Получение биоаналитических реагентов на основе полимерных дисперсий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

?Г£ ОД

1 ¡3 к;ом исэ

На правах рукописи

ГЕНЕРАЛОВА АЛЛА НИКОЛАЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ ДИСПЕРСИЙ

Специальность 02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2000

__

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители: доктор химических наук

Зайцев Сергей Юрьевич кандидат химических наук Лукин Юрий Владимирович.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Мягкова Марина Александровна, доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович.

Ведущая организация: МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет.

Защита состоится «J& » мая 2000 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 063.41.05 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова но адресу: 119831, Москва, Г-435, ул. М. Пироговская, д.1. Отзывы направлять по адресу: 117571, Москва, пр.Вернадского, д..86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан «//» апреля 2000 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 063.41.05, д.х.н., проф.

[—

И.А.Грицкова

ЕоМо, о

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Развитие биоаналитических методов определения белковых молекул, низкомолекулярных веществ (гаптенов), нуклеиновых кислот является одной из актуальных проблем медицины, иммунологии, биотехнологии. В последние годы в этой области все более широко используются полимерные дисперсии, частицы которых нашли применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биохимических исследований. Основные требования, которым они должны удовлетворять - это заданный диаметр полимерных частиц, их узкое распределение по размерам, биологическая и коллоидно-химическая устойчивость в физиологических растворах, возможность образования ковалентной связи белков и других биолигандов с функциональными группами полимера, расположенными на поверхности частиц, возможность введения различных добавок (хромофорных, флуорофорных, функциональных и т. д.). В связи с этим весьма актуальным является получение таких полимерных частиц для различного вида биохимических исследований.

Цель данной работы состояла в синтезе полимерных микросфер, содержащих специальные метки (флуоресцентные, хромофорные, дигитонин) для детекции нуклеиновых кислот, гербицида (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) и холестерина при биоаналитических исследованиях.

Научная новизна.

• Установлено, что диаметр полиакролеиновых частиц, распределение частиц по размерам, их коллоидно-химическая устойчивость существенно зависят от природы ксантеновых красителей, поверхностно-активных веществ и других добавок, влияющих на межмолекулярное взаимодействие полимерных цепей, например, водного раствора аммиака.

• Показано, что при полимеризации стирола с использованием дигитонина в качестве стабилизатора при определенной концентрации мономера и инициатора формируются полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам.

• Найдено, что добавление водного раствора аммиака при получении полиакролеиновых суспрнзий увеличивает степень ассоциации олигомеров акролеина и снижает их содержание в водной фазе. Использование таких суспензий повышает чувствительность реакции ингцбирования латексной агглютинации с визуальной детекцией результатов на примере определения гаптена 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-0).

• Разработан метод нерадиоактивной детекции нуклеиновых кислот путем гибридизационного анализа на мембране, в котором в качестве маркера использовали

сенсибилизированные стрептавидином полиакролеиновые микросферы, содержаи флуоресцентный краситель.

• Впервые специфическое взаимодействие полистирольных частиц, стабилизирован! дигитонином, с холестерином плазматических мембран клеток эндотелия и липид! монослоев подтверждено методом электронной сканирующей микроскопии и метог Ленгмюра-Блоджетт.

Практическая значимость работы. Созданы биореагенты на осн флуоресцентных полиакролеиновых микросфер, применение которых в гибридизацнош анализе нуклеиновых кислот дает возможность значительно упростить проиеде: нерадиоактивных методов определения ДНК. Получены биоаналитические реагенты основе окрашенных полиакролеиновых микросфер, которые позволяют использовать , определения гербицидов простой, чувствительный, не требующий специальн оборудования метод ингибирования латексной агглютинации в иммунохимичеа планшете. Выявлены оптимальные концентрации биореагентов для определения 2,4-1 реакции ингибирования латексной агглютинации с турбидиметрической регистрац результатов. Разработан способ получения специфического латекса-маркера количественного определения холестерина в плазматической мембране клеток.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано работ и получено 1 авторское свидетельство. Результаты работы докладывались Российских и международных конференциях. Автор защищает:

- исследование влияния различных добавок на устойчивость полиакролеиновых диспер в процессах полимеризации и сополимеризации, диаметр частиц, распределение их размерам, а также коллоидно-химическую устойчивость;

- способ получения полистирольных частиц с узким распределением по размерам использовании дигитонина в качестве стабилизатора;

- данные по детекции ДНК в дот-анализе с использованием флуоресцени

полиакролеиновых микросфер, сенсибилизированных стрептавидином;

- цетод определения гербицида 2,4-1) с участием окрашенных полиакролеино: ^икросфер, сенсибилизированных моноклональными антителами к 2,4-0, в рсак ингибирования латексной агглютинации, проводимой в иммунохимическом планшете

- данные по использованию сополимерных микросфер для исследования реак латексной агглютинации методом турбидиметрии при определении гербицида 2.4-С,

- исследование взаимодействия латекс-маркера, содержащего дигитонин, и холестерина плазматических мембран и липидных монослоев методом электронной сканирующей микроскопии и с помощью мономолекулярных пленок, полученных на весах Ленгмюра.

Grpyicrypa и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего /¿зУработ. Работа изложена настраницах, содержит 42 рисунка и 12 таблиц.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.

Глава I. Обзор литературы, в котором рассматриваются способы получения полимерных суспензий и их применение в различных видах биоанализа.

Глава П. Экспериментальная часть.

Исходные вещества. Мономеры (акролеин, стирол, метилметакрилат) очищали по стандартной методике, инициаторы (гидроксид натрия, персульфат калия), красители (родамин Ж, флуоресцеинизотиоцианат, кристаллический фиолетовый), дигадрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, хлорид натрия, борную кислоту, тетраборат натрия, 2,4-D, дигитонин, холестерин и другие реагенты использовали без дополнительной очистки.

Методы исследования. Кинетику полимеризации изучали гравиметрическим и дилатометрическим методами. Размеры частиц определяли на субмикронном анализаторе частиц "Coulter N4 MD" (Франция). Спектры поглощения полимерных суспензий снимали на спектрофотометре «Hitachi 557» (Япония), спектры поглощения водных растворов красителей, их содержание в надосадочной жидкости, концентрацию олигомеров и поверхностных альдегидных групп определяли с помощью спектрофотометра «Beckman DU-70» (Германия). Спектры флуоресценции снимали на спектрофлуориметре «Jobin Ivon» (Япония) и цитофлуориметре «Epics V» (Франция). Полиакролеиновые суспензии сенсибилизировали биолигандами путем ковалентного связывания их первичных амидогрупп с альдегидными группами полиакролеиновых частиц. При проведении биоспецифических реакций на мембране и в планшете применяли визуальную детекцию результатов. Для детекции реакции агглютинации в объеме использовали спектрофотометр «Ultrospec» (Швеция); при проведении реакции на плазматической мембране клеток -сканирующий электронный микроскоп «Hitachi S-570» (Япония); при проведении реакции на модели клеточной мембраны - пленочные весы Ленгмюра «Lauda» (Германия).

Глава Ш. Результаты и их обсуждение.

I1I.1. Синтез полимерных микросфер.

В большинстве биохимических анализов полимерные микросферы выступают в качестве маркера, позволяющего облегчить визуальную детекцию результатов биоспецифических реакций. В этом случае они должны иметь узкое распределение частиц по размерам (коэффициент вариации 5-10%); обладать воспроизводимыми коллоидно-химическими свойствами; иметь высокую стабильность при хранении и агрегативную устойчивость в физиологическом растворе; содержать на поверхности микросфер биологически активные вещества или функциональные группы, позволяющие ковалентно связывать белки и лиганды.

В данной работе были получены и использованы микросферы для детекции биоспецифических взаимодействий «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин» и «дигитонин-холестерин» (табл.1).

IU.1.1. Получение полиакролеиновых микросфер в присутствии ксаытеновых красителей.

