Разработка микрофлюидного устройства с оптическим иммуносенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

На правах рукописи

ЕСИКОВА Надежда Александровна

РАЗРАБОТКА МИКРОФЛЮИДНОГО УСТРОЙСТВА С ОПТИЧЕСКИМ ИММУНОСЕНСОРНЫМ ЭЛЕМЕНТОМ НА ОСНОВЕ НАТРИЕВОБОРОСИЛИКАТНОГО ПОРИСТОГО СТЕКЛА

Специальность: 01.04.01 - Приборы и методы экспериментальной физики

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

21 НОЯ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005539164

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)

Евстрапов Анатолий Александрович

Ястребов Сергей Гурьевич

Шилова

Ольга Алексеевна

Научный руководитель:

доктор технических наук, доцент, заведующий лабораторией «Информационно-измерительных био- и хемосенсорных микросистем» ИАП РАН

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ науки Физико-технического института им. А.Ф. Иоффе РАН

доктор химических наук, доцент, заведующая лабораторией неорганического синтеза ФГБУ науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт химии силикатов им. И.В. Гребенщикова РАН

Ведущая организация: ЗАО «Научные приборы».

Защита состоится 13 декабря 2013 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д002.034.01 на базе ИАП РАН по адресу 198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, д. 31/33.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ИАП РАН по адресу: 190103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 26. Отзывы на диссертацию и автореферат направлять по адресу: 190103, Санкт-Петербург, Рижский пр., д. 26.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

«¿2.» ноября 2013 г.

[У

АЛ. Буляница

Актуальность темы

Тенденция миниатюризации в области экспресс-анализа жидких биологических проб отобразилась в развитии двух подходов, связанных с созданием микрофлюидных устройств и биочипов. К преимуществам микрофлюидных устройств (МФУ) относятся широкие возможности манипуляций с жидкой пробой.

Высокоспецифичным методом обнаружения аналита в биопробе является постановка иммунных реакций. Иммунный анализ находит широкое применение в медицине, фармакологии, мониторинге окружающей среды, пищевой промышленность. Чувствительность обнаружения при этом, в частности, зависит от условий проведения реакции и характеристик системы детектирования. Гетерогенный количественный иммунный анализ, осуществляемый на микропланшетах, характеризуется высокой чувствительностью и производительностью, но требует значительного времени для проведения анализа (для инсулина от 4,5 ч.). А множество экспресс-тестов на основе иммунной реакции рассчитаны лишь на качественный или полуколичественный анализ. Конкурентный иммунный анализ позволяет обнаружить мелкие белки и сократить длительность анализа.

Постановка конкурентного иммунного анализа на МФУ дает возможность объединить преимущества иммунного анализа (высокая специфичность) и микрофлюидики (возможность проведения отдельных стадий или всего анализа в микромасштабе на одном устройстве за счет простоты манипуляции с пробой, экспрессность и т. д.). Наиболее чувствительным и простым для реализации в таких устройствах является флуоресцентный метод детектирования иммунных комплексов.

Использование пористых структур в качестве основы сенсорного элемента позволяет дополнительно повысить чувствительность за счет увеличения площади сенсорного слоя в малом объеме. Перспективным представляется пористое стекло (ПС), основными характеристиками которого являются развитая поверхностная структура (пористость до 50%, регулируемый

размер пор), оптическая прозрачность в широком спектральном диапазоне, физическая и химическая стойкость, высокая воспроизводимость характеристик образцов внутри одной серии.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод об актуальности разработки микрофлюидного устройства с иммуносенсором на основе пористого стекла.

Цель работы

Разработка и создание микрофлюпдного устройства с интегрированным биосенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла для проведения иммунного анализа.

Основные задачи

1. Исследование натриевоборосиликатных двухфазных и полученных из них пористых стекол методами оптической спектроскопии и высокоразрешающей микроскопии.

2. Обоснование и выбор метода иммобилизации белка и адаптация его для пористого стекла.

3. Разработка, изготовление и исследование микрофлюидного устройства с интегрированным биосенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла.

4. Аппробация метода иммунного анализа с применением отдельно биосенсорного элемента и на микрофлюидном устройстве с интегрированным сенсорным элементом (на примере инсулина).

Научная новизна

— Впервые обнаружена немонотонная зависимость интенсивности флуоресценции биосенсорного элемента на основе натриевоборосиликатного пористого стекла ЗВБ-МАП от соотношения концентраций антигенов и антител (Сптс-1п*/С1Ео) в диапазоне концентраций СпТС_|т=(5,8'Ю"7-К2,3-10~6) М и С18о=(3-10"8-2-1(Г7) М.

— На основании данных оптической спектроскопии в видимом диапазоне (коэффициент поглощения и показатель преломления) согласно

моделям эффективных сред получены оценки структурных характеристик (в частности, пористость) микро- и макропористых натриевоборосиликатных стекол (8В-МИП и 8В-МАП).

— Полнены оценки размеров комплексов иммобилизованного на пористое стекло инсулина методом сканирующей ближнепольной оптической микроскопии, размер (0,4... 1,3мкм) и форма которых зависят от концентрации инсулина в растворе.

Практическая значимость

— Способ получения МФУ с интегрированным биосенсорным элементом на основе ПС для иммунного анализа позволяет оперативно изготавливать прототипы устройств со встроенными сенсорными элементами.

— Методика иммобилизации инсулина и ^О методом ковалентного связывания адаптирована для изготовления биосенсорного элемента на основе ПС БВЗ-МАП.

— Методологический подход к оцениванию структурных характеристик макропористых стекол 8В-МАП с высотам светопропусканием и низким релеевским светорассеянием, полученные по данным оптической спектроскопии, могут применяться для неразрушающего контроля ПС.

— Макет детектора для микрофлюидного устройства используется при проведении научно-исследовательских работ ИАП РАН (по НИР «Разработка принципов организации мультисенсорных систем и их информационного обеспечения в медико-биологических исследованиях» (2009-2012 тт) и грантам КНВШ за 2008-2013 гг).

