Разработка и исследование спектрометров и биосенсорных аналитических устройств на принципе оптического кругового дихроизма с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

На правах рукописи

Чулков Дмитрий Петрович

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОМЕТРОВ И БИОСЕНСОРНЫХ АНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ НА ПРИНЦИПЕ ОПТИЧЕСКОГО КРУГОВОГО ДИХРОИЗМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОДАТЧИКОВ НА ОСНОВЕ НАНОКОНСТРУКЦИЙ ДНК

Специальность: 01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

5 ДЕК 2013

Москва-2013 005543654

005543654

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт спектроскопии Российской академии наук (ИСАН)

Научный руководитель: заведующий лабораторией

доктор физико-математических наук Компанец Олег Николаевич Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Баграташвили Виктор Николаевич

доктор физико-математических наук Иванов Андрей Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Научно-технологический центр уникального приборостроения РАН

Защита состоится « 26 » декабря 2013 года в «14» час. «00» мин. на заседании диссертационного совета Д002.014.01 при ФГБУН Институт спектроскопии РАН по адресу: 142190, г. Москва, г. Троицк, ул. Физическая, дом 5.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке при ФГБУН Институт спектроскопии РАН или на сайте Института: www.isan.troitsk.ru.

Автореферат разослан 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д002.014.01, ^^ ,

кандидат физико-математических наук / Пыталев Д. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Наша жизнь диктует возрастающую с каждым годом необходимость разработки новых методов и приборов медицинской диагностики, контроля качества потребляемых продуктов питания, лекарственных препаратов для высокочувствительного и одновременно экспрессного определения в них опасных для здоровья и жизни соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки. К таким соединениям (генотоксикантам) относятся антибиотики, противоопухолевые и другие лекарственные препараты, тяжелые металлы, диоксины и т.п. соединения, наночастицы которые следует определять в физиологических жидкостях (плазма крови, урина, вода и др.).

Решение этой проблемы традиционными методами и с помощью традиционной аналитической аппаратуры затруднено тем, что такое определение является процедурой дорогостоящей, требует значительного времени (сутки), необходимое оборудование стоит многие десятки тысяч долларов, работать на нем должен высококвалифицированный персонал, а чувствительность и избирательность определения биологически активных и токсичных соединений (БАС) оказываются не всегда достаточными. По этой причине создание альтернативных экспрессных методов анализа биологических жидкостей и портативной высокочувствительной аналитической аппаратуры является исключительно важной и актуальной задачей.

Альтернативу традиционным методам составляют биосенсорные методы анализа, использующие чувствительные элементы (биодатчики) в комбинации с различного рода преобразователями. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что большая часть коммерчески доступных в настоящее время биосенсорных аналитических устройств (биосенсоров) создана на основе ферментов. Однако развитие биосенсорики и биомедицины и решаемые в их рамках аналитические задачи расширяют горизонты для создания нового поколения биодатчиков, например, на основе молекул биополимеров, обладающих широкими аналитическими возможностями.

В последнее время большое внимание привлекает применение в биосенсорике оптически активных структур на основе частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (далее ХЖКД ДНК), получаемых методом «фазового исключения» жестких линейных нативных двухцепочечных молекул ДНК низкой молекулярной массы (< МО6 Да) из водно-солевых растворов, содержащих нейтральные синтетические полимеры, в частности, полиэтиленгликоль. Такие частицы ХЖКД ДНК называют также «жидкие наноконструкции ДНК» (НаК ДНК) [1].

На основе НаК, благодаря их уникальным свойствам (высокая химическая реакционная способность, спирально-закрученная

пространственная структура соседних слоев молекул ДНК, высокая локальная концентрация молекул ДНК, аномальный круговой дихроизм), в ИМБ РАН созданы семейства высокоэффективных полифункциональных и специализированных биодатчиков, в том числе стабилизированных форм, получаемых путем иммобилизации частиц «жестких» («сшитых» наномостиками) НаК ДНК в полимерном гидрогеле [2,3].

Изменение под действием БАС из контактирующей с биодатчиком жидкости оптической активности биодатчика (вплоть до ее полного исчезновения), которое регистрируется при помощи портативного спектрометра кругового дихроизма (дихрометра), в этом случае может быть прямо связано с концентрацией БАС в жидкости [4,5] и использовано для решения упомянутой выше проблемы.

Целью данной диссертационной работы является исследование возможностей метода кругового дихроизма и биодатчиков на основе наноконструкции ДНК для высокочувствительной регистрации спектров КД биологически активных и токсичных соединений (БАС) и создания высокоэффективных биоаналитических устройств (оптических биосенсоров) для применений в биомедицине, фармакологии, экологии, пищевой промышленности.

Для достижения указанной цели в диссертационной работе были поставлены следующие основные задачи:

1. Провести модернизацию портативного полифункционального спектрометра кругового дихроизма (КД) для работы с биодатчиками, содержащими наноконструкции ДНК, и биосенсорного анализатора (оптического биосенсора) на их основе для определения БАС в жидкости.

2. Исследовать возможность использования полимерных оптически активных материалов на основе наноконструкции ДНК в качестве дополнительных (вторичных) стандартов для тестирования и калибровки дихрометров и характеризации биологически активных веществ.

3. Исследовать особенности спектров КД биодатчиков на основе наноконструкций ДНК при их взаимодействии с различными БАС для обоснования разработки специализированных компактных одноволновых спектрометров кругового дихроизма.

4. Разработать и исследовать различные версии компактного одноволнового дихрометра и оптических биосенсоров на их основе для детекции и определения наличия и концентрации в жидкости различных БАС.

Научная новизна выполненных по теме диссертации работ подтверждается научными публикациями, патентами и заявками на изобретения.

Практическая значимость работы подтверждается тем, что разработанные биосенсорные аналитические системы уже используются для проведения научных и прикладных исследований, в первую очередь для разработки новых типов биодатчиков на основе наноконструкций ДНК и аналитических методик с их использованием (ИМБ РАН), а также для контроля содержания и качества некоторых противоопухолевых и фитопрепаратов в учреждениях биомедицинского профиля. На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработан и исследован портативный полифункциональный дихрометр с расширенным в УФ область до 200 нм рабочим диапазоном, приспособленный для высокочувствительной регистрации спектров КД

БАС с помощью биодатчиков, содержащих наноконструкции ДНК, и на его основе реализована портативная биосенсорная аналитическая система (оптический биосенсор) биомедицинского назначения для определения в жидкости наличия и концентрации БАС.

2. На основе исследования особенностей спектров КД полимерных оптически активных материалов (ПОАМ), содержащих наноконструкции ДНК, показана возможность использования ПОАМ в качестве дополнительных (вторичных) стандартов оптической активности на достаточно большом наборе дискретных длин волн в УФ- и видимой областях спектра для тестирования и калибровки спектрометров кругового дихроизма и характеризации БАС.

3. Разработан новый компактный одноволновый дихрометр, работающий только на одной длине волны, соответствующей максимуму аномальной полосы КД специализированного (под определяемое БАС) биодатчика, содержащего наноконструкции ДНК, и на его основе реализованы компактные биоаналитические устройства (биосенсоры) для определения содержания БАС в жидкости.

4. Предложены две модификации многофункциональной биосенсорной аналитической системы для определения характеристик КД оптически активных веществ и их концентрации в жидкости с дискретным переключением длин волн комплексного источника излучения в УФ и видимом диапазонах.

