Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретического определения катехоламинов и полифенолов с электрохимическим детектированием в микрочипе

Николаев, Андрей Валерьевич

Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретического определения катехоламинов и полифенолов с электрохимическим детектированием в микрочипе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Николаев, Андрей Валерьевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретического определения катехоламинов и полифенолов с электрохимическим детектированием в микрочипе»

Автореферат диссертации на тему "Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретического определения катехоламинов и полифенолов с электрохимическим детектированием в микрочипе"

Санкт-Петербургский Г осударственный Университет

НИКОЛАЕВ АНДРЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

На правах рукописи

Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретичсского определения катехоламннов н полифеполов с электрохимическим детектированием

в микрочипе

Специальность U2.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

з 1 ОКТ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005536023

Работа выполнена иа кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Карпова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: Яшин Яков Иванович

доктор химических наук, профессор, НТЦ «Хроматография» НПО «Хнмавтоматика», директор

Слядцсв Максим Николаевич

кандидат химических паук, ООО "ЛЮМЭКС-МЛРКЕТИНГ", руководитель медико-биологического отделения

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) г. Санкт-Петербург

Защита состоится «21» ноября 2013 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Средний пр., д. 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан октября 2013 г.

Ученый секретарь дисеетрационного совета В.В. Панчук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность. Масштабы разработок, посвященных микрофлюидным аналитическим системам (МФАС), активно растут. Их достоинства заключаются в экспрессности, малом расходе образцов и реагентов, портативности аппаратуры и сравнительной простоте ее изготовления.

Одним из первых методов анализа, переведенных в микроформат, стал капиллярный электрофорез (КЭ). Традиционные варианты детектирования в капиллярном электрофорезе на микрочипах - ультрафиолетовое, флуориметрическое, масс-спектрометрическое и электрохимическое (ЭХ). Наше внимание сконцентрировано на последнем, характеризующемся высокой чувствительностью, простотой реализации и сравнительно низкой стоимостью.

Капиллярный электрофорез в чип-формате с электрохимическим детектированием получил достаточно широкое распространение за рубежом, однако в нашей стране практически не изучен, и в настоящее время отечественных микрофлюидных систем КЭ с ЭХ-детектированием нет.

В качестве важных и информативных моделей для изучения возможностей различных вариантов капиллярного электрофореза являются биогенные амины и природные антиоксиданты полифенольного типа. Биогенные амины (дофамин, норадреналин, адреналин) - диагностические маркеры различных заболеваний сердечнососудистой и центральной нервной систем. Огромное внимание в последние годы уделяется определению в биологических жидкостях, пищевых продуктах, БАДах полифенольных антиоксидантов,, способных блокировать вредное воздействие на организм свободных радикалов.

Использование микрофлюидных систем, обеспечивающих экспрессное определение этих аналитов, открывает новые перспективы. Этим обусловлена и актуальность решаемой задачи.

Цель диссертационного исследования: разработка микрофлюидной аналитической системы с электрохимическим детектированием и выявление ее возможностей при определении электроактивных аналитов (катехоламинов, катехинов, фенолов).

В связи с поставленной целью решались задачи:

1. Отработка основных этапов изготовления микрофлюидного чипа, оптимизация условий и рабочих параметров (конфигурация электрохимической ячейки, герметизация чипа, сепарационное напряжение в канале микрочипа, очистка поверхности электрода,

состав и концентрация буферного раствора) на примерах модельных систем элекгроактивных аналитов.

2. Выявление возможности on-line концентрирования катехоламинов с использованием стэкинга с усилением поля на разработанной микрофлюидной аналитической системе с электрохимическим детектированием.

3. Модификация каналов микрочипа окислением в газовом разряде (N2+O2) и поверхностно-активными веществами (ПАВ) (додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия и ионной жидкостью-1-додецил-З-метилимидазолий хлоридом) с целью снижения гидрофобное™ поверхности.

4. Получение сравнительных оценочных аналитических характеристик по эффективности, воспроизводимости электроосмотического потока (ЭОП), пределам обнаружения, временам миграции электроактивных аналитов (катехоламинов, фенолов, катехинов) с использованием микрофлюидной аналитической системы и традиционных вариантов КЭ с УФ- и ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.

5. Определение электроактивных компонентов в реальных объектах с использованием разработанной микрофлюидной аналитической системы (зеленый чай, вино, фармпрепараты).

Научная новизна

Разработана портативная микрофлюидная аналитическая система для экспрессного электрофоретического определения катехоламинов и полифенольных антиоксидантов с электрохимическим детектированием в гибридном микрочипе из стекла и ПДМС.

Предложены новый вариант гибридного микрочипа с золотыми электродами и способы стабилизации в нем скорости электроосмотического потока обработкой поверхности канала в газовом разряде (N2+O2) и ПАВ (додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, ионная жидкость 1-додецил-З-метилимидазолий хлорид). Установлено, что в результате модификации поверхности чипа анионными ПАВ (ДДСН, дезоксихолат натрия) увеличилась скорость ЭОП и воспроизводимость времен миграции (с 10 до 5 %). Модификация ионной жидкостью (1-додецил-З-метилимидазолий хлорид) привела к обращению ЭОП и обеспечила максимальное увеличение эффективности в сравнении с результатами, полученными на необработанном чипе.

Разработана экспрессная схема микрочипового капиллярного электрофореза для определения катехоламинов с предварительным стэкингом с усилением поля.

Предложен способ повышения воспроизводимости времен миграции и снижения

пределов обнаружения аналитов с использованием микрофлюидной аналитической системы за счет контроля герметичности соединения покровной пластины с микроканалом в области измерительных электродов электрохимического детектора (по электрохимическому осаждению серебра на электроды).

Практическая значимость работы

Разработан макет гибридного микрочипа для качественного и количественного определения полифенольных антиоксидантов в реальных объектах (образцы зеленого чая, красные вина) с пределами детектирования (3.5-2.3) мкг/мл и общим временем анализа 4 мин.

Реализован вариант on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля) при электрофоретическом определении катехоламинов в МФАС, обеспечивший снижение пределов обнаружения более чем в 10 раз.

Показано, что с использованием микрофлюидной аналитической системы возможно проведение как группового анализа полифенольных антиоксидантов (режим капиллярного зонного электрофореза), так и установление покомпонентного состава анализируемой смеси (режим мицеллярной электрокинетической хроматографии).

Положения, выносимые на защиту:

1. Микрофлюидная аналитическая система капиллярного электрофореза с электрохимическим детектором для экспрессного определения природных антиоксидантов полифенольного типа.