Полиакролеиновые микросферы, содержащие на поверхности альдегидные группы, которые могут в одну стадию образовывать ковалентную связь с первичными аминогруппами белковых молекул, являются наиболее перспективными для биохимических исследований. В литературе описаны различные способы получения полиакролеиновых дисперсий, из которых наиболее привлекателен метод анионной осадительной полимеризации акролеина в водно-щелочной среде, проводимой в две стадии. Первая стадия проводится при 20°С (анионная осадительная полимеризация), а вторая - при 70°С в атмосфере инертного газа с добавлением радикального водорастворимого инициатора (K2S2O8). Повышение температуры и добавление КгйгОк вызвано необходимостью увеличить коллоидно-химическую устойчивость полиакролеиновых микросфер не только в процессе синтеза, но и при последующей иммобилизации биолигандов.

Исследование кинетики анионной полимеризации акролеина на начальных стадиях реакции, проводимой данным способом, показало, что образование частиц начинается сразу носце добавления в систему инициатора (щелочи) и заканчивается в узком временном интервале. В дальнейшем происходит лишь незначительное увеличение диаметра сформировавшихся полимерных частиц, приводящее к образованию практически монодисперсных микросфер (рис.1). Такой способ проведения полимеризации позволил синтезировать полиакролеиновые частицы с диаметром 0.6 мкм и концентрацией

альдегидных групп 35 мкмоль/г полимера. При дальнейшем их использовании в качестве носителей белка в иммунохимических реакциях было обнаружено, чгго данные дисперсии недостаточно устойчивы в физиологическом растворе и подвержены деструкции вследствие

вымывания олигомеров.

Кроме того, они были неокрашены, что затрудняло регистрацию биоспецифических взаимодействий неинструментальными методами.

Особенности анионной осадительной полимеризации, связанные с высокой чувствительностью данной системы к добавлению ионов, позволяют красителем ФИТЦ (0.3% масс.в расчете на мономер); 3 - направленно изменять

с красителем РодЖ (0,33 % масс.в расчете на мономер). свойства суспензий. С

целью получения коллоидно- и химически устойчивых суспензий, отвечающих требованиям биохимических анализов, была исследована возможность регулирования свойств полиакролеиновых микросфер путем добавления на стадии синтеза различных добавок, которые могут влиять на механизм формирования и характеристики частиц полимера, а также окрашивать их или придавать флуоресцентные свойства.

Было изучено влияние красителей на синтез и свойства полиакролеиновых частиц. Выбор красителя определялся требованием расположения хромофорных групп красителя на поверхности полимерных частиц. Ранее проведенные исследования показали, что для этих целер наиболее перспективны ксантеновые красители. В данной работе были использованы красртели флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) и родамин Ж (РодЖ), которые диссоциируют в воде с образованием цветного аниона и катиона, соответственно.

Исследование концентрационной зависимости спектров поглощения и флуоресценции водных растворов красителей показало, что для раствора РодЖ, в отличие от ФИТЦ, наблюдались значительные изменения в спектрах поглощения и флуоресценции, начиная с концентрации 10"4 М и выше, связанные с образованием ассоциатов молекул красителя. Происходило концентрационное тушение флуоресценции, которое необходимо учитывать при ролучении флуоресцентных полимерных частиц.

Рис. 1. Изменение диаметра полиакролеиновых частиц от времени полимеризации 1 - без красителя;; 2 - с

Таблица 1.

Биоаналитические методы, основанные на использовании полимерных мнкросфер.

Биоаналитический метод Цель Метод детекции Полимерные микросферы Биологический объект

Метка Размеры

1.Реакция агглютинации 1.1. Прямая А) в планшете Определение микроколичеств антител или антигенов в физиологических жидкостях. Формирование комплекса «антиген-антитело» в планшете и его визуальная регистрация. Краситель 0.8-2 мкм 2,4-0-0УА 2,4-О-РАА

Б) в объеме Изучение кинетики реакции агглютинации Формирование комплекса «антиген-антитело» и его детекция по изменению оптической плотности 0.1-0.2 мкм 2,4-Б-ОУА 2,4-О-РАА

1.2 Непрямая А) ингибирование реакции агглютинации в планшете. Определение микроколичеств низкомолекулярных веществ (гапте-нов), которые в нативной форме не образуют специфического комплекса (агглютината). Визуальная регистрация в планшете ингибирования образования агглюти-национного комплекса. Краситель 0.8-2 мкм 2,4-О

Б)-«- в объеме Изучение кинетики реакции ингибирования агглютинации Детекция ингибирования образования комплекса по изменению оптической плотности. 0.1-0.2 мкм 2,4-0

2.Гибридизационный анализ. Определение микроколичеств дезок-сирибонуклеиновых кислот (ДНК), иммобилизованных на мембране. Формирование комплекса «ДНК+ биотин-стрептавидин+латекс» и его детекция по флуоресцентному сигналу. Флуоресцентный краситель 1.5-2 мкм Фаг Я

З.Маркирование компонентов клеточных мембран. Изучение топографии распределения холестерина в мембранах эндотелиальных клеток. 1.Изменение площади модельной мембраны, полученной на весах Ленгмюра, при введении маркера в подложку. 2. Подсчет частиц маркера на поверхности мембраны биообразца при использовании сканирующей электронной микроскопии. Дигитонин 0.1 мкм Холестерин

Частицы, содержащие ФИТЦ, получали полимеризацией акролеина по ранее приведенной методике при введении красителя в реакционную систему на стадии анионной полимеризации. Было обнаружено, что добавление ФИТЦ (0.3% масс.в расчете на мономер) в исходную систему приводит к снижению скорости роста диаметра микросфер (рис. 1) и к уменьшению диаметра частиц полимерной суспензии. Было высказано предположение о том, что полученный при диссоциации в воде отрицательно заряженный ион красителя может выступать в роли соинициатора и повышать эффективность инициирования. В этом случае число формирующихся частиц возрастает, т.е. мономер преимущественно расходуется на их образование. Было показано, что увеличение концентрации ФИТЦ в диапазоне 0,15-3% масс, в расчете на мономер приводит к уменьшению диаметра частиц с 0.6 до 0.2 мкм (коэффициент вариации 10-12%), соответственно, и повышению устойчивости дисперсий. Однако интенсивность окрашивания дисперсий была недостаточна.

С целью получения более интенсивной окраски частиц дисперсии данным красителем была проведена модификация ФИТЦ аллиламином, и полученный мономер вступал в реакцию сополимеризации с акролеином. Полученные частицы, диаметр которых возрастал от 0.6 до 1.3 мкм и увеличивалась интенсивность флуоресценции при повышении концентрации модифицированного красителя с 0.15 до 1.5% масс, в расчете на мономер, имели ярко-желтую окраску, причем количество включенного в полимерную матрицу красителя составляло не менее 70 %. Данные частицы могут быть использованы в биоаналитических исследованиях (табл.1).

Полимерные микросферы, содержащие катионный краситель родамин Ж, получали аналогичным методом. Было установлено, что добавление РодЖ (0,33% масс, в расчете на мономер) в водную фазу на стадии анионной полимеризации приводит к повышению диаметра микросфер (рис.1). В этом случае, по-видимому, при увеличении концентрации красителя, т.е. при повышении содержания катионов красителя, в исходной системе формируется меньшее число частиц из-за уменьшения количества инициирующих полимеризацию ионов ОН", что снижает эффективность инициирования. Было показано, что с порышением концентрации РодЖ от 0.04 до 0.6% масс, в расчете на мономер возрастал диаметр частиц с 0,8 до 2 мкм (коэффициент вариации 10-15%), увеличивалась интенсивность окраски полученных дисперсий, краситель практически не вымывался в процессе очистки. Полученные частицы не теряли агрегативной устойчивости в физиологическом растворе.