Положения, выносимые на защиту

1. Способ изготовления биосенсорного элемента на основе пористого стекла методом иммобилизации белка (ковалентного связывания), для которого подобраны условия подготовки, активации и силанизации поверхности ПС.

2. Способ создания микрофлюидного устройства на основе биосенсорного элемента из пористого стекла и двухуровневой системы

подвода/отвода пробы к нему, реализованный в конструкции из полндиметилсилоксана.

3. Метод обнаружения содержания инсулина в 40 мкл пробы в диапазоне концентраций (2,9-10',-^2,3'Ю"6) М за время менее чем 2 ч при постановке конкурентного иммунного анализа на МФУ с биосенсорным элементом на основе пористого стекла.

4. Методология оценивания оптических (коэффициент поглощения, показатель преломления) и структурных (пористость, средний размер пор) характеристик пористых стекол с высоким светопропусканием (=90%) и низким релеевским светорассеянием при помоши моделей эффективных сред по данным оптической спектрометрии в диапазоне длин волн (36(Н420) нм.

Апробация работы: Основные результаты диссертации доложены на следующих международных и российских конференциях и семинарах: VIII and IX seminar on porous glasses — special glasses. PGL'2007 и PGL'2009 (Poland. Wroclaw); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии. 2007 и 2010гг. (г.Москва, г.Волгоград); VII и VIII международных конференциях «Прикладная оптика-2008» и «Прикладная оптика-2010» (г. Санкт-Петербург); IX Молодежной научной конференции, посвященной 60-летию Института химии силикатов РАН. 2008 (г. Санкт-Петербург); XX симпозиуме «Современная химическая физика» 2008 (г. Туапсе); «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» II. 2011 (г.Казань); 5-й Международной научно-технической конференции «Сенсорная электроника и микросистемные технологам» (СЕМСТ-5). 2012 (Украина, г. Одесса).

Публикации: Основные результаты работы изложены в 17 печатных работах, из них 7 опубликованы в журналах, входящих в перечень ВАК.

Личный вклад автора: Автор участвовал: в постановке цели и задач исследований; в разработке методик иммобилизации белка на пористое стекло, создании микрофлюидного устройства с интегрированным сенсорным элементом; в планировании и проведении экспериментов, в том числе

постановке иммунной реакции на МФУ; анализе и интерпретации результатов. Подготовка публикаций проводилась совместно с соавторами.

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, двух глав, заключения, списка литературы из 89 наименований. Текст диссертации изложен на 118 страницах, содержит 39 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (глава 2), выводов и списка использованной литературы.

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость результатов выполненной работы, перечислены научные положения, выносимые на защиту.

Глава 1 представляет собой литературный обзор, посвященный микрофлюидным аналитическим системам и сенсорным элементам для них. Описаны используемые для микрофлюидных устройств материалы и методы их изготовления. Введено понятие микрофлюидных платформ и их классификация. Рассмотрены варианты постановки и детектирования иммунных реакций на чипе. Приведен краткий обзор методов иммобилизации белка на стеклянную поверхность. Для создания сенсорного элемента на основе ПС выбран метод ковалентного связывания антитела с поверхностью.

Описан метод изготовления, приведена классификация и примеры применения пористых структур. Рассмотрены модели эффективной среды (столы, Лоренц-Лоренца, Бруггемана - для ПС с высоким светопропусканием) позволяющие оценить оптические и структурные характеристики дисперсных сред по данным оптической спектрометрии. Для ПС с высоким диффузным светорассеянием используется четырехпотоковая модель и функция Гуревича-Кубельки-Мунка (ГКМ).

В заключении сделан вывод о целесообразности разработки биосенсорной системы на микрочиповой платформе для постановки конкурентного

иммунного анализа на ПС с флуоресцентным детектированием; поставлена цель и сформулированы задачи работы.

В главе 2 приведены результаты экспериментальных исследований. Раздел 2.1 посвящен изложению принципа работы сенсорного элемента, методу иммобилизации белка, описанию исследуемых образцов и оборудования (штатного и оригинальных разработанных макетов). Принцип работы сенсорного элемента основан на постановке конкурентной иммунной реакции:

IgG + (Ins-FITCHIns <-> (IgG-Ins-FITC)+ (IgG-Ins) + (Ins-FITQ+lns, где IgG - иммобилизованный на ПС иммуноглобулин G. Ins — инсулин, FITC-ins - меченый изотиоцианатом флуоресцеина инсулин, (IgG-Ins-FITC) и (IgG-Ins) - образующиеся в ходе реакции меченый и немеченый иммунные комплексы.

Иммобилизация белка проводится в 4 стадии: активация поверхности 0.5М NaOH, силанизация APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан), обработка глутаральдегидом и, собственно, иммобилизация белка.

В работе использовались образцы ПС в виде пластин 8x8 мм толщиной 0,5 мм полученные из стекла 8В и ДВ-1Ш (или SBS). Рассмотрены ПС двух типов обработки: при выщелачивании двухфазного стекла получаются ПС типа МИП, их дальнейшая щелочная проработка приводит к образованию стекол типа МАП. Образцы ПС разработаны, изготовлены и охарактеризованы методом БЭТ в ФГБУ науки ИХС РАН. Средний диаметр пор ПС SBS-МИП -5,1 нм, SBS-МАП - 490 им, 8В-МИП - 2.4 нм, 8В-МАП - 34 им.

Для исследования образцов использовалось стандартное оборудование, детектирование результатов проведения иммунной реакции проводилось на специально созданных макетах (макет 1 и макет 2). Макет 1 предназначен для измерения спектров флуоресценции (465^800 нм) образцов в проходящем, отраженном или рассеянном свете. Он состоит из лазера DPBL-9010F (Photop Suwtech Inc, Китай) с длиной волны излучения 473 нм, столика для позиционирования образца, рамановского акусто-оптического спектрометра

РАОС-1 (НТЦ уникального приборостроения РАН, Россия) и волоконно-оптической системы, позволяющей изменять угол регистрации отраженного света в пределах от 5 до 180°. Макет 2 разработан и создан для детектирования результатов иммунной реакции на ПС или в МФУ. Источником излучения является сверхъяркий светодиод (Luxeon Star В, Philips Lumileds Lighting Company) мощностью (1=3) Вт с максимумом излучения на длине волны 470 нм. МФУ или сенсорный элемент позиционируется на столике для фиксации. Для фокусировки возбуждающего излучения используется оптическая система. Выделение длин волн возбуждения (/»=480 нм) и детектирования флуоресценции (1=520 нм) достигается при помощи светофильтров. Сигнал регистрируется лавинным фотодиодом С5460-01 (Hamamatsu, Япония).

