Лиотропные жидкие кристаллы двухцепочечных нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ^ ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВООДКИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИШЧКСИИЙ ФАКУЛЬТЕТ

ЛИОТРОПНЫЕ ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ ДВУХВДПОЧЕЧШХ ЙУКЛЕИНОВ1Я КИСЛОТ

02.00.10 - Сиоорганическая химия,химия природных

и физиологически активных веществ; 02;*00.06 - химия высокомолекулярных соединений

• Диссертация в форме-научного доклада на соискание ученой 'степени доктора химических наук

«

На правах рукописи

ЕВДОКИМОВ Юрий Михайлович

УДК 573.3; 541(61+24):539.2

Москва -1991

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: - члон-корр.АН СССР,профессор А.Р.Хохлов,

- доктор химических наук Б.И.Сухоруков,

- доктор физико-математических, наук, профессор А.С.Сонин

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: - Институт кристаллографии им.А.В.ШуОникова

АН СССР

(

■0

Защита состоится •'^•"ÎV.i'.'..K.ÎM на заседании

Специализированного Совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском Государственном УшгаерОит&те им.М.В.Ломоносова по адресу: ГСП 1198Э9, Москва, В - 234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического

факультете МГУ . ;__

Диссертация разослана......'Л.....îrb\£r.r...........

Ученый Секретарь

Специализированного Совета у

кандидат химических наук . (^i- И.Г.Смирнова

Г

■ актуальность ПРОБЛЕМЫ. Исследование струга-урн и свойстз важнейших ;/ :.'йисзд|ш1меров - нуклеиновых кислот, осуществляющих хранение и передачу генятичоской информации в живых клетках, представляет _ собой важную моздисцигопшарну» проблему, привлекающую внимании специалистов многих областей науки.

Известно, что молекулы двухцепочечных ДНК, входное» в состав биологических объектов - вирусов и хромосом, находятся в плотноупакованном, конденсированном состояния, для которого характерна, прежде всего, высокая степень пространственной организации. Рад обстоятельств, а именно, высокая(достигается 6С%) концентрация ДНК в биологических объектах в сочетании с "мгновенной" доступностью любого участка ДНК (гена) для выполнения своих биологических функций, а также специфические свойства двухцепочечных молекул ДНК такие, кап высокая "жесткость".наличке спиральной структуры и оптической активности делают актуальным не только вопрос о фазовом состоянии ДНК в вирусах и хромосомах, но и о биологических факторах, "управляющих" этим состоянием. Исследование конкретных особенностей упаковки молекул ДИК п клетках было, и остается до настоящего времени, задачей, не имеющей однозначного рэаения. Это обусловлено как сложностью структуры биологических объектов, так и недостаточным совершенством физико-хжических методов исследования. Поэтому важной задачей на пути к пониманию особенностей структуры и свойств фаги ДНК, образующейся в клетках, является создание искусствешшх моделей (модельных систем), в которых находят отражение основные свойства молекул ДНК, характерные . для биологических объектов.

В течение 10 последних лет усилия нескольких групп ученых из Японии, США и Франции были направлены па выяснение особенностей относительно простой модельной системы - конденсированной фазы ДНК, образующейся в концентрированных водно-солевых растворах. Несмотря на простоту этой модели, предложенной в 1961 г. К.Робинсоном (Англия), лишь в 1384-1939 гг. стали накапливаться однозначные данные, характеризующие упаковку молекул ДНК в фазе, образующейся в этих условиях.

Наш исследования, в отличив от исследований зарубежных авторов, были сконцентрированы на исследовании свойств другой модельной системы - конденсированной .фазы, образующейся в

1 -11 90

1

водно-полимерно-солевых растворах, из молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с биологически активными веществами. Такая модель представляется более перспективной как с физико-химической, так и молекулярно-биологичвской точки зрения, хотя бы потому, что она учитывает наличие в кявнх клетках как катионов разных металлов, разных полимеров биологического происхождения, так и низкомолекулярных биологически активных веществ,

взадаодействувдих с молекулами нуклеиновых кислот. Следовательно, настоящая работа,находясь на стыке молекулярной биологии,химии и физической химии биологически активных веществ и высокомолекулярных соединений, "вскрывает'* новые возможности нуклеиновых кислот и приближает нас к более полному пониманию структуры и свойств конденсированной фазы ДНК., возникающей во внутриклеточных условиях.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ■ Цель настоящей работы состояла в установлении типа (типов) , фаз, образуемы х при конденсации в водао-полимерно-солевых растворах' молекулами природных нуклеиновых кислот, их комплексов с биологически активными веществами (синтетические и природные антибиотики,

противоопухолевые соединения), а также в разработке системы доказательств типа (типов) упаковки молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с разными биологически активными веществами в дисперсиях, образующихся в этих растворах. ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. В йаддои исследования входило:

1).Исследовать свойства конденсированной фазы (фаз),образуемой в водно-полимерю-солевых растворах молекулами природных нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов.а также комплексов ДНК с биологически активными веществами (противоопухолевые соединения, антибиотики).

2).Установить от (типы) конденсированной фазы нуклеиновых кислот, образующейся в водно-полимерно-солевых растворах.

3).Выяснить основные факторы,"управляющие" характером упаковки молекул нуклеиновых кислот в лиотропной жидкокристаллической фазе.

4).Исследовать свойства дисперсий нуклеиновых кислот и их комплексов с биологически активными веществами, образуемых в водно-полимерно-солевых растворах.

5).Установить характер упаковки молекул нуклеиновых кислот и

молекул комплексов нуклеиновых кислот с биологически активными вещества^! в частицах • дисперсий, образуемых в

водно-полимерно- солевы х расгв орах.

6).Исследовать связь кекду свойствами водно-полимерно-солевых растворов и свойствами жидкокристаллических дисперсий, определить факторы, влияющие на характер упаковки молекул нуклеиновых кислот в жидкокристаллических дисперсиях.

7).Оценить возможность использования жидкокристаллических дисперсий, образуемых молекулами ДНК, для определения наличия в растворе биологически активных веществами и установления типа комплексов, образуемых биологически активны?,® вещества!®; молекулами ДНК.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. При выполнении настоящей работы получен ряд новых, приоритетных результатов. Впервые доказано,что в водно-полимерных растворах нейтральных синтетических полимеров (типа полигликолэй) двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот

а £

и синтетических полинуклвотздов (иол.масса от 3x10° до 3x10 ) образуют жидкие тсристаллн .Установлено,что Факторами,"/тгразляющаш" структурой кидких кристаллов нуклеиновых кислот и опрэделявдими их принадлежность к холестерическому или нематическому типу, являются свойства водно-полимерного раствора и свойства самих молекул нуклеиновых кислот.Обнаружено, что модификация молекул ДНК в результате взаимодействия с антибиотиками мокет менять характер упаковки этих молекул в жидкокристаллической фазе. Впервые показано, что модификация молекул ДНК под действием противоопухолевых соединений • ■ - группы платины .(XI) (например,Щ1с-дихлородиамшшплатиной (II») приводит к формированию новой, оптически изотропной жидкокристаллической Фазы ДНК.

Идеология метода "внешних хромофоров",известного в физика термотрогошх жидких кристаллов, бала впервые "перенесена" на случай лиотропных жидких кристаллов нуклеиновых кислот и их жидкокристаллических дисперсий,образующихся в водно-полимерных растворах. Сопоставление сеойств жидких кристаллов и жидкокристаллических дисперсий, образованных из комплексов ДНК с биологически активными веществами (антрациклины, аятрахиноны, олигопептидные антибиотики и т.д.),позволило показать, что характер упаковки молекул ДНК в жидкокристаллических дисперсиях в целом совпадает с характером упаковки.молекул ДНК в жидких

2-11 90

3

кристаллах.Основные факторы, "управляющие" характером упаковю молекул ДНК, сохраняются в случае дисперсий, однако, их действк; проявляется в болеё замэтиой форме. Установлена связь мевд свойствами водно-полшлерпого раствора и конденсацией молеку; нуклеиновых кислот, сопровождаемой образованем жидких кристаллов. практическая ценность РАБОТЫ. Установленные в настоящей работе факторы "управления" структурой лиотропных жидких кристаллов ну1Слеиновых кислот должны учитываться при описании свойств лиотропных зкидккх. кристаллов других биополимеров (белки, полисахариды и т.д.). Полученные в работе результаты позволяют 'утвередать, что свойства конденсированной фазы ДНК в биологических объектах, для которых характерна невысокая концентрация гнстонсвых оелков (например, для хромосом простейших), должны соответствовать свойствам холестерических жидких кристаллов ДНК. Разработанный метод доказательства жидкокристаллической упаковки молекул ДНК в зэдкокристаллическиз дисперсиях, основанный на использовании в качестве "внешниз хромофоров" биологически активных веществ, образующих, прочные комплексы б молекулами ДНК, был применен в Ивановское Госушверситете для установления тша лиотрошшх кидкю кристаллов производных целлюлозы. Полученные в ходе

настоящей работы резул ь та т ы, сиадетел ь ствунцие о высокой "подвижности" структуры т частиц жидкокристаллически дисперсий нуклеиновых кислот,были использованы при конструирование биодатчиков оиосенсорных устройств, позволяющих дотектироваз наличие в среде биологически активных веществ .взаимодействующих с ДНК. Тем самым, начато формирование нового направления биотехнологии, а именно, создания биодатчиков на основе аидкш кристаллов двухцепочечных нуклеиновых кислот. апробация работы.По материалам диссертации были прочитаны доклады на различных международных и всесоюзных конференциях,в том числе: на VII Иенском Симпозиуме по биофизической химии "Узн авание биополимеров" (Веймар,1980), на 4 Международной конференции социалистических стран по жидким кристаллам (Тбилиси, 1981), на iv Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981), на II Международной конференции в рамках программы стран СЭВ по биофизике "Взаимодействие между биополимерами и биологическая эффективность лекарств"

(Брно, 1982), ка Первом . Всесоюзном Стто зиуме по жидкокристаллическим полимерам (Суздаль, 1983), ка Пятой конферотдал социалистических стран по задаз-м кристаллам (Одесса, 1983), на X Невском Симпозиуме по одофк з дческой химии "Маквкулярно-биологические механизмы действия противоопухолевых антибиотиков" (Веймар, 1Э84), ка v Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков,1984), на IV Рабочем совещании "Жидкокристаллическое состояние в биологических системах и их моделях" (Пущино,1984), на Симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Финико -химич е ски о свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино, 1985), ¡га v Всесоюзной научной конференции "Жидкие кристаллы и их практическое применение" (Иваново, 1985), на v Всесоюзном Рабочем совещании "Жидкокристаллическое состояние в биологических системах и их моделях" (Пущино, 1986), на Втором Всесоюзном Симпозиуме "Жидкокристаллические полимеры" (Суздаль, 1387), на конференции "Химия жидких кристаллов. Применение в хроматографии" (Куйбышзв, 1987), на Международном Конгрессе " Взаимодействие нуклеиновых кислот" (Падуя, 1987), на vi Всесоюзной конференции "Жидкие кристаллы и их практическое использование" (Чернигов, 1988), на vi Всесоюзном Совещании "Жидкокристаллическое состояние .. в биологических системах и их моделях" (Пущино, 1988), на VI Всесоюзном Совещании "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1988), на III Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Пущино, 19G9), на III конференции Италия-СССР по физике ¡кидких кристаллов и Лэнгмюровских пленок .(Ачириале/Катания, 1990), , на Индо-советской конференции "ДНК-белковое взаимодействие и сшвки" (Бангалор, 1990).

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена в настоящей работе в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с В.И.Сашювым и С.Г.Скуркдиннм. Вклад других советских и зарубежных авторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем своим советским и заруоеяннм коллегам автор приносит благодарность за участие в совместных исследованиях.

I .ЛИОТРОЛНЫЕ ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ ПРИРОДНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

и синтетических: полиютшеотидов в водо-псш-мершх растворах • 1 ) .Формирование фаз щаущиыйвйх кИ£Л31л. Фазы нуклеиновых кислот в водао-полимерно-солевых растворах формировали в соответствии с

предложенной нами двухстадкйной схемой.В качестве .примера приведена схема формирования фаз в водно-солевых раствора! полиэтиленгликоля (ПЭГ).Выбор ПЭГ определялся целым рядом обстоятельств: во-первых, структура молекул ПЭГ обеспечивает существование растворов, имеющих,в зависимости от концентрации

СХЕМА ФОРМИРОВАНИЯ ФАЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ГОГ-СОДЕРЖАЩХ ВОДНО-СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ

Водно-солевой ( м, и*. Т°, рН) раствор нуклеиновой кислоты

Ра^ТборШ.

, (мол.масса - 1х106,Сщ 5-50 мкг/мл)

I стадия СйЕШи|1С8 0.

Водно-солевым ( м, К+, Т°, рН) раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ)

Раствор(Б)

(мол. масса ( 1-40 )х103,0ПЭ1, ~ 0-600 мг/мл)

й & Е й. 2 £ £ I Е ДййиЕЕйЯЯ

а ле ни а в-и а истш

--------------------'■-—----------------

II стадия

Частицы дисперсии нуклеиновой кислоты концентрируют за счет центрифугирования

( - 5000 об/мин, - 1 час, 4° С )

а&ЕА2УЕ1еа пн

и ыт ыи и а и ь й £ а о ц а

В работе использовали: двух- и одноцепочечные ДНК из разных источников (бактериофаги,бактерии,плазмиды,клетки животных); двухцепочечную РНК (репликативная форма фага е 2) .рибосомальную РНК," т-РНК; синтетические полинуклеотиды:поли (ДА)хполи (дТ); поли (дА-дТ) хполи (ла-дТ ) ;поли (дГ-дЦ) хполи (дГ-дЦ); поли (А) хполи (У) поли(И)хполиЩ) ;поли (А )хполи (дТ) ;поли (А) ;поли(У);поли(Ц); поли (Г).

