Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства

Хомякова, Елена Алексеевна

Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Хомякова, Елена Алексеевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства»

Автореферат диссертации на тему "Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Синтез и свойства"

МОСКОВСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫМ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Хомякова Елена Алексеевна

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2-ДИОЛЬНЫЕ, АЛЬДЕГИДНЫЕ И ГИДРАЗИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА

02.00.10-биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

005009216

да,/-/'

2 0ЕВ шг

МОСКВА-2012

005009216

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Орецкая Татьяна Семёновна

кандидат'химических наук Зубин Евгений Михайлович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Формановскйй Андрей Альфредович

кандидат химических наук Хандажииская Анастасия Львовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится 28 февраля в 16.00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном ; университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 27 января 2012 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Смирнова И.]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Модифицированные производные нуклеиновых кислот (НК) широко используются в молекулярной биологии и медицинских исследованиях, так как обладают уникальными свойствами, в том числе, способностью регулировать экспрессию генов, избирательно связываясь с белками и комплементарными последовательностями ДНК и РНК.

Одним из направлений исследований в химии нуклеиновых кислот является разработка методов синтеза и изучение свойств 2'-модифицированных олигонуклеотидов, содержащих в своем составе химически активные группировки. Использование таких производных для получения конъюгатов с различными молекулами представляется перспективным подходом для направленного изменения свойств НК-фрагментов. Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова была разработана стратегия синтеза реакционноспособных производных ДНК, в рамках которой предложены эффективные методы синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих амино-, карбоксильную, 1,2-диольную и альдегидную группы.

Успешное использование данного синтетического подхода позволяет продолжить создание способов получения новых химически активных производных ДНК, что является актуальной задачей химии нуклеиновых кислот. Кроме того, важным представляется разработка методов синтеза новых реакционноспособных аналогов РНК, так как число работ, посвященных синтезу таких соединений, ограничено.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методов синтеза модифицированных производных ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Отдельной частью работы было изучение физико-химических свойств олигонуклеотидов и характера их взаимодействия с различными низкомолекулярными соединениями и биомолекулами.

Основными этапами работы были: а) синтез олигодезокси- и олигорибонуклеотидов, содержащих диольные, альдегидные и гидразидные группировки; б) исследование физико-химических свойств 2'-диольных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов; в) изучение закономерностей ковалентного связывания 2'-альдегидных олигонуклеотидов с ДНК- и РНК-узнающими белками, на примере ДНК-метилтрансферазы БэоП (М.ЭзоП) и белка бактериальной рибонуклеазы Р, и оценка перспективности их использования для аффинной модификации; г) разработка методики конъюгации олигонуклеотидов, содержащих гидразидные группировки, с карбонильными соединениями для дальнейшего получения новых НК-производных с заранее заданными свойствами. Необходимым этапом было сравнение результатов исследования 2'-диоксоазапентильных производных с данными, полученными для 2'-оксоэтильных аналогов в рамках настоящей и предшествующих работ.

Научная новизна и практическая значимость работы. С использованием 3'-амидофосфита 2'-0-[2-(2,3-диацетоксипропил)амино-2-оксоэтил]-5'-0-(4,4'-диметокситри-тил)-Л'3-пивалоилоксиметилуридина впервые синтезированы модифицированные олигорибонуклеотиды, содержащие в 2'-положении углеводного фрагмента 1,2-диольные и альдегидные группировки. Встраивание в олигонуклеотидную цепь модифицированных

остатков уридина, содержащих 1,2-диольные группировки, существенно не влияет на термическую стабильность ДНК-, РНК- и гибридных дуплексов.

В настоящей работе впервые изучено взаимодействие 2'-диоксоазапентильных ДНК- и РНК-производных с метилтрансферазой SsoII и белком бактериальной РНКазы Р, соответственно. Проведено сравнительное исследование свойств альдегидных олигонуклеотидов нового типа и 2'-оксоэтильных производных, описанных ранее. Данные, полученные при проведении кросс-линкинга в присутствии ДНК-конкурентов, показывают, что реакция 2'-альдегидных дуплексов с метилтрансферазой SsoII носит неизбирательный характер, что свидетельствует о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания химической реакции или о возможном наличии двухстадийного механизма узнавания белком ДНК-лиганда. Следует отметить, что различие в строении модифицированных звеньев не сказывается на специфичности взаимодействия ДНК-дуплексов с M.SsoII.

В представленной работе предложен новый эффективный метод получения 2'-гидразидных производных ДНК и РНК. Показано, что 2'-гидразидные олигонуклеотиды могут быть успешно применены для конъюгации с различными ароматическими и алифатическими альдегидами.

Полученные результаты могут быть использованы для создания новых типов биологически активных производных нуклеиновых кислот. Разработка методов синтеза и изучение свойств 2'-модифицированных альдегидных и гидразидных олигонуклеотидов способствует дальнейшему развитию методов конъюгации биомолекул с различными соединениями. Альдегидные производные РНК могут применяться для присоединения пептидов и белков, что может использоваться для эффективной и адресной доставки малых интерферирующих РНК в клетки и ткани. Кроме того, встраивание модифицированных олигорибонуклеотидов в протяженную молекулу РНК позволяет вводить в состав нуклеиновой кислоты разнообразные функциональные группировки. Такие протяженные РНК, содержащие химически активные или репортерные группы, могут быть применены для решения различных задач молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в российском и международном периодических изданиях. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Spring-Meeting and Workshop "Protein-protein interactions" of International Research Training Group, 09.03.-12.03.2008, Rauischholzhausen, Germany; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11.05.15.05.2008, Новосибирск, Россия; Workshop "Enzyme and enzyme complexes acting on nucleic acids" of International Research Training Group, 16.05.-19.05.2010, Vilnius, Lithuania; Sixth Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology, 04.09.-07.09.2011, Queens' College Cambridge, UK.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного современным методам исследования структуры белково-нуклеиновых комплексов, обсуждения результатов, экспериментальной части,: приложения, выводов и списка цитируемой литературы (251 ссылка), содержит 29 рисунков, 16 схем, 17 таблиц.

Работа выполнена при поддержке программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Одним из направлений исследований в химии нуклеиновых кислот является разработка методов синтеза олигонуклеотидов, содержащих в своем составе химически активные группировки. Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова были разработаны эффективные методы получения 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных олигодезоксирибонуклеотидов -производных нуклеиновых кислот, содержащих в 2'-положении углеводного фрагмента альдегидную группу роНппауа, Ы.й. е1 а!., 2009]. Такие реакционноспособные аналоги применялись для получения конъюгатов с различными низкомолекулярными соединениями и для исследования закономерностей ковалентного связывания с ДНК-узнающими белками.

Для получения 2'-альдегидных производных ДНК в олигомерную цепь в процессе автоматического твердофазного синтеза встраивают соединение-предшественник, содержащее 1,2-диольную группировку, которую в дальнейшем окисляют до альдегида периодатом натрия (схема 1).

Схема 1

Л "о1 У Н1 » "о!)

гбК.У олигануклеотидный . гГ^и' .... «8« п^кг РМТгО^\^Оу синтез ^

, б Ь-г ыс ^ Ь-2 и'б 'о-г 'о-г

ЛЧ^ но^он - Г"

см

1а,Ь V 2а,Ь За (и") 4а<и°)

ЗЬ (ий*°) 4Ь (и"«)

а: г = -СН2-; Р1 = Н; И2 = Вг;

Ь : г= -СН2СОЫНСН2-; Я' = пивалоилоксиметил; = Ас;

Р3, К4 = фрагменты защищенных олигодезоксирибонуклеотидных цепей;

Я5, ^ = фрагменты олигодезокскрибонуклеотидных цепей " - '

В рамках настоящей работы данная синтетическая схема была взята за основу, а затем соответствующим образом модифицирована для разработки методов синтеза новых 2'-альдегидных олигорибонуклеотидов и 2'-гидразидных ДНК- и РНК-производных. Основной особенностью предложенного в данной работе подхода является возможность использования З'-амидофосфита 1Ь для получения последовательно 1,2-диольных, альдегидных и гидразидных аналогов ДНК и РНК за счет комбинирования приемов твердофазного олигонуклеотидного синтеза и методик постсинтетической модификации фрагментов нуклеиновых кислот.