2. Конфигурация электрохимической ячейки (in-channet) с расположением рабочего электрода и электрода сравнения перпендикулярно сепарационному полю, и условия элекгрофоретического определения катехинов и катехоламинов.

3. Схема гибридного микрочипа из ПДМС-стекла с золотыми электродами и модифицированной поверхностью каналов микрочипа (окисление в газовом разряде, добавка ДДСН, дезоксихолата и 1-додецил-З-метилимидазолий хлорида).

4. Схема on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля) при электрофоретическом определении катехоламинов в МФАС, обеспечившая снижение пределов обнаружения более чем в 10 раз.

5. Схема экспрессного анализа реальных объектов (чай, вино) с помощью микрофлюидной аналитической системы для определения антиоксидантов полифенольного типа.

Публикации и апробация работы

Материалы диссертации опубликованы в 2-х статьях и 6 тезисах докладов. Результаты исследований докладывались на VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа "ЭМА-2012" (2012 г., Уфа, Россия); International Student Conference "Science and Progress" (2012 г., С-Петербург, Россия); II Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез"(2013 г., Краснодар, Россия); VII Всероссийской конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев 2013» (2013, С-Петербург, Россия); Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( 2011 г., Волгоград, Россия); VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием Менделеев-2012. (2012 г., С-Петербург, Россия).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 3 глав с обсуждением полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (159 наименований). Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 104 рисунка и 15 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулирована цель исследования.

1-я глава (Обзор литературных данных) включает разделы, посвященные описанию материалов и техник изготовления чипов, различных способов обработки поверхности сепарационного канала, варианты конструкции электрохимической ячейки, а также области применения микрочипов; специальный раздел посвящен свойствам электроактивных аналитов (катехоламинов и антиоксидантов полифенольного типа) и методам их электрофоретического определения.

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов, аналитов и методов исследования.

Разработанная система для капиллярного электрофореза представляет собой чип-анализатор с амперометрическим детектором и потенциостатом, высоковольтным источником и блоком связи с компьютером. Микрофлюидный чип, собранный из стеклянной и полимерной частей, устанавливается в чип-анализатор. В полимерной покровной пластине сформированы каналы трапециевидной формы (основания

соответственно равны 35 и 65 мкм, высота 20 мкм), а так же резервуары объемом ~1 мкл. Матрицы для изготовления полимерной части чипа получали методом фотолитографии. Кремниевые пластины (кремний n-типа КЭФ-4,5 (100)) покрывали слоем фоточувствительного полимера Shipley 1813 (1-2 мкм) с использованием центрифугирования. После высушивания (95"С; 30 мин) на пластины закрепляли заранее подготовленные фотошаблоны с изображением микроканалов и засвечивали при Х.=410 нм. Необлученный фоторезист удаляли 1%-ным раствором NaOH, промывали в потоке деионизированной воды, высушивали при комнатной температуре. Для получения рельефного изображения микроканалов на пластине проводили анизотропное травление матриц 50%-ным водным раствором КОН при 80 "С. Готовые матрицы проверяли под микроскопом на отсутствие дефектов рельефного изображения каналов.

Изготовление золотых электродов на стеклянной подложке микрочипа.

На стеклянную пластинку (предметное стекло), покрытую слоем золота (350-400 нм), методом напыления наносили фоторезист. После просушки пластину засвечивали при ^=410 нм через шаблон с изображением электродов. Необлученный слой фоторезиста удаляли 1М раствором NaOH. Далее проводили химическое травление слоя золота, не покрытого затвердевшим фоторезистом с использованием свежеприготовленной смеси: (30мл) 10%-ных растворов (NH2)2CS, K4[Fe(CN)f,]3 и Na2S203, 2:1:2 (объемн.). Полимерную часть {реплики-отпечатки) чипа готовили методом формования на полученных ранее кремниевых матрицах. В качестве материала для микрофлюидных чипов выбран полидиметилсилоксан (ПДМС) Sylgard 184. Для проведения полимеризации смешивали мономер и сшиватель (10:1) и выдерживали смесь до её полного затвердевания (1ч при 90 "С).

В 3-й главе обсуждается решение ряда технических проблем, обеспечивших реализацию аналитической задачи.

Золотые электроды Стеклянная подложка

Резервуар пробы

Резервуар слива

полимерная пясть нз ПДМС

Резервуар буфера Резервуар слава пробы Рабочий капилляр

Детекюр

я № L

-1 о Г'

и Электроды

Л измерительной

ячейки 1 '

Анод

(Электрод канала ввода пробы

рис. 1. Структура микрофлюидного чипа и его параметры.

При изготовлении полимерной части чипа (Рис. 1) для полного покрытия кремниевой пластины при формовании найдено необходимый объем смеси субстрат-сшиватель (Рис. 2). Готовые реплики проверялись под микроскопом на наличие дефектов формы каналов. Электроды чипа изготавливали на стеклянной подложке. Поскольку у золота плохая адгезия к стеклу, при напылении электродов сначала наносили слой титана толщиной 30-40 нм, а затем слой золота (350-400 нм).

$у!£аг<1184-в здгап) 184а

г! "СН,

/ Чц

н,</ СН,

н.с— —сн,

НЦС—вС-СЦ

, у

'■са-8|-сн5 чо

Н3С-®|-СНз

^-сн> у $| СН,-Й1-~СНЭ

с7 "^ч, Ъ

Рис. 2. Полимеризация полидиметилсилоксана.

Электрическое поле, создаваемое напряжением в разделительном канале, оказывает значительное влияние на показания электрохимического детектора, что необходимо учитывать при изготовлении чипа. Существуют различные варианты расположения электродов детектора в микрофлюидных системах капиллярного электрофореза. Нами выявлены возможности двух- и трехэлектродной электрохимической ячеек с «.о//-сИаппеЬ-конфигурацией: рабочий электрод располагается непосредственно внутри канала, а изоляция от разделительного напряжения обеспечивается золотым разъединительным электродом (декаплером), расположенным в рабочем канале непосредственно перед рабочим электродом детектора (Рис. 3). В ЭХ-ячейке формируется область без электрического поля, где аналиты мигрируют за счет образовавшегося в капилляре электроосмотического потока. Для оптимизации конфигурации ЭХ-ячейки с целью минимизации шума изучено влияние концентрации буферного электролита на фоновый ток ЭХ ячейки. В КЭ на чипах, как правило, используются буферные электролиты с концентрацией 5-50 мМ. Увеличение

концентрации приводит к росту тока в сепарационном канале. В качестве рабочих выбраны боратные буферные электролиты рН = 9.2 с концентрациями 1, 5, 10 мМ.