Раздел 2.2 посвящен изучению оптических и структурных характеристик ПС. Обсуждено влияние сорбированной в поры воды на спектральные свойства ПС в ближнем ИК диапазоне длин волн, приведены спектры интенсивности флуоресценции исходных образцов. ПС можно условно разделить на образцы с высоким светопропусканием (из двухфазного стекла 8В) и с высоким диффузным рассеянием (из ДВ-1Ш). Для первых, в диапазоне преобладания релеевского рассеяния, можно провести оценку оптических и структурных характеристик по данным оптической спектрометрии, используя известные модели эффективной среды. Поэтому особое внимание уделяется определению этого спектрального диапазона для различных типов стекол. Диапазон преобладания релеевского рассеяния для ПС, полученных из 8В, составил (360=420 нм). Для ПС 8Б-МИП наблюдается два участка (250-280) нм и (350=420) нм. Это, вероятно, связано с тем, что при изготовлении кремнезем удален из пор каркаса не полностью и образует вторичную структуру, т.е. имеются по крайней мере два характерных размера рассеивающих объектов.

Рассмотрены модели эффективной среды: 1) модель стопы, 2) Бруггемана и 3) Лоренц-Лоренца. В модели Лоренц-Лоренца не учитывается вклад наполнителя пор (пористой структуры, образованной вторичным кремнеземом).

1.40 1.35 ' 1,30 1.25

-¿Г

----——.

----- . 1

. 6

5'

В модели стопы структура представлена набором слоев плотно упакованных частиц или пор; учтены поглощение и отражение от границы раздела. Модель Бруггемаиа описывает пористую среду со сферическими пересекающимися между собой порами, а модель Лоренц-Лоренца - гетерогенную систему одинаковых сферических частиц. В данных моделях поглощение среды считается пренебрежимо малым. За показатель преломления матрицы при оценке показателя преломления ПС (рис. 1) по моделям Бруггемана и Лоренц-

Лоренца взят показатель

преломления исходного двухфазного стекла (определенный по модели стопы).

Пользуясь оценками показателя преломления и коэффициента поглощения можно вычислить средний объем и количество пор (а также пористость). Оценки пористости приведены на рис. 2.

Для микропористых стекол применима модель стопы, а полученные оценки показателя преломления для 8Б-МИП находятся в интервале (1,27 К 1,257). Для макропористых стекол 8Б-МАП наиболее подходит модель Бруггемана, оценка показателя преломления по которой составляет (1,236-1,248), а пористости (47-49%), что несколько ниже, чем согласно методу БЭТ (53%).

Для ПС с высоким диффузным

380 <Ю0 420

длина волны нм

Рисунок 1. Дисперсия показателя преломления для ПС 8Б-МИП (1.2,3) и 8Б-М АП (4, 5,6), 1,4- модель стопы; 2, 5 -модель Лоренц-Лоренца; 3,6- модель

Бруггемана _

380

длина волны, нм

Рисунок 2. Оценки пористости для ПС 8Б-МИП (1 -3) и 8Б-МАП (4-6): модель стопы (1,4), Лоренц-Лоренца (2,5) и Бруггемана (3,6).

светорассеянием SBS-МИП и SBS-МАП определена функция Гуревича-Кубельки-Мунка (ГКМ), минимум которой для ПС МИП лежит в диапазоне 520*540 нм, для ПС МАП - в диапазоне 580*600 им. В этих спектральных диапазонах можно пренебречь поглощением матрицы.

Раздел 2.3 посвящен разработке сенсорного элемента на основе ПС. В предположении пренебрежимо низкого светопоглоидения ПС по сравнению с FITC, проведена оценка диапазона детектирования флуоресцентной метки, сорбированной в ПС (концентрации меченого белка). Наибольшей чувствительности обнаружения FITC в ПС SBS-700-МАП толщиной 0,5 мм можно достичь в диапазоне концентраций I0'5*10"J моль.

Проведена адаптация метода иммобилизации белка для ПС. Исследованы разные режимы сушки образцов между стадиями активации поверхности и силанизации при использовании двух видов растворителей для (3-аминопропила)триэтоксисилана (APTES) (толуол и ацетон). На примере иммобилизации инсулина на ПС 8В-МАП выбран режим сушки Зч. при 100°С; в качестве растворителя силана - ацетон.

Рассмотрено влияние концентрации раствора белка на его иммобилизацию на примере ковалентного связывания FITC-Ins с поверхностью ПС 8В-МАП.

При изучении зависимости интенсивности флуоресценции образца от концентрации раствора иммобилизуемого белка (рис. 3) выявлены пики флуоресценции FITC на длине волны 524 нм (а) и глутаральдегида на 550 нм (б).

Изображения поверхности исследуемых образцов,

полученные методом

сканирующей ближнепольной

\

'•/"V о I!

/ VX м s

1x10е 2x1 СГ5 Концентрация FITC-Ins (M)

660 600 Длина волны (нм)

650

Рисунок 3. Спектральные зависимости интенсивности флуоресценции ПС 8В-МАР после иммобилизации FITC-Ins из раствора концентрации 1 -2,3-1(Г5М, 2 - 1,2-10"5М, 3 -5,8-10"6М.

