasadzinski, and P. K. Hansma, Precision height measurements of freeze fracture replicas using the scanning tunneling microscope// J. Vac. Sci. Technol B, — 1991, — v. 9, — №2,pp.1231-1235.

21. J. N. Israelachvili, Intermolecular and Surface Forces. — London: Academic Press, 1985. — 296p.

22. V. V. Yaminsky and B. W. Ninham, The hydrophobic force: the lateral enhancement of subcritical fluctuations // Langmuir, — 1993, — v. 9, — pp.3618.

23. R. M. Overney, E. Meyer, J. Frommer, and Н.-J. Guntherodt, Force microscopy study of friction and elastic compliance of phase-separated organic thin films// Langmuir, — 1994, — v. 10, — №4, — pp. 12811286.

24. M. F. Perutz, M. G. Rossman, A. Cullis, Н. Muirhead, G. Will, and A. C. T. North,// Nature, — 1960, — v. 185, — pp.415.

25. J. D. Watson and F. Н. Crick, Molecular structure of nucleic acids// Nature, — 1953, — v. 171, — pp. 737-738.

26. А. И. Китайгородский, Рентгеноструктурный анализ мелкокристаллических и аморфных тел. — М., Ленинград: Гос. изд-во технико-теоретической литературы, 1952. — 588 с.

27. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот (под ред. Ю. С.Лазуркина). — М.: Наука, 1967. — 322 с.

28. C. E. ШП, // J. Biophys. and Biochem. Cytol., — 1955, — v. 1, — pp. 1.

29. A. K. Kleinschmidt and R. K. Zahn, Uber desoxyribonucleinsaure-molekulen in protein mischfilmen // Zeitschrift fur Naturforschung, — 1959, — v. 14b, — pp. 770-779.

30. A. K. Kleinschmidt, Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acids molecules, — v. XII of Methods in Enzymology. — New York: Academic Press, 1968.

31. Д. И. Черный, Электронно-микроскопические исследования специфических комплексов ДНК. Автореф. дис. . докт. биол. наук, Институт молекулярной генетики РАН, — М., 1999. — 50с.

32. H. G. Hansma, K. A. Browne, M. Bezanilla, and T. C. Bruice, Bending and staightening of DNA induced by the same ligand: characterization with the atomic force microscope// Biochemistry, — 1994, — v. 33, — pp.8436-8441.

33. W. A. Rees, R. W. Keller, J. P. Vesenka, G. Yang, and C. Bustamante, Evidence of DNA bending in transcription complexes imaged by scanning force microscopy// Science, — 1993, — v. 260, — pp. 16461649.

34. G. Travaglini, H. Rohrer, M. Amrein, and H. Gross, Scanning tunneling microscopy on biological matter// Surf. Sci., — 1987, — v. 181, — pp. 380-390.

35. D. D. Dunlap and C. Bustamante, Images of single-stranded nucleic acids by scanning tunneling microscopy// Nature, — 1989, — v. 342, — pp. 204-206.

36. C. R. Clemmer and T. P. Beebe, Graphite: A mimic for DNA and other biomolecules in scanning tunneling microscopes studies // Science, —1991, — v. 251, — pp. 640-642.

37. W. M. Heckl and G. Binnig, Domain walls on graphite mimic DNA // Ultramicroscopy, — 1992, — v. 42-44, — pp. 1073-1078.

38. J. Vesenka, M. Guthod, C. L. Tang, R. Keller, E. Delaine, and C. Bustamante, Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope // Ultramicroscopy, —1992, — v. 42-44, — pp. 1243-1249.

39. T. Thundat, D. P. Allison, R. J. Warmack, G. M. Brown, K. B. Jacobson, J. J. Schrick, and T. L. Ferrell, Atomic force microscopyof DNA on mica and chemically modified mica // Scanning Microscopy, — 1992, — v. 6, — №4, — pp. 911-918.

40. N. H. Thomson, S. Kasas, B. Smith, H. G. Hansma, and P. K. Hansma, Reversible binding of DNA to mica for AFM imaging// Langmuir, — 1996, — v. 12, — №24, — pp. 5905-5908.

