Функционализация полимерных носителей для иммунохимического анализа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

УДК 678.746.22 + 541.6 + 541.183 + 616.153.96-097 + 576.807.7 + 576.8.097

— — — г -

. . О

ШМАНАЙ

к я - 1 ФЕ3 2003

Вадим Владимирович

ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МИНСК - 2000

Работа выполнена в Институте физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси

Научный руководитель - доктор химических наук,

профессор Метелица Д.И.

Научный консультант - кандидат химических наук

Былина Г.С.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Воложин A.II.,

доктор химических наук Свиридов О.В.

Оппонирующая организация -

Белорусский государственный университет, химический факультет

Защита состоится " 8 " февраля 2000 г. в 14 час. 00 мин. на заседании Совета по защите диссертаций Д 01.24.01 при Институте физико-органической химии HAH Беларуси, 220072, г. Минск, ул. Сурганова 13,(017)284-16-79.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физико-органической химии HAH Беларуси.

Автореферат разослан " 6 " января 2000 г.

Ученый секретарь Совета, кандидат химических наук

Гладких JI.B.

Ь о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Полимерный носитель - один из основных компонентов твердофазного иммунохимического анализа, определяющих его качественные характеристики: чувствительность, воспроизводимость результатов, вид калибровочной кривой, срок хранения иммуносорбен-та. Наиболее распространенные макроносители для иммуноанализа изготовлены из ^модифицированного полистирола и предназначены для физической сорбции иммунореагентов.

Инактивация сорбированных на полистироле антител и ограниченная способность белков и многих антигенов небелковой природы к гидрофобной сорбции ставят перед исследователями задачи по созданию новых носителей, сочетающих операционные достоинства формованных полистирольных матриц (прозрачность, легкость дозирования, низкая стоимость) с функциональными качествами активированных микрочастиц и гелей, применяемых в аффинной хроматографии и энзимологии (высокая емкость и прочность связывания, минимальная инактивация белков, низкий уровень неспецифической сорбции). Один из путей решения этой проблемы - функционализация полистирола, позволяющая в широких пределах изменять свойства поверхности для ковалентной иммобилизации биологических макромолекул и создания для них оптималыюго микроокружения. Известно небольшое число таких матриц. Формилированные полистирольные макроносители ранее не были описаны.

Создание более качественных по сравнению с традиционными твердофазных матриц актуально для Беларуси, поскольку способствует обеспечению потребности Республики в современных иммунодиапюстических наборах реагентов и созданию конкурентоспособной продукции. Наличие в стране соответствующей научной базы (Институт биоорганической химии НАНБ, Биологический факультет БГУ) и технологических возможностей (Хозрасчетное эпытное производство ИБОХ НАНБ) позволяет успешно решать эти задачи.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ИФОХ НАНБ в рамках программы 'Полимер 01" по темам: "Исследование закономерностей процессов синтеза и физико-химических свойств новых функциональных и реакционноспособных полимеров, органических электролитов" (1991-1995, номер госрегистрации 1993585), "Разработка, исследование свойств и изыскание путей рационального применения новых функциональных и реакционноспособных полимеров и композиционных материалов для охраны окружающей среды, здоровья человека и технического использования" (1996-2000, номер госрегистрации 19962777), а также по гранту БРФФИ № Х98М-079 "Функционализация полисахаридами твердофазных полимерных носителей для иммунохимического анализа" (1999-2001, номер госрегистрации 19991821).

Цель н задачи исследования. Цель проведенного исследования получение новых функционализированных матриц для иммуноапализ; активацией отлитых под давлением шаров из линейного полистирола I модификацией бумаги полимерами, приготовление на их основ! иммуносорбентов и разработка методик иммуноферментного анализа (ИФА) с их использованием. Поставлены следующие задачи:

1. Получить формилированные полистирольные шары (ФПСШ) и исследовать структуру их активного поверхностного слоя;

2. Разработать методы получения носителей, содержащих альдегидные, амин-ные, ацетильные, гидразидные, карбоксильные, гидроксильные, амидные. углеводные группы на спейсерах различной длины и структуры химической модификацией полистирольных матриц полифункциональными соединениями;

3. Разработать методы получения гетерофункциональных матриц;

4. Разработать методы получения бумажных матриц с повышенной влаго-прочностыо, способных к периодатному окислению, армированием или импрегнированием фильтровальной бумаги полимерами различной структуры;

5. Разработать методы количественного определения активных функциональных групп на синтезированных носителях;

6. Изучить закономерности ковалентной иммобилизации белков на функционализированных матрицах;

7. Исследовать неспецифическую сорбцию пероксидазных конъюгатов на ФПСШ и оптимизировать условия ее блокировки;

8. Установить зависимость активности иммуносорбентов на основе функционализированных носителей от условий их получения и хранения;

9. Получить гидразидсодержащие матрицы для направленной иммобилизации антител;

10. Получить иммуносорбенты и разработать методику конкурентного ИФА Гцв человека с использованием ФПСШ и поликлональных антител к

11. Получить иммуносорбенты и разработать методику двухцентрового ИФА хорионического гонадотропина человека (ХГч) с применением ФПСШ и моноклональных антител к а- и р-субъединицам ХГч;

12. Получить иммуносорбенты и разработать методики ИФА прогестерона и кортизола с использованием различных типов модифицированной полимерами бумаги и поликлональных антител к стероидным гормонам.

Объекты н предмет исследования. Объекты исследования - функцио-нализированные производные полистирола и целлюлозы. В качестве предмета исследования определено активирование полистирольных шаров диаметром 0,63 см и модифицирование фильтровальной бумаги для использования в ИФА.

Методология и методы проведенного исследования. В работе использованы физические, физико-химические, химические и биохимические методы: ЯМР- и ИК-спектроскопия; спектрофотометрия и фотоколориметрия; атомно-силовая микроскопия; элементный микроанализ; газовая и ионообменная хроматография; гель-фильтрация; рН-метрия; кислотно-основная и окислительно-восстановительная титрометрия; химическая модификация природных и синтетических полимеров; методы органического синтеза; радикальная полимеризация; определение концентрации белков; очистка и химическая модификация белков; иммунизация животных, получение и выделение специфических антител; простая и двойная иммунодиффузия; ферментативные реакции окисления ароматических аминов; прямой ИФА; конкурентный ИФА; "сэндвич"-ИФА. Разработаны методики количественного анализа карбонильных, аминных и гидразидных групп на модифицированных полистирольных матрицах.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Получено 23 макроносителя для иммуноанализа химической модифицикацией полистирола полифункциональными соединениями с образованием на поверхности спейсеров различной длины и структуры, содержащих альдегидные, ацетильные, аминные, гидразидные, карбоксильные, гидроксильные, амидные и углеводные группы. Получен ряд новых бумажных носителей, отличающихся повышенной влагопрочиостыо и способных к периодатному окислению.