11

оптической микроскопии (СБОМ) в поперечно-силовом режиме показали, что при низкой концентрации раствора белка (5,8-10"°М) для иммобилизации образуется множество хаотично расположенных комплексов РГГСМпв размером (0,8...1,3) мкм и конгломератов из них. Повышение концентрации до 1,2-10°М приводит к большему количеству мелких комплексов размером (0,4...0,6) мкм. При дальнейшем увеличении концентрации до 2,3-10"5М наблюдается укрупнение структур. Т.о. проявляется свойство белка формировать на поверхности стекол комплексы различных размеров. Возможно, это связано с неоднородным распределением зарядов на поверхности ПС.

Изучены спектральные зависимости флуоресценции образцов двухфазных стекол 8В и ДВ-1Ш, а также стекла К8, после иммобилизации меченого белка, показавшие, что в процессе обработки двухфазных стекол происходит вымывание нестойкой фазы и образование развитой поверхности. Уровень

интенсивности флуоресценции двухфазного стекла ДВ-1И1 позволяет сделать вывод о его пригодности для создания сенсорных элементов.

Результаты измерений светопропускания ПС 8В-МАП приведены на рис. 4: 1 исходного образца; 2 - ПС с иммобилизованным 3 -

после проведения иммунной реакции. На спектральной зависимости наблюдается полоса поглощения флуоресцеина с максимумом на 495 нм, что свидетельствует о факте образования иммунных комплексов. Иммобилизация ^О ведет к значительному снижению пропускания ПС, однако после проведения иммунной реакции светопропускание возрастает на -45 %, что позволяет выдвинуть гипотезу о том, что образующийся в результате

Рисунок 4. Спектральные зависимости пропускания ПС 8В-МАП: 1 - исходный образец, 2-после иммобилизации ^О, 3 - после проведения иммунной реакции.

реакции иммунный комплекс оптически более однороден и имеет меньшее светорассеяние, чем слой иммобилизованного lgG. Это также подтверждается данными со СБОМ: в режиме силовой микроскопии на образце 8В-МАП с иммобилизованным инсулином визуализированы отдельные частицы и группы частиц со средним радиусом 0.6 мкм. После проведения иммунной реакции на поверхности образца наблюдаются частицы более крупных размеров (от 2 до 5 мкм). В режиме отраженного света, кроме образовавшихся частиц, проявляется оптически неоднородная поверхностная структура. Такой эффект может быть обусловлен образованием на поверхности образца относительно равномерной пленки с более крупными элементами, чем поры самого стекла.

В связи с тем, что IgG представляет собой Y-образную молекулу размером примерно (7x10x2) нм3, а размеры пор стекла 8В-МАП и SBS-МАП составляют 34 и 490 нм соответственно, белок не может занять все активные сайты поверхности. Это приводит к неспецифичному связыванию более мелких белков с поверхностью ПС при анализе. Для устранения этого эффекта часто используется бычий сывороточный альбумин (БСА), не взаимодействующий с инсулином, но блокирующий его доступ к поверхности стекла. Поэтому для постановки конкурентной иммунной реакции и обнаружении более низких концентраций инсулина созданы образцы: 1) с иммобилизованным IgG и 2) с IgG и БСА. Это позволило продемонстрировать принципиальную возможность создания сенсорных элементов на основе ПС для конкурентного иммунного анализа. Однако, в некоторых случаях наблюдалась немонотонная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации пробы.

Проведено исследование равномерности иммобилизации белков на ПС методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в полуконтактном режиме. Измерена топология поверхности исходного образца, образцов на разных стадиях иммобилизации IgG и после проведения иммунной реакции. Полученные данные свидетельствуют об образовании достаточно равномерного сенсорного слоя на поверхности ПС.

Раздел 2.4 посвящен исследованию влияния концентраций белков (1«С, РХТСЧш, БСА) на интенсивность флуоресценции образца, теоретической оценке необходимых концентраций, оптимизации сенсорных элементов и постановке анализа на МФУ.

Предложен способ представления результатов измерений аналитического сигнала, заключающийся в построении зависимости интенсивности флуоресценции на длине волны 524 нм от соотношения концентраций ИТСМпэ к (Српс-ьк/ С\0). При таком подходе все полученные зависимости

приобретают единообразный вид (рис. 5). Зависимости не монотонны, имеют локальные экстремумы, что, вероятно, связано со сложными процессами взаимодействия инсулина с ¡<¿0 и его иммобилизацией на оставшиеся свободными активные сайты поверхности стекла.

Результаты теоретической оценки количества активных сайтов на поверхности ПС (162-1015 для ЭВБ-МАП) и количества молекул 1§0, которое

может на них иммобилизоваться

х S

250 200150100 500

0

50

200

100 150

Clns'ClgG

Рисунок 5. Зависимость интенсивности флуоресценции на длине волны 524 нм от соотношения концентраций белков cfjrc-fa/cigg. 1 -Chtc-1hS=4,6-10"6M, Cigg - переменная, 2 - Chtc-Ihs=2,3-1 0"6М,

C|gG - переменная, 3 - C|go=3,l • 1СГЧМ, Српт-tas- переменная, 4 - Ci8g=4,6-10"7M, Скпс-ins - переменная.

при учете У-образной структуры и размера белка (4,6-1015 молекул) показали необходимость

иммобилизации еще 157.4-10ь мелких молекул (или 17,9 мг БСА на образец ПС) для исключения взаимодействия инсулина с поверхностью стекла при проведении реакции (обеспечения специфичности анализа).

Экспериментальные исследования показали, что применение (22=25) мг/мл БСА при объеме раствора I мл на образец позволяет получить монотонную

зависимость аналитического сигнала от концентрации аналита. Продемонстрирована возможность обнаружения инсулина концентрацией (2,8-10"7^1,2-10"6) М в 600 мкл реакционной смеси при детектировании на созданных макетах. Коэффициент вариации измерений составил (0,5-К2,5)%.

В имуноферментном анализе (ИФА) основной вклад в длительность анализа вносят стадии инкубирования: для иммобилизации белка, для протекания иммунной реакции с аналитом и для связывания с меченым вторичным антителом. Исследовано влияние длительности проведения иммунной реакции на величину аналитического сигнала, позволившее снизить время инкубирования до 30 мин. Поскольку сенсорный слой иммобилизуется на ПС заранее, а постановка конкурентной иммунной реакции исключает стадию связывания с меткой, то общее время анализа удалось снизить до 1 ч. 40 минут.