41. J. Hu, M. Wang, H.-U. G. Weier, P. Frantz, W. Kolbe, D. F. Ogletree, and M. Salmeron, Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl)triethoxysilane-mica by atomic force microscopy// Langmuir, — 1996, — v. 12, — №7, — pp. 1697-1700.

42. Y. L. Lyubchenko, B. L. Jacobs, and S. M. Lindsay, Atomic force microscopy of reovirus dsRNA: a routine technique for length measurements// Nucleic Acids Research, — 1992, — v. 20, — №15, — pp. 3983-3986.

43. Y. Lyubchenko, L. Schlyakhtenko, R. Harrington, and P. Oden, Atomic force microscopy of long DNA: imaging in air and under water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, — 1993, — v. 90, — pp. 2137-2140.

44. В. В. Прохоров, Д. В. Клинов, Е. В. Юркова, В. В. Демин, Исследование возможностей атомно-силовой микроскопии при картировании ДНК// Материалы 16-ой Российской конференции по электронной микроскопии, — 1996, — сс. 227.

45. J. Yang and Z. Shao, The effect of probe force on the resolution of atomic force microscopy of DNA// Ultramicroscopy, — 1993, — v. 50, — pp.157-170.

46. Q. Zhong, D. Inniss, K. Kjoller, and V. B. Elings, Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy// Surf. Sci. Lett., — 1993, — v. 290, — pp. L688-L692.

47. H. G. Hansma, D. E. Laney, M. Bezanilla, R. L. Sinsheimer, and P. K. Hansma, Application for atomic force microscope of DNA// Biophisical Journal, — 1995, — v. 68, — pp. 1672-1677.

48. J. Yang, K. Takeyasu, and Z. Shao, Atomic force microscopy of DNA molecules//FEBS Lett., — 1992, — v. 301, — pp. 173-176.

49. A. Schaper, L. I. Pietrasanta, and T. M. Jovin, Scanning force microscopy of circular and linear plasmid DNA spread on mica with a quaternary ammonium salt// Nucleic Acids Res., — 1993, — v. 21, — №25, — pp. 6004-6009.

50. A. Schaper, J. P. P. Starink, and T. M. Jovin, The scanning force microscopy of DNA in air and in n- propanol using new spreading agents // FEBS Letters, — 1994, — v. 355, — pp. 91-95.

51. H. Butt, T. Muller, and H. Gross, Immobilized biomolecules for scanning force microscopy by embedding in carbon// Journal of Structural Biology, — 1993, — v. 110, — pp. 127-132.

52. L. A. Bottomley, J. N. Haseltine, D. P. Allison, R. J. Warmack, T. Thundat, R. A. Sachlebe, G. M. Brown, R. P. Woychik, K. B.

53. Jacobson, and T. L. Ferrell, Scanning tunneling microscopy of DNA: The chemical modification of gold surfaces for immobilization of DNA// J. Vac. Sci. Technol.A, — 1992, — v. 10, — №4, — pp. 591-595.

54. D. P. Allison, T. Thundat, K. B. Jacobson, L. A. Bottomley, and R. J. Warmack, Imaging entire genetically functional DNA molecules with the scanning tunneling microscope// J. Vac. Sci. TechnolA, — 1993, — v. 11, — №4, — pp. 816-819.

55. D. Dunlap, Scanning tunneling microscopy of DNA // IEEE engenering in medecine and biology, — 1996, — v. 15, — №1, — pp. 46-50.

56. R. Guckenberger, M. Heim, G. Cevc, H. F. Knapp, W. Wiegrabe, and A. Hillebrand, Scanning tunneling microscopy of insulators and biological specimens based on lateral conductivity of ultrathin water films// Science, — 1994, — v. 266, — pp. 1538-1540.

57. Д. В. Клинов, Исследование биополимеров методами сканирующей зондовой микроскопии. Автореф. дис. . канд. физ.-мат. наук, МФТИ, — М., 1997. — 20с.

58. Z. Shao, J. Mou, D. M. Czajkowsky, J. Yang, and J.-Y. Yuan, Biological atomic force microscopy: what is achieved and what is needed// Advances in Physics, — 1996, — v. 45, — №1, — pp. 1-86.