Разработаны методики анализа активных карбонильных, аминных и гидразидных групп на твердых носителях, отличающиеся простотой выполнения и универсальностью.

Установлены закономерности ковалентной иммобилизации различных белков па ФПСШ. Оптимизированы условия получения иммунных и аффинных сорбентов с использованием ФПСШ и модифицированной бумаги в качестве твердофазных носителей иммунореагентов.

Получены матрицы для иммуноанализа, позволяющие проводить пространственно направленную (ориентированную) ковалентнуто иммобилизацию (ПНИ) антител. Впервые получены макроносители для иммуноанализа с химически привитыми акриловыми сополимерами и функциональными производными полисахаридов.

Разработаны методики ИФА четырех антигенов с использованием кова-лентно иммобилизованных поликлональных и моноклональных антител на носителях, содержащих активные альдегидные группы.

Полученные данные могут стать основой для дальнейших исследований свойств функционализированных поверхностей полимерных материалов, а также физико-химических характеристик иммобилизованных иммунореагентов при их использовании в ИФА.

Научная значимость полученных результатов определяется их использованием в изучении механизмов молекулярной сорбции на твердой поверхно-

сти, в исследовании свойств белков и других макромолекул при их взаимодей ствии с функционализированными полимерами, при получении препарате для атомно-силовой микроскопии, в разработке методик иммунохимическог анализа, в иммунологических и других биохимических исследованиях. Опи санные активированные матрицы использованы сотрудниками учреждени HAH Беларуси при проведении собственных исследований.

Предложенные подходы к дизайну активированных носителей могу быть применены в работе с разнообразными полимерными матрицами органи ческой или неорганической природы.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные рс зультаты использованы при разработке иммунодиагностических наборов i иммуносенсорных систем. Возможно их коммерческое использование в произ водстве наборов реагентов и активированных матриц. Разработанная методик; экспресс-анализа IgG, позволяющая быстро и с высокой точностью определят! концентрацию этого белка, уже использована сотрудниками ИБОХ НАНБ i научных исследованиях.

Кроме описанных в диссертации методик ИФА в ИБОХ HAH Бсларуи на основе ФПСШ разработаны наборы реагентов для анализа стероидных гор монов, строфантина К и для иммунорадиометрического анализа (ИРМА) фер ритина, методики ИРМА и ИФА легких цепей IgG человека. Все эти наборь реагентов успешно прошли медицинские испытания в учреждениях Мини стерства здравоохранения Беларуси.

Практическая значимость работы определяется универсальностью разработанных матриц и возможностью использования тест-систем на их основе с применением специализированного оборудования фирм "Abbott", "F. Hoffmann-La Roche" и многих других.

На основе данных представленной работы возможно изготовление активированных матриц, производство наборов реагентов для иммуноанализа \ разработка новых средств иммуноанализа.

Основные положения днссертации? выносимые на защиту.

1. Получение полистирольных макроносителей с различными функциональными группами для ковалентной иммобилизации иммунореагентов.

2. Получение бифункциональных матриц, содержащих альдегидные и суль-фогруппы, карбоксильные и аминогруппы.

3. Получение армированных и импрегнированных полимерами бумажных носителей иммунореагентов.

4. Способ стабилизации активного слоя ФПСШ при высушивании.

5. Закономерности иммобилизации белков на ФПСШ.

6. Методики количественного анализа карбонильных, аминных и гидразид-ных групп на полистирольных макроносителях.

. Метод блокировки неспецифической сорбции пероксидазных конъюгатов на ФПСИ1.

. Направленная иммобилизация антител на гидразидсодержащих матрицах. . Получение иммуносорбента и методика конкурентного экспресс-ИФА ^С с использованием ФПСШ.

0. Получение иммуносорбента и методика "сэндвич"-ИФА ХГч с использованием ФПСШ.

1. Получение иммуносорбентов на основе модифицированной бумаги и методики ИФА кортизола и прогестерона с их использованием.

Личный вклад соискателя. Основная часть результатов получена лично втором и сотрудниками группы функциональных полимеров ИФОХ НАНБ од его руководством. Планирование экспериментов, теоретическое обсужде-ие и оформление результатов проводилось совместно с научным руководите-ем, научным консультантом и лично автором. Экспериментальные'данные с спользованием ЯМР-спектроскопии, АРМ-микроскопии и элементного мик-оанализа получены сотрудниками ИФОХ НАНБ.

Опубликоваииость результатов. Результаты диссертации опубликова-ы в 13 статьях с общим количеством страниц - 86.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, бщей характеристики работы, обзора литературы (глава 1) и пяти глав основой части, заключения и приложений.

В первой главе обобщены литературные данные по химической актива-ии полимерных носителей биологически активных макромолекул и дана раткая характеристика методов ИФА. Во второй главе описаны использован-ые приборы, материалы, реагенты и методы исследования. Третья глава по-вящена получению активированных матриц взаимодействием ФПСШ с раз-ичными полифункциональными реагентами. В четвертой главе описана мо-ификация фильтровальной бумаги различными полимерами. В пятой главе зложены результаты исследования ковалентной иммобилизации белков на >ПСШ и приведены данные по оптимизации получения иммуносорбентов на снове активированных полистирольных шаров и модифицированной бумаги. 1 шестой главе представлены методики ИФА иммуноглобулина в, ХГч, кор-изола и прогестерона, разработанные с использованием описанных в диссер-ации твердофазных носителей.

Диссертация изложена на 203 страницах, включает 58 рисунков на 49 границах, 26 таблиц на 16 страницах и 4 приложения на 7 страницах. Список спользованных источников включает 473 наименования работ отечественных зарубежных авторов.

ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ ФОРМОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Наиболее распространенными макроносителями в иммуноапализе я в ля ются планшеты, пробирки и шары. Выбор полистирольных шаров для изуче ния химически активированных носителей обусловлен сравнительно легко! химической модификацией полистирола, универсальностью и операционным! преимуществами шаров по сравнению с другими носителями, возможность« одновременной активации большого количества шаров, определяющей высо кую степень однородности иммуносорбентов.