Исследования иммобилизации белка на ПС, изучение принципиальной возможности получения сенсорного элемента на основе ПС и оптимизация длительности анализа были проведены на сенсорных элементах в статическом режиме. При постановке иммунного анализа на МФУ применялась следующая последовательность операций: резервуар с верхней стороны сенсорного элемента заполнялся пробой, через 5 минут резервуар с другой (нижней) стороны сенсорного элемента заполнялся буферным раствором. Далее МФУ помещалось в термостат и выдерживалось при температуре 37°С в течение 30 мин., при этом проба в верхнем резервуаре находилась в статическом режиме, а через нижнюю часть устройства непрерывно подавался буферный раствор. После проведения иммунной реакции обе камеры промывались буферным раствором и проводились измерения интенсивности флуоресценции сенсорного элемента непосредственно в з'стройстве.

На рис. 6 представлена градуировочная зависимость, полученная при обнаружении инсулина в диапазоне концентраций (5,7-10"7-^2,3-10"6) М в 20 мкл исходной пробы или (2,9-10"7-1,2-10"6) М в 40 мкл реакционной смеси за 1ч. 40 мин. на макете! при концентрации CmC-tos=4>6-10"sM. Зависимость

-су

аппроксимируется функцией F = FQ+A(\. — e ' где F0=16111 у.е. -интенсивность флуоресценции при отсутствии инсулина в пробе (величина фонового сигнала), С - концентрация аналита, С0= 1,25-10"6 М - характерная концентрация инсулина, А=8500. Коэффициент корреляции между экспериментальными значениями и аппроксимацией составляет 0,9994. При С«Со зависимость близка к линейной, коэффициент чувствительности равняется А/Со, при О>С0 происходит насыщение. Аналогичные зависимости также были получены для концентрации Ситс.ьа=4,6-10"6 М по 10 образцам.

Раздел 2,5 посвящен разработке и созданию микрофлюидного устройства (рис. 7) для проведения иммунного анализа. Материалом для МФУ выбран лолидаметилсюкжсан (Sylgard-184, Dow Corning). Конструкция приспособления для отливки деталей, состоящая из мастер-формы для создания

Рисунок 7. Изображение прототипа МФУ

Рисунок 8. Конструкция устройства для отливки деталей МФУ из ПДМС

0,0 1,0x10* 2,0x10"6 4,8x10^

Концентрация Ins(М)

Рисунок 6. Градуировочная зависимость для

обнаружения инсулина на МФУ. Снтс-ьг^МИО"5 М

резервуара (1), проволоки для формирования подводящих каналов (2), чашки Петри (3), кольца, фиксирующего высоту детали (4) и крышки для формирования плоской поверхности (5), приведена на рис. 8. Интегрирование сенсорного элемента производилось при помощи более вязкого силастика Т4 (ООО «Пента Север»). Для соединения отвержденных деталей использовался полидиметилсилоксан.

В работе показана возможность создания по крайней мере четырех независимых сенсорных областей на одном образце размером (8x8) мм путем герметичного соединения ПС и пластины из ПДМС с заранее сформированными лунками диаметром 1,3 и 2,5 мм (методом «мягкой литографии»). Полученные данные позволяют организовать проведение параллельных анализов и повысить их точность, введя положительный и/нли отрицательный контроль.

В заключении представлены основные результаты работы и выводы.

Основные результаты и выводы

1. Определены оценки структурных (пористость, средний размер пор) характеристик пористых стекол с высоким с вето п р о пус ка i ш ем (-90%) и низким релеевским светорассеянием на основании данных оптической спектрометрии в диапазоне длин волн (360^420) нм при использовании моделей эффективной среды, что дает возможность проводить неразрушающий контроль и оценку пористости ПС. Оценки коррелируют с данными, полученными методом БЭТ.

2. Осуществлена адаптация метода и условий иммобилизации белка (иммуноглобулина G, инсулина) для пористого стекла SBS-700/48-МАП методом ковалентного связывания с целью формирования чувствительного слоя и создания сенсорного элемента. Подобраны временные и температурные условия для активации поверхности ПС; выбран растворитель для силанизации APTES, что позволило создать равномерный чувствительный слой для проведения иммунной реакции.

3. Выявлена немонотонная зависимость интенсивности флуоресценции образца биосенсорного элемента размером (8x8x0,5) мм после проведения

иммунной реакции от соотношения концентраций СптсмпД^о» имеющая несколько экстремумов. Выбрана концентрация БСА (22мг/образец), обеспечивающая блокирование активных сайтов поверхности ПС, оставшихся свободными после иммобилизации 1§0, что позволило получить монотонную зависимость аналитического сигнала, необходимую для количественной оценки результатов иммунного анализа.

4. Разработаны и изготовлены методом «мягкой литографии» (отливки из полидиметилсилоксана) герметичные прототипы МФУ, представляющие собой двухуровневую систему подвода/отвода пробы и регентов к интегрированному в устройство биосенсорному элементу, позволяющие проводить иммунный анализ проб объемом до 40 мкл.

5. Продемонстрирована возможность обнаружения инсулина в диапазоне концентраций 2,9-10"?-1,2-10"6М менее чем за 2 ч на созданных прототипах МФУ. Предел обнаружения и чувствительность анализа могут быть изменены под конкретные диагностические цели путем подбора концентрации белков при создании чувствительного слоя.

6. Разработан и создан макет детектора для МФУ, позволяющий проводить измерения люминесценции в отраженном или проходящем свете. Показания детектора коррелируют с результатами измерений на стандартном оборудовании.

Благодарности:

Автор выражает благодарность научному руководителю д.т.н. Евстрапову АЛ. за помощь в планировании работ и обсуждении полученных данных; д. хим. н. Антроповой Т.В. (ИХС РАН им. И.В. Гребенщикова) за предоставление образцов ПС, оценки их характеристик методом БЭТ и консультации по вопросам, связанным с поведением пористых стекол в различных условиях; ведущему инженеру Цымбалову А.И. за консультации и изготовление деталей макетов и составу лаборатории 232 ИАП РАН.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Antropova T.V. Spectral characteristics and structure of porous glasses И Optica Applicata. 2005. V.35, Л» 4, p.753-760.