59. H. Herz, // J. Reine Angew. Math., — 1882, — v. 92, — pp. 156.

60. Л. Д. Ландау, Е. M. Лифшиц, Теория упругости, — т. VII серии Теоретическая физика. — М.: Наука, 1987. — 246с.

61. Физические величины1, справочник. — М.: Энергоатомиздат, 1991. — 1231с.

62. Г. Б. Двайт, Таблицы1 интегралов. — М.: Наука, 1973. — 228 с.

63. Н. С. Бахвалов, Н. П. Жидков, Г. М. Кобельков, Численныгеметодыг.1. М.: Наука, 1987. — 598 с.

64. G. Binnig, Force microscopy// Ultramicroscopy, — 1992, — v. 42-44,pp. 7-15.

65. V. Koutsos, E. Manias, G. ten Brinke, and G. Hadziioannou, Atomic force microscopy and real atomic resolution. Simple computer simulations//Europhys. Lett., — 1994, — v. 26, — №3, — pp. 103-107.

66. S. Banerjee, M. K. Sanyal, and A. Datta, A simulation study of multi-atom tips and estimation of resolution in atomic force microscopy// Applied surface science, — 1996, — v. 99, — №3, — pp. 255-260.

67. K. L. Westra and D. J. Thomson, Atomic force microscopy tip radius needed for accurate imaging of thin film surfaces// J. Vac. Sci. Technol. B, — 1994, — v. 12, — №6, — pp. 3176-3181.

68. А. А. Бухараев, Д. В. Овчинников, А. А. Бухараева, Диагностика поверхности с помощью сканирующей силовой микроскопии // Заводская лаборатория, — 1997, — №5, — сс. 10-27.

69. V. J. Garcia, L. Martinez, J. M. Briceno-Valero, and C. H. Schilling, Dimensional metrology of nanometric spherical particles using AFM: II, application of model — tapping mode// Probe Microscopy, — 1998,v. 1, — №2, — pp. 117-125.

70. K. L. Westra, A. W. Mitchell, and D. J. Thomson, Tip artifact in atomic-force microscope imaging of thin film surfaces // J. Appl. Phys., — 1993,v. 74, — №5, — pp. 3608-3610.

71. J. S. Villarrubia, Morphological estimation of tip geometry for scanned probe microscopy// Surface Science, — 1994, — v. 321, — №3, — pp. 287-300.

72. Y. F. Drygin, O. A. Bordunova, M. O. Gallyamov, and I. V. Yaminsky, Atomic force microscopy examination of TMV and virion RNA// FEBS letters, — 1998, — v. 425, — pp. 217-221.

73. H. G. Hansma, I. Revenko, K. Kim, and D. E. Laney, Atomic force microscopy of long and short double-stranded, single-stranded andtriple-stranded nucleic acids// Nucleic Acids Research, — 1996, — v. 24, — №4, — pp. 713-720.

74. R. G. Milna, // in Principles and Techniques in Plant Virology (C. I. Kado and Н. O. Agrawal, eds.), — pp. 76-128, — New York: VNR, 1972.

75. A. Nicolaieff, G. Lebeurier, M.-C. Morel, and L. ffirth, The uncoating of native and reconstituted TMV by dimethylsulphoxide: the polarity of stripping// J. gen. Virol., — 1975, — v. 26, — pp. 295-306.

76. L. E. Blowers and T. M. A. Wilson, The effect of urea on TMV: polarity of disassembly// J. gen. Virol., — 1982, — v. 61, — №1, — pp. 137-141.

77. R. ^gue and A. Asselin, Polyacrylamide-agarose gel electrophoresis of tobacco mosaic virus disassembly intermediates// Can. J. Botany, — 1984, — v. 62, — pp. 2236-2239.

78. Н. J. Vollenweider, J. M. Sogo, and T. Koller, // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., — 1975, — v. 72, — pp. 83.

79. G. Lebeurier, A. Nicolaieff, and K. E. Richards, Inside-out model for self-assembly of tobacco mosaic virus (electron microscopy) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, — 1979, — v. 74, — №1, — pp. 149-153.