Увеличение содержания РодЖ приводило к росту полосы в спектре поглощения в обларти 500 нм и сильному батохромному сдвигу максимума флуоресценции с 558 нм до 578 нм. Такие же изменения наблюдались при ассоциации молекул РодЖ в водном растворе. Относительный квантовый выход флуоресценции возрастал при увеличении концентрации

красителя до 0,4% масс, в расчете на мономер, а затем падал примерно в два раза. Однако, цитофлуориметрические измерения показали повышение суммарной интенсивности флуоресценции, что, вероятно, связано с увеличением содержания красителя в полимерных микросферах. Таким образом, найдено, что оптимальная концентрация РодЖ, при которой получаются интенсивно окрашенные частицы и отсутствуют процессы концентрационного тушения флуоресценции, составляет 0.33% масс, на мономер, и эта дисперсия может быть использована в биоаналитических исследованиях (табл.1).

Щ.1.2. Получение полнакролеиновых микросфер в присутствии поверхностно-активных веществ.

Обнаруженное влияние ионов красителя на концентрацию инициирующих полимеризацию ионов ОН" и процесс формирования частиц при полимеризации акролеина позволило предположить, что такие же явления будут наблюдаться и при добавлении на стадии анионной полимеризации анионактивных ПАВ: додецилсульфата натрия (ДСН), алкилсульфоната натрия (ACH). В этом случае можно ожидать снижения диаметра частиц полимерных суспензий вследствие увеличения концентрации инициатора в системе. Совместное введение ДСН в диапазоне концентраций от 0.5 до 2% масс, в расчете на мономер и красителя РодЖ (0,33% масс, в расчете на мономер) позволило получить окрашенные частицы с размерами от 1.2 до 0.5 мкм. Аналогичные закономерности наблюдались и при анионной полимеризации в присутствии ACH и РодЖ, взятых в тех же соотношениях, но следует отметить, что увеличение гидрофобной части ПАВ приводило к более резкому снижению диаметра частиц и позволило получить частицы с диаметром 0.3 мкм.

В пользу высказанного предположения о влиянии ионов на процесс полимеризации свидетельствуют данные, полученные при добавлении неионного ПАВ TritonX-100. Повышение концентрации ПАВ не влияло на концентрацию ионов инициатора и не снижало диаметр частиц. Концентрация поверхностных альдегидных групп частиц при увеличении содержания неионного ПАВ в реакционной системе незначительно снижалась, в то время как для ДСН и ACH увеличивалась на 45 и 30%, соответственно. Эти результаты подтверждают тот факт, что анионы ПАВ в данном случае выступают в качестве соицициаторов полимеризации, при добавлении которых увеличивается числс образующихся частиц, а, следовательно, концентрация поверхностных альдегидных групп.

Таким образом, добавление поверхностно-активных веществ дает возможности регулировать размеры, количество поверхностных альдегидных групп и получат! агрегативно устойчивые дисперсии, частицы которых могут быть использованы в качеств! носителей биолигандов (табл.1).

Ш.1.3. Синтез полиакролеиновых частиц в присутствии водного раствора аммиака.

На основании полученных данных по высокой чувствительности осадительной анионной полимеризации к введению дополнительных ионов было интересно исследовать влияние ионов небольших молекул, например, аммиака. Добавление водного раствора аммиака, вероятно, с одной стороны, за счет диссоциации и образования КН/ позволяет сдвинуть равновесие в сторону образования более активных в полимеризации свободных ионов (карбанион и катион) по сравнению с контактными ионными парами, а, следовательно, повысить эффективность инициирования. С другой стороны, аммиак способен вступать в реакцию с полимерным акролеином, что может приводить к образованию межмолекулярных связей.

Полимеризацию проводили в присутствии N113, концентрацию которого меняли в пределах 0,05-0,3% масс, в расчете на мономер. Было отмечено, что сразу после добавления всех компонентов системы происходит рост диаметра частиц (рис.3). Повышение

концентрации аммиака ускоряло рост полимерных частиц, что, вероятно, связано с более эффективным инициированием реакции за счет смещения равновесия в сторону образования свободных ионов. Увеличение концентрации аммиака до 0.3% масс., повышало выход полимера до 75%, снижало количество олигомеров в надосадочной жидкости до 0,08 мг/мл.

Наибольшая

стабильность наблюдалась у полимерных дисперсий, полученных в присутствии водного раствора >Шз с концентрациями 0.2 и 0.3% масс.в расчете на мономер. Данные частицы, удовлетворяли необходимым требованиям для использования в реакции латексной агглютинации в планшете, но отсутствие цветной метки затрудняло процесс визуальной детекции данной реакции. Поэтому частицы, полученные в присутствии 0.2% масс. МНз, после синтеза были окрашены.

Рис.3. Изменение диаметра полиакролеиновых частиц, полученных в присутствии водного раствора аммиака, от времени полимеризации: 0.05% (1); 0,1% (2); 0,2% (3); 0.3% (4)масс. в расчете на мономер.

Использовали красители - родамин Ж и кристаллический фиолетовый (КФ) Включение красителя в данной системе может реализоваться за счет его адсорбции н< поверхности микросфер. Окрашивание проводили в течение 0.5 ч или 1 ч при дву; температурных режимах (20° и 70°С). Частицы, обработанные КФ, имели более интенсивно! окрашивание и более высокий процент включения красителя (76% при 70°С, 1ч), чем пр1 добавлении РодЖ (64% при 70°С, 1ч), поэтому для дальнейших исследований полимерньи дисперсии после синтеза окрашивали КФ.

Окрашенные микросферы были обработаны фосфорно-молибденовой кислотен Н71ТМ012О42] с целью снижения десорбции красителя. Известно, что эта кислота може вступать в реакцию комплексообразования с красителем, в которой происходит замещение • атомов водорода на катионы красителя с образованием нерастворимого в воде соединения Добавление раствора ФМК с концентрациями 0.05%-0.2% масс, в расчете на полимер окрашенным дисперсиям позволило повысить концентрацию красителя в частицах с 76% д 89%, причем этот эффект наблюдался уже при 0,05% масс. ФМК. Таким образом, был: получены интенсивно окрашенные, агрегативно устойчивые частицы, имеющие диаметр 1. мкм, которые могут быть использованы для регистрации результатов латексно агглютинации в планшете (табл.1).

Ш.1.4. Получение полимерных микросфер для инструментальных методов анализа.

Частицы, используемые в инструментальных методах анализа, должны иметь диамет 100-150 нм, узкое распределение по размерам, содержать функциональные группы, которы могут химически связывать антитела, иметь высокий показатель преломления, обладат агрегативной и седиментационной устойчивостью, в том числе в физиологически растворах. Микросферы должны также давать значительное изменение величин! оптического поглощения в процессе реакции и высокую воспроизводимость результато анализа.

Частицы, удовлетворяющие данным требованиям, могут бьгть получены путе затравочной полимеризации акролеина на поверхности блок-сополимерных части пол1|(стирол-метилметакрилата). Из литературы известно, что частицы таких бло] сополимеров имеют структуру «ядро-оболочка», где поверхность обогащи метцлметакрилатом, как более гидрофильным мономером. Полиметилметакрилат хорош набухает в акролеине. Поэтому была выбрана следующая стратегия получения требуемь частцц: частицы поли(стирол-метилметакрилата) с диаметром 0,15 мкм получали пр объемном соотношении мономер-вода, равном 1:9, безэмульгаторной радикально полимеризацией стирола и метилметакрилата (соотношение 85:15 по массе) в присутств!-персульфата калия (0.5% масс в расчете на мономеры) (80°С). Далее снижали температу{

(40°С) и добавляли акролеин в количестве 1.5-10 % масс.в расчете на мономеры, выдерживали в течение двух часов с целью набухания поверхности акролеином, добавляли инициатор (персульфат калия, 0.05% масс, в расчете на акролеин) и проводили полимеризацию. Характеристики полученных частиц даны в табл.2.

Таблица. 2.