5. На примере определения ряда БАС (дауномицин, гепарин, гомоцистеин, гипорамин и другие соединения) показано, что разработанные на основе портативных полифункциональных и одноволновых специализированных дихрометров с использованием ДНК-биодатчиков биоаналитические тест-системы (биосенсоры) способны определять концентрацию БАС в жидкости с чувствительностью, сравнимой с чувствительностью определения тех же аналитов при помощи традиционных (био)химических аналитических методов и приборов.

Лнчный вклад автора:

Результаты, представленные в диссертационной работе, получены автором лично либо при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими исполнителями работы и соавторами публикаций. Апробация результатов работы:

Результаты работы прошли апробацию на следующих конференциях:

1. Конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», декабрь 2009г., РАН, Москва.

2. Конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», декабрь 2010 г., РАН, Москва.

3. III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010», июнь 2010 г., МГУ, Москва.

4. Конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», декабрь 2011 г., РАН, Москва.

5. V Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» ТКМФ-5, Троицк М.о., июнь 2012 г..

6. Научная конференция, посвященная обсуждению итогов реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», сентябрь 2013 г., МИСиС, Москва.

7. Ежегодная Всероссийской научная школа-семинар «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2013» , Саратов, СГУ имени Н.Г. Чернышевского, ноябрь 2013 г..

Структура и объём диссертационной работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы из 42 наименований, изложена на 128 страницах и содержит 37 рисунков, 2 таблицы и 40 формул.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во Введении приводится обоснование выбора темы диссертационной работы и её актуальности; сформулированы основные задачи диссертационной работы, научная новизна и практическая значимость; содержатся сведения об апробации работы и её структуре; сформулированы выносимые на защиту положения и приведен список публикаций в области рассматриваемой темы.

Описан нанотехнологический подход к конструированию биодатчиков на основе двухцепочечной ДНК. Приведено описание принципа работы дихрометра и биосенсора на его основе с использованием содержащего НаК ДНК биодатчика. Показаны этапы развития биосенсорных аналитических устройств на основе ДНК-биодатчиков и дихрометров.

В первой главе «Разработка и исследование портативного полифункционального дихрометра (СКД-2МУФ)» описаны принцип и особенности работы портативного полифункционального дихрометра, приспособленного для высокочувствительной регистрации спектров КД биологически активных соединений (БАС) с помощью биодатчиков на основе наноконструкций ДНК. Приведены рассчитанная оптическая и функциональная схемы работы дихрометра. Показаны и обоснованы усовершенствования и новые физико-технические решения, позволившие расширить рабочий диапазон, точность измерения и надежность работы дихрометра.

В первом параграфе описан принцип работы портативного полифункционального дихрометра. На Рис. 1 приведена структурная схема дихрометра, определяющая основные его функциональные части, их назначение и взаимосвязи.

Модуляция круговой поляризации

Рис. I. Структурная схема дихрометра

Источник света (ксеноновая газоразрядная лампа) излучает широкополосный световой поток, попадающий на вход монохроматора, который вырезает из широкополосного излучения узкополосный световой поток, длина волны которого может перестраиваться с помощью дифракционной решетки. Этот поток проходит через призму-поляризатор, становится линейно поляризованным с заданным направлением вектора поляризации и попадает на оптический вход фотоэластического модулятора круговой поляризации, на выходе из которого становится циркулярно поляризованным с периодически изменяющимся направлением вращения вектора поляризации. При прохождении кюветы с исследуемым образцом (биодатчик/биодатчик в контакте с содержащей БАС жидкостью), обладающим свойством аномального КД, на выходе фотоприемника (ФЭУ) цифровой системы регистрации возникает электрический сигнал, переменная составляющая которого на частоте модуляции круговой поляризации излучения пропорциональна величине кругового дихроизма ДА = (Ак - А/,). Постоянная составляющая электрического сигнала на выходе фотоприемника,

пропорциональная поглощению в веществе, поддерживается неизменной с помощью отрицательной обратной связи в цепи питания ФЭУ. Одновременное измерение переменной и постоянной составляющих электрического сигнала эквивалентно измерению отношения величин КД и поглощения в веществе (ДА/А). Прокалибровав прибор по известному эталону КД, становится возможным измерять величину сигнала КД в требуемых единицах в области длин волн эталона.

С выхода фотоприемника сигнал поступает на вход цифровой системы регистрации, на другой вход которой подается опорный сигнал с частотой модуляции поляризации. В системе регистрации сигнал усиливается, фильтруется, преобразуется в цифровой код, передается в компьютер для обработки и выводится на экран монитора. Интерфейсная плата на основе микроконтроллера осуществляет необходимое взаимодействие всех элементов устройства, сбор и предварительную обработку сигнала КД и передачу данных в компьютер, а также тестирование параметров дихрометра.

Во втором параграфе описаны назначение, конструкция и принцип работы узлов и элементов, формирующих оптическую систему дихрометра.

Источником излучения в дихрометре служит широкополосная ксеноновая лампа L2273 фирмы Hamamatsu. Благодаря оригинальному решению, согласно которому конструкция узла лампы оставляет анод совершенно свободным (при этом он охлаждается потоком воздуха, создаваемым вентилятором между внешним корпусом и внутренним корпусом домика, в котором размещена прозрачная кварцевая часть лампы), удалось избежать потери излучения за счет поглощения озоном при работе в УФ диапазоне. Источник излучения обеспечивает оптимальный температурный режим работы ксеноновой лампы и нужную интенсивность светового потока во всем диапазоне длин волн от 200 до 750 нм. В области длин волн 200 нм выход УФ излучения составил 120 мкВт, что более чем в 2 раза превышает уровень, достигаемый в прототипе дихрометра (СКД-2М).

Были исследованы две осветительные системы, построенные на одном сферическом зеркале с радиусом кривизны 100 мм: с входным апертурным углом 24,1 град, (работа при примерно трехкратном увеличении) и другая, имеющая малый апертурный угол и, соответственно, световой диаметр, и работающая при единичном увеличении. На основании проведенного расчета сделан вывод, что существенный выигрыш (примерно на порядок) по световому потоку в направлении входной щели монохроматора получается, если ограничить световой размер зеркала 26 мм (апертурный угол 7,3 град) и расположить его по отношению к источнику под углом 32 град и на расстоянии 108,4 мм от входной щели (0,4x4 мм) монохроматора.

В рамках выполнения работы проанализированы существующие оптические схемы монохроматора дихрометра и выбрана хорошо зарекомендовавшая себя схема Черни-Тернера с горизонтальным ходом луча с компенсацией комы Фасти. При работе в диапазоне длин волн более 400 нм для снижения уровня фоновой засветки за счет УФ излучения, направляемого дифракционной решеткой монохроматора по пути светового потока во втором порядке отражения, в световой поток перед входной щелью монохроматора вводится поглощающий УФ излучение спектральный фильтр.

В качестве исполнительного механизма поворота дифракционной решетки вместо используемого в СКД-2 малотехнологичного электродинамического привода применен надежный шаговый привод на базе поворотного устройства 8MR174 (фирмы «Standa»), доработанного с целью юстировки решетки, обеспечивающий разрешение позиционирования длины волны не хуже 0,02 нм и время ее перестройки на 30 нм не более 2 с.

При установке комплекта зеркал с радиусом кривизны 400 мм монохроматор обеспечивает в диапазоне длин волн 200 - 750 нм вполне достаточное для работы спектральное разрешение 1,7 нм.