В процессе формилировання дихлорметиловым эфиром в присутствш

образуется пористая мембраноподобная оболочка с развитой поверхностью нерастворимая в большинстве растворителей, что свидетельствует о сшивк< полимерных цепей в результате реакции. Поверхностный слой отделяется рас творением внутренней ^модифицированной части шара. Активный наружньп слой исследован методом ИК-спектроскопии и с помощью элементного анали за. ИК-спектр смеси полистирола и поли-и-формилстирола (ПФС) хорошо мо делирует спектр активного слоя, а его количественный состав определен по за висимости оптической плотности (ОП) полосы 1680 см'1 от содержания ПФС ) модельной смеси. В процессе реакции формилировання образуется сшитьн сополимер стирола и и-формилстирола в соотношении 1:4. Рассчитанная тол щина поверхностного слоя составила в среднем 20 мкм, содержание альдегид ных групп -1,5-6,3 мкмоль/см2 (0,5-2,3 мкмоль/см2 активных групп).

Недостатком ФГ1СШ является физическая квазистабильность структу ры активного слоя: длительное хранение шаров в воде не приводит к сущест венному изменению количества активных альдегидных групп и способности 1 связыванию белков, но высушивание на воздухе в течение нескольких мину уменьшает эти параметры в десятки раз.

Для стабилизации активного слоя ФПСШ выбраны глицерин и ПЭГ Шары, высушенные без стабилизации, показывали содержание активны: групп в пределах 0,03-0,13 мкмоль/см2. Обработка шаров перед высушивание! водным раствором ПЭГ-400 с концентрацией 40-80% позволила сохранить 80 85% активных альдегидных групп, а 20-60%-ным глицерином - около 100%.

Аналогичная зависимость наблюдалась при иммобилизации бычьего сь: вороточного альбумина (БСА). Плотность иммобилизации белка (ПИБ) на ис ходных шарах составляла 27 мкг/см2, на высушенных без стабилизации -

мкг/см2. Обработка шаров 80%-ным раствором ПЭГ-400 сохраняет 85% их исходной емкости по белку, а 40-80%-ным раствором глицерина - почти 100%. Столь же высоким был уровень активности "стабилизированных" шаров после года хранения. Обработка ФПСШ растворами глицерина или ПЭГ-400 различной концентрации позволяет в широких пределах регулировать содержание активных групп и плотность иммобилизации белка.

Оптимизация реакции ФПСШ с гндразидами карболовых кислот (буфер с рН=5, содержащий 1 М ЫаС1, мольный избыток реагента 10-30, время реакции 3 ч) позволила синтезировать ряд матриц, содержащих удаленные от поверхности гидразидные группы. Такие носители позволяют проводить направленную иммобилизацию гликопротеинов, окисленных псриодатом натрия.

Получены гид рач ид содержащие сорбенты с различной длиной и структурой спейсерной группы по реакции ФПСШ с синтезированными гндразидами малоновой, глутаровой, адипиновой, азелаиновой, тетраоксагексадекан-1,16-диовой, 1,1,3,3-пропантетракарбоновой, В-винной, дигликолевой кислот. Содержание активных групп составило 0,04-0,64 мкмоль/см2.

До 80% ароматических колец в активированном слое ФПСШ после реакции формилирования остаются в неизмененном виде, что позволяет проводить их превращение по реакции электрофильного замещения с целью получения гетерофункциональных матриц: обработка ФПСШ 70-100%-ной Н28 04 в течение 4 ч позволила ввести до 2,6 мкмоль/см2 сульфогрунп.

После сульфирования ФПСШ наблюдалось сильное (до 120%) увеличение содержания активных альдегидных групп. Причиной может быть изменение структуры поверхностного слоя, его разрыхление и повышение гидро-фильности, приводящее к большей доступности альдегидных групп. Эти же факторы обеспечивают полученным носителям сохранение свойств после высушивания, что не характерно для несульфированных ФПСШ.

Реакция ФПСШ с первичными аминами моделирует ковалентную иммобилизацию белковых молекул, определяет способность аминов блокировать неспецифическую сорбцию белков и позволяет создавать на поверхности по-листирольных матриц спейсеры различной длины и структуры. Изучена реакция ФПСШ с аминами: аммиаком, моноэтаноламином, этилендиамином, гек-саметилендиамином, трис-гидроксиметиламинометаном, диэтилентриамином и Ь-лизином. Получены матрицы с содержанием аминогрупп 0,07-0,87 мкмоль/см2 при степени замещения альдегидных групп на носителе до 50%. В результате реакции лизина с ФПСШ получены бифункциональные матрицы, несущие аминные и карбоксильные группы.

Перспективно получение новых полистирольных матриц с химически привитыми на их поверхности полисахарндиымн или полиакриламидными гидрофильными спейсерами, позволяющее соединить операционные достоинства формованных матриц с функциональными преимуществами полисахаридов. Синтезированы сополимеры акриламида и и-нитрофенилового эфира ме-

такриловой кислоты, который в мягких условиях замещается различными функциональными группами. Получены и привиты на ФПСШ гидразидсодер-жащие сополимеры (0,06-0,31 мкмоль/см2 активных групп).

Получены функционализированные матрицы прививкой на ФПСШ синтезированных гидразидных производных полисахаридов: декстрана, окси-этилкрахмала, Фиколла, яблочного и цитрусового пектина (0,02-0,1 мкмоль/см2 активных групп).

Разработаны методики количественного анализа карбонильных, амин-ных и гидразидных групп на поверхности модифицированных носителей, позволяющие определить содержание активных групп на отдельно взятом шаре.

Метод фотоколориметрического определения карбонильных групп основан на реакции солянокислого раствора 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ) известной концентрации с альдегидными или кетогруппами на поверхности носителя. В результате реакции образуется полимерный гидразон с уменьшением концентрации ДНФГ в растворе, которое контролируется по изменению ОП на длине волны 430 нм. Количество неспецифичсски связанного реагента определено после его отмывки раствором Твина-20.

Реакцию 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (ТНБС) и гидразидов с образованием замещенного тринитрофенилгидразида использовали для колориметрического определения содержащихся на сорбенте гидразидных групп. Концентрацию ТНБС в растворе определяли по реакции с гидразином.

Количество аминогрупп на поверхности полистирольных носителей определяли фотоколориметрически при 360 нм по изменению концентрации пикриновой кислоты в растворе в результате ее взаимодействия с аминогруппами с образованием пикратов.