Концентрация альдегидных групп на поверхности сополимерных микросфер и концентрация олигомера в надосадочной жидкости.

% масс, акролеина в расчете на мономеры Концентрация альд. групп Концентрация олигомера (мг/мл.)

мкМ/г мкМ/м"* 1 очистка 2 очистка 3 очистка 4(через месяц)

1.5 12.2 0.72 0.087 0.045 0.031 0.023

3.0 14.3 0.89 0.092 0.048 0.033 0.026

5.0 17.3 1.02 0.094 0.050 0.040 0.031

10.0 18.1 1.10 0.100 0.054 0.042 0.035

При повышении концентрации акролеина в процессе модификации частиц поли(стирол-метилметакрилата) агрегативная устойчивость дисперсий снижалась. Это может быть связано с образованием частиц полиакролеина в водной фазе. Была найдена оптимальная концентрация акролеина для модификации сополимерных частиц, которая составила 1.5% масс, в расчете на мономеры. При этой концентрации акролеина были получены агрегативно и седиментационно устойчивые частицы, с размерами 0,15 мкм, высоким показателем преломления, низкой плотностью, которые можно использовать для исследования реакции латексной агглютинации методом турбидиметрии (табл.1).

Ш.1.5. Получение полимерных дисперсий для маркирования холестерина клеточных мембран.

Полимерные дисперсионные маркеры, используемые для тестирования компонентов клеточных мембран, должны удовлетворять ряду требований, главными из кчторых являются низкий уровень неспецифического взаимодействия, прочная связь полимерных частиц с биолигандами в маркерных конъюгатах, устойчивость к агрегированию и механическим воздействиям в процессе маркирования клеток.

Одним из компонентов клеточной мембраны является холестерин, для обнаружения которого может быть использована реакция биоспецифицеского взаимодействия с дигитонином, приводящая к образованию нерастворимого комплекса. Для обеспечения возможности регистрации данного комплекса методом сканирующей электронной микроскопии можно использовать латексные маркеры - суспензии

полимерных частиц, содержащих на поверхности дигитонин, который является специфическим биолигандом, а также проявляет поверхностно-активные свойства.

Проведение полимеризации с использованием в качестве стабилизатора дигитонина по эмульсионному механизму, при котором возможно получение частиц необходимого диаметра, можно осуществить в условиях формирования полимерно-мономерных частиц из микрокапель мономера. Для этого дигитонин добавляли в мономерную фазу, разбавляли водой, содержащей инициатор, и поднимали температуру до 60°С.

Для получения латексного маркера использовали метод эмульсионной полимеризации стирола при массовом соотношении фаз 1:10 в присутствии инициатора (персульфат калия, 0.012% масс, в расчете на мономер) и стабилизатора (дигитонин). Ход полимеризации контролировали дилатометрически и процесс проводили до 96-98% конверсии стирола. С увеличением в реакционной системе концентрации дигитонина от 2.5 до 8% масс, в расчете на мономер уменьшался индукционный период, скорость полимеризации стирола линейно возрастала. Характеристики полученных полимерных суспензий приведены в табл.3.

Таблица.З.

Свойства полимерных микросфер, содержащих дигитонин.

Концентрация вводимого ДГТ, %масс. в расчете на стирол. Средний диаметр частиц, мкм Коэффициент полидисперсности Устойчивость к воздействию электролита (0,15 М №С1)

2.5 0.105 1.09 +

5 0.11 1.04 +

8 0.088 1.04 -

«+» - устойчивый латекс, «-» - неустойчивый латекс

Таким образом, полимерные суспензии, полученные в присутствии дигитонина (5"А масс, в расчете на мономер), устойчивы к действию электролита, содержат на поверхность биоактивный лиганд и могут быть использованы в качестве маркера холестерина (табл. 1).

Ш.2, Применение полиакроленновых дисперсий для гибридизацнонного анализ: нуклеиновых кислот.

Сущность метода гибридизацнонного анализа заключается в том, что посл< гибридизации искомой ДНК, иммобилизованной на синтетической мембране, ( полцнуклеотидным зондом, несущим метку - биотин, визуализация осуществляется 1

помощью полимерных микросфер, содержащих флуоресцентный краситель и покрытых

стрептавидином, при УФ-облучении мембраны.

Оптимальные спектрально-флуоресцентные параметры полиакролеино-вых частиц были получены при концентрации РодЖ 0,33% масс, в расчете на мономер. Диаметр частиц в этом случае составлял 1,8 мкм, коэффициент вариации 10%. В качестве полинуклеотидного зонда в данном анализе использовали фрагменты биотинилированной ДНК (bt-ДНК) бактериофага X.

Альдегидные группы полиакролеиновых частиц легко вступают в реакцию с первичными аминогруппами белков. Это позволило проводить сенсибилизацию ПА частиц стрептавидином (МС-СА) в одну стадию путем инкубации дисперсии и белка в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7.4 при комнатной температуре в течение 2-х часов. С помощью реакции латексной агглютинации (PJIA) определяли пригодность конъюгата для проведения гибридизационного анализа. Следует отметить, что в гибридизационном анализе максимальную чувствительность проявляли только те конъюгаты, которые в PJIA детектировали концентрацию биотинилированной ДНК не менее 4 иг/мл. В случае увеличения значения минимальной детектируемой концентрации bt-ДНК флуоресцентный сигнал на мембране отсутствовал. Поэтому в дальнейшей работе использовались только высокоактивные конъюгаты МС-СА, полученные в растворе БСА и при использовании в качестве блокирующего буфера 0,5% раствор овальбумина в ФСБ.

Чувствительность гибридизационного анализа зависит от типа мембраны, на которой иммобилизуют ДНК (химического состава полимерного материала, структуры и размера пор), При постановке реакции на традиционных нитроцеллюлозных мембранах с размерами пор 0,45 мкм был зарегистрирован высокий неспецифический фон, который маскировал

СИГНАЛ.

Использование нейлоновой мембраны («Gene Screen Plus», 0,45 мкм), имеющей модифицированный приповерхностный слой, позволило устранить эти недостатки. ДНК фага X наносили на мембрану в количествах от 5нг до 1,6 пг с 5-ти кратным шагом

Рис.3. Схема опосредованной детекции биотинилиро-ванного гибрида на синтетической мембране с использованием конъюгата полиакролеинового латекса со стрептавидином.

разбавления. После нанесения ДНК и проведения дот-блот гибридизации с биотинилированным зондом нейлоновую мембрану отмывали от избытка зонда и проводили блокировку трисовым буфером, содержащим 1% желатина. Далее гибридизационный сигнал детектировали 0,001% дисперсией латексного конъюгата. После облучения мембраны УФ-светом в местах нанесения ДНК появлялись розовые флуоресцирующие пятна, причем максимального значения соотношение фон-сигнал достигало через 30 мин. Минимальная детектируемая концентрация в гибридизационном анализе на нейлоновой мембране составила 1,6 пг ДНК фага X. ДНК, некомплементарная данному зонду и нанесенная в количестве 10 нг, флуоресцентного сигнала не давала, что указывает на отсутствие неспецифического связывания.

Для повышения чувствительности анализа, т.е. увеличения степени доступности биотиновых остатков, были использованы синтетические мембраны с меньшим диаметром пор (0,35мкм), в которые ДНК не проникает и остается экспонированной на поверхности. Этим требованиям удовлетворяет целлофан, используемый для диализа («Sigma», Германия). ДНК фага к наносили на мембрану из водного раствора в количествах от 1нг до 0,3 пг с последовательным пятикратным разведением, затем блокировали буфером с 1% желатина. В этом случае чувствительность анализа после проведения гибридизации ДНК фага X с биотинилированным зондом составила 0,3 пг.

Таким образом, разработан способ нерадиоактивного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, основанный на применении флуоресцентных полиакролеиновых частиц для детекции гибридизационного сигнала. Метод не уступает по чувствительности широко применяющимся методам гибридизационного анализа, использующим ферментные конъюгаты; отличается экспрессностью, простотой выполнения, поскольку не требует специальной дорогостоящей аппаратуры для визуализации сигнала.