80. L. S. Lerman, The polymer- and salt-induced condensation of DNA. Physico-chemical properties of the nucleic acids, — London: Academic Press, 1973.

81. L. S. Lerman, A transition to a compact form DNA in polymer solution// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, — 1971, — v. 68, — pp. 18861890.

82. L. C. Gosule and J. A. Schellmann, Compact form of DNA induced by spermidine// Nature, — 1976, — v. 259, — pp. 333-335.

83. D. K. Chattoraj, L. C. Gosule, and J. A. Schellmann, DNA condensation with polyamines. II. Electron microscopic studies// J. Mol. Biol., — 1978, — v. 121, — pp. 327-337.

84. R. Marquet, A. Wyart, and C. Houssier, Influence of DNA length on spermine-induced condensation. importance of the bending and stiffening of DNA// Biochemica et Biophysica Acta, — 1987, — v. 909,pp.165-172.

85. Y. Y. Vengerov, L. P. Martinkina, and T. E. Semenov, Electron microscopic study of compaction of individual DNA molecules with histone Hl in surface films //FEBS, — 1993, — v. 322, — №3, — pp. 311314.

86. S. M. Mel'nikov, V. G. Sergeyev, and K. Yoshikawa, Transition of double-stranded DNA chains between random coil and compact globule states induced by cooperative binding of cationic surfactant// J.Am. Chem. Soc., — 1995, — v. 117, — pp. 9951-9956.

87. S. M. Mel'nikov, V. G. Sergeyev, and K. Yoshikawa, Discrete coil-globule transition of large DNA induced by cationic surfactant// J. Am. Chem. Soc., — 1995, — v. 117, — pp. 2401-2408.

88. R. W. Wilson and V. A. Bloomfield, Counterion-induced condensation of deoxyribonucleic acid: a light-scattering study// Biochemistry, — 1979, — v. 18, — pp. 2192-2196.

89. V. A. Bloomfield, Condensation of DNA by multivalent cations: Consideration on mechanism// Biopolymers, — 1991, — v. 31, — pp.1471-1481.

90. I. Baeza, P. Gariglio, L. M. Rangel, P. Chavez, L. Cervantes, C. Arguello, C. Wong, and C. Montanez, Electron microscopy and biochemical properties of polyamine-compacted DNA// Biochemistry,1987, — v. 26, — pp. 6387-6393.

91. S. A. Allison, J. C. Herr, and J. M. Schurr, Structure of viral ^29 DNA condensed by simple triamines: A light-scattering and electron-microscopy study// Biopolymers, — 1981, — v. 20, — pp. 469-488.

92. Y. Fang and J. H. Hoh, Early intermediate in spermidine-induced DNA condensation on the surface of mica// JACS, — 1998, — v. 120, — №35,pp.8903-8909.

93. D. D. Dunlap, A. Maggi, M. R. Soria, and L. Monaco, Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery// Nucl. Acids. Res., — 1997, — v. 25, — pp.3095.

94. J. Widom and R. L. Baldwin, Cation-induced toroidal condensation of DNA: studies with Co3+(NH3)6// J. Mol. Biol., — 1980, — v. 144, — pp.431-453.

95. О. А. Пышкина, Комплекш ДНК-ПАВ в малополярныгх органических растворителях. Автореф. дис. . канд. хим. наук, МГУ, 1997.22 с.

96. Е. Д. Щукин, А. В. Перцов, Е. А. Амелина, Коллоидная химия. — М.: Высшая школа, 1992. — 414 с.

97. С. И. Васильев, Ю. Н. Моисеев, Н. И. Никитин, С. В. Савинов, И. В. Яминский, Сканирующий туннельный микроскоп «СКАН-8»: конструкция и области применения// Электронная промышленность,1991, — №3, — сс. 36-39.

98. V. Y. Uvarov, Y. D. Ivanov, A. N. Romanov, M. O. Gallyamov, O. I. Kiselyova, and I. V. Yaminsky, Scanning tunneling microscopy study of cytochrome P-450 2B4 incorporated in proteoliposomes // Biochimie,1996, — v. 78, — pp. 780-784.