ПЭГ,разную молекулярную структуру : при малой концентрации ПЭГ молекулярная структура соответствует разбавленному (изотропному) раствору; при некоторой "критической" концентрации ПЭГ молекулярная структура соответствует "нолуразОавлзнному" раствору (раствору с флуктуациокой полимерной сеткой) (В.Г.Погребняк.1977; А.Ю.Гросберг,1981). Кроме того, изменение концентрации ПЭГ в растворе сспровоздается заметным изменением физикс-жмических свойств растворов (после достижении "критической" концентрации ПЭГ меняются такие свойства раствора,как вязкость(В.Г.Яогребняк,1^79), поверхностное натяжение (А.А.Кирияненко,1972), диэлектрическая постоянная (R.ArnoId, 1985) И Т.Д. ) .ВО-ВТОрИХ, ПЭГ, Б ОТЯГНв ОТ своих гомологов - полиметилен- или полнпропилзнглгаазля, растворим в воде в достаточно широком ряду концентрации и молекулярных масс (О.П.Дымент, 1976). В-третьих,молекулы 113Г, не образуя стехиометрических комплексов с молекулами нуклеиновых кислот, вызывают фазовое "исключение" этих биополимеров из водно-солевых растворов (П-0.Альбертсон,1S74;J.т.Lis,1975).В-четвертых, растворы ПЭГ не обладают заметным собственным электронным поглощением в той области спектра, в которой поглощают азотистые основания нуклеиновых кислот. В-пятых, молекула ПЭГ содержат гидроксильную грушу,реакционная способность которой достаточна для проведения некоторых химических реакций.Наконец, препараты ПЭГ разной молекулярной массы доступны и относительно дешевы.

Приведенная схема показывает,что к ее преимуществам относится,прежде всего, тот факт, что она позволяет управлять свойствами раствороз в широких 'пределах. Это в свою очередь означает, что в отличие от схемы, исгользоевнной зарубежными автора?® (F.Livolant, 1984,1989; R. Rill, 19G6 ), двухстадийная схема позволяет получать большую информация о влиянии свойств растворителя не только на эффективность фазового разделения, но ик на свойства образующейся фазы нуклеиновых raí слот.

В некоторых случаях фазы нуклеиновых кислот формировали в водно-солевых растворах, содержащих оксиэтиленглицерины, а тазско водорастворимые сополимеры этилен- и пропиленгликоля ("плюроник", "проксакол").

Свойства образованных фаз нуклеиновых кислот и их комплексов с биологически активными соединениями исследовали при помощи методов, принятых в физике термотрошшх жидких кристаллов.

3-11 оо

2) .Рентгенографические характеристики сформированных щ

двухаепочечннх нуклеиновых кислот. На кривых рассеяния фаз, сформированных в соответствии с приведенной выше схемой из молекул двухцепочечных ДНК и двухцепочечной РНК фага ег, присутствует один четко выраженный Брегговский рефлекс. Величина этого рефлекса лежит<з зависимости от условий) в пределах от 25 .до 40 А0. На рис. 1 приведены,в качестве примера, кривые малоуглового (углы от 0,5 до 5°) рассеяния рентгеновских лучай на фазах, сформированных из молекул двухцепочечной ДНИ низкой мол.массы.

Тот факт, что высглие порядки малоутлового рефлекса не 'рентгенограммах не наблюдаются, указывает на отсутствие регулярного трехмерного порядка в расположении молекул нуклеиновнз кислот, т.е.указывает на то, что фаза, образованная из двухцепочечных нуклеиновых кислот или полинуклеотидов в ГОГ-содеркасдах растворах,не имеет идеальной кристаллической структуры. Оценка рентгенографических параметров, обычно используемых (ЬЧК.Вайнитейн, 1963) в таких случаях (размера "кристаллитов" ( 1), "радиуса взаимодействия" ( гщ ) и параметра "разупорядоченности" ( д/а >, проведенная для разных случаев, показывает, (что величина ¡- лежит в пределах гоо-зоо а°, величина гш - 150-300 А0, величина л/а составляет ~ 0,1 - 0,15. (Следует отметить,что результаты рентгенографического анализа частиц бактериофагов свидетельствуют о наличии на малоугловых рентгенограммах рефлекса, величина которого соответствует 22 - 24 (л. 1ораиН, 1987).средний размер "кристаллитов", определенный в случае молекул ДНК, упакованных в головка* бакткериофагов, близок 100 А°(А.Т.Дембо,1965 ).Что ке касается кристаллов, выращенных из коротких молекул ДНК в этанольнык растворах, эти кристаллы характеризуются параметров "разупорядаченности" равным 0,1-0,16 и "радиусом взаимодействия" -' 100-200 А°(Б.И.Верккн, 1978) .Сочетание приведенных выпаде данныа позволяет утверждать,что в полученных нами фазах, для которых характерен рефлекс ~ 4 о А0 (или далее меньше ), молекулы нуклеиновых кислот уложены упорядочение; для фаз,несмотря на отсутствие регулярной трехмерной структуры, характерен однемершй (ближний, трансляционный порядок) в расположен» молекул нуклеиновых кислот,причем при определенных условияа

плотность упаковки молекул ДНК достигает максимальной. »

Изучение рассеяния рентгеновских лучей под больший углами ( 4 - 20° ), проведенное для оценки параметров, характеризующих вторичную структуру двухцопочечных молокул ДНК (В-форла),в фазах, образованных в ПЭГ--содержащих растворах, показало,что конденсация нуклеиновых кислот не приводит к изменении параметров вторичной

Рис.1. Кривые малоуглового рассеяние рентгеновских лучей фазами, сформированными из нативной ДНК ( ДНК селезенки крупного рогатого скота, мол.масса ~ 0,бх106) в ПЭГ-содерясапих водно-солевых (мол.масса ПЭГ 4000; 0,3 М Nací) растворах 1 - Cjjgp.140 мг/мл; 2 - 0ПЭГ 180 мг/мл; 3 - C,¡3r 260 мг/мл;

4 - СдЭГ 300 мг/мл;

5 - Спэг 180 мг/мл ( мол.масса ДНК 1,5х106);

6 - CU™ Í80 мг/мл ( денатурированная теплом ДНК).

структуры молекул ДНК. Учитывая это обстоятельство,можно, пользуясь известным уравнением, связывающим величину Брегговского рефлекса и концентрацию нуклеиновой кислоты в исследуемой фазе (J. Torbet, 1989 ):

( М / L = Ид С а2 2 / У~Э ! ; fv ! ), где: м / l - масса, приходящаяся на единицу длины молекулы нуклеиновой кислоты;

О - концентрация нуклеиновой кислоты в фаза; остальные параметры имеет общепринятое значение,

оценить концентраций ДНК (РНК) в фазах, образующихся при конденсации этих молекул в ПЭГ-содеркащих растворах. Оценка показывает, что концентрация ДНК е фазе, образующейся при СдЭр 100 иг/мл, составляет 250 мг/мл; npi Сд^, - 310 мг/мл, она увеличивается до, - 800 мг/мл. Концентрация двухцзпочечной РНК в фазе, образующейся при Сддр 100 мг/мл, составляет 370 мг/мл; при °ПЭГ 300 мг/т - 760 мг/мл. Следует отметить,что концентрация нуклеиновых кислот з фазах, образованных. в ГОГ-содеркащих растворах, соответствует той области концентраций," в которой становится возможным возникновение жидкокристаллической фазы нуклеиновых КИСЛОТ (V.A.Bloomfield.i 9S0 ; S.Trohalaki ,1984 ) . Теоретические и экспериментальные оценки концентрации ДНК, показывают,что для образования жидкокристаллической фазы необходима концентрация,составляющая ~ 100-200 МГ/МЛ (A.A.Brian, 1981; й.Rill,1986;T.E.Strzelecka,1968» .

В пользу образования именно жидкокристаллической фазы при конденсации нуклеиновых кислот в ПЭГ-содеркащих растворах свидетельствует ряд обстоятельств.Во-первых, зависимость положения Брегговского рефлекса на кривой рассеяния от концентрации ПЭГ в растворе. "Уменьшение" величины "d" по мере возрастания Спэг (рис.2), наблюдаемое в случае как двухцепочечных ДНК, так и РНК, свидетельствует не только о "подвижном", "жидкостном" характере упаковки молекул нуклеиновых кислот в образующихся фазах, но и указывает на связь мэаду характером упаковки молекул нуклеиновых кислот и свойствами ПЭГ-содержащих растворов (А.Сгозberg, 1982).

Одно из свойств водно-солевых растворов ПЭГ, которое мокет влиять на характер укладки молекул нуклеиновых кислот, это

' 0 100 140 180 220 260 300

Спзг,мг/мл

Рис.2. Зависимость малоуглового рефлекса ( d ) на рентгенограммах фаз ДНК от концентрации ПЭГ ( 20с0 ).

величина диэлектрической постоянной ( еа ) раствора ПЭГ'. Как следует из данных (K.Arnold.1985), npi Cjjgj, - 300 МГ/МЛ, величина effl составляет ~ 60. В этих условиях взаимодействие мевду соседними молекулами двухцепочечкых нуклеиновых кислот в момент конденсации таково, что оно обеспечивает упаковку молекул нуклеиновых кислот с плотностью, Слиской к максимальной, о чем свидетельствует величина Врегговсного рефлекса (а ~ 25 А°). . Рентгенографический анализ свойств фаз, сформированных из молекул двухцепочечной ДНК в ГОГ-содэрасащих растворах (Спэг 150 мг/мл), в которые дяА изменения величины еа добавляли

4-Пою

метанол, этанол, кзопропанол и другие органические растворители, показал, что увеличение, в частности, концентрации изопропажш 1до 20 об Л) приводит к смещению положения малоуглового рефлексе в гторону больших углов (от 2,4 до 3,67°). Это соответствует

"а" ОТ 38,6 до 24,1 А0. Величина е

с

уыеныаенив Евличина ПЭГ--еодержадего <СдЭЗ,150 мг/мл) раствора изопраданола ( 20*), рассчитанная на основании представления об объемно -аддитивно?; характере этой величины (К.Кгезвв,19?б; А.Абдуллин,1987), показала, что она составляет ~ 57. Следовательно, .несмотря на относительно невысокую концентрацию полизтиленгликоля в 'растворе.плотность упаковки молекул ДНК в таком растворе достигает практически максимальной. Наличие одинакового Броггозскага рефлекса для фаз, сформированных в растворах, различавшихся по концентрации ПЭГ, свидетельствует о том, чт-с плотность упаковки молекул нуклеиновых кислот связана именно сс свойствами этих; растворов. Совпадение величин диэлектрических постоянных растворов определяет одинаковый характер упаковки в ню молекул нуклеиновых кислот при конденсации.

Во-вторых, в пользу "жидкостного" характера упаковки молекул в фазах, сформированных в ЕВГ-содераащих растворах,свидетельствует тот факт, что нагревание фаз,образованных из молекул ДНК, сопровождается смещением рефиекса ка рентгенограммах в область меньших углов и размытием его максимума, т.е.увеличением среднего расстояния между молекулами ДНК^. в образованных фазах в уменьшением степени их упорядочения. Существование заметной зависимости расстояния между молекулами нуклеиновых кислот сближает свойства этой фазы со свойствам! жидкостей и отличает ее свойства от свойств, характерных для кристаллов ДНК ( У.Ьдгга*:!, 1 вбз;Б.И.Веркин, 1978). Никаких скачкообразных изменений в характере упаковки молекул ДНК в фазах, сформированных при разных концентрациях ПЭГ (рис.3), не наблюдается вплоть до температур,при которых происходит разделение цепей ДНК. В случае ДНК это имеет место при температуре ~95°с ; при этом малоугловой рефлекс и сче з ает, фаза становится "рентгенографически" изотропной.Можно сказать, что упаковка молекул нуклеиновых кислот в фазах, ооразувдихся в ДЭГ-содержащих растворах, является "подвижной";она легко меняется при изменении свойств растворителя, чего не наблюдается в случае кристаллов нуклеиновых кислот.

20 -

qT-1---1-1-1-

0 20 40 60 80

T°C

Рис.3.Зависимость матоуглового рефлекса ел, характерного для фаз нуклеиновых кислот, от темперагуры, 1 - ДНК, Сддр 120 мг/мл; 2 - ДНИ, С11ЭГ 170 мг/мл; 3 - ДНК, Оддр 300'мг/мл; 4 - поли(й)хполи(С),СПЭр 190 мг/мл.