Ш.З. Использование полиакролеиновых дисперсий для детекции гербицида (2,4-D) методом латексной агглютинации в планшете.

В последние годы для контроля загрязнения окружающей среды различными гербицидами все больший интерес представляют иммунохимические методы анализа, отличающиеся высокой чувствительностью и меньшей трудоемкостью по сравнению с традиционными методами газовой и жидкостной хроматографии. Одним их таких методов являртся реакция латексной агглютинации (РЛА), в которой использование латексных частрц, сенсибилизированных антителами или антигенами, позволяет значительно облегчить детекцию реакции «антиген-антитело». Наиболее простым неинструментальным методом

проведения латекс-агглютинации является постановка реакции в планшете с последующей визуальной регистрацией результатов.

Моновалентные антигены (гаптены) при взаимодействии с антителами не образуют агглютинатов, поэтому для их определения используется реакция ингибирования латексной агглютинации (РИЛА). Основными реагентами, использующимися в РИЛА для определения гаптенов, являются полимерные микросферы, сенсибилизированные соответствующими антителами, поливалентный антиген (агтлютинатор) и сам гаптен (ингибитор). В данной работе использовали гаптен - 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-D), которая широко используется в сельском хозяйстве в качестве гербицида.

Было найдено, что частицы, полученные путем анионной осадительной полимеризации акролеина в присутствии 0,2% NH3, затем окрашенные красителем КФ и обработанные ФМК, удовлетворяли всем требованиям планшетного варианта РЛА и РИЛА. Агглютинатор, используемый для определения 2,4-D в РИЛА представлял собой гаптен (2,4-D), конъюгированный с молекулой - носителем, в качестве которой выступал или глобулярный белок, или синтетический полимер.

Окрашенные полиакролеиновые микросферы сенсибилизировали моноклональными антителами против 2,4-D. Активность полученных конъюгатов (МС-АТ) определяли в РЛА с агглютинатором на основе глобулярного белка овальбумина (2,4-D-OVA), содержание гаптена в молекуле OVA составлял 25 мол %. Было показано, что оптимальная нагрузка АТ, при которой получена минимальная детектируемая концентрация 2,4-D-OVA (3 нг/мл), составляла 5 мкг/мг полимера и в дальнейших исследованиях использовали этот конъюгат.

Для отработки оптимальных условий постановки РИЛА сначала определяли рабочую концентрацию 2,4-D-OVA в диапазоне 1.6-100 нг/мл. Отсутствие реакции агглютинации в лунке оценивали как положительную реакцию ингибирования. Была определена минимальная детектируемая концентрация 2,4-D (0.62 нг/мл) при рабочей концентрации агглютинатора 2,4-D-OVA 12.5 нг/мл. В дальнейших экспериментах эта концентрация использовалась в качестве рабочей концентрации 2,4-D-OVA.

Природа агглютинатора играет важную роль при проведении реакции ингибирования. Синтетические полимеры, например полиакриламид (ПАА), дают возможность получать аггщотинаторы с требуемой степенью замещения гаптена в молекуле, определенной молекулярной массы, обладающие химической и иммунологической инертностью. С целью оптимизации структуры были получены синтетические агглютинаторы 2,4-D-HAA с различным содержанием гаптена (2,4-D) в молекуле полиакриламида (от 2.5 до 25 мол. %). Молекулярная масса ПАА составляла 40 кДа. Следует отметить, что для 2,4-D-IIAA, имеющего характеристики аналогичные параметрам 2,4-D-OVA, минимальная определяемая

концентрация в PJIA была на 2 порядка ниже минимальной детектируемой концентрации 2,4-D-OVA и составила 0.02 нг/мл.

Было найдено, что при уменьшении концентрации агглютинатора с 1.0 до 0.03 нг/мл минимальная детектируемая концентрация 2,4-D в РИЛА при участии 2,4-D-TIAA снижалась с 2.0 до 0.06 нг/мл. Рабочая концентрация 2,4-О-ПАА, которая в этом эксперименте была выбрана равной 0.12 нг/мл,, позволяет определять до 0.25 нг/мл 2,4-D. Таким образом, использование агглютинаторов на основе ПАА, по сравнению с агглютинаторами на основе OVA повышает чувствительность РИЛА и использует в реакции более низкие концентрации 2,4-D-nAA, что делает анализ более экономичным.

Для определения специфичности РИЛА исследовали перекрестные реакции с различными гербицидами - структурно-родственными соединениями 2,4-D. Максимальное значение в перекрестной реакции составило меньше 10% от значения 2,4-D в реакции РИЛА, т.е. использование в РИЛА МС-АТ и агглютинаторов позволяет проводить высокоспецифичные реакции при определении 2,4-D.

Данные биоаналитические реагенты позволили провести РИЛА для определения 2,4-D в пробах экстрактов из зерна. Были проанализированы 9 проб методами РИЛА и поляризационного флуороиммуноанализа. Получена хорошая корреляция между данными обоих методов. Однако, концентрация 2,4-D в пяти образцах составляла от 30 до 80 нг/мл и не могла быть определена с помощью флуороиммуноанализа, т.к. чувствительность данного метода 100 нг/мл.

Таким образом, реакция ингибирования латексной агглютинации с использованием окрашенных полиакролеиновых частиц является чувствительным, высокоспецифичным и простым одностадийным методом, который не требует ни специального лабораторного оборудования, ни специально подготовленного персонала и может быть проведен в полевых условиях. Данный анализ может быть использован для полуколичественного определения 2,4-D в воде и пищевых продуктах.

Ш.4, Турбидиметрические исследования реакции латексной агглютинации при определении 2.4-D.

Одним из инструментальных методов детекции РЛА является турбидиметрический аналрз, в основе которого лежит способность агрегатов частиц рассеивать свет более интенсивно по сравнению с отдельными частицами. В качестве дисперсионных носителей использовали полимерные михросферы, полученные сополимеризацией акролеина и полц(стирол-метшшетакрилата), которые имеют на поверхности альдегидные группы для ковадентного связывания антител. Агглютинаторы были получены на основе овальбумина и полиакрил амида. В качестве гаптена использовали 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту.

Сенсибилизацию полимерных микросфер антителами против 2,4-0 проводили либо путем прямой реакции поверхностных альдегидных групп и первичных аминогрупп белков, либо при участии спейсера (6-аминокапроновой кислоты, АКК).

Спектрофотометрические исследования всех конъюгатов в отсутствие агглютинаторов показали, что в течение 600 с величина оптического поглощения оставалась постоянной, то есть, данные частицы не подвергались спонтанной агрегации и сохраняли седиментационную устойчивость при выбранных условиях реакции, и могут быть использованы при турбидиметрическом анализе реакции латексной агглютинации.

На рис.4 представлены результаты кинетических исследований РЛА конъюгатов на основе сополимерных микросфер с концентрацией антител (10-25 мкг /мг полимера) и агглютинатора 2,4-О-ОУА (90 нг/мл). Скорость изменения оптического поглощения суспензии в начале реакции и величина предельного значения ААтх возрастают с увеличением концентрации иммобилизованных антител. Максимальное значение А/1тах, равное 0,5, получено для МС-АКК-АТ с наибольшей нагрузкой антител (25 мкг/мг полим.).

В случае использования конъюгатов МС-АТ (без спейсера) введение агглютинатора

практически не изменяло значения оптического

поглощения образца, т.е. отсутствовало взаимодействие МС-АТ и молекул агглютинатора, что может быть вызвано стерическими причинами. Повышение нагрузки антител в МС-АТ, не модифицированные АКК, до 20 мкг/мг полимера приводило к неспецифической агрегации частиц.