2. Есикова H.A. Пористые стекла как функциональный элемент микрофлюидных чипов // Научно-технический вестиик СПБГУ ИТМО. 2006. №26; С.303-311.

3. Есикова H.A. Оптические свойства пористых стекол // Научно-технический вестник СПБГУ ИТМО. 2007. №37, С. 109-117.

4. Evstrapov A.A., Esikova N.A., Rudnitskaja GE., Antropova T.V. Application of porous glasses in microfluidic devices // Optica Applicata. 2008. V.38, №1, P. 31 -38.

5. Евстрапов A.A., Есикова H.A., Антропова T.B. Исследование пористых стекол методами оптической спектроскопии // Оптический журнал. 2008. Т.75, №4, С. 71-77.

6. Evstrapov A., Esikova N., Rudnitskaja G, Antropova T., Porous glasses as sensor elements for microfluidic chips // Optica Applicata 2010. V.40, №2, P.333-340.

7. Евстрапов A.A., Есикова H.A., Рудницкая Г.Е., Антропова Т.В., Анфимова И.Н. Разработка оптического сенсорного элемента для микрофлюидных чипов на основе натриевоборосшшкатного пористого стекла // Научное приборостроение. 2010. Т.20, №1. С. 52-58.

8. Есикова H.A., Евстрапов A.A., Рудницкая Т.Е., Антропова Т.В. Оптический биосенсорный элемент для микрофлюидных устройств на основе пористых стекол // Тезисы докладов 5-ой Международной научно-технической конференции «Сенсорная электроника и микросистемные технологии» (СЕМСТ-5), Украина, Одесса, 4-8 июня 2012 р. - С.85.

9. Разработка принципов организации мультисенсорных систем и их информационного обеспечения в медико-биологических исследованиях: отчет о НИР / Кисляков ЮЛ., Евстрапов A.A., Есикова H.A., Титов. Ю.А. и др. - СПб: ИАП РАН, 2013.-58 с.

Печать трафаретная Усл.пл. - 1 Заказ №934 Тираж: 100 экз. Типография «Копицетр» Санкт-Петербург, пл. Стачек д.4 (812)438-38-09

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ АНАЛИТИЧЕСКОГО ПРИБОРОСТРОЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201450715

ЕСИКОВА Надежда Александровна

РАЗРАБОТКА МИКРОФЛЮИДНОГО УСТРОЙСТВА С ОПТИЧЕСКИМ ИММУНОСЕНСОРНЫМ ЭЛЕМЕНТОМ НА ОСНОВЕ НАТРИЕВОБОРОСИЛИКАТНОГО ПОРИСТОГО СТЕКЛА

Специальность 01.04.01 - Приборы и методы экспериментальной физики

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель доктор технических наук Евстрапов А.А.

Санкт-Петербург 2013

Содержание

Введение.................................................................................... 5

1. Литературный обзор.................................................................10

1.1 Микрофлюидные аналитические системы............................10

1.1.1 Микрофлюидные устройства: материалы,

методы изготовления................................................ 12

1.1.2 Иммунный анализ.................................................... 14

1.1.3 Иммобилизация белков..............................................21

1.2 Пористые структуры.......................................................24

1.2.1 Изготовление, исследование, классификация

и применение пористых структур................................ 24

1.2.2 Методы исследования оптических и

структурных характеристик пористых структур............. 28

1.2.3 Модели эффективной среды; определение оптических

и структурных характеристик пористых пластин............ 31

1.3 Выводы к главе 1...........................................................36

2. Экспериментальная часть...........................................................38

2.1 Методы, образцы и оборудование.......................................38

2.1.1 Принцип работы сенсорного элемента...........................38

2.1.2 Иммобилизация белка на стекло...................................41

2.1.3 Образцы пористого и двухфазного стекла.......................45

2.1.4 Оборудование.........................................................46

2.1.5 Макеты устройства детектирования............................. 47

2.2 Исследование пористого стекла методами оптической спектрометрии...............................................................51

2.2.1 Влияние нагрева на спектры светопропускания

пористых стекол.......................................................52

2.2.2 Флуоресценция исходных образцов двухфазных и пористых стекол.......................................................54

2.2.3 Определение спектрального диапазона преобладания

релеевского рассеяния...............................................55

2.2.4 Оценки оптических и структурных характеристик ПС методом оптической спектрометрии..............................58

2.2.5 Диффузно рассеивающие ПС......................................61

2.2.6 Выводы к разделу 2.2................................................62

2.3 Сенсорный оптический элемент на основе пористого стекла.....63

2.3.1 Оценка рабочего диапазона концентраций......................63

2.3.2 Адаптация метода иммобилизации для ПС......................65

2.3.3 Влияние концентрации исходного раствора меченого инсулина на иммобилизацию.......................................69

2.3.4 Исследование иммобилизации меченого

инсулина на двухфазное стекло....................................73

2.3.5 Исследование возможности создания сенсорного элемента на основе пористого стекла............................75

2.3.6 Исследование равномерности иммобилизации белка методом атомно-силовой микроскопии..........................79

2.3.7 Выводы к разделу 2.3.................................................82

2.4. Исследование сенсорного элемента и постановка анализа на

микрофлюидном устройстве.............................................83

2.4.1. Зависимость интенсивности флуоресценции от соотношения концентраций белков......................................83

2.4.2 Оценка концентраций белка для иммобилизации.............86

2.4.3 Экспериментальный подбор концентрации БСА..............89

2.4.4 Определение длительности проведения

иммунной реакции.........................................................92

2.4.5. Обнаружение инсулина в пробе...................................93

2.4.6. Обнаружение инсулина на микрофлюидном устройстве.... 97 2.4.7 Выводы к разделу 2.4...............................................100

2.5. Разработка конструкции микрофлюидного устройства..........101

2.5.1 Микрофлюидное устройство с интегрированным сенсорным элементом..............................................101

2.5.2 Мультисенсорный элемент на основе пористого стекла... 106

2.5.3 Выводы к разделу 2.5...............................................108

Заключение......................................................................................................................................109

Список сокращений и обозначений................................................ 111

Список литературы.....................................................................112

Введение

Тенденция миниатюризации в области экспресс-анализа жидких биологических проб отобразилась в развитии двух подходов, связанных с созданием микрофлюидных устройств и биочипов. К преимуществам микрофлюидных устройств (МФУ) относятся широкие возможности манипуляций с жидкой пробой.