Для получения высокой степени поляризации излучения в качестве поляризатора используется прямоугольная призма полного внутреннего отражения (ПВО) из нелинейного одноосного кристалла - широко распространенного в практике квантовой электроники и нелинейной оптики

кристалла КДП или негигроскопичного ТВО, обладающего на порядок большей анизотропией. Для выделения линейно поляризованного светового потока с выбранным направлением вектора поляризации (обыкновенный луч) на выходе поляризатора поставлена регулируемая спектральная щель.

Для выбора модулятора круговой поляризации было проведено экспериментальное сравнение характеристик электрооптической ячейки на основе жидкокристаллического сегнетоэлектрика и характеристик модулятора фотоэластического типа, на основании результатов такого сравнения в дихрометре применен более эффективный модулятор фотоэластического типа.

Узел термостатируемой кюветы для размещения образцов усовершенствован. Он выполнен разъёмным, из двух половин, каждая из которых конструктивно объединена с двумя элементами Пельтье и радиатором и имеет возможность скользящего перемещения в общем корпусе, что позволяет обеспечить плотное соприкосновение стенок юоветного отсека со стенками кварцевой кюветы и регулируемую силу прижатия для минимизации напряжений, возникающих в материале кюветы (кварц УФ-1) при её установке в прибор.

Применение широтно-импульсного регулятора для регулирования мощности, подводимой к элементам Пельтье, позволило существенно уменьшить габариты и повысить к.п.д. устройства. Микропроцессорный контроллер обеспечивает все необходимые функции регулятора температуры. Точность поддержания температуры на каждой ее ступени составила величину 0,5 °С, время выхода на заданную температуру с такой точностью - не более 10 минут во всем диапазоне рабочих температур 12 - 80 °С. Плата управления термостатом оказалась вполне приемлемых размеров, что позволило разместить ее в корпусе дихрометра (в отличие от прототипа СКД-2).

В третьем параграфе приведено описание системы регистрации дихрометра. В качестве фотоприёмника используется фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) Ш464 фирмы НАМАМАТБи с входным окном, имеющим пренебрежимо малый собственный остаточный дихроизм. Предварительный усилитель (ПУ) усиливает электрический сигнал ФЭУ, пропорциональный

прошедшему через исследуемую пробу световому потоку, в полосе частот от постоянного тока до 100 - 200 кГц, то есть постоянную и переменную составляющие сигнала на частоте модуляции 50 кГц. Далее постоянная составляющая сигнала выделяется фильтром нижних частот с полосой пропускания до 200 Гц, переменная составляющая выделяется активным полосовым фильтром, настроенным на частоту модуляции, детектируется синхронным детектором и через мультиплексор поступает на вход АЦП, который преобразует сигнал в цифровую форму. Делением обеих составляющих сигнала (постоянной и переменной) осуществляется нормирование регистрируемого сигнала кругового дихроизма.

В четвертом параграфе описан алгоритм работы прикладного программного обеспечения (ППО) дихрометра и показаны его основные функции. ППО, установленное на внешнем компьютере, осуществляет управление режимами работы дихрометра, визуальное отображение результатов измерения на экране персонального компьютера, сохранение и документирование результатов измерений, выполнение различных действий по обработке экспериментальных результатов, задание и поддержание температурного режима анализируемых проб, тестирование и диагностику аппаратной и программной частей прибора.

Алгоритм выполнения измерений спектров КД биодатчиков, БАС и концентрации БАС в исследуемых образцах состоит из следующих этапов:

■ Запись собственных шумов («базовой линии») дихрометра;

■ Измерение спектров КД БАС и аномального КД биодатчика;

■ Калибровка дихрометра перед проведением аналитических измерений (снятие калибровочной кривой);

■ Определение неизвестных концентраций БАС в жидкости.

Во втором разделе параграфа кратко описаны процедуры настройки и калибровки дихрометра. Для приведения рабочих характеристик дихрометра к параметрам измерительного прибора проводятся калибровка по длине волны его монохроматора и модулятора круговой поляризации и калибровка по оптической плотности регистрируемого дихрометром сигнала КД.

Во второй главе «Калибровка спектрометров кругового дихроизма с помощью полимерных оптически активных материалов» показана возможность применения полимерных оптически активных материалов, содержащих наноконструкции ДНК, в качестве вторичных стандартов оптической активности для калибровки спектрометров кругового дихроизма на примере разработанного полифункционального дихрометра.

В первом параграфе показана актуальность проблемы калибровки спектрометров оптического кругового дихроизма (КД) и поставлена задача поиска среди различных оптически активных соединений новых кандидатов на роль стандартов кругового дихроизма для калибровки спектрометров КД. Описаны существующие на данный момент средства и соединения, используемые в качестве стандартов для калибровки спектрометров КД, и обоснована их недостаточность для калибровки в широком диапазоне длин волн. Показано, что ошибка измерения КД даже при помощи поверенных по первичному эталону спектрометров может достигать 30% и более [6].

Проведен анализ литературных данных о физико-химических свойствах и характеристиках известных оптически активных соединений, проявляющих КД в УФ и видимом диапазонах спектра данных, который показал, что эти соединения не обладают стабильностью характеристик КД при хранении и могут быть использованы для целей калибровки только непосредственно после их приготовления, что препятствует их применению в качестве стандарта КД.

В связи с этим при выполнении диссертационной работы была исследована возможность использования в качестве стандартов для калибровки измерений КД в широком диапазоне длин волн полимерных оптически активных материалов (ПОАМ), содержащих в своем составе наноконструкции ДНК, имеющих характерные для них заданные стабильные во времени характеристики КД в определенном интервале длин волн в УФ и/или в видимом диапазоне спектра и сохраняющих эти характеристики при хранении, по меньшей мере, в течение нескольких месяцев после их изготовления. Другой задачей работы являлась разработка способа поверки и калибровки дихрометров для проведения измерений КД различных исследуемых

материалов по результатам измерений характеристик сигнала КД указанных полимерных оптически активных материалов.

Во втором параграфе показано, что оптическую активность частиц «жидких» НаК ДНК, проявляемую в виде аномальной полосы в спектре КД в области поглощения хромофоров ДНК при облучении циркулярно-поляризованным излучением на длине волны 270 нм, как и оптическую активность, проявляемую в спектре КД в области поглощения хромофоров ряда комплексов «ДНК-интеркалятор» в видимой области, определенно можно использовать в широком диапазоне длин волн от УФ до ИК области в качестве стабильных характеристик сигнала КД, а структуры, содержащие наноконструкции ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор», рассматривать в качестве дополнительных (вторичных) стандартов КД, предварительно аттестовав их характеристики КД при помощи первичного стандарта на основе водных растворов d-10-камфорсульфоновой кислоты (КСК) или менее гигроскопичных кристаллов d-10-камфорсульфоната аммония (КСА).

Предложено в качестве таких дополнительных (вторичных) стандартов использовать частицы «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор» с одним из известных интеркаляторов (дауномицин, митоксантрон, сангвиритрин, красители PicoGreen, SYBR Green и др.), а также комплексов ДНК с несколькими (до четырех) интеркаляторами одновременно. Проблема стабилизации свойств частиц «жидких» НаК ДНК решена в ИМБ РАН за счет иммобилизации этих частиц в полимерном гидрогеле, созданном на основе макромономера полиэтиленгликоля (ПЭГ). Проницаемость гидрогеля для низкомолекулярных веществ открывает возможность для диффузии молекул разных соединений в гидрогель и последующего их взаимодействия с размещенными в гидрогеле молекулами ДНК, в том числе молекул интеркаляторов, входящих в состав частиц «жидких» НаК ДНК.

5-е-81

1-й

(з

О %

е 5§; В

8, 3

X

"5

£ я л

ОС I

х а>ж = 2 ?