В результате проведенного исследования получены и охарактеризованы 23 активированные полнетирольные матрицы в виде шаров стандартного диаметра 0,63 см с разнообразными функциональными группами на их поверхности.

МОДИФИЦИРОВАНИЕ БУМАГИ ПОЛИМЕРАМИ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Целлюлозная бумага и ее модифицированные формы интенсивно применяются в современных методах иммуноанализа: ИФА на индикаторных полосках и в точечном твердофазном ИФА. Применение немодифицированноЕ фильтровальной бумаги показало, что ее недостатком является низкая влаго-прочность. Пропитка бумаги нерастворимыми в воде полимерами - наиболее простой путь, позволяющий повысить влагопрочность бумажных носителей.

Импрегнирование бумаги. С целью определения оптимальных условий модификации бумаги получены носители, импрегнированные полимерам! различной природы: полистиролом, ПФС, полиакрилонитрилом, полиметил-

летакрилатом при их концентрации в контактном растворе 0,01-1%. Содержание модифицирующего полимера в полученных образцах составило 1-140 чкг/см2.

Армирование бумаги, включающее пропитку мономерами с их последующей сополимеризацией, позволяет получить структуру типа "сеть в сети". Гакие носители соединяют достоинства различных полимеров. Армированная эумага обладает большей прочностью, особенно при трехмерной сшивке по-пимера, и структурной однородностью. Синтетический сополимер служит каркасом, а целлюлоза - функциональным носителем иммунореагентов. Получены носители, армированные сополимером и-дивинилбензола (ДВБ) и 4- винилфе-нилоксирана (ВФО), а также тройным сополимером ДВБ, ВФО и стирола, содержащие до 300 мкг/см2 сополимеров.

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БИОАФФИНПЫХ СОРБЕНТОВ НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ

НОСИТЕЛЕЙ

Взаимодействие белков с альдегидсодержащими матрицами протекает с образованием на носителе оснований Шиффа:

ФПСШ-СНО + Н21М-белок ФПСШ-СП=М-белок.

Исследована зависимость этой реакции от времени и температуры, содержания альдегидных групп на носителе, рН и ионной силы раствора, молекулярной массы белка, его р1 и начальной концентрации.

Время выхода на плато кинетических кривых связывания ^О с ФПСШ (3-4 ч) не зависит от содержания альдегидных групп в пределах 0,91-1,34 мкмоль/см2 и превышает его величину для адсорбции белков на немодифици-рованных полимерных поверхностях (0,5-2 ч). ПИБ БСА и овальбумина также не зависели от количества активных групп.

При проведении иммобилизации белков в 0,1 М фосфатном буфере при рН=р1 белка увеличение начальной концентрации приводит к резкому возрастанию ПИБ и ее более высоким значениям, чем в карбонатном буфере с р11 9,5. ПИБ при рН=р1 достигает 95 мкг/см2 для БСА и 40 мкг/см2 для ^С при увеличении начальной концентрации до 300-350 мкг/мл. Отношение количества связанного белка к введенному в реакцию приэтом уменьшается до 35% для БСА и до 15% для 1ёСт, а 50%-ньтй уровень связывания достигается при концентрации БСА 120 мкг/мл и - 60 мкг/мл. При низких концентрациях (до 10 мкг/мл) на ФПСШ иммобилизовано более 90% белков (БСА, овальбумина, пероксидазы хрена (ПХ)).

Образование прочных ковалентных связей между молекулами белка и сорбентом приводит к отсутствию плато на зависимости ПИБ от начальной концентрации, что отличает ФПСШ от сорбционных носителей. Ковалентная

иммобилизация на ФПСШ позволяет увеличить ПИБ на 2 порядка в сравне нии с физической сорбцией на немодифицированных матрицах.

При рН 9,5 значение ПИБ в значительной мере определяется концентрацией соли в растворе и увеличивается с ее возрастанием, выходя на плате при 0,4 М в случае альбуминов и 0,2 М для Увеличение концентрациг №С1 до 0,4 М приводит к возрастанию ПИБ альбуминов в 4-5 раз, тогда каь ПИБ ^О в тех же условиях увеличивается лишь на треть.

В 0,1 М фосфатном буфере зависимость ПИБ всех исследованных белко! от рН имеет максимум, соответствующий р1 белка: при увеличении рН от 3 дс 4,6 ПИБ БСЛ возрастает с 13 до 54 мкг/см2. В присутствии 1 М №С1 с увеличением рН от 4 до 10 ПИБ белков уменьшается, и при рН=р1 пика не наблюдается, что связано с экранированием заряда молекул белка ионами и СГ у изменением суммарного электрического заряда белка. Присутствие №С1 и изменение рН от 5 до 9 не оказывают существенного влияния на ПИБ

После восстановления альдегидных групп до гидроксильных боргидри-дом натрия способность ФПСШ связывать белки снижается в 3-5 раз. Еще существенней (до 10 раз) ПИБ снижается после восстановительного аминирова-ния активных альдегидных групп. К аналогичным результатам приводит также обработка ФПСШ неионным детергентом Твин-20. Это дает основания утверждать, что иммобилизация белков происходит по сложному механизму как за счет химической реакции, так и за счет гидрофобного взаимодействия белка с модифицированным полистиролом.

Показано, что количество иммобилизованного белка снижается с увеличением молекулярной массы от 20 до 900 кДа для девяти белков различной природы. Наиболее характерно эта зависимость выражена при рН=р1.

На основании полученных результатов следует отказаться от карбонатного буфера с рН 9,5 и проводить реакцию белков с ФПСШ в более мягких условиях. Это позволяет избежать нежелательной денатурации молекул при получении иммуносорбентов и приводит к более высоким значениям ПИБ.

Установленные зависимости ПИБ от различных факторов позволили оптимизировать условия блокировки неспецифической сорбции на ФПСШ пе-роксидазных конъюгатов ^О, Анти-^в и БСЛ (ИСК). Как индивидуальные белки (БСА, овальбумин), так и сыворотка лошади, приводят к минимальной величине НСК всех исследованных конъюгатов при рН блокирующего раствора 4-5, что соответствует р1 альбуминов и в несколько раз ниже величины НСК при рН 9,5. Самое значительное влияние рН наблюдалось при сорбции конъю-гата БСА-ПХ. Блокировка НСК Твином-20 не зависит от рН.