д\ расположение ' сепарационного канала

декаплер

Декаплер •Рабочий электрод-

Электрод сравнения-Вспомогательный электрод

расположение сепарационного канала

Рис. 3. Конфигурация электрохимической ячейки в режиме о//-сИапе1 детектирования: А) внешний вид ЭХ ячейки на чипе; Б) конфигурация трехэлектродной ячейки; В) двухэлектродной ячейки

Канал заполнялся буферным электролитом, включалось сепарационное напряжение и регистрировалась величина фонового тока ячейки, максимальный рост которого наблюдался для конфигурации с расстоянием между электродами 150 мкм. С увеличением тока возрастал и уровень шума (табл. 1).

300.00 800.00 ■ 700.00 < 600.00 i 500,00 « 400.00 " 300,00 200.00 100.00 0.00

♦ ISO «175 4 275

........,.......А........,.......

4,00 6,00

2.00 4,00 6,00 3.00 10.00 концентрация буферного электролита

Рис. 4. Зависимость фонового тока двухэлектродной ячейки в конфигурации "off-channel" от

концентрации электролита и рабочий электрод Сепарационное 200 В/см

буферного расстояния - декаплер. напряжение

Фоновый ток ячейки, нА Величина шума, нА

5 0.2

100 3.1

1000 20.4

Таблица 1.

Зависимость величины шума ЭХ ячейки от фонового тока

Поскольку трехэлектродная ячейка обладает лучшими параметрами, изготовлены чипы с тремя электродами и расстоянием декаплер-рабочий электрод 275 мкм, 175 мкм и 150 мкм. Вспомогательный электрод располагался за электродом сравнения на расстоянии 200 мкм от последнего (Рис. 3). Применение трехэлектродной ячейки позволило увеличить отношение сигнал/шум в сравнении с двухэлектродной в 3 раза.

Экспериментально было подтверждено, что использование ячейки с максимальным

расстоянием декаплер-рабочий электрод предпочтительно. При этом с увеличением расстояния декаплер-индикаторный электрод может происходить значительное уширение зоны аналита. Обнаружено и другое ограничение: на разъединительном электроде выделялся водород, что приводит к разрыву цепи и значительным флуктуациям тока ячейки. В литературе для решения данной проблемы предложено использовать в качестве разъединительного палладиевый электрод.

Для проверки эффективности этой процедуры выполнена серия специальных экспериментов по электроосаждению Р<1 из раствора РёСЬ на золотой разъединительный электрод, обеспечившая увеличение времени работы чипа без выделения пузырей (для 5 мМ буферного раствора до 4 мин), однако полностью решить проблему не удавалось. Именно поэтому выявлены возможности другой конфигурации - т-сИаппеI (Рис. 5).

Рабочая поверхность электродов

сепарашюннып канал

\т

А)

Сепарашюнный канал

л ш

рабочий 1

электрод я

Рис. 5.

Схема расположения электродов при т-сИаппе1 конфигурации детектора

Б)

В этом случае положение электродов относительно канала не должно вносить существенного вклада в фоновые токи. Для проверки данной гипотезы изготовили чип (Рис. 6), в котором две пары электродов размещались вдоль канала, менялась концентрация буферного электролита и регистрировалась зависимость фонового тока ячейки от положения пары электродов (табл.2).

к детектору

Рис. 6. Чип, с дополнительной парой электродов

Таблица 2. Зависимость величины шума ЭХ ячейки от фонового тока на разных парах

Концентрация буферного электролита, мМ Ток, нА Электроды (1) Ток, нА Электроды (2)

5 1. 8±0.1 2.0±0.1

10 2.5±0.1 2.4±0.1

25 6.0±0.2 6.1±0.2

Следующим этапом, как и для off-channel конфигурации, явилось добавление третьего вспомогательного электрода, который поместили за электродом сравнения и рабочим электродом (Рис. 7).

(А)

(Б)

вспомогагельный-

«а я электрод

С с! рабочий электрод

о о

о 1 сепарационный —

Ö и в канал

электрод сравнения '

Рис. 7. Конфигурация трехэлектродной ячейки (А) и увеличенное изображение ячейки собранного чипа

Для изготовления хлорсеребряного электрода сравнения проводилось гальваническое осаждение серебра на золотую поверхность, после чего его гальванически хлорировали из 0.1 М раствора HCl. В процессе анализа необходимо было поддерживать постоянной концентрацию хлорид-ионов.

Решена проблема быстрого загрязнения поверхности золотых микроэлектродов внутри сепарационного канала (Рис. 8).

загрязненная поверхность рабочего электрода |

Рис. 8. Потемнение поверхности рабочего электрода, вызванное осаждением смолообразных продуктов окисления

чистая золотая л' поверхность

Анодное окисление соединений, содержащих фенольные гидроксилы, может приводить к образованию хинонов (Рис. 9) и смолообразных продуктов.

-К"

быстро

+а

быстро

-IV

Рис. 9. Схема окисления гидрохинона до хинона Очистку электродов проводили гальванически, прокачивая через сепарационный канал 0.1 М раствор Н2504 в течение 1 мин. На рабочий электрод подавали отрицательный потенциал -1.5 В. После электрохимической очистки через канал прокачивали этиловый спирт в течение 3 мин. В ходе экспериментов установлено, что

каждый ПДМС-микрочил может обеспечивать стабильную работу при проведении в среднем ~ 10 циклов анализа смеси фенолов с концентрацией 1 мг/мл. Для улучшения герметизации чип после сборки помещали в камеру, из которой откачивали воздух, а сепарационный канал заполняли 10 мМ раствором AgNOз. Проводили электроосаждение серебра на электроды детектора. При недостаточной герметичности чипа наблюдалось осаждение серебра за пределами сепарационного канала.

Способы модификации поверхности чипа. В предварительных экспериментах на

модельных образцах фенолов выявлена необходимость модификации гидрофобной

поверхности каналов микрочипа, что вызывает адсорбцию аналитов (Рис.10).

Рис. 10. Электрофореграмма раствора пирокатехина и резорцина (С=200 мкг/мл). Боратный буфер 10 мМ, амперометрическое детектирование, сепарационное напряжение 200 В/см. Потенциал детектирования +1 В.