Следует отметить, что в то время как в литературе описано достаточно много способов получения производных ДНК, содержащих альдегидные группы, число подходов к синтезу модифицированных РНК такого типа ограничено. Основным из них является окисление З'-концевого звена, которое приводит к образованию реакционноспособной диальдегидной группировки. К недостаткам данного подхода можно отнести формирование нескольких продуктов в реакциях с аминосодержащими соединениями. В

этой связи актуальным представляется разработка новых методов синтеза 2'-альдегидных производных РНК.

1. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении 1,2-диольные н альдегидные группировки

Синтез модифицированных ДНК-фрагментов, содержащих 1,2-диольные группировки, осуществляли в рамках метода, представленного на схеме 1.

Для получения модифицированных РНК-производных использовали аналогичный подход, основными преимуществами которого являются простота и универсальность, так как модифицированный 3*-амидофосфит 1Ь встраивается в олигорибонуклеотидную цепь без существенного изменения стандартного регламента (схема 2).

Для получения олигорибонуклеотидов в твердофазном синтезе использовали 0.1 М растворы стандартных З'-амидофосфитов 2'-0-тре/и-бутилдиметилсилильных производных рибонуклеозидов и 0.2-0.5 М раствор модифицированного амидофосфита Ib в абсолютном ацетонитриле и синтетический цикл, в котором время присоединения модифицированного звена к растущей цепи увеличивали до 30-60 мин. В этих условиях степень превращения на стадии конденсации, определенная по оптическому поглощению диметокситритил-катиона, составляла приблизительно 95-97%.

Необходимым шагом после завершения твердофазного синтеза является деблокирование полученных РЖ-фрагментов. Для решения этой задачи мы исследовали возможность использования двух вариантов: 1) обработка смесью концентрированного водного аммиака и этанола (3:1, v/v) в течение 17 ч при 25°С; 2) обработка смесью концентрированного водного аммиака и 40%-ного водного метиламина (1:1, v/v) (AMA) в течение 40 мин при 65°С. Удаление тярет-бутилдиметилсилильных защитных групп осуществляли тригидрофторидом триэтиламина по стандартной методике. Необходимо подчеркнуть, что используемые для защиты имидной и 1,2-диольной группировок амидофосфита Ib пивалоилоксиметильная и ацетильные группы успешно удаляются в процессе деблокирования под действием аммиака или AMA. Тем не менее, второй способ предпочтителен из-за меньшего времени обработки. Таким образом, был предложен метод получения 1,2-диольных олигорибонуклеотидов.

Схема 2

R1, R2 = фрагменты защищенных олигорибонуклеотидных цепей; R3, R4 = фрагменты олигорибонуклеотидных цепей

Для решения поставленных задач нами был синтезирован ряд модифицированных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина (и11") (табл. 1). Строение полученных олигонуклеотидов подтверждали данными масс-спектрометрии МА1Л51-ТОР.

Таблица 1. Данные масс-спектрометрии модифицированных олигонуклеотидов.

№ Олигонуклеотидная последовательность (5'->3') МАЬШ-ТОР Мв, вычисл ./найден.

I с1(АССТТССи<|'",ООСТАТГСАСТСС) 6522.2/6522.1

II с1(ослсстсаолАи'Ьоетсссстст) -

III с!(АТСААААСАООАСАААТи'"",ОТССТААААССАА) -

IV ¿(СОЛи^ТТСООССТАТТООТ) 5630.7/5630.8

V (1(ОСАи'"0ТСТАОТТСТСОТТТСТСС) 6872.5/6872.6

VI г(ОАи""АОАиОАииАССОССОСАОиАСОАООСОСА) 10497.4/10498.0

VII г(ОАиАаАи'"°ОАииАССОСССОАСиАСОАСССССА) 10497.4/10496.0

VIII г(ОАиАОАШАи'"">иАССОССООАОиАСОАООСОСА) 10497.4/10497.0

IX г(ОАиАОАиОАии""°АССОССООАСиАСОАООСОСА) 10497.4/10496.0

X г(ОииААиСАиОСиСОООиААиСОСиССООССООиии'""'С) 11627.9/11628.0

XI г(ШОи'",0АОСООСАССОТСССОАА) 6859.2/6858.5

XII г(0ииААиСАиССиС0а0иААи'1"°СССиСС) 8413.1/8410.6

XIII г(аииААиСАШСиСОООиААиСОСиа"0ОС) 8413.1/8410.6

XIV г(ОииААиСАиОСиССООиААи"мСОСиО)ёС 8397.1/8396.2

XV г(0ииААиСАиССиС00СиААиС0Си|1"°0)<1С 8397.1/8399.7

XVI г(ОШААи,|"0САиОСиССОСиААиСОСиО)аС 8397.1/8400.3

XVII г(АССииССи"*0СОСиАииОАСиО)ёС 6742.1/6745.5

XVIII г(ОСАОСОАииАССССи'""'ОСАШАииАА)с1С 8403.1/8403.4

Для получения альдегидсодержащих производных ДНК и РНК проводили окисление 1,2-диольной группировки в составе олигонуклеотидов под . действием периодата натрия в течение 1 ч при 25°С (схема 3).

Схема 3

а о

нЛ нЛ

]—{ рН 4.0-4.5 \—{

йг<5 о ч ягб о \

он

он н

в 7

К1, ^ - фрагменты олигодезокси- или олигорибонуклеотидных цепей

2. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положе11ии гидразидную группировку

Задачей данной части исследования являлась разработка метода синтеза 2'-гидразидных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов - аналогов, содержащих

реакционноспособную нуклеофильную группировку, для дальнейшего получения с их помощью новых НК-производных с заранее заданными свойствами. В литературе описано два основных метода получения гидразидных олигонуклеотидов. Первый предполагает встраивание в олигонуклеотидную цепь в процессе твердофазного автоматического синтеза модифицированного амидофосфита, содержащего гидразидную группировку. Второй вариант - постсинтетическая модификация олигонуклеотида с помощью соединения, в состав которого входит остаток гидразида.

В настоящей работе для получения 2'-гидразидных производных ДНК и РНК был использован второй подход. Олигодезокси- и олигорибонуклеотиды (I, IV, V, Х1У-ХУ1, XVIII), содержащие 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридин, обрабатывали периодатом натрия для получения 2'-альдегидной группировки (схема 4). Для последующего превращения альдегидной группы в гидразидную к 2'-альдегидным олигонуклеотидам 7 добавляли дигидразид янтарной кислоты в присутствии полярного апротонного растворителя диметилсульфоксида (ДМСО) и проводили реакцию в течение 18 ч при комнатной температуре (рН 4.0-4.5). Образовавшиеся в результате реакции гидразоны 8 восстанавливали цианборгидридом натрия в течение 30 мин при 25°С.

Схема 4

о о о о

нкА нЛ о Н нЛ Н1Г

й'й ь—у 1?!6 ь-\ Ь^ я!б Ь-

>-ж он о >-Нн

о 4—( о ^ I

^—он Н

л\

Р1. Г?2 = фрагменты олигодезокси- или олигорибонуклеотидных цепей

В результате были получены модифицированные олигонуклеотиды, содержащие остатки 2'-0-(2-((2-(2-(4-гидразинил-4-оксобутаноил)гидразинил)зтил)амино)-2-оксоэто-кси)уридина (иь). Степень превращения, определенная методом обращено-фазовой ВЭЖХ, составляла 70-80%. Строение ряда полученных олигонуклеотидов подтверждали данными масс-спектрометрии МАЬБЬТОР (табл. 2).

Таблица 2. Данные масс-спектрометрии модифицированных олигонуклеотидов.

№ Олигонуклеотидная последовательность (5*—>3') ¡\lALDI-TOF МБ, вычисл ./найден.