Увеличение концентрации агглютинатора 2,4-Б-ОУА (45-140 нг/мл) и количества иммоби-

лизованных на микросферы антител ускоряло данную реакцию и повышало

Рис. 4. Кинетические закономерности реакции латексной агглютинации между МС-АКА-АТ и 2,4-0-0УА (90нг/мл). Нагрузка антител, 25 (1), 15 (2), 10 (3) мкг/мг ролимера; 15 (4) мкг/мг полимера (для МС-АТ, без спейсера). Стрелкой показан момент добавления 2,4-0-РУА.

значение ЛА^. Максимальные значения скорости и ДЛтлх получены при добавлении 2,4-0-ОУА (140 нг/мл) к МС-АКК-АТ (25 мкг/мг полимера).

При добавлении синтетических агглютинаторов 2,4-О-ПАА (90 нг/мл) с различным содержанием 2,4-0 к МС-АКК-АТ (15 и 25 мкг/мг полимера) были сняты кинетические кривые, аналогичные приведенным выше для агглютинатора на основе глобулярного белка. Повышение нагрузки антител на полимерные частицы увеличивает значения ДЛ/мин и ААШ11Х. Следует отметить, что для всех МС-АКК-АТ в реакции с 2,4-Б-Г1АА при содержании 2,4-0 2,5 мол.% получены более высокие значения АЛ/мин, чем с 2,4-0-0УА (90 нг/мл), но значения ААтах ниже.

Для проведения реакции ингибирования с целью определения гаптена 2,4-И были выбраны реагенты, имеющие оптимальные показатели в прямой реакции агглютинации. МС-АКК-АТ смешивали со свободным 2,4-П, выдерживали при комнатной температуре, затем добавляли агглютинатор и следили за изменением оптического поглощения. Наибольшая степень ингибирования была зарегистрирована для синтетического агглютинатора (50% ингибирования при 25 нг/мл 2,4-Б).

Таким образом, проведенные исследования показали, что турбидиметрия является простым и быстрым методом изучения реакции латексной агглютинации, который позволяет регистрировать специфическую агрегацию частиц через определенные промежутки времени сразу после введения агглютинирующего агента, а не только по окончании реакции агглютинации, или реакции ингибирования агглютинации. Скорость реакции и предельное значение оптического поглощения, измеряемые в данном анализе, являются важнейшими характеристиками системы, которые дают возможность оптимизировать условия и выбор реагентов для создания дисперсионной тест-системы с инструментальной детекцией результатов.

Ш.5. Использование полимерных микросфер для маркирования холестерина клеточных мембран.

Маркирование компонентов клеточных мембран является одним из важных методов изучения клеток. Количественные изменения в содержании холестерина приводят к развртию атеросклероза, поэтому актуальной задачей является определение количества данного стероида в составе клеточных мембран.

Закономерности взаимодействия полистирольного латексного маркера, содержащего на поверхности дигитонин, и холестерина первоначально были исследованы на модели клетрчной мембраны, которую получали в виде монослоя фосфатидилхолина, холестерина или их смеси в различных мольных соотношениях (0.2-1.0) на водной подложке.

Эксперимент проводили на пленочных весах Ленгмюра при введении латексного маркера в

подложку, ход реакции контролировали по изменению площади монослоя.

При взаимодействии латекс-маркера и дигито-нина с монослоем холестерина площадь монослоя практически линейно увеличивалась, т.е. частицы маркера встраивались в монослой. При введении маркера в подложку, на поверхности которой находился монослой фосфати-дилхолина, приращение его площади не

1,мин

400

Рис.5. Изменение площади монослоя холестирин/ фосфа-тидилхолина (Х/Ф) во времени при введении латекса в подложку, мол. соотношение Х/Ф: 0.2 (1), 0.4 (2), 0.6 (3), 0.8(4), 1.0(5).

происходило, т.е. в данном монослое отсутствовали центры связывания с полимерными частицами, содержащими дигитонин. Таким образом, реакция полимерного маркера с холестерином, входящим в состав монослоя, была специфична.

На рис.5 представлены результаты взаимодействия латексного маркера с монослоями холестерин/ фосфатидилхолин, молярное соотношение которых меняли в диапазоне от 0.2 до 1.0. После установлен™ в результате реакции максимального приращения площади монослоя оно оставалось постоянным не менее 100 мин при всех исследуемых соотношениях. Причем, чем выше концентрация холестерина в монослое, тем больше было максимальное приращение площади, полученное в процессе эксперимента, т.е. возрастало максимальное число частиц суспензии, которые встраивались в монослой за счет специфического взаимодействия с холестерином.

, Исследование кинетических закономерностей взаимодействия латексного маркера с холестерином плазматических мембран клеток при использовании метода СЭМ показало, что кривые по форме практически не отличаются от наблюдаемых при исследовании смещанных монослоев на модельной системе. Эти зависимости имеют два характерных участка: первый соответствует взаимодействию латексных частиц с холестерином, а второй -максимальному числу частиц, которые могут с ним прореагировать. Величина неспецифического связывания латекс-маркера при реакции на биомембране составляла 5-7%.

Таким образом, созданный латексный маркер специфически реагирует не только с

холестерином модельных мембран, но и плазматических мембран клеток и, следовательно,

его можно рекомендовать для широкого применения при проведении биологических

исследований

Глава IV. Выводы.

1. Установлено, что природа ксантеновых красителей, поверхностно-активных веществ и добавок, влияющих на межмолекулярное взаимодействие полимерных цепей, например, водного раствора аммиака, влияют на процесс формирования и роста полиакролеиновых частиц, их диаметр, распределение по размерам, коллоидно-химическую устойчивость.

2. Показано, что при полимеризации стирола с использованием дигитонина в качестве стабилизатора при определенной концентрации мономера и инициатора формируются полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам.

3. Найдено, что использование водного раствора аммиака увеличивает степень ассоциации олигомеров акролеина. За счет этого достигнута высокая чувствительность реакции ингибирования латексной агглютинации с визуальной детекцией результатов при определении гаптена 2.4-D.

4. Разработан способ нерадиоактивного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот на мембране, основанный на применении флуоресцентных полиакролеиновых микросфер для детекции гибридизационного сигнала.

5. Впервые специфическое взаимодействие полистирольных частиц, стабилизированных дигитонином, с холестерином плазматических мембран клеток эндотелия и липидных монослоев подтверждено методом электронной сканирующей микроскопии и методом Ленгмюра-Блоджетт.

6. Доказано, что турбидиметрия является простым и быстрым методом регистрации реакции латексной агглютинации, который может быть использован для создания диагностической тест-системы при определении 2.4-D с инструментальной детекцией результатов.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Црохин Е.П., Гальцева Г.В., Тартаковский И.С., Прозоровский C.B., Радченко О.В., Мисуренко М.К., Лукин Ю.В., Генералова А.Н., Зубов В.П., Бахарев В.Н., Авдеев Д.Н., Трмежникова Н.Д., Костюковский В.М., Вейнблат В.И., Лопаткин ОН., Сергеев A.A., Трифонов В.д., Яковенко П.И. Способ получения антигенного диагностикума. A.c. № 1596747(1989).

2. Щербо С.Н., Лукин Ю.В., Ягофаров СМ., Генералова А.Н., Турчинский М.Ф. Спектрально-люминисцентные свойства молекул красителей, содержащихся в частицах полимерных суспензий,- В сб.: Всесоюзное совещание по молекулярной люминисценции. Тезисы докладов. - Караганда, 1989, с. 130.

3. Зубов В.П., Лукин Ю.В., Бахарев В.Н., Генералова А.Н., Александер С.К., Фидлер Л.М. Новые отечественные иммунолатексные диагностикумы. - В сб.: 1 Всесоюзного съезда иммунологов. Тезисы докладов. - Сочи, 1989, с. 152.

4. Венер Т.И., Генералова А.Н., Лукин Ю.В. Полимерные флуоресцентные метки в качестве биоспецифицеских маркеров. - В сб.: 10-ой конференции молодых ученых по синтезу и исследованиям биологически активных соединений. Тезисы докладов. - Рига, 1989, с. 103.