Изучены возможности двух вариантов обработки чипа: окисление поверхности ПДМС в газовом разряде и динамическая модификация с использованием поверхностно-активных веществ (додецилсульфата натрия (ДЦСН), дезоксихолата натрия и ионной жидкости - 1-додецил-3-метилимидазолий хлорида). Основная проблема при модификации связана с регенерацией поверхности ПДМС. Для проведения экспериментов по обработке в газовом разряде (N2+02) использовали генератор, представляющий собою герметичную камеру с электродами, подключенными к катушке Теслы (Рис. 11). Обработку чипа проводили в атмосфере воздуха, при давлении в камере ~ 200 Па.

Рис. 11.

Камера для окисления поверхности ПДМС в газовом разряде

20 30 80 110 1« 170 200

время, с

'"•"•к ...........-......""*" • Поверхность канала становилась гидрофильной:

при введении капли дистиллированной воды в любой из резервуаров жидкость смачивала канал полностью. Для необработанного чипа этого не наблюдалось. Для сохранения гидрофильных свойств поверхности канал периодически обрабатывали 0.1 М раствором

щелочи и 20 мМ боратным буфером. По воспроизводимости ЭОПа (маркер -диметилсульфоксид) подбиралось время обработки канала. Динамическая модификация каналов микрочипа.

Растворы модификаторов (ДДСН, дезоксихолат натрия, 1-додецил-З-метилимидазолий хлорид) готовили в 20 мМ боратном буфере. Анионные и катионные ПАВ способствовали увеличению скорости электроосмотического потока, поскольку их молекулы (Рис. 12), сорбируясь на поверхности ПДМС, формировали в зависимости от природы детергента отрицательный или положительный заряд (Рис. 13).

Рис. 12. ПАВ, применявшиеся при модификации стенок каналов микрочипа. 1 - ДДСН; 2 - 1-додецил-З-метилимидазол хлорид 3- дезоксихолат натрия

(А)

(В).

Катод (-)

с с ос со со У У У у у У У У

ЭОП

У. У. У. У. У. У. У. '/

ос ос со 3 с

9 9 9 9 Ъ

Анод Катод а а а а а Анод

(+) (■) а о а а а (+)

О й й Й й

Рис. 13. Формирование заряда на поверхности при сорбции анионного (А) и катионного детергента (В).

Для выявления зависимости между скоростью ЭОПа и концентрацией ПАВ в буфере готовились растворы с концентрацией ПАВ, меньшей ККМ (1, 2, 3 и 4 мМ). При таких значениях они выполняли роль ион-парного, а не мицеллообразующего агента. Обработка каналов микрочипа растворами всех ПАВ привела к увеличению скорости

ЭОП. Максимальные значения ЭОПа (8*10"4 см2/с*В для ДДСН и 6.5*10"4 см2/с*В для дезоксихолата натрия) достигались при минимальной концентрации анионных ПАВ (1 мМ) (Рис.14). Дальнейшее увеличение концентрации детергентов вызывало снижение скорости, обусловленное увеличением ионной силы буферного электролита.

е ■> о

....., 1

* ->

-и 3

Рис. 14.

Зависимость подвижности ЭОП от концентрации поверхностно активных веществ:

1 - ДДСН;

2 - ионная жидкость 1-додецил-З-метилимидазолий хлорид;

3 — дезоксихолат натрия

Концентрация ПАВ. мМ

Электрофореграммы смеси гидрохинона, пирокатехина и резорцина после модификации поверхности ПДМС представлены на Рис. 15.

50 ■ модификация плазмой

модификация

•, I \ V V \

модификация

2 3

модификация

время, с

Рис. 15. Электрофореграммы смеси (1)-гидрохинона, (2)-пирокатехина, (3)-резорцина, полученные после модификации поверхности ПДМС: а) в разряде; б) дезоксихолатом натрия; в) додецилсульфатом натрия; г) 1-додецил-З-метилимидазолий хлоридом. Условия: сепарационное напряжение 200 В/см, буферный электролит -боратный 20 мМ, рН 9.2, потенциал детектирования +1 В.

В случае катионного ПАВ 1-додецил-З-метилимидазолий хлорида необходимо было менять полярность высоковольтного источника. Кривая зависимости скорости ЭОП от концентрации (Рис. 14) пересекает ось абсцисс, поскольку при низких концентрациях этого модификатора отрицательный заряд поверхности, обусловленный диссоциацией силанольных гидроксильных групп стеклянной подложки, может превосходить величину положительного заряда, формируемого сорбирующимися на ПДМС молекулами ПАВ. Таким образом, при низких концентрациях ионной жидкости наблюдалось обращение ЭОПа. Максимальная скорость (7*10"4 см2/с*В) достигалась при концентрации этого модификатора 3 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации ионной жидкости приводило к росту ионной силы буферного электролита и снижению скорости ЭОП.

Рассчитаны воспроизводимость ЭОП и значение эффективности для каждого из компонетов при различных способах модификации поверхности (табл. 3).

Таблица 3. Результаты модификации поверхности канала микрочипа (п=4, Р=0.95).

Газовый разряд (N2+02) ДДСН Дезоксихолат N3 Ионная жидкость

Эффективность, т.т.

Гидрохинон 970±40 950±40 700±60 1630±50

Пирокатехин 1360±50 1320±60 760±60 2100±60

Резорцин 1530±60 1500±60 870±60 2410±60

Воспроизводимость ЭОП, %

4 5 9 6

При обработке в разряде достигается большая эффективность и полное разделение фенольных компонентов по сравнению с анионными детергентами. При модификации ионной жидкостью эффективность выше, чем в случае окисления в разряде. Разделяемые компоненты опережают ЭОП, миграции снижаются; селективность разделения недостаточна. При использовании окисления в разряде и ДДСН компоненты пробы и ЭОП движутся в разных направлениях, что приводит к росту времен миграции и уширеншо зон аналитов вследствие диффузии. В дальнейших экспериментах в качестве модификатора выбран ДДСН, поскольку чипы остаются разборными, и в случае засорения канала полимерную часть можно легко заменить. Кроме того, модификация с использованием ДДСН менее трудоемка.

В 4-й главе обсуждается возможность применения разработанного устройства при определении нейротрансмиттеров (Рис. 16).

адреналин норадреналин дофамин

Рис. 16. Структурные формулы адреналина, норадреналина, дофамина.

Выполнена серия предварительных электрофоретических экспериментов в условиях капиллярного зонного электрофореза на приборе "Капель 105 М" с последующей адаптацией найденных условий к микрофлюидной системе (Рис. 17).

Рис. 17

Электрофореграмма смеси

катехоламинов. МФАС.

Условия: боратный буфер 10 мМ, рН 9.2. Сепарационное напряжение 200 В/см. Потенциал детектирования +1 В.