XIX ассалиТгсоссстАТтсет) 5728.8/5727.9

XX ¿(ОСАи'ТСТАСТТСТОСТТТСТСС) -

XXI [1(АССТТССи,,ООСТАТТСАСТСС) -

XXII г(ОЦиААи1,САиОСиСОООиААиСОСШ)с1С 8495.2/8494.9

XXIII г(ОСАОСОАШАСССОи|,ОСАиОАииАА)с1С 8501.2/8501.4

XXIV г(ОШААиСАиОСиСОООиААи',СОС1га)с1С -

XXV г(ОииААиСАиОСиСОООиААиСССи|,С)(1С -

Таким образом, был предложен эффективный метод получения 2'-гидразидных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов, основанный на периодатном окислении 1,2-диольной группы и дальнейшем превращении 2'-альдегида в гидразид с использованием дигидразида янтарной кислоты.

3. Физико-химические свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-диг11дроксипроп11л)амино-2-оксоэт11л]уридина

Термическую стабильность дуплексов А-Н, образованных ^модифицированными и модифицированными олигонуклеотидами с комплементарными ДНК- или РНК-матрицами, определяли путем регистрации изменений УФ-поглощения исследуемого образца от температуры (табл. 3). Термическую стабильность дуплексов С и D изучим по изменению флуоресценции красителя SYBR Green I.

Таблица 3. Термическая стабильность ДНК-, РНК- и РНК-ДНК-дуплексов.

Шифр ДНК-, РНК-, РНК-ДНК-дуплекс (5'->373'->5') тпл(±1),°с h26o (±1),%

А d(ACGTTCCTGGCTATTGACTGC) d(TGCAAGGACCGATAACTGACG) 70 25

В I d(ACGTTCCOaaoGGCTATTGACTGC) d(TGCAAGGA—CCGATAACTGACG) 68 25

С d(ATСAAAACAGGACAAAT T GTССTAAAACСAA) d(TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT) 76 -

D III d(ATCAAAACAGGACAAATÜaa°GTCCTAAAACCAA) d(TAGTTTTGTCCTGTTTAA—CAGGATTTTGGTT) 76 -

Е r(A---CGUUCCUGGCUAUUGACUG)dC T-r(GCAAGGACCGAUAACUGAC--G) 80 27

F XVII r(A---CGÜUCCOaaoGGCUAÜÜGACüG)dC T-r(GCAAGGA--CCGAUAACUGAC--G) 81 26

G r(ACGUUCCUGGCUAUUGACUG)dC d(TGCAAGGACCGATAACTGAC--G) 64 27

Н XVII r(ACGUUCCUaa°GGCUAUUGACUG)dC d(TGCAAGGA—CCGATAACTGAC--G) 65 26

Введение в состав олигонуклеотидов остатка 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина не вызывает заметной дестабилизации ДНК-, РНК- или смешанных РНК-ДНК-дуплексов. Температура плавления меняется в пределах 2°С, а величина гипохромного эффекта - в пределах 1% (табл. 3). Эти результаты согласуются с данными по изучению термической стабильности дуплексов, содержащих остатки 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина [¿^ерт, Т.Б. е1 а!., 2002].

Для изучения физико-химических свойств использовали 2'-диольные олигонуклеотиды, так как альдегидные аналоги могут быть нестабильны в условиях проведения эксперимента.

4. Взаимодействие метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими 2'-диольную и 2'-альдегидную группировки

Селективное взаимодействие е-аминогруппы остатков лизина белка с 2'-альдегидной группой в модифицированной ДНК приводит к образованию основания Шиффа, которое затем восстанавливают до вторичного амина цианборгидридом натрия (схема 5).

В ряде предыдущих работ [Dolinnaya, N.G. et al., 2009] была исследована возможность использования 2'-оксоэтильных олигонуклеотидов для аффинной модификации субъединицы р50 фактора транскрипции NF-кВ, эндонуклеазы рестрикции SsoII и метилтрансферазы SsoII. Было обнаружено, что 2'-оксоэтильная группировка в составе модифицированного нуклеотидного остатка, введенного в центральное положение участка узнавания ДНК, образует ковалентную связь с остатками лизинов, которые удалены от ДНК-узнающего центра белка при образовании специфического ДНК-белкового комплекса. В этой связи интересным представлялось оценить, каким образом использование 2'-диоксоазапентильного нуклеозида - модифицированного звена другого строения, влияет на эффективность и специфичность кросс-линкинга.

Схема 5

I-. „ Ur

1-1 ~ U'

Э0~Р=0 )—\

но он

- О 0-Z 0-Р=0 >-Н

1 о

I—« „ иг

.. о o-z о—р=о у-н 1 • о

Ura • Ade—

NaBH3CN

Ura • Ade—

О O-Z °0-Р=0 ^ NH

белок белок

1 = -СНГ или -СН2СОМНСН2-

М^оП может не только катализировать метилирование ДНК, но и выступать в качестве фактора транскрипции, который связывается с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации 8зо11. При этом происходит ингибирование собственного синтеза и активация транскрипции гена эндонуклеазы рестрикции ЗвоП. Основное число контактов с М^оП обеспечивает локализованный внутри промоторной области 15-звенный инвертированный повтор (регуляторный участок).

Перед изучением ковалентного связывания необходимо было исследовать влияние введения модифицированного звена в ДНК на комплексообразование с М^оН. Для этой цели использовали 2'-диольные олигонуклеотиды, так как альдегидные аналоги проявляют высокую реакционную способность, и в этом случае оценить эффективность образования специфического комплекса не представляется возможным из-за параллельного протекания химической реакции. Степень связывания немодифицированного ДНК-дуплекса С, содержащего регуляторный участок, составляла 78%. Введение модифицированных звеньев - 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина (и*"0) и 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина (и11), в состав ДНК-дуплексов Б (табл. 3) и J (54 АТСААААСАСОАС АААТи"ОТССТААААССАА-3 73 '-ТАСТТТТСТССТОТТТААСАСО АТТТГСОТТ-5'), соответственно, снижает эффективность образования специфического комплекса с М^эоП примерно в 1.5 раза. Это может быть связано с тем, что согласно модели рСшу^ша, А.Э. е1 а1., 2003] модифицированные нуклеотидные остатки находятся в месте предполагаемых контактов с белком, а также, по-видимому, вызывают локальные изменения структуры двойной спирали. Степень связывания фермента с дуплексом К (5'-ССАССТССОААи|1'">ОТССССТСТ-3 73 '-САСССТТТСАСССОАСАТС^'), не содержащим участок узнавания, составляет 3%.

Для изучения ковалентного связывания М.ЭзоП с 2'-альдегидными производными ДНК нами были сконструированы олигонуклеотидные дуплексы Ь-О, содержащие остатки 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина (и<|*р) или 2'-0-(2-оксоэтил)уридина (и") в определенных положениях олигонуклеотидной цепи (табл. 4). Место введения модификации, как и в случае 2'-диольных олигонуклеотидов, было выбрано на основании предложенной модели.

Таблица 4. Эффективность ковалентного связывания ДНК-дуплексов с ДНК-метилтрансферазой ¿'¿о//.__

Шифр ДНК (5'—>373'—»5') Выход ДНК-белкового конъюгата", %

Ь ы ы ССАССТСССААО^СГССССТСТ САСССТТТ—САССССАСАТв 3

М М1 М2 АТСААААСАССАСАААТЦ^СТССТААААССАА ТАСТТТТбТССТЭТТТАА—САСбАТТТТССГТ 27

М1 АТСААААСАССАСАААТЦ^СТССТААААССАА 8

N N1 N2 АТСААААСАС6АСАААТи°СТССТААААССАА ТАСТТТТСТССТбТТТАА-САССАТТТТССГТ 40

N1 АТСААААСА6САСАААТи°6ТССТААААССАА 20

О 01 02 СТСССАСССи°САААТ САСССГСС6А-6ТТТА 4

Приведены средние значения, полученные не менее чем в трех независимых экспериментах. Ошибка измерений не превышала 15%. Регуляторный участок метилтрансферазы ЗяоН подчеркнут.