¿О® 2 = §

яГса©

= «о. ^

Я ^¿¡аЬ ^ 2 ПЛ П

<0 XX X

5

е-

700

г-

300

400 500

Длина волны, нм

Рис.2. Некоторые соединения в свободном виде (жирные линии ) и включенные в структуру частиц НаК ДНК, иммобилизированных в составе ПОАМ (пунктирные линии), проявляющие круговой дихроизм на разных длинах волн

В третьем параграфе описан разработанный способ (алгоритм) калибровки дихрометра и измерений характеристик сигнала КД в широком диапазоне длин волн. Показано, что, используя указанный способ калибровки, можно определить (измерить) величину аномального кругового дихроизма, проявляемого любым ПОАМ, содержащим частицы наноконструкций ДНК (НК), в полосе 270 нм и в дополнительной, специфической для его НаК полосе, и, используя его в качестве дополнительного стандарта КД на длине волны экстремумов указанных полос, проводить с его помощью калибровку спектрометров КД и измерение КД любых других веществ.

При реализации способа используются такие факторы, как (1) близость аномальной отрицательной полосы в спектре КД ПОАМ в УФ области (270 нм) к полосе КД положительного знака на 290,5 нм первичного эталона - водного раствора КСК, (2) наличие дополнительной аномальной оптической активности ПОАМ, проявляемой в виде дополнительных полос в спектре их КД на

достаточно большом наборе длин волн в диапазоне от УФ до ИК области, и (3) наличие для каждого ПОАМ, при соблюдении фиксированных условий их получения (формирования), определенного соотношения между амплитудой аномальной полосы в спектре КД, расположенной в УФ области вблизи 270 нм, и амплитудой дополнительных полос в видимом диапазоне.

Таким образом были определены характеристики КД в оптических единицах дополнительного стандарта на основе ПОАМ, содержащего «жидкие» НаК ХЖКД ДНК, на длине волны 270 нм; ПОАМ, содержащего в своем составе частицы НаК комплекса «ДНК-SYBR Green», на длине волны 500 нм и ПОАМ, имеющего в своем составе сшитые наномостиками частицы «жестких» НаК ДНК, на длине волны 515 нм.

Поскольку технология формирования ПОАМ на основе разного рода наноконструкций ДНК [2,3] не препятствует получению стабильных характеристик их КД на многих длинах волн в широком спектральном интервале от УФ до ИК области, то можно изготовить комплекты таких ПОАМ, обладающих аномальным КД на дискретных длинах волн в УФ и видимом диапазонах спектра, и использовать их не только в качестве дополнительных стандартов для более точной калибровки спектрометров КД в широком диапазоне длин волн, но также и для более корректного определения (измерения) на этих длинах волн характеристик КД исследуемых природных соединений, химических веществ и синтетических материалов, обладающих этим свойством, в том числе для контроля качества самих ПОАМ, используемых как биодатчики биосенсорных аналитических систем.

Третья глава «Разработка и исследование компактных одноволновых дихрометров» посвящена разработке новых портативных дихрометров, работающих с использованием ДНК-биодатчиков на дискретных длинах волн^

В первом параграфе приведено обоснование выбора направления разработки нового дихрометра. В таком устройстве для определения конкретного БАС используется специфический для него биодатчик на основе

НаК ДНК, реагирующий на нарушение их целостности и конформационных свойств изменением аномального сигнала кругового дихроизма (КД), а регистрация изменения сигнала КД осуществляется с помощью дихрометра, работающего только в одной полосе в УФ или видимом диапазоне [7].

Такой выбор предопределил отказ от громоздких и дорогих широкополосного лампового источника излучения, монохроматора и фотоэлектронного умножителя. Кроме этого, благодаря реализации системы управления дихрометром на базе встраиваемого компьютера (ВК), удается значительно уменьшить вес и габаритные размеры прибора.

В этом же параграфе описан состав и принцип работы первого реализованного экспериментального образца компактного дихрометра с использованием гелевых ДНК-биодатчиков (СКД-4), показана его функциональная схема и приведены технические характеристики.

Во втором параграфе описана более поздняя версия компактного дихрометра (СКД-4М) с расширенными коммуникационными возможностями (рис. 3). Ее габаритные размеры уменьшены до 210x314x350 мм, что важно для использования прибора в мобильных комплексах экспресс-диагностики. Для распечатки результатов тестов предусмотрена возможность установки встраиваемого термопринтера. Для упрощения процедуры ввода в систему информации о биодатчиках предусмотрено подключение сканера штрих-кодов, имеется возможность передавать данные по беспроводным каналам Wi-Fi и Bluetooth, в сети Ethernet, а также интегрировать прибор в современные лабораторные информационные системы.

Рис. 3. Фото одноволнового дихрометра (СКД-4М) со встроенным компьютером (слева - дихрометр без кожуха, вид сбоку)

В третьем параграфе описано программное обеспечение одноволнового дихрометра (СКД-4М). Показан графический интерфейс пользователя и дано описание основных функций и алгоритма работы программы. Приведен алгоритм расчета оптимального значения величины рабочего тока светодиодов осветителя и коэффициентов усиления при калибровке и измерении сигнала КД. Коэффициенты усиления и входное напряжение подбираются программой для каждого исследуемого образца и каждого светодиода. Программное обеспечение осуществляет реализацию режимов работы дихрометра, визуальное отображение результатов измерения на экране ВК, сохранение и документирование результатов, обработку экспериментальных данных, вычисление неизвестной концентрации БАС в жидкости с помощью предварительно построенных калибровочных графиков.

В четвертом параграфе описано устройство и принцип работы многофункциональной системы для определения характеристик КД ПОАМ, предложенной в двух вариантах. В отличие от одноволнового дихрометра, в такой системе формируется несколько излучателей, подобранных соответственно выбранному режиму и излучающих на заданных длинах волн, в

том числе в УФ области. В качестве источника УФ излучения предложено использовать миниатюрную дейтериевую лампу, в качестве источников видимого излучения - узкополосные миниатюрные светоизлучающие диоды с высокой яркостью излучения, а устройство их крепления выполнить в виде вращающейся турели с многопозиционным диском или в виде многопозиционных держателей с зеркалами так, чтобы излучатели располагались на одной оптической оси с поляризатором, спектральной щелью, модулятором, кюветой и фотодетектором в течение времени работы системы в нужном режиме.

Такая система, будучи относительно компактной, без какой-либо потери чувствительности регистрации сигнала КД, может быть приспособлена для работы в шести режимах: поверки (калибровки) системы в УФ и видимой области спектра; тестирования оптических свойств БАС; калибровки оптических свойств ПОАМ на основе наноконструкций ДНК и контроля их оптической активности перед их использованием в качестве биодатчиков; определения скорости диффузии БАС в ПОАМ и/или исследования динамики трансформации наноконструкций ДНК при взаимодействии с БАС; определения наличия и концентрации БАС в исследуемой жидкости.

Результатом реализации сделанного предложения стал действующий лабораторный макет многофункциональной системы (в варианте с вращающейся турелью).

В четвертой главе «Разработка и исследование биосенсорных аналитических систем на основе разработанных дихрометров и ДНК-биодатчиков» приведено описание реализованных биосенсорных аналитических устройств (оптических биосенсоров) и даны примеры их использования в ряде аналитических задач.