99. K. Deguchi and J. Mino, Solution properties of long-chain dialkyldimethyl ammonium salts// Journal of Colloid and Interface Science, — 1978, — v. 65, — №1.

100. V. G. Sergeyev, S. V. Mikhailenko, O. A. Pyshkina, I. V. Yaminsky, and K. Yoshikawa, How does alcohol dissolve the complexes of DNA with a surfactant// JACS., — 1999. (in press).

101. I. Langmuir, // JACS, — 1917, — v. 39, — pp. 1848.

102. M. Джейкок, Д. Парфит, Химия поверхностей раздела фаз. — М.: Мир, 1984. — 269 с.

103. K. B. Blodgett and I. Langmuir, // Phys. Rev., — 1937, — v. 51, — pp. 964.

104. K. Kobayashi, K. Taklaoka, and S. Ochiai, // Thin Solid Films, — 1988, — v. 159, — pp.267.

105. A. L. Rogach, L. Katsikas, and A. Kornowsky, // Ber. Bunsenges. Phys. Chem., — 1996, — v. 100, — pp. 1772.

106. Y. Fang and J. Yang, Role of the bilayer-bilayer interaction on the ripple structure of supported bilayers in solution// J. Phys. Chem., — 1996, — v. 100, — №38, — pp. 15614-15619.

107. W. A. Ducker and E. J. Wanless, Surface-aggregate shape transformation// Langmuir, — 1996, — v. 12, — №24, — pp. 59155920.

108. S. Manne and H. E. Gaub, Molecular organization of surfactant at solid-liquid interfaces// Science, — 1995, — v. 270, — pp. 1480-1482.

109. C. Е. Бреслер, Введение в молекулярную биологию. — М., Ленинград: Наука, 1966. — 512 с.

110. Э. Зенгуил, Физика поверхности. — М.: Мир, 1990. — 536 с.

111. И. Ф. Люксютов, А. Г. Наумовец, В. Л. Покровский, Двумерные кристаллы. — Киев: Наукова думка, 1988. — 218 с.

112. А. И. Китайгородский, Органическая кристаллохимия. — М.: Изд-во АН СССР, 1955. — 558 с.

113. А. И. Китайгородский, Молекулярные кристаллы. — М.: Наука, 1971. — 424 с.

114. D. L. Dorset and B. K. Annis, Lamellar order and the crystallization of linear chain solid solution// Macromolecules, — 1996, — v. 29, — №8, — pp.2969-2973.

115. J. P. K. Peltonen, P. He, and J. B. Rosenholm, Order and defect of Langmuir-Blodgett films detected with the atomic force microscopy// J.Am. Chem. Soc., — 1992, — v. 114, — pp. 7637-7642.

116. M. Florsheimer, A. J. Steinfort, and P. Gunter, Lattice constant of Langmuir-Blodgett films measured by atomic force microscopy// Surface Science Letters, — 1993, — v. 297, — pp. L39-L42.

117. D. K. Schwartz, R. Viswanathan, and J. A. N. Zasadzinski, Coexisting lattice structures in a Langmuir-Blodgett film identified by atomic-force microscopy// Langmuir, — 1993, — v. 9, — pp. 1384-1391.

118. R. Viswanathan, J. A. Zasadzinski, and D. K. Schwartz, Spontaneous chiral symmetry breaking by achiral molecules in a Langmuir-Blodgett film// Nature, — 1994, — v. 368, — pp. 440-443.

119. J. A. Zasadzinski, R. Viswanathan, L. Madsen, J. Garnaes, and D. K. Schwartz, Langmuir-Blodgett films// Science, — 1994, — v.263, — pp.1726-1732.

120. A. Schaper, L. Wolthaus, D. Mobius, and T. M. Jovin, Surface morphology and stability of Langmuir-Blodgett mono- and multilayers of saturated fatty acids by scanning force microscopy// Langmuir, — 1993, — v. 9, — №8, — pp. 2178-2184.

121. T. Kajiyama, Y. Oishi, F. Hirose, K. Shuto, and T. Kuri, Direct observation of molecular arrangements in fatty acid monolayers with an atomic force microscope// Langmuir, — 1994, — v. 10, — №4, — pp.1297-1299.