Отработку оптимальных условий получения ковалентно связанных комплексов M.SsoII с ДНК проводили с использованием дуплекса М (с регуляторным участком M.SsoII). Отношение концентраций ДНК и M.SsoII варьировали от 1:2 до 1:100. Наибольший выход продукта достигался при соотношении дуплекс - белок 1:100.

В табл. 4 приведена эффективность кросс-линкинга различных ДНК-лигандов с метилтрансферазой SsoII. Дуплексы М и N содержали регуляторный участок M.SsoII, дуплексы L и О не содержали участков узнавания и служили отрицательным контролем. Было показано, что при взаимодействии M.SsoII с ДНК-дуплексами М и N, содержащими регуляторный участок, выходы ДНК-белковых конъюгатов составляли 27 и 40%, соответственно (табл. 4, рис. 1). Неспецифические дуплексы L и О реагировали с более низкой эффективностью (выход продукта 3% и 4%, табл. 4). Одноцепочечные олигонуклеотиды М1 и N1 также образовывали конъюгаты с M.SsoII с выходами 8 и 20% (табл. 4), хотя их диольные аналоги - олигонуклеотиды III (табл. 1) и XXVI (5'-ATCAAAACAGGACAAATUdGTCCTAAAACCAA-3') не формировали комплекс с белком. Следует отметить, что в случае 2'-оксоэтильного ДНК-дуплекса N ковалентное связывание проходило с большей эффективностью. M.SsoII образует с ДНК-дуплексами три конъюгата с различной подвижностью в денатурирующем ПААГ (рис. 1), что связано, по-видимому, с взаимодействием нескольких молекул ДНК с различными остатками лизина мономера M.SsoII, расположенными в НК-узнающем центре или на поверхности белка.

Дуплекс L Дуплекс М Дуплекс О Дуплекс N

_ 86

Конъюгаты ^ «

ДНК-M.SsoII igpj

_ 26

Рис. 1. Радиоавтограф электрофоретического разделения в 12%-ном ПААГ в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН) продуктов ковалентного связывания М^эоИ с модифицированными ДНК-дуплексами Ь, М, О и N. Дорожки / - ДНК-дуплексы Ь, М, О, N в отсутствие белка. Дорожки 2 -ДНК-дуплексы Ь, М, О, N в присутствии М.ЗэоП. Положения белков-маркеров и их молекулярные массы в кДа указаны справа. (Маркеры предварительно окрашены синим хромофором.)

5. Изучение ингибирования реакции 2'-альдегидных фрагментов ДНК с метилтрансферазой вяоИ в присутствии ДНК-конкурентов

Образование ковалентной связи при взаимодействии М.ЭзоН со специфическими и неспецифическими ДНК-дуплексами может свидетельствовать о протекании реакции, как в составе специфического комплекса, так и вне его. Кроме того, наблюдается образование

конъюгатов с одноцепочечными олигонуклеотидами, не являющимися лигандами данного фермента. В этой связи необходимым представлялось детально изучить специфичность ковалентного связывания модифицированных фрагментов ДНК, содержащих регуляторный участок, с М.ЭбоП.

Кросс-линкинг 32Р-меченных модифицированных лигандов М и N с М.БэоП исследовался в присутствии возрастающих количеств немеченых ДНК-дуплексов (рис. 2). В роли последних выступали: а) немодифицированный ДНК-дуплекс С с участком узнавания; б) немодифицированный ДНК-дуплекс Р (5'-ОАТСАОТАСТААТТАССАТТА ТАААООАТСА-З 73' -СТАОТС АТСАТТААТССТААТАТТТССТАОТ-5') без участка узнавания; в) модифицированные ДНК-дуплексы Ь, О без участка узнавания. Такой подход является стандартным для определения специфичности ковалентного связывания НК с белком.

я н я

= £0 ж

"г

•В

I 040 £ 20

100 И--------

а.

■•♦•••с ■-»- р

.......-ж-

О 20 40 «0 80 100

Соотношение концентраций датиекс-конкурент/дуплекс М

Рис. 2. Зависимость относительного выхода ДНК-белковых конъюгатов от соотношения концентраций ДНК-конкурент/дуплекс М. Исследование ковалентного связывания М^оН с ДНК-дуплексом М, содержащим остаток и1|*р, в присутствии конкурентов С, Р и Ь; Р - ДНК-дуплекс, не содержащий участок связывания М.БбоИ; С - ДНК-дуплекс, содержащий регуляторный участок \1SsoII; Ь - реакционноспособный неспецифический ДНК-дуплекс, содержащий остаток и'1"1'. Ошибка измерений не превышала 15%. За 100% принимали максимальный выход комплекса ДНК-белок без добавления ингибитора.

Добавление в реакционную смесь немодифицированных конкурентов снижает выход конъюгата не более чем на 60%. Возможно, изменение характера кривой ингибирования и выход ее на плато при 40-60-кратных избытках конкурента связано с тем, что образование основания Шиффа происходит достаточно быстро, и дуплекс без модификации не способен эффективно конкурировать с 32Р-меченным модифицированным фрагментом ДНК. Снижение эффективности кросс-линкинга М.ЭзоН с ДНК-дуплексом М при добавлении в реакционную смесь немодифицированного неспецифического дуплекса Р, вероятно, происходит в результате электростатического взаимодействия большого избытка ДНК-конкурента с поверхностью белка. Наибольший ингибирующий эффект наблюдался при добавлении в инкубационную смесь реакционноспособного ДНК-

дуплекса без участка узнавания (рис. 2, кривая L). Аналогичный характер ингибирования ковалентного связывания наблюдался в случае 2'-оксоэтильных производных.

Неизбирательный характер взаимодействия M.SsoII с 2'-оксоэтильными и 2'-диоксоазапентильными дуплексами, может быть связан с тем, что реакция альдегидных групп олигонуклеотидов с E-аминогруппами остатков лизина происходит параллельно с формированием специфического комплекса ДНК-белок. Возможно, быстрое протекание химической реакции препятствует взаимодействию ДНК-связывающего белка со специфическим лигандом. Кроме того, подобный характер ингибирования может быть связан с тем, что химическая реакция происходит одновременно с протеканием первой стадии узнавания белком ДНК-лиганда в рамках двухстадийного механизма, когда более прочный специфический комплекс образуется на второй стадии. Подобный механизм показан для ряда белков, таких как репликационный белок А, ТАТА-связывающий белок, эндонуклеаза рестрикции EcoRV, метилтрансфераза EcoKI.

Обобщая полученные экспериментальные результаты, можно сделать вывод о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания химической реакции. Такой характер взаимодействия альдегидных производных ДНК с M.SsoII связан с тем, что активная группировка в составе ДНК-фрагмента реагирует не только с остатками лизина ДНК-узнающего центра после образования специфического комплекса, а с любыми доступными лизинами при столкновении молекул белка и ДНК в растворе. Невозможность различить продукты кросс-линкинга, образовавшиеся в рамках специфического комплекса и вне его, затрудняет применение 2'-альдегидных производных ДНК для структурно-биологических исследований.

Таким образом, нами были синтезированы производные ДНК, содержащие в своем составе остатки 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина. Впервые было изучено их взаимодействие с метилтрансферазой SsoII. Проведено сравнительное исследование свойств альдегидных олигонуклеотидов двух типов: 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных. В случае оксоэтильных дуплексов выходы продуктов ковалентного связывания были примерно в 1.5 раза выше. Однако различие в строении модифицированных звеньев не сказывается на специфичности взаимодействия ДНК-дуплексов с M.SsoII.

6. Ковалентное связывание 2'-альдегидных олигонуклеотидов с белком бактериальной рибонуклеазы Р

Для изучения свойств новых реакционноспособных олигорибонуклеотидов было проведено исследование взаимодействия 2'-альдегидных производных РНК с белком бактериальной рибонуклеазы Р.