Таким образом, сочетание ряда фактов : высокой концентрации двухцепочечных нуклеиновых кислот в фазах. образующихся в ПЭГ-содеряащих растворах,зависимость плотности упаковки от свойств растворителя (диэлектрическая постоянная к температура),сввдельствует о том, что характер упаковки молекул нуклеиновых кислот в ооразуицихся фазах отличается от характера упаковки этих молекул в кристаллах. Эти факты свидетельствуют в пользу жидкокристаллического характера упаковки молекул нуклеиновых кислот в фазах,образованных а водно-солевых ПЭГ-содержащнх растворах.

t3

3) .Рентгенографические характеристики ¡ШЙ^. сформированных й2 молекул двухцепочечных полинуклеотидов. На кривых рассеяния фаз, сформированных в ' ПЭГ-содеркащах растворах из молекул. двухцепочечних синтетических полирибонуклеотидов - поли(А)хполи(У) пож(И)хполи<Ц), которые нринадлакат к А-семейству, присутствует один ЬреггоЕСкий рефлекс. Наличие малоуглового, рефлекса на рентгенограммах фаз отражает упорядоченное расположение молекул нолинуклеотадов в фазах. Изучение рассеяния рентгеновских лучей под большими углами ( 4 - 20°), проведенное для оценки состояния вторичной структуры этих полинуклеотидов, показало, что конденсация двухцепочечных полирибонуклеотидов не приводит к изменению параметров А-форма -Нагревание фазы поли(И)хполиЩ) в интервале температур от 20 до 75сС сопровождается ростом величины "й" < рис.3 ), т.е. увеличением среднего расстояния мезду соседними молекулами поли(И)хполи(Ц). При нагревании, таккэ как и в случае фаз. сформированных из двухцепочечных молекул ДНК, наблюдается уменьшение радиуса взаимодействия (гщ) или размера кристаллитов (Ь >, а также увеличение параметра разугорядоченности (д/а). Эти данные указывают на "подвижный" характер упаковки молекул поли(И)хполи(Ц) в образующихся фазах. Разделение цепей молекул поли(И)хполи(Ц) при температуре ~ 80°С приводит к разупорядочению молекул поли(И)хполи(Ц); фаза становится изотропной. у_

Что же касается молекул денатурированной ДНК, рибосомальной РНК или молекул одноцепочетаых синтетических полинуклеотидов, жесткость которых существенно меньше жесткости двухцепочечных молекул, то для фаз, сформированных в ПЭГ-содеркадах растворах, малоугловой рефлекс практически не выражен (см.например, рис.1, кривую 6, относящуюся к случаю одноцепочечной ДНК ).Этот факт указывает на отсутствие упорядоченного расположения молекул одноцепочечшх нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов в фазах, образующихся в ПЭГ-содеркащах растворах.

4) .Текстуры а>аз .саормированннх уга двухцепочечных молекул ЛИК ■ Параллельно с рентгенографическим анализом фаз, сформированных из молекул нуклеиновых кислот в ПЭГ-содеркащих растворах, изучены текстуры фаз. На рис.4 показан вид текстуры тонкого слоя фазы, сфорлированной из молекул ДНК в ПЭГ-содержащем растворе. Вид тонкого слоя, фазы ДНК напоминает закристаллизованную

Рис.4.Вид текстур тонких слоев фаз ДНК в ПЭГ-содерзсадих растворах. А и Б--"неспецифическиэ" текстуры тонких слоев фаз ДНК, сформированных в ПЭГ-содержащем растворе, наблюдаемые в естественном (А) и в поляризованном (.николи скрещены) свете (Б). ( Спэг 110 мг/мл, 1 М МаС1 + фосфатный суфар, 20°С, увеличение 200х).

В и Г - специфическиз текстуры фаз ДНК, сформированных в ПЭХ'-содэржащих растворах.

В - текстура "отпечатков" пальцев в естественном свете ( С^ур 130 мг/кл, 1 М НаС1 + фосфатный буфер, 65°С). Отметка на рис соответствует 10 микронам. Г - текстура с "черныш изогнутыми нитями", наолвдаьмая в поляризованном свете.

(0„эг300 мг/мл, 1 М МаС1 + фосфатный буфер, 20°С) 3-1190 и

шликристаишческух) массу. Текстура, наблюдаемая в поляризованном свете, определяется анизотропией оптических свойств фазы; она связана с характером расположения молекул ДНК в пространстве. Текстура - одно из прямых доказательств в пользу жидкокристаллической организации молекул ДНК в образующихся фазах (С.Чачдрасекар,1Э80). Сочетание двух фактов: наличия одномерного порядка в расположении молекул ДНК в фазах, образованных в ПЭГ-содеркалщх растворах, оба а ружи в ае м ого при помо щи рентгенографического анализа, и наличия • оптической анизотропии фазы, обнаруживаемой при помощи поляризационной микроскопии, доказывает жидкокристаллический характер упаковки молекул ДНК в фазах, образующихся е ПЭГ-содержащих растворах.

Приведенные на рас л А. и Б текстуры нужно отнести к •"неспецифическому" типу <А.С.Сонин,1983); такие текстуры не позволяет идентифицировать тип жидких кристаллов ДНК.

Совершенствование техники приготовления образцов жидки? кристаллов позволило выявить специфическую пространственную сгруктурц фазы ДНК, связанную с характером взаимодействия между молекулами ДНК в растворах ПЭГ. На рис.4 В - вид тонкого слоя фазы ДНК, сформированной в ПЭГ-содеркащем растворе.Наблюдаемая текстура известна под названием текстуры "отпечаткоз пальцев"; она характерна . для холестеряческих жидких кристаллов низкомолекулярных соединений, а .также синтетических и биологически: полимеров (С. Бе шиз, 197в; Р.1_1уо1ап1:',198&). Периодичность ( в ) эквидистантных даний связана с шагом ( Р > спиральной структуры холестерическоих жидких кристаллов ( Р = 2 Б >. Величина Р холестерической спирали лежит в пределах 2-3 микрон.Полученное значение Р соответствует результатам оценок шага холестерической спирали жидких кристаллов, образуемых молекулами ДНК в водно-солевых растворах шли 11,1969), величина Р в нашем случае, также как и в случае жидких кристаллов поли(А)хполи(У) • (е.х1гика,1977), практически не зависит от температуры ПЭГ-содержащах растворов (в интервале температур от 25 до 85°С), Нагревание холестерических квдких кристаллов ДНК до температур, превышающих 95°С , т.е. до температур, при которых происходит разделение цепей молекулы ДНК (денатурация), сопровождается исчезновением специфической текстуры; в этих условиях фаза становится "оптически" изотропной.

Рис. 4 г иллюстрирует вид тонкого слоя фазы, сформированной из молекул ДНК в ПЭГ-содеркащем растворе с белее высокой концентрацией ПЭГ ( СПЭр 300 кг/мл ). Отличительной особенностью текстуры является наличие системы "черных изо га утих нитей" (Дж. Вендорф,1981). Такая текстура характерна для другого типа жидких кристаллов, а именно, нематических кидких кристаллов. Это означает, что увеличение концентрации ПЭГ в растворе до 300 мг/мл, сопровождаемое понижением величины ащ до во, приводит не только к увеличению плотности упаковки молекул ДНК в жидкокристаллической фазе, но и к исчезновению спиральной закрутки пространстве1Шой структуры жидких кристаллов.

Образование двух типов лиотропных гадает: кристаллов может быть интерпретировано в рачках теорги, предложенной в 198Ь году (Ы.А.0з1роу,19в5).Из теории следует, что угол спиральной закрутки ( ч> ) нематических слоев холестерического жид?сого кристалла зависит от соотношения между диэлектрическими свойствами среды и диэлектрическими свойствами полимера,- образующего жидкий кристалла, а таккэ от температуры раствора. Переход от энергии взаимодействия между молекула!® полимера к выражению для шага (Р, холестерической- спиралй'Приводит к уравнению :

v - 2 п а/ р »

** п. 1_3 V - «В •

или («ц/е^; е/еи> " ив

где: а - среднее расстояние между осями молекул полимера е квазинематических слоях; р - шаг спиральной структуры холестерика; в — диэлектрическая постоянная среды;

е||, - продольная и поперечная компоненты диэлектрической проницаемости молекулы полимера;

в|| -поперечная и продольная компоненты тензора гирации (оптического вращения) молекулы полимера; Т - температура;

к - константа Больцмана; А и В - подгоночные константы •

Анализ уравнения I 2 ) позволяет сделать ряд выводов, имевдш практическое значение. Во-первых, если зафиксировать температуру ;Т) раствора и свойства полимера (ец> ех), то изменение величии ещ до"1ср;шзческого"| е *) значения мохет обратить величину ч> в нули т.е. из оптически активных молекул полимера можно сформировать н< холестерические жидкие кристаллы, а "компенсированную структуру" свойства которой аналогичны свойствам нематических жидких кристаллов. Сопоставление свойств растворов ПЭГ, данных рентгенографического анализа зквдких кристаллов ДНК и их текстур, дает основание предполагать,что величина еш составляет ~ 60. Во-вторых,если зафиксировать значения ещ, е(| и ех,то,в принципе может быть достигнута такая температура, при которой величина < также обращается в нуль.т.е. "кошенсированная" структура може' возникнуть и при изменении температуры раствора Следует отметить что при определенных условиях должна иметь место ситуация, пр которой вслед за образованием "компенсированной" структуры, пр повышении температуры, вновь образуется холеотерическая жидкокристаллическая фаза ( <р =0 ).Однако,при этой" температур! направление спиральной закрутки образуицегося холестерика буде: "зеркальным" по отношении к исходному.Это означает,что в случа< лиотропных жидких кристаллов полимеров имеется принципиальна; возможность для реализации перехода "холестерикр нематик холестерик_1".В-третьих, зафиксировав свойства растворителя (Т еш> и меняя соотношение между величинами е|( и с1, т.е. меняя свойства молекул полимера, можно также сформировать два тип. холестерических жидких кристаллов, различающихся знаком ч> и ода тип нематических жидких кристаллов.

5). Текстуры фаз, сформированных из молекул нолшИ)хполиЩ). Вид тонкого слоя фазы, сформированной из молекул поли(И)хполи(Ц), напоминает в поляризованном свете закристаллизованную

поликристаллическую массу. Наличие малоуглового рефлекса на рентгенограммах фаз в сочетании с оптической анизотропией фаз, сформированных из молекул поли (И )хполи(Щ, показывает, что эти молекулы образуют жидкокристаллическую фазу. Текстура жидких кристаллов поли(И)хполиЩ) относится к "неспецифическому" типу;

она не позволяет установить тип жидких кристаллов поди (И) хлоли Щ). Попытки установить тип жидких кристаллов при помощи методов, разработанных для двухцепочечннх молекул ДНК, не привели к положительным результатам.Интересным оказалось изменение вэда текстуры при увеличении температуры. В интервале температур от 20°С до 70°С неспецифическая текстура сохраняется. При температуре ~ 70°С текстура представляет собой систему '"черных изогнутых нитей"(см.pic.4),характерную для нематических жидких кристаллов.Дальнейшее повышение температуры сопровождается изменением вида текстуры - текстура,характерная для нематических жидких кристаллов исчезает, и внсзь появляется неспецифяческая текстура. При тешературе ~ йО°С текстура в поляризованном свете перестает наблюдаться; фаза становится оптически изотропной. Это означает,что в отличие от жидких кристаллов ДНК, нагревание жидких кристаллов поли(И)хполк(Ц) инициирует появление нескольких тшхов текстур. Следовательно,в отличие от жидких кристаллов ДНК, в случае жидких кристаллов, сформированных из молекул поли<И)хполя(Ц), в качестве фактора, инициирующего переход между разными типами жидких кристаллов, выступает температура, т.е. температура "управляет" характером упаковки лиотропных ¡жидких кристаллов поли(И)хлоли(Ц).

Приведенные Еыше результаты показывают, что молекулы оптически активных, двухцепочечных нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов образуют пул конденсации в водно-полимерно-солевых растворах либо холестерические либо нематические жидкие кристаллы. Это означает, что свойства лиотропных .-жидких кристаллов нуклеиновых кислот существенным образом отличаются от свойств термотропных жидких кристаллов, поскольку в случае термотропных жидких кристаллов оптическая активность молекул однозначно "задает" золвстеркческув упаковку молекул. В качестве фактора, "управляющего" характером упаковки молекул нуклеиновых кислот в жидкокристаллических фазах, образующихся в ПЭГ-содержащах растворах, выступает диэлектрическая постоянная и температура растворов.

II. ЛИОТРОПНЫЕ ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ КОМПЛЕКСОВ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ Были исследованы свойства жидких кристаллов, сформированных

о-иоо

из молекул ДНК, связанных в комплексы с различными биологически активными веществами - антибиотиками антрациюшновой группы (аклациномицин А, адриамицин, виолачяцин,дауномицин,иремицин, кармяномивдн, штеффимицин), противоопухолевые соединениями группы платины (П), а также синтетическими соединениями антратшоновой группы. Выбор этих веществ определялся несколькими обстоятельствами.Во-первых, наличием аналогов, различающихся как по химической структуре, так и по биологической активности; во-вторых, способностью веществ образовывать разные типы комплексов с молекулами нуклеиновых кислот; и,наконец тем, что информация о характере взаимодействия этих соединений с ДНК может быть полезной при направленном . синтезе новых производных. Исследование свойств жидких хряст ало в, сформированных из комплексов нуклеиновых кислот с различными веществами, представляет интерес также и с теоретической точки зрения, поскольку на основании теории (Ы.о.э1роу,1'ЭЗЬ).можно предполагать существование такой модификации молекул нуклеиновых кислот, при которой становится возможным формирование разных типов жидких кристаллов, различающихся между собой способом пространственной организации.^

1).рентгенографические характеристики <раэ. сформированных из молекул ДШи связанных в. комплекс» е. :*нтраииклинам. В качестве примера, приведены рентгенографические параметры фаз, образованных молекулами ДНК, связанными в комплексы с противоопухолевым антибиотиком - даудашщином, молекулы которого "встраиваются" (штеркалируют) мекду парами азотистых оснований. Оказалось, что модификация молекул ДНК приводит к формированию фаз, для которых характерно небольшое уменьшение величины "а".Например,при г = о величина "а" составляет 34 А°; при г =0,11 - 32,7 А0; Щи г =0,14 - 31,4 А0, а при г = 0,16 - 30,7 А0. Уменьшение величины "¿1" означает, что модификация приводит к увеличению плотности упаковки молекул ДНК в образующейся фазе, причем при всех степенях заполнения молекул ДНК дауномицином, одномерный порядок - в расположении молекул комплексов (ДНК-дауномицин) сохраняется.