Проведение блокировки при рН=р1 и введение нейтрального белка в раствор конъюгата снижает величину НСК до значений 0,05-0,15 при концентрациях конъюгата 0,5-1 мкг/мл и 0,005-0,02 при обычных концентрациях реагентов (20-100 нг/мл).

Величина ИСК определяется свойствами всех компонентов: носителя, блокирующего раствора, природой конъюгата. Для подбора оптимальных условий блокировки предложен универсальный подход: ее эффективность может быть повышена при использовании раствора с рН=р1 блокирующего белка и при добавлении нейтральных белков в раствор конъюгата.

Важным качеством носителя для иммуноанализа является минимальная потеря активности иммунореагентов в процессе иммобилизации и создание микроокружения для связанных реагентов, которое обеспечивает длительное сохранение их биологической активности. При получении иммуносорбентов для конкурентного ИФА 1сС установлено, что на ФПСШ хорошо сохраняется активность антител, и обработка иммуносорбентов различными веществами для стабилизации антител не повышает их сохранность. Высушивание шаров снижает активность антител на 10-15%, но при хранении они теряют активность медленнее, чем в растворе: через 11 недель с осушителем иммуносор-бенты имели 95% исходной активности (80-85% через год), с увлажнителем -лишь 4%, в растворе - 75-85% (67% через год). Активность иммобилизованных Анти-^О в прямом ИФА Т.^О-ПХ мало зависит от величины рН, при котором проводилась иммобилизация, и максимальна при исходной концентрации антител 30 мкг/мл. При увеличении концентрации до 1 мг/мл она снижается до 45% от максимальной, что свидетельствует о стерических препятствиях при взаимодействии плотно иммобилизованных антител с меченым Т§0.

Синтезированные гидразидные носители позволяют проводить направленную иммобилизацию антител. Иммуносорбент с привитым сополимером акриламида и гидразида метакриловой кислоты показал на 38% более высокую активность, чем ФПСШ со случайно иммобилизованными антителами. Показана возможность реализации обратной схемы ПНИ антител: окисленные антитела модифицированы синтезированными полимерными гидразидами в растворе и затем иммобилизованы на ФПСШ.

Определена оптимальная концентрация моноклональных антител к Р-ХГч (Анти-Р-ХГч) при получении нммуносорбента для "сэндвнч"-ИФА ХГч (150-200 мкг/мл). Благодаря отмывке сорбированных антител лаурил-сульфатом натрия (ЯВЯ) снижена погрешность результатов анализа до 2% (против 4% на шарах, не отмытых БОЯ, и 6% на "сорбционных" ПСШ). Анти-Р-ХГч в растворе быстро теряют активность, в то время как в иммобилизованные на ФПСШ сохраняют ее в течение длительного времени. Высушенные иммуносорбенты хранятся заметно лучше, чем мокрые, хотя высушивание снижает их активность на 15-20%. Хорошее сохранение активности высушенных иммуносорбентов объясняется образованием ковалентных связей, что снижает конформационную подвижность белковых молекул и препятствует их денатурации. .

Однородность нммуносорбента - важный фактор, определяющий воспроизводимость результатов анализа. Сравнение ФПСШ различных партий по

содержанию альдегидных групп, ПИБ и прямому ИФА показало, что воспрс изводимость содержания активных групп и результатов ИФА хорошо совпадс ет для девяти исследованных типов шаров. В течение 8 лет ФПСШ практиче ски не теряют своей способности быть основой иммуносорбентов удовлетвс рительного качества. Формилирование ПСШ проводится в колбе при переме шивании, что исключает краевой эффект. Показано, что при встряхивании н шейкере положение шара не влияет на результат анализа.

Условным количественным критерием эффективности матриц для ИФу коргизола или прогестерона с использованием модифицированной бумаг считали соотношение В/В0, где Во - активность ферментной метки в иммунно! комплексе "антиген-антитело" в отсутствие свободного антигена, а В - то же его присутствии в верхней граничной концентрации (10"(> М для кортизола 10~7 М для прогестерона). Минимальное значение В/В0, отвечающее больше: крутизне калибровочных зависимостей, показали иммуносорбенты на основ бумаги, импрегнированной ПФС. Большая часть биоаффинных сорбентов ока залась пригодной для разработки методик ИФА.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОАФФИННЫХ СОРБЕНТОВ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

На основе описанных выше иммуносорбентов разработаны методик] ИФА четырех антигенов: двух белков и двух стероидных гормонов.

Экспресс-определение ТеС человека основано на конкурентном связы вании нативного и меченного пероксидазой человека с иммобилизован ными Анти-1цО на ФПСШ. Использованы иммуносорбенты с избыточным со держанием активных антител; анализ проводился в кинетическом режиме, чт< позволило сократить время определения ГцО при сохранении высокой чувст вительности.

Для оптимизации условий проведения анализа изучен прямой ИФ/ конъюгата Линейность зависимости ОП450 от его исходной концен

трации сохраняется во всем исследованном диапазоне (0-80 нг/мл), что позво ляет использовать любую концентрацию конъюгата в зависимости от требуе мой чувствительности определения.

Исследована кинетика иммунной реакции меченого антигена с ФПСШ Анти-1§0'. в течение первых 30 мин активность связанного с иммуносорбенто! конъюгата возрастала линейно и достигала 65% максимального значения, по лученного при времени инкубации 2 ч. Коэффициент вариации определени остаточной пероксидазной активности в растворе над шарами (1%) демонст рирует высокую однородность иммуносорбента. ОП450 "холостого" опыта н превышала 0,01 и в среднем равнялась 0,007, что составляет 0,5% от макси мального значения ОП при нулевой концентрации и 7% от ОП450 при мак симальной концентрации антигена. Считали достоверным анализ в интервал 10-90%) ингибирования реакции конъюгата с иммуносорбентом, что соответсз

вует концентрации в диапазоне 50-3200 нг/мл (рис. 1). Относительная погрешность анализа составляла в среднем 3%. Проведение анализа не требует дорогостоящих реагентов и оборудования, он прост в исполнении (две инкубации по 15 мин и одна промывка около 5 мин). Все реагенты хранятся в течение длительного времени без существенной потери активности.