1 - дофамин

2 - норадреналин

3 - адреналин

■л

м 1Э -

время, с

Построены градуировочные зависимости и определены пределы детектирования для дофамина, норадреналина, адреналина (2.7; 2.5; 2.2 мкг/мл, соответственно). Для их дальнейшего снижения в условиях микрофлюидной системы выявлены возможности online концентрирования компонентов пробы с использованием стэкинга с усилением поля, основанном на различии в электропроводности раствора пробы и буферного электролита. Значения факторов концентрирования и пределы обнаружения катехоламинов, полученные с применением референтных методов, представлены в табл. 4 и 5.

Таблица 4. Факторы концентрирования и пределы детектирования катехоламинов

Компонент SEFh Предел обнаружения, мкг/мл

Дофамин 9 0.30

Норадреналин 9 0.27

Адреналин 8 0.28

Таблица 5. Пределы обнаружения (мкг/мл) катехоламинов

Компонент МФАС МФАС, концентрирование КЗЭ, ("Капель 105")(без концентрирования) вэжх ("Цвет-Яуза")

Дофамин 2.7 0.30 0.6 0.033

Адреналин 2.2 0.28 0.5 0.018

Норадреналин 2.5 0.27 0.7 0.025

Таким образом, для определения катехоламинов с использованием микрофлюидной системы в биологических жидкостях необходимо предварительное проведение и off-line концентрирования. Для объектов с более высоким содержанием электроактивных аналитов такой процедуры не требуется, как например, лекарственных форм катехоламинов. С использованием микрофлюидной системы определено содержания адреналина в препарате "ДОФАМИН-ФЕРЕЙН" - ампулы для инъекций 0.5% и "Фармакон - Адреналин" (ампулы 0.1%).

Препарат Заявленное содержание, мг/мл Найдено, мг/мл

ДОФАМИН-ФЕРЕИН 5 4.8±0.4

Фармакон - Адреналин 1 0.95±0.09

В 5-й главе обсуждается возможность применения разработанного микрофлюидного устройства при определении полифенольных антиоксидантов в образцах зеленого чая (Рис. 18).

. !, он

т;с 1

(-)-'3mikaiexiiH (ЭК)

ОН

НО^Д^ОН соон

Галловая кислота

(■ )-Эпигаллокатет; и н ОГК)

ХО

"со:

КО^Д-ЧЗН он

(-)-Эпигаллокателин галлат

(ЭГКГ)

^ 1 но" ^ чж

он

(-)-Эпнкатсхнн галлзг (ЭКГ)

Рис. 18. Основные антиоксиданты чайного листа Катехины - подходящие объекты для капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ);

являясь ионогенными аналитами при рН рабочего буфера > 8 они находятся в форме

анионов. В предварительных экспериментах найдены условия электрофоретического

разделения катехинов в режиме традиционного КЭ. Концентрацию рабочего буфера (боратный, рН 9.2) варьировали от 5 до 25 мМ. Полного разделения достичь не удалось. Галлаты элюировались совместно (Рис. 19 А). В случае капиллярного зонного электрофореза в чип-формате эта тенденция — возможность осуществления группового анализа — может быть выражена более отчетливо, что и подтвердилось при анализе реального образца (эксракт зеленого чая) в режиме КЗЭ на микрочипе (Рис. 19. Б).

Подобный подход может быть рекомендован для группового анализа антиоксидантов, например, при определении оксидативного стресса.

¡Н

!ГК

¡и

гкг

ЭКГ

эгкг

3 :з

¿и

гктокт-эгкг

эк+эгк

Г'

яр«у|. мин Бремя, с

Рис. 19. А) Электрофореграмма модельной смеси катехинов в КЗЭ, полученной на системе капиллярного электрофореза "Капель 105 М"; буферный электролит: 25 мМ боратный (рН 9.2)

Б) Электрофореграмма раствора зеленого чая в режиме КЗЭ, полученная на МФАС. Буферный электролит боратный, рН 9.2, 25 мМ. Потенциал детектирования +1 В.

Для улучшения разделения катехинов реализован и режим мицеллярной электрокинетической хроматографии. Аналиты распределяются между мицеллами, образующими псевдостационарную фазу, и буферным электролитом (мицеллообразующий агент - ДДСН в концентрации 25 мМ.), фосфатный буфер, рН рабочего электролита 7.0. Изучены закономерности влияния концентрации мицеллообразующего агента на миграционную подвижность (ц) аналитов и коэффициенты разрешения (К5) в этих условиях (Рис. 20).

Г'

13.03

. 1 э.оз

. • 2 в.пз

. .3 1-ЭКГ 7.03

г-псг „ 6.0Э

,-»4 з-эк & ¡.эз

4-ЭГКГ 4.0Э

5-ЭГК зоз

2.03

мз

1-ЭГКОГКГ

2-ЭГКГ'ЭК

3-ЭК.ТКГ ■1-ЭКГГКГ

С^с:-:. мМ

ССДДСН), ыМ

Рис. 20. Зависимость электрофоретических подвижностей (ц) и коэффициентов разрешения (Я5) от концентрации ДДСН в рабочем электролите.

Обнаруженные на модельных смесях закономерности позволили перейти к количественному определению эпигаллокатехина, эпигаллокатехин галлата, эпикатехина, эпикатехин галлата, галлокатехина в настое зеленого чая с использованием разработанной МФАС (Рис. 21). Анализ на микрофлюидной системе проводили в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (рабочий электролит 25 мМ фосфатный буфер; 25 мМ ДЦСН).

время, с

Рис. 21. Электрофореграмма раствора зеленого чая.

1 - ЭГК; 2 - ЭГКГ; 3 - ЭК; 4 - ГКГ; 5 - ЭКГ.

Условия: микрофлюидная аналитическая система; амперометрический детектор, потенциал детектирования +1 В. Рабочий электролит: фосфатный буфер, 25 мМ, рН=7.0. ДЦСН 25 мМ. Сепарационное напряжение 200 В/см.

В табл. 5 представлены результаты количественного определения катехинов и время анализа в экстракте зеленого чая, полученные различными методами: ОФ ВЭЖХ, МЭКХ на приборе капель 105 М и МФАС, иллюстрирующие хорошее соответствие.