5. Lukin Yu., Avdeev D., Vener Т., Kuznetsov A., Generalova A., Erokhin E., Zhorov O., Martsev S., Zubov V. Novel biospecific reagents on the fine polymer particles bases. - In: World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. Abstracts. - Kyoto, Japan, 1991, p. 35.

6. Lukin Yu, Generalova A., Trifonov V., Avdeev D., Bakharev V. Immunodispersive diagnostics on polymer microspheres basis. - In: Vl-th Conference of young scientists on Organic and Bioorganic Chemistry. Abstracts. -Bechine, Czechoslovakia, 1989, p. 160.

7. Венер Т.И., Турчинский М.Ф., Кнорре В.Д., Генералова АН., Лукин Ю.В., Щербо С.Н., Туркин С.И., Зубов В.П. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с использованием окрашенных латексов. - Биоорганическая химия, 1990, т. 16, № 3, с. 424426.

8. Povaliy Т.М., Popova E.G., Gusev S.A., Zaitsev S.Yu., Generalova A.N., Gritskova I.A. Method of cell cholesterol marking for scanning electron microscopy - In: Pittsburg Conference oi) Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy (Pittcon-92). Abstracts. - New Orleans, U£A, 1992, p. 945.

9. Lukin Yu. V., Pavlova I.S., Lyubavina I.A., Generalova A.N. Non-instrumental immunoassay tests for herbicides. - In: 2-nd Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analyses. Abstracts. - Lund, Sweden, 1996, p. P-39.

10. Lukin Yu.V., Generalova A.N., Tyrtysh T.V., Eremin S.A. Detection of 2,4-diphlorophenoxyacetic acid by noninstrumental latex immunoassay.- In: Immunochemical Technology for Environmental Applications. ACS Symposium Series 657 (Ed.: Diana S.Aga, E.M.Thurman) American Chemical Society, Washington, DC, 1997, Chapter 8, p. 97-105.

11.Lukin Yu.V., Pavlova I.S., Generalova A.N., Zubov V.P. Detection of herbicidcs by simple immunoassay techniques. - In: 6-th Symposium on Chemistry and Fate of Modern Pesticides , Amsterdam, Netherlands, 1997, p. 46.

12. Lukin Yu.V., Pavlova I.S., Generalova A.N., Zhorov O.V., Martsev S.P. Immunoreagent based on polymer dispersions for immunochemical assays. - In: 12-th International Symposium on Affinity Interactions: Fundamental and Applications of Biomolecular Recognition. Abstracts. -Kalmar, Sweden, 1997, p. PA-21.

13. Lukin Yu.V., Pavlova I.S., Generalova A.N., Eremin S.A. Simple immunoassay for herbicides detection. - In: 9-th International Congress of Pesticide Chemistry. Abstracts.- London, UK, 1998, v. 2, Topics 5-8, p.7 A-048.

14. Lukin Yu.V., Pavlova I.S., Generalova A.N., Zubov V.P., Zhorov O.V., Martsev S.P. Immunoreagent based on polymer dispersions for immunochemical assays - J. of Molecular Recognition, 1998, V. 11, p. 185-187.

15. Генералова A.H., Буряков АН., Лукин Ю.В., Зубов В.П. Турбидиметрические исследования реакции латексной агглютинации при определении 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. - Биоорган, химия, 2000, т. 26, N 6, с. 478-483.

16. Генералова А.Н., Грицкова И.А., Гусев С.А., Зайцев С.Ю. Определение холестерина в клеточных мембранах с использованием полистирольных латексных частиц. - В сб.: Вопросы общей биологии в ветеринарии,- Изд. Моск. гос. акад. вет., мед. и биотехн. им. К.И. Скрябина, 2000, стр. 154-159.

Введение.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Основные принципы биоаналитических исследований.

1.2. Получение полимерных микросфер для биологических исследований.

1.2.1. Способы получения окрашенных полимерных суспензий.

1.2.2. Синтез полимерных суспензий с альдегидными группами на 17 поверхности.

1.3. Применение полимерных микросфер в биоанализе.

1.3.1. Полуколичественные методы (тесты), проводимые при участии 30 частиц полимерных суспензий.

1.3.2. Количественные методы (анализы), основанные на использовании 34 микросфер полимерных суспензий.

1.3.3.Комплексные методы анализа биоспецифических взаимодействий, 38 проявляемых с помощью частиц полимерных суспензий.

Глава II. Экспериментальная часть.

II. 1. Исходные вещества. 52 Н.2. Методы исследования.

Глава III. Результаты и их обсуждение.

III. 1 Синтез полимерных микросфер.

111.1.1. Получение полиакролеиновых микросфер в присутствии 68 ксантеновых красителей.

III. 1.2. Получение суспензий полиакролеина в присутствии 82 поверхностно-активных веществ.

Полимерные синтетические микросферы с узким распределением частиц по размерам применяют в различных областях науки и техники, например, в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии, при подсчете аэрозольных частиц, при малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для счета вирусных частиц, для стимулирования клеточного продуцирования антител и их очистки, в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии, стабильности, седиментации и т.д. [1-4]. В последние годы частицы монодисперсных суспензий нашли широкое применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биоаналитических исследований, основанных на детекции специфических взаимодействий биообъектов. Основные требования, которым в этом случае должны удовлетворять полимерные частицы - это биологическая, химическая и коллоидная устойчивость в физиологических жидкостях, узкое распределение частиц по размерам, возможность образования прочной связи белков и других биолигандов с поверхностными функциональными группами частиц суспензий. Кроме того, необходимо уметь получать дисперсии с заданными размерами частиц, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций [4].

Таким образом, цель данной работы состояла в синтезе полимерных микросфер, содержащих специальные метки (флуоресцентные, хромофорные, дигитонин) для детекции нуклеиновых кислот, гербицида (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) и холестерина при биоаналитических исследованиях.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Основые принципы биоаналитических исследований.

В настоящее время существует большое количество методов, позволяющих определять наличие или концентрацию биохимических лигандов в исследуемых биологических образцах. Определяемый лиганд, как правило, играет важную роль в биохимических процессах, или позволяет диагностировать заболевание, тип крови и многое другое. Значительное место среди данных методов занимают анализы, основанные на специфическом, высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд. К этой паре лиганд-антилиганд могут быть отнесены биоспецифические взаимодействия «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин», «углевод-лектин», «иммуноглобулин-белок А», «транспортный белок-рецепторный белок», «холестерин-дигитонин», «комплементарные олиго- и полинуклеотид» и другие, в образовании которых участвуют электростатические и межмолекулярные силы, действующие на близком расстоянии, а также стереоспецифическая комплементарность молекул [5]. Эти взаимодействия положены в основу иммунохимических методов, гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, маркирования компонентов клеточных мембран и т.д.

Принцип работы иммунодиагностических тестов основан на иммунохимической реакции между антигеном (веществом, несущим признаки генетически чужеродной информации для данного вида организма) и антителами (белками, относящимися к классу иммуноглобулинов, продуцируемыми клетками иммунной системы организма в ответ на появление антигена) с образованием комплекса «антиген-антитело» [6]. Связывание с ацтигеном сопровождается изменениями конформационной структуры антител и приводит к реализации эффекторных функций, которые способствуют удалению антигена из организма. Антитела соединяются с антигеном И-концевым участком молекулы антитела -Бф-фрагментом, содержащим антигенсвязывающий центр. Реакция «антиген-антитело» основана на принципе взаимного узнавания, обусловленном комплементарностью активных центров антитела и детерминантных групп (эпитопов) антигена [7].