В первом параграфе приведено описание разработанного совместно с ИМБ РАН высокоэффективного биосенсорного аналитического устройства (биосенсора) для определения концентрации гепарина в жидкости. Работа биосенсора основана на регистрации полифункциональным дихрометром

изменений аномального сигнала КД, присущего биодатчику на основе наноконструкций ДНК, при его взаимодействии с молекулами гепарина, содержащимися в анализируемой жидкости. Измерение концентрации гепарина в лекарственных препаратах производится при помощи аналитической программы «Биосенсор» с использованием калибровочной кривой, представляющей собой зависимость величины изменения аномального сигнала, генерируемого биодатчиком, от концентрации находящегося с ним в контакте гепарина. В результате проведенных исследований было показано, что биосенсор на основе разработанного в ИСАН полифункционального дихрометра с использованием ДНК-биодатчиков разработки ИМБ РАН обеспечивает порог обнаружения гепарина в жидкости не более 0,5 мкг/мл, при этом время анализа одной пробы составляет всего около 5 мин.

Во втором параграфе кратко приведены результаты других работ, выполненных с использованием оптических биосенсоров.

Полифункциональный дихрометр (СКД-2МУФ) использовался в ИМБ РАН для определения наличия и концентрации антибиотика дауномицина (ДАУ) в биологической жидкости (в модельном лабораторном растворе и в крови пациентов). Содержание ДАУ определяли путем измерения величины приобретенной ДНК-биодатчиком за счет интеркаляции ДАУ аномальной оптической активности в видимой области спектра на X ~ 505 нм [8]. Величина сигнала КД измерялась при помощи аналитической программы «Биосенсор», учитывающей предварительно измеренную калибровочную зависимость сигнала КД от концентрации ДАУ. Минимальная концентрация ДАУ, определяемая в крови пациента при помощи оптического биосенсора на основе НаК ДНК и дихрометра СКД-2МУФ, составила величину 5,0-10"7 М - лучше или сопоставимую с пределами определения дауномицина при помощи классических методов и аппаратуры.

Полифункциональный дихрометр использовался в ИМБ РАН и в исследованиях спектра КД «жестких» частиц наноконструкций комплексов (ДНК-гадолиний) [8], предполагаемых к использованию в качестве «носителей» гадолиния в нейтрон-захватной терапии, а также в экспериментах по оценке

влияния наночастиц золота на свойства биологических объектов (исследовалось действие таких частиц на пространственно упорядоченную структуру ХЖКД ДНК как модельной системы) [9].

В третьем параграфе приведены результаты исследования с помощью одноволнового дихрометра (СКД-4) биодатчиков, обладающих выраженными комплексообразующими свойствами по отношению к ионам Си2+, на примерах определения некоторых лекарственных препаратов растительного происхождения по методике, разработанной сотрудниками ИМБ РАН и ВИЛАР РАСХН [10]. Было установлено, например, наличие прямо пропорциональной связи между величиной относительного изменения сигнала кругового дихроизма, генерируемого биодатчиком, и концентрацией гипорамина (в интервале от 0,5 до 4 мкг/мл), что позволяет использовать эту зависимость в качестве калибровочной прямой.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при помощи разработанных биосенсорных устройств можно не только проводить предварительный скрининг лекарственных препаратов, но и определять их достаточно низкие концентрации.

При использовании частиц НаК ДНК, иммобилизованных в синтетические полимерные матриксы (гелевые/пленочные ДНК-биодатчики), оптический биосенсор можно использовать и как диффузометр при анализе механизмов транспорта БАС и определении их коэффициентов диффузии в указанных матриксах. Полученные коэффициенты диффузии молекул двух сильно отличающихся по молекулярной массе БАС (гомоцистеин, гепарин), проникающих в гидрогель и разрушающих наномостики НаК ДНК, согласуются с состоянием геля и размером этих молекул [10].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ В Заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационной работы:

1. Разработан и исследован новый портативный вариант полифункционального дихрометра, приспособленный для регистрации спектров КД биологически активных соединений (БАС) с помощью биодатчиков на основе наноконструкций ДНК, изменяющих присущий им аномальный сигнал КД при взаимодействии с БАС из находящейся в контакте с биодатчиком жидкости. По сравнению с прототипом дихрометр имеет расширенный в УФ область до 200 нм рабочий диапазоном, более высокую (в 5 раз) точность и воспроизводимость результатов спектральных измерений и более высокую надежность работы в целом. На основе разработанного дихрометра и указанных выше ДНК-биодатчиков реализована портативная биосенсорная аналитическая система (оптический биосенсор) биомедицинского назначения для определения в жидкости наличия и концентрации БАС.

2. Показана возможность использования полимерных оптически активных материалов (ПОАМ) на основе наноконструкций ДНК, включенных в состав полиэтиленоксидных гидрогелей, в качестве дополнительных (вторичных) стандартов оптической активности на достаточно большом наборе дискретных длин волн в УФ- и видимой областях спектра для тестирования и калибровки спектрометров кругового дихроизма и характеризации БАС. Проведение предложенных калибровочных процедур означает, что при помощи полифункционального дихрометра и ПОАМ, калибруемых по первичному эталону на длине волны 290,5 нм, можно проводить корректное определение оптической активности любого другого оптически активного соединения или материала, обладающего этим свойством, исходя из определенного соотношения регистрируемых дихрометром сигналов КД этого соединения (материала) и вторичного стандарта на основе ПОАМ, а также контролировать качество используемых соединений и материалов, в том числе биодатчиков на основе ПОАМ.

3. Разработан и исследован новый компактный одноволновый дихрометр, регистрирующий КД на дискретной длине волны, соответствующей аномальной полосе КД специализированного (под определяемое БАС) биодатчика на основе наноконструкций ДНК, и реализован оптический биосенсор на их (дихрометр + биодатчик) основе. Предложены две модификации многофункциональной аналитической системы, работающей в УФ и видимом диапазонах с дискретным переключением длин волн излучения комплексного источника излучения, для определения характеристик КД оптически активных материалов, в том числе биодатчиков на основе наноконструкций ДНК.

4. На примерах определения ряда модельных БАС (гепарин, дауномицин, гомоцистеин, фитопрепараты), выполненного в ряде организаций биомедицинского профиля с использованием разработанных дихрометров и ДНК-биодатчиков, показано, что созданные на их основе портативные оптические биосенсоры имеют высокую эффективность и способны определять концентрацию в жидкости БАС с чувствительностью, сравнимой с чувствительностью определения тех же аналитов при помощи традиционных (био)химических аналитических методов и приборов. Оптический биосенсор можно использовать также и как диффузометр при анализе механизмов транспорта БАС и определении их коэффициентов диффузии в полимерных матриксах.

Результаты диссертационной работы отражены в следующих материалах: Публикации:

1. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, М.А.Павлов, Д.П.Чулков. Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин. Наноконструкции ДНК для тестирования и калибровки спектрометров кругового дихроизма // Наукоемкие технологии.- 2013.- №4,-С. 68-76.

2. Ф. В. Верещагин, В. М. Гусев, Ю.М. Евдокимов, О. Н. Компанец, А. М. Павлов, М. А. Павлов, С.Г. Скуридин, Д. П. Чулков. Портативный дихрометр

новой биосенсорной аналитической системы биомедицинского назначения на основе ДНК-биодатчиков // Биомедицинская радиоэлектроника.- 2013,- №3.-С.58-68.

3. В.М. Гусев, Ю.М. Евдокимов, О.Н. Компанец, М.А. Павлов, С.Г. Скуридин, Д.П.Чулков. Биологически активные материалы на основе наноконструкций нуклеиновых кислот и калибровка спектрометров кругового дихроизма // Сборник материалов V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (ТКМФ-5, г.Троицк М.о., 4-8 июня 2012 г.).-2012.- Т.2.- С.26-28.

4. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Д.П.Чулков, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.А.Дубинская. Компактная биосенсорная аналитическая система медицинского назначения на базе одноволнового дихрометра СКД-4 // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010»,- М.: МГУ, 2010.- Т.4.- С.169-172.

Заявки на изобретения:

1. Заявка № 2013123106/22(034127) от 21.05.13 на изобретение: Способ калибровки спектрометров кругового дихроизма / Гусев В.М., Компанец О.Н., Павлов М.А., Чулков Д.П.. Евдокимов Ю.М, Скуридин С.Г.

2. Заявка № 2013128637/22(042650) от 24.06.13 на изобретение: Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик оптического сигнала кругового дихроизма биологически активного материала / Гусев В.М., Компанец О.Н., Павлов М.А., Чулков Д.П., Евдокимов Ю.М, Скуридин С.Г.

Отчеты:

1. Итоговый отчет о научно-исследовательской работе «Разработка нового биосенсорного метода экспрессного определения в жидкости генотоксикантов и компактного биоаналитического устройства (биосенсора) для его реализации» по государственному контракту от 04.07. 2008 г. № 02.512.11.2217,

выполненной в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (2009 г.). Заказчик - Минобрнауки РФ.

2. Итоговый отчет по проекту «Разработка и создание оптического биосенсора медицинского назначения с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК и компактного одноволнового дихрометра для контроля оптических свойств биодатчиков и детекции биологически активных и токсичных соединений в физиологических жидкостях» Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине», 2009 г.

3. Итоговый отчет по проекту "Разработка технологии определения биологически значимых соединений и лекарств в биологических жидкостях (на примере противоопухолевых антибиотиков) с помощью компактного оптического биосенсора" Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», 2010 г.

4. Итоговый отчет по проекту «Компактный оптический биосенсор на основе ДНК-биодатчиков и дихрометра и оценка с его помощью влияния наночастиц на свойства биологических объектов» Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине», 2011 г.

5. Итоговый отчет о НИОКР по теме: «Разработка биосенсорного аналитического устройства (биосенсора) для определения концентрации гепарина в жидкости» по государственному контракту от 13.10.2011 г. № 14.527.12.0012. Заказчик - Минобрнауки РФ.

Тезисы докладов на научных конференциях:

1. О.Н.Компанец, В.М.Гусев, С.Ф.Кольяков, М.А.Павлов, А.М.Павлов, Д.П.Чулков. Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.А.Дубинская. Разработка и создание оптического биосенсора медицинского назначения с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК и компактного одноволнового дихрометра для контроля оптических свойств биодатчиков и детекции

биологически активных и токсичных соединений // Тезисы докладов конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».- М., 2009 - С.232-233.

2. О.Н.Компанец, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.М.Гусев, М.А.Павлов, А.М.Павлов, Д.П.Чулков. С.Ф.Кольяков. Разработка технологии определения биологически значимых соединений и лекарств в биологических жидкостях (на примере противоопухолевых антибиотиков) с помощью компактного оптического биосенсора // Тезисы докладов конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»,- М., 2010,- С.254-255

3. О.Н.Компанец, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.М.Гусев, М.А.Павлов, Д.П.Чулков. Компактный оптический биосенсор на основе ДНК-биодатчиков и дихрометра и оценка с его помощью влияния наночастиц на свойства биологических объектов // Тезисы докладов конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».- М., 2011.- С.295-297.

4. Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.М.Гусев, О.Н.Компанец, М.А.Павлов, Д.П.Чулков. Биосенсорная технология экспрессного определения в жидкости биологически активных соединений на основе гелевых ДНК-биодатчиков и портативного дихрометра // Тезисы доклада научной конференции, посвященной обсуждению итогов реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы».- М.: МИСиС, 2013.

5. Д.П.Чулков, В.М.Гусев, О.Н.Компанец, М.А.Павлов. Компактный одноволновый дихрометр СКД-4М для биосенсорного аналитического устройства на основе наноконструкций ДНК // Тезисы доклада ежегодной Всероссийской научной школы-семинара «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине 2013».- Саратов, 2013.

Список цитируемой литературы

1. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.l., Skuridin S.G. Nanostructures and Nanoconstructions Based on DNA.- Boca Raton-London-New York: CRC Press (Taylor & Francis Group), 2012.-228 p.

2. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов C.B., Скуридин С.Г. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова,- M.: Радиотехника, 2008,- 294 с.

3. Евдокимов Ю.М, Салянов В.И., Скуридин С.Г.; Наноструктуры и наноконструкции на основе ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова,- М.: САЙНС-ПРЕСС, 2010,- 254 с.

4. Компанец О.Н. Портативные оптические биосенсоры для определения биологически активных и токсичных соединений // УФН,- 2004,- №174,- С.686-690.

5. Компанец О.Н., Евдокимов Ю.М. Оптические биосенсоры генотоксикантов на основе наноконструкций ДНК и портативных дихрометров // УФН,- 2009,- №179,- С.329-334.

6. Р.Н. Schippers, H.P.J.M. Dekkers. Direct Determination of Absolute Circular Dichroism Data and Calibration of Commercial Instruments // Anal. Chem.- 1981.-№53,- P.778.

7. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин. Компактный биосенсор биологически активных веществ на основе гелевого ДНК-би о датчика и одноволнового дихрометра // Альманах клинической медицины,- M.: МЗСР РФ, 2008.- T.XVII, Ч.2.- С.311-312.

8. Yu.M. Yevdokimov, V.I.Salyanov, S.G.Skuridin, S.V.Semenov, O.N.Kompanets. The CD spectra of Double-Stranded DNA Liquid-Crystalline Dispersions / Ed. Yu.M.Yevdokimov.- Nova Science Publishers, Inc., 2011.- 103 p.

9. Скуридин С.Г., Дубинская B.A., Рудой В.M., Дементьева О.В., Захидов СТ., Маршак T.JL, Кузьмин В.А., Попенко В.И., Евдокимов Ю.М. Действие наночастиц золота на упаковку молекул ДНК в модельных системах // ДАН.-2010,- Т.432, №6, июнь,- С.838-841.

10. В.М.Гусев, О.Н.Компанец, А.М.Павлов, М.А.Павлов, Д.П.Чулков, Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, В.А.Дубинская. Компактная биосенсорная аналитическая система медицинского назначения на базе одноволнового дихрометра СКД-4 // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010»,- М.: МГУ, 2010,- Т.4.- С. 169-172.

Подписано в печать 25.11.2013. Формат 60x84/16. Печ. л. 1,75. Заказ 8537. Тираж 75 экз.

Типография ООО «ТРОВАНТ». ЛР № 071961 от 01.09.99. 142191, г.Москва, г. Троицк, м-н «В», д.52. Тел. (495) 775-43-35, (495) 851-09-67, 850-21-81 www.trovant.ru E-mail: tan@trovant.ru

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ СПЕКТРОСКОПИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИСАН)

На правах рукописи

0^201451056

Чулков Дмитрий Петрович

Разработка и исследование спектрометров и биосенсорных аналитических устройств на принципе оптического кругового дихроизма с использованием биодатчиков на основе наноконструкций ДНК

Специальность: 01.04.05 - Оптика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: доктор физ.-мат. наук Компанец Олег Николаевич

г. Москва г.Троицк 2013 г.

)

Содержание

Стр.