2).Текстуры Сформированных иа молекул ДНК,

модифицированных анграциклинами & антрахинонами. На рис.5 приведены текстуры тонких слоев фаз, сформированных

ro6ufA050

Рис.5. Текстуры жидких кристаллов,сфорлированных в ПЭГ-содержащем растворе из молекул ДНИ, связанных в комплексы с дауномицином <СПЭГ170 МГ/МЛ, 0,3 М НаС1 + фосфатный буфер). А - холестерические жидкие кристаллы и;оОЩ 0,050; Б - нематические жидкие кристаллы 0,165);

В - холестерические жидкие'кристаллы (г0(3що,б?5). (Величина г0(?щ - отношение молярной концентрации добавленного в раствор дауномицшш к молярной концентрации иуклеотвдов ДНК).

Отметка на рисунке соответствует 10 микронам.

при разных значениях го0щ из комплексов ДНК с антрациклином - дауномицином.Приведенные на рис.ЬА и 5В текстуры это текстуры "отпечатков пальцев"; они характерны для холестерических жидких кристаллов. Этот результат показывает, прежде всего, что молекулы комплекса <ДНК-дауномицин) образуют жидкокристаллическую фазу при конденсации в ГОГ-содержащих растворах, т..а. связывание антибиотика не влияет на способность молекул ДНК к образованию жидких кристаллов.Величина Р в случае рис.БА составляет 6,6 - Ь,8 микрон; т.е.связывание дауномицина сопровождается увеличением шага хслестеричесной спирали.

Увеличение степени связывания дауномицина с ДНК (го0ц 0,165) приводит к тому,что формируются не холвстерические.а нематические жидкие кристаллы (рис.5 Б).

Дальнейшее увеличение степени заполнения молекул ДНК дауномицином и формирование фаз из полученных комплексов вновь приводит к появлению текстуры "отпечатков пальцев".

Жидкокристаллические фазы, сформированные из комплексов ДНК с антрахиноном - гидрохлоридом 3,8-ди(и-димзтиламинопропиламида) -4,5-диокси-Э,10- а нтрацендиона,А-762), характеризуются (вплоть до значзний го0щ = 0.25), текстурами только "отпечатков пальцев". Величина Р е этом случае составляет ~ 5,5 микрона.

Таким образом, анализ текстур жидкокристаллических фаз, сформированных из. комплексов (ДНК-дау7:смицин), позволяет сделать вывод, согласно которому изменение*структуры молекул ДНК, происходящее при связывании с биологически активным веществом -дауномицином, оказывается достаточным для того, чтобы "управлять" характером жидкокристаллического упорядочения молекул в фазах, образующихся в водно-солэвых растворах ПЭГ.

3.).Рентгенографические характеристики <ьаз .образованных молекулами ДНКд. модифицированными соединениями платины На

кривых рассеяния рентгеновских лучей на фазах,образованных из исходных и модифицированных цис-дахлородиамминплатиной (II), цис-Рин), молекул ДНК, присутствует малоугловой рефлекс,отражающий упорядоченное расположение молекул ДНК в образующихся фазах. Цис-П< II) при реакции с молекулами ДНК "сшивает" два пуринових остатка (преимущественно гуаниловых) за счет образования связей с атомами N-7, расположенными в широкой бороздке ДНК.По мере увеличения степени модификации молекул ДНК

максимум рофлокса смещается в сторону меньших углов, а сам максимум на кривой рассеяния размывается Напри?,*,ер, при г = о величина "а" равна 29,06 Л°, при г 0,01 - 29,45 , при г 0,03 - 32,01 А0, а при г =0,1 - 36,21 А0. Модификация молекул ДНК цис-(Ри сопровоадается изменением всех параметров, характеризующих упорядоченное расположение молекул в фазах: наблюдается уменьшение размера "кристаллитов"!ь) и "радауса взаимодействия"'гш1.а также увеличение параметра

•"разупорядочешости" <л/а) .основной вывод, следующий из анализа полученных данных, состоит в том, что степень упорядочения сосодних молекул ДНК уменьшается по мере увеличения степени модификации молекул ДНК цис-рк ii) при сохранении в целом упорядочешюго расположения молекул ДНК в фазе. Можно отметить, что величина Брегговского рефлекса при высоких степенях модификации ДНК при ее взаимодействии с цис-СРИ достигает таких значений,которые соответствует концентрациям ДНК,находящимся % на границе области перехода из изотропного в жидкокристаллическое состояние.

Были изучены свойстза фаз, образованных из дзухцепочочшх молекул ДНК, модифицированных дихлоро-2,2 -бипиридилплатиной (IXХсоедине н ие 1), а также хлоридом

2,2-бипиридилэтилендиа!.щнплатины (II) (соединение 2). Если химическая структура . соединения 1 определяет его ковалентное связывание с атомами азота пуршовых остатков, то химическая структура соединения 2 исключает ковалентнее связывание этого соединения ДНК. Рентгенографический анализ показал, что максимум на кривых-рассеяния, характерный для фаз комплексов ДНК с соединениями платины рассмотренного типа (1 или 2),смотается в сторону меньших углов по мере увеличения степени модификации ДНК.Такой характер изменения положения Брегговского рефлекса и форлы самого рефлекса при взаимодействии соединений платины (II) с ДНК отличается от изменений, которые характерны для фаз, образованных из комплексов молекул ДНК с соединениями антрациклиновой группы; он аналогичен изменению величины м" зшдкокрксталлических фаз нуклеиновых кислот, образованных в ПЭГ-содержащих растворах, при увеличении температуры 4КТекстурн Фаз, сформированных из молекул ДНК, модифицированных соединениями платины IIII.Текстуры фаз,

7-1190

сформированных из исходных молекул ДНК в Насю4 -содержащих растворах ПЭГ, были сопоставлены с текстурами фаз, сформированных из молекул ДНК, модифицированных разными соединениями платины (II). Периодическое чередование темных и светлых полос,описывающее текстуру "отпечатков пальцев", доказывает,что молекулы исходной ДНК образуют холестерическую жидкокристаллическую фазу. Величина тага, г, спиральной структуры холестерина, оцениваемая на основании полученных данных, составляет ~ 3 микрона, что соответствует данным, полученным для ИаС1-содержащего раствора ПЭГ той же концентрации.

Взаимодействие ДНК с цис-РЬ (II) и последующее формирование жидких кристаллов из модифицированных молекул ДНК сопровождается уменьшается шага холестерической спирали: например, при г « 0,01 он составляет 1,5-1,9 микрон. Более глубокая модификация молекул ДНК цис-Р1(П) приводит к тому, что величина Р уменьшается до таких значений,точное определение которых при помощи поляризационного * микроскопа не удается. При г = о,1 фаза ДНК не обладает оптической анизотропией; текстуру этой фазы можно наблюдать только в естественном свете. Для такой фазы ДНК характерна гекстура.назваяная нами "капельной". Вид текстуры фазы, образованной молекулами ДНК при высокой степени их модификации цис-Р-ыы > в сочетание с одномерным порядком в расположении молекул ДНК, свидетельствует об образовании новой фазы.свойства которой отличаются ^от свойств классических жидкокристаллических фаз нуклеиновых кислот: холестерической или нематической.

Что же касается текстур фаз, сформированных из молекул ДКН, модифицированных соединениями 1 или 2 , то можно отметить следующее. При высокой степени (г ~ 0,02) модификации ДНК соединением 1 фаза теряет свою __ оптическую анизотропию; вид текстуры фазы.наблвдаемой в естественном свете, отличается от ввда текстур холестерической и немятических фаз жидких кристаллов ДНК.Связывание соединения 1 с ДНК и последующее формирование фаз из таких комплексов приводит только к уменьшению шага холестерической спирали; например, при г = 0,016 величина Р уменьшается до 1,5 -2,0 микрон. Это означает, что при одинаковой степени модификации молекул ДНК соединениями плагины (II) характер упаковки молекул ДНК в жидкокристаллических фазах

различается.Изменение свойств молекул ДИК, происходящее при взаимодействии с разными соединениями платины (í х > определяет способ упорядочения молекул ДНК в наоддах кристаллах.

Таким образом, взаимодействие координационных соединений платины (II) или антибиотиков антроцикликевоЯ группы с молекулами ДНК "управляет" способом упаковки молекул ДНК в жидкокристаллических фазах.

Приведенные выше данные показывают, что ' молекулы двухцепочечнеых нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов.а тапке молекулы комплексов ДНК с различными биологически активными веществами, модифицирующими структуру ДНК, образуют в водно-полимеряо-солевых растворах лиотропнне жидкие кристаллы. В случав лкотропных жидких кристаллов нуклеиновых кислот их пространственная структура зависит не только от хиралькости молекул этих полимеров, но и от соотношения между "диэлектрическими свойствами" растворов и молекул нуклеиновых кислот. Соотношение меаду свойствами водно-полимерно-солевых растворов и свойствами двухцепочечных нуклеиновых кислот определяет возможность формирования либо холестерических либо нематических жидких кристаллов.Модификация молекул ДНК может приводить таюке к появлению новой фаза, свойства которой отличаются от свойств нематических или холестерических гадких кристаллов ДНК.

III .НИДКОКРЙСТМЛИЧЕСКИЕ ДИСПЕРСИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ! ВЕЩЕСТВАМИ 1).Формирование и свойства яиякокристаллических дисперсия нуклеиновых кислот. Вопрос о то?л, какими свойства?® обладают частицы дисперсий, сформированных из молекул нуклеиновых кислот в водно-полимерно-солввых растворах, интересен прежде всего с теоретической точки зрения. Это связано с тем, что физико-химические свойства частиц дисперсий. особенно "свервдисперсий" размером от 100 до 1000 А0, могут значительно отличаться от свойств, характерных для непрерывных фаз.Отличия в свойствах возникают за счет "размерного

эффекта"(А•"damczyk,1У89).Этот эффект обусловлен существованием энергетических вкладов в свободную энергию, связанных с поверхностным натяжением частиц и наличием дефектов

упаковки молекул,образующих частили. В случае жидкокристаллических дисперсий наличие таких вкладов может приводить, в частности, к тому, что упаковка молекул, характерная для жидких кристаллов, может отсутствовать в дисперсиях (А.Айатсгук,1У89).

К щ

Рис. 6.Изменение форда спектра поглощения при формировании дисперсии ДНК в водно-солевых растворах ПЭГ. Ка вставке - изменение величины "кажущейся" оптической плотности ,(АК) при увеличении концентрации ПЭГ в водно-солевом растворе ДНК.

1 - спектр поглощения водно-солевого раствора ДНК 1С11ЭГ 0 мг/ыл)5

2 - спектр поглощения 1 в присутствии ПЭГ(СПЭГ 150 мг/мл);

3 - спектр поглощения 1 в присутствии ПЭГ(Спэг 180 мг/мд);

4 и 5 - спектры поглощения тех же ПЗГ-содерхащих водно-солевых растворов ДНК за вычетом вклада "кажущейся" оптической плотности.

Как следует из схемы, приведенной в разделе I, к образованию дисперсии нуклеиновой кислоты (мол. масса шкса . 1X10®) приводит смешение водно-солевых растворов нуклеиновой кислоты с водно-солевыми растворами ПЭГ. Измерения спектров поглощения позволяют оценить как размер частиц дисперсии, так и установить связь мезду свойствами водно-солевых растворов ПЭГ и эффективностью конденсации молекул ДНК. Начиная с определенной концентрации ПЭГ в растворе, оптическая плотность в полосе поглощения нуклеиновой кислоты уменьшается, а в области длин волн,превышающих 320 нм, увеличивается (рглс.6).Поскольку при длинах волн, превышающих 320 км, ни ДНК, ни ПЭГ не обладают электронным поглощением, увеличение оптической плотности в этой области спектра обусловлено рассеянием излучения на частицах дисперсии ДНК ("кажущаяся оптическая плотность, Д^). Оценка диаметра id> частиц дисперсии, основанная на применении уравнения(и.я.Слоним,1970):

Лк = К х ( 3 )

где: величина "п" связана при определенных условиях с размером частиц , рассеивающих излучение, показала что величина в в случае дисперсии ДНК составляет ~ ю3 л°. Надржер, при Спэг 100 мг/мл величина D равна 4,5х103А°; при 300 мг/мл

3,8x10"А0. Зависимость величию! D от концентрации ПЭГ в растворе выражается уравнением:

D(MKM) = ( Kj/ Cjjgp)7' + К2 ( 4 )

где: х ~ 0,2; К2 ~ 4; опэг е мг/мл.Увеличение концентрации ДНК в растворе приводит к росту величины D, увеличений концеитращш Г.ЭГ - к уменьшению D. Размер частиц дисперсии связан танке с иол. массой ПЭГ, хотя точная аналитическая связь манду атими параметра:.«! не установлена. •

Величина коэффициента трансляционной диффузии ( Др ) частиц дисперсии ДНК (Спэг 170 мг/мл;мол.масса ПУГ 4000; 0,3 М NaCi) была определена при • помощи метода лазерной корреляционной спектроскопии. При Сдщ( О величшга составляет

14х10~10см^/сек. Получегаюв значение Д^, соответствует частице, имеющей диаметр idi 3,7 х 103А°.