Таблица 5. Количественный анализ катехинов в образцах чая разными методами, (Р=0.95, п=4)

Метод определения ВЭЖХ МЭКХ, Капель 105 М МЭКХ, МФАС

Эпигаллокатехин галлат, мкг/мл 182±12 175±10 167±15

Галлокатехин галлат, мкг/мл 46±5 48±4 44±8

Эпикатехин, мкг/мл 153±10 156±7 162±15

Эпикатехин галлат,мкг/мл 68±5 64±4 67±9

Эпигаллокатехин, мкг/мл 5±1 4±1 4±2

Время разделения, мин 25 14 4

Работоспособность созданной МФАС проверена и при определении антиоксидантов полифенольного типа в различных образцах красных сухих вин (рис. 22) и дигидрокверцетина в фармацевтическом препарате «Капилар».

* 15

гкг

ЭКГ

Л I

,1 '^л Г 1 К!

«V

гч /

тч т ^г ш Г-. СС О! о г^гмг

время, с

Рис. 22. Электрофореграмма образца красного вина в режиме МЭКХ на МФАС.

Условия: микрофлюидная аналитическая система, амперометрический детектор, потенциал детектирования + 1 В. Буферный электролит фосфатный, 25 мМ, рН=7.0. ДДСН 25 мМ. Сепарационное напряжение 200 В/см.

Дигидрокверцетин - антиоксидант природного происхождения. Содержится в большом количестве в комлевой части сибирской лиственницы и используется в фармацевтической промышленности для производства БАД и лекарственных средств.

Препарат Заявленное содержание, мг Найдено, мг

Таблетки "Капилар" 10 9.6±1.2

Таким образом, разработанная микрофлюидная система может применяться для экспрессного определения полифенольных антиоксидантов в природных объектах с содержанием последних > 10 мкг/мл. В случае меньших концентраций требуется предварительное концентрирование.

ВЫВОДЫ

1. Предложена и обоснована общая схема микрофлюидной аналитической системы (МФАС) с электрохимическим детектированием для экспрессного определения полифенолов и катехоламинов с электрохимическим детектированием в микрочипе.

2. Разработан и изготовлен макет гибридного микрочипа с интегрированными золотыми электродами и модифицированной поверхностью микроканалов окислением в

газовом разряде и ПАВ (додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия, ионной жидкостью 1-додецил-З-метилимидазол хлорид). Показано, что на одном ПДМС-микрочипе можно провести до десяти анализов реальных объектов.

3. Установлено, что модификация каналов микрочипа в газовом разряде (N2+O2) позволяет увеличить скорость электроосмотического потока в 2 раза по сравнению с ^модифицированным чипом; воспроизводимость времен миграции аналитов увеличена в 1,5 — 2 раза.

4. Модификация поверхности чипа анионными ПАВ (ДДСН, дезоксихолат натрия) привела к увеличению скорости ЭОП и воспроизводимости времен миграции. Использование в качестве модификатора ионной жидкости 1-додецил-З-метилимидазол хлорида привело к обращению ЭОП. При этом достигнуто максимальное увеличение эффективности в сравнении с результатами, полученными на необработанном чипе.

5. Выявлены возможности on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля) катехоламинов на разработанной МФАС, обеспечившего снижение пределов обнаружения катехоламинов в 10 раз.

6. Показано, что на МФАС возможно проведение как группового анализа полифенольных антиоксидантов в режиме КЗЭ, так и определения индивидуальных компонентов в режиме МЭКХ.

7. Разработана и апробирована на реальных объектах схема электрофоретического определения антиоксидантов полифенольного типа в образцах чая и красных вин и подтверждена правильность полученных результатов референтными методами: ВЭЖХ и КЭ.

Основные материалы работы опубликованы в следующих работах:

1. Николаев A.B., Карцова J1.A. Модификация поверхности каналов микрочипа с электрохимическим детектированием для определения биологически активных веществ. Сорбционные и хроматографические процессы. 2013. Том 13. Вып. 1. С. 98107.

2. A.B. Николаев, JI.A. Карцова. Микрофлюидные системы капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием. Вестник Санкт-Петербургского ун-та. 2012. Серия 4. Выпуск 2. С.50- 64.

3. Николаев A.B., Суханов B.JL. Филимонов В.В., Карцова JI.A. Разработка и оптимизация рабочих параметров чмп-анализатора для определения нейротрансмиттеров и антиоксидантов полифенольного типа в природных объектах методом капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием.XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 25-30 сентября. 2011 г. Тезисы докладов. Т. 4. С.378.

4. Николаев A.B., Зарипов Р.Т., Карцова Л.А.Модификация поверхности каналов микрочипа для анализа нейротрансмиттеров. Тезисы докладов VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием

Менделеев-2012. С. 245-246.

5. Nikolaev A.V., Kartsova L.A. Development and optimization of working parameters of the chip-analyzer for determination of neurotransmitters by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Conference abstracts. International Student Conference "Science and Progress", 12-16 November, St-Petersburg. 2012. P. 27.

6. Николаев A.B., Карцова JI.A. Обработка поверхности каналов микрочипа из ПДМС для анализа биологически активных соединений. Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012». Уфа-Абзаково, 3-9 июня 2012 г. С.114.

7. Николаев А.В., Карцова Л.А., Зарипов Р.Т., Филимонов В.В. Модификация каналов чип-анализатора для определения электроактивных аналитов. Тезисы докладов. "Кинетика и динамика обменных процессов». 2012. 25 ноября — 2 декабря. Дивноморское. Краснодарский край. С. 16.

8. Николаев А.В., Карцова Л.А., Филимонов В.В. Чип-анализатор для определения электроактивных веществ методом капиллярного электрофореза. Тезисы докладов II Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез". 2013. Краснодар. С. 55.

Работа выполнялась при техническом содействии Центра физики наногетероструктур ФТИ им. А.Ф. Иоффе (Руководитель: Копьев П. С., сотрудники: Филимонов В.В., Суханов

Подписано к печати 16.10.13. Формат 60x84 '/ig . Бумага офсетная. Гарнитура Тайме Печать цифровая. Печ.л. 1,00. Тираж 100 -экз. Заказ 5894.