Рибонуклеаза Р (РНКаза Р) in vivo формирует рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из одной субъединицы РНК и одной молекулы белка. Функцией данного фермента является каталитическое отщепление 5'-концевой последовательности пре-тРНК. В качестве модельного объекта для изучения особенностей ковалентного связывания использовали бактериальную рибонуклеазу Р, в состав которой входят РНК-компонента из Bacillus stearothermophilus и белок из Bacillus subtilis (Р-белок).

Данная часть работы была проведена в рамках совместных исследований с лабораторией профессора Роланда Хартмана, Университет имени Филиппа, Марбург, Германия.

При изучении ковалентного связывания РНК В. stearothermophilus с белком В. subtilis РНКазы Р в состав РНК-компоненты в одно из положений было встроено модифицированное звено (Udap), содержащее альдегидную группировку. Остаток 2'-диоксоазапентильного нуклеозида был включен в положения 20 или 24 РНК, непосредственно сближенные с Р-белком (рис. 3). Положения модификаций в РНК были выбраны на основе модели, предложенной в работе [Buck, А.Н. et al., 2005]. Модифицированное звено было также введено в положение 6 РНК, не контактирующее с белком (рис. 3). Такую РНК планировалось использовать в качестве отрицательного контроля.

Были предложены два метода формирования полноразмерной РНК, содержащей в своем составе модифицированное звено (рис. 3). Первый подход предполагал лигирование РНК-транскрипта -фрагмента РНК РНКазы Р из В. stearothermophilus, кодируемого геном гпрВ и не содержащего . 26 нуклеотидов с 5'-конца (Bstea-rapB[Al-26]), и модифицированного олигонуклеотида, содержащего 1,2-диольную группу, с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы на ДНК-матрице. Окисление диольной группировки до альдегидной предполагалось проводить после формирования полноразмерной РНК.

' 1

viri] i I: л

•u.ai.iio4j r,

~~1 + „.«..,;.,л _i •.■«•••

О IK.™*--

)

Лип

Олигонуклеотид

гибри

ос

ф г | г cv

Г4 г

U<J с оаи АС А

Шеа-гпрВ[Ы-26] (РНК-транскрипт)

Рис. 3. Формирование полноразмерной РНК В. з1еаго11гегторИИш. Остатки 1)|1ар, вовлеченные во взаимодействие с белком В. ¡иЫШэ РНКазы Р, выделены овалом (о). Квадратом (□) отмечен остаток и""", не контактирующий с белком согласно модели.

Второй способ получения полноразмерной РНК РНКазы Р основан на формировании комплекса между РНК-транскриптом и предварительно окисленным модифицированным олигонуклеотидом, содержащим на З'-конце дезоксирибонуклеотидное звено, за счет комплементационных взаимодействий в процессе гибридизации (рис. 3). С этой целью модифицированный или ^модифицированный олигонуклеотид добавляли к транскрипту В&ча.-гпрВ[Ь.\-26\ в соотношении 1:20, соответственно. Встраивание 2'-дезоксирибонуклеотида необходимо, чтобы не допустить образования 3'-концевой диальдегидной группировки в процессе периодатного окисления. Данный метод формирования полноразмерной РНК позволяет избежать лигирования и должен упростить

идентификацию аминокислотных остатков после проведения ковалентного связывания между РНК и белковой компонентой рибонуклеазы Р.

Анализ наблюдаемых констант скорости реакции ферментативного гидролиза пре-тРНК рибонуклеопротеиновыми комплексами РНКазы Р, содержащими лигированную и нелигированную РНК, показал, что вне зависимости от способа формирования структуры такие РНК проявляют активность в составе рибонуклеопротеинового комплекса, сопоставимую с активностью холофермента, содержащего РНК дикого типа. Введение модифицированного звена и"1"0 в состав РНК-компоненты не влияет на ферментативную активность РНКазы Р. В этой связи в дальнейшем для получения РНК-белковых конъюгатов полноразмерную РНК формировали за счет комплементационных взаимодействий.

Ковалентное связывание белка РНКазы Р с 2'-диоксоазапентильными олигонуклеотидами ХХУП-ХХ1Х (табл. 5, рис. 4) проводили в рамках метода, представленного на схеме 5 (соотношение олигорибонуклеотид - белок 1:100). Олигонуклеотид XXIX служил отрицательным контролем, так как в этом случае модификация, согласно предложенной модели, локализована в области, не взаимодействующей с белком (рис. 3).

В табл. 5 приведена эффективность кросс-линкинга различных РНК-лигандов, отличающихся положением модифицированного звена, с белком В. зиЬйШ рибонуклеазы Р.

Таблица 5. Эффективность ковалентного связывания РНК и ДНК-дуплексов с белком рибонуклеазы Р.

Шифр РНК-транскрипт Олигорибонуклеотид (5'—>3') или ДНК (5'—♦З'/З'—>5') Выход НК-белкового конъюгата*, %

XXVII + г (СииААиСАиССиССССиААЦ^РСССиО с!С 9

XXVII - г (СииААОСАиЗСиССССиААЦ^РСЕСиО с!С 6

XXVIII + г(сииААисАиссиссссиААпсссо^Ро'ас 8

XXVIII - г (СииААиСАиССиССССиААиСССО^РО а С 6

XXIX + г (СииААи^РСАШСиССбСиААиСССиС) с1С 9

XXIX - г (СииААО^РСАиССиССССиААиСССиО) <5С 5

ь - ССАССТСбСААи^ТССССТСТ САСССТТТ—САССССАСАТС 15

м - АТСААААСАССАСАААТиаарСТССТААААССАА ТАСТТТТСТССТбТТТАА—САССАТТТТССГТ 10

Приведены средние значения, полученные не менее чем в трех независимых экспериментах. Ошибка измерений не превышала 15%.

Было показано, что при взаимодействии Р-белка с РНК, сформированной из транскрипта с олигонуклеотидами XXVII и XXVIII, выходы РНК-белковых конъюгатов составляли 9 и 8%, соответственно (рис. 4). Применявшийся в качестве отрицательного

контроля олигонуклеотид XXIX, входящий в состав РНК РНКазы Р, реагировал с такой же эффективностью (выход продукта 9%, табл. 5). Кроме того, Р-белок образовывал конъюгаты с модифицированными одноцепочечными олигорибонуклеотидами XXVII-XXIX без добавления транскрипта Вз1еа-/"ирВ[Д1-26], что исключает формирование РНК-составляющей фермента и образования специфического РНК-белкового комплекса. Выходы продуктов ковалентного связывания Р-белка с олигонуклеотидами ХХУП-ХХ1Х снижались незначительно и составляли 5-6% (табл. 5). Из данных литературы известно, что Р-белок может взаимодействовать с короткими одноцепочечными фрагментами РНК или ДНК, однако, эффективность связывания с олигодезоксирибонуклеотидами значительно ниже, чем с РНК-фрагментами [ЭркгГаскп, С. е1 а!., 2000]. Кроме того, было обнаружено, что ДНК-дуплексы Ь и М, содержащие остаток 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина, также образовывали конъюгаты с Р-белком с выходами 10 и 15%, соответственно (табл. 5).

XXVII XXVIII XXIX

1 2 3 1 2 3 1 2 3 Р-белок - + + - + + - + +

РНК-транскрипт + + - + +- + +-

Рис. 4. Анализ методом электрофореза в 13%-ном ПААГ в присутствии ДСН продуктов ковалентного связывания белка В. яиЫШз РНКазы Р с модифицированными 32Р-меченными фрагментами РНК ХХУН-ХХ1Х. Олигорибонуклеотиды ХХУП-ХХ1Х в присутствии транскрипта Ъъ\е?1-гпрВ[М-26] (дорожки 1), в присутствии транскрипта ^\.са-гпрВ[М-26] и Р-белка (дорожки 2), в присутствии Р-белка (дорожки 3). Положения белков-маркеров и их молекулярные массы в кДа указаны справа. Представлен радиоавтограф геля.

Олигорибонуклеотид

Конъюгаты _

Р-белок-олигорибонуклеотид

170

_.130

Таким образом, нами были впервые синтезированы производные РЖ, содержащие в своем составе остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина, и изучено их взаимодействие в составе РНК-субъединицы Bacillus stearothermophilus с белком рибонуклеазы Р из Bacillus subtilis.