Реакция образования такого комплекса является высокоиммуноспецифичной, т.е. на появление в организме определенного антигена иммунная система вырабатывает антитела строго определенного строения, способные взаимодействовать только с этим антигеном. Константа аффинности антител к индивидуальным антигенам составляет 1041012 М"1 [8]. Вследствие того, что и антиген, и антитело могут взаимодействовать одновременно с несколькими молекулами, образуются пространственные сетки, узлами которых служат молекулы антигена.

Образование сеток-агломератов, а, следовательно, и обнаружение того или иного вида антигенов, может быть зарегистрировано различными методами, например, спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, лазерной автокорреляционной спектроскопии и т.д. Использование для обнаружения комплекса «антиген-антитело» специального дорогостоящего оборудования создает заметные трудности для широкого применения указанных методов при диагностике заболеваний. Связывание антигенов (антител) с полимерным носителем, который выполняет индикаторную функцию, позволяет даже невооруженным глазом обнаружить появление комплексов как скопление агломератов частиц носителя, что значительно упрощает проведение анализа, основанного на биоспецифическом взаимодействии «антиген-антитело» [4].

Иммунохимические методы анализа позволяют с уникальной специфичностью анализировать в биологических образцах содержание определенных антигенов, которые свидетельствуют о присутствии инфекционных объектов или аномальных продуктов жизнедеятельности клеток организма, например, характерных для клеток злокачественных новообразований. Значительная часть антигенов является белками, и различия в антигенных свойствах отражают изменения в первичных структурах этих белков в области антигенных детерминант. Наличие таких различий автоматически означает и различие в соответствующих участках генов, т.е. молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или информационных матричных рибонуклеиновых кислот (РНК), кодирующих образование этих белков. В этих случаях узнавание антигенов с помощью иммунохимических методов может быть заменено узнаванием соответствующих участков нуклеиновых кислот [9]. С этой целью может быть использовано уникальное свойство последних образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Свойство комплементарности было впервые сформулировано Уотсоном и Криком в 1953 г., когда они предложили пространственную структуру ДНК в виде двойной спирали, т.е. двух полимерных полинуклеотидных цепей, образующих две спирали, навитые вокруг общей оси. Проведенный ими стереохимический анализ показал, что две цепи будут стабилизированы в единой структуре, если они устроены так, что против каждого остатка аденина и цитозина одной цепи находятся соответственно тимин и гуанин в другой. При этом создаются особо благоприятные условия для образования водородных связей между этими гетероциклическими фрагментами нуклеотидных остатков [10].

Имеющиеся оценки говорят о том, что некоторая последовательность нуклеотидов длиной порядка 20 звеньев может быть с помощью комплементарной последовательности дискриминирована от такой же последовательности, отличающейся всего на один нуклеотид. Такие последовательности получили название ДНК-зондов или РНК-зондов. Поиск определенных нуклеиновых кислот и определение их количества по связыванию с ДНК-зондами получил название гибридизационного анализа [11].

Ключевыми моментами метода гибридизационного анализа нуклеиновых кислот являются техника проведения эксперимента и способы детекции образовавшихся гибридов. Детекция осуществляется с помощью метки, вводимой в ДНК-зонд. Чаще всего

32 125 35 в качестве меток используют радиоактивные изотопы Р, I, Б. Однако, такие зонды нестабильны, небезопасны в работе, дорогостоящи [12]. Эти недостатки ограничивают возможность применения данного способа визуализации реакции гибридизации, особенно в диагностических целях. В связи с этим более перспективными являются нерадиактивно меченые зонды [13]. Метка, с помощью которой происходит детекция после образования гибридов, может быть введена непосредственно в нуклеотидную последовательность, использующуюся в качестве зондов, но для большинства нерадиоактивных методов характерно использование непрямого мечения зондов. В этом случае в зонд вводят специфические лиганды (метки), а после гибридизации лиганды могут быть обнаружены с помощью лиганд-специфических белков. Наибольшее развитие получили методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина (рис.1.1), т.к. он характеризуется сродством (аффинностью) к белку стрептавидину (1015 М-1) и образует устойчивый комплекс «биотин-стрепта-видин» [14]. Визуализация данного комплекса может быть осуществлена с помощью ферментов, частиц коллоидного золота, ионами европия (Еи+3) и т.д. [15, 16], а также при использовании наполненных флуоресцентным красителем полимерных микросфер с функциональными группами на поверхности, которые могут взаимодействовать с первичными аминогруппами белка (стрептавидина).

Одним из способов детекции биоспецифических реакций «антиген-антитело» и «биотин-стрептавидин» заключается в том, что антиген (антитело) или стрептавидин иммобилизуют на полимерные частицы, в результате чего реакцию между компонентами данных пар, которая в этом случае носит название реакции латексной агглютинации, можно наблюдать визуально [4]. Неудобство визуального наблюдения этой реакции состоит в том, что трудно определить конечную точку реакции, так как обычная полимерная суспензия высоким

СН2)4-С-ОН

Рис.1.1. Биотин. имеет белый цвет, который плохо воспринимается глазом. Для устранения этого недостатка было предложено использовать окрашенные латексы [17], которые позволяют повысить чувствительность метода.

Одним из процессов, во многом определяющим развитие таких заболеваний, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, является накопление холестерина в плазматических мембранах различных клеток организма. Холестерин (рис. 1.2.) относится к классу стероидов и является одним из важных компонентов биомембран, который играет определяющую роль в их функционировании [18]. Нарушение сбалансированности транспорта холестерина в клетку и из нее служит главной причиной развития атеросклероза [19, 20]. Однако, сведений о количестве и закономерностях распределения холестерина в плазмолемме клеток в норме и при заболевании недостаточно. Известные в настоящее время методы определения либо требуют большого количества биологического материала [21], либо характеризуются низкой специфичностью [22], либо для выявления холестерина необходимо его присутствие в клетке в значительных количествах, [23, 24]. Все это требует создания простого и доступного метода оценки содержания холестерина и изучения его топографии распределения в мембранах клеток.

В начале 20-го века Виндаус открыл, что холестерин образует со стероидным гликозидом - дигитонином (рис 1.3.)- нерастворимый в спиртовых растворах комплекс, содержащий эквимолярные количества обоих компонентов [25]. Реакция комплексообразования обладает высокой стереоспецифичностью [26].

Рис.1.2. Холестерин.

Аддукт холестерина с дигитонином (холестерин-дигитонид) имеет незначительную растворимость. Благодаря этому дигитонин является наиболее подходящим сапонином для осаждения холестерина.

В некоторых работах предпочтительную роль при взаимодействии компонентов аддукта отдают гидрофобному взаимодействию циклопентапергидрофенантренового цикла [27], а в других рассматривают их как соединения включения [28]. Соединения включения

Ксилоза Галактоза Глюкоза

Рис. 1.3. Дигитонин это "комплекс", в котором один компонент "хозяин" образует кристаллическую решетку, имеющую полости в форме длинных туннелей или каналов, в которых располагаются другие молекулы, "гости". Между "гостем" и "хозяином" не образуется ковалентной связи. Если полость в решетке "хозяина" замкнута со всех сторон так, что молекулы "гости" захвачены как в клетке, такие соединения известны как "клатраты" или "клеточные соединения". Соединения включения занимают промежуточное положение между твердыми растворами внедрения и истинными химическими соединениями. Они образуются за счет стереоспецифической комплементарности, т.е.пространственной связи между молекулой или кристаллической решеткой молекулы "хозяина" и молекулой - "гостем". Включаемое вещество по своей пространственной конфигурации должно соответствовать полости "хозяина" [28]. Н Н

Наиболее перспективным представляется создание маркера холестерина, в котором специфический лиганд будет связан с таким носителем, который можно будет непосредственно регистрировать методами электронной микроскопии. В настоящее время в качестве носителей используют макромолекулы (гемоцианин), биологические частицы (вирусы, бактерии), частицы коллоидного золота [29, 30]. В то же время имеются все данные для создания количественного метода определения холестерина в мембранах клеток на основе полимерных носителей, содержащих в своем составе дигитонин, способный специфически связываться с холестерином.