Высокоспецифичным методом обнаружения аналита в биопробе является постановка иммунных реакций. Иммунный анализ находит широкое применение в медицине, фармакологии, мониторинге окружающей среды, пищевой промышленность. Чувствительность обнаружения при этом, в частности, зависит от условий проведения реакции и характеристик системы детектирования. Гетерогенный количественный иммунный анализ, осуществляемый на микропланшетах, характеризуется высокой чувствительностью и производительностью, но требует значительного времени для проведения анализа (для инсулина от 4,5 ч.). А множество экспресс-тестов на основе иммунной реакции рассчитаны лишь на качественный или полуколичественный анализ. Конкурентный иммунный анализ позволяет обнаружить мелкие белки и сократить длительность анализа.

Постановка конкурентного иммунного анализа на МФУ дает возможность объединить преимущества иммунного анализа (высокая специфичность) и микрофлюидики (возможность проведения отдельных стадий или всего анализа в микромасштабе на одном устройстве за счет простоты манипуляции с пробой, экспрессность и т. д.). Наиболее чувствительным и простым для реализации в таких устройствах является флуоресцентный метод детектирования иммунных комплексов.

Использование пористых структур в качестве основы сенсорного

элемента позволяет дополнительно повысить чувствительность за счет

увеличения площади сенсорного слоя в малом объеме. Перспективным

представляется пористое стекло (ПС), основными характеристиками

5

которого являются развитая поверхностная структура (пористость до 50%, регулируемый размер пор), оптическая прозрачность в широком спектральном диапазоне, физическая и химическая стойкость, высокая воспроизводимость характеристик образцов внутри одной серии.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод об актуальности разработки микрофлюидного устройства с биосенсорных элементом на основе пористого стекла для иммунного анализа.

Цель работы

Разработка и создание микрофлюидного устройства с интегрированным биосенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла для проведения иммунного анализа.

Основные задачи

1. Исследование натриевоборосиликатных двухфазных и полученных из них пористых стекол методами оптической спектроскопии и высокоразрешающей микроскопии.

2. Обоснование и выбор метода иммобилизации белка и адаптация его для пористого стекла.

3. Разработка, изготовление и исследование микрофлюидного устройства с интегрированным биосенсорным элементом на основе натриевоборосиликатного пористого стекла.

4. Апробация метода иммунного анализа с применением отдельно биосенсорного элемента и на микрофлюидном устройстве с интегрированным сенсорным элементом (на примере инсулина).

Научная новизна

— Впервые обнаружена немонотонная зависимость интенсивности флуоресценции биосенсорного элемента на основе натриевоборосиликатного пористого стекла 8В8-МАП от соотношения концентраций антигенов и

1 6

антител (Сптс-^С^о) в диапазоне концентраций СптсмпбК^-Ю" +2,3-10") М иС,8о=(3-Ю'8-2-10-7) М.

— На основании данных оптической спектроскопии в видимом диапазоне (коэффициент поглощения и показатель преломления) согласно моделям эффективных сред получены оценки структурных характеристик (в частности, пористость) микро- и макропористых натриевоборосиликатных стекол (8В-МИП-И 8В-МАП).

— Получены оценки размеров комплексов иммобилизованного на пористое стекло инсулина методом сканирующей ближнепольной оптической микроскопии, размер (0,4...1,3мкм) и форма которых зависят от концентрации инсулина в растворе.

Практическая значимость работы:

— Способ получения МФУ с интегрированным биосенсорным элементом на основе ПС для иммунного анализа позволяет оперативно изготавливать прототипы устройств со встроенными сенсорными элементами.

— Методика иммобилизации инсулина и методом ковалентного связывания адаптирована для изготовления биосенсорного элемента на основе ПС 8В8-МАП.

— Методологический подход к оцениванию структурных характеристик макропористых стекол 8В-МАП с высоким светопропусканием и низким релеевским светорассеянием, полученные по данным оптической спектроскопии, могут применяться для неразрушающего контроля ПС.

— Макет детектора для микрофлюидного устройства используется при проведении научно-исследовательских работ ИАП РАН (по НИР «Разработка принципов организации мультисенсорных систем и их информационного обеспечения в медико-биологических исследованиях» (2009-2012 гг) и грантам КНВШ за 2008-2013 гг).

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ изготовления биосенсорного элемента на основе пористого стекла методом иммобилизации белка (ковалентного связывания), для которого подобраны условия подготовки, активации и силанизации поверхности ПС.

2. Способ создания микрофлюидного устройства на основе биосенсорного элемента из пористого стекла и двухуровневой системы подвода/отвода пробы к нему, реализованный в конструкции из полидиметилсилоксана.

3. Метод обнаружения содержания инсулина в 40 мкл пробы в

7 6

диапазоне концентраций (2,9-10" -К2,3-10" ) М за время менее чем 2 ч при постановке конкурентного иммунного анализа на МФУ с биосенсорным элементом на основе пористого стекла.

4. Методология оценивания оптических (коэффициент поглощения, показатель преломления) и структурных (пористость, средний размер пор) характеристик пористых стекол с высоким светопропусканием (~ 90%) и низким релеевским светорассеянием при помощи моделей эффективных сред по данным оптической спектрометрии в диапазоне длин волн (360+420) нм.