Данные, полученные при проведении кросс-линкинга, показывают, что реакция 2'-альдегидсодержащих олигорибонуклетидов с белком РНКазы Р носит неспецифический характер. По-видимому, как и для ДНК-узнающих белков, быстрое протекание химической реакции препятствует взаимодействию РЖ-связывающего белка со специфическим лигандом. Возможно, неизбирательное протекание химической реакции происходит также

на фоне низкой специфичности связывания Р-белка с РНК-лигандами в выбранных условиях.

Тем не менее, высокая реакционная способность полученных соединений позволит использовать их для получения конъюгатов с различными низкомолекулярными соединениями, которые направленно изменяют свойства НК-фрагментов. Кроме того, альдегидные производные РНК могут применяться для присоединения пептидов и белков для последующей эффективной и адресной доставки малых интерферирующих РНК в клетки и ткани.

7. Получение конъюгатов 2'-гидразидных олигонуклеотидов с карбонильными соединениями

В настоящее время получение конъюгатов олигонуклеотидов с различными молекулами представляется достаточно перспективным подходом к направленному изменению физико-химических и субстратных свойств фрагментов нуклеиновых кислот, что, в свою очередь, является необходимым условием для использования последних в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Перспективным подходом для получения конъюгатов олигонуклеотидов с различными молекулами является метод хемоселективного лигирования. В этом случае образование конъюгата происходит благодаря взаимодействию уникальной пары химически активных групп, избирательно реагирующих с высоким выходом за короткий промежуток времени. Примерами таких реакций могут выступать 1,3-диполярное циклоприсоединение по Хьюсгену, реакции Дильса-Альдера, Штаудингера, малеимидных производных с тиольными группами, а также реакция карбонильных соединений с различными нуклеофилами: гидразинами, гидразидами, аминоокси- и 1,2-аминотиольными соединениями.

Реакцию 2'-гидразидных олигонуклеотидов 9 с серией алифатических и ароматических альдегидов проводили в водном растворе (рН 4.5-5.5) или в смеси с ДМСО в течение 18 ч при 25°С. Образовавшийся в результате реакции гидразон 10 восстанавливали 50 мМ раствором №ВН3СМ в течение 30 мин при 25°С (схема 6). В случае ароматических альдегидов восстановление не требовалось, так как гидразоны, образованные ароматическими альдегидами, стабильны в широком интервале рН. Реакционные смеси анализировали методами гель-электрофореза в 20%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины или обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Схема 6

о о о

"А нЛ ■ нЛ

ксно ^

Ь—V Ц'б О-Л Ь-Д

>-ж У-мн

V О 0 ч—\

нм-ж ш-ш ны-ын

10 „ 0^4°

ны-жг ны-ын

Р1, Р2 = фрагменты олигодеэокси- или олигорибонуклеотидных цепей

Строение полученных конъюгатов 10 и 11 подтверждали данными масс-спектрометрии МАЬБЫОР (табл. 6). Степень превращения в среднем составляла 60-90%.

Анализ данных масс-спектрометрии (табл. 6) показывает, что в ряде случаев в процессе реакции образуется несколько продуктов, отличающихся по массе на 1, 2 или 3 алкильных или алкилиденовых остатка, что может быть связано с множественным алкилированием экзоциклических аминогрупп гетероциклических оснований.

Чтобы проверить это предположение, были проведены реакции немодифицированного олигонуклеотида той же последовательности, что и олигонуклеотид XX и других олигонуклеотидов случайной последовательности с 4-гидрокси-З-метоксибензальдегидом и пирен-1-карбальдегидом с добавлением или без добавления ИаВИзСК При анализе реакционных смесей методами обращенно-фазовой ВЭЖХ, гель-электрофореза в 20%-ном ПААГ, масс-спектрометрии МАЬШ-ТОК продуктов алкилирования гетероциклов обнаружено не было (данные не приведены).

Таблица б. Данные масс-спектрометрии конъюгатов 2 '-гидразидных олигонуклеотидов с низкомолекулярными соединениями._

Олигонуклеотид3 Присоединяемая молекула МАЬБ1-ТОР Мв, вычисл ./найден.

XIX 2-Гидрокси-1 -нафтальдегид 5884.9/5882.6

XIX Антрацен-9-карбальдегвд 5919.0/5918.6

XIX 4-Диметиламинокоричный альдегид 5888.0/5887.3 6047.2/6046.9е

XIX 3-(4-треш-Бутилфенил)пропаналь 5903.1/5903.5 6077.3/6075.4С 6251.6/6251У

XIX 4-Гидрокси-3-метоксибензальдегидь 5862.9/5862.6 6000.1/5997.1° 6135.2/6134.2'1

XIX 4-Гидрокси-З-метоксибензальдегид 6001.1/6000.2С 6137.2/6136.1"

XX Перилен-З-карбальдегид" 7232.9/7232.6

XX Пирен-1 -карбальдегид" 7182.8/7182.8

XXI Пирен-1 -карбальдегид" 6832.6/6832.1

XXII 4-Гидрокси-З-метоксибензальдегид 8631.3/8633.0 8767.5/8767.6°

XXIV Перилен-3 -карбальдегид5 8757.5/8758.5

XXV Пирен-1 -карбальдегид" 8707.4/8706.7

а нуклеотидная последовательность см. табл. 2; без восстановления NaBHзCN;с две алкильные или алкилиденовые группы; а три алкильные или алкилиденовые группы

В связи с этим можно предположить, что в процессе реакции протекает множественное алкилирование остатков гидразидов. Возможный механизм реакции представлен на схеме 7. Это может быть использовано для присоединения флуоресцентных молекул, когда множественное включение приводит к увеличению интенсивности сигнала.

Схема 7

I (—! /—. ГТСНО.Н1 ^Т

О—V НСНО.Н* О—\ МаВН3СИ О—к 2.ЫаВН3СМ

>"\Н -- >-\Н --->-№ ---¿-Ш

О I О х—ч О 1—\ о 4—ч

НМ-ЫН НЫ-ЫН НЫ-ЫН N—N4

НШ-МН НЫ-Ы НЫ-Ы

^-й ^-я

Я =■ алхильный или арильный остаток

Таким образом, было показано, что 2'-гидразидные олигонуклеотиды могут быть успешно применены для конъюгации с различными ароматическими и алифатическими альдегидами.

ВЫВОДЫ:

1. С использованием З'-амидофосфита 2'-0-[2-(2,3-диацетоксипропил)амино-2-оксоэтш1]-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-ЛЗ-пивалоилоксиметилуридина впервые синтезированы модифицированные олигорибонуклеотиды, содержащие в 2'-положении углеводного фрагмента 1,2-диольные и альдегидные группировки.

2. Показано, что встраивание в олигонуклеотидную цепь модифицированных остатков уридина, содержащих 1,2-диольные группировки, существенно не влияет на термическую стабильность ДНК-, РНК- и гибридных дуплексов.

3. Данные, полученные при проведении кросс-линкинга в присутствии ДНК-конкурентов, показывают, что реакция 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных дуплексов с метилтрансферазой ЭзоН носит неизбирательный характер, что свидетельствует о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания реакции между е-аминогруппой остатка лизина белка и альдегидной группировкой или о возможном наличии двухстадийного механизма узнавания белком ДНК-лиганда.

4. Ковалентное связывание 2'-диоксоазапентильных олигорибонуклеотидов с белком РНКазы Р носит неизбирательный характер, так как, по-видимому, быстрое протекание химической реакции препятствует специфическому взаимодействию белка с лигандом.

5. Предложен новый эффективный метод получения 2'-гидразидных производных ДНК и РНК. Показано, что 2'-гидразидные олигонуклеотиды могут быть успешно применены для конъюгации с различными ароматическими и алифатическими альдегидами.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях: Статьи

1. Хомякова Е.А.. Казанова Е.В., Зубин Е.М., Кубарева Е.А., Молочков Н.В., Рязанова Е.М., Орецкая Т.С. 2'-Альдегидные олигонуклеотиды. Синтез и применение для аффинной модификации ДНК-узнающих белков. // Биоорганическая химия (2010) 36, N3, С. 343-353.