Разработана методика твердофазного "сэндвич'УИФА интактиого ХГч в диапазоне концентраций 5-2000 МЕ/л, которая отличается высокой чувствительностью (5 МЕ/л) и низкой относительной ошибкой определения (менее 2%). Применение моноклональных антител к разным субъединицам ХГч дает возможность проводить две иммунные реакции в одну стадию, что сокращает время анализа до 1,5 часа. Высокая емкость ФПСШ, сохранение активности иммобилизованных антител и высокая прочность ковалентной связи позволяют в 3,5 раза снизить погрешность анализа и расширить диапазон калибровочной кривой (рис. 2). Благодаря оптимизированным условиям блокировки неспецифической сорбции использована высокая концентрация конъюгата без существенного увеличения значения ОП450 нулевого стандарта (в среднем 0,02). Калибровочная кривая имеет почти линейный вид при линейной оси абсцисс.

На основе модифицированной бумаги разработаны твердофазные им-муноферментные методы определения микроколичеств кортизола и прогестерона с использованием аффинных сорбентов, несущих коныогаты ОВА-КОР, и иммунных сорбентов с иммобилизованными антителами, и проведено сравнение носителей между собой по их эффективности в ИФА стероидов. Предложенные иммуноферментные методы позволяют определять 10"ш-10"6 М кортизола (рис. 3) и Ю"10-1О"7 М прогестерона (рис. 4) в буферных растворах.

Схема ИФА кортизола (методика 1 с иммобилизованным антигеном) включает три стадии (МБ-модифицированная бумага): МБ-ОВА-КОР + КОР + Анти-КОР -> [МБ-ОВА-КОР:Анти-КОР] + [КОР:Анти-КОР],

2. [МБ-ОВА-КОР:Анти-КОР] + ПХ-втор.АТ -> [МБ-ОВА-КОР:Анти-КОР:ПХ-втор.АТ],

3. [МБ-ОВА-КОР:Анти-КОР:ПХ-втор.АТ] + Н202 + 4-аминоантипирин (ААГ1) + и-иодфенол —> ОП505.

Схема ИФА кортизола (методика 2, непрямой конкурентный ИФА с иммобилизованными на носителе вторыми антителами) включает две стадии:

1. МБ-втор.АТ + КОР + ПХ-КОР + Анти-КОР -> [МБ-втор.АТ:Анти-КОР: ПХ-КОР] + [КОР: Анти-КОР],

2. [МБ-втор.АТ:Анти-КОР:ПХ-КОР] +Н202 + о-фенилендиамин ОП490.

ОП«0

1 -0,5 »

о Г ■ ■ """I 1 """ч 11 """I 10 100 1000 10000 Концентрация ^О, нг/мл

Рис. 1. Калибровочная зависимость конкурентного ИФА человека.

В/Во, %

100 г 80 -60 -40 -20 -

0 -.-1-■-1-1—

-И -9 -7

^Скор, М

Рис. 3. Калибровочная зависимость ИФА кортизола по методике 1 с использованием аффинного сорбента на ДВБ-ВФО-бумаге.

ОП450

Концентрация ХГч, МЕ/л

Рис. 2. Калибровочная зависимое™ "сэндвич"-ИФА ХГч при 25°С (1) и 37°С (2).

В/Во, %

100 г 80 -60 -40 -20 -0 -

-12 -10 -8 ^Спрог, М

Рис. 4. Калибровочная зависимость ИФА прогестерона по методике 3 с использованием иммунносорбента на ПФС-бумаге.

Схема ИФА прогестерона (методика 3, конкурентный ИФА с иммобилизованными на носителе первыми антителами) включает две стадии:

1. МБ-Анти-ПРОГ + ПРОГ + ПХ-ПРОГ -> [МБ-Анти-ПРОГ:ПХ-ПРОГ],

2. [МБ-Анти-ПРОГ:ПХ-ПРОГ] + Н202 + ААП + и-иодфенол -» ОП505

При разработке методик для девяти систем с различными типами модифицированной бумаги подобраны оптимальные условия по концентрациям антител и коныогатов. Определение кортизола по методике 1 наиболее эффективно с применением армированной бумаги. При определении прогестерона по методике 3 с использованием бумаги, импрегнированной полистиролом, проявляется гидрофобность модифицированной бумаги и гидрофобная природа самого антигена: критерий В/В0 при 10'7 М прогестерона достигает 60%. Применение ПФС приводит к оптимальной гидрофобности носителя, что снижает неспецифические взаимодействия и критерий В/В0 до 16%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Получено и охарактеризовано 23 активированных полистирольных макроносителя для иммуноанализа, содержащих в активном поверхностном слое альдегидные, аминные, ацетильные, гидразидные, карбоксильные, амид-ные, гидроксильные и углеводные группы для ковалентной иммобилизации иммунореагентов на спейсерах различной длины и структуры, в том числе полимерных (акриловых и полисахаридных). Синтезированы бифункциональные матрицы, содержащие альдегидные и сульфогруппы, аминные и карбоксильные группы. Установлено, что поверхностный слой формилированных полистирольных шаров представляет собой мембраноподобный поперечносшитый пористый сополимер стирола и и-формилстирола толщиной около 20 мкм, содержащий до 6,3 мкмоль/см2 (до 2,3 мкмоль/см2 активных) альдегидных групп [3-5,7,8].

2. Разработаны простые методики количественного микроонределения карбонильных, гидразидных и аминных функциональных групп на поверхности активированных полистирольных шаров [3,5,7].

3. Установлены закономерности ковалентной иммобилизации белков на ФПСШ: плотность иммобилизации белков мало зависит от содержания альдегидных групп в пределах 0,91-1,34 мкмоль/см2 и уменьшается с увеличением молекулярной массы белков при р№=р1; емкость ФПСШ по белку на 2 порядка превышает емкость немодифицированных носителей; при низкой начальной концентрации (5-10 мкг/мл) с сорбентом связывается до 90% белка (против «50% при физической сорбции); величина рН раствора существенно влияет на плотность иммобилизации белка, максимальные значения которой достигаются при рН-р! белка [6,11,13].

4. Оптимизировано получение нммуносорбентов на основе ФПСШ иммобилизация антител одинаково эффективна в диапазоне pH от 4 до 10; вы сушенные иммуносорбенты сохраняют активность при длительном храненш без доступа влаги; блокировка неспецифической сорбции пероксидазны: конъюгатов на ФПСШ наиболее эффективна при pH блокирующего буферной раствора, равном pi блокирующего белка. Иммуносорбенты на основе ФПСП обладают высокой степенью однородности для применения в иммуноанализе Активные альдегидные группы сохраняются на ФПСШ и позволяют получат качественные иммуносорбенты в течение более восьми лет. Получены гидра зидсодержащие носители для пространственно направленной иммобилизацш антител, что улучшает качество нммуносорбентов [7,9,10,12].