Низкоскоростное центрифугирование частиц дисперсии ДЩ в

приведенных выше условиях позволило оценить величину коэффициента седиментации (з> частиц дисперсии.При Сд^-а-О величина s составляет 14,3х103х10~13сек.

Оценка мол. ыаосы частиц дисперсии ДНК, основанная на получе1шых значениях Д™ и з, показывает, что мол. масса одной

1П

частицы близка к 5x10 . Поскольку средняя мол.масса одной молекулы ДНК, использованной для формирования дисперсии

Q,7xl0е, можно считать, что в состав одной частицы дисперсии ДНК, формируемой при СдЭГ 170 мг/мл, входят ~ Ю4 молекул.

Оценка радиуса (R> частиц дисперсии ДНК, основанная на учете результатов теории, описывающей конденсацию молекул ДНК в полшэр-содержащих растворах (А.Ю.Гросберг,1S85), показывает, что величина и составляет 2,9х103А° (0ддГ 170 мг/мл). Порядок полученного в результате теоретической оценки значения в совпадает с порядком экспериментально определяемой величины D, которая характеризует диаметр частиц дисперсии ДНК.

Сочетание результатов, полученных при помощи разных методов, свидетельствует о том, что молекулы ДНК образуют в ПЭГ-содержалдах растворах дисперсии, частицы которых имеют "микроскопический" размер Ю3 А0); е состав одной частицы входят - 104 молекул ДНК ("микрофазы" ДНК). При объяснении причин малого размзра частиц дисперсии ДНК в ПЭГ-содержаидех растворах учитывается вклад как кинетического, так и термодинамических факторов.

Регистрация спектров поглощения позволяет не только оценить величину "критической" концентрации (СддрКРит), т.е. концентрацию ПЭГ, соответствующую началу, образования дисперсии ДНК (вставка на рис. 6), но и установить зависимость этой величины от свойств использованных растворов. Определение величины спэГК*МТ в ПЭГ-содержалщх растворах развой мол. масса (от 1000 до 40000) показало, что эта величина зависит от мол. массы ПЭГ - чем выше мол. масса ПЭГ, тем меш.ша величина СПЭГКРИТ (рис.7). Между кривой,характеризующей зависимость величины ' С^др11?, т.е.концентрации ПЭГ при которой начинается смена режима свойств ПЭГ, от мол.массы ПЭГ,и кривой, характеризующей зависимость СГОГЬФ- от мол.массы ПЭГ, существует соответствие. Это означает прежде всего, что смена режима свойств ПЭГ инициирует образование дисперсий ДИК.Ниже кривых, приведенных на рис.7 , молекулы ДНК образуют изотропные растворы ( ПЭГ -"хороший растворитель"), выше

хз

кривых - молекулы ДНК образуют дисперсии (ПЭГ -"плохой растворитель") .Поскольку произведение МдЭ1,пРх у , где МПЭ1,ПР- мол. масса ПЭГ. при которой начинается формирование фпуктуационной полимерной сетки, а V - обтэмная доля ПЭГ, составляет ~ 600, корреляция между кривыми 1 и 2 на рис. 7 означает, что мол. масса ПЭГ , при которой мскс'1' формироваться дисперсия ДНК, должна превышать 600. Два принципиальных результата, а именно, существование зависимости между "критической" концентрацией ПЭГ и мол. массой ПЭГ и образование дисперсии ДНК в тех случаях, когда

Мод. масса ПЭГ

Рис.7. Зависимость величины СпдрПР от мол. массы ПЭГ (кривая 1)и зависимость величины С[1ЭГКРИТ от мол. массы ПЭГ при формировании дисперсий ДНК в водно-солевых (0,3 М Nací) растворах ПЭГ (кривая 2);

(Пунктир в левой-части кривой 2 означает, что при мол. массе ПЭГ нияе 1000 дисперсия ДНК не образуется).

мол. масса ПЭГ превышает "критическое" значение ( - 600) быт? положены в основу теории, описывающей роль ПЭГ при конденсации

ЫОЛекуЛ ДНК (A.Yu.Gro3berg,19Ö2). В ТвОрИИ уЧИТЫВавТСЯ ТОТ фЭКТ, что образование дисперсии ДНК происходит в условиях смены режимов свойств ПЭГ, т.е. в условиях возникновения дальнодействуюцих флуктуаций в растворах ПЭГ, обусловленных формированием флуктуационной полимерюй сетки.- Предполагается, что в водно-солевых растворах ПЭГ взаимодействие мезду экранированными протмвоионами молекулами ДНК ( или их сегментами) осуществляется через молекулы ПЭГ. Moser ли притяжение молекул ДНК через ПЭГ сказаться сильнее их отталкивания, возникающего в связи с существцванием исключенного объема? В теории содержится положительный ответ на этот вопрос. Формирование флуктуационной сетки ПЭГ приводит к тому, что молекулы ПЭГ, участвовавшие в образовании этой сетки "уходят" при СдЭр » Cjjgp1^51,1 из ближайшего окру|'.ения молекул ДНК. Такой "уход" означает, что вблизи молекулыДНК создаются условия для размещения не молекул ПЭГ, а других молекул нуклеиновых кислот.Молекулы ПЭГ на только "уходят" из состава образующихся частиц дисперсии ДНК, но и "сжимают" частицы дисперсий. Ыокно сказать, что роль ПЭГ при формировании дисперсий нуклеиновых кислот отличается от роли обычного органического "осадагеля". Следовательно, в ПЭГ-содержащих растворах создается специфические условия, при которых происходит Формирование конденсированной фазы нуклеиновых кислот.

Увеличение ионной силы растворов ПЭГ, содержащих соли щелочных металлов, от 0,1 до 0,7 сопровождается уменьшением величины СШ/Р-, причем минимальная величина СПЭрКР12'г соответствует во всех случаях натриевым солям. Изменение анионного состава ПЭГ-содеркацих растворов не приводит к изменению величины СПЭ/Р", определенной в растворе фиксированного катионного состава. Этот результат показывает, что меняя катионный состав раствора (при фиксированных прочих условиях) можно влиять на образование дисперсии ДНК-Переход от растворов, содержащих соли щелочных металлов, к растворам солей целсчно-земельных металлов сопровождается уменьшение» величины %эгК^ИТ • Например, если в случае ^-содержащего раствора, иошая сила раствора, достаточная для образования дисперсии составляет 0,1 (Сдзг 170 мг/кл), то в случае Mg2""-содержащих растворов, эта величина уменьшается до 0,003.

Что же касается формирования дисперсий из молекул других

ауклеиновых кислот в ПЭГ-содержащих растворах, то нужно отметить следующее. Добавление ПЭГ (мол.масса 4000) к водно-солевым (0,3 М. iaci) растворам двухцепочэчной РЖ (решшкативная форма фага мол .масса ~ 2х106 ) сопровождается также, как и в случае цвухцепочечлой ДНК, появлением "кажущейся"' оптической плотности при \ > 320 нм, уменьшением амплитуды полосы поглощения - и небольшим смещением максимума поглощения в длинноволновую область зпектра. Также, как и в случае ДО., "каадаяся" оптическая ллотность появляется только после достижения "критической" концентрации ПЭГ в растворе, причем величина 0ПЭГКР:1Т в случае РНК достаточна близка к соответствующей величине для ДНК. Аналогичные изменения в спектрах поглощения отмечены при смешении зодно-соловых растворов ПЭГ с водно-солевыми растворами даухцепочэчных синтетических полшуклеотидов. Измерения спектров гаглоцения водно-солевых растворов ПЭГ денатурированной теплом ДНК кжазали, что в этом случав отмеченные выше изменения в спектрах гоглощения выражены слабее. Спектры поглощения водно-солевых(0,3 М JaCl) одноцепочечннх полирибонуклеотидов поли (У), поли(А), голи(Г), а также т-РНК в присутствии ПЭГ(мол.масса 20000) ¡ввдетельствует об отсутствии изменений в спектрах, указывающих на >бразование дисперсий.

Таким образом, в специфических условиях» создаваемых в [ЭГ-содержащих рас т во р ах, жесткие двухцепочечные молекулы [уклеиновых кислот могут образовывать дисперсии. Факторами, 1ЛИЯЮЩШИ на эффективность образования дисперсий, являются ¡войства ( ионная сила, катиошый состав, концентрация и мол. iacca ПЭГ) растворов.

В связи с полученными данными возникает вопрос о том, каким пособом уложены молекулы нуклеиновых кислот в дисперсиях. Если "честь представление о формировании э ПЭГ-содержащих растворах астиц "микроскопического" размера и принять во внимание малую онцентрацию таких частиц в исследуемых растворах, то можно казать, что методы доказательств упорядоченного расположения олекул в частицах такого размера отсутствовали к моменту ачала нашей работы.

I-Доказательство жидкокристаллическое упаковки молекул ИШИ1ШШ1 кислот е. дисперсиях. Доказательство существования идкокристаллической упаковки двухцепочечнкх молекул нуклешовых

И

кислот и синтетических полинуклеотидов в дисперсиях основано ш применении к ним идеологии метода "внешних хромофоров", разработанной (К.Заеуа, 19?9) для термстротшх холесторико! низкомолекулярных соединений. В основе метода лежит факт появлеш} аномальной оптической активности . в полосе поглощения моде^ окрашенных соединений ("внешних хромофоров"), которые растворяют I расплавах термотропных холестериков и которые определенным образог ориентируются в таких холостериках. Аномальная оптическая активность может проявляться,в частности, в виде интенсивно! полосы в спектре кругового дихроизма (КД) или оптическогс вращения.Полоса в спектре КД не является полосой селективноп отражения, поэтому на нее действуют не те факторы, которы! определяют изменение величины шага, Р, спиральной структур} холестериков.

Из данных, приведенных в раздело I .следует,чт( двухцепочэчные оптически активные молекулы нуклеиновых кисло: стремятся к холестерической упаковке,поэтому первое из условй рассмотренного вние метода может выполняться "автоматически".Чт( ке касается второго условия - растворения "внешни хромофоров" 1 жидкокристаллической фазе, то в случае молекул нуклеиаовых кисло" это условие также выполнимо в силу того, что в состав молеку, нуклеиновых кислот азотистые основания ("внешние хромофоры") поглощавдие в УФ-области спектра.Азотистые основания достаточна жестко закреплены в структуре нуклежовых кислот, угол их наклон! по отношению к оси спирали молекул нуклеиновых кислот практически не меняется при всех условиях, не вызывающих денатурацию эти мслекул. Это означает, что в случае образования холестерически жидких кристаллов нуклеиновых кислот, оптические свойств; азотистых могут нести информацию об особенностях упаковки соседни молекул нуклеиновых кислот.В этом случае амплитуда полосы 1 спектре КД будет описываться уравнением:

Де = к Р V 3Лп( Л ,, - А . )/21 V 2 - V 2 ) ( 5 )

г 11 X I о

где: де = - ед - круговой дихроизм при частоте ;

vo ~ частота, при которой располагается полоса селективного отражения холестерина, связанная с шагом (Р) его спиральной структуры ( Р = ^ п уо ). в случаэ лиотропных жидких кристаллов, сформированных, из молекул ДНК, имепцих мол. массу

ниже 1х106, величина Р соответствует нескольким микронам;

дп - оптическая анизотропия, которая имеет отрицательный знак в нашем случае;

Аи - Ах - линейный дихроизм ДНК, который зависит от угла наклона азотистых оснований по отношение'к оси спирали ДНК

о

( А| | - Ах»/ А = к, <4 Соз2а - 1 > 4 6)

Чинейный дихроизм азотистых оснований имеет отрицательный знак.

Знак полосы зависит как от направления спиральной закрутки холестерина, так и угла под которым молекулы "внешнего хромофора" ориентированы по отношению к директору квазинематического слоя. В самом методе на содержатся ограничения пи на число "внешних хромофоров", ни на их оптический свойства, ни на величину Р.

Поскольку в уравнении (5) в явной форме не содержится "размер" жидкокристаллической фазы, предположение, вытекающее из метода "внешних хромофоров", состоит в том,что формирование не только холестерических жидких кристаллов, но и жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот, имеющих упаковку, близкую к холестеряческой, может сопровождаться появлением интенсивной полосы в спектре КД.При образовании дисперсий, имеющих "нематическую" упаковку соседних молекул, полоса в спектре КД должна отсутствовать.

На рис.8 спектр КД водно-солевого раствора исходной ДНК сопоставлен со спектром КД дисперсии, сформированной в ПЭГ-содерашцем растворе ( С^р » %эгКрИТ) из той же самой ДНК. Можно отметить следующее. Во-первых, интенсивная полоса в спектре КД расположена в области поглощения азотистых оснований (л ~ 300 нм). Во-вторых,форма полосы в спектре КД аналогична Еорме полосы поглощения ДНК.Наконец, значение ~ ао ед.),

характеризующее оптическую активность азотистых оснований в составе дисперсии ДНК, во много' раз превышает величину де, характерную для азотистых оснований в составе исходных, линейных молекул ДНК ( - 2,5 ед.». Сочетание этих фак т ов доказывает, что азотистые основания в составе молекул ДНК выступают в качестве "внешних хромофоров", встроенных в структуру жидкокристаллических дисперсий.