Отпечатано н Отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812)428-4043,428-6919

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Николаев, Андрей Валерьевич, Санкт-Петербург

САНКТ ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РАЗРАБОТКА МИКРОФЛЮИДНОЙ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ И ПОЛИФЕНОЛОВ С ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ В МИКРОЧИПЕ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

04201452155

На пр£ :описи

НИКОЛАЕВ АНДРЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Л.А. Карцова

Санкт-Петербург 2013

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................6

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ..............................................11

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................13

1.1. Основные направления в создании микрофлюидных устройств......13

1.2. Принципы создания микрофлюидных чипов для капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием.............................14

1.3. Основные варианты капиллярного электрофореза..............................15

1.4. Материалы и техника изготовления микрофлюидных аналитических систем.....................................................................................................................16

1.4.1. Стеклянные микрочипы для капиллярного электрофореза................16

1.4.2. Полимерные чипы для капиллярного электрофореза..........................19

1.4.3. Обработка полимерных матриц.............................................................20

1.5. Микрочипы на основе полидиметилсилоксана.....................................22

1.5.1. Герметизация ПДМС-чипов...................................................................22

1.5.2. Физическо-химические характеристики поверхности ПДМС............23

1.5.3. Модификация поверхности ПДМС.......................................................24

1.5.3.1. Модификация поверхности ПДМС в газовой фазе.......................24

1.5.3.2. Модификация поверхности ПДМС в жидкой фазе......................25

1.6. Электрохимическое детектирование в капиллярном электрофорезе на чипах.................................................................................................................29

1.6.1. Конфигурации электрохимической ячейки..........................................31

1.6.1.1. «Епс1-скагте1 »-детектирование.......................................................33

1.6.1.2. «1п-сИаппе1 »-детектирование.........................................................38

1.6.1.3. «ОДГ-скаппе1»-детектирование.......................................................39

1.6.1.4. Двухэлектродное амперометрическое детектирование.............42

1.6.2 Сочетание амперометрического детектирования с другими способами детектирования..................................................................................................43

1.6.2. ¡.Сочетание амперометрического детектирования с электрохемшюминисцентным....................................................................43

I.6.2.2. Амперометрическое/флуоресцентное детектирование..............44

1.6.3. Материалы для изготовления электродов.............................................45

1.6.4. Варианты электрохимического детектирования в КЭ на чипах.........47

1.7. Примеры использования микрофлюидных чип-анализаторов с ЭХ детектированием.................................................................................................49

1.7.1. Биологический и клинический анализ..................................................51

1.7.2. Анализ объектов окружающей среды...................................................53

1.7.3. Анализ пищевых продуктов...................................................................54

II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................................................57

И.1. Оборудование...............................................................................................57

II. 1.1. Микрофлюидный чип-анализатор........................................................57

И. 1.2. Аппаратура для изготовления чипов....................................................59

И. 1.3. Аналитическое оборудование...............................................................59

II. 1.4. Вспомогательное оборудование...........................................................61

П.2. Реактивы.......................................................................................................61

П.З Подготовка чипа, аналитического оборудования, рабочих растворов

электролитов к анализу.....................................................................................62

П.3.1 Изготовление чипа..................................................................................62

П.З. 1.1. Подготовка кремниевой матрицы................................................62

П.З. 1.2. Изготовление золотых электродов на стеклянной подложке

микрочипа......................................................................................................63

П.З. 1.3. Создание реплик (формовка)..........................................................65

П.3.2. Обработка поверхности каналов чипа.................................................67

П. 3.2.1. Обработка плазмой........................................................................67

II. 3.2.2. Динамическая модификация поверхности канала.......................68

II.3.3. Ввод пробы в сепарационный канал микрочипа................................69

И. 3.4. Изучение движения жидкости в канале с использованием

флуоресцеина.....................................................................................................69

Н.3.5. Гальваническая модификация поверхности электродов чипа...........70

П.3.6. Подготовка кварцевого капилляра к работе ("Капель 105", КЗЭ).... 71

П.3.7. Приготовление подвижных фаз и буферных электролитов..............71

II. 3.7.1. Приготовление воротного буферного электролита для анализов (КЗЭ)...............................................................................................................71

11.3.7.2. Приготовление ацетатного буферного электролита (рН 4.0) (КЗЭ)...............................................................................................................72

11.3.7.3. Приготовление буферного электролита (МЭКХ).......................72

П.3.8. Подготовка стандартных растворов к анализу....................................72

П.3.9. Пробоподготовка реальных объектов к электрофоретическому и

хроматографическому анализу........................................................................73

И.ЗЛО. Определение полифенолов методом ОФ ВЭЖХ с

электрохимическим детектированием............................................................73

IL3.11. Определение полифенолов в различных режимах капиллярного

электрофореза....................................................................................................74

П.3.12. Определение нейротрансмиттеров методом капиллярного зонного

электрофореза с УФ-детектированием...........................................................74

П.3.13. Определение катехоламинов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием...............................................................................................75

III. ПОДГОТОВКА ЧИП-АНАЛИЗАТОРА И ОПТИМИЗАЦИЯ ЕГО РАБОЧИХ ПАРАМЕТРОВ...................................................................................76

IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗРАБОТАННОГО МИКРОФЛЮИДНОГО ЧИП-АНАЛИЗАТОРА С ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ..................................................115

V. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПОЛИФЕНОЛЬНОГО ТИПА В РАЗЛИЧНЫХ

РЕЖИМАХ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА...................................129

ВЫВОДЫ................................................................................................................145

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................147

ВВЕДЕНИЕ

Масштабы исследований и разработок, посвященных микрофлюидным аналитическим системам (МФАС), активно растут. Объединив все стадии химического анализа (ввод пробы, дериватизацию, разделение и детектирование) на миниатюрной платформе, в 1990 г. швейцарские ученые А. Манц и Г. Видмер предложили концепцию «лаборатории-на-чипе» [1], которая впоследствии получила широкое развитие во многих странах мира (Китай, Франция, Испания, США, Япония). Сегодня этому направлению посвящены сотни публикаций в ведущих научных журналах [2-4], многочисленные международные конференции; издаются монографии.

Одним из первых методов анализа, переведенных в микроформат, стал капиллярный электрофорез (КЭ), и до сих пор это направление считается наиболее перспективным [5, 6]. Причина заключается в том, что КЭ на чипах присущи высокая скорость разделения и введения образца; малый расход реагентов, простота в оформлении и возможность проведения большого количества параллельных определений.

Традиционные варианты детектирования в капиллярном электрофорезе на микрочипах - ультрафиолетовое (УФ), флуориметрическое, масс-спектрометрическое и электрохимическое (ЭХ). Наше внимание сконцентрировано на последнем, характеризующемся высокой чувствительностью, простотой реализации и сравнительно низкой стоимостью.

В качестве интересных и информативных моделей для исследования новых вариантов капиллярного электрофореза можно использовать биогенные амины и природные антиоксиданты.

Биогенные амины (дофамин, норадреналин, адреналин) -диагностические маркеры различных заболеваний сердечно-сосудистой и центральной нервной систем.