5. Получены иммуносорбенты для ИФА иммуноглобулина G и хорио нического гонадотропина человека с применением ФПСШ. Разработаны мето дики ИФА IgG и ХГч.

Определение IgG конкурентным методом с использованием поликло нальных антител отличается быстротой проведения (40 мин), простотой (дв! инкубации при комнатной температуре без использования специализирован ного оборудования), малой относительной погрешностью (±3%) и широки» диапазоном измеряемых концентраций (50 нг/мл - 3,2 мкг/мл).

Метод твердофазного "еэндвич"-ИФА интактного ХГч в диапазон! концентраций 5-2000 МЕ/л отличается высокой чувствительностью (5 МЕ/л) i хорошей воспроизводимостью результатов (±2%). Применение моноклональ ных антител дает возможность проводить две иммунные реакции в одну ста дию, что сокращает время анализа до 1,5 часа [10,12].

6. Разработаны методы получения влагопрочных сорбентов импрегни рованием или армированием фильтровальной бумаги различными полимера ми. Модифицированные бумажные матрицы легко активируются периодатны? методом и способны ковалентно связывать антитела, белки и конъюгаты бел ков со стероидами.

На основе образцов модифицированной бумаги получены соответст вующие биоаффинные носители и разработаны методики ИФА стероидны гормонов, позволяющие определять Ю^-Ю"6 М кортизола и 10"lü-10"7 М про гестерона в буферных растворах [1,2].

7. Доказана возможность широкого применения разработанных носи телей в качестве матриц для иммуноферментного и других видов иммунохи мического анализа. Все методики с применением активированных шаров адаг тированы для специализированного полуавтоматического оборудования фир1 "Abbott", "F. Hoffmann-La Roche" и простейших фотоколориметров, достуг ных любой клинической лаборатории.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Шманай В.В., Былина Г.С., Еремин A.M., Метелица Д.И. Биоаффинные сорбенты на основе модифицированной полимерами бумаги // Becni Лка-дэмп навук Беларусь Сер. xiM. навук.- 1992.- № 5-6.- С. 50-56.

2. Еремин А.Н., Былина Г.С., Шманай В.В., Метелица Д.И. Иммунофермент-ное микроопределение кортизола и прогестерона с использованием бумаги, модифицированной полимерами // Журнал аналитической химии,-1993.- Т. 48, Вып. 1.-С. 137-144.

3. Шманай В.В., Былина Г.С., Винокурова Л.Г. Количественное определение карбонильных групп на поверхности модифицированных полистирольных матриц для иммунологического анализа // Весщ Акадэмп навук Беларусь Сер. xiM. навук,- 1995,- № 1.- С. 9-13.

4. Былина Г.С., Винокурова Л.Г., Шманай В.В. Исследование структуры поверхностного слоя формилированных полистирольных шаров, используемых в качестве твердофазной матрицы в иммунохимическом анализе // Журнал прикладной химии,-1996.- Т. 69, Вып. 3.- С. 493-496.

5. Былина Г.С., Винокурова Л.Г., Шманай В.В. Исследование реакционной способности формилированных полистирольных шаров, используемых в иммуноанализе, при взаимодействии с первичными аминами // Журнал прикладной химии,- 1998.- Т. 71, Вып. 4.- С. 658-661.

6. Шманай В.В., Былина Г.С. Взаимодействие белков с формилировапными полистирольными шарами // Журнал прикладной химии,- 1998,- Т. 71, Вып. 4,- С. 661-666.

7. Шманай В.В., Николаева Т.А., Винокурова Л.Г. Получение спейсерных гидразидных групп на формованных полистирольных носителях для твердофазного иммуноанализа // Биотехнология,- 1999,- № 2.- С. 59-64.

8. Шманай В.В., Винокурова Л.Г. Стабилизация структуры поверхностного слоя формилированных полистирольных носителей, используемых в иммуноанализе, при их высушивании // Биотехнология,- 1999.-№2.- С. 65-68.

9. Shmanai V. Blocking of non-specific sorption in ELISA on formylated polystyrene beads // J. Immunoassay.-1999.- Vol. 20, № 1&2.- P. 13-30.

10. Шманай B.B., Найденов В.Э. Экспресс-определение иммуноглобулина G человека твердофазным иммуноферментным методом // Журнал аналитической химии,- 1999.- Т. 54, Вып. 6,- С. 659-664.

11. Shmanai V.V., Bylina G.S. Proteins immobilization on formylated polystyrene supports // React. Funct. Polymers.-1999.

12. Шманай В.В. Твердофазный иммуноферментный анализ хорионическогс гонадотропина человека с использованием в качестве носителя формилиро-ванных полистирольных шаров // Becni Акадэмн навук Беларусь Сер. xiM навук. 2000,-№ 1,- С. 101-104.

13. Шманай В.В. Иммобилизация белков на форматированных полистирольных макроносителях для иммунохимического анализа // Доклады НАН Беларуси,- 2000,- Т. 44, № 1,- С. 61-64.

Автор выражает благодарность и признательность всем, кто помогал ему в работе и получении информации, а также принимал участие в проведении совместных исследований:

научному консультанту Былине Георгшо Станиславовичу, научному руководителю диссертации профессору Метелице Дмитрию Ивановичу, заведующему лабораторией ионного обмена и сорбции отдела высокомолекулярных соединений ИФОХ НАНБ академику Солдатову Владимиру Сергеевичу, а также Бандарику С.Е., профессору Берлину Ю.А., Винокуровой Л.Г., Владыке A.C., Волкович С.М., Еремину А.Н., Жавнерко Г.К., Залесской Е.Г., Коляде А.Г., Луневу В.Е., Маркович М.М., Марцеву С.П., Мильто К., Найденову В.Э., Николаевой Т.А., Пивень Н.В., Скаковскому Е.Д., Солдатенко Е.И., сотрудникам лаборатории мембранных процессов ИФОХ НАНБ, сотрудникам фирм "NUNC", "BIO-RAD", "Sigma-Aldrich" и "Pierce".

РЕЗЮМЕ

Шманай Вадим Владимирович "Функционализация полимерных носителей для иммунохимического анализа"

Ключевые слова: функционализация полимеров, полистирол, формилирова-ние, альдегидные группы, гидразиды, полисахариды, модифицированная бумага, иммуноферментный анализ, носители для иммуноанализа, иммобилизация белков, антитела, иммуноглобулин в человека, хорионический гонадотро-пин, кортизол, прогестерон.