Л,HM

Рис.8. Спектры КД линейной, двухцепочечной, правоспирально® B-формы ДНК (кривая 1, Сдщ 33 мкг/мл, 0,3 М Nací) и дисперсной фазы, сформированной в ПЭГ-содержащем водно-солевом растворе(кривая 2, мол.масса ПЭГ 4000, СПЭГ 170 мг/мл- 0,3 М NaCl). л А в см; 1 см - 10~4опт. ед; д А *= a a r .

Возражение против такого предположения является очевидным полоса в спектре КД дисперсий ДНК располагается в УФ-области, в которой оптическое рассеяния может привести к существенному искажению как амплитуды полосы, так и -формы спектра КД. Это возражение означает, что требуется дотго.'пжтельная проверка предположения о жидкокристаллической природе упаковки молекул ДНК в дисперсиях. Для этого нужно проанализировать,прежде всего, уравнения (2) и (5).Из анализа уравнения ( 2 ), следует, что факторы, определяющие структуру холесгерических кидких кристаллов, должны действовать и в случае их дисперсий. Уравнение ( 5 ), в свою очередь, означает,что изменение пространственной упаковки молекул может привести к изменению амплитуды полосы не только в случае жидких кристаллов, но и жидкокристаллических дисперсий.

Амплитуда полосы в спектре КД зависит от длины молекул ДНК. При небольшой длине молекул ДНК ( менее 150 пар оснований, - 500 А0) сформировать дисперсию, имеющую аномальную оптическую активность, не удается. Этот результат отражает тот факт, что имеется "нижний" предел длины молекул ДНК; очень короткие молекулы не конденсируются в ПЭГ-содеряащих растворах.Оптическая активность дисперсий ДНК достигает максимума при их формировании из молекул длиной ~ юоо А0 ( 300 пар оснований). "Верхний предел" молекулярной массы ДНК, при которой еще сохраняется способность к формированию оптически активных дисперсий близок к 3x106. При дальнейшем увеличении длины молекул ДНК амплитуда полосы в спектре КД уменьшается; при мол. массе » 10x10Ь спектры КД дисперсий лишь немногим отличаются от спектров КД классических форм нуклеиновых кислот.Отсутствие аномальной оптической активности при образовании дисперсий из высокомолекулоярных ДНК свидетельствует о том,что кинетические факторы влияют на характер упаковки молекул ДНК.

Отсутствие аномальной оптической активности при фордировании дисперсий из денатурированной ДНК или одноценочечных лолинуклеотидов свидетельствует о том, что появление амплитуды полосы в спектре КД связано не' с рассеянием, а с характером упаковки молекул зтих полимеров.

Амплитуда полосы в спектре КД сложным образом зависит от Сддр.Отрицательная полоса в спектре КД появляется только после достижения "критической" концентрации ПЭГ в растворе. Величина ОщрЧ». определяемая на основании анализа спектров КД, близка к

величине ОдэрК*5ИТ . определяемой в аналогичных условиях на основании анализа спектров поглощения. Амплитуда полисы в спектре КД достигает максимального значения при сПЗр ~ 160-190 мг/мл, после чего она резко уменьшается. При Сддр ~ 3 00 мг/мл интенсивная полоса в fспектре КД практически отсутствует.Факт "ухода" полосы в спектрах НД дисперсий, формируемых при высокой концентрации ПЭГ, очень важен при объяснении характера упаковки молекул ДНК в дисперсиях. В этих условиях, как известно (fi.Arnold,1965), величина диэлектрической постоянной

ПЭГ-содержадах растворов < e^i уменьшается до ~ 60. Изменение величины моазт быть достигнуто не только при изменении концентрации ПЭГ в растворе, но и при добавлении в ПЭГ-содеркащий раствор органических растворителей.Оказалось, что при формировании дисперсий в ПЭГ-содержащлх растворах (Сдэг 150 ЫГ/Ш1> w NaCi), в которые для изменения величины ет добавляли метанол,- этанол, изопропалол, морфэлин.даоксан удается создать не только такие условия, при которых амплитуда полосы в спектре КД обращается в нуль, но и условия, при которых полоса становится положительной. Оценки величины effi,соответствующие условиям, при которых амплитуда полосы в спектре КД дисперсии ДНК обращается в нуль (критическое значение е_. -- е"т) показывают, что величина е*ш лежит в пределах от 50 до 57 для разных случаев.¡ Эти результаты близки к данным, характеризующим величину еш* ПЭГ- содержащего раствора.Для растворов, имеющих значения ет выше и ниже рассчитанного значения еш", знаки полос в спектрах КД различаются. (Аналогичные результаты, свидетельствующие о возможности формирования дисперсий,различающихся знакими полос в спектрах КД, были получены при использовании в качестве растворителей оксиэтиленглицеринов разных мол. масс ( » 1000)).Факт появления в спектрах в спектрах КД отрицательной полосы в сочетании с фактом смены знака полосы означает,что из оптически активных молекул ДНК формируются дисперсии, для которых характерна жидкокристаллическая упаковка.Эта упаковка может быть как холестерической, так и нематической.

Величина С^ЭГКРИ'Г зависит от ионной силы раствора - чем выше ионная сила раствора, тем ниже величина C^p^11. И, наконец, эффективность образования дисперсии ДНК, имеющей интенсивную полосу в спектре КД, зависит от природы катионов солей,

присутствующих в растворе, и не зависит от природы анионов этих солей.Величина СПЭрКРкт в Ма+-содергсадем растворе на 60 мг/мл нкке, чем в ся+-содержащем растворе той не ионной силы.

Приведенные результаты показывают,что формирование оптически активных дисперсий происходит только при Определенном соотношении свойств' растворителя и свойств молекул ДНК.Отсвда следует,что' в случав других нуклеиновых кислот, отличающихся по свойствам от ДНК, можно сформировать дисперсии, оптические свойства которых Оудут отличаться от свойств дисперсий ДНК при тех же самых свойствах растворителя.

Сопоставление спектров КД дисперсий, сформированных в ПЗГ-содержащем растворе (18 0 мг/мл; 0,3 М Nací) из молекул правоспиральных синтетических двухцепочечных полшуклеатидов цоли(дА-дТ)хполи(дА-ДТ) и поли(дА)хполи(дТ), различающихся только порядком чередования азотистых оснований,, показывает, что их дисперсии раадагмдотся знаком интенсивных полос в спектрах КД. Из молекул поли(дГ-дЦ)хыоли(дГ-дЦ), принадлежащих при высокой ионной силе раствора ( ji » 2,6) к левоспиральной z-форле,также можно сформировать два семейства дисперсий, различающихся знаком интенсивной полосы в спектре КД.

При переходе от В-семейства нуклеиновых кислот к А-семейству, обнаружено, что полирибонуклеотиды могут также образовывать два типа дисперсий, различающихся знаком оптической активности.Из молекул двухцепочечной РНК или молекул поли(И)хполиЩ) можно сформировать дисперсии, различаются знаком оптической активности.Переход между формами дисперсий, различающимися знаком полосы в спектре КД, монет быть вызван изменением концентрации ПЭГ в растворе (в случае РНК) или изменением ионной силы раствора (в случае поли(И)хполи(Ц)). Однако-, из полирибонуклеотидов поли(А)хполи(У), полиЦ)хполи(дТ) ' формируются только такие дисперсии, которые при всех использованных условиях имеют спектры КД, содержащие положительную полосу.

Полученные выше результаты показывают, что из нуклеиновых кислот, принадлежащих к разным семействам (правоспиральные В- и A-формы, левоспиральная z-форма) можно сформировать дисперсии, характеризуемые спектрами КД, содержащими интенсивные полосы в области поглощения азотистых оснований.Тот факт, что на уровне дисперсий проявляется действие тех же факторов, < которые

"управляют" структурой жидких, кристаллов нуклеиновых кислот, показывает.что структура частиц дисперсий в целом аналогична структуре их жидкокристаллических фаз.Следовательно,из молекул нуклешовых кислот можно сформировать жидкокристаллические дисперсии, имеющие в ¡зависимости от свойств растворителя, разную пространственную структуру, в рамках этого вывода очевидно, что при постоянных свойствах растворителя химическая модификация азотистых оснований нуклеиновых кислот, может привести к изменению пространственной упаковки молекул в жидкокристаллических дисперсиях, что в свою очередь, будет сопровождаться изменением аномальной оптической активности дисперсий.

3 )Жидкокшстаплическяе дисперсия, с<юршрованные из химически модкфицкравашых молекул ДМ.

Как кислотная, так и щэлочная ионизация азотистых оснований в составе молекул ДНК или РНК, приводящие к разделению цепей нуклеиновых кислот, сопровождаются тем, что аномальная оптическая активность дисперсий исчезает.

Формирование дисперсий (мол.масса ПЭГ 20000; 0,3 М НаС1) из молокул ДНК, содержащих метилированные по атому N-7 гуаниловые остатки, приводит к уменьшению амплитуды полосы в спектре КД и к обращения; ее в нуль при высокой ( ~ 20 % при С^ 80 мг/мл и ~ 40 % при СрЭГ 100 мг/мл.) степени модификации ДНК. Метилирование цитозиновых остатков в составе • молекул ДНК по атому С-5, осуществляемое в биологической система (путем внутривенного введения крысам 4-метил-2,6-дитретбутилфенола) с последующим формированием дисперсий, также сопровоадается резким уменьшением амплитуды отрицательной полосы в спектре КД. Амплитуда полосы обращается в куль при содержании метилцнтозина, превышающем 2% .

Представляют интерес данные, характеризующие действие на ДНК соединений группы платины (11), которые применяются в качестве противоопухолевых. Из молекул ДНК, обработанных соединениями платины (II), различающимися по химической структуре и биологической активности,были сформированы жидкокристаллические дисперсии. Рис. 9 показывает, что реакция соединений платины( И) с гуаниловыми остатками ДНК приводит к исчезновению оптической анизотропии дисперсий. Присоединение 1 атома платины на 50-100 оснований нуклеиновых кислот оказывается достаточным для полного исчезновения отрицательной полосы в спектре КД.

Рис.9.Зависимость амплитуды полосы ( при * 270 нм) в спектрах КД дисперсий, сформированных в ПЭГ-содерасащем растворе (мол. масса ПЭГ 4000, С^р 170 мг/мл, 0,3 М ЫаС104) из молекул ДНК ( мол.масса ДНК - 0,5х106),модифицированных соединениями платины (II) от величины "г". 1 - ЦИС-Р*-(ЫН3)2С12 ; 2 - Р^еЫС^: 3 - Р1:<Ъ-гаееп>С12; ■ 4 - Р^Н31 Вг )С12; 5 - ТраНС^ ( ЫН3 )2С10; : 6 - ЦИС-^МН3Ш2С1; 7 - траНС-Р^Нд^т ; в - ЦИС^ННуРуСП.,; ^ - ЦИС-РиМН3 >2(М02 )2; 10 - РиНН3)3С1.

Использованные нами соединения располагаются в своеобразный ряд по эффективности действия на свойства кидкокрималлических дисперсий. Положение соединения в этом ряду, устанавливаемое по изменению амплитуды полосы в спектре КД дисперсш, в целом

согласуется с его положением в том ряду соединений платит (II) .который составлен по измерению биологической активное« (Н.М.Акименко,1984). Ыохно предполагать, что регистрация спектров КД жидкокристаллических дисперсий окажется удобным приемом длг детектирования небольших изменений в структуре молекул нуклеияовы: кислот, вызванных химической модификацией азотистых оснований. ■1 (Жидкокристаллические дисперсии комплексов ДНК, о. антсаниклинами и антрахинонами.Из анализа особенностей метода "внешегс хромофора" следует, что связывание биологически активянз веществ с нуклеиновымн кислотами и формирование жидкокристаллических дисперсий из полученных комплексов, долхне приводить к появлению, как минимум, двух полос в спектре КД. одна из полос должна располагаться в области поглощения азотистыз оснований, тогда как другая - в области поглощения хромофоров биологически активных веществ. В качестве "внешних хромофоров" были использованы биологически активные вещества антрациклиновой 1 антрахиноновой груш.

Из комплексов ДНК с антрациклинами, различающимися пс химической структуре, были сформированы дисперсии. Следует отметить, что связывание антрациклинов с ДНК не влияьт на величину На рис. 10, в качестве примера, приведены спектры КД дисперсий, сформированных в ПЭГ-содеркащем растворе из комплекса (ДНК-дауяомицин). Обращают на сеоя Екимание ряд фактов. Во-первых, в спектре КД дисперсий присутствуют две полосы. При невысоко! степени заполнения молекул ДНК даукомицином (г ~ 0,04) обе полось имеют отрицательный знак. Одна из полос расположена в обласп поглощения азотистых оснований ДНК ( к ~ 300 нм), другая - I области поглощения хромофоров антибиотика < х - 500 нм). Во-вторых, форма полос в спектре 1СД аналогична форме спектро! поглощения ДНК и антибиотика, соответственно.В-третьих, амплитудн обеих полос ( в расчете на моль пар оснований ДНК, йе270' 11,111 Н£ моль антибиотика, связанного с ДНК, ле&05) достаточно близки. Появление двух интенсивных полос, расположенных в разных областш спектра, подтверждает тот факт, что молекулы ДНК образу* жидкокристаллическую дисперсию. имеющую холестерическу* упаковку.Кроме того, одинаковый знак полос свидетельствует о том, что ориентация молекул дауномицина по отношению к оси молекулы ДНИ совладает с ориентацией азотистых оснований. В-четвертых,дисперсии

молекул ДНК, связанных в комплексы с дауномицином, сформированные

Рис.10.Спектры кругового дихроизма дисперсий, сформированных в

ПЭГ-содержшдем растворе (мал.масса ПЭГ 4000, СПЭГ170 мг/ил' 0,3 М НаС1) из комплексов (ДКК-дауномицин} в УФ- и видимой оОластях.