Определению антиоксидантов в пищевых продуктах, БАДах, биологических жидкостях в последние годы уделяется огромное внимание, наиболее эффективными среди которых являются природные полифенолы. Такой активный интерес к этим аналитам обусловлен их способностью блокировать вредное воздействие на организм свободных радикалов, замедляя процессы старения, защищая от ряда заболеваний.

Использование микрофлюидных систем, обеспечивающих экспрессное определение этих аналитов, открывает новые перспективы. Этим определена и актуальность решаемой задачи.

В связи с поставленной целью решались задачи:

— Отработка основных этапов изготовления микрофлюидного чипа, оптимизация условий и рабочих параметров {конфигурация электрохимической ячейки, герметизация чипа, сепарационное напряжение в канале микрочипа, очистка поверхности электрода, состав и концентрация буферного раствора) на примерах модельных систем электроактивных аналитов.

— Выявление возможности on-line концентрирования катехоламинов с использованием стэкинга с усилением поля на разработанной микрофлюидной аналитической системе с электрохимическим детектированием.

— Модификация каналов микрочипа окислением в газовом разряде (N2+O2) и поверхностно-активными веществами (ПАВ) (додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия и ионной жидкостью 1-додецил-З-метилимидазолий хлоридом) с целью снижения гидрофобности поверхности.

— Получение сравнительных оценочных аналитических характеристик по эффективности, воспроизводимости электроосмотического потока (ЭОП), пределам обнаружения, временам миграции электроактивных аналитов (катехоламинов, фенолов, катехинов) с использованием микрофлюидной аналитической системы и традиционных вариантов КЭ с УФ- и ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.

— Определение электроактивных компонентов в реальных объектах с использованием разработанной микрофлюидной аналитической системы {зеленый чай, вино, фармпрепараты).

Научная новизна

Предложены новый вариант гибридного микрочипа с золотыми электродами и способы стабилизации в нем скорости электроосмотического потока обработкой поверхности канала в газовом разряде (N2+02) и ПАВ (додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, ионная жидкость 1-додецил-З-метилимидазолий хлорид). Установлено, что в результате модификации поверхности чипа анионными ПАВ (ДДСН, дезоксихолат натрия) увеличилась скорость ЭОП и воспроизводимость времен миграции (с 10 до 5 %). Модификация ионной жидкостью (1-додецил-З-метилимидазолий хлорид) привела к обращению ЭОП и обеспечила максимальное увеличение эффективности в сравнении с результатами, полученными на необработанном чипе.

Предложен способ повышения воспроизводимости времен миграции и снижения пределов обнаружения аналитов в условиях микрофлюидной аналитической системы за счет контроля герметичности соединения покровной пластины с микроканалом в области измерительных электродов электрохимического детектора (по электрохимическому осаждению серебра на электроды).

Практическая значимость работы

Показано, что в условиях микрофлюидной аналитической системы возможно проведение как группового анализа полифенольных антиоксидантов (режим капиллярного зонного электрофореза), так и установление покомпонентного состава анализируемой смеси (режим мицеллярной электрокинетической хроматографии).

Положения, выносимые на защиту

2. Конфигурация электрохимической ячейки (in-channel) с расположением рабочего электрода и электрода сравнения перпендикулярно сепарационному полю, и условия электрофоретического определения катехинов и катехоламинов.

3. Схема гибридного микрочипа из ПДМС-стекла с золотыми электродами и модифицированной поверхностью каналов микрочипа (окисление в газовом разряде, добавка ДЦСН, дезоксихолата и 1-додецил-З-метилимидазолий хлорида).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ПДМС — полидиметилсилоксан ПЭТ - полиэтилентерефталат ПК - поликарбонат ПММА — полиметилметакрилат КЭ - капиллярный электрофорез

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЭХ - электрохимический

УФ - ультрафиолетовый

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ЭОП - электроосмотический поток

ЛИФ - лазерно-индуцированная флуоресценция

МФЧА — микрофлюидный чип-анализатор

МФАС — микрофлюидная аналитическая система

МС - масс-спектрометрическое

АД — амперометрический детектор

п.ф. - подвижная фаза

н.ф. - неподвижная фаза

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

КЭХ - капиллярная электрокинетическая хроматография

ЛИФ - лазерно-индуцированная флуоресценция

ДДСН - додецилсульфат натрия

ДМСО - диметилсульфоксид

УНТ - углеродная нанотрубка

MES - 2-(ТЧ-морфолино)этансульфоновая кислота

1E-3MI-TFB — 1-этил-З-метилимидазол тетрафторборат

HIAA - 5-гидроксииндол-З ацетоуксусная кислота

NBD - 4-хлор-7-нитробензофуразан

ЭК - эпикатехин ЭГК — эпигаллокатехин ЭКГ - эпикатехин галлат ЭГКГ - эпигаллокатехин галлат НА - норадреналин ДА - дофамин А - адреналин

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные направления в создании микрофлюидных устройств

Основными требованиями, предъявляемыми современными клинико-диагностическими лабораториями к анализу, являются экспрессность, использование минимального объема пробы, возможность «доставки» прибора к объекту анализа, простота автоматизации. Этому полностью соответствуют микрофлюидные аналитические системы (МФАС), к которым в настоящее время отмечен повышенный интерес в нашей стране и за рубежом. Кроме очевидных преимуществ миниатюризации аналитических систем таких, как интегрирование в одном чипе нескольких реакторов, смесителей, экстракторов, насосов, дозаторов, они позволяют реализовать в одном устройстве размером в несколько квадратных сантиметров все стадии пробоподготовки, дозирования, смешивания реагентов, очистки, разделения и анализа пробы [7].

Выделяют два основных класса микроаналитических систем: микрофлюидные (основаны на принципах проточного анализа и представляющие собой различные формы капиллярного электрофореза и хроматографии) и матричные (содержат топологически кодированные площадки с тем или иным способом иммобилизованными комплементарными группировками, избирательно связывающими целевые компоненты) [8].

Среди микрофлюидных систем наибольший интерес вызывают развитие и коммерциализация МФАС, являющихся чип-реализацией высокоэффективного капиллярного электрофореза [2, 9, 10].

1.2. Принципы создания микрофлюидных чипов для капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием

Схемы наиболее часто применяемых структур микрофлюидных чипов для капиллярного электрофореза представлены на Рис. 1.

Чип с простым перекрестным, или Т-инжектором (Рис. 1. а), и с двойным Т-инжектором (Рис. 1. б) [11], включают систему микроканалов шириной от 10 до 100 мкм и резервуаров (100 - 250 мкл). При этом длина р