Апробация работы: Основные результаты диссертации доложены на следующих международных и российских конференциях и семинарах: Eight and ninth seminar on porous glasses - special glasses. PGL'2007 и PGL'2009 (Poland. Wroclaw); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии. 2007 и 2010гг. (г.Москва, г.Волгоград); VII и VIII международной конференции «Прикладная оптика-2008» и «Прикладная оптика-2010» (г. Санкт-Петербург); IX Молодежной научной конференции, посвященной 60-летию Института химии силикатов РАН. 2008 (г. Санкт-Петербург); XX симпозиуме «Современная химическая физика» 2008 (г. Туапсе); «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» И. 2011 (г. Казань); 5-й Международной научно-технической конференции

«Сенсорная электроника и микросистемные технологии» (СЕМСТ-5). 2012 (Украина, г. Одесса,).

Работа выполнена в рамках грантов РФФИ №08-08-00733-а и 09-02-09482-мобз; научной программы СПбНЦ РАН, раздел «Комплексные междисциплинарные проекты», проект «Микрофлюидные аналитические системы с интегрированными наноструктурами (пористыми стеклами)» за 2009 и поддержана грантами КНВШ для студентов и аспирантов ВУЗов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга за 2008-2010 гг. и субсидии КНВШ молодым ученым, молодым кандидатам наук ВУЗов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга за 2012 г.; программой «У.М.Н.И.К.» за 2012 и 2013 гг.

1. Литературный обзор

1.1 Микрофлюидные аналитические системы

Одним из перспективных направлений развития приборостроения является разработка микроаналитических систем на основе микрофлюидных устройств (МФУ). Эти системы обладают такими преимуществами перед традиционными макроаналогами, как высокая экспрессность анализа, малый расход пробы и реагентов, возможность объединения отдельных стадий или всего анализа на одном компактном чипе, полный контроль и управление всеми аналитическими операциями, низкое энергопотребление и т д. За последние 10 лет опубликовано более 10000 статей по микрофлюидике. Только в США свыше 1000 патентов связано с микрофлюидикой [1].

В начале 1990х A. Manz разработал концепцию аналитических систем на мирочиповой платформе [2]. В то же время с развитием технологий выделилось такое научное направление, как микрофлюидика, посвященное изучению поведения жидкостей и газов в микромасштабах. Системы на основе микрофлюидных чипов получили название ^iTAS (Micro Total Analysis System, микросистемы для полного анализа), или lab-on-chip (лаборатория на чипе). Основным принципом создания этих систем является интегрирование всех функций аналитической лаборатории, включая транспортировку пробы, пробоподготовку, точное дозирование, перемешивание с реагентами, нагрев, титрование и другие операции в устройстве размером в несколько квадратных сантиметров [3]. С тех пор ведутся активные работы по разработке микрочиповых устройств, функциональных элементов для них, методов получения микро- и наноструктур.

МФУ представляет собой стеклянную, кремниевую или полимерную пластину с системой каналов с интегрированными функциональными элементами и интерфейсом для связи со внешними устройствами (например,

устройствами для ввода пробы и реагентов). Разновидность МФУ в планарном исполнении - микрофлюидный чип (МФЧ).

Несмотря на то, что исследования и разработки ведутся более 25 лет, до сих пор не сложилась четкая терминология и классификация в данном направлении. Например, в [4] под микрофлюидными чипами понимаются лишь чипы, предназначенные для анализа, хотя известно о существовании микрофлюидных чипов для проведения синтеза [5, 6].

В данной работе рассматриваются вопросы создания МФУ для анализа биологических проб путем постановки иммунной реакции.

Уровень современных технологий позволяет изготовить и разместить все необходимые для анализа устройства в небольшом объеме и даже интегрировать основную их часть в МФУ. Однако, стоимость такой интегрированной аналитической системы высока, поэтому для решения многих практических задач применяются внешние системы детектирования и управления процессами, проводимыми на МФУ. Такой подход позволяет создавать более дешевые устройства, основанные на использовании коммерческих приборов и оборудования (детектров, внешних насосов, дозаторов и т.д.).

Авторы [1] вводят определение микрофлюидной платформы (МФП), представляющей собой набор функциональных элементов, позволяющих реализовать определенные действия с пробой, которые легко комбинировать друг с другом в рамках определенных технологий. МФП задают общее направление миниатюризации, интеграции, автоматизации и создания систем для проведения множества параллельных измерений. Разработка систем из отдельных функциональных элементов и самих элементов для той или иной МФП представляется авторам более целесообразной, чем развитие отдельных изолированных систем lab-on-chip.

МФП можно классифицировать в соответствии с основным принципом

движения жидкости (капиллярные, под действием давления, под действием

центробежных сил, электрокинетические и акустические) [1], по

11

доминирующему способу/методу управления движением жидкости (силовыми полями, постоянными/переменными электрическими полями, электромагнитными полями, магнитными полями, ультразвуковыми полями и комбинированными методами) или по методам изготовления. Поскольку метод изготовления и получаемые характеристики структур во многом определяются материалом МФУ, то можно также ввести соответствующую классификацию (стеклянные, кварцевые, кремниевые, полимерные и гибридные устройства). Наибольшее распространение находят полимерные материалы, поскольку они отличаются доступностью и разнообразием свойств. Свойства материалов, применяемых для микрофлюидных устройств, и методы их обработки подробно описаны в обзорных статьях, например в

[3].

1.1.1 Микрофлюидные устройства: материалы, методы изготовления

Полимерные материалы для МФУ выгодно отличаются низкой стоимостью и большим ассортиментом имеющихся в продаже вариантов материалов. Одним из наиболее распространенных материалов является полндгшетшсгшоксаи (ПДМС). Это недорогой эластомерный материал, устойчивый к кислотам и щелочам, обладающий высокой оптической прозрачностью в видимом диапазоне [3]. Из ПДМС изготавливаются простые и дешевые МФЧ однократного применения [7]. Способы изготовления МФУ из ПДМС подробно описаны в [8]. В [9, 10] приведены методы модификации поверхности ПДМС, позволяющие изменить свойства поверхности или сформировать на ней функциональные группы. Кроме того, ПДМС может применяться для герметизации микрофлюидных чипов [11], он позволяет соединять стекло или полимеры при комнатной температуре.