1 - г - О, 2 - с - 0,032, 3 - г « 0,141, 4 - г « 0,198. (Д А в см, 1 см - 10~'1опт.ед).

Величина "г" - отношение концентрации антиокотика, • связанного с ДНК, к молярной концентрации нуклеотидов ДНК.

при высокой концентрации ПЭГ (С11ЭГ » 200 мг/мл) не имеют аномальных, полос ни в области поглощения ДНК, ни в ооласти поглощения антибиотика.

Молекулы биологически активного вещества , взаимодействуя с ДНК, меняют свойства этих молекул.Следовательно,они могут влиять на взаимодействие между соседними молекулами ДНК и на характер их пространственной упаковки в жидкокристаллических дисперсиях.В пользу этого утверждения свидетельствует тот факт, что при г 0,1 происходит смэна знака обеих полос в спектре КД с отрицательного на положительный. Если свойства жидких кристаллов комплексов (ДНК-дауномицин) соответствуют свойствам жидкокристаллических дисперсий , то очевидно, что знак полосы в спектре КД отражает определенное направление пространственной закрутки молекул комплекса. Это означает, что смена знака полосы в спектре КД с отрицательного на положительный, вызванная "заполнением" молекул ДНК дауномицином, подтверждает существование двух типов холеотэриков, различающихся только направлением спиральной закрутки , ит с утствие пол о сы в спектре КД означает

образование дисперсии, для которой характерна нз холестерическая, в нематическая упаковка молекул.

Факт появления двух интенсивных полос в спектре КД дисперсий, сформированных из комплексов ДНК с дауномицином, оыл подтвержден при исследовании свойств дисперсий, сформированных из молекул ДНК, связанных в комплексы с шестью другими антрациклинами. Зависимость амплитуды полос от величины г показывает, что характер пространственной упаковки молекул ДНК определяется химической структурой биологически активных соединений. Эта зависимость позволяет ранжировать антибиотики по тому, насколько эффективно тот или иной антибиотик вызывает "обращение" знака полосы в спектре КД дисперсий. Но исключено, что между эффектом "обращения" знака полосы и биологической активностью антрациклинов существует корреляция; в этом случае изучение спектров КД

жидкокристаллических дисперсий можно использовать для предварительного скрининга антибиотиков, наиболее сильно влияющих на характер пространственной упаковки молекул ДНК.

Ионизация молекул дауномицина в составе дисперсий, образованных из комплекса (ДНК -дауномицин) и имеющих положительные полосы в спектре КД, или разрушение комплекса под действием

додецилсульфата натрия, приводит к уменьшению до нуля амплитуды только одной полосы в спектре КД, а именно, полосы расположенной в области поглощения антибиотика. Несмотря на уход молекул антибиотика из состава рассмотренного комплекса, холестерическая упаковка молекул ДНК. в дисперсиях сохраняется и амплитуда положительной полосы в спектре КД в области -поглощения ДНК практически не меняется. Сохранение положительного знака полосн в спектре КД означает, что направление укладки молекул ДНК остается таким , каким оно было "в момент формирования"1 дисперсии. Лишь денатурация ДШ приводит к одновременному исчезновению обеих полос в спектре КД.

Появление одинаковых по знаку полос в случае одинаково ориентированных хромофоров, поглощающих в разных ооластях спектра, постоянство положения максимумов полос при изменении внешних условий позволяет провести ориентировочную опенку величины (Р) шага холестерической спирали, характерной для дисперсий. С учетом одинакового знака полос в спектре КД можно считать, что полоса селективного отражения, связанная с шагом Р спиральной структуры холестерика, располагается при длинах волн лежащих по одну сторону от обеих полос е .спектре КД, точнее при я » 500 нм. В этом случае величина Р долкна тлеть порядок микрон. Такая ориентировочная оценка вполне соответствует прямым данным, полученным прт анализе жидких кристаллов ДНК.

Сложная картина наблюдается при нагревании дисперсий, сформированных из комплексов (ДНК-дауномицин). Следует отметить гф^хде всего, что при нагревании положение максимумов обеих полос ае меняется; происходит лить изменение амплитуд обеих полос. При нагревании дисперсий, сформированных при малых значениях г (до г < 0,1), от 20 до 85°С наблюдается уменьшение амплитуды збеих отрицательных полос. (В области- температур от 20 до У5°С амплитуды меняются незначительно; в области 75-85°С амплитуды уменьшаются до нуля). При больших значения г (г » о,1) амгоглтудц збеих положительных полос в спектре КД уменьшаются,обращается в ауль, происходит смена .знака с положительного на отрицательный и затем амплитуды отрицательных полос снова обращаются в нуль. При лаксимальной степени заполнения ДНК антибиотиком наблюдается "одностадийное" уменьшение амплитуды положительной полосы до нуля з интервале температур 75-8У°0. Полученные результаты показывают»

что эффективность действия факторов, пуправляювдис"свойстваш! дисперсий, отличается от их действия ка жидкокристаллические фазы.

Рис.11. Спектры поглощэния водно-солевых 1 0,3 М Na.cn растворов (А): 1 - свободной ДНК спермы лосося; 2 - комплекса <ДНК-А~?47); . 3 - антрахинона А-747; а также спектры КД дисперсий, сформированных в i ПЭГ-содержащем растворе (мол.масса ПЭГ 4000,СпЭр 170 мг/мл 0,3 М МаС1)

i Б): 1 - дисперсия исходной ДНК;

2 - дисперсия комплекса (ДНК-А-747, "г" » о,031) На вставке - зависимость амплитуды полос в спектре КД дисперсий комплексов ( ДНК-А-747, ¿eo7Q и Ле500 от величины "г".

и

Другая груша биологически активных соединений, которые были использованы в качестве "внешних хромофоров", это антрахиноны.На pic. 11 , в качестве примера, приведены спектры КД дисперсий, сформированных из молекул ДНК. связанных в комплексы с вптрахиноном 1 («■»-диэтиламинопрошламздо ) М-окси-Э, Ю-антрашндионом (А-747). Наличие двух отрицательных полос в спектре КД позволяет сделать вывод о том, что А-747 - интеркалятор.Молекулы А-747 располагаются под углом, близким к углу ориентации азотистых оснований.Аналогичное утверждение справедливо и для многих другах антрахинонов .взаимодействующих с ДНК. Характерная особенность взаимодействия антрахинонов с ДНК состоит в том, что несмотря на высокие степени заполнения молекул ДНК этими соединениями, знак полос в спектре КД остается отрицательным. Это означает, что действие антрахинонов на ДНК отличается от действия антрациклинов, хотя обе группы соединений являются интеркаляторами.

При изучении спектров КД дисперсий, образованных из комплексов молекул ДНК с олигопеггтидаым антибиотиком дистамицином, было обнаружено, что в этом случае в спектре КД антибиотика появляется полоса, знак которой противоположен знаку полосы, расположенной., в области поглощения хромофоров ДНК. Увеличение степени связывания с ДНК сопровождается "обращением" знаков обеих полос. Знак полосы в. области поглощения азотистых оснований становится положительным, а знак полосы в области поглощения антибиотика - отрицательным. Из уравнений (5) и (6) следует, что молекулы этого антибиотика ориентированы по отношению к оси спирали ДНК под углом, меньшим 54°.

Следовательно, знак интенсивных полос в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий, сформированных из молекул ДНК, модифицированных биологически активными вещества*«!, позволяет установить способ расположения этих соединекний на ДНК.

Следует отметить,что.анализ спектров НД дисперсий позволил установить разную ориентацию молекул координационных соединений платины ni», рассмотренных в разделе II,3.

Таким образом, биологичосни активные вещества, взаимодействуя с ДНК, могут менять ее свойства так, что из модифицированных молекул формируются жидкокристаллические дисперсии, различающиеся характером упаковки молекул ДНК. Факторами, "управляюцими" свойствами дисперсий, являются свойства

водно-полимерчшх растворов, свойства молекул ДНК .Так кэ как и ] случае »задних 1сристаллов, могут формироваться дисперсии, дл: которых характерна холестерическая или нематическая упаков» молекул ДНК. Однако,■ в случае дисперсий, сочетание факторе; "управления" является более гибким; в частности, оно позволяв: формировать нематические структуры в более широком набор условий.

Приведошше выае данные, характеризующие свойства жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот, показывают, чт< жидкокристачлкческиэ дисперсии, достаточно легко меняя сво! свойства "в ответ" на изменение внешних условий, могут Сын использованы в качестве основы для создания оптических биодатчико] для Онесенсорннх устройств,позволяющих определять не толы« наличие в среде г. концентрацию биологически активных соединений взаимодействующих с ДНК, но и устанавливать спосооы расположена молекул"этих веществ на молекуле ДНК.

В заключение, можно сказать несколько слов о возможности реализации жидкокристаллического состояния молекул нуклеиновы; кислот в Оиолощческих объектах.Поскольку оптически активны« молекулы ДНК при высокой концентрации должны находиться 1 жидкокристаллическом состоянии, возникает ворос о том, создаюта ли в клетках условия, обеспечивающие локальноэ повышени* концентрации ДНК. Детальное исследование стадий сборки некоторы: бактериофагов и1-к. ЬаеттП, 1974 > показало, что в клетках бактерий при помощи полимеров биологического происхождения, не 'образуют комплексы с молекулами ДНК, создаются такие условия, которые приводят к конденсации молекул ДНК. Эта ситуация была назван) "РЕС-Икв з1±ипЫоп", ПЭГ-подобкая ситуация. Следует добавит; также, что изучение тонких срезов хромосом простейших, 1 частности,ДШОфЛагеЛЛЯТ ргоЬзпэтгшп ш1сапз (В.В111,1988), показало, что молекулы ДНК в этих хромосомах уложены такт способом, который характерен для укладки молекул ДНК ] холестериках. Следовательно, пользуясь полученными нами данными характеризующими особенности образования жидких кристаллов ] жидкокристаллических дисперсий нуклеиновых кислот, можно не только "консервировать1* молекулы ДНК в состоянии, характерном дл, биологических объектов, но и выяснять пути направленное воздействия разных факторов на процесс упаковки молекул ДНК ]

клетках.

• вывода

1. Жесткие двухцепочечше молекула нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотвдов низкой мол. массы ( £ 1х106) образуют в результате "исключения" из водно-солевых растворов, . содержащих некоторые полигликоли, фазы, для которых характерно упорядоченное расположение соседних молекул нуклеиновых кислот. Наличие малоуглового рефлекса на рентгенограммах фаз, характер его изменения при изменении внешних условий, в сочетании с наличием оптических текстур у полученных фаз» свидетельствуют о том, что из двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот и синтетических полинунлеотидов формируются жидкокристаллические фазы (жидкие кристаллы). Оптически активные молекулы ^ нуклеиновых кислот образуют в водно-полимерных растворах два типа лиотропных жидких кристаллов: холестерические жидкие кристаллы и нематаческие жидкие кристаллы.

Рентгенографические параметры вторичной структуры нуклеиновых кислот не меняются при. образовании жидких кристаллов.

2. Факторами "управления" характером пространственной укладки молекул нуклеиновых кислот, образующих лиотропяые жидкие кристаллы, являются свойства (молекулярная структура, диэлектрическая постоянная и температура) ПЭГ-содержащих водно-солевых растворов, а также свойства самих молекул нуклеиновых кислот.

3. Молекулы ДНК, структура которых модифицирована в результате взаимодействия с биологически активными веществами актрациклиновой и антрахиноновой групп, образуют лиотрошшо жидкие кристаллы. Для комплексов (ДНК-антрациклины) характерны

(в зависимости от степени модификации ДНК антибиотиком) два типа холестериков и один тип нематиков; для комплексов (ДНК-антрахиноны) - один тип ' холестериков.

. Кз молекул ДНК,структура которых модифицирована в результате взаимодействия с противоопухолевыми соединениями группы платины (II),образуются лиотропные жидкие кристаллы.В том случае, если молекулы ДНК модифицированы в результате взаимодействия с цис-дихлородиамминплатшюй (II >, они образуют упорядоченную фазу,

свойства которой отличаются от свойств как холестерических, так г тематических гладких кристаллов. Эта фаза названа "капельной" (по виду текстуры, наблюдаемой только е естественном свете).

4.Несткио двухцепочечныв молекулы нуклеиновых кислот v. синтетических полинуклеотвдов образуют дисперсии е водно-полимерно-солевых растворах. В состав одной частицы дисперсии, образующейся в ПЭГ-содергакзм растворе, входят 104 молекул ДНК ( Сдщ /0). Определены условия формирования дисперсий нуклеиновых кислот (длина молекул нуклеиновых кислот, мол. масса и концентрация ПЭГ, ионная сила, катионный coca и свойства растворителя).