Исследовано активирование отлитых под давлением полистирольных шаров диаметром 0,63 см и модифицирование фильтровальной бумаги для использования в иммуноферментном анализе (ИФА).

Цель работы - получение новых функционализированных матриц для иммуноанализа активацией полистирольных шаров и модификацией бумаги полимерами, приготовление на их основе иммуносорбентов и разработка методик ИФА с их использованием.

В работе использованы разнообразные физические, физико-химические, химические и биохимические методы.

Получены и охарактеризованы 23 активированных полистирольных макроносителя для иммуноанализа, содержащих альдегидные, аминные, ацетильные, гидразидные, карбоксильные, амидные, гидроксильные и углеводные группы для ковалентной иммобилизации иммунореагентов на спейсерах различной длины и структуры, в том числе полимерных (акриловых и полисаха-ридных). Синтезированы бифункциональные матрицы.

Установлена структура поверхностного слоя формилированных полистирольных шаров (ФПСШ). Разработаны методики количественного микроопределения карбонильных, гидразидных и аминных функциональных групп на поверхности активированных шаров.

Установлены закономерности ковалентной иммобилизации белков на ФПСШ и ее отличия от физической сорбции. Оптимизировано получение иммуносорбентов на основе ФПСШ. Разработаны методики ИФА иммуноглобулина О и хорионического гонадотропина человека с применением ФПСШ.

Разработаны методы получения влагопрочных сорбентов импрегнирова-нием или армированием фильтровальной бумаги различными полимерами. На основе модифицированной бумаги получены биоаффинные носители и разработаны методики ИФА кортизола и прогестерона.

РЭЗЮМЕ

Шманай Вадз1м Уладз1мфав1ч "Функцыянагпзацыя пол1мерных носьб1тау для ¡мунах1м1чнага анал'пу"

Ключавые словы; функцыянашзацыя пол1мерау, полютырол, фармшраваши альдэпдныя групы, пдразщы, полюахарыды, мадыфжаваная папер, ¡мунах1м1чны анашз, носьб1ты для ¡мунаанал1зу, ¡мабшзацыя бялкоу, антыц< лы, ¡мунаглабулш в чалавека, харыяшчны ганадатрашн, картызол, прагест; рон.

Даследавана актывацыя адл1тых пад щекам полютырольных шароу дьп метрам 0,63 сантиметра 1 мадыфкаваннс фшьтравальнай паперы для выкарь стання у ¡мунаферментным анализе (1ФА).

Мэта работы - атрыманне новых функцыянащзаваных матрыд дл ¡мунаанашзу актывацыяй полютырольных шароу I мадыфкацыяй паперы пс л1мсрам1, прыгатаванне на ¡х аснове ¡мунасарбентау 1 распрацоука методы 1ФА з ¡х выкарыстаннем.

У рабоце выкарыстоувалкя розныя ф131чныя, ф1знса-х1м1чныя, Х1М1чныя б1ях1м!чныя метады.

Атрыманы 1 ахарактарызаваны 23 актываваных полктырольных макра носьбга для ¡мунаанатзу, змяшчаючых альдэпдныя, ампшыя, ацэцщьньи пдразщныя, карбаксшьныя, амщныя, пдраксшьньтя ! вугляводныя групы дл кавалентнай ¡мабшзацьп ¡мунарэагентау на спэйсерах рознай даужыш \ струк туры, у тым л1ку пашмерных (акрылавых I полюахарыдных). Сштэзаваш б1функцыянальныя матрыцы.

Выяулена структура паверхневага слою фармшраваных пол1стырольны шароу (ФПСШ). Распрацаваны мстодьш колькаснага м'1кра'тншйзу карбг шльных, пдразщных \ амшных функцыянальных груп на паверхш актывавз ных шароу.

Выяулены заканамернасщ кавалентнай ^мабшзацьп бялкоу 1 яе адроз неннс ад ф'шчнай сорбцьн. Аптым1завана атрыманне ¡мунасарбентау на аснов ФПСШ. Распрацаваны методы га 1ФА ¡мунаглабул'шу О 1 харыяшчнага гате датрашну чалавека з выкарыстаннем ФПСШ.

Распрацаваны метады атрымання вшьгацетрывалых сарбента 1мпрэгшраваннем або арм^раваннсм фшьтравальнай паперы розным! ш лшерамь На аснове мадыфкаванай бумап атрыманы б1яафшныя носьб!Ты распрацаваныя методыю 1ФА картызола 1 прагестэрона.

SUMMARY

Shmanai Vadim Vladimirovich "Functionalization of polymer carriers for immunochemical analysis"

Key words: polymer functionalization, polystyrene, formylation, aldehyde oups, hydrazides, polysaccharides, modified paper, enzyme immunoassay, solid rriers for immunoassay, protein immobilization, antibody, human immunoglobulin , chorionic gonadotropin, Cortisol, progesterone.

Activation of injection-molded polystyrene beads (diameter 0,63 cm) and odifying filter papers used as solid phases in enzyme immunoassay (EIA) has been vestigated.

The following tasks were solved in the work: polystyrene beads derivatisation obtain new functional matrices for immunoassay; modifying filter paper with jlymers of various nature; preparation of immunosorbents based on the matrices ¡signed; development of EIA procedures using the immunosorbents prepared.

Various physical, physico-chemical, chemical and biochemical methods were ;ed in the work.

Twenty three activated polystyrene carriers for immunoassay are prepared, he carriers contain the following functional groups: aldehyde, amine, acetyl, hy-•azide, amide, carbohydrate, carboxy- and hydroxy-groups for covalent immobili-ition of antigens and antibodies via spacer arms of various length and nature, in-uding acrylic copolymers and polysaccarides. Bifonctional matrices are prepared.

The structure of the surface shell of the formylated polystyrene beads (FPSB) determined. The procedures for quantitative microanalysis of carbonyl, hydrazide, id amine groups in the FPSB surface shell are developed.

The regularities of protein covalent immobilization on FPSB as compared to iiysical sorption are established. The immunosorbents preparation using FPSB is ptimized. EIA techniques for analysis of human IgG and chorionic gonadotropin re developed using the FPSB-based immunosorbents.

The methods are developed to obtain moisture-resistant sorbents by a way of Iter paper impregnating or reinforcing with various polymers. The bioaffinity carri-rs are obtained to develop the EIA techniques for analysis of Cortisol and proges-:rone with modified paper as a solid support.