2. Е.А. Khomvakova. Е.М. Zubin, I.P. Smirnov, G.E. Pozmogova, D.A. Stetsenko, T.S. Oretskaya. DNA or RNA oligonucleotide 2'-hydrazides for chemoselective click-type ligation with carbonyl compounds. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (2011) 30, N. 7-8. P. 577-584.

Тезисы конференций

1. Е.А. Khomvakova. Е.М. Zubin, I.P. Smirnov, G.E. Pozmogova, T.S. Oretskaya, D.A. Stetsenko. "DNA or RNA oligonucleotide 2'-hydrazides for chemoselective click-type ligation with carbonyl compounds", Sixth Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology, 04.09.-07.09.2011, Queens' College Cambridge, UK, Poster abstract 65.

2. E. Khomvakova. E. Zubin, N. Dolinnaya, L. Pavlova, E. Kubareva, R. Hartmann, Т. Oretskaya. "2'-Modified oligoribonucleotides: synthesis, properties and cross-linking with RNase P", Workshop "Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids" of the International Research Training Group Gießen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded), 16.05.-19.05.2010, Vilnius, Lithuania.

3. Е.А. Хомякова. E.B. Казанова, A.B. Качалова, Е.М. Зубин. '^'-Модифицированные олигонуклеотиды. Синтез и применение." // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11.05.-15.05.2008, Новосибирск, Россия, С. 159.

4. Орецкая Т.С., Ле Тхи Хиен, Ян Фань, Федотова Е.А., Хомякова Е.А. "Модифицированные олигонуклеотиды: химия и молекулярно-биологические исследования", IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11.05.-15.05.2008, Новосибирск, Россия, С. 151.

5. Е. Khomvakova. Е. Zubin, Е. Kubareva, S. Müller, R. К. Hartmann, Т. Oretskaya. "Synthesis of reactive 2'-aldehyde oligonucleotides for cross-linking with DNA methyltransferase SsoII and ribonuclease P", Spring-Meeting and Workshop "Proteinprotein interactions" of the International Research Training Group, 09.03.-12.03.2008, Rauischholzhausen, Germany, P. 6.

Подписано в печать: 26.01.2012

Заказ № 6554 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Хомякова, Елена Алексеевна, Москва

61 12-2/250

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Хомякова Елена Алексеевна

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2-ДИОЛЬНЫЕ, АЛЬДЕГИДНЫЕ И ГИДРАЗИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ СИНТЕЗ И СВОЙСТВА

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Научные руководители:

профессор, д.х.н. Орецкая Т.С. с.н.с., к.х.н. Зубин Е.М.

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 4

2. ВВЕДЕНИЕ 6

3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 8

3.1. Химические методы исследования структуры комплексов биомолекул 11

3.1.1. Фотоактивируемые производные нуклеиновых кислот 11

3.1.1.1. Арилазидные производные нуклеиновых кислот 12

3.1.1.2. Галоген- и тиосодержащие производные нуклеиновых кислот 17

3.1.2. Образование ковалентной связи между молекулами белка и нуклеиновой кислоты с использованием формальдегида 20

3.1.3. Олигонуклеотиды, содержащие апуриновые/апиримидиновые сайты 22

3.2. Физические методы структурной биологии 24

3.2.1. Рентгеноструктурный анализ 24

3.2.2. Ядерный магнитный резонанс 28

3.2.3. Сравнение методов ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа для исследования НК-белковых комплексов 32

3.3. Исследование структурных особенностей рибонуклеазы Р 34

3.3.1. РНК-субъединица бактериальной рибонуклеазы Р 37

3.3.2. Белок бактериальной рибонуклеазы Р 38

3.3.3. РНК-белковые взаимодействия в бактериальной рибонуклеазе Р 39

3.4. Заключение 42

4. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, СОДЕРЖАЩИЕ 1,2-ДИОЛЬНЫЕ, АЛЬДЕГИДНЫЕ И ГИДРАЗИДНЫЕ ГРУППИРОВКИ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ) 43

4.1. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении

1,2-диольные группировки 45

4.2. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении альдегидные группировки 48

4.3. Синтез модифицированных фрагментов ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении гидразидную группировку 49

4.4. Физико-химические свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина 52

4.5. Влияние модифицированных звеньев, содержащих 1,2-диольную группу,

на структуру двойной спирали ДНК с использованием ферментов системы рестрикции-модификации ЗбоП 54

4.5.1. Гидролиз ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2'-<9-[2-(2,3-дигидроксипропил)-амино-2-оксоэтил]уридина и 2'-6>-(2,3-дигидроксипропил)уридина, эндонуклеазой рестрикции БзоП 55

4.5.2. Метилирование ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидрокси-пропил)амино-2-оксоэтил]уридинаи 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина, метилтрансферазой ЗбоН 57

4.6. Взаимодействие модифицированных олигонуклеотидов с метилтрансферазой 8зо11 и белком бактериальной рибонуклеазы Р 59

4.6.1. Взаимодействие метилтрансферазы ЭзоП с ДНК-дуплексами, содержащими 2'-диольную и 2'-альдегидную группировки 59

4.6.2. Изучение ингибирования реакции 2'-альдегидных фрагментов ДНК с метилтрансферазой БзоН в присутствии ДНК-конкурентов 66

4.6.3. Ковалентное связывание 2'-альдегидных олигонуклеотидов с белком бактериальной рибонуклеазы Р 72

4.7. Получение конъюгатов 2'-гидразидных олигонуклеотидов с карбонильными соединениями 81

4.8. Заключение 85

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 87

6. ВЫВОДЫ 106

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107

8. ПРИЛОЖЕНИЕ 127

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

АП-сайт - апуриновый/апиримидиновый сайт

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН - додецил сульфат натрия

ДТТ - дитиотреит (трео-\,4-димеркапто-2,3-бутандиол)

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

КД - круговой дихроизм

криоЭМ - криоэлектронная микроскопия

мРНК -матричная РНК

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

рРНК - рибосомная РЖ

РСА - рентгеноструктурный анализ

ТГФ - тетрагидрофуран

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

тРНК - транспортная РНК

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс Ас - ацетил

AdoMet - S-аденозил-Ь-метионин

AMA - смесь концентрированного водного аммиака и 40% водного метиламина (1:1, v/v) BER - эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований ВТРР - /и/?ет-бутилимино-три(пирролидино)фосфоран Bz - бензоил

COSY - корреляционная ЯМР-спектроскопия

CPG - стекло с определенным размером пор 2,5-DHBA - 2,5-дигидроксибензойная кислота DMAP - 4,4-диметиламинопиридин DMTr - 4,4'-диметокситритил Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил

HEPES - 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфокислота

HMQC - ЯМР-спектроскопия с использованием гетероядерной многоквантовой корреляции HSQC - ЯМР-спектроскопия с использованием гетероядерной одноквантовой корреляции MALDI-TOF - матричная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия

NER - экзиционная репарация ДНК путем удаления нуклеотидов Ni-NTA - никелевая соль нитрилотриуксусной кислоты NOE - ядерный эффект Оверхаузера

NOESY - ЯМР-спектроскопия с использованием ядерного эффекта Оверхаузера Рот - пивалоилоксиметил

SAXS - малоугловое рассеяние рентгеновских лучей TBAHS - гидросульфат тетрабутиламмония 2,4,6-ТНАР - 2,4,6-тригидроксиацетофенон Ud - 2'-0-(2,3-Дигидроксипропил)уридин

Ijdao - 2'-0-[2-(2,3-Дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридин Ijdap - 2'-0-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридин

Uh -2'-0-(2-((2-(2-(4-гидразинил-4-оксобутаноил)гидразинил)этил)амино)-2-

оксоэтокси)уридин

U0 - 2'-0-(2-оксоэтил)уридин

2. ВВЕДЕНИЕ

Модифицированные производные нуклеиновых кислот (НК) широко используются в молекулярной биологии и медицинских исследованиях, так как обладают уникальными свойствами, в том числе способностью регулировать экспрессию генов, избирательно связываясь с белками и комплементарными последовательностями ДНК и РНК.