5.Идеология метода "внешнего хромофора" использована дл; доказательства жидкокристаллической упаковки молекул нуклеиновы: кислот в частицах дисперсий. Появление интенсивной полоса в спектре КД при формировании дисперсий в ПЭГ-содержащих растворах можно рассматривать как указание на жвдкокристаллическу! упаковку молекул нуклеиновых кислот в частицах дисперсий. Факторами, влиявдими на характер упаковки молекул нуклеиновые кислот в дисперсиях, являются свойства водно-псшмерно-солевы: ( концентрация, свойства и мат.масса полигликоля, иокаая сила и катионнкй состав) растворов, а также свойства самих молекул нуклеиновых кислот(принадлежность к А~ или В-семейству, порядок, чередования азотистых оснований в цепи нуклеиновой кислоты).

6.Формирование дисперсий из молекул ДНК, связанных к комплексы с биологически активными веществами - антрациклинами и антрахшшнами, олигопептидаым антибиотиком и соединениями группы платины (II), содержащими ароматические заместители, сопровождается появлением двух интенсивных полос в спетре КД. Ода; из полос расположена в области поглощения азотистых оснований ДНК тогла как другая - в области поглощения хромофоров биологически активного вещества.

Взаимодействие биологически активных веществ с ДНК, сопровождаемое модификацией структуры этих молекул, приводит i изменению пространственной упаковки молекул ДНК в частица жидкокристаллических дисперсий. Характер пространственной упакови молекул ДНК зависит от химической структуры биологически активных веществ.В случае жидкокристаллических дисперсий, i отличие от жидких кристаллов, пространственная упаксвка может быт:

изменена за счет совместного действия температуры и антисиотика.

Спектры КД дисперсий, сформированных в ПЗГ-содерхащих растворах из молекул ДНК, обработанных разными соединениями группы платим til), позволяют "ранясировать" эти соединении по эффективности их действия на пространственную укладку молекул ДНК в дисперсиях.

7.Свойства жидкокристаллических дисперсий могут быть использованы в практических целях, б частности, для определения биологически активных веществ, взаимодействующих с ДНК. Свойства жидкокристаллических дисперсий должны учитываться при интерпретации состояния молекул ДНК в составе простейших биологических объектов (вирусы, хромосомы).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ СТАТЬЯХ:

1).Ю.М.Евдокимов, (1975), Структурные фарш двухцепочечной ДНК в составе биологических объектов, Журнал ВХО им.Менделеева, Т.20,стр.259-271.

2).В.И.Салянов, В.Г.Погребшпс, С.Г.Скуридин.Г.Б.Лорткипанидза, З.Г.Чидаавадзе, И.А.Юряник, Ю.М.Евдокимов, (1978),О связи меяду молекулярным строением водных растворов полиэтиленгликоля и компактизацией двухц е почечн ы х ДНК, Колек. биология,

т. 12,вып.3,стр.485-495.

3 !. Yu.M.Yevdokimov,i 19'79 ) .Compact fora of DNA - the poasibl« Eodel of lntraphage DNA, Studia blophyslca, Band 74, Heft 3, a.219-221.

4).Ю.М.Еедокимоз,(1979), ' Компактная форма ДНК - модель внутрифаговой ДНК, Сб.Физические методы изучения молекулярных и надмолекулярных структур, Л-д, стр.73-106.

5) .С.Г.Скуридин, В.С.Шашков, Ю.М.Евдокимов, Я.И.Варшавский, (1979), Об условиях формирования оптически активных компактных частиц двухцепочечной ДНК в содержащих полизткленгликолъ растворах разных солей,Малек.биология,т.13, вып.4, стр.804-в10.

6).Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, (1981), Описание процесса конденсации ДНК(РНК) в .водно-солевых растворах,содержащих полиэтиленглшоль, Биофизика. т.24,вып.2, стр.222-227.

7).Yu.M.Yevdokimov, V.1.Salyanov,(1981).Two modes of long-range arlantation of DNA Ъазез upon compaction, Nucl.Acld.3 fiea. , /.9, n.3, pp.743-752.

8). Yu.Yevdokimov, V.Salyanov, S.Skurldin, N.Akimsnko, ( I 962 J, МяаорЬазе state of the DNA molecules and their complexes with antracyclines,Studia biophysics, v.92,n.2, pp.59-60,

9).Ю.М.Евдокимов, (19S2), Ha Mexi швого i неживого,Людина i CBiT, т. 6, стр.45-47. „

10).В.И.Салядав, Ю.М.Евдокимов, Г.Берг, (1982), Изменение пространственной укладки молекул ДНК, индуцируемое антибиотиками, Антибиотики,т.12,стр.38-42.

И).Ю.М.Евдокимов, Я.М.Варшавский, (1982), Жидкокристаллическое состоящее нуклеиновых кислот в растворе, ДАН СССР, Т.263, н.5, стр.1254-1257.

12).ft.N.Евдокимов, В.И.ОаляноЕ, (1983), Особенности спектров кругового дихроизма жидких кристаллов, образованных из комплексов ДНК с некоторыми антибиотиками, Антибиотики, т.4, стр.265-270.

13).Н.М.Акименко, В.Кляйнвэхтер.О.М.Евдокимов (1983), Влияние некоторых биологически активных соединений двухвалентной платины на свойства гядкокристаллической "микрофазы" ДНК, Антибиотики, т.7, стр.531-535.

14).Yu.M. Yüvdoklmov, V.I.Salyanov, A.T.Dembo, H.Berg, (1963),

A monophase (liquid crystal) state of DNA complexes with antracycline antibiotics, Bloined. Blochlm. Acta, v.47, П.7/В, pp.8i>5-866. • •

15).N.Akinenko, V.Kleinwachter, Yu.Yevdokimov, (1983), Liquid crystalline mlcrophasea of DNA molecules complexed with conpounds of platinum (II),FEES Letters, v.156, n.l, pp.58-62. 13).Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, (1983).Высокая оптическая активность при внутримолекулярной компактизации(глобулизации) высокомолекулярной ДНК, ДАН СССР, т.272, н.2, стр.499-502. .

17).Г.В.Лоргкипанидзе, Ю.М.Евдокимов, А.Т.Дембо.Я.М.Варшавский, (1984), Ыезофаяное состояние двухцеп о че ч ной РНК и полирибонуклэотидов, характеризуемое высокой оптической активностью, Молек.биология, г.18,вып.2, стр.466-473.

18).Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридин, Н.М.Акименко, (1984), Жидкокристаллические микрофазы низкомолекулярных двухцепочечных нуклеиновых кислот и синтетических полинукдеотидов, ВМС (А), т.24, H.H. стр.2403-2410.

19).V.l.Salyanov, Yu.M.Yevdokimov, Ya.M.Varshavsky, W.Forster, SC

E.Stutter, H.Berg, (1964 ),Interaction of antracycline antibiotics with biopolymera.Influence of polyethylene glycol on the DNA binding conatant of зепи antracycllnes.atudia blophysica, v.104, n.1-3, pj.-.!>7-65.

20).Ю.M.Евдокимов, В.И.Салянов, А.И.Полетаев. М.Палумбо, (1985).Жидкокристаллическое состояние комплексов ДНК с некоторыми биологически-активными соединениями, ДАН ССОР, т.280, н.6, стр.1456-1459.

21).О.М.Евдокимов, В.И.Салянов, Н.М.Акименко, П.А.Чельцов, М.Палумбо, (1985),"Внешние хромофоры" и интенсивные полосы в спектрах кругового дихроизма жидкокристаллических микрофаз нуклеиновых кислот, Биофизика, т.30,вып.6,стр.948-954.

22 ).Yu.M.Yevdokimov, V.Salyanov, M.Palumbo, 11985), Liquid crystalline state of ENA molecules complaxed with biologically active compounds, Mol.Cryst.Ltq.Cryst.^ v.131, n.3-4, pp.285-297.

23>.С.Г.Скуридин, А.Т.ДемСо, Ю.М.Евдокимов, (1985), Пространственная жидкокристаллическая упаковка двухцепочечных молекул ДНК при различном катионном составе растворггеля, Биофизика,-т.30, вып.5, стр.750-757. 24).С.Г.Скуридин, Г.Б.Лорткипанидзе.Г.Б.Мусаев, Ю.М.Евдокимов, (1985), Формирование жидкокристаллических микрофаз двухцепочечных нуклеиновых кислот и синтетических полинуклеотидов низкой молекулярной массы, ВМС(А), т.27, н.11,стр.2261-2273.

'г25> .N.M.AkimanVo, P.A.Chalt30V, Z.Balcarova, V .Kleinwachter, Yu.M.Yevdokimov,(1965),A study of interaction of platinum (II) compounds with DNA by means of CD spectra of solution and liquid crystalline micriophasoa of DNA, Gan.Physiol. Biophya.,v.4, pp.597-603.

26) .S.G.Skuridin, H.Damaschun, G.Dama3chun, Yu.U.Yevdokimov, S.Misselwitz, (1986), Polymer condensed DNA : a study by small mgla X-ray scattering, intermediate angle X-ray scattering and ;ircular dichroitic spectroscopy, Studia biophysjca, v.112, t.2-3, pp. 139-150 .

17).Ю.М.Евдокимов, О.Г.Скуридин, Н.С.Бадаев, (19)36), Доказательство образования двух типов жидкокристаллических шкрофаз молекул ДНК в водно-солевых растворах полиэтиленгликодя,

ДАН СССР, Т.286, р.4, стр.997-1000.

28).В.И.Салянов, Ю.М.Евдокимов, (1986), Изменение ¡гростраяствеш укладки молекул ДНК, образующих жидкокристаллические микрофаг при изменении внешни* усломвй, ВЫС(А), т.28, р.5, стр.971-977. Й9).î).M.Евдокимов, В.^.Салянов, А.Т.Дембо, Ы.И.Шраго, Л. А. Ханши (1986),Оптические свойства жидкокристаллических микрофаз ДНК водно-оргакическимх растворах, Кристаллография, t.í выи.4,стр.736-741.

30) .С.Г.Скуридин, Н.С.Бадаев.О.Д.Даврентович.Ю.М.Евдокмов, (198' Управлеше пространственной структурой жидких кристаллов ДНК х помощи соединений антрациклиновой и антрахиноновой груш,ДАН CGC Т.295, р.5, стр.1240-1243.

31 ).В.И.Соляное,íi.Л.Чельцов, В.Кляйнвехтер.Ю.М.Евдокимов, (1988) Дна типа взаимодействия металлоинтеркаляторов с молекулами ДНК, ДАН СССР, Т.301,Н.б, стр.1241-1244.

32).Ю.М.Евдокимов, С.Г.Скуридан , (1988), Псевдокапсулировашше жидкие кристаллы ДНК, ДАН СССР, т.303,н.1, стр.232-235.

33).С.Г.С-куридин, Э.В.Штыкова, А.Т.Дембо,И.О.Бадаев,П.А.Чельцов, Ю.М.Евдокимов, (1988), Образование упорядоченной оптиче< изотропной фазы молекул ДНК низкой мол. массы, кодифицированных Щ1с-да2лородишждинплат1шой,Биофизика,т .33,вып. 1, стр.55-60.

34).Ю.М.Евдокимов,С.Г.Скуридин,В.И.Салянов,Н.С.Бадаев,(1988), Жидкие кристаллы ДНК - возможная система тестировав взаимодействия с ДНК биологически активных соединений платины (I

и некоторых антибиотиков, Антибиотики и химиотерапия, т.33, н. стр.903-905.

35 >. S. S kur 1 d i ri, N. Badae v, A. Dambo, G. Lort k 1 pan idze, Yu. Ye vdok i mo v (19йв),Т*ю types of temperatura induced transitions poly(1IxpolylC) liquid crystals,Liquid Crystals, v.3,n.l,pp.51-(

36 1. Yu.il .Yevdokiaov. S.G.Skuridin,V.1. Saïyanov, ( 1988 ), The liqu crystalline phauea of double-stranded nucleic acida in vitro ал in vivo, Liquid Crystals, v.3,n.ll, pp.1443-1459.

37).Ю.M.Евдокимов, В.И.Салянов,С.Г.Скуридин, (1989), Жидкокристаллические дисперсии суперспиралькой кольцевой ДНК основа Оиосенсороа, ДАН СССР, т.307,р.5,стр.1262-1265. 33).В.И.Салянов, Б,С.Прасолов, M.Палумбо, Ю. M.Евдокимов, (1989), Аномальная оптическая активность , индуцируемая при коццэнса разных пространственных форм двухцепочечных нуклеиновых кислот

гофизика, Т.34.ВЫП.1, стр.20-27.

Э).Ю.М.Евдокимов,0.Г.Скурвдин,В.И.Салянов,А.О.Семейкин,М.Иэлумбо, 1989),Нуклеиновые кислоты как основа создания юсенсороз.Молек.биология,•т.23, вып.$, "стр.1581-1588. )).В.И.Салянов, Ю.М.Евдокимов, М.ПалумОо/ (19Э0), Исследование зойств конденсированных форм линейной и кольцевых суперсниралышх 2С с митоксантраном и бисангреном. Антибиотики и химиотерапия, ,35, стр.19-22.

I). Yu.M. Yevdokimov.S.G. Skuridin,V. I .Salyanov, G. Damaachun, Damaachun, R.Misselviltz, V.Kloinwachter, (1990 1, Effect of atlnum (II) chemotherapeutic agents on properties of DNA liquid ystals, Biophysical Chemistry, v.35, pp.143-153.

Подп.в netf.17.04.91. Формат «30.60x94 1/16 Объем 3,25 пл.- Заказ USO Тираж 100 '

ПШПачаткнк: Мосгорпечати Н.Краснохолмская д.о