Введение .........................................................................................3

Глава 1. Разработка и исследование портативного полифункционального дихрометра (СКД-2МУФ)..........................................................................................23

1.1. Принцип работы дихрометра...........................................................................23

1.2. Описание оптической системы дихрометра..................................................30

1.3. Система регистрации дихрометра...................................................................43

1.4. Программное обеспечение дихрометра..........................................................45

Глава 2. Калибровка спектрометров кругового дихроизма с помощью полимерных оптически активных материалов.........................................................50

2.1. Актуальность проблемы и постановка задачи.............................................50

2.2. Полимерные оптические активные материалы...........................................53

2.3. ПОАМ как вторичные стандарты оптической активности........................58

Глава 3. Разработка и исследование компактных одноволновых дихрометров70

3.1. Компактный одноволновый дихрометр (СКД-4)..........................................70

3.2. Компактный одноволновый дихрометр (СКД-4М).......................................78

3.3. Программное обеспечение компактного дихрометра...................................79

3.4. Многофункциональная аналитическая система для определения характеристик КД ПОАМ.......................................................................................86

Глава 4. Разработка и исследование биосенсорных аналитических систем на основе разработанных дихрометров и ДНК-биодатчиков......................................95

4.1. Оптический биосенсор на основе полифункционального дихрометра и определение гепарина..............................................................................................95

4.2 Оптический биосенсор на основе полифункционального дихрометра и измерение концентрации дауномицина...............................................................102

4.3 Оптический биосенсор на основе одноволнового дихрометра...............105

Заключение................................................................................................................116

Список сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов.... 118

Список литературы...................................................................................................119

Список рисунков.......................................................................................................125

Список таблиц...........................................................................................................128

Список формул..........................................................................................................128

Введение

Наша жизнь диктует возрастающую с каждым годом необходимость разработки новых методов и приборов медицинской и экологической диагностики, контроля качества потребляемых продуктов питания, лекарственных препаратов для высокочувствительного и одновременно экспрессного определения в них опасных для здоровья и жизни соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки. К таким соединениям (генотоксикантам) относятся антибиотики, противоопухолевые и другие лекарственные препараты, тяжелые металлы, диоксины, наночастицы и т.п. соединения, которые следует определять в физиологических жидкостях (плазма крови, урина, вода и т.п.).

Решение этой проблемы традиционными методами и с помощью традиционной аналитической аппаратуры затруднено тем, что такое определение является процедурой дорогостоящей, требует значительного времени (сутки), необходимое оборудование стоит многие десятки тысяч долларов, работать на нем должен высококвалифицированный персонал, а чувствительность и избирательность определения биологически активных и токсичных соединений (БАС, или генотоксикантов) оказываются не всегда достаточными. По этой причине создание альтернативных экспрессных методов анализа биологических жидкостей и портативной высокочувствительной аналитической аппаратуры является исключительно важной и актуальной задачей.

Альтернативу традиционным методам составляют биосенсорные методы анализа, использующие чувствительные элементы (биодатчики) в комбинации с различного рода преобразователями. Биосенсорные технологии не обязательно лучше, чем не-биосенсорные методы, но тесная комбинация продуцирования сигнала и его детекции, возможность миниатюризации открывают новые широкие области их применений - это мониторинг непосредственно у постели больного, возможность быстрого, «он-лайнового» контроля качества фармпрепаратов, продуктов питания, в биотехнологической промышленности -

контроль и оптимизация технологических процессов, в экологическом мониторинге - обнаружение токсичных веществ немедленно, без доставки проб в лабораторию.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что большая часть коммерчески доступных в настоящее время биосенсорных аналитических устройств (биосенсоров) создана на основе ферментов. Однако развитие биосенсорики и биомедицины и решаемые в их рамках аналитические задачи расширяют горизонты для создания нового поколения биодатчиков, например, на основе молекул биополимеров, обладающих широкими аналитическими возможностями.

В последнее время большое внимание привлекает применение в биосенсорике оптически активных структур на основе частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (далее ХЖКД ДНК, DNA cholesteric liquid-crystalline dispersion, или DNA CLCD), получаемых методом «фазового исключения» жестких линейных нативных двухцепочечных молекул ДНК низкой молекулярной массы (< 1-Ю6 Да) из водно-солевых растворов, содержащих нейтральные синтетические полимеры, в частности, полиэтиленгликоль (далее ПЭГ, или PEG). Такие частицы ХЖКД ДНК называют также «жидкокристаллические наноконструкции ДНК» («жидкие» НаК ДНК, liquid-crystalline nanoconstructions based on DNA, или DNA LC NaC) [1].

Особенности указанных выше частиц «жидких» НаК ДНК (Рис. 1) состоят в следующем:

1) полимер не входит в состав образующихся частиц «жидких» НаК ДНК;

2) для частиц «жидких» НаК ДНК характерно сохранение химической реакционной способности структурных элементов (азотистых оснований и других), высокая локальная концентрация молекул ДНК (до 400 мг/мл) и упорядоченное расположение соседних молекул ДНК;

Пары оснований

Сахара-фосфатные

Лпя

Б-20А

Один вэ слоев, образованных молекулами ДНК (для молекулярного упорядочения требуется осмотическое давлениерастворителя)

Если поляризованный свет проходит вдоль о си холестерической жидкокристаллической структуры ДНК, в спектре кругового дихроизма (КД) в области поглощения ДНК появляется интенсивная (аномальная) полоса

Двухцепочечиые (дц) молекулы ДНК в водно-солевом растворе

Наночастица холестерической жидкокристаллической дисперсии (жкд) ДНК; Диаметр - 10ЭА; N -10* молекул ДНК; Р - период спиральной холестерической закрутки. Молекулы полимера не входя т в состав частицы ХЖКД.

1. Спектр КД линейкой ДНК (В-формы) 2. Спектр КД жкд ДНК

Образование ХЖКД приводит к пространственной закрутке соседних слоев из молекул ДНК НК) и сопровождается появлением аномальной отрицательной (в случае ДНК) и положительной для РНК) полосы в спектре КД, расположенной в области поглощения азотистых оснований НК

Рис. 1. Схема формирования холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК (ДНК-биодатчика) и появления аномального сигнала кругового

дихроизма (КД) [2]

3) для частиц «жидких» НаК ДНК характерна спирально-закрученная («холестерическая») пространственная структура соседних слоев молекул ДНК, формирование которой сопровождается появлением оптической активности, проявляемой, в частности, в виде интенсивной (аномальной) полосы в спектре кругового дихроизма (КД) в области поглощения хромофоров ДНК (X ~ 270 нм) [2,25]. Стабильная амплитуда указанной аномальной полосы в спектре КД характеризует наличие спирально-закрученной пространственной структуры частиц «жидких» НаК ДНК.

Высокая локальная концентрация ДНК и «жидкостной» характер упаковки соседних молекул создают условия для быстрой диффузии разных химически и биологически активных соединений (далее БАС) в структуру частиц «жидких» НаК ДНК и их взаимодействия с ДНК. При этом некоторые соединения

образуют связи между парами оснований ДНК, а также могут встраиваться (интеркалировать) между ними, другие соединения, например, фиксируются вдоль сахарофосфатных цепей ДНК или другим образом. При этом любое взаимодействие БАС с ДНК отражается в спектре КД частиц «жидких» НаК ДНК, что позволяет установить способ фиксации молекул-«гостей» в структуре ДНК [2].

В частности, взаимодействие соединений-интеркаляторов с молекулами ДНК, образующими частицы «жидких» НаК ДНК, сопровождаемое встраиванием молекул интеркаляторов между парами оснований ДНК, приводит к появлению в спектре КД дополнительных аномальных полос КД в области поглощения хромофоров интеркалятора, интенсивность которых прямо связана с их концентрацией (Рис. 2).