Одним из направлений исследований в химии нуклеиновых кислот является разработка методов синтеза и изучение свойств 2'-модифицированных олигонуклеотидов, содержащих в своем составе химически активные группировки. Использование таких производных для получения конъюгатов с различными молекулами представляется перспективным подходом для направленного изменения свойств НК-фрагментов. Ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова была разработана стратегия синтеза реакционноспособных производных ДНК, в рамках которой предложены эффективные методы синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих амино-, карбоксильную, 1,2-диольную и альдегидную группы.

Целью настоящего исследования является разработка методов синтеза модифицированных производных ДНК и РНК, содержащих в 2'-положении 1,2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. Отдельной частью работы было изучение физико-химических свойств олигонуклеотидов и характера их взаимодействия с различными низкомолекулярными соединениями и биомолекулами.

с карбонильными соединениями для дальнейшего получения новых НК-производных с заранее заданными свойствами.

С использованием З'-амидофосфита 2'-0-[2-(2,3-диацетоксипропил)амино-2-оксоэтил] -5'-0-(4,4 '-диметокситритил)-Л8-пивалоилоксиметилуридина впервые синтезированы модифицированные олигорибонуклеотиды, содержащие в 2'-положении углеводного фрагмента 1,2-диольные и альдегидные группировки. Показано, что встраивание в олигонуклеотидную цепь модифицированных остатков уридина, содержащих 1,2-диольные группировки, существенно не влияет на термическую стабильность ДНК-, РНК- и гибридных дуплексов.

Впервые изучено взаимодействие 2'-диоксоазапентильных ДНК- и РНК-производных с метилтрансферазой ЗэоП и белком бактериальной РНКазы Р, соответственно. Проведено сравнительное исследование свойств альдегидных олигонуклеотидов нового типа и 2'-оксоэтильных производных, описанных ранее. Показано, что оксоэтильные производные обладают более высокой реакционной способностью в условиях ковалентного связывания с НК-узнающими белками. Продемонстрирован неизбирательный характер взаимодействия 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных производных с метилтрансферазой БвоП, что свидетельствует о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания химической реакции или о возможном наличии двухстадийного механизма узнавания белком ДНК-лиганда. Следует отметить, что различие в строении модифицированных звеньев не сказывается на специфичности взаимодействия ДНК-дуплексов с М.ЗбоП.

Работа включает обзор литературы, посвященный современным методам исследования структуры белково-нуклеиновых комплексов.

3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Взаимодействия нуклеиновых кислот с белками играют важную роль в процессах хранения и передачи генетической информации, поэтому исследование структуры белково-нуклеиновых комплексов является одной из основных задач молекулярной биологии. Детальное понимание строения таких комплексов необходимо для изучения механизмов функционирования различных НК-узнающих белков. На сегодняшний день существуют различные подходы, позволяющие изучать структуру комплексов биомолекул. В качестве основных можно указать:

1. рентгеноструктурный анализ (РСА);

2. ядерный магнитный резонанс (ЯМР);

3. криоэлектронная микроскопия (криоЭМ);

4. малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (8АХ8);

5. аффинная модификация.

Методы исследования НК-белковых взаимодействий, широко применявшиеся ранее, такие как ковалентное связывание между компонентами изучаемого комплекса с последующим анализом образовавшегося конъюгата и изучение свойств белков, полученных с использованием сайт-направленного мутагенеза, в последнее время используются реже, так как не дают полной информации о структуре комплекса. К настоящему моменту на первый план вышли физические методы структурной биологии (РСА, ЯМР, криоЭМ и ЗАХБ). Эти подходы дают возможность охарактеризовать структуры полноразмерных комплексов с разным пространственным разрешением: от низкого, сравнимого с размерами биомолекул, до высокого, сопоставимого с расстояниями между атомами. На сегодняшний день основной объем информации о структуре биомолекул с хорошим разрешением получен с помощью

рентгеновской кристаллографии с использованием синхротронных источников и ядерного магнитного резонанса.

Настоящий обзор содержит три основных раздела. В первых двух обсуждаются химические и физические методы исследования структуры комплексов белков с нуклеиновыми кислотами. Последний посвящен изучению пространственного строения рибонуклеазы Р с использованием современных подходов структурной биологии.

Применение метода ковалентного связывания нуклеиновых кислот с белками подробно обсуждается в обзоре [1]. В связи с этим первая глава включает анализ литературы, опубликованной после 2003 г. Во второй части обзора, посвященной физическим методам исследования, мы остановились на методах рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса. Данные по изучению комплексов методом РСА обобщены в обзоре 2005 г. [2], поэтому мы рассматривали только работы, вышедшие за последние 6 лет. Кроме того, во второй главе также кратко охарактеризованы криоэлектронная микроскопия и малоугловое рассеяние, которые активно используются, несмотря на то, что обладают более низким разрешением по сравнению с ЯМР и РСА. Анализ структур белков и их комплексов с использованием малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов подробно обсуждается в обзорах 2010 г. [3, 4]. Мы не рассматривали метод, основанный на получении белков с помощью сайт-направленного мутагенеза и анализе их свойств, так как в последнее время он практически не используется для изучения структуры НК-белковых комплексов.

Все эти ограничения круга рассматриваемых вопросов позволили нам сосредоточить внимание прежде всего на обсуждении различных подходов к исследованию строения комплексов биомолекул и проанализировать возможности, проблемы и перспективы развития структурной биологии (табл. 3.1).

Таблица 3.1. Сравнительная характеристика основных подходов структурной биологии.

Метод Основные преимущества метода Основные проблемы метода

Ядерный магнитный резонанс Возможность анализа структуры в растворе или изучения динамической структуры комплекса с высоким разрешением (~2 А) Не подходит для анализа структуры больших комплексов (>100-120 кДа).

Рентгеноструктурный анализ Возможность изучения достаточно больших комплексов с высоким разрешением (~2 А) Невозможно использовать для анализа слишком подвижных или не полностью структурированных комплексов, так как необходимым эпатом метода является кристаллизация образца. По этой же причине невозможно анализировать динамические изменения в комплексе.

Криоэлектронная микроскопия и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей Исследование сложных мульти-субъединичных структур в растворе Разрешение этих методов ниже, чем в случае РСА и ЯМР, и составляет 5-20 А.

Химические методы анализа структуры Простота подготовки препаратов НК и белков, входящих в состав комплекса. В последнее время широко используется для изучения и выделения молекулярных партнеров различных биомолекул или для исследования доменов белка, взаимодействующих с НК, в случае крупных мульти-субъединичных комплексов [5-7]. Метод позволяет определить отдельные контакты в сближенных участках НК и белка и не дает представления о структуре в целом.

3.1. Химические методы исследования структуры комплексов биомолекул

Метод ковалентного связывания был первым предложен для характеристики структур НК-белковых комплексов и активно использовался для изучения различных объектов молекулярной биологии с начала 60-х гг. В последние 10-20 лет химические методы не являются основными в структурных исследованиях, однако некоторые задачи по изучению строения биомолекул успешно решаются с помощью кросс-линкинга.

Основные варианты аффинной модификации белков НК-фрагментами изложены в обзоре [1]. За последнее время не было разработано принципиально новых подходов к кросс-линкингу нуклеиновых кислот с белками, поэтому в этой части обзора мы рассматриваем только работы, в которых с помощью методов ковалентного связывания решались задачи структурной биологии, и не обсуждаем особенности строения модифицированных НК-производных и методы их получения.

Основные подходы, которые в последние годы использовались для исследования белково-нуклеиновых комплексов, можно условно разделить на две группы. Первый основан на использовании УФ-света для образования ковалентных "сшивок" между биополимерами в составе специфического комплекса. Второй метод не предполагает использования излуч