ДЮРИЧГ»км (ЯШ* м-!?» ВИг.М т Чихотж-Иш

0 »¡».¡ихомо!» чтм имея!

1 Ц4ИЙ» ошм >« 21 *м

* ^ ; г»»»»™«-»!*«»**«

ЧУ

А - первоначальная ЖКД ДНК (170 мг/мл ПЭГ; 03 М КаС1;

0,01 М Иа-фосфатный буфер; рН 6.8)

В - после добавления порфина (С - 5.3х1(И М)

С- после добавления порфина и мнтоксянтрона (С 9.5x10 ' М)

НМ

300 350 400 450 500 550

600

650 700

Рис. 2. Спектр кругового дихроизма ЖКД ДНК, обработанной двумя соединениями, интеркалирующими между парами оснований ДНК и поглощающими свет на

разных длинах волн [2,3]

Спектральные особенности этих полос: знак, амплитуда и положение

максимума регистрируемого спектрометром сигнала КД, фиксируемые при

определенных условиях получения этого сигнала, также стабильны и характеризуют свойства частиц «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор».

Напомним, что круговой дихроизм возникает в результате преимущественного поглощения света одной поляризации со спирально-закрученной структурой хирального вещества или его асимметрическим центром. Плоскополяризованный свет можно представить состоящим из двух векторных циркулярно-поляризованных компонент, одна из которых закручена вправо (Ы) и поляризована в направлении движения по часовой стрелке, а другая - закручена влево (Ь), т.е. поляризована в направлении, противоположном ее движению. Компоненты с левой и правой круговыми поляризациями могут по-разному поглощаться при прохождении плоскополяризованного света через оптически активный образец. В этом случае возникает разность Де в коэффициентах экстинкции е для векторов с правой и левой круговыми поляризациями Де = - которую и называют круговым дихроизмом. Величина КД связана с поглощением вещества (оптической плотностью) А простым соотношением Де = (Ая - Аь)/(с1), где с - концентрация вещества (М/л); 1 - толщина кюветы (см). Спектр КД представляет собой зависимость величины Де от длины волны А,. В спектре КД в области поглощения оптически активных хромофоров, имеющихся в молекуле, присутствует экстремум, который в зависимости от соотношения между величинами еь и ея может быть либо положительным, либо отрицательным.

Изменение оптической активности биодатчика (вплоть до ее полного исчезновения) под действием БАС, регистрируемое при помощи портативного спектрометра КД (дихрометра), в определенных условиях прямо связано с концентрацией БАС в жидкости. Таким образом, наночастицы ХЖКД дц ДНК можно рассматривать как миниатюрные (размером 0,5 микрона) оптические биодатчики, меняющие свои характеристики «в ответ» на действие БАС.

Измерение концентрации БАС производится с помощью предварительно полученной с использованием известных концентраций определяемого соединения калибровочной кривой, представляющей собой зависимость величины изменения аномального сигнала, генерируемого биодатчиком, от концентрации находящегося с ним в контакте БАС. Результат каждого измерения можно представить на экране монитора в виде точки на калибровочной кривой с индикацией численного значения концентрации БАС, обнаруженной в исследуемой пробе.

Однако, несмотря на привлекательность использования пробирочной формы «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор» в качестве систем со стабильной характеристикой КД, у пробирочных форм наблюдается постепенное уменьшение оптической активности по мере их хранения, связанное с седиментацией частиц «жидких» НаК и, следовательно, неконтролируемым уменьшением их концентрации в растворе.

Проблема стабилизации свойств частиц «жидких» НаК ДНК была решена в ИМБ РАН за счет иммобилизации этих частиц в полимерном гидрогеле, созданном на основе макромономера полиэтиленгликоля (ПЭГ) [3]. В этом случае получают синтетический полимерный оптически активный материал (далее ПОАМ, РОАМ), содержащий разнесенные в массиве полимерного гидрогеля единичные частицы «жидких» НаК ДНК. Описанная иммобилизация не сопровождается нарушением пространственной структуры частиц «жидких» НаК ДНК и практически не влияет на исходную величину их аномальной оптической активности. При этом используемый полимерный гидрогель оптически прозрачен, может иметь любую удобную для экспериментатора форму, обеспечивает сохранение аномальной оптической активности размещенных в нем частиц «жидких» НаК ДНК, по меньшей мере, в течение 6 месяцев с момента приготовления (при соблюдении не очень жестких условий хранения), не токсичен, химически и биологически инертен к ДНК и проницаем для низкомолекулярных веществ. Проницаемость полимерного гидрогеля для

низкомолекулярных веществ открыла возможность для диффузии молекул разных соединений в гидрогель и последующего их взаимодействия с размещенными в гидрогеле молекулами ДНК, и, таким образом, в этих условиях сохраняется возможность включения определенных соединений, в частности, интеркаляторов, в состав частиц «жидких» НаК ДНК.

Спектр КД вышеуказанного ПОАМ, как и в случае пробирочной формы частиц «жидких» НаК ДНК и комплексов «ДНК-интеркалятор», характеризуется наличием двух аномальных полос, одна из которых расположена в области поглощения хромофоров ДНК на длине волны ~ 270 нм, а другая (дополнительная) полоса - в области поглощения хромофоров включенного в структуру частиц соединения, в частности, интеркалятора. Изменение оптической активности биодатчика (вплоть до ее полного исчезновения) под действием БАС, регистрируемое при помощи портативного спектрометра КД (дихрометра), в этом случае также прямо связано с концентрацией БАС в жидкости.

В ИМБ РАН разработан еще один способ получения стабильных частиц НаК ДНК. Этот способ заключается в формировании «сшивок», например, в виде наномостиков из чередующихся молекул антибиотика антрациклинового ряда, например, дауномицина, и ионов металла, например, меди (Си2+), между соседними молекулами ДНК как в одном, так и в соседних квазинематических слоях исходной жидкой НаК ДНК [2,3,4]. При получении частиц «твердых» НаК ДНК диффузионная подвижность соседних молекул ДНК исчезает и возникает жесткая трехмерная пространственная структура, основным фактором стабилизации которой является уже не осмотическое давление водно-полимерного раствора, а число и прочность наномостиков.

Вследствие наличия наномостиков такие «твердые» частицы НаК ДНК стабильны в широком интервале условий и способны существовать за пределами существования частиц лиотропной ХЖКД ДНК (Рис. 3).

Рис. 3. Образование «твердых» наноконструкций (НаК) ДНК [3]

Для частиц «твердых» НаК ДНК характерна, наряду с аномальной оптической активностью, проявляемой в спектре КД на длине волны 270 нм, дополнительная аномальная оптическая активность, проявляемая в видимом диапазоне спектра в области поглощения хромофоров антибиотика (А, ~ 515 нм), входящего в состав наномостиков. При этом уменьшение оптической активности (вплоть до полного исчезновения), сопровождающее разрушение наномостиков под действием БАС, для которых элементы наномостиков являются субстратом, прямо связано в определенных условиях с количеством указанных разрушений, то есть, с концентрацией БАС [6]. Эта особенность взаимодействий также открывает возможность для использования частиц «твердых» НаК ДНК в качестве сенсорного элемента (биодатчика) биоаналитических систем, используемых для обнаружения в анализируемых растворах БАС, "мишенью" которых являются указанные наномостики.

Недостаточная стабильность оптических свойств пробирочной формы частиц «жестких» НаК ДНК, обусловленная седиментацией этих частиц, устраняется уже известным путем